CN104784711A - 生物相容性良好的氧化钆磁共振成像纳米探针的制备方法 - Google Patents

生物相容性良好的氧化钆磁共振成像纳米探针的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种生物相容性良好的氧化钆磁共振成像纳米探针的制备方法，步骤如下：1)在烧杯中，将生物大分溶于水，搅拌至完全溶解；向上述溶液加入Gd(NO3)3·6H2O水溶液，搅拌均匀后，加入NaOH水溶液后，调至pH＝10，室温下继续搅拌1h后得到无色液体；2)将所得含杂质的氧化钆纳米探针提纯，透析时间为24h，每隔4h换一次水；透析后得到纯化纳米探针；3)通过冷冻干燥得到絮状白色固体产物。该探针制备方法简单、制备条件简易、原料绿色环保、水溶性好、T1弛豫率高和潜在生物毒性低，便于规模化生产，其在医学成像领域具有较大的发展潜能和应用价值。

Description

生物相容性良好的氧化钆磁共振成像纳米探针的制备方法
技术领域
本发明涉及磁共振成像探针的制备领域，特别是生物相容性良好的氧化钆磁共振成像纳米探针的制备方法。
背景技术
磁共振成像(MRI)相较于其他成像手段如光学成像、X光成像、计算机断层扫描成像(CT)和正电子发射计算机断层扫描成像(PET-CT)等相比，具有无放射性损伤和高空间分辨率等特点，在各种疾病的临床诊断中发挥极其重要的作用。在对一些组织分辨率较低的病灶进行成像时，为了提高诊断的灵敏度和准确度，需要使用造影剂来辅助成像。磁共振造影剂可分为阳性造影剂(如钆和锰的配合物或纳米材料)和阴性造影剂(如超顺磁性四氧化三铁纳米材料)。其中阳性造影剂可以在T1加权成像中使病灶区域图像变亮，从而产生灵敏的诊断效果，因此其在基础科研中和临床诊断方面得以广泛的研究和应用。目前钆类配合物是临床上应用最为广泛的阳性造影剂，但是由于其循环半衰期短，T1弛豫率较低，快速肾脏代谢带来潜在的肾毒性和无靶向性等缺点，极大的限制了其在活体磁共振靶向成像中应用。与此同时，高磁场强度3T的核磁成像系统在临床上得到普及，使得低T1弛豫率的钆类配合物不能完全满足高磁场强度下的特殊成像需求。
纳米材料由于其尺寸和形态可调、血液循环时间长和表面易于功能化，可以基于被动靶向(EPR作用)和主动靶向(靶标识别分子识别)作用进行活体靶向成像。近年来基于纳米材料的分子探针技术飞速发展，在基础研究中取得了令人瞩目的成就，但是在临床应用方面进展缓慢，其根本原因在于纳米分子探针具有潜在的生物毒性。此外目前的这些T1磁共振成像纳米探针也存在着制备步骤较为繁琐，和灵敏度低等缺点。基于此，发展新型的、制备方法简单和生物相容性良好的T1磁共振成像分子探针意义重大。
为了解决纳米探针存在潜在生物毒性这一普遍性的缺点，以生物体内固有的生物大分子为模板来构建纳米探针成为人们开发生物相容性良好的分子探针的新方法。生物大分子包括蛋白质、核酸、肝素、透明质酸等一般具有丰富的羧基或者磷酸官能团，基于其与稀土元素的强配位作用，因此可以作为构建稀土类纳米探针的优良模板。同时，由于生物大分子固有的生物相容性属性，其作为稳定剂得到的纳米材料一般具有低毒和无免疫原活性，有利于探针延长血液循环时间，减少网状内皮系统的吞噬，有效地富集到病灶区域，可以极大的提高成像的灵敏度和准确度。基于生物大分子构建的纳米探针，在量子点、贵金属纳米团簇、药物载体、基因载体以及纳米材料表面改性等方面得到广泛而深入的研究。因此，发展基于生物大分子为模板的、简易、绿色制备T1磁共振造影剂已经刻不容缓。
发明内容
本发明目的是为了解决临床广泛使用的低T1弛豫效能的钆类对比剂不能满足在高磁场强度3T下特殊成像需求的问题，发展基于钆元素的T1磁共振分子探针，提供一种高弛豫率和生物相容性良好的氧化钆磁共振成像纳米探针的制备方法。
本发明方法以生物大分子作为稳定剂，基于其富含的羧基(或磷酸基团)与Gd3+配位，在碱性条件下诱导一步制备生物大分子稳定的氧化钆纳米探针。该方法室温制备、简便易行，易于规模化生产。该探针兼具水溶性好、弛豫率高和潜在生物毒性低等优点。
本发明的技术方案：
一种生物相容性良好的氧化钆磁共振成像纳米探针的制备方法，步骤如下：
1)将生物大分子溶于水，搅拌至完全溶解；向上述溶液加入Gd(NO3)3·6H2O水溶液，生物大分子与Gd(NO3)3·6H2O质量比为200:9、80:9或40:9；搅拌均匀后，加入NaOH溶液，调至pH＝10～12，室温下继续搅拌超过1h后，得到含有未反应杂质的氧化钆纳米材料；
2)将所得氧化钆纳米材料透析提纯，截留分子量为：8000-14000Da，透析时间18～24h，期间至少换4次水；透析后得到纯化氧化钆纳米材料；
3)通过冷冻干燥得到絮状白色固体产物，即为氧化钆磁共振纳米探针。
所述生物大分子为分子量5000的酶切透明质酸钠盐、分子量300K的透明质酸钠盐、牛血清白蛋白或转铁蛋白。
本发明的优点及效果：
该方法制备的磁共振成像纳米探针-生物大分子稳定的氧化钆，具有水溶性好、高弛豫率和生物相容性良好等优良的性质，为一种新型的绿色的磁共振成像探针；该探针制备方法简单，室温下一锅法即可完成反应，易于重复和量产；所用的原料毒性低，绿色环保；所选择生物大分子生物相容性良好，可以有效降低探针引起的免疫反应；因此，该探针是一种制备方法简单、高弛豫率和低生物毒性的磁共振成像分子探针。
该探针核磁共振成像效果显著，T1弛豫率高达，组织对比增强效果明显提升。得益于透明质酸优良的生物相容性，减少了活体内免疫反应的发生，因此生物相容性良好，具有较低的细胞毒性和活体毒性。总之，该探针制备方法简单、制备条件简易、原料绿色环保、水溶性好、T1弛豫率高和生物相容性良好，便于规模化生产，其在医学成像领域具有较大的发展潜能和应用价值。
附图说明
图1为氧化钆纳米探针的高倍透射电镜图。显示在电镜下该探针的尺寸约为2nm。
图2为氧化钆纳米探针的体外T1弛豫率及T1加权成像。通过与临床所用钆喷葡胺相对比如左图，得到该探针在体外T1弛豫率为14.95s-1mM-1，而钆喷葡胺T1弛豫率仅为5.01s-1mM-1；如右图显示的T1加权成像，在相同钆元素的浓度下，氧化钆纳米探针成像效果明显优于钆喷葡胺。
图3为氧化钆纳米探针的体外细胞毒性实验MTT。证明该探针对细胞毒性很小，生物安全性高。
具体实施方式
实施例1：
1)在烧杯中，将0.2g分子量5000的酶切透明质酸钠盐，溶于10ml水中，搅拌至完全溶解。向上述溶液分别加入1mL 0.1M Gd(NO3)3·6H2O水溶液，其中透明质酸钠盐与Gd(NO3)3·6H2O质量比为40:9，5min后，加入NaOH水溶液，调至pH＝10。室温下继续搅拌1h后，得到无色液体；
2)将所得透明质酸氧化钆纳米材料装入透析袋(截留分子量为8000-14000Da)，提纯，透析时间为24h，每隔4h换一次水。透析后得到总体积为50mL纯化纳米探针溶液；
3)通过冷冻干燥得到絮状白色固体产物，即为氧化钆磁共振纳米探针；
取20mg该实施例制备的磁共振成像探针固体进行高倍透射电子显微镜表征如图1证明在电镜下该纳米探针尺寸小(2nm)；T1弛豫率及T1加权成像如图2证明T1弛豫率高达14.95s-1mM-1Gd，在与临床所用对比剂(钆喷葡胺：T1弛豫率为5.01s-1mM-1Gd)相同钆元素浓度下，信号强度明显提升，即低剂量的氧化钆纳米探针就可以达到高剂量钆喷葡胺的成像效果；体外细胞毒性实验MTT如图3证明MTT实验证实生物毒性低。
实施例2：
一种生物相容性良好的氧化钆磁共振成像纳米探针的制备方法，步骤和方法与实施例1基本相同，不同之处在于所用透明质酸钠盐与Gd(NO3)3·6H2O质量比为200:9。
取20mg该实施例制备的磁共振成像探针固体进行高倍透射电子显微镜表征、T1弛豫率及T1加权成像和体外细胞毒性实验MTT，检测结果与实施例1相近。
实施例3:
一种生物相容性良好的氧化钆磁共振成像纳米探针的制备方法，步骤和方法与实施例1基本相同，不同之处在于所用透明质酸钠盐与Gd(NO3)3·6H2O质量比为80:9。
取20mg该实施例制备的磁共振成像探针固体进行高倍透射电子显微镜表征、T1弛豫率及T1加权成像和体外细胞毒性实验MTT，检测结果与实施例1相近。
实施例4:
一种生物相容性良好的氧化钆磁共振成像纳米探针的制备方法，步骤和方法与实施例1基本相同，不同之处在于所用生物大分子模板为分子量为300K的透明质酸钠盐。
取20mg该实施例制备的磁共振成像探针固体进行高倍透射电子显微镜表征、T1弛豫率及T1加权成像和体外细胞毒性实验MTT，检测结果与实施例1相近。
实施例5:
一种生物相容性良好的氧化钆磁共振成像纳米探针的制备方法，步骤和方法与实施例1基本相同，不同之处在于所用生物大分子模板为转铁蛋白。
取20mg该实施例制备的磁共振成像探针固体进行高倍透射电子显微镜表征、T1弛豫率及T1加权成像和体外细胞毒性实验MTT，检测结果与实施例1相近。
实施例6:
一种生物相容性良好的氧化钆磁共振成像纳米探针的制备方法，步骤和方法与实施例1基本相同，不同之处在于所用生物大分子模板为牛血清白蛋白。
取20mg该实施例制备的磁共振成像探针固体进行高倍透射电子显微镜表征、T1弛豫率及T1加权成像和体外细胞毒性实验MTT，检测结果与实施例1相近。

Claims (2)

1.一种生物相容性良好的氧化钆磁共振成像纳米探针的制备方法，步骤如下：
1)将生物大分子溶于水，搅拌至完全溶解；向上述溶液加入Gd(NO3)3·6H2O水溶液，生物大分子与Gd(NO3)3·6H2O质量比为200:9、80:9或40:9；搅拌均匀后，加入NaOH溶液，调至pH＝10～12，室温下继续搅拌超过1h后，得到含有未反应杂质的氧化钆纳米材料；
2)将所得氧化钆纳米材料透析提纯，截留分子量为：8000-14000Da，透析时间为18～24h，期间至少换4次水；透析后得到纯化氧化钆纳米材料；
3)通过冷冻干燥得到絮状白色固体产物，即为氧化钆磁共振纳米探针。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述生物大分子为分子量5000的酶切透明质酸钠盐、分子量300K的透明质酸钠盐、牛血清白蛋白或转铁蛋白。
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