CN104666251A - 一种半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒及制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒及制备方法与应用，制备为：取聚合物和疏水性药物，溶于有机溶剂中，搅拌，滴加到TPGS水溶液中，搅拌，减压挥发，离心，弃上清液，得载疏水性药物的聚合物初始纳米粒；将初始纳米粒重悬于Tris缓冲液中，加多巴胺盐酸盐反应，离心，得载疏水性药物的被聚多巴胺包裹的纳米粒；将载疏水性药物的被聚多巴胺包裹的纳米粒分散在弱碱水溶液中，加入肝癌靶向配体半乳糖胺，反应，离心，冷冻干燥得半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒。本发明方法简单，无污染。半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒具有良好肝脏靶向性、生物相容性以及生物可降解性，可靶向肝癌并有治疗作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒及其制备方法与应用。
背景技术
肝脏是人体最为关键的器官之一，参与体内消化、排泄、解毒和免疫调节等多个过程，因此肝脏也是人体最易受损的器官之一。然而，肝癌等疾病导致了大量的死亡，严重威胁人类的健康。肝癌治疗的方法迄今已经发展了有十几种之多，例如：化学治疗、放射疗法、外科手术、生物疗法、基因治疗、光动力学治疗、癌症疫苗等。发展比较早且使用广泛的治疗方法是化学治疗和放射疗法，其主要缺点在于：治疗手段对癌细胞的靶向性不高，不能有效区分癌细胞和正常细胞，特别是化疗及一些蛋白质药物具有很高的细胞毒性，在治疗的同时也对正常机体器官造成很大损伤。按照传统的给药方式，小分子药物在体内随机分布，真正蓄积到病患部位进而发挥药效的只是少部分药物，多数都被代谢排出体外，生物利用度很低。
靶向性药纳米物传递是一种既可以提高治疗靶向性又比较容易实现的治疗途径，主要依靠药物分子通过靶向特异性到达病变部位，杀灭致病病毒、修复受损组织或消除疾病症状。概括而言，靶向性药物输送体系具有如下主要优点：高度靶向性，减少毒副作用；增加非水溶性药物在体内的分散量，稳定药物在体内的存在；浓集药物并能够调节药物的释放速度；改变药物给药途径，如将需要静脉注射的药物制成方便的口服药物。目前关于体内靶向功能的药物载体成功用于临床报道极其少见，导致靶向药物的临床应用进展缓慢。
聚合物纳米粒子(NPs)由于其靶向缓释、控释的特点，被公认为是一种优良的抗癌药物载体系统。聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)(PEG-PLGA)等生物可降解的药物载体，具有良好的生物相容性、生物可降解性及抗张强度，在人体无毒，无积累，因此它在生物医学领域具有很诱人的应用前景和极高的商业价值，广泛应用于负载抗癌药的纳米药物。但是这种纳米药物不具有主动靶向的功能。肝癌靶向治疗已经成为癌症纳米技术领域非常重要的研究方向。与正常细胞相比，肿瘤细胞表面常会出现一些受体的表达异常，这为靶向治疗提供了基础。
肝肿瘤细胞表面存在特异的去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein Receptor，ASGPR)，可专一性识别端基含有半乳糖的载体(如半乳糖胺)，并与之特异性结合，通过细胞内吞作用进入肝癌细胞并释放药物。靶向配体的导入要求纳米粒子表面有可链接的反应官能团，在纳米药物表面修饰一层聚多巴胺(polydopamine，pD)被认为是一种在纳米药物表面引入化学反应官能团较简单的方法，多巴胺的分子结构如下：
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒。
本发明的第二个目的是提供一种半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)按比例，称取100mg聚合物和2-20mg的疏水性药物，溶于8-10ml有机溶剂中，在搅拌条件下，滴加到100ml的0.3-10mg/L的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯水溶液中，搅拌6～24小时，减压挥发除去有机溶剂，10000～20000rpm离心15-30min，弃上清液，用去离子水洗涤，沉淀为载疏水性药物的聚合物初始纳米粒；
(2)按1mg-10mg:1mL的比例将所述初始纳米粒重悬于10mM，pH＝8.5的Tris缓冲液中，加入多巴胺盐酸盐使浓度为0.2～1.0mg/mL，反应3～12小时，10000～20000rpm离心15-30min，收集沉淀，用去离子水洗涤，获得载疏水性药物的被聚多巴胺包裹的纳米粒；
(3)按1mg-10mg:1mL的比例将载疏水性药物的被聚多巴胺包裹的纳米粒分散在pH为8.5～12的弱碱水溶液中，加入肝癌靶向配体半乳糖胺使浓度为0.1-10mg/mL，反应1～3小时，10000～20000rpm离心15-30min，收集纳米粒子，用去离子水洗涤，冷冻干燥得半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒。
聚合物选自聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、聚己内酯、聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)或聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乳酸。
疏水性药物选自紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、香豆素-6、顺铂、5-氟尿嘧啶、喜树碱、布洛芬或10-羟基喜树碱。
有机溶剂为丙酮、二氧六环、二甲基亚砜、二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺。
弱碱水溶液为PBS缓冲溶液、Tris缓冲溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢纳水溶液或氢氧化钠水溶液。
上述方法制备的半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒。
上述半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒在制备恶性肝癌治疗药物的应用。
本发明的半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒的制备方法简单，无污染。所获得的半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒具有良好肝脏靶向性、生物相容性以及生物可降解性，实验证明，可靶向肝癌，并对肝癌有治疗作用。
附图说明
图1为动态光散射测的实施例1制备的半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒Gal-pD-TPGS-PLA/NPs(载多烯紫杉醇)粒度分布。
图2为实施例1制备的半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒Gal-pD-TPGS-PLA/NPs(载多烯紫杉醇)的场发射扫描电子显微镜(FESEM)图谱。
图3为实施例1制备的半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒Gal-pD-TPGS-PLA/NPs(载多烯紫杉醇)的透视电子显微镜(TEM)图谱。
图4为载多烯紫杉醇(DTX)的TPGS-PLA/NPs、pD-TPGS-PLA/NPs、Gal-pD-TPGS-PLA/NPs的差示扫描量热分析曲线(DSC)。
图5为载多烯紫杉醇TPGS-PLA/NPs、pD-TPGS-PLA/NPs、Gal-pD-TPGS-PLA/NPs的体外粒释放曲线。
图6为载多烯紫杉醇TPGS-PLA/NPs、pD-TPGS-PLA/NPs、Gal-pD-TPGS-PLA/NPs与空白TPGS-PLA、pD-TPGS-PLA、Gal-pD-TPGS-PLA纳米粒(与载药纳米粒相同纳米粒悬液浓度)24小时内对HepG2细胞的细胞活性实验结果，商品化的多烯紫杉醇制剂泰素帝做对比。
图7为载多烯紫杉醇TPGS-PLA/NPs、pD-TPGS-PLA/NPs、Gal-pD-TPGS-PLA/NPs与空白TPGS-PLA、pD-TPGS-PLA、Gal-pD-TPGS-PLA纳米粒(与载药纳米粒相同纳米粒悬液浓度)48小时内对HepG2细胞的细胞活性实验结果，商品化的多烯紫杉醇制剂泰素帝做对比。
图8为载多烯紫杉醇纳米粒对肿瘤的抑制效果图。
图9为载多烯紫杉醇纳米粒对小鼠体重变化率与治疗时间的曲线图。
图10为激光共聚焦扫描电子显微镜(CLSM)观察用TPGS-PLA、pD-TPGS-PLA、Gal-pD-TPGS-PLA共聚物制备的载香豆素-6纳米粒孵育1小时的HepG2细胞。细胞核用DAPI染成蓝色，载香豆素-6纳米颗粒是绿色的，分别通过EGFP通道和DAPI通道观察细胞摄取情况。
图11为荧光酶标仪检测的TPGS-PLA、pD-TPGS-PLA、Gal-pD-TPGS-PLA共聚物制备的载香豆素-6纳米粒孵育2小时的HepG2细胞摄取效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
聚乳酸(PLA)、
聚乙醇酸(PGA)、
聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、
聚己内酯(PCL)、
聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)(PEG-PLGA)
聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乳酸)(TPGS-PLA)
实施例1
一种半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取100mg聚合物TPGS-PLA和10mg的多烯紫杉醇粉末，溶于8ml丙酮中，在搅拌条件下，滴加到100ml的0.3mg/L的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)水溶液中，搅拌6小时，减压挥发除去丙酮，20000rpm离心15min，弃上清液，用去离子水洗涤三次，以除去乳化剂TPGS和游离的多烯紫杉醇，沉淀为载多烯紫杉醇的初始纳米粒TPGS-PLA/NPs；
(2)按5mg:1mL的比例将所述初始纳米粒TPGS-PLA/NPs重悬于10mM，pH＝8.5的Tris缓冲液中，加入多巴胺盐酸盐使浓度为0.5mg/mL，反应3小时，10000rpm离心30min，收集沉淀，用去离子水洗涤三次，以除去未反应的多巴胺盐酸盐，获得载多烯紫杉醇的被聚多巴胺包裹的纳米粒pD-TPGS-PLA/NPs；
(3)按5mg:1mL的比例将步骤(2)获得的pD-TPGS-PLA/NPs分散在pH为8.5的碳酸氢钠水溶液中，加入肝癌靶向配体半乳糖胺(Gal)使浓度为5mg/mL，反应1小时，10000rpm离心30min，收集纳米粒子，用去离子水洗涤，冷冻干燥得半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒Gal-pD-TPGS-PLA/NPs(载多烯紫杉醇(Docetaxel,DTX))。
步骤(1)，步骤(2)，步骤(3)获得的纳米粒的Zeta电位(Zetasizer Nano ZS)分别在-10mV左右，表面电荷的绝对值比较高，颗粒之间相互排斥作用较强，因而在分散相中高度稳定。三种纳米粒子的载药量分别为8.23％、8.07％、7.69％，包封率分别为89.68％、89.25％、88.47％。
如图1所示，动态光散射测的实施例1制备的纳米粒Gal-pD-TPGS-PLA/NPs(载多烯紫杉醇)粒度分布较均匀，平均粒径大约在200nm左右。
如图2所示，实施例1制备的纳米粒Gal-pD-TPGS-PLA/NPs(载多烯紫杉醇)的扫描电镜结果，可以看出纳米粒子大小较均一，呈球形，粒径大约在200nm左右。
如图3所示，实施例1制备的纳米粒Gal-pD-TPGS-PLA/NPs(载多烯紫杉醇)的透视电镜结果，可以看出纳米粒子较光滑，呈球形，粒径大约在200nm左右。
实施例1制备载多烯紫杉醇TPGS-PLA/NPs,聚多巴胺修饰的pD-TPGS-PLA/NPs,半乳糖胺和聚多巴胺修饰的Gal-pD-TPGS-PLA/NPs的差热分析曲线见图4，由图4可见，被聚合物包裹的多烯紫杉醇纳米粒三种纳米粒在169℃没有出现熔融吸热峰，表明化疗药多烯紫杉醇在纳米粒以一种无定形态或固溶体状态存在于纳米粒中。
如图5所示，透析法测定纳米粒的粒缓释曲线，实施例1各步骤获得的三种纳米粒子各15mg分别分散于5ml释放介质PBST溶液(由8.5g NaCl、2.2g Na2HPO4、0.3g NaH2PO4、1.0g吐温-80和去离子水1000ml组成，并经高压灭菌而得。)中，形成悬液。将纳米颗粒悬液置于透析袋中，封好袋口。密闭的透析袋放入50ml离心管中，加入15ml PBST，置于恒温水浴摇床中于37℃，120rpm振荡。在一定时间间隔内，从离心管中取出10ml溶液用于分析，同时补充等量的新鲜PBST于离心管中。收集的样品中加入2ml二氯甲烷萃取，弃去水相。萃取得到的样品经溶解于5ml流动相乙腈：水(50/50，V/V)，通入N2使二氯甲烷挥发，直至溶液变澄清，滤器过滤，然后加入流动相，定容至10ml。流动相使用前经0.45μm滤膜过滤，并超声处理。每次进样20μl，HPLC测定样品的峰面积，测试条件和测包封率时所用HPLC的条件相同。根据数据绘制载药纳米颗粒体外释放曲线，所得结果见图5。图5显示载多烯紫杉醇TPGS-PLA/NPs、pD-TPGS-PLA/NPs、Gal-pD-TPGS-PLA/NPs的体外粒释放曲线，由图可见，14天后，三种纳米粒产品的体外粒释放率分别达到了41.14％,41.11％and41.81％，三种纳米粒具有相似的释放曲线，呈两相释放特征并伴随初始的“突释效应”，易满足临床要求。
如图6和图7分别为纳米粒在24小时和48小时对肝癌细胞HepG2的细胞毒性结果，采用MMT发测定该纳米粒子的细胞毒性：将HepG2细胞(ATCC,Rockville,MD)接种于96孔细胞培养板中，细胞培养24h贴壁后，弃去陈旧培养基，用PBS冲洗一次，加入待测样品、阳性对照、阴性对照分别培养24h、48h。在规定的时间间隔后，弃去陈旧培养基，用PBS冲洗一次，每孔加入100μl含MTT 1mg/ml的细胞培养基，37℃孵育4h后，弃去MTT，每孔加入100μl的二甲基亚砜(DMSO)，黑暗37℃培养2h，振荡10min，用酶标仪测定570nm波长的吸光度。
结果表明，不载药的三种纳米粒具有良好的生物相容性，因为在不同纳米粒悬液浓度下它对HepG2细胞均没有明显的毒性；而载多烯紫杉醇三种纳米粒具有明显的细胞毒性，并且细胞毒性大于商品化的多烯紫杉醇制剂泰素帝
此外，MTT实验结果说明载多烯紫杉醇的TPGS-PLA/NPs、pD-TPGS-PLA/NPs、Gal-pD-TPGS-PLA/NPs对HepG2细胞的毒性具有时间和浓度依赖性。
图8显示的是载多烯紫杉醇的三种纳米粒子(TPGS-PLA/NPs、pD-TPGS-PLA/NPs、Gal-pD-TPGS-PLA/NPs)体内抑制肿瘤生长的效果。将实验动物(4-5周龄)随机分为五组，每只动物右侧腋下注射2×106HepG2细胞，待肿瘤长到体积约50mm3左右的时候开始腹腔注射治疗，一组注射saline作为空白对照，一组注射商业化的其他三组分别注射载DTX的TPGS-PLA/NPs、pD-TPGS-PLA/NPs、Gal-pD-TPGS-PLA/NPs，分别在0,4,8,12天进行注射，14天后将实验动物处死，分离出移植瘤。如图8所示，可以看出和三种纳米粒子都较为明显的抑制了肿瘤的生长，三种纳米粒子的抑制效果要比抑制效果好，其中载DTX的Gal-pD-TPGS-PLA表现出最好的治疗效果。图9为五组动物在注射粒后的体重变化曲线，可以看出注射了纳米粒子的三个实验组的动物体重都没有出现明显的下降，进一步说明制备的纳米粒子具有较好生物相容性，具备临床应用的基础。
实施例2
一种半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取100mg聚合物TPGS-PLA和2mg香豆素-6，溶于8ml二氯甲烷中，在搅拌条件下，滴加到100ml的0.3mg/L的TPGS水溶液中，搅拌24小时，减压挥发除去二氯甲烷，20000rpm离心15min，弃上清液，用去离子水洗涤三次以除去乳化剂TPGS和游离的香豆素-6，沉淀为载香豆素-6的初始纳米粒TPGS-PLA/NPs；
(2)按1mg:1mL的比例将所述初始纳米粒TPGS-PLA/NPs重悬于10mM，pH＝8.5的PBS缓冲溶液中，加入多巴胺盐酸盐使浓度为0.2mg/mL，反应5小时，20000rpm离心15min，收集沉淀，用去离子水洗涤三次，以除去未反应的多巴胺盐酸盐，获得载香豆素-6的被聚多巴胺包裹的纳米粒pD-TPGS-PLA/NPs；
(3)按1mg:1mL的比例将步骤(2)获得的pD-TPGS-PLA/NPs分散在pH为10的PBS缓冲液中，加入肝癌靶向配体半乳糖胺(Gal)使浓度为10mg/mL，反应2小时，20000rpm离心15min，收集纳米粒子，用去离子水洗涤，冷冻干燥得半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒Gal-pD-TPGS-PLA/NPs(载香豆素-6)。
将HepG2细胞悬液均匀接种于6孔细胞培养板中，再加入1ml培养基，37℃、5％CO2孵箱中培养24h。于HepG2细胞中加入25μg/ml的载香豆素-6纳米颗粒，继续培养1h。另外，在Gal-pD-TPGS-PLA/NPs组同时加入半乳糖胺作为受体竞争实验观测细胞对纳米粒子的摄取情况，来观察Gal-pD-TPGS-PLA/NPs的靶向情况。纳米粒子与细胞孵育相应的时间后，去除培养基，用冰冷的PBS冲洗三次，加入甲醇固定细胞20min，弃去甲醇，加入DAPI染液孵育5min，再用PBS冲洗三次，可以在细胞摄取实验中通过对细胞核的定位来确定载香豆素-6纳米粒在细胞中的位置。
图10是用激光共聚焦扫描电子显微镜观察HepG2细胞对载香豆素-6的三种纳米颗粒(PEG-PLA/NPs、pD-PEG-PLA/NPs和Gal-pD-PEG-PLA/NPs)的摄取结果。从图中可以看出，仅仅在与细胞孵育1h后，纳米粒就已经被细胞所摄取，并且加入载香豆素-6的半乳糖胺和聚多巴胺修饰的Gal-pD-TPGS-PLA/NPs一组，显示出最强的荧光信号。但是当Gal-pD-TPGS-PLA/NPs同时加入半乳糖胺后，则荧光减弱。这些结果表明制备的Gal-pD-TPGS-PLA/NPs有较好的肝脏靶向性。
为了将细胞对三种纳米粒子的摄取进行定量分析，将HepG2细胞种于96孔细胞培养板中，细胞密度为2×104/孔，培养过夜后加入HBSS溶液孵育1h后，分别加入50、100、500μg/ml的载香豆素-6的三种纳米粒子，孵育2h后,去掉培养基，用冰浴的PBS洗三次，用含0.5％的Triton X-100和0.2mol/l NaOH的裂解液裂解细胞，用荧光酶标仪进行荧光值的测量。图11是HepG2细胞对三种载药纳米粒的摄取率,可以看出摄取结果与图10相符。
实施例3
一种半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取100mg聚合物PLGA和20mg紫杉醇粉末，溶于10ml二氧六环中，在搅拌条件下，滴加到100ml的10mg/L的TPGS水溶液中，搅拌12小时，减压挥发除去二氧六环，15000rpm离心15min，弃上清液，用去离子水洗涤三次以除去乳化剂TPGS和游离的紫杉醇，沉淀为载紫杉醇的初始纳米粒PLGA/NPs；
(2)按10mg:1mL的比例将所述初始纳米粒PLGA/NPs重悬于10mM，pH＝8.5的Tris缓冲液中，加入多巴胺盐酸盐使浓度为1.0mg/mL，反应12小时，15000rpm离心20min，收集沉淀，用去离子水洗涤三次，以除去未反应的多巴胺盐酸盐，获得载紫杉醇的被聚多巴胺包裹的纳米粒pD-PLGA/NPs；
(3)按10mg:1mL的比例将步骤(2)获得的pD-PLGA/NPs分散在pH为10的Tris缓冲溶液中，加入肝癌靶向配体半乳糖胺(Gal)使浓度为0.1mg/mL，反应3小时，10000rpm离心30min，收集纳米粒子，用去离子水洗涤，冷冻干燥得半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒Gal-pD-PLGA/NPs(载紫杉醇)。
实验证明，本实施例所获得的半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒Gal-pD-PLGA/NPs的表征数据与实施例1无实质性差别。
实施例4
一种半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取100mg聚合物PCL和2mg阿霉素粉末，溶于10ml二甲基亚砜中，在搅拌条件下，滴加到100ml的1mg/L的TPGS水溶液中，搅拌24小时，减压挥发除去二甲基亚砜，20000rpm离心15min，弃上清液，用去离子水洗涤三次以除去乳化剂TPGS和游离的阿霉素，沉淀为载阿霉素的初始纳米粒PCL/NPs；
(2)按5mg:1mL的比例将所述初始纳米粒PCL/NPs重悬于10mM，pH＝8.5的Tris缓冲液中，加入多巴胺盐酸盐使浓度为0.5mg/mL，反应3小时，15000rpm离心20min，收集沉淀，用去离子水洗涤三次，以除去未反应的多巴胺盐酸盐，获得载阿霉素的被聚多巴胺包裹的纳米粒pD-PCL/NPs；
(3)按2mg:1mL的比例将步骤(2)获得的pD-PCL/NPs分散在pH为10的碳酸纳水溶液中，加入肝癌靶向配体半乳糖胺(Gal)使浓度为1mg/mL，反应2小时，15000rpm离心20min，收集纳米粒子，用去离子水洗涤，冷冻干燥得半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒Gal-pD-PCL/NPs(载阿霉素)。
实验证明，本实施例所获得的半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒Gal-pD-PCL/NPs的表征数据与实施例1无实质性差别。
实施例5
一种半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取100mg聚合物PLA和10mg10-羟基喜树碱粉末，溶于8ml乙腈中，在搅拌条件下，滴加到100ml的0.3mg/L的TPGS水溶液中，搅拌24小时，减压挥发除去乙腈，10000rpm离心30min，弃上清液，用去离子水洗涤三次以除去乳化剂TPGS和游离的10-羟基喜树碱，沉淀为载10-羟基喜树碱的初始纳米粒PLA/NPs；
(2)按2mg:1mL的比例将所述初始纳米粒PLA/NPs重悬于10mM，pH＝8.5的Tris缓冲液中，加入多巴胺盐酸盐使浓度为0.5mg/mL，反应3小时，20000rpm离心15min，收集沉淀，用去离子水洗涤，获得载10-羟基喜树碱的被聚多巴胺包裹的纳米粒pD-PLA/NPs；
(3)按2mg:1mL的比例将步骤(2)获得的pD-PLA/NPs分散在pH为9的碳酸钠水溶液中，加入肝癌靶向配体半乳糖胺(Gal)使浓度为1mg/mL，反应2小时，15000rpm离心20min，收集纳米粒子，用去离子水洗涤，冷冻干燥得半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒Gal-pD-PLA/NPs(载10-羟基喜树碱)。
实验证明，本实施例所获得的半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒Gal-pD-PLA/NPs的表征数据与实施例1无实质性差别。
实施例6
一种半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取100mg聚合物PGA和20mg5-氟尿嘧啶，溶于10mlN,N-二甲基甲酰胺中，在搅拌条件下，滴加到100ml的1mg/L的TPGS水溶液中，搅拌12小时，减压挥发除去N,N-二甲基甲酰胺，20000rpm离心15min，弃上清液，用去离子水洗涤三次以除去乳化剂TPGS和游离的5-氟尿嘧啶，沉淀为载5-氟尿嘧啶的初始纳米粒PGA/NPs；
(2)按2mg:1mL的比例将所述初始纳米粒PGA/NPs重悬于10mM，pH＝8.5的Tris缓冲液中，加入多巴胺盐酸盐使浓度为1.0mg/mL，反应3小时，20000rpm离心15min，收集沉淀，用去离子水洗涤，获得载5-氟尿嘧啶的被聚多巴胺包裹的纳米粒pD-PGA/NPs；
(3)按2mg:1mL的比例将步骤(2)获得的pD-PGA/NPs分散在pH为10的碳酸氢钠水溶液中，加入肝癌靶向配体半乳糖胺(Gal)使浓度为1mg/mL，反应2小时，15000rpm离心20min，收集纳米粒子，用去离子水洗涤，冷冻干燥得半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒Gal-pD-PGA/NPs(载5-氟尿嘧啶)。
实验证明，本实施例所获得的半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒Gal-pD-PGA/NPs的表征数据与实施例1无实质性差别。
实验证明，用聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)即PEG-PLGA替代本实施例的PGA，其它同本实施例，得到的半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒Gal-pD-PEG-PLGA/NPs的表征数据与实施例1无实质性差别。
本实施例中的有机溶剂还可以采用四氢呋喃。
Claims (7)
1.一种半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)按比例，称取100mg聚合物和2-20mg的疏水性药物，溶于8-10ml有机溶剂中，在搅拌条件下，滴加到100ml的0.3-10mg/L的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯水溶液中，搅拌6～24小时，减压挥发除去有机溶剂，10000～20000rpm离心15-30min，弃上清液，用去离子水洗涤，沉淀为载疏水性药物的聚合物初始纳米粒；
(2)按1mg-10mg:1mL的比例将所述初始纳米粒重悬于10mM，pH＝8.5的Tris缓冲液中，加入多巴胺盐酸盐使浓度为0.2～1.0mg/mL，反应3～12小时，10000～20000rpm离心15-30min，收集沉淀，用去离子水洗涤，获得载疏水性药物的被聚多巴胺包裹的纳米粒；
(3)按1mg-10mg:1mL的比例将载疏水性药物的被聚多巴胺包裹的纳米粒分散在pH为8.5～12的弱碱水溶液中，加入肝癌靶向配体半乳糖胺使浓度为0.1-10mg/mL，反应1～3小时，10000～20000rpm离心15-30min，收集纳米粒子，用去离子水洗涤，冷冻干燥得半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述聚合物为聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、聚己内酯、聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)或聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乳酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述疏水性药物为紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、香豆素-6、顺铂、5-氟尿嘧啶、喜树碱、布洛芬或10-羟基喜树碱。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述有机溶剂为丙酮、二氧六环、二甲基亚砜、二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述弱碱水溶液为PBS缓冲溶液、Tris缓冲溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢纳水溶液或氢氧化钠水溶液。
6.权利要求1-5之一的方法制备的半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒。
7.权利要求6的半乳糖胺和聚多巴胺修饰的肝癌靶向纳米粒在制备恶性肝癌治疗药物的应用。
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