CN111821472A - 一种可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针 - Google Patents

一种可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针 Download PDF

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Abstract

本发明属于生化分析技术领域，具体涉及一种可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针，其单体由葫芦[6]脲与PEG组成。此分子探针原理如下：葫芦[6]脲为带有疏水性空腔的笼状分子，通过在葫芦[6]脲上修饰水溶性PEG长链后组成纳米颗粒单体，在水溶液中超声，一端疏水一端亲水的单体靠分子间作用力，自组装成纳米颗粒；其内部空腔可以作为疏水性药物递送的有效载体。同时，纳米颗粒上的葫芦[6]脲和纳米颗粒内部空腔同时出现129Xe超极化化学交换饱和转移信号。在药物传递释放前后，这两处的化学交换饱和转移均会出现变化，在一定程度上，有效避免了假阳性或者阴性信号的可能。

Description

一种可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针。
背景技术
129Xe是一种无毒的惰性气体，对化学环境十分敏感，化学位移变化大，可溶于多种溶剂，并且可以与多种蛋白、磷脂、孢子等相互作用，使其十分适合应用于生物医学领域。当采用自旋交换光泵技术(SEOP)将129Xe进行超极化后，129Xe的核磁共振信号得到了极大的增强，灵敏度相对于热极化状态提高了10000倍，使其可作为一种造影剂应用于动物和人体肺部或者脑部磁共振成像。超极化129Xe技术既传承了磁共振检测无损伤的优势，同时又弥补了传统磁共振灵敏度低的缺点，为探测超低浓度化学或生物分子提供了一种非常有潜力的技术。但是将超极化129Xe直接作为分子探针存在无靶向性且交换速率过快不易检测的缺点。为了克服这些缺陷，充分利用Xe的优势，2001年，由Pines小组首先提出了一种基于129Xe的分子探针设计策略：利用一种笼状化合物穴番作为129Xe的主体分子，对笼状化合物穴番进行功能化的修饰，经过修饰后，功能化的穴番就可以实现对目标物的特异性识别，因129Xe对化学环境特别敏感，当探针与目标物作用后，穴番笼内129Xe的化学位移会发生变化，可以根据这种变化来监测探针分子与目标物的识别。葫芦脲作为一种广泛应用的笼状分子，研究表明其与Xe也有一定的亲和力。Leif研究组研究证实葫芦[6]脲也可作为129Xe的主体分子，可发展基于葫芦脲的129Xe分子探针。
临床使用的疏水性药物如紫杉醇(PTX)治疗癌症的主要问题之一是其水溶性差从而导致治疗效果低。葫芦脲具有独特的疏水性空腔，如果将其组装成纳米结构，其可以有效负载疏水性药物，并将其传递至细胞质中释放。
综上所述以葫芦脲为基础的纳米颗粒，具有极高的129Xe灵敏度，并且能够有效地传递疏水性药物。
发明内容
申请人在前人研究的基础上，以葫芦[6]脲为129Xe的主体分子，将葫芦[6]脲组装成内部可以载药的129Xe纳米颗粒类型的分子探针，然后结合Hyper-CEST技术对疏水型药物的运输和释放进行监测，实现靶向给药的准确性。也就是以葫芦[6]脲为单元，合成内部中空的水溶性纳米颗粒，在一次测试过程中，会有双信号的出现以及改变，双信号分别来源于葫芦[6]脲的空腔以及纳米颗粒内部空腔，这样可以避免阴性或者假阳性信号的出现，实现药物的准确传递。
为了实现以上发明目的，本发明采取如下技术方案：
一种可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针，所述分子探针由两亲性单体在水溶液中靠分子间相互作用力自组装而成，所述两亲性单体为用亲水性基团修饰的带有疏水空腔的129Xe分子笼葫芦[6]脲，所述修饰部位为葫芦[6]脲分子的腰部，所述用亲水性基团修饰的修饰物为长链PEG，优选为分子量2000-10000的巯基-聚乙二醇(SH-PEG)。
上述可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针用于递送疏水性药物时所述疏水性药物负载于由两亲性单体在水溶液中靠分子间相互作用力自组装形成的空腔内(结构示意图见图1)。
进一步，本发明提供了一种所述可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)、在氮气保护下，向葫芦[6]脲(CB[6])中加入盐酸(盐酸的优选浓度范围为3.0-3.5mol/L，操作时可以通过加较浓盐酸和水的方式达到此浓度范围)，超声使葫芦[6]脲全部溶解后，加入过氧化氢溶液，剧烈搅拌溶液并使其在紫外光下照射至少1小时，然后减压蒸发溶剂，得到粗产物白色固体，粗产物用硅胶柱色谱纯化，得到单羟基葫芦[6]脲(CB[6]-(OH)1)；
所述葫芦[6]脲和过氧化氢溶液中过氧化氢的比例为1g：(4-6)×10-4mol，优选为1g：5×10-4mol；
所述硅胶柱色谱纯化中优选使用水、乙酸和甲酸的混合物作为洗脱剂，进一步，水/乙酸/甲酸体积比为10：10：1；
2)、在冰水浴中，向NaH(一般纯度为60％，分散在在矿物油中)的无水DMSO溶液中加入单羟基葫芦[6]脲(CB[6]-(OH)1)并在室温下搅拌至少0.5小时。在冰水浴中将烯丙基溴加入到上述反应混合物中并在室温下搅拌至少8小时。将反应混合物倒入冰水中，得到白色固体，依次用水、乙醚洗涤，最后真空干燥，得到化合物3-丙烯基-1-氧单取代葫芦[6]脲(CB[6]-(OCH2CH＝CH2)1)；
所述NaH(以NaH化合物计量)：无水DMSO：单羟基葫芦[6]脲：烯丙基溴＝30mg：(30-40)mL：(180-220)mg：(80-120)μL，最佳比例为50mg：35mL：200mg：100μL；
3)、将巯基-聚乙二醇SH-PEG加入到3-丙烯基-1-氧单取代葫芦[6]脲(CB[6]-(OCH2CH＝CH2)1)的甲醇溶液中，N2脱气后用紫外光照射混合物至少2天后，减压除去溶剂，将粗产物透析至少2天，冻干得到产物，单体3-巯基-聚乙二醇丙烷-1-氧单取代葫芦[6]脲(CB[6]-(OCH2CH2CH2-S-PEG)1)；
优选的，SH-PEG的平均分子量为2000-10000，最佳为5000；
所述巯基-聚乙二醇：3-丙烯基-1-氧单取代葫芦[6]脲：甲醇＝150mg：(15-25)mg：(1-3)mL，最佳比例为150mg：20mg：2mL；
优选的，所述透析采用截留分子量MWCO为5000-5500Da的透析袋，最佳为截留分子量MWCO为5000Da的透析袋；
4)、将单体3-巯基-聚乙二醇丙烷-1-氧单取代葫芦[6]脲(CB[6]-(OCH2CH2CH2-S-PEG)1)，在蒸馏水中超声，得到目标纳米颗粒，即为可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针。
步骤1)和步骤3)中紫外光的波长为254nm。
优选的，步骤4)中超声时间为30min。
将上述可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针作为分子笼用于递送疏水性药物时，所述可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针作为分子笼应用于疏水性药物的制备，其过程如下：
将上述步骤3)中所得单体3-巯基-聚乙二醇丙烷-1-氧单取代葫芦[6]脲、疏水性药物混合溶解在有机溶剂中，蒸干溶剂后加水超声形成载药纳米颗粒水溶液。
本发明还研究了所述可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针的应用，应用过程中，采用磁共振波谱仪与超极化装置联用来检测129Xe化学交换饱和转移信号，利用该信号的变化来获取疏水性药物传递的信息。
还可以将所述可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针作为分子笼用于临床疏水性药物筛选的研究，具体过程如下：
可以通过核磁共振的方法进行一系列疏水性药物的筛选，包括药物的负载效率和其在细胞中的释放速率。
将所述可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针作为分子笼用于天然混合物中某一种化合物的分离，具体过程如下：
从天然混合物中选择包封某一种化合物(如从二糖混合物中选择包封D-蔗糖)；
还可以利用所述可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针，通过核磁共振的方法选择性识别和分离水中复杂生物分子。
本发明的一种可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针，与现有技术相比，有益效果和优点在于：
在超极化129Xe磁共振测试中，一次采样会有双信号的出现以及改变，这样可以避免阴性或者假阳性信号的出现，同时纳米颗粒内部疏水空腔可以实现疏水药物传递的准确判断。
附图说明
图1为实施例1中分子探针结构示意图，其中双信号分别来源于葫芦[6]脲的空腔以及纳米颗粒内部空腔；
图2为实施例1中纳米颗粒结构的透射电镜图；
图3为实施例2中纳米颗粒在水溶液中的Z谱图；
图4为实施例3中纳米颗粒载入尼罗红后在水溶液中的荧光共聚焦成像；
图5为实施例3中纳米颗粒载入尼罗红前后信号变化的Z谱图；
图6为实施例4中模拟载药纳米颗粒与细胞共孵育后的荧光共聚焦成像；
图7为实施例5中模拟载药纳米颗粒与细胞共孵育后在水溶液中的Z谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于阐述本发明而不用于限制本发明权利要求书的范围。此外应理解，在阅读了本发明所讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价形式同样落于本申请所依附权利要求书所限定的范围。
下面结合具体实施例以及图1～图7，对本发明进行详细说明。
实施例1-5所采用的主要试剂以及材料来源如下：
NaH(纯度60％，分散在在矿物油中)、乙酸、甲酸、过氧化氢溶液、乙醚、浓盐酸、甲醇均从国药集团购买，为分析纯级别。
烯丙基溴购买自萨恩化学技术(上海)有限公司，为分析纯级别。
SH-PEG(MW:5000)购买自上海芃圣生物科技有限公司，名称为甲氧基聚乙二醇巯基，MPEG5000-SH，为化学纯级别。
葫芦[6]脲为根据文献方法(S.Y.Jon,N.Selvapalam,D.H.Oh,J.-K.Kang,S.-Y.Kim,Y.J.Jeon,J.W.Lee and K.Kim,J.Am.Chem.Soc.,2003,125,10186)在实验室自行制备。
如无特殊说明，以上试剂均是直接使用，未经过进一步的纯化。
所用水均为去离子水。
人非小细胞肺癌细胞A549购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
实施例1纳米颗粒具体合成，步骤如下：
1)、在氮气保护下，将1.00g葫芦[6]脲(CB[6])加入50mL的圆底烧瓶中，加入20mL蒸馏水和10mL 10M HCl溶液。超声使葫芦脲全部溶解后，加入50μL过氧化氢溶液(含过氧化氢5×10-4mol)。剧烈搅拌溶液并使其在254nm波长的紫外光下照射2小时。然后减压蒸发溶剂，得到粗产物白色固体。粗产物用硅胶柱色谱纯化，用水、乙酸和甲酸的混合物(水/乙酸/甲酸体积比为10：10：1)洗脱，得到CB[6]-(OH)1 283mg；
2)、在冰水浴中，向NaH(纯度60％，为在矿物油中的分散体，总质量为50mg)的无水DMSO(无水DMSO用量为35mL)溶液中加入200mg CB[6]-(OH)1并在室温下搅拌1小时。在冰水浴中将100μL烯丙基溴加入到该反应混合物中并在室温下搅拌12小时。将反应混合物倒入冰水(100mL)中，得到白色固体，依次用水、乙醚彻底洗涤，最后真空干燥，得到化合物CB[6]-(OCH2CH＝CH2)187mg；
3)、在50mL圆底烧瓶中，将150mg SH-PEG(MW:5000)加入到溶有20mg CB[6]-(OCH2CH＝CH2)1的甲醇(甲醇用量2mL)溶液中，并用N2脱气。用紫外光(254nm)照射混合物3天后，在减压下除去溶剂。将粗产物用截留分子量MWCO为5000Da的透析袋透析3天，冻干得到产物，单体CB[6]-(OCH2CH2CH2-S-PEG)1 107mg；
4)、将单体CB[6]-(OCH2CH2CH2-S-PEG)1，加入到蒸馏水中超声30min，即得到目标纳米颗粒水溶液，所得溶液以单体计浓度为0.5-2.5mg/mL；
本实施例制备的纳米颗粒结构示意图如图1所示，单体CB[6]-(OCH2CH2CH2-S-PEG)1一端亲水，一端疏水，超声时在亲疏水作用下形成纳米颗粒。其中双信号分别来源于葫芦[6]脲的空腔以及纳米颗粒内部空腔。
将本实施例制备的纳米颗粒(单体浓度1mg/mL)用高分辨率透射电镜进行扫描，所得的高分辨透射电镜图如图2所示，从图2中可以看出纳米颗粒的粒径在450nm左右。
实施例2实施例1制备的纳米颗粒在水溶液中的Z谱图的测试，具体步骤如下：
129Xe核磁共振和磁共振成像实验在配备有微成像梯度线圈的400MHz(9.4T)Bruker AV400宽口径波普仪(Bruker Biospin，Ettlingen，Germany)上进行，Xe核的RF脉冲频率为110.7MHz。129Xe NMR谱使用10mm双谐振探头(129Xe和1H，PA BBO 400W1/S2BB-HD-10Z)，具有翻转角(90°)的矩形脉冲。使用连续流动极化装置通过自旋交换光泵法产生超极化的129Xe气体。核自旋极化度大约为20％。由体积百分数10％N2、88％He和2％Xe(Xe为86％富集的129Xe或天然丰度129Xe，本实施例用的是天然丰度129Xe)组成的混合气体直接通到10mm核磁管中持续20秒，然后等待3s，以确保产生的气泡完全破裂，再采集信号。在NMR波谱仪上，样品温度设定为300k。在实施例1步骤4)中，将2.64mg的单体CB[6]-(OCH2CH2CH2-S-PEG)1溶解在2ml的蒸馏水中，超声30min。连续(CW)饱和脉冲扫描的化学位移范围为δ＝30-250ppm。
本实施例测得纳米颗粒在水溶液中的Z谱图结果如图3所示。在纳米颗粒的Hyper-CEST谱中显示了三个CEST信号。一个信号归因于溶解态的129Xe直接饱和，化学位移在δ＝193.5ppm，而另两个信号是申请人想要得到的，研究药物传递的双信号。其中一个信号在100ppm，源自于葫芦[6]脲中内的129Xe的化学转移。另外一个信号在205ppm，源于纳米颗粒内部的129Xe的化学转移。
实施例3实施例1制备的纳米颗粒载药实验，步骤如下：
首先，取2.00mg实施例步骤3)中制备的单体CB[6]-(OCH2CH2CH2-S-PEG)1溶解在2ml的甲醇中，加入80μl 1mmol/L的尼罗红乙醇溶液，旋干溶剂，制成薄膜，然后加入2ml的蒸馏水，超声30min。
实施例4和5的模拟载药纳米颗粒参照上述方法制备，仅改变单体CB[6]-(OCH2CH2CH2-S-PEG)1用量。
本实施例制得的模拟载药纳米颗粒在水溶液中的荧光共聚焦成像如图4所示，因为尼罗红为红色疏水染料，只有在疏水环境下才能发出红色荧光，现将尼罗红替代疏水性药物包裹在纳米颗粒内部，以此来确定纳米颗粒内部空腔是否为疏水空腔，确定其是否有传递疏水药物的可能。由共聚焦的红色荧光可以看出，纳米颗粒内部为疏水的环境，具有传递疏水性药物的可能。
将本实施例制得的模拟载药纳米颗粒，按照实施例2的操作进行CEST测试，并将其与未载药的纳米颗粒进行对比，结果如图5所示。观察到申请人所关注的双信号出现改变；在100ppm处，源自于葫芦[6]脲中内的129Xe的化学转移信号会有所减弱，并且向高场有微小的偏移。另外一个在200ppm，源于纳米颗粒内部的129Xe的化学转移信号也会减弱，甚至消失。
在图3中可以看到在200ppm处的信号有2个，左边为纳米颗粒内部信号，右边为129Xe溶解态信号，右边信号只要在水体系中是不会改变的，我们在这两个信号中观察的是左边信号。图5中可以看出载药后左边信号消失，只有溶解态信号。
结论：当纳米颗粒内部载入疏水药物时，纳米颗粒内部信号会减弱甚至消失，葫芦[6]脲中内的信号会出现减弱与偏移，借助两个信号的变化，可以判断药物是否被成功载入，以及其是否成功释放。
实施例4参照实施例3制备的模拟载药纳米颗粒与细胞共孵育，步骤如下：
用A549细胞进行体外细胞摄取实验。将A549细胞在含有10％胎牛血清、100单位/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素(博士德，中国)的F-12k培养基中于37℃在5％CO2的潮湿空气中培养。
将细胞以2×10 5个/mL的密度接种在6孔板中，孵育12小时使其贴壁，然后加入500μL2mg/mL(将实施例3中单体用量加倍即可)的模拟载药纳米颗粒水溶液于培养基中，在37℃下共孵育1、2、4小时。用PBS洗涤3次后，用4％多聚甲醛在室温下固定10分钟。固定的细胞用DAPI染色5分钟，并用PBS洗涤4次。最后将细胞固定在载玻片上，在激光共聚焦扫描显微镜(A1R/A1，Nikon，Japan)下成像。
本实施例可以观察到模拟载药纳米颗粒与细胞共孵育后的荧光共聚焦成像，如图6所示，可以看出，随着时间的增长，纳米颗粒进入细胞的含量增加，并在细胞内部释放出更多的尼罗红；即随着时间的增加，观察到细胞质中的红色荧光越来越强。表明此纳米颗粒有疏水性药物传递的功能。
实施例5参照实施例3制备的模拟载药纳米颗粒在细胞中的Z谱图的测试，步骤如下：
在6mL A549细胞的培养基中加入4mL 4mg/mL(将实施例3中单体用量加三倍即可)的模拟载药纳米颗粒水溶液，然后在37℃下共孵育3小时，然后用PBS洗涤3次去除细胞外的纳米颗粒，最后将细胞分离下来，悬浮在2ml PBS中按照实施例2的操作进行Hyper-CEST实验。
本实施例可以观察到模拟载药纳米颗粒进入细胞后，双信号的改变，结果如图7所示。纳米颗粒在细胞中释放尼罗红后，双信号也出现了较为明显的改变。100ppm处的化学位移会往低场偏移至120ppm，水峰附近200ppm处的化学位移的峰会明显变宽。
结论分析：同图5所示载入药物的曲线对比可以看出，纳米颗粒内部信号会重新出现与溶解态信号重叠使其在200ppm处信号大大加宽，葫芦[6]脲中内的信号向低场偏移，借助两个信号的变化，由此可知纳米颗粒被细胞吞噬，并且在细胞中释放疏水性药物。

Claims (9)

1.一种可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针，所述分子探针由两亲性单体在水溶液中自组装而成，所述两亲性单体为用亲水性基团修饰的葫芦[6]脲，所述修饰部位为葫芦[6]脲分子的腰部，所述用亲水性基团修饰的修饰物为平均分子量2000-10000的巯基-聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述的分子探针，其特征在于：所述巯基-聚乙二醇平均分子量为5000。
3.将权利要求1或2所述的分子探针应用于递送疏水性药物，其特征在于：所述疏水性药物负载于由两亲性单体在水溶液中靠分子间相互作用力自组装形成的空腔内。
4.一种权利要求1或2所述的分子探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）、在氮气保护下，向葫芦[6]脲中加入3.0-3.5mol/L盐酸，超声使葫芦[6]脲全部溶解后，加入过氧化氢溶液，剧烈搅拌溶液并使其在紫外光下照射至少1小时，然后减压蒸发溶剂，得到粗产物白色固体，粗产物用硅胶柱色谱纯化，得到单羟基葫芦[6]脲；
所述葫芦[6]脲和过氧化氢溶液中过氧化氢的比例为1g：（4-6）×10-4mol；
2）、在冰水浴中，向NaH的无水DMSO溶液中加入单羟基葫芦[6]脲并在室温下搅拌至少0.5小时，在冰水浴中将烯丙基溴加入到上述反应混合物中并在室温下搅拌至少8小时，将反应混合物倒入冰水中，得到白色固体，依次用水、乙醚洗涤，最后真空干燥，得到化合物3-丙烯基-1-氧单取代葫芦[6]脲；
所述NaH：无水DMSO：单羟基葫芦[6]脲：烯丙基溴=30mg：（30-40）mL：（180-220）mg：（80-120）μL；
3）、将平均分子量为2000-10000的巯基-聚乙二醇加入到3-丙烯基-1-氧单取代葫芦[6]脲的甲醇溶液中，N2脱气后用紫外光照射混合物至少2天后，减压除去溶剂，将粗产物透析至少2天，冻干得到单体3-巯基-聚乙二醇丙烷-1-氧单取代葫芦[6]脲；
所述巯基-聚乙二醇：3-丙烯基-1-氧单取代葫芦[6]脲：甲醇=150mg：（15-25）mg：（1-3）mL；
4）、将单体3-巯基-聚乙二醇丙烷-1-氧单取代葫芦[6]脲在蒸馏水中超声，得到可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：巯基-聚乙二醇平均分子量为5000。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：所述透析采用截留分子量MWCO为5000-5500Da的透析袋。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述可以递送疏水性药物的超极化129Xe磁共振分子探针作为分子笼应用于疏水性药物的制备的过程如下：
将权利要求4所述制备方法的步骤3）中所得单体3-巯基-聚乙二醇丙烷-1-氧单取代葫芦[6]脲、疏水性药物混合溶解在有机溶剂中，蒸干溶剂后加水超声形成载药纳米颗粒水溶液。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：采用磁共振波谱仪与超极化装置联用来检测所述载药纳米颗粒水溶液的129Xe化学交换饱和转移信号，利用该信号的变化来筛选和/或研究临床疏水性药物。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：采用磁共振波谱仪与超极化装置联用来检测所述载药纳米颗粒水溶液的129Xe化学交换饱和转移信号，获取包括药物的负载效率和药物在细胞中的释放速率在内的信息。
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