CN102154474B - 一种用于肺癌诊断的分子信标复合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于肺癌诊断的分子信标复合物，包括磁性纳米微球以及吸附在磁性纳米微球上的分子信标，acc+Cct+Atca+Cgat+Tagcattaa为环状序列，其中环状序列中用大写表示的碱基是进行锁核酸修饰处理后的碱基；所述磁性纳米微球包括磁性纳米颗粒以及在包被磁性纳米颗粒表面的壳聚糖。本发明克服了现有技术中分子信标在活体细胞检测时易产生假阳性信号的缺陷，本发明分子信标复合物能够抵御活细胞内核酸酶的降解作用，对活细胞内miR-155进行检测，从而实现对肺癌的诊断与鉴别诊断。
Description
技术领域
本发明属于一种用于测定或检验核酸的分子信标，特别涉及一种测定或检验miR-155的分子信标的复合物。
背景技术
微小RNA(microRNA，miRNA)的检测方法很多。Northern杂交是检测miRNA在组织细胞中的表达水平的一种简便而可靠方法，可经凝胶电泳检测miRNA的分子大小经典的方法是Northern-blot，但需要总RNA量较多。基因芯片技术和实时荧光定量PCR被应用于miRNA的系统研究和定量检测，但步骤烦琐，成本较高，易受到逆转录效率的限制。荧光原位杂交(FISH)等方法是相对简化的方法，然而miRNAs原位检测系统相对较少，主要的原因是低拷贝、且片断较小。尽管通过采取碱基修饰的探针能显著提miRNA/cDNA杂交复合物熔链温度，miRNA/cDNA杂交复合物熔链温度过低，难于耐受复杂的漂洗等过程。更为重要的是，传统的miRNA检测方法难以实现完整细胞内miRNA的特异性检测。分子信标可确保反应不受其前体及基因组DNA污染等因素的干扰，对序列高度同源的miRNA也可精确区分；超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度，从几个拷贝到几万个拷贝，定量线性范围跨越7个数量级；样品消耗少，仅需1～10ng的总RNA；适用范围广，总RNA、细胞裂解物以及纯化的RNA都可用于miRNA的定量检测，尤其适用于活体细胞miRNA的检测。
现有技术中已有用于定量检测miR-155表达的分子信标。miRNA可能成为肿瘤早期诊断的生物新靶标。不同肿瘤具有不同的miRNA表达模式，通过miRNA表达谱的分析，将有助于临床上对肿瘤进行诊断、分期及预后的估计。组织中miRNA的异常表达能作为诊断肿瘤的标志物。microRNA的表达情况与包括I期肿瘤在内的肺腺癌的生存相关。研究发现，人miR-155(hsa-miR-155)高表达与预后不良有关；hsa-miR-155高表达是预后不良的因素。miR-155可作为肺癌的一种肿瘤标志物，用于肺癌的诊断与鉴别诊断。分子信标具有背景信号低，灵敏度高、特异识别性强、操作简单，不必与未反应的探针分离即可实时检测，可用于活体分析等优点。在生物化学分析，生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用价值。目前已通过基因芯片筛选出肺癌miRNA表达谱并对其功能进行了鉴定，本发明选择与肺癌发生及预后相关的miR-155进行检测，但常规分子信标用于活细胞内mRNA的检测分析时，由于细胞内核酸酶对分子信标骨架的降解和破坏作用，常导致假阳性信号的产生。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能够抵御活细胞内核酸酶的降解作用，对活细胞内miR-155进行检测，从而实现对肺癌的诊断与鉴别诊断的分子信标的复合物。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种用于肺癌诊断的分子信标复合物，其特征在于：包括磁性纳米微球以及吸附在磁性纳米微球上的分子信标，所述分子信标其序列为
5’-Alexa488-CCAGCG-aec+Cct+Atca+Cgat+Tagcattaa-CGCTGG-BHQ1-3’，其中CCAGCG为5’端茎状序列，CGCTGG为3’端茎状序列，发光基团为Alexa488，萃灭基团为BHQ1，acc+Cct+Atca+Cgat+Tageattaa为环状序列，其中环状序列中用大写表示的碱基是进行锁核酸修饰处理后的碱基；所述磁性纳米微球包括磁性纳米颗粒以及在包被磁性纳米颗粒表面的壳聚糖，所述磁性纳米微球是表面经聚乙二醇处理的磁性纳米微球。
根据成熟microRNA的序列信息来设计分子信标，分子信标的具体设计依据网站(www.molecular-beacons.org)中分子信标的设计原则来进行，环状探针结构设计原则为：长度在15～30个碱基之间；与目标miRNA能互补配对。茎状序列结构设计原则：探针序列的长度为5～7个碱基；GC含量一般在70～80％之间；融链温度比检测温度要7～10℃；G碱基不能连接发光基团。发光基团与萃灭基团的选择：发光基团能被相应的萃灭基团所萃灭，两个基团有一高的信号背景比(2.0以上)。根据以上原则本发明为抵御活细胞内核酸酶的降解作用，本发明对设计好的分子信标中的部分碱基进行锁核酸修饰。锁核酸(Lockednucleic acid，LNA)是一种新型的核苷酸衍生物，其结构中βD-呋喃核糖的2′-O，4′-C位通过缩水作用形成环形的氧亚甲基桥这一刚性的缩合结构，改变了核苷酸的几何和立体性质，减小了核糖结构的柔韧性，从而显著地提高了它的稳定性，该构象不仅显著提高了核酸的抗酶切能力，而且提高了杂交亲和性。LNA修饰的碱基数目不应超过6个，否则与miRNA结合速度较慢。本发明将人miR-155分子信标中的4个碱基进行了LNA修饰，上述分子信标环状序列中的大写字母即做了LNA修饰。
为了提高分子信标定量检测的灵敏度和稳定性，采用磁性纳米微球来提取和纯化本发明所述的分子信标。磁性纳米微球提取DNA的原理是：在磁性纳米颗粒表面包被富含正电荷化学基团的高分子材料(如壳聚糖)，制备成带正电荷的磁性纳米微球。把磁性纳米微球加入到DNA提取液中，在偏酸性(PH6.5)的缓冲液中，溶液中的DNA能吸附在带正电荷纳米微球上。采用磁性纳米微球做为分子信标的载体，提取相应DNA，可以去除许多影响PCR扩增的杂质，提高PCR扩增的稳定性。此外，一定量的磁性纳米微球可以吸附一定量的DNA，有助于获得相对恒量的模板DNA，提高荧光分子信标探针定量检测的准确性。
磁性纳米颗粒(MNPs)形成以磁性材料为中心，可包被生物分子的核壳结构，不但具备良好的磁导向性，也具有良好的生物相容性，可与多种功能分子结合，在活细胞和活体组织成像方面得到广泛应用。但未经修饰的纳米颗粒对活细胞有金属毒性，故要对纳米颗粒进行表面修饰。
壳聚糖是一种氨基多糖，由几丁质经脱乙酰化后得到，具有良好的生物相容性，能抵抗活体生物降解而被用于表面修饰。壳聚糖可定向固定分子信标增加固定量，又具有生物可降解性易于释放分子信标。同时壳聚糖具有低免疫原性和可降解性能，对细胞无毒副作用。
进一步，所述磁性纳米颗粒是Fe3O4磁性纳米颗粒。
Fe3O4磁性纳米颗粒便于核磁共振(MRI)显像，分子信标便于荧光显微镜显像，该纳米技术具有双重显像功能。
进一步，所述磁性纳米微球是表面经聚乙二醇处理的磁性纳米微球。
壳聚糖的分子链上含丰富的羟基和氨基可被进一步化学修饰，聚乙二醇(PEG)修饰壳聚糖后的纳米颗粒有很好的长循环稳定性，可逃避吞噬系统吞噬，能提高体内和体外的生物相容性。
具体实施方式
本发明用于肺癌诊断的分子信标复合物，其特征在于：包括磁性纳米微球以及吸附在磁性纳米微球上的分子信标，所述分子信标其序列为
5’-Alexa488-CCAGCG-acc+Cct+Atca+Cgat+Tageattaa-CGCTGG-BHQ1-3’，其中CCAGCG为5’端茎状序列，CGCTGG为3’端茎状序列，发光基团为Alexa488，萃灭基团为BHQ1，aec+Cct+Atea+Cgat+Tagcattaa为环状序列，其中环状序列中用大写表示的碱基是进行锁核酸修饰处理后的碱基；所述磁性纳米微球包括磁性纳米颗粒以及在包被磁性纳米颗粒表面的壳聚糖，所述磁性纳米微球是表面经聚乙二醇处理的磁性纳米微球。
现介绍本发明用于肺癌诊断的分子信标复合物的制备方法：
a.设计需要合成的分子信标：确定人miR-155序列为
5’-TTAATGCTA ATCGTGATAGGGGT-3’，设计人miR-155的分子信标环状序列为ACCCCTATCACGATTAGCATTAA，发光基团为Alexa488，萃灭基团为BHQ1；选定4个环状序列中需要进行LNA修饰的碱基，则设计分子信标其序列确定为5’-Alexa488-CCAGCG-acc+Cct+Atca+Cgat+Tagcattaa-CGCTGG-BHQ1-3’，其中环状序列中用大写表示的碱基即确定为要进行锁核酸修饰处理的碱基；
根据上述确定的分子信标序列可采用常规技术手术(如使用DNA剪切酶，聚合酶等)或交由相关公司(如Takara)进行合成；
b.制备磁性纳米Fe3O4颗粒：将20mL的氢氧化钾溶液倒入烧瓶中搅拌，再将20mL的硝酸钾溶液加入其中，充分搅拌后，将10mL的硫酸亚铁溶液加入，直至反应溶液呈墨绿色，并产生一些絮状物质；
充分搅拌上述反应溶液后移入90℃的水浴中陈化4h，得到黑色Fe3O4凝胶溶液。将上述凝胶溶液置于磁场中，进行Fe3O4磁性颗粒与溶液的分离；采用去离子水清洗分离得到的Fe3O4磁性颗粒；将清洗好的Fe3O4颗粒真空干燥出黑色的Fe3O4颗粒粉末。
c.制备磁性纳米微球：用聚乙二醇对上步骤最后得到的Fe3O4颗粒进行表面处理，然后将处理后的Fe3O4颗粒分散到100mL无水乙醇中，形成磁流体；将磁流体倒入三口烧瓶中并加入十二烷基硫酸钠0.3g、10mL苯乙烯，搅拌1h；然后在氮气环境下加入与Fe3O4颗粒的质量比为1：1的壳聚糖以及1mL的二乙烯基苯，水浴加热至60℃反应1h；升温至75℃，在碱性条件(用0.1mol/L NaOH溶液控制至pH＝10)下进行悬浮聚合10h；进而在90℃下陈化，陈化后使用乙醇和水洗涤，最后进行磁分离，分离出磁性纳米微球；
d.采用吸附法将制备的磁性纳米微球与合成的分子信标分子信标复合物。
本发明分子信标复合物其使用方法：在200μL无血清的RPMI1640培养基中配制250nmol/L的miR-155分子信标，加入4μl脂质体，于37℃细胞培养箱内共同孵育20min；将含分子信标和脂质体的无血清RPMI1640培养基直接加到活肺癌细胞中，并于37℃细胞培养箱内避光孵育60min，再用Hochest33342(碧云天公司)染20min后应用激光共聚焦显微镜观察活肺癌细胞miR-155的表达。
共聚焦结果可见A549、SPC-A1肺癌细胞内可见较强的绿色荧光，位于胞浆和胞核内，背景很低。用Real-time PCR验证分子信标检测的miR-155表达的结果。通过细胞和组织miR-155表达水平的检测结果，说明本发明设计的分子信标的可行性和实用性。复合物DNase I保护实验和细胞蛋白孵育实验观察复合物的生物稳定性及释放效应，分子信标壳聚糖纳米复合物实时成像SPC-A1肺癌细胞，用激光共聚焦观察成像结果。这可进一步证实了miR-155分子信标的可行性和实用性。
上述分子信标复合物制备方法中b步骤采用的是溶胶一凝胶法制备磁性纳米Fe3O4颗粒，其优点是能够保证严格控制化学计量比，易实现高纯化；工艺简单，反应周期短，反应温度低；产物粒径小，分布均匀，分散性好。另外对b步骤生成的Fe3O4颗粒粉末可用TEM观察生成的Fe3O4纳米颗粒的形貌；用电子衍射(ED)和XRD测量其晶体的结构；用VSM测量其磁性；测量合格后，再进行c步骤。对c步骤最后分离出磁性纳米微球，可用用X射线仪观察磁性颗粒内Fe3O4磁核的晶形是否完整，并粗略计算Fe3O4的粒径.用透射电镜观察Fe3O4磁核和磁性颗粒的结构和形貌，用红外光谱仪测定磁性颗粒的官能团组成，用振动样品磁强计测定磁性颗粒的磁饱和强度。d步骤所述“吸附法”是指寡核苷酸探针或靶分子通过次级键(例如离子键)与固相基质表面相连并固定，或者是以非共价键作用将寡核昔酸探针或靶分子直接或恒电位吸附到固相基质的表面，或者由本发明探针中的磷酸根负离子与固相基质表面带正电荷的修饰层通过静电作用而固定。
如公从所知，本发明用于肺癌诊断的分子信标复合物中分子信标的发光基团为Alexa488、萃灭基团为BHQ1可等同替换为其他发光基团、萃灭基团(如发光基团Cy5、萃灭基团BHQ2)，此处不作具体限定，本发明所提供的仅是基于一个技术构思的最优方案。
对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，如这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
Claims (1)
1.一种用于肺癌诊断的分子信标复合物，其特征在于：包括磁性纳米微球以及吸附在磁性纳米微球上的分子信标，所述分子信标其序列为5’-Alexa488-CCAGCG-acc+Cct+Atca+Cgat+Tagcattaa-CGCTGG-BHQ1-3’，其中CCAGCG为5’端茎状序列，CGCTGG为3’端茎状序列，发光基团为Alexa488，萃灭基团为BHQ1，acc+Cct+Atca+Cgat+Tagcattaa为环状序列，其中环状序列中用大写表示的碱基是进行锁核酸修饰处理后的碱基；所述磁性纳米微球包括磁性纳米颗粒以及在包被磁性纳米颗粒表面的壳聚糖，所述磁性纳米微球是表面经聚乙二醇处理的磁性纳米微球。
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