CN115160263B - 一种磁共振波谱分子探针及其制备方法、应用方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种磁共振波谱分子探针，结构式为：上述磁共振分子探针的制备方法，合成路线为：
Description
技术领域
本发明属于磁共振波谱技术领域，具体涉及一种利用分子探针与待测物去甲肾上腺素发生特异性反应生成新的化学位移峰从而实现磁共振波谱的高灵敏检测。
背景技术
磁共振波谱(magnetic resonance spectroscopy,MRS)是一种基于磁共振成像(MRI)的功能成像技术，能够无创检测体内代谢物和生化分子的变化，在疾病的诊断，尤其是中枢神经系统疾病的诊断中发挥着至关重要的作用。然而，在MRS的应用中仍然存在一些巨大的挑战。一方面，MRS目前仅限于检测少量内源性代谢物，主要包括胆碱、肌酸和N-乙酰天冬氨酸等。另一方面，大部分内源性物质的化学位移值主要在1～5之间，造成波谱峰的严重重叠，这就给在这个区间的波谱峰的识别带来了困难。外源性的分子探针与MRS技术相结合有望很好地解决上述问题，这也将拓宽MRS的应用范围。
去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)是一种儿茶酚类的神经递质，它与抑郁症的发生和发展之间有着非常密切的关系。利用磁共振波谱的分子探针(MRS molecularprobes，MMP)对NE进行特异性检测需要满足一些基本的要求。首先，MMP需要与NE发生特异性的化学反应。众所周知，NE在结构上与多巴胺(DA)和肾上腺素(EP)非常相似。这使得对NE的特异性检出变得非常困难。因此，NE的特异性检测只能通过关注NE本身的结构特点来实现。其次，MMP与NE反应后，需要至少产生一个新的化学位移峰，其化学位移值要大于5，这样才能很好地远离体内水和代谢物的干扰。更重要的是，这有助于提高检测灵敏度。最后，MMP应具有良好的生物安全性和生物相容性。目前虽然有少量荧光探针分子可以对NE进行检测，但由于受荧光穿透深度的影响，并不能在活体上进行原位无创的检测。因此，利用磁共振波谱对NE进行检测成了当下亟待解决的问题。
发明内容
为解决现有技术中荧光探针分子对NE进行检测的方案的技术缺陷，本发明提供一种基于分子探针与去甲肾上腺素发生特异性化学反应生成醛基并利用醛基的化学位移峰来实现磁共振波谱检测的新方法。
本发明的技术方案为：
一种磁共振波谱分子探针，结构式为：
优选地，本发明的磁共振波谱分子探针，
R为氢原子，或是3个碳以下的烷基；n＝1或2。
一种上述磁共振分子探针的制备方法，合成路线为：
一种磁共振波谱分子探针的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备化合物2：
称取化合物1和三光气，溶于二氯甲烷中，形成第一溶液；将吡啶溶于二氯甲烷中，形成第二溶液，然后将第二溶液缓慢滴加到第一溶液中；反应完全结束后，将反应液倾倒入水中，分离有机相，并多次萃取，之后干燥，蒸干溶剂，获得化合物2；
S2，制备化合物TR：
将化合物3和三乙胺溶于二氯甲烷中，形成第三溶液；将含有化合物2的二氯甲烷溶液缓慢滴加到第三溶液中，滴加完毕后，反应温度升至室温并继续反应直至反应结束；去除溶剂，最后柱层析得到最终化合物。
优选地，本发明的磁共振波谱分子探针的制备方法，
S1，制备化合物2：
称取1.0当量的化合物1和0.5当量的三光气，溶于二氯甲烷中，形成第一溶液；将1.0当量的吡啶溶于二氯甲烷中，形成第二溶液，然后在0℃下将第二溶液缓慢滴加到第一溶液中；在0℃搅拌数小时，反应完全结束后，将反应液倾倒入水中，分离有机相，并用二氯甲烷多次萃取，之后用硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，获得化合物2；
S2，制备化合物TR：
将1.0当量的化合物3和2.0当量的三乙胺溶于二氯甲烷中，形成第三溶液；在0℃下，将含有2.0当量化合物2的二氯甲烷溶液缓慢滴加到第三溶液中，滴加完毕后，反应温度升至室温并继续反应直至反应结束；在减压下去除溶剂，最后柱层析得到最终化合物。
一种磁共振波谱分子探针的应用方法，使用上述的磁共振波谱分子探针检测去甲肾上腺素。
优选地，本发明的磁共振波谱分子探针的应用方法，磁共振波谱分子探针与去甲肾上腺素反应完成后，获取反应物的磁共振波谱。
优选地，本发明的磁共振波谱分子探针的应用方法，检测的去甲肾上腺素处于除了去甲肾上腺素的儿茶酚类神经递质中。
优选地，本发明的磁共振波谱分子探针的应用方法，检测的去甲肾上腺素处于氨基酸环境中。
优选地，本发明的磁共振波谱分子探针的应用方法，检测的去甲肾上腺素处于阴阳离子环境、ROS/RNS环境、pH值4～9的溶液环境、活细胞环境中。
磁共振波谱分子探针检测去甲肾上腺素的原理：
去甲肾上腺素中的氨基和羟基先后对分子探针TR发生亲核取代反应，生成不稳定的环状半缩醛，半缩醛在生理条件下水解生成含有醛基的化合物，醛基官能团在磁共振波谱上10左右的位置出峰，该波谱峰不受体内代谢物质的干扰，极大提升了检测灵敏度。
本发明的有益效果是：
该分子探针能响应去甲肾上腺素以及该分子探针能够从儿茶酚类神经递质中特异性检测出去甲肾上腺素；
本发明的磁共振探针分子的抗干扰能力和稳定性很强，能够在常见阴阳离子、pH值4～9的测试环境以及活性氧物质存在时干扰情况下正常检测；能够在细胞层面上检测内源性的去甲肾上腺素；
本发明的探针分子的生物安全性和生物相容性高。
附图说明
下面结合附图和实施例对本申请的技术方案进一步说明。
图1为分子探针TH与去甲肾上腺素的响应及选择性测试；
(A)只有TH存在；(B)分子探针TH与去甲肾上腺素、(C)多巴胺和(D)肾上腺素的反应；
图2为分子探针TH与常见氨基酸的响应情况；分子探针TH与(A)去甲肾上腺素、(B)谷胱甘肽、(C)半胱氨酸、(D)赖氨酸、(E)丝氨酸、(F)苏氨酸、(G)丙氨酸和(H)苯丙氨酸；
图3为TH与常见的阴阳离子的反应；图3中，(A)为TH与常见的阳离子的反应，包括Zn2+,Fe2+,Ca2+,Cu2+,Mg2+；(B)为TH与常见阴离子的反应，包括：Cl-,SO4 2-,CO3 2-,and AcO-；
图4为分子探针TH在不同ROS/RNS存在下的稳定性测试；
图5为分子探针TH在pH范围从4.0到9.0下的测试实验；
图6为分子探针TH在三种不同细胞系上(Panca1、HeLa和PC12细胞)对去甲肾上腺素的检测；
图7为分子探针TH的生物安全性测试实验，图7中，(A)为MTT细胞毒性实验；(B)为注射TH后小鼠体重的变化；(C)为主要脏器的组织切片。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在本申请的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请保护范围的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明创造的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请的技术方案。
本实施例中，选取了R为甲基，n＝1时的分子探针为案例做详细的说明。
化合物6的制备：称取化合物4(5.0mmol，620mg)和三光气(2.5mmol，742mg)，将其溶于10mL二氯甲烷中。将吡啶(403μL，5.0mmol)溶于5.0mL二氯甲烷中，在0℃下，将其缓慢滴加到上述溶液中。在0℃搅拌数小时，反应完全结束后，将反应液倾倒入水中，分离有机相，并用二氯甲烷多次萃取，并用硫酸钠干燥有机相，减压蒸干溶剂，获得化合物6。
化合物TH的制备：将化合物5(1.0mmol，80μL)和三乙胺(2.0mmol，277μL)溶于5.0mL二氯甲烷中，在0℃下，将含有化合物6(2.0mmol，372mg)的2.0mL二氯甲烷溶液缓慢滴加到上述溶液中，滴加完毕后，反应温度升至室温并继续反应直至反应结束。在减压下去除溶剂，最后柱层析得到最终化合物；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.38(d,J＝8.0Hz,2H),7.19(d,J＝8.0Hz,2H),5.44-5.43(m,1H),3.90-3.84(m,2H),2.36(s,3H),2.02-1.92(m,2H),1.87-1.84(m,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝164.6,139.3,136.0,135.6,130.8,130.0,125.4,42.3,29.4,21.2(Figure S).HRMS(ESI,m/z):calcd for C12H14NaO3S[M+Na]+,261.0561,found261.0553.IR(cm-1):2926,2857,1725,1466,1382,1137,1118.
由实施案例合成出来的化合物TH可以响应去甲肾上腺素并在9.7ppm出现了特征性的醛基官能团的波谱峰(如图1所示)。当另外两种儿茶酚类的神经递质多巴胺和肾上腺素加入到TH溶液中时，并没有在9.7ppm观察到相应的峰，这意味着TH并没有与多巴胺和肾上腺素反应(如图1所示)。
本实施例研究了一系列氨基酸是否会影响TH对去甲肾上腺素的检测。我们选取了常见的氨基酸，包括苯丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等加入到TH溶液里。实验结果发现，这些氨基酸都没有导致9.7ppm的波谱峰的出现(附图2)。随后，我们还选择谷胱甘肽(GSH)添加到TH溶液中。在TH和GSH存在的情况下，也没有观察到9.7ppm处有信号出现(如图2)。以上这些实验结果表明TH对去甲肾上腺素表现出很高的特异性和选择性。
紧接着，本实施例探索了常见的阴阳离子是否会对NE的检测带来干扰。将这些阴阳离子(Zn2+,Fe2+,Ca2+,Cu2+,Mg2+,Cl-,SO4 2-,CO3 2-,and AcO-)加入到TH的溶液中，并没有观察到9-10ppm之间有波谱峰出现(如图3)，这说明这些阴阳离子不会影响TH对去甲肾上腺素的检测。
由于体内存在着一定量各种各样的活性氧/氮物种(ROS/RNS)，因此我们研究了一些常见的ROS/RNS(H2O2,.OH,NO and ONOO-)对检测的影响。实验发现，当向TH的溶液中加入ROS/RNS共同孵育1h后，没有发现9-10ppm之间有波谱峰的出现(如图4)。这意味着ROS/RNS不会对检测带来干扰。另外，我们也研究了不同pH是否会对检测造成干扰。将TH加入到pH从4-9的缓冲液中孵育1h，结果显示，9-10ppm之间并没有出现化学位移峰(如图5)。以上说明了在这个pH的区间内TH不会分解出含有醛基基团的化合物，因此不会对检测造成干扰。
随后，本实施例研究了TH是否能够检测活细胞中的去甲肾上腺素。我们选取了HeLa、Panc1、PC12三种不同类型的细胞来进行实验。当TH与HeLa细胞和Panc1细胞在35℃下共同孵育1h后，并没有在9-10ppm之间观察到波谱峰的信号(如图6)。我们在PC12细胞上也进行了同样的实验。众所周知，PC12细胞是一类常用的神经细胞株，被广泛用于神经系统疾病的研究。更重要的是，PC12细胞可以大量分泌去甲肾上腺素。在孵育1h后，在9.7ppm处观察到了一个显著的波谱峰的信号(如图6)，这是TH响应NE后释放出醛基的化学位移信号。以上实验结果说明了TH可以在细胞水平上特异性地检测去甲肾上腺素。
本实施例中用MTT方法评估了探针的细胞毒性。实验发现，即使探针浓度高达1000μg/mL，孵育时间为48h，细胞的存活率仍然高达85％以上。这说明该分子探针具有较低的细胞毒性。静脉注射该探针后，小鼠的体重变化和主要脏器的组织切片相对于对照组并无显著变化(如图7)。以上说明了探针TH具有良好的生物安全性。
以上述依据本申请的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项申请技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项申请的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (8)
1.一种磁共振波谱分子探针，其特征在于，结构式为：
R为甲基；n＝1。
2.一种权利要求1所述的磁共振波谱分子探针的制备方法，其特征在于，合成路线为：
3.根据权利要求2所述的磁共振波谱分子探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，制备化合物2：
称取化合物1和三光气，溶于二氯甲烷中，形成第一溶液；将吡啶溶于二氯甲烷中，形成第二溶液，然后将第二溶液缓慢滴加到第一溶液中；反应完全结束后，将反应液倾倒入水中，分离有机相，并多次萃取，之后干燥，蒸干溶剂，获得化合物2；
S2，制备化合物TR：
将化合物3和三乙胺溶于二氯甲烷中，形成第三溶液；将含有化合物2的二氯甲烷溶液缓慢滴加到第三溶液中，滴加完毕后，反应温度升至室温并继续反应直至反应结束；去除溶剂，最后柱层析得到最终化合物。
4.根据权利要求3所述的磁共振波谱分子探针的制备方法，其特征在于，
S1，制备化合物2：
称取1.0当量的化合物1和0.5当量的三光气，溶于二氯甲烷中，形成第一溶液；将1.0当量的吡啶溶于二氯甲烷中，形成第二溶液，然后在0℃下将第二溶液缓慢滴加到第一溶液中；在0℃搅拌数小时，反应完全结束后，将反应液倾倒入水中，分离有机相，并用二氯甲烷多次萃取，之后用硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，获得化合物2；
S2，制备化合物TR：
将1.0当量的化合物3和2.0当量的三乙胺溶于二氯甲烷中，形成第三溶液；在0℃下，将含有2.0当量化合物2的二氯甲烷溶液缓慢滴加到第三溶液中，滴加完毕后，反应温度升至室温并继续反应直至反应结束；在减压下去除溶剂，最后柱层析得到最终化合物。
5.一种权利要求1所述的磁共振波谱分子探针的应用方法，其特征在于，将权利要求1所述的磁共振波谱分子探针应用于制备检测去甲肾上腺素的探针，所述磁共振波谱分子探针与去甲肾上腺素反应完成后，获取反应物的磁共振波谱。
6.根据权利要求5所述的磁共振波谱分子探针的应用方法，其特征在于，检测的去甲肾上腺素处于除了去甲肾上腺素的儿茶酚类神经递质中。
7.根据权利要求5所述的磁共振波谱分子探针的应用方法，其特征在于，检测的去甲肾上腺素处于氨基酸环境中。
8.根据权利要求5所述的磁共振波谱分子探针的应用方法，其特征在于，检测的去甲肾上腺素处于阴阳离子环境、ROS/RNS环境、pH值4～9的溶液环境、活细胞环境中。
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