CN105617408B - 用于mri造影成像的白蛋白磁性纳米粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及白蛋白磁性纳米粒的MRI造影成像作用及其制备方法。白蛋白溶解在除过氧的水中;预通氮气除去反应体系中的氧气;先逐滴滴入稀氨水溶液使体系的pH值为10~12,再逐滴滴入无水氯化铁和硫酸亚铁的混合溶液,铁的总浓度为1.4~1.8M/L,铁与白蛋白的摩尔比为2.4×104~3.1×104:1;在氮气保护条件下搅拌,升温65~75℃加热30~60分钟,反应结束后温度降至室温进行下一步的纯化;将制得的纳米粒用分子量为8kD~14kD的透析袋透析24h,得到纯净的白蛋白磁性纳米粒。纳米粒子水合粒径为50~90nm,适合应用于MRI,药物载体,免疫测定等生物学应用。是生物医学应用的理想材料。
Description
技术领域
这种白蛋白磁性纳米粒属于生物医学领域,涉及白蛋白磁性纳米粒的MRI造影成像作用及其制备方法。
背景技术
白蛋白是人体血浆中含量最多的蛋白质,以白蛋白作为稳定剂制备的磁性纳米粒具有高度生物相容特性和无毒的特点。这种白蛋白磁性纳米粒子具有广泛的体内应用途径,例如:MRI,免疫测定,药物传递,组织分离,细胞靶向等,是生物医学应用的理想材料。应用于生物医学的纳米粒子的关键因素是具有合适的粒径和方便简单的纯化过程便于工业化生产。目前常用的合成方法有:(1)共沉淀法;(2)高温反应法;(3)电化学反应法;(4)微乳法;(5)流动注射合成法;(6)多元醇法;(7)气溶胶法;(8)超声波分解法。其中共沉淀法是最简单最有效的合成磁性纳米粒的方法,我们是在传统的共沉淀法上做了一些改善,使合成的纳米粒子具有合适的粒径、窄的粒径分布以及简单的纯化过程,提高纳米粒子的稳定性,使其更广泛的应用于医学的各个领域。
白蛋白作为血浆中最丰富的蛋白质,具有调节血浆渗透压,作为某些金属离子和抗肿瘤药物的载体,延长药物的体内循环时间,提高药物稳定性等优点,近年来,它在体内成像研究领域成为了热点。
发明内容
为了解决目前共沉淀法制备四氧化三铁纳米粒的工序复杂和制备的产物不易分离纯化等缺点,我们在传统的共沉淀制备方法上简化了实验步骤,制备的纳米粒的水合粒径为50~90nm,性质相对稳定,纯化方法简单易行。
为了达到上述目的,本实验的技术方案如下:
用于MRI造影成像的白蛋白磁性纳米粒的制备方法,其步骤如下:
(a)称取白蛋白溶解在除过氧的水中;预通氮气除去反应体系中的氧气;先逐滴滴入稀氨水溶液使体系的pH值为10~12,再逐滴滴入无水氯化铁和硫酸亚铁的混合溶液,铁的总浓度为1.4~1.8M/L,铁与白蛋白的摩尔比为2.4×104~3.1×104:1;在氮气保护条件下搅拌,升温65~75℃条件下加热30~60分钟,反应结束后温度降至室温进行下一步的纯化;
(b)将制得的纳米粒用分子量为8kD~14kD的透析袋透析24h,透析的过程中换4~6次超纯水得到纯净的白蛋白磁性纳米粒。
本发明制得的白蛋白磁性纳米粒;其白蛋白直接附着在四氧化三铁表面,形成的白蛋白磁性纳米粒,水合粒径为50~90nm,
所述水是爆沸10分钟后的除氧水。所述三价铁与二价铁的摩尔比为1:1.8~2。所述搅拌速率为700~1000rmp。
所述步骤(b)中透析24h中,前12h时间每隔3~4h换一次超纯水,后12h时间每隔6~8小时换一次超纯水。
本发明是在氨水形成的碱性环境中加入适当比例的二价和三价铁在室温下反应形成四氧化三铁,白蛋白通过物理吸附直接附着在四氧化三铁表面,紧接着65~75℃加热使形成的纳米粒活化而制成的稳定的白蛋白磁性纳米粒。
本发明将纯化后的纳米粒使用粒度测定仪(DLS)测定纳米粒的水合粒径,使用透射电镜(TEM)测定纳米粒观察纳米粒的形态。
本发明以未用白蛋白包被的空白四氧化三铁纳米粒和糊精包被的四氧化三铁纳米粒为对照,使用核磁共振大鼠成像研究系统测定白蛋白包被的四氧化三铁纳米粒在体外的MRI成像效果。
由于技术的改善,本技术制得的纳米粒与传统共沉淀法制得的纳米粒具有如下优点:
1.本技术实现了白蛋白通过简单的物理吸附包覆在四氧化三铁纳米粒表面,不需要添加有机稳定剂,使下一步的纳米粒纯化操作简单易行。
2.本技术制备的纳米粒子水合粒径为50~90nm,TEM测定的粒径为10~20nm,该试验重复性高,制备的纳米粒稳定,适合应用于MRI,药物载体,免疫测定等生物学应用。可以广泛应用于MRI,免疫测定,药物传递,组织分离,细胞靶向等,是生物医学应用的理想材料。
3.该技术的制备方法简单,易于操作,适用于大批量生产。
附图说明
图1是制备的白蛋白四氧化三铁纳米粒子;
图2是DLS测定的白蛋白四氧化三铁纳米粒子的粒径;
图3a是透射电镜(TEM)测定的白蛋白四氧化三铁纳米粒子的50nm放大倍数图;
图3b是透射电镜(TEM)测定的白蛋白四氧化三铁纳米粒子的20nm放大倍数图;
图4是本技术制备的白蛋白四氧化三铁纳米粒子应用于MRI测定的纵向弛豫时间(T1)图;
图5是本技术制备的白蛋白四氧化三铁纳米粒子应用于MRI测定的横向弛豫时间(T2)图。
具体实施方式
下面结合实例对本技术做进一步描述:
具体步骤如下:
称取白蛋白溶解在除过氧的水中;预通氮气除去反应体系中的氧气;先逐滴滴入稀氨水溶液使体系的pH值为10~12,再逐滴滴入无水氯化铁和硫酸亚铁的混合溶液,三价铁与二价铁的摩尔比为1:1.8~2;无水氯化铁和硫酸亚铁必须用除氧水超声溶解完全,铁的总浓度为1.4~1.8M/L,铁与白蛋白的摩尔比为2.4×104~3.1×104:1;在700~1000rmp磁搅拌和氮气保护条件下,65~75℃加热条件下加热30~60分钟,反应结束后待溶液温度降至室温即可进行下一步的纯化;
将制得的纳米粒用分子量为8kD~14kD的透析袋透析24h,透析的过程中换4~6次超纯水得到纯净的白蛋白磁性纳米粒。
所述水都是爆沸10分钟后的除氧水,整个实验过程是在氮气保护下进行的,以免水和空气中的氧气氧化二价铁而不能形成稳定的强磁性四氧化三铁纳米粒。
所述步骤(b)中,将制得的白蛋白磁性纳米粒降温至室温,用分子量8kD~14kD的透析袋透析24h,前12h时间每隔3~4h换一次超纯水,后12h时间每隔6~8小时换一次超纯水即可得到纯净的白蛋白磁性纳米粒。
实施例1
称取1g牛血清白蛋白溶解在除过氧的水中,预通氮气除去反应体系中的氧气。先逐滴滴入稀氨水溶液使体系的pH值为12,再逐滴滴入精密称取的无水氯化铁和硫酸亚铁的混合溶液,三价铁与二价铁的摩尔比为1:1.8,铁的总浓度为1.8M/L,铁与白蛋白的摩尔比为2.4×104:1。在1000rmp磁搅拌和氮气保护条件下,75℃加热30分钟后反应结束。反应结束后待溶液温度降至室温,纳米粒用分子量为8kD~14kD的透析袋透析24h,透析的过程中换6次超纯水即可得到纯净的白蛋白磁性纳米粒。
取纯化后的白蛋白四氧化三铁纳米粒,超声分散均匀后,用粒度测定仪(DLS)测定纳米粒的水合粒径为75nm(如图2),用透射电镜(TEM)测定纳米粒的粒径为20nm,纳米粒形状较均一为类圆形(如图3)。
取纯化后的白蛋白四氧化三铁纳米粒,使用核磁共振大鼠成像研究系统进行成像测定,测定的T1和T2值分别为24.7ms,1.7ms(如图4,图5)。
实施例2
称取0.6g牛血清白蛋白溶解在除过氧的水中,预通氮气除去反应体系中的氧气。先逐滴滴入稀氨水溶液使体系的pH值为10,再逐滴滴入精密称取的无水氯化铁和硫酸亚铁的混合溶液,三价铁与二价铁的摩尔比为1:2,铁的总浓度为1.4M/L,铁与白蛋白的摩尔比为3.1×104:1。在700rmp磁搅拌和氮气保护条件下,65℃加热60分钟后反应结束。反应结束后待溶液温度降至室温,纳米粒用分子量为8kD~14kD的透析袋透析24h,透析的过程中换4次超纯水即可得到纯净的白蛋白磁性纳米粒。
取纯化后的白蛋白四氧化三铁纳米粒,超声分散均匀后,用粒度测定仪(DLS)测定纳米粒的水合粒径为53nm,用透射电镜(TEM)测定纳米粒的粒径为16nm,纳米粒形状较均一为类圆形。
取纯化后的白蛋白四氧化三铁纳米粒,使用核磁共振大鼠成像研究系统进行成像测定,测定的T1和T2值分别为27.6ms,1.9ms。
实施例3
称取0.8g牛血清白蛋白溶解在除过氧的水中,预通氮气除去反应体系中的氧气。先逐滴滴入稀氨水溶液使体系的pH值为11,再逐滴滴入精密称取的无水氯化铁和硫酸亚铁的混合溶液,三价铁与二价铁的摩尔比为1:1.9,铁的总浓度为1.6M/L,铁与白蛋白的摩尔比为2.7×104:1。在900rmp磁搅拌和氮气保护条件下,70℃加热45分钟后反应结束。反应结束后待溶液温度降至室温,纳米粒用分子量为8kD~14kD的透析袋透析24h,透析的过程中换5次超纯水即可得到纯净的白蛋白磁性纳米粒。
取纯化后的白蛋白四氧化三铁纳米粒,超声分散均匀后,用粒度测定仪(DLS)测定纳米粒的水合粒径为67nm,用透射电镜(TEM)测定纳米粒的粒径为16nm,纳米粒形状较均一为类圆形。
取纯化后的白蛋白四氧化三铁纳米粒,使用核磁共振大鼠成像研究系统进行成像测定,测定的T1和T2值分别为28.5ms,1.8ms。
实施例4
称取1g人血清白蛋白溶解在除过氧的水中,预通氮气除去反应体系中的氧气。先逐滴滴入稀氨水溶液使体系的pH值为12,再逐滴滴入精密称取的无水氯化铁和硫酸亚铁的混合溶液,三价铁与二价铁的摩尔比为1:1.8,铁的总浓度为1.8M/L,铁与白蛋白的摩尔比为2.4×104:1。在1000rmp磁搅拌和氮气保护条件下,75℃加热30分钟后反应结束。反应结束后待溶液温度降至室温,纳米粒用分子量为8kD~14kD的透析袋透析24h,透析的过程中换6次超纯水即可得到纯净的白蛋白磁性纳米粒。
取纯化后的白蛋白四氧化三铁纳米粒,超声分散均匀后,用粒度测定仪(DLS)测定纳米粒的水合粒径为83nm,用透射电镜(TEM)测定纳米粒的粒径为20nm,纳米粒形状较均一为类圆形。
取纯化后的白蛋白四氧化三铁纳米粒,使用核磁共振大鼠成像研究系统进行成像测定,测定的T1和T2值分别为26.1ms,1.8ms。
实施例5
称取0.6g人血清白蛋白溶解在除过氧的水中,预通氮气除去反应体系中的氧气。先逐滴滴入稀氨水溶液使体系的pH值为10,再逐滴滴入精密称取的无水氯化铁和硫酸亚铁的混合溶液,三价铁与二价铁的摩尔比为1:2,铁的总浓度为1.4M/L,铁与白蛋白的摩尔比为3.1×104:1。在700rmp磁搅拌和氮气保护条件下,65℃加热60分钟后反应结束。反应结束后待溶液温度降至室温,纳米粒用分子量为8kD~14kD的透析袋透析24h,透析的过程中换4次超纯水即可得到纯净的白蛋白磁性纳米粒。
取纯化后的白蛋白四氧化三铁纳米粒,超声分散均匀后,用粒度测定仪(DLS)测定纳米粒的水合粒径为59nm,用透射电镜(TEM)测定纳米粒的粒径为18nm,纳米粒形状较均一为类圆形。
取纯化后的白蛋白四氧化三铁纳米粒,使用核磁共振大鼠成像研究系统进行成像测定,测定的T1和T2值分别为28.4ms,1.9ms。
实施例6
称取0.8g人血清白蛋白溶解在除过氧的水中,预通氮气除去反应体系中的氧气。先逐滴滴入稀氨水溶液使体系的pH值为11,再逐滴滴入精密称取的无水氯化铁和硫酸亚铁的混合溶液,三价铁与二价铁的摩尔比为1:1.9,铁的总浓度为1.6M/L,铁与白蛋白的摩尔比为2.7×104:1。在900rmp磁搅拌和氮气保护条件下,70℃加热45分钟后反应结束。反应结束后待溶液温度降至室温,纳米粒用分子量为8kD~14kD的透析袋透析24h,透析的过程中换5次超纯水即可得到纯净的白蛋白磁性纳米粒。
取纯化后的白蛋白四氧化三铁纳米粒,超声分散均匀后,用粒度测定仪(DLS)测定纳米粒的水合粒径为65nm,用透射电镜(TEM)测定纳米粒的粒径为20nm,纳米粒形状较均一为类圆形。
取纯化后的白蛋白四氧化三铁纳米粒,使用核磁共振大鼠成像研究系统进行成像测定,测定的T1和T2值分别为25.2ms,1.6ms。
综上所述,本技术制备的白蛋白纳米粒有如下优点:
(1)采用改良的共沉淀法制备的白蛋白纳米粒粒径为50~90nm,形态均一,分布范围窄,稳定性好。
(2)使用核磁共振大鼠成像研究系统测定本技术制备的白蛋白四氧化三铁纳米粒,可得到T1值的范围为24~29ms,T2值的范围为1.6~1.9ms,制备的白蛋白四氧化三铁纳米粒在MRI的成像方面效果良好。
(3)该制备方法简单,易于操作,便于推广。
Claims (4)
1.用于MRI造影成像的白蛋白磁性纳米粒;其特征是白蛋白直接附着在四氧化三铁表面,形成的白蛋白磁性纳米粒,水合粒径为50~90nm;制备方法步骤如下:
(a)称取白蛋白溶解在除过氧的水中;预通氮气除去反应体系中的氧气;先逐滴滴入稀氨水溶液使体系的pH值为10~12,再逐滴滴入无水氯化铁和硫酸亚铁的混合溶液,铁的总浓度为1.4~1.8M/L,铁与白蛋白的摩尔比为2.4×104~3.1×104:1;在氮气保护条件下搅拌,升温65~75℃条件下加热30~60分钟,反应结束后温度降至室温进行下一步的纯化;
(b)将制得的纳米粒用分子量为8kD~14kD的透析袋透析24h,透析的过程中换4~6次超纯水得到纯净的白蛋白磁性纳米粒;
所述无水氯化铁和硫酸亚铁的摩尔比为1:1.8~2。
2.如权利要求1所述的纳米粒,其特征是所述水是爆沸10分钟后的除氧水。
3.如权利要求1所述的纳米粒,其特征是所述步骤(b)中透析24h中,前12h时间每隔3~4h换一次超纯水,后12h时间每隔6~8小时换一次超纯水。
4.如权利要求1所述的纳米粒,其特征是所述搅拌速率为700~1000rmp。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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