KR101455921B1 - 수난용성 약물을 내부에 포함하는 알부민 나노입자 제조방법 - Google Patents

수난용성 약물을 내부에 포함하는 알부민 나노입자 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수용액상에서의 가용화 및 안정화를 통해 생체 내 전달을 매개할 수 있는 수난용성 약물을 내부에 포함하는 비펩타이드성 중합체와 알부민 회합체 나노입자 제조방법에 관한 것으로, 특히 유기용매만을 사용하더라도 비펩타이드성 중합체와 알부민 회합체 및 수난용성 약물의 동시 용해가 가능하므로 별도의 화학적 또는 물리적인 작용을 가하지 않더라도 두 성분의 혼합이 잘 이루어지게 되는 특징이 있다.
또한, 본 발명에 따른 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 나노입자 제조방법은, 계면활성제, 가용화제를 포함하지 않으므로, 수난용성 약물의 제제화에 의한 과민반응 또는 독성반응을 일으키지 않는 동시에 환자의 순응도를 높일 수 있는 장점이 있다. 또한 다양한 수난용성 약물 뿐만 아니라, 영상/진단용 무기나노입자의 안정화 등에도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

수난용성 약물을 내부에 포함하는 알부민 나노입자 제조방법{Albumin nanoparticles containing poorly water soluble drugs and its preparation method and application thereof}
본 발명은 수용액상에서의 가용화 및 안정화를 통해 생체 내 전달을 매개할 수 있는 수난용성 약물을 내부에 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 나노입자 제조방법에 관한 것이다.
질환의 치료를 위해 사용되는 약리학적 활성물질에 있어 많은 수가 수난용이며, 약물의 수용해도를 높이기 위해 생체 내 투여시 자극성 또는 독성을 유발할 수 있는 다양한 계면활성제를 포함한 가용화제 또는 유기용매와 제제화 되거나 유화안정화제와 함께 제형화 된다. 예를 들어 식물유래 항암제인 파클리탁셀은 소수성이 매우 높은 수난용성 약물로서 크레모포어(Cremophor EL)와 에탄올의 공용매에 가용화 시킴으로써 주사제형으로 만들어진다. 그러나 크레모포어는 알러지반응을 포함하는 심각한 과민반응을 일으킬 수 있어 스테로이드, H2-길항제, 항히스타민의 투여를 통한 치료 전 준비과정이 필요하며, 심각한 급성 알러지 반응을 피하기 위해 3시간 내지 24시간 이상의 투여시간이 필요하다. 따라서 긴 주입시간에 의한 환자의 불편함과 함께 투여시간 동안의 환자 모니터링, 준비과정 및 주사과정은 입원에 많은 추가 비용이 필요하게 된다.
이러한 심각한 부작용을 줄이기 위해 고분자 미셀 혹은 미세구를 수난용성 항암제의 전달체로 이용하는 방법과 항암제를 친수성 고분자에 결합시킴으로써 사용하는 방법 등이 연구되었다. 이중 미셀 혹은 미세구를 전달체로 이용하는 경우는 주로 친수성과 소수성 블록을 하나의 사슬에 지니고 있는 양친성 공중합체가 수용액상에서 열역학적으로 안정한 core-shell 구조를 지니는 콜로이드입자를 형성할 수 있는 성질을 이용하여 미셀 또는 자가응집체 내부의 소수성 core에 수난용성 약물을 봉입하여 전달할 수 있는 기술들이 개발되었다.
생체내 물질인 단백질을 이용한 미소구는 약물 또는 진단제의 전달체로서의 용도가 보고되었다. 다양한 생체 단백질 중 알부민은 그 분리 기술이 잘 확립되어있으며, 혈액 내 혈장 단백질 중 약 70 %를 차지하여 분리 및 사용에 있어 여타 단백질에 비해 경제성이 높으며 취득이 용이할 뿐 아니라 높은 생체적합성으로 인해 투여 즉시 생체 내에서 이용할 수 있는 전달체이며 주사제를 비롯한 다양한 투여 제형을 제공할 수 있다. 그 예로 유화 및 가교제인 글루타르알데히드를 이용한 화학적 가교결합에 의한 알부민 미소구의 제조법(미국특허 4,671,954)과 유화 혼합물을 100℃ 내지 150℃에서 가열하여 미소구를 생성하는 열변성 제조법(Leucuta et al., International Journal of Pharmaceutics 41:213-217 (1988))등이 제안되었다.
그러나 이러한 미소구 제조방법은 유중수 에멀전의 수성상에서 열변성 또는 가교결합을 형성하여 입자를 형성해야하는 기술적 한계로 인해 수용성 물질의 포접에는 적합하나 수난용성 물질의 담체로서는 적합하지 않은 한계가 있다.
또한 폴리락타이드 등의 공중합체를 수난용성 약물과 유기상에 용해시키고 수상에 도입시켜 유중수 에멀전으로 유화시킴으로써 나노입자를 만들고, 이때 알부민을 표면 안정화를 위한 계면활성제로 사용하는 제조법이 문헌에 제시되어있다 (Bazile et al., Biomaterials, 13:1093 (1992)).
아브락시스 바이오사이언스(Abraxis, 미국)는 수난용성 항암제인 파클리탁셀을 알부민에 화학적으로 접합시켜 기존 탁솔®의 문제점인 크레모포어를 사용하지 않는 대안적인 단백질 안정화 나노제형 아브락산®을 개발하였다.
또한, 비보렉스(VivoRX, 미국)는 특정 유/수 에멀전 조건에서 고압, 고전단력을 이용하여 크레모포어 또는 계면활성제를 사용하지 않고도 수난용성 약물을 포접한 나노입자 캅솔®을 개발하였다(미국특허 5,439,686, 대한민국특허 10-0923172).
다만, 상기의 아브락산® 및 캅솔®의 제조방법은 수난용성 약물의 화학적 결합방식과 에멀전상에서의 고압, 고전단력을 이용하여야 하는바, 제조시에 화학적 결합을 일으키도록 반응기를 조절하여야 하는 문제점과 고압, 고전단력을 이용하여 나노입자를 제조하는 바, 약물의 안정도가 낮아지며 시간 및 비용이 증가하는 문제점이 있었다.
또한, 중국 특허출원 공개번호 101543630에 의하면 소수성 블록과 친수성 블록을 동시에 특정 공중합체 또는 단백질에 도입하여 양친매성을 부여하는 기술이 알려져 있으나, 이에 따르면 첨가하는 재료가 늘어나서 반응이 복잡해지는 문제점이 있었다. 따라서, 추가 소수성기의 도입 없이 수난용성 약물을 안정화시키는 기술이 필요한 실정이었다.
이에, 본 발명자들은 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체를 사용할 경우 계면활성제를 사용하거나, 화학적 결합방식과 에멀전상에서의 고압, 고전단력을 이용하지 않고도 유기용매에서도 용해도가 높으며 특히 수난용성 약물과 회합체를 형성할 수 있다는 것을 확인하였다.
또한, 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체를 제조한 후 유기용매를 제거한 후 친수성 용매를 첨가하여 용매확산법 및 필름형성법등의 간단한 나노입자 제조방법에 의해서 자기조립에 의한 수난용성 약물을 포함하는 나노입자를 형성할 수 있음을 확인하였으며, 상기 방법으로 제조된 수난용성 약물을 포함하는 나노입자는 기존에 공지된 항암제를 포함하는 알부민 나노입자에 비해 항암제가 잘 전달되어 항암효과가 우수하다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 기존의 수난용성 약물 또는 생체영상용 무기나노입자의 생체 내 전달을 위한 나노입자의 제조방법으로서 계면활성제를 사용하거나 또는 화학적 결합방식과 에멀전상에서의 고압, 고전단력을 이용하던 문제점을 해소하기 위한 것이다.
본 발명은 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체를 제조하고 이를 유기용매에 수난용성 약물과 일정한 몰비로 용해시킨 후 유기용매를 제거하고 친수성용매에서 자기조립에 의한 나노입자를 형성하는 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
또한 본 발명에 의해서 제조된 비펩타이드성 중합체와 알부민 회합체 나노입자는 수용액상에서의 가용화 및 안정화를 통해 생체 내 전달을 매개할 수 있으므로 수난용성 약물 또는 생체영상용 무기나노입자의 담체로 사용될 수 있는바 본 발명은 상기 제조 방법에 의해서 제조된 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체 나노입자를 제공하기 위한 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 비펩타이드성 중합체를 알부민과 혼합하여 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체를 형성하는 제1단계;
유기용매 상에, 수난용성 약물 또는 생체영상용 무기나노입자, 및 상기 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체를 용해하여 혼합물을 제조하는 제2단계; 및
상기 혼합물의 유기용매를 제거하고 친수성 용매을 첨가하여 자기조립에 의해서 나노입자로 제조하는 제3단계를 포함하는,
수난용성 약물 또는 생체영상용 무기나노입자를 내부에 포함하는 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체 나노입자를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 단계 1은 비펩타이드성 중합체를 알부민과 혼합하여 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체를 형성하는 단계로서, 비펩타이드성 중합체를 알부민과 혼합하기 위해서 비펩타이성 중합체가 알부민의 아민기와 반응할 수 있는 치환기로 치환되어 있을 수 있다. 이때, 알부민의 아민과 반응할 수 있는 반응기는 N-히드록시숙신이미드, 숙신 이미딜 숙시네이트, 숙신 이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 부타노에이트, 벤조트리아졸 카보네이트, 알데히드 및 카테콜로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되진 않는다.
본 발명에서 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥사졸린, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리사카리드, 덱스트란, 폴리 비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 에틸 에테르, 폴리아크릴 아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리시아노아크릴레이트, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산, 헤파린 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에서는 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 것이 바람직하고, 이러한 폴리에틸렌 글리콜의 유도체를 사용할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 유도체는 직선형 또는 가지형이며 가지형은 둘 이상의 다중기를 갖을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 알부민은 인간유래 혈청알부민(human albumin, HSA)인 것이 바람직하다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 비펩타이드성 중합체와 알부민의 몰비는 5:1 내지 50:1인 것이 바람직하다.
본 발명에서 비펩타이드성 중합체의 분자량은 750Da 내지 300,000Da의 범위에서 선택되는 것이 바람직하다.
상기 단계 1에서 비펩타이드성 중합체는 알부민 단백질의 친수성 도메인에 위치한 아민기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있다. 비펩타이드성 중합체는 친수성 고분자임에도 불구하고 수용매 뿐만 아니라 다양한 종류의 유기용매에서도 매우 높은 용해도를 나타낼 수 있다. 더 나아가서 단계 1에 의해서 제조된 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체는 알부민 단백질의 친수성 도메인에 비펩타이드성 중합체가 결합되어 있으므로 알부민 단백질의 친수성 영역은 줄어들고 소수성 영역이 남아 있게 되는바, 비펩타이드성 중합체만을 사용하는 경우와 비교하여 회합체를 형성함으로서 유기용매에 대한 용해도를 더욱 높일 수 있다.
상기 단계 2는 유기용매 상에, 수난용성 약물 또는 생체영상용 무기나노입자, 및 상기 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체를 용해하여 혼합물을 제조하는 단계이다.
알부민 분자는 사슬의 양친성으로 인해 생체 내에서 콜레스테롤, 지질분자 등 소수성물질의 전달체로서 역할을 하며, 혈액 내 투여된 소수성 약물과의 결합에 있어 중요한 역할을 할 수 있다. 이러한 특성은 알부민 분자 내부에 형성된 소수성 도메인에 기인한다.
유기용매 상에서 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체는 펩티드 사슬의 재구성(chain rearrangement)을 통해 알부민 소수성 도메인이 밖으로 드러나 유기용매 상에 노출되게 된다.
또한, 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체의 비펩타이드성 중합체 사슬 도 유기용매 상에 노출되어 존재함으로써 알부민 단백질이 유기 용매상에서 안정화되도록 도울 수 있다.
따라서 수난용성 약물이 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체와 유기용매에 함께 용해된 상태에서 상분리가 일어나지 않으며, 용매의 제거 시 회합체와 약물이 균일하게 존재하는 필름의 형성이 가능하도록 할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 유기용매는 에탄올, 메탄올, 이소프로필알콜, 부탄올, 디메틸설폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 테트라하이드로퓨란(THF), 아세토니트릴, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 헥산, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름, 아세톤 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있다. 또한 상기 유기용매에 수용매를 혼합하여 사용할 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유기용매는 수상과 섞여 에멀전을 형성하지 않는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 그 예로는 에틸알콜, 메틸알콜, 이소프로필알콜, 부틸알콜, 디메틸설폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 테트라하이드로퓨란(THF) 또는 아세토니트릴이 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 수난용성 약물 또는 생체영상용 무기나노입자와, 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체의 몰비는 1:5 에서 1:50 인 것이 바람직하다. 최적의 몰비는 사용되는 수용성 약물 또는 용도(예를들어 SPION의 long-circulation제형)에 따라 다르게 설정될 수 있다.
단계 2에서는 소수성 알킬(아실기) 또는 담즙산 등의 추가적인 소수성기를 도입하지 않고도 수난용성 약물이 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체와 유기용매에 함께 용해된 상태로 안정화될 수 있다는 점을 이용한 것이다.
따라서 본 발명에서는 단순히 알부민이 친수성기 및 소수성기를 도입하기 위한 뼈대 역할 만을 하는 것이 아니라, 추가 소수성기의 도입 없이 비펩타이드성 중합체와 알부민 자체에 있는 소수성 도메인을 이용하여 수난용성 약물을 용해할 수 있다.
본 발명에서 상기 수난용성 약물은 항암제, 항생제, 항진균제, 항염증제, 면역억제제 또는 영양제일 수 있고, 생체영상용 무기나노입자는 진단제 또는 조영제일 수 있다.
항암제로는 탁산 또는 그의 유도체로서 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 오르타탁셀을 사용할 수 있다.
또한 항암제로서 아드리아마이신, 콜히친, 시클로포스파미드, 악티노마이신, 블레오마이신, 두아노루비신, 에피루비신, 미토마이신, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 플루오로우라실, 카르보플라틴, 카르무스틴(BCNU), 메틸 CCNU, 시스플라틴, 에토포시드, 인터페론, 캄프토테신 및 그의 유도체, 페네스테린, 토페테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 타목시펜, 피포술판, 이리노테칸, 겜시타빈, 헤르셉틴, 비노렐빈, 카페시타빈, 알림타, 아바스틴, 벨케이드, 타르세바, 뉴라스타, 라파티닙 및 소라페닙을 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 항암제로는 파클리탁셀 또는 캄프토테신인 것이 보다 더 바람직하다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
항생제로는 네오마이신, 아미카신, 아즈트레오남, 클로람페니콜, 팔미트산클로람페니콜, 클로람페니콜 나트륨 숙시네이트, 시프로플록사신, 클린다마이신, 메트로니다졸, 젠타미신, 린코마이신, 토브라마이신, 반코마이신, 폴리믹신 B, 콜리스티메테이트 나트륨 및 콜리스틴을 사용할 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
항진균제로는 그리세오풀빈, 켈로코나졸, 암포테리신 B, 니스타틴 또는 칸디시딘을 사용할 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
항염증제로는 비스테로이드성 항염증제 예를들어 인도메타신, 나프록센, 이부프로펜, 라미페나존, 피록시캄 등과 스테로이드성 항염증제 예를들어 코르티손, 덱사메타손, 플루아자코르트, 히드로코르티손, 프레드니솔론, 프레드니손 등을 사용할 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
면역억제제로는 시클로스포린, 아자티오프린, 미조리빈 또는 타크롤리무스를 사용할 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
영양제로는 지용성 비타민 예를들어 비타민 A, D, E, K 등을 사용할 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
진단제 또는 조영제로는 MR 자기 조영제 예를들어 산화철 나노입자, 플루오로카본, 지용성 상자성 화합물 등; 초음파 조영제; 방사선 조영제 예를들어 요오도-옥탄, 할로카본, 그라핀 등; 및 실질적으로 수불용성인 특성의 물리 또는 물리화학적 개질 없이 전달할 수 없는 다른 진단제도 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 진단제 또는 조영제로는 산화철 나노입자인 것이 보다 더 바람직하다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
본원발명의 일 실시예에 의하면 디메틸설폭사이드(DMSO)를 사용하여 상기 단계 2에서 제조된 폴리에틸렌글리콜과 알부민의 회합체를 용해할 수 있다. 또한 수난용성 약물 또는 생체영상용 무기나노입자의 경우에는 유기용매에는 가용성인바, 폴리에틸렌글리콜과 알부민의 회합체와 수난용성 약물 또는 생체영상용 무기나노입자를 모두 유기용매에 용해시킬 수 있다.
상기 단계 3은 유기용매를 제거하고 친수성 용매를 첨가하여 자기조립에 의해서 나노입자로 제조하는 단계이다. 유기용매를 제거하고 수난용성 약물 또는 생체영상용 무기나노입자가 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체와 균일하게 섞여있는 혼합물을 얻는 단계이며 혼합물에 친수성 용매를 첨가함으로서 자기조립 반응에 의해서 소수성을 가지는 단백질의 부분은 입자의 내부에 위치하게 되고 친수성을 가지는 부분은 수용액 쪽으로 위치하게 되면서 소수성 부위에 수난용성 약물 또는 생체영상용 무기나노입자가 포집되게 되고 나노크기를 갖는 입자로 형성된다.
단계 3에서 친수성 용매를 첨가하면 수난용성 약물과 알부민의 소수성 도메인들 간의 상호작용으로 나노 입자의 내부에 수난용성 약물 또는 생체영상용 무기나노입자가 위치하게 되고, 친수성이며 유연한 비펩타이드성 중합체 사슬은 단백질의 친수성 도메인과 함께 입자의 최외곽에 위치를 하여 core-shell 구조를 형성함으로써 입자 표면을 안정화시키는 동시에 다른 입자와의 상호작용에 의한 집합(aggregation)을 최소화한다.
본 발명의 일실시예에 의하면 친수성 용매를 첨가한 경우 수난용성약물이 입자내부 소수성 부위에 위치함을 확인할 수 있다.
또한, 단계 3의 나노 입자를 포함하는 용액은 매우 안정한 콜로이드 특성을 갖는다는 장점이 있다.
본 발명에서 친수성 용매는 물, 증류수, 멸균수, 인산완충식염수(PBS), 메탄올, 정제수, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올, 에틸렌 글라이콜, 아세톤, 2-부타논, 4-메틸-2-프로파논 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 친수성 용매를 첨가하여 자기조립에 의해서 나노입자로 제조하는 방법은 용매확산법 또는 필름형성법인 것이 바람직하나 이에 제한되지는 않고 일반적으로 알려져 있는 나노입자 제조방법을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명에서 제조되는 회합체 나노입자의 크기는 200nm 내지 500nm인 것이 바람직하다. 200nm 이하인 경우에는 수난용성 약물 또는 생체영상용 무기나노입자가 포집되는 양이 적으며 500nm 이상인 경우에는 나노입자의 크기가 커서 생체전달력이 떨어지는 문제가 있다.
본 발명의 제조방법에 의해서 제조된 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체 나노입자는 담체로서 사용되며 따라서 약물을 안전하게 생체내부에 전달할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해서 제조된 수난용성 약물 또는 생체영상용 무기나노입자를 내부에 포함하는 것을 특징으로 하는 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체 나노입자를 제공한다.
본원발명은 유기용매에 비펩타이드성 중합체와 알부민 회합체 및 수난용성 약물의 동시 용해가 가능하므로 별도의 화학적 또는 물리적인 작용을 가하지 않더라도 두 성분의 혼합이 잘 이루어지는바, 유기용매를 제거하고 친수성용매를 첨가하여 일반적인 나노입자 형성 방법인 반응투과막을 이용한 용매확산법 또는 용매증발에 의한 필름생성법에 의하여 나노입자를 형성할 수 있다.
반면, 기존의 나노입자 제조시에는 유중수 에멀전의 수성상에서 열변성 또는 가교결합을 형성하여 알부민 유도체와 수난용성 약물이 혼합되도록 하였는바, 제조된 나노입자의 안정성이 떨어지고 제조 시간이 길고 비용이 증가하는 등의 문제가 있었다.
본 발명은 기존의 나노입자 제조방법에 비하여 제조된 나노입자의 안정성이 높고, 제조단계가 간단한바 제조시간이 줄고 비용이 줄어드는 효과가 있으며 본 발명의 제조방법으로 제조된 항암제를 포함하는 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체는 기존에 공지된 알부민 나노입자에 비해 항암제가 잘 전달되어 항암효과가 우수하다는 효과가 있다.
즉, 본 발명에 따른 제조방법에 의해서 제조된 파클리탁셀을 내부에 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 나노입자 조성물은 기존의 알부민과 파클리탁셀을 화학적 가교결합에 의해서 제조한 아브락산(IC50 = 35.3 nM)과 유방암 세포주(MDA-MB453)에서의 세포활성을 비교하였을 때, 더 낮은 IC50 값(5.7 nM)을 가지므로 더 높은 항암활성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명에 따른 제조방법에 의해서 제조된 파클리탁셀을 내부에 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 나노입자 조성물의 유방암 세포주인 SK-BR-3 투여 동물모델에서 항암활성을 측정한 결과 파클리탁셀을 함유한 알부민 나노입자는 아브락산(Abraxane®)과 비슷한 정도의 우수한 암 성장억제 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.
기존의 나노입자 제조시에는 유중수 에멀전의 수성상에서 열변성 또는 가교결합을 형성하여 알부민 유도체와 수난용성 약물이 혼합되도록 하였는바, 제조된 나노입자의 안정성이 떨어지고 제조 시간이 길고 비용이 증가하는 등의 기술적 한계가 있었다.
본 발명에 따른 비펩타이드성 중합체와 알부민 회합체 나노입자 제조방법은, 바람직하게는 유기용매 하나만을 사용하여 비펩타이드성 중합체와 알부민 회합체 및 수난용성 약물의 동시 용해가 가능하므로 별도의 화학적 또는 물리적인 작용을 가하지 않더라도 두 성분의 혼합이 잘 이루어지게 된다.
따라서 유기용매를 제거한 후 친수성 용매를 첨가하여 일반적인 나노입자 형성 방법인 반응투과막을 이용한 용매확산법 또는 용매증발에 의한 필름생성법에 의하여 수난용성 약물을 내부에 포함하는 나노입자를 형성할 수 있어서 제조된 나노입자의 안정성이 증가하고 제조방법이 간단하며 비용이 감소되는 이점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 나노입자 제조방법은, 계면활성제, 가용화제를 포함하지 않으며, 나노입자의 제조시 유기용매가 제거되면서 소수성의 형태를 띠는 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 내부에 수난용성 약물이 포접되는 자기조립현상에 의해서 나노입자가 형성됨으로서 수난용성 약물의 제제화에 의한 과민반응 또는 독성반응을 일으키지 않는 동시에 환자의 순응도를 높일 수 있는 장점이 있다. 또한 다양한 수난용성 약물 뿐아니라, 영상/진단용 무기나노입자의 안정화 등에도 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법으로 제조된 항암제를 포함하는 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체는 기존에 공지된 알부민 나노입자에 비해 항암제가 잘 전달되어 항암효과가 우수하다는 효과가 있다.
도 1은, 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체의 형성을 확인하기 위한 전기영동을 나타낸 것이다.
도 2는, 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체가 디메틸설폭사이드(DMSO)상에서의 용해되는 것을 나타낸 것이다.
도 3은, 용매확산법에 의해 제조된 파클리탁셀을 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 나노입자의 투과전자현미경(TEM)이미지(bar = 200 nm)를 나타낸 것이다.
도 4는, 필름형성법에 의해 제조된 파클리탁셀을 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 나노입자의 투과전자현미경(TEM, 위)이미지(bar = 200 nm)와 주사전자현미경(SEM, 아래)이미지(bar = 100 nm)를 나타낸 것이며 (inset image). 왼쪽 그래프는 알부민 회합체 나노입자 크기분포를 광산란법을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는, 필름형성법에 의해 제조된 켐프토테신을 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 나노입자의 투과전자현미경(TEM)이미지(bar = 100 nm)를 나타낸 것이다.
도 6은, Nile red를 이용한 나노입자 내 수난용성 약물의 위치 특성화를 나타낸 것이다.
도 7은, 필름형성법에 의해 제조된 파클리탁셀을 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 나노입자로부터 파클리탁셀의 방출 양상을 나타낸 것이다 (phosphate buffered saline, PBS with 0.1 % sodium salicylate).
도 8은, 필름형성법에 의해 제조된 소수성 형광프로브인 DiD(적색형광, Invitrogen, Carlsbad, CA)와 DiI(초록색형광, Invitrogen, Carlsbad, CA)을 모델약물로 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 나노입자의 유방암 세포주인 MCF-7으로의 전달을 공초점 현미경으로 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 9는, 필름형성법에 의해 제조된 파클리탁셀을 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 나노입자의 유방암 세포주 (SK-BR-3, MDAMB-453, MCF-7)에서의 항암활성을 나타낸 것이다. 시판되는 알부민/파클리탁셀 제제인 아브락산(Abraxane®)을 대조군으로 사용하였다.
도 10은, 필름형성법에 의해 제조된 파클리탁셀을 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 나노입자의 동물종양모델(nude mice nu/nu, SK-BR-3 xenograft)에서의 고형암 성장저해 효과와 항암효과에 의한 생존기간 연장을 관찰한 결과를 나타낸 것이다. 시판되는 알부민/파클리탁셀 제제인 아브락산(Abraxane®)을 대조군으로 사용하였다.
도 11은, 필름형성법에 의해 제조된 소수성 형광프로브인 DiD(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 모델약물로 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 나노입자의 동물종양모델(nude mice nu/nu, SK-BR-3 xenograft)에서의 수동적 표적화(passive tumor targeting) 효과에 의한 시간에 따른 고형암 내 축적을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는, 필름형성법에 의해 제조한 SPION을 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 나노입자의 투과전자현미경(TEM) 이미지(bar = 100 nm)를 나타낸 것이다.
도 13은, 필름형성법에 의해 제조한 SPION을 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 나노입자의 안정성을 나타낸 것이다 (인산염 식염수 (PBS, pH 7.4), 방부제로서 0.02% 아지화 나트륨, 37 ℃).
도 14는, 필름형성법에 의해 제조한 SPION을 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 나노입자의 이완성(relaxivity, 487.5 ± 13.1 mM-1s-1)을 나타낸 것이다. 시판되는 MR영상화용 산화철나노입자인 Feridex® (~230 mM-1s-1) 보다 우수한 이완성을 나타내었다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 알부민- PEG 회합체의 제조
알부민-PEG 회합체의 제조를 위해 N-hydroxysuccimide(NHS)로 활성화된 polyethyleneglycol (NHS-PEG, Mw 5,000, SunBio, Seoul, Korea)을 인간알부민과 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50 (PEG-NHS/알부민)의 반응비로 PBS에 각각 용해시키고 섞은 후 12시간 동안 교반하여 반응시켰다. 반응 결과물을 반투막(Spectra/Por, MWCO 10,000)에 넣고 정제수(deionized water)에서 투석하여 반응하지 않은 PEG를 제거한 후, 동결건조하여 균일한 백색의 케이크를 얻었다.
얻어진 분말을 PBS에 녹여 Laemni 완충용액 (Laemni sample buffer, 63 mM Tris-HCl, 10% Glycerol, 2 % SDS, 0.0025 % Bromophenol blue, pH 6.8)에 희석하여 트리-글라이신(Tris-Glysine) 불연속 아크릴아미드겔 전기영동으로 회합체 형성을 확인하였다(도 1).
실시예 2: 용매확산법에 의한 파클리탁셀 나노입자 제조
파클리탁셀 0.5 mg과 알부민-PEG 접합체(1:10 회합체) 10 mg을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 투명한 용액을 얻었다. 혼합물을 반투막(Spectra/Por, MWCO 10,000)에 넣고 정제수(deionized water)에서 투석하여, 유기용매를 확산을 통해 제거하였다.
분산액은 0.45 ㎛ 셀룰로스 필터로 여과하여 동결건조제를 첨가하지 않은 상태로 48시간 동안 동결건조하여 균일한 백색의 케이크를 얻었으며, 이를 멸균수 또는 PBS를 첨가하여 분산액으로 재조성할 수 있었다. 얻어진 파클리탁셀/알부민-PEG 회합체 분산액은 투명하였으며, 투과전자현미경(TEM) 관찰결과 입자 50 내지 200 nm의 크기를 지니는 구형 나노입자임을 관찰할 수 있었다(도 2 및 도 3).
실시예 3: 필름형성법에 의한 파클리탁셀 나노입자 제조
파클리탁셀 0.5 mg과 알부민-PEG 접합체(1:10 회합체) 10 mg을 50% THF 수용액에 용해시켜 투명한 용액을 얻었다. 혼합물을 회전증발기에 옮기고 감압상태, 100 ℃에서 용매를 증발시켜 둥근플라스크(round-bottom flask) 벽에 얇은 필름을 형성시켰다. 얻어진 필름에 증류수를 넣고 자석교반기 또는 초음파 수조에서 용해시켜 나노입자 분산액을 생성하고, 이를 0.45 ㎛ 셀룰로스 필터로 여과하여 동결건조제를 첨가하지 않은 상태로 48시간 동안 동결건조하여 균일한 백색의 케이크를 얻었다. 얻어진 케이크는 멸균수 또는 PBS를 첨가하여 고농도의 분산액으로 재조성 할 수 있었다(도 4).
실시예 4: 필름형성법에 의한 켐프토테신 나노입자 제조
상기 실시예에서의 방법과 마찬가지로 켐프토테신 0.5 mg을 chloroform/methanol (4:1)에 녹이고 알부민-PEG (80% methanol) 접합체(1:10 회합체) 10 mg을 80% methanol 수용액에 각각 용해시킨 후 섞어 투명한 혼합물 용액을 얻었다. 혼합물을 회전증발기에 옮기고 감압상태, 100 ℃에서 용매를 증발시켜 둥근플라스크(round-bottom flask) 벽에 얇은 필름을 형성시켰다. 얻어진 필름에 증류수를 넣고 자석교반기 또는 초음파 수조에서 용해시켜 나노입자 분산액을 생성하고, 이를 0.45 ㎛ 셀룰로스 필터로 여과하여 동결건조제를 첨가하지 않은 상태로 48시간 동안 동결건조하여 균일한 백색의 케이크를 얻었을 수 있었으며, 이를 멸균수 또는 PBS를 첨가하여 분산액으로 재조성 할 수 있었다. 얻어진 켐프토테신/알부민-PEG 회합체 분산액은 투명하였으며, 투과전자현미경(TEM) 관찰결과 입자 50 내지 200 nm의 크기를 지니는 구형 나노입자임을 관찰할 수 있었다(도 5).
실시예 5: 수난용성 약물의 알부민- PEG 회합체 나노입자 내 위치 확인
수난용성 형광물질인 nile red는 주위환경의 소수성 정도에 따라 일정 흡광파장(excitation wave)에 의한 최대 발광파장(emission maxima)의 red-shift가 일어나며, 이를 통해 nile red가 위치한 마이크로환경의 소수성 정도를 예측할 수 있다. 따라서 파클리탁셀이나 켐프토테신 등의 수난용성 약물들이 알부민-PEG 회합체 나노입자 내 위치와 그 마이크로환경의 성질을 확인하기 위해 상기의 필름형성법을 이용하여 수난용성 형광물질인 nile red를 포접한 나노입자를 제조하였다.
얻어진 나노입자를 530 nm (excitation wavelength)에서 emission wavelength의 변화를 스캐닝 모드로 관찰하였으며, 최대 emission 파장이 655 nm에서 635 nm로 옮겨갔음을 관찰할 수 있었다. 이로 미루어보아 알부민-PEG 회합체 나노입자가 자기조립을 통해 수난용성 약물을 담지한 곳은 단백질 내 소수성 도메인이라는 것을 추측할 수 있었다(도 6).
실시예 6: 포접된 파클리탁셀의 정량과 수용액상에서의 약물 방출 경향
알부민-PEG 회합체 나노입자 내에 포접된 파클리탁셀의 양을 측정하기 위해, 동결건조한 나노입자를 DMSO에 용해하여 HPLC법을 이용하여 정량하였으며, 5%를 목표 loading으로 제제화 하였을 때 99% 이상의 약물이 나노입자 내에 포접되어 있음을 알 수 있었다.
나노입자로부터의 약물 방출 경향 관찰을 위해 나노입자를 0.1% sodium salicylate가 포함된 phosphate-buffered saline(PBS)에서 투석하고(MWCO 10,000) 정해진 시간에 따라 샘플링을 하고 HPLC 분석을 통해 방출된 파클리탁셀의 양을 정량하였다(도 7). 이때 0.1 % sodium salicylate는 소수성 약물인 파클리탁셀의 수용액상 용해도를 높이기 위해 사용하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이 알부민-PEG 회합체 나노입자로부터 파클리탁셀 약물이 일정시간 동안 서방출되었다.
실시예 7: 알부민- PEG 회합체 나노입자의 세포 내 전달효율 측정
알부민-PEG 회합체 나노입자의 세포 내 전달효율 측정을 위해 수난용성 모델 약물로서 소수성 형광프로브인 DiD(적색형광, Invitrogen, Carlsbad, CA)와 DiI(초록색형광, Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 실시예 3에 기재한 바와 같이 필름형성법에 의해 나노입자를 제조하였다. 유방암 세포인 SK-BR-3 세포를 glass-bottomed dish에서 배양한 후 형광프로브를 담지한 나노입자를 처리하고, 6 시간 후 10% 포름알데하이드(formaldehyde)로 고정화하여 공초점현미경을 이용하여 관찰한 결과 형광나노입자의 세포 내 전달이 효율적으로 일어났음을 확인하였으며, 적색과 녹색 형광 이미지의 중첩 시 황색(적색+녹색) 형광을 나타내는 것으로 보아 적색형광과 녹색형광이 분리되어 존재하지 않고 같은 입자 내에 존재함을 확인할 수 있었다. 이는 나노입자가 세포 내 전달 후에도 안정한 형태로 존재하여 실시예 6에서와 같이 약물을 일정시간 동안 서방출할 수 있음을 알 수 있었다 (도 8).
실시예 8: 유방암 세포주에서의 항암 활성 측정
파클리탁셀을 함유한 알부민-PEG 회합체 나노입자의 항암활성의 측정을 위해 유방암 세포주인 SK-BR-3, MDA-MB453, MCF-7에 처리하고 MTT assay를 통해 세포활성을 측정하였다. SK-BR-3와 MCF-7 세포주에서는 아브락산(Abraxane®)과 비슷한 암세포 성장 저해효과를 나타내었으며, 특히 MDA-MB453 세포주에서는 본 발명에 의해 제조된 파클리탁셀/알부민-PEG 회합체 나노입자가 대조군으로 사용한 아브락산(Abraxane®) 또는 DMSO에 용해시킨 파클리탁셀 보다 유의하게 낮은 IC50 값을 나타내었다(도 9). 폴리에틸렌글리콜과 알부민 회합체 나노입자 조성물은 기존의 알부민과 파클리탁셀을 화학적 가교결합에　의해서 제조한 아브락산(IC50 = 35.3 nM)과 유방암 세포주(MDA-MB453)에서의 세포활성을 비교하였을 때, 더 낮은 IC50 값(5.7 nM)을 가지므로 더 높은 항암활성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9: 인간 유방암 동물모델에서의 항암활성 측정
동물모델에서 파클리탁셀을 함유한 알부민-PEG 회합체 나노입자의 항암활성의 측정을 위해 유방암 세포주인 SK-BR-3을 배양 후 효소처리하여 분리하고 원심분리를 통해 농축하여(1.5x107cells/ml), 면역결핍마우스(nude mouse, nu/nu)에 경피주사(100㎕)하여 동물종양모델을 제작하였다. 약물투여를 위해 동일한 양의 파클리탁셀을 함유한 알부민 나노입자 및 대조군을 PBS에 희석한 후 정해진 투여 스케줄에 따라 마우스 꼬리에 정맥주사하고, 고형암 부피를 측정하였다. 고형암의 부피를 계산하기 위한 계산식은 다음과 같다.
tumor volume (mm3) = [length × (width)2]/2
파클리탁셀을 함유한 알부민-PEG 회합체 나노입자는 아브락산(Abraxane®)과 비슷한 정도의 고형암(tumor)의 부피가 감소하였으며, 우수한 암 성장억제 효과를 나타냄을 관찰할 수 있었다 (도 10).
실시예 10: 인간 유방암 동물모델에서의 알부민- PEG 회합체 나노입자의 고형암 표적화 관찰
알부민-PEG 회합체 나노입자의 정맥주사 후 수동적 표적화 (passive tumor targeting) 효과에 의한 시간에 따른 고형암 내 축적을 소수성 형광프로브를 모델약물로 실시간 생체 내 이미징 기술을 통해 관찰하였다. 필름형성법에 의해 제조된 소수성 형광프로브인 DiD(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 수난용성 모델약물로 포함하는 알부민-PEG 회합체 나노입자를 실시예 9에서 제시한 동물종양모델에 정맥 주사한 후, in vivo 형광 이미징 장비를 이용하여 나노입자의 종양 내 분포를 시각화 하였다. 그 결과 나노입자가 96 시간 까지도 종양 내에 축적됨을 관찰할 수 있었다 (도 11). 이러한 결과로 보아 알부민 나노입자는 혈중에서 안정하게 상당시간 동안 순환할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 11: 필름형성법에 의한 산화철나노입자 봉입 나노입자 제조
상기 실시예를 기반으로 하여 산화철나노입자(SPION, 7 nm) 0.5 mg을 70 % THF 수용액에 분산시키고 알부민-PEG 접합체(1:10 회합체) 10 mg을 70 % THF 수용액에 따로 용해시킨 후 혼합하였다. 혼합물을 회전증발기에 옮기고 감압상태, 100 ℃에서 용매를 증발시켜 둥근플라스크(round-bottom flask) 벽에 얇은 필름을 형성시켰다. 얻어진 필름에 증류수를 넣고 자석교반기 또는 초음파 수조에서 용해시켜 나노입자 분산액을 생성하고, 0.45 ㎛ 셀룰로스 필터로 여과하여 동결건조제를 첨가하지 않은 상태로 48시간 동안 동결건조하여 균일한 갈색의 케이크를 얻었으며 이를 멸균수 또는 PBS를 첨가하여 분산액으로 재조성할 수 있었다. 얻어진 SPION/알부민-PEG 회합체 분산액은 투명하였으며, 투과전자현미경(TEM) 관찰결과 입자 약 200 nm의 크기를 지니는 구형 나노입자 내에 7 nm의 SPION 입자가 포접되어 있음을 확인하였다(도 12).

Claims (15)

  1. 알부민의 아민과 반응할 수 있는 반응기로 치환된 비펩타이드성 중합체를 알부민과 혼합하여 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체를 형성하는 제1단계;
    유기용매 상에, 수난용성 약물 또는 조영제, 및 상기 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체를 용해하여 혼합물을 제조하는 제2단계; 및
    상기 혼합물의 유기용매를 제거하고 친수성 용매를 첨가하여 자기조립에 의해서 나노입자로 제조하는 제3단계를 포함하는,
    수난용성 약물 또는 조영제를 내부에 포함하는 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체 나노입자를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥사졸린, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리사카리드, 덱스트란, 폴리 비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 에틸 에테르, 폴리아크릴 아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리시아노아크릴레이트, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산, 헤파린 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체 나노입자를 제조하는 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 알부민의 아민과 반응할 수 있는 반응기는 N-히드록시숙신이미드, 숙신 이미딜 숙시네이트, 숙신 이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 부타노에이트, 벤조트리아졸 카보네이트, 알데히드 및 카테콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체 나노입자를 제조하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 유기용매는 에탄올, 메탄올, 이소프로필알콜, 부탄올, 디메틸설폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 테트라하이드로퓨란(THF), 아세토니트릴, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 헥산, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름, 아세톤 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체 나노입자를 제조하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 유기용매에 수용매를 혼합하여 공용매를 사용하며 공용매가 에멀전을 형성하지 않는 것을 특징으로 하는 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체 나노입자를 제조하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체와 알부민의 몰비는 5:1 내지 50:1인 것을 특징으로 하는 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체 나노입자를 제조하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 수난용성 약물 또는 조영제와 상기 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체의 몰비는 5:1 내지 50:1인 것을 특징으로 하는 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체 나노입자를 제조하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 친수성 용매는 물, 증류수, 멸균수, 인산완충식염수(PBS), 메탄올, 정제수, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올, 에틸렌 글라이콜, 아세톤, 2-부타논, 4-메틸-2-프로파논 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체 나노입자를 제조하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 친수성 용매를 첨가하여 자기조립에 의해서 나노입자로 제조하는 방법은 용매확산법 또는 필름형성법인 것을 특징으로 하는 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체 나노입자를 제조하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 수난용성 약물은 항암제, 항생제, 항진균제, 항염증제, 면역억제제 또는 영양제인 것을 특징으로 하는 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체 나노입자를 제조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항암제는 파클리탁셀 또는 캄프토테신인 것을 특징으로 하는 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체 나노입자를 제조하는 방법.
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서, 상기 제조되는 회합체 나노입자의 크기는 200 내지 500nm인 것을 특징으로 하는 회합체 나노입자 제조방법.
  15. 제1항 내지 제2항, 제4항 내지 제12항 및 제14항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해서 제조된 수난용성 약물 또는 조영제를 내부에 포함하는, 알부민의 아민과 반응할 수 있는 반응기로 치환된 비펩타이드성 중합체와 알부민의 회합체 나노입자.

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