CN102961345B

CN102961345B - 一种雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球的制备方法

Info

Publication number: CN102961345B
Application number: CN201210470282.2A
Authority: CN
Inventors: 李桂银; 周治德; 黄勇; 操良丽; 陈真诚
Original assignee: Guilin University of Electronic Technology
Current assignee: Guilin University of Electronic Technology
Priority date: 2012-11-20
Filing date: 2012-11-20
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2032-11-20
Also published as: CN102961345A

Abstract

本发明涉及一种雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球的制备方法。将合成的Fe₃O₄纳米颗粒加入液体石蜡油中，与羧甲基壳聚糖溶液混合，加入交联剂，采用磁分离收集纳米微球，经洗涤、干燥得到磁性羧甲基壳聚糖纳米微球；将制得的磁性羧甲基壳聚糖纳米微球配成水分散液，雷帕霉素溶于乙腈，搅拌，将二者混合；采用磁分离，下层沉淀用超纯水洗涤，经冷冻干燥、粉碎得到雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球。本发明制备的纳米载药微球具有靶向性强、载药量高、缓释性能好、粒径小、药物毒副作用低等特点，能显著提高雷帕霉素药物对肿瘤细胞的杀伤率；该方法工艺简单，制备条件温和，易于规模化生产。

Description

一种雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球的制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物功能材料在生物医学领域中的应用，尤其涉及一种用磁性羧甲基壳聚糖固定雷帕霉素制成纳米药物微球的方法。

背景技术

雷帕霉素（RAPA），是从吸水链霉菌的发酵液中分离出来的一种新型大环内酯类免疫抑制剂。它不仅具有抗移植免疫排斥反应，而且对前列腺癌、肾癌、乳腺癌、结肠癌及肝癌等还具有较强的抑制作用。RAPA能够通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的蛋白激酶催化活性以及磷脂酰肌3激酶(phosphoinositide—3 kinase，PI3 K)／Akt信号转导通路来调控基因表达、细胞生长和增殖，通过阻断不同的细胞因子受体信号传导，来阻断T淋巴细胞及其它细胞由G1期至S期的进程，从而发挥其免疫抑制效应。然而，临床给药发现雷帕霉素存在水溶性低(2.6ug/mL)、靶向性差及局部浓度过高等问题，同时易伴随骨髓抑制、高血脂、过度免疫抑制、腹泻、头疼等一系列的毒副反应，不利于连续化疗。因此，RAPA的临床应用受到了极大的限制。

为解决上述问题，开发新的分子靶向药物载体已成为当下学者们研究的热点，例如：S. Jhunjhunwala, G. Raimondi, A.W. Thomson, S.R. Little. Delivery of rapamycin to dendritic cells using degradable microparticles, J. Control Release[J].133 (2009) 191-197，通过单乳化蒸发法得到粒径为3.4μm的乳酸-羟基乙酸共聚物载雷帕霉素微米颗粒。此微球的平均粒径为3.4±1.65μm，药物包封率达73.95±5.43%，初步解决雷帕霉素的低水溶性和雷帕霉素的突释等问题，但是仍然存在某些不足：比如制备的雷帕霉素载药颗粒比较大，一方面阻碍了药物在血管内的流通，另一方面易导致载药微球被网状内皮组织吞噬，达不到治疗效果；载药微球靶向性差，不能准确的将药物定向输送至病变部位，仍然无法解决其对正常组织的损伤，达不到最佳治疗效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种靶向性强、载药量高、粒径较小、缓释性能好的雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球颗粒的制备方法，该载药微球颗粒具有超顺磁性，对肿瘤细胞具有较强的杀伤能力。

为了解决这个技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球的制备方法，包括如下步骤（未注明的用量和比例以质量计）：

1、制备磁性Fe₃O₄纳米颗粒，备用：

（1）将七水硫酸亚铁水溶液和PEG-20000水溶液混合，不断搅拌下加一定浓度的稀氨水至pH值为9.5~10.5，溶液呈现墨绿色；

（2）逐步加入双氧水溶液，使得溶液由墨绿色变为黑色；

（3）收集溶液并转移至高压反应釜，于160℃下恒温5h；

（4）采用磁分离，收集下层沉淀；先后用蒸馏水和无水乙醇洗涤，然后采用真空干燥10~20小时，干燥完成后研磨得到磁性Fe₃O₄纳米颗粒。

2、制备磁性羧甲基壳聚糖纳米微球，备用：

（1）将磁性Fe₃O₄纳米颗粒加到油相，搅拌分散均匀；

（2）将配好的羧甲基壳聚糖溶液作为水相缓慢加到油相中，搅拌混合均匀，得到混合液；

（3）向混合液中加入交联剂并继续搅拌反应一段时间；

（4）磁分离收集下层沉淀，先后用石油醚、丙酮洗涤，干燥得到磁性羧甲基壳聚糖纳米微球；

3、制备雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球：

（1）将制得的磁性羧甲基壳聚糖纳米微球配成一定浓度的水分散液作为水相；雷帕霉素溶于一定体积的乙腈液作为有机相；

（2）将有机相缓慢地加入水相中，搅拌10~20小时；

（3）先用超纯水洗涤，然后用磁分离收集所得微球；重复超纯水洗涤、磁分离步骤3-5次；

（4）将所得微球经冷冻干燥后粉碎，即得到粒径为30±2nm的雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球。

步骤1中所述的水浴温度优选30℃；所述稀氨水浓度优选8.3%（v/v）；所述双氧水加入量优选0.27ml。

步骤2中（1）所述的油相可以是含3%司盘-80的液体石蜡油；优选参数为超声时间10min，搅拌速度300rpm，时间5min；

步骤2中（2）所述的羧甲基壳聚糖溶液用去离子水配制得到，优选浓度为 2%（m/v）；所述油相和羧甲基壳聚糖溶液的用量体积比优选3：1；所述参数优选超声时间30min，搅拌速度500rpm，时间2h；

步骤2中（3）所述交联剂可以为25%的戊二醛溶液（v/v），用量为羧甲基壳聚糖用量的2.5倍，搅拌速度500rpm，时间为2h；

步骤2中（4）的下层沉淀先用石油醚洗涤2次，再用丙酮洗涤3~4次，优选60℃真空干燥12小时；

步骤3中（1）所述磁性羧甲基壳聚糖纳米微球的用量为雷帕霉素用量的8~12倍；磁性羧甲基壳聚糖纳米微球配成的水分散液的浓度为0.5%~1.0%。

步骤3中（2）所述水相的体积用量是有机相的10~20倍；

步骤3中（2）所述搅拌，其转速为600rpm~1500rpm，时间为10~15h；

步骤3中（4），优选方案是，真空冷冻干燥10~15h。

步骤3中（4），所述粉碎，可以是万能粉碎、超微粉碎、气流粉碎或者研磨。

所述磁性Fe₃O₄纳米颗粒和磁性羧甲基壳聚糖纳米微球的制备为现有技术。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1、由于磁性Fe₃O₄纳米微球的植入，使得雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球具有超顺磁性（见图4），可在外磁场引导下通过静脉、动脉导管和口服给药或直接注射等途径选择性地到达并定位于肿瘤靶区释放药物，提高雷帕霉素的靶向治疗作用。

2、由于本发明制作过程中温度、时间及搅拌速度的综合控制，使得雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球直径较小（30±2nm）、球形度好、载药量高、缓释性能好，还加强了药物的靶向治疗效果。

3、本发明的原料简单易得，所用到的羧甲基壳聚糖纳米材料及四氧化三铁纳米颗粒具有良好的生物相容特性，是作为载药包覆的优选材料。雷帕霉素药物难溶于水，由于羧甲基壳聚糖良好的亲水性，为雷帕霉素在肿瘤治疗中提供了高效、低毒的给药方式。

附图说明

图1. 雷帕霉素、磁性羧甲基壳聚糖纳米微球及雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球的红外图谱

图2. 雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球的TEM图

图3. 雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球的体外释放图谱

图4. 雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球的VSM图谱

图5. 雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球的细胞毒性实验（MTT）检测结果

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在实例中，除另有说明外，所有份数和百分比均按质量计。

实施例1

（1）准确称取0.4g羧甲基壳聚糖(CMCS)溶于20ml去离子水中，搅拌溶解后过滤，随后加入0.4g的Fe₃O₄纳米粒子，超声5min使其均匀分散；在250ml的三口瓶里加入60ml液体石蜡油（含1.8ml span-80），边搅拌边将羧甲基壳聚糖溶液缓慢逐滴的加入液体石蜡油中，混合液超声30min，500rpm充分搅拌反应两小时，缓慢逐滴加入2ml25%的戊二醛溶液，500rpm继续搅拌反应2h。磁分离，先用石油醚充分洗涤2-3次，随后用丙酮继续冲洗3次，以至得到干净的纳米颗粒，于真空干燥箱60℃干燥12h，得到Fe₃O₄/CMCS纳米颗粒，备用。

（2）准确称取100mg的Fe₃O₄/CMCS纳米颗粒，分散于14ml超纯水中；称取11.9mg的雷帕霉素（Rapa）溶于1ml乙腈液。然后将Rapa液缓慢逐滴的加入Fe₃O₄/CMCS纳米粒分散液中，磁搅拌子840rpm搅拌12小时。先超纯水洗涤，再磁分离；重复超纯水洗涤、磁分离步骤4次；用冷冻干燥设备，干燥10h后，研磨，得到了干燥的包覆有雷帕霉素药物的Fe₃O₄/CMCS-Rapa纳米颗粒（见图1）。合成的Fe₃O₄/CMCS-Rapa纳米微球平均粒径为30nm，粒度分布均匀，载药纳米颗粒呈规则的圆球形（见图2），平均包封率为62.9%，载药量为6.56%。此载药纳米颗粒在pH7.4的磷酸缓冲溶液中具有良好的缓释性能，在开始的20小时内释放了44%，随后达到一个缓释的过程，14天内累计释放量为93%（见图3）。磁滞回线表明，Fe₃O₄/CMCS-Rapa纳米微球的顺磁性没有因为药物的包覆受到较大影响（见图4）。细胞毒性实验也说明，雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球对人肝癌细胞Hep-G2较单纯的雷帕霉素具有更强的杀伤力，并且这种杀伤力呈剂量依赖性（见图5）。

实施例2

准确称取100mg实施例1制备的Fe₃O₄/CMCS纳米颗粒分散于15ml超纯水中；称取10mg的雷帕霉素（Rapa）溶于1ml乙腈液。然后将Rapa液缓慢逐滴的加入Fe₃O₄/CMCS纳米粒分散液中，磁搅拌子600rpm搅拌过夜。先超纯水洗涤，再磁分离；重复超纯水洗涤、磁分离步骤3次，于真空冷冻干燥设备干燥15h，粉碎，得到Fe₃O₄/CMCS-Rapa纳米颗粒。制出的Fe₃O₄/CMCS-Rapa纳米颗粒粒度分布均匀，载药纳米颗粒呈规则的圆球形，平均包封率为52.53%，载药量为5.2%。

实施例3

准确称取100mg实施例1制备的Fe₃O₄/CMCS纳米颗粒分散于15ml超纯水中；称取12.5mg的雷帕霉素（Rapa）溶于1ml乙腈液。然后将Rapa液缓慢逐滴的加入Fe₃O₄/CMCS纳米粒分散液中，磁搅拌子1500rpm搅拌过夜。先超纯水洗涤，再磁分离；重复超纯水洗涤、磁分离步骤5次，冷冻干燥12h，研磨，得到Fe₃O₄/CMCS-Rapa纳米颗粒。制出的Fe₃O₄/CMCS-Rapa纳米颗粒粒度分布均匀，载药纳米颗粒呈规则的圆球形，平均包封率为46.36%，载药量为6.32%。

Claims

1.一种雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球的制备方法，包括磁性Fe3O4纳米颗粒的制作，磁性羧甲基壳聚糖纳米微球的制作；所述磁性Fe3O4纳米颗粒制作步骤如下：

A、将七水硫酸亚铁水溶液和PEG-20000水溶液混合，不断搅拌下加一定浓度的稀氨水至pH值为9.5~10.5，溶液呈现墨绿色；

B、逐步加入双氧水溶液，使得溶液由墨绿色变为黑色；

C、收集溶液并转移至高压反应釜，于160℃下恒温5h；

D、采用磁分离，收集下层沉淀；先后用蒸馏水和无水乙醇洗涤，然后采用真空干燥10~20小时，干燥完成后研磨得到磁性Fe3O4纳米颗粒；

所述磁性羧甲基壳聚糖纳米微球制备步骤如下：

a. 将磁性Fe3O4纳米颗粒加到油相，搅拌分散均匀；

b. 将配好的羧甲基壳聚糖溶液作为水相缓慢加到油相中，搅拌混合均匀，得到混合液；

c. 向混合液中加入交联剂并继续搅拌反应一段时间；

d. 磁分离收集下层沉淀，先后用石油醚、丙酮洗涤，干燥得到磁性羧甲基壳聚糖纳米微球；

其特征在于：还包括如下步骤：未注明的用量和比例以质量计

（1）将制得的磁性羧甲基壳聚糖纳米微球配成水分散液作为水相，雷帕霉素溶于乙腈液作为有机相；所述的磁性羧甲基壳聚糖纳米微球的用量为雷帕霉素用量的8~12倍，，磁性羧甲基壳聚糖纳米微球配成的水分散液的浓度为0.5%~1.0%；

（2）将有机相缓慢地加入水相中，所述的水相体积用量是有机相体积用量的10~20倍；进行搅拌，其转速为600rpm~1500rpm，时间为10~20h；

（4）将所得微球经冷冻干燥，所述冷冻干燥时间为10~15h；粉碎，得到雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球，所述雷帕霉素/磁性羧甲基壳聚糖纳米载药微球的粒径为30±2nm。