CN103611172B - 载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球及制备方法，包括如下步骤：利用改良的化学共沉淀法制备四氧化三铁纳米粒和纳米雄黄；利用去溶剂化-交联法制备载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球。该方法简单易行，通过白蛋白纳米球集热疗、化疗、热控释、磁靶向等优点为一体，为肿瘤的治疗开拓了新的思路。此新型的纳米运载体除了作为治疗载体，还可进行体内磁共振成像研究，为临床应用研究提供可靠的实验研究数据及理论基础。

Description

载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球及制备方法

技术领域

本发明涉及一种既可作为磁共振成像造影剂又可对肿瘤进行治疗的载药磁性白蛋白纳米球及其制备方法。

背景技术

雄黄属于硫化物类含砷矿物中药，对急性早幼粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、多发性骨髓瘤等恶性血液系统疾病疗效显著，对一些实体瘤细胞，体外实验也证实具有抑制生长和诱导凋亡作用，如肝癌细胞系、乳腺癌多药耐药细胞系、骨肉瘤细胞等。庞琦等的研究已发现雄黄对体外培养的鼠胶质瘤细胞有明显抑制作用，且在动物体内实验中证明局部用药有效，用药3周后，75％的种植瘤消失，3个月内的复发率为仅为8.3％，提示雄黄治疗肿瘤前景光明。与亚砷酸注射液相比，雄黄毒副作用较小，但其传统制剂工艺都是以研磨、水飞的形式，存在工业生产速度慢、颗粒偏大、生物利用度较低等缺点，长期或大剂量使用仍然会出现许多不良反应。若能通过改进传统制剂工艺、采用现代技术制备新型含砷中药，从而提高生物利用度、减少药物用量、降低毒副作用并提高疗效将具有重要的临床意义。砷制剂已从传统的制剂工艺和给药途径中迈出了可喜的一步，新型的含砷纳米中药抗肿瘤效应明显优于传统剂型的砷类中药，显示了在肿瘤治疗方面具有较好的应用前景，有望成为砷剂治疗肿瘤的新剂型，为砷剂的临床应用开辟了新途径，也为传统中药在抗肿瘤纳米医药的发展上提供了新的思路和方法。

热疗是一种古老但很有前景的肿瘤治疗方法，它是一类利用各种物理能量（如微波、射频和超声波等）在人体组织中所产生的热效应，使组织细胞温度升至43 ℃以上的有效治疗温度，加速肿瘤细胞死亡的疗法。自临床应用以来，显示出许多优点。首先，它本身的副作用极小而被称为绿色疗法；其次，将热疗与放疗或化疗结合使用，不仅可以减少放、化疗药物剂量，从而减少放、化疗副作用，而且可以实现全周期、全空间对癌细胞的杀伤，大大提高疗效。90年代初，Jordan等发现纳米级氧化铁粒子有很高的热效应，在可以临床使用的磁场强度和频率范围内，其热效应比微米级的磁粒子高得多，据此Jordan等采用了纳米技术和热疗相结合的磁流体热疗（MFH）治疗肿瘤取得重要进展。

氧化铁纳米粒子具有超顺磁性、良好的生物相容性和高灵敏性，被认为是一种良好的磁共振成像造影剂。由于其适中的纳米尺度和肿瘤组织透过性增强及滞留（EPR）效应，氧化铁纳米粒子能够在肿瘤组织富集，因而在磁共振肿瘤成像领域具有巨大的应用前景。然而，作为纳米材料，氧化铁纳米粒子在血液循环系统中容易被血浆中的调理素非特异性吸附，进而被网状内皮系统（RES）快速识别和摄取，大量的滞留在肝脾等器官。这会降低氧化铁纳米粒子在肿瘤部位的富集，从而影响肿瘤成像的效果。与巨噬细胞被动靶向的葡聚糖包被的四氧化三铁纳米颗粒比较，本发明所用的载药磁性白蛋白纳米球具有能够降低血浆蛋白结合率，减少网状内皮系统清除率，增加循环时间的优点，因而更适用于肿瘤的的分子影像学研究

本发明的载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球通过白蛋白纳米球集热疗、化疗、热控释、磁靶向等优点为一体，为肿瘤的治疗开拓了新的思路。此新型的纳米运载体除了作为治疗载体，还可进行体内磁共振成像研究，为临床应用研究提供可靠的实验研究数据及理论基础。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种同时包裹化疗药物（纳米雄黄）、磁粒（四氧化三铁纳米粒）的载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球，同时提供一种简单易行的制备上述载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球的方法。       

技术方案：本发明的载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：

按照质量比2.5：1至6：1称取牛血清白蛋白、Fe₃O₄磁性纳米粒，将二者放入去离子水中，配置成牛血清白蛋白浓度为10mg/ml至24 mg/ml的混合液，按照纳米雄黄与Fe₃O₄磁性纳米粒质量比为1：200，将纳米雄黄滴加到上述混合液中，充分搅拌混匀，调节pH值为碱性，在磁力搅拌下缓慢加入无水乙醇，直至溶液出现浑浊，然后缓慢加入戊二醛固化，搅拌8小时以上，将反应液倒入离心管内超高速离心，用去离子水洗涤后即得到载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球。

本发明方法的一个优选方案中，牛血清白蛋白与Fe₃O₄磁性纳米粒的混合液中，牛血清白蛋白浓度为10 mg/ml。

本发明方法的一个优选方案中，纳米雄黄是采用化学共沉淀法制备的，具体步骤为：

将雄黄原粉粉碎后，用2mol/L浓盐酸在40~60℃下、恒温磁力搅拌器上搅拌2小时以上，蒸馏水冲洗至中性，然后用浓盐酸浸泡24~48小时，蒸镏水冲洗至中性，过滤，弃滤液，得到去除杂质元素的雄黄粉末；

将上述预处理后的雄黄粉末加入饱和的Na₂S溶液，在氮气保护下，保持40~60℃，磁力搅拌2~4小时，去离子水反复冲洗，过滤，弃渣，最后向得到的溶液中缓慢滴加0.2 mol/L的盐酸，并不断搅拌，直至溶液澄清透明，即得到纳米雄黄。

本发明的载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球，是按照上述任一种方法制备得到的。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：

自制的载药磁性白蛋白纳米球在扫描电镜检测下近似球形，大小均匀，平均在140 nm（图1）。动态光散射分析仪显示载药磁性白蛋白纳米球的水合粒径约为200 nm。在扫描电镜视野下任意选几个视野，能谱仪证实制备的载药磁性白蛋白纳米球只含有S、A_S、Fe与O四种元素。采用原子荧光分光光度计测定的载药磁性白蛋白纳米球的平均载药量为2%，包封率约为70%。张阳德等采用超声乳化的方法制备磁性阿霉素白蛋白纳米球，方法繁琐，本发明方法简单易行，所用材料简单易取。文献中载药磁性白蛋白纳米粒的制备过程选用药物均是临床用药，本发明采用自制的纳米药物，副作用小，利用率高。载药磁性白蛋白纳米球相对分子质量足够小，具有一定的通透性，能跨越人体内部生理屏障(血管壁、细胞膜等)，有效地到达目的组织；生物相容性好，免疫原性低，体内副作用小。随着纳米技术日新月异的高速发展，白蛋白纳米粒载体给药系统必将在抗肿瘤等治疗中发挥越来越重要的作用，其在临床达到广泛应用的前景也指日可待。本发明在制备白蛋白纳米球的基础上，将纳米雄黄和适当的磁性成分同时包载在白蛋白纳米粒中，经过表征，发现其具有高的载药量及好的热疗效果。

本发明通过白蛋白纳米球集热疗、化疗、热控释、磁靶向等优点为一体，为肿瘤的治疗开拓了新的思路。此新型的纳米运载体除了作为治疗载体，还可进行体内磁共振成像研究，为临床应用研究提供可靠的实验研究数据及理论基础。

附图说明

图1为本发明方法制备得到的载药磁性白蛋白纳米球透射电镜照片。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案做进一步具体说明。

实施例1：本发明的一种既可作为磁共振成像造影剂又可对肿瘤进行治疗的载药磁性白蛋白纳米球的制备方法，具体步骤如下：

1）四氧化三铁纳米粒的制备：

采用化学共沉淀法制备： ① 分别称量FeCl₃·6H₂O与FeCl₂·4H₂O各10.8 g和4.37 g，放入广口瓶内，溶解于200 ml三蒸水内； ② 100 ml的1 mol/L的氨水迅速倒入广口瓶； ③ 将液体置于加通气口塞的广口瓶放在磁力搅拌器上，放入搅拌子，充入N₂ 保护，设定反应温度为50度，设定搅拌速度为3000转/分，搅拌30 min后停止。自然冷却，液体倒入烧杯，然后用强磁铁吸住烧杯底部，倾去上层废液，用去离子水反复冲洗生成物，洗涤三次，将生成物真空干燥备用。本发明方法中所采用的四氧化三铁纳米粒，可以是采用其他方法制备得到，四氧化三铁纳米粒在本发明方法中作为磁共振的造影剂，因此其制备方法和流程并不构成对本发明保护范围的限定。

2）纳米雄黄的制备：

采用化学共沉淀法制备。将雄黄原粉粉碎后，用2mol/L浓盐酸在40~60℃下、恒温磁力搅拌器上搅拌2小时以上，蒸馏水冲洗至中性，然后用浓盐酸浸泡24~48小时，蒸镏水冲洗至中性，过滤，弃滤液，得到去除杂质元素的雄黄粉末；

将上述预处理后的雄黄粉末加入饱和的Na₂S溶液，在氮气保护下，保持40~60℃，磁力搅拌2~4小时，去离子水反复冲洗，过滤，弃渣，最后向得到的澄清溶液中缓慢滴加0.2mol/L的盐酸，并不断搅拌，即得到纳米雄黄。本发明方法中所采用的纳米雄黄，可以是采用其他方法制备得到，纳米雄黄在本发明方法中作为负载在纳米粒上的有效成分，因此其制备方法和流程并不构成对本发明保护范围的限定。

3）采用去溶剂化-交联法制备载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球：

精密称取适量牛血清白蛋白250 mg、磁粉（Fe₃O₄磁性纳米粒）100 mg，滴加500 ug纳米雄黄与上述混合液，加三蒸水直至总体积为25 ml，此时牛血清白蛋白浓度为10 mg/ml，充分搅拌混匀，调节pH值为碱性，在磁力搅拌下缓慢加入无水乙醇，直至溶液出现浑浊，然后按照Fe₃O₄磁性纳米粒与2.5%的戊二醛水溶液2000mg/ml的比例缓慢加入戊二醛固化，搅拌8小时以上，将反应液倒入离心管内超高速离心，用去离子水洗涤后即得到载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球。

实施例2：

精密称取适量牛血清白蛋白400 mg、磁粉（Fe₃O₄磁性纳米粒）100 mg，滴加500 ug纳米雄黄与上述混合液，加三蒸水直至总体积为25 ml，此时牛血清白蛋白浓度为16 mg/ml，充分搅拌混匀，调节pH值为碱性，在磁力搅拌下缓慢加入无水乙醇，直至溶液出现浑浊，然后按照Fe₃O₄磁性纳米粒与2.5%的戊二醛水溶液2000mg/ml的比例缓慢加入戊二醛固化，搅拌8小时以上，将反应液倒入离心管内超高速离心，用去离子水洗涤后即得到载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球。

实施例3：

精密称取适量牛血清白蛋白600 mg、磁粉（Fe₃O₄磁性纳米粒）100 mg，滴加500 ug纳米雄黄与上述混合液，加三蒸水加三蒸水直至总体积为25 ml，此时牛血清白蛋白浓度为24 mg/ml，充分搅拌混匀，调节pH值为碱性，在磁力搅拌下缓慢加入无水乙醇，直至溶液出现浑浊，然后按照Fe₃O₄磁性纳米粒与2.5%的戊二醛水溶液2000mg/ml的比例缓慢加入戊二醛固化，搅拌8小时以上，将反应液倒入离心管内超高速离心，用去离子水洗涤后即得到载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球。

Claims (4)

1.一种载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，该方法采用去溶剂化-交联法制备载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球，包括以下步骤：

按照质量比2.5：1至6：1称取牛血清白蛋白、Fe₃O₄磁性纳米粒，将二者放入去离子水中，配置成牛血清白蛋白浓度为10 mg/ml至24 mg/ml的混合液，按照纳米雄黄与Fe₃O₄磁性纳米粒质量比为1：200，将纳米雄黄滴加到上述混合液中，充分搅拌混匀，调节pH值为碱性，在磁力搅拌下缓慢加入无水乙醇，直至溶液出现浑浊，然后缓慢加入戊二醛固化，搅拌8小时以上，将反应液倒入离心管内超高速离心，用去离子水洗涤后即得到载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球。

2.根据权利要求1所述的载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白与Fe₃O₄磁性纳米粒的混合液中，牛血清白蛋白浓度为10 mg/ml。

3.根据权利要求1或2所述的载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述的纳米雄黄是采用化学共沉淀法制备的，具体步骤为：

将雄黄原粉粉碎后，用2mol/L盐酸在40~60℃下、恒温磁力搅拌器上搅拌2小时以上，用蒸馏水冲洗至中性，然后用浓盐酸浸泡24~48小时，用蒸镏水冲洗至中性，过滤，弃滤液，得到去除杂质元素的雄黄粉末；

将上述预处理后的雄黄粉末加入饱和的Na₂S溶液，在氮气保护下，保持40~60℃，磁力搅拌2~4小时，去离子水反复冲洗，过滤，弃渣，最后向得到的溶液中缓慢滴加0.2 mol/L的盐酸，并不断搅拌，直至溶液澄清透明，即得到纳米雄黄。

4.一种载纳米雄黄磁性白蛋白纳米球，其特征在于，该磁性白蛋白纳米球是按照权利要求1、2或3所述方法制备得到的。