CN109134380A - 氯代氨基咪唑类化合物及其制备方法、用途和检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种氯代氨基咪唑类化合物及其盐，以及它们的制备方法、用途和高效液相色谱检测方法。所述氯代氨基咪唑类化合物包括4‑氯‑1‑甲基‑1H‑咪唑‑2‑胺、(4‑氯‑1‑甲基‑1H‑咪唑‑2‑基)二氯磷酰胺、(4‑氯‑1‑甲基‑1H‑咪唑‑2‑基)氨基磷酸。通过将这些化合物作为对照品，控制、检测磷酸肌酸二钠制备过程中的中间体及产品纯度，从而能够有效地控制磷酸肌酸二钠原料药及其制剂的质量。
Description
技术领域
本发明涉及氯代氨基咪唑类化合物及其制备方法、用途和检测方法。
背景技术
磷酸肌酸为机体重要的生理活性物质之一，它在体内的能量代谢中发挥十分重要的作用，作为机体化学能量的储备形式，用于高能磷酸键的再合成。磷酸肌酸于1927年由哺乳动物肌肉中分离得到，其后进行了化学合成，并将其制成钠盐用于临床。临床研究证实了磷酸肌酸二钠(也称磷酸肌酸钠、磷酸肌酸二钠四水合物)在保护心肌、治疗心肌损害等方面优于1,6-二磷酸果糖[广西医科大学学报,2016,33(3):516-518.]。磷酸肌酸二钠除应用于心肌保护外，还对神经细胞起保护作用，另外还是不违反兴奋剂规则的力量和速度运动比赛项目的首选运动补剂[天津药学,2004,16(1):60-62]。
目前工业上大规模的磷酸肌酸二钠生产主要为化学合成法及酶促合成法。酶促合成法虽然反应条件温和、绿色环保，但操作过程烦琐、成本高、效率低，一定程度上限制了其生产规模。因此，化学合成法是外源性磷酸肌酸二钠的主要生产途径，并以肌酐在三氯氧磷条件下磷酰化反应后再水解开环的合成方法应用最广泛。常见的磷酸肌酸二钠的杂质为肌酸、肌酐、磷酸肌酐等。
原料药有关物质是影响药效和引起不良反应的主要因素之一，尤其磷酸肌酸二钠是以注射剂形式用于临床，相比其它剂型，对产品的品质和安全性有更高的要求。为了磷酸肌酸二钠的用药安全，达到有效控制其质量的目的，对药品中有关物质的研究显得尤为重要。
发明内容
本发明人研究磷酸肌酸二钠的传统工艺发现，其中间体以及终产物中存在一些有关物质。如果这些有关物质没有被有效地除去，对终产物的质量产生较大的影响。本发明人进一步寻求减少磷酸肌酸二钠产品中这些有关物质的含量的方法，从而达到有效地控制磷酸肌酸二钠产品质量的目的。
本发明人进一步研究发现，在磷酸肌酸二钠的合成过程，4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的存在，会进一步影响中间体或终产物中(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸或其盐(例如(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠)的含量，最终对磷酸肌酸二钠产品的质量产生影响。
为此，本发明一方面，提供一种氯代氨基咪唑类化合物或其盐，所述氯代氨基咪唑类化合物具有如下式(I)所示的化学结构：
其中，R1为H或R为Cl或OH；
当R1为H时，化合物为：
当R1为R为Cl时，化合物为：
当R1为R为OH时，化合物为：
优选地，所述的盐选自4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐、乳酸盐、醋酸盐、琥珀酸盐、枸橼酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐；或者(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的碱金属盐、碱土金属盐、铵(NH4 +)盐、二甲胺盐、三乙胺盐、四丁基铵盐、哌啶盐、吡啶盐、二甲氨基吡啶盐。(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的盐优选为其锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或钡盐，更优选为其钠盐，更优选为(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠。
本发明另一方面还提供所述的4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的制备方法，其包括以下两种合成方法：
方法一：以肌酐或其盐(例如盐酸肌酐)为起始物料，以水为诱导剂，与三氯氧磷进行回流反应生成，合成路线如下：
采用适当的方法分离纯化4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺。
方法二：
(1)以肌酐或其盐(例如盐酸肌酐)为起始物料，加入起始物料质量的0.01％-2％的水，作为诱导剂，与三氯氧磷进行回流反应。除去多余的三氯氧磷，优选减压蒸馏除去，优选将三氯氧磷回收利用；
(2)向反应体系中加入起始物料质量的2-10倍，优选5-8倍的溶剂，搅拌后过滤，优选抽滤(滤液含有二氯磷酰肌酐为主要成分，可用于合成磷酸肌酐二钠)；
所述溶剂选自卤代烃、醋酸烷基酯、2-8碳脂肪(芳基)醚、2-8碳烷烃、6-8碳芳烃；优选卤代烃，更优选二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷；更优选二氯甲烷；
(3)向滤饼中加入水，或者加无机酸水溶液控制pH＜2，进行水解反应，优选室温加水水解，然后调节反应体系pH值至8-12，优选9-10，优选加入NaOH调节pH值；
(4)用起始物料质量(肌酐或其盐)的10-50倍，优选25-35倍的溶剂萃取，优选分2-3次萃取，之后，将萃取溶剂蒸除，得到4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺粗品；
优选用溶剂洗涤该粗制品，洗涤溶剂用量优选为始物料质量的0.1-1倍，优选0.4-0.6倍；
步骤(4)的溶剂为：卤代烃、醋酸烷基酯、2-8碳脂肪(芳基)醚、2-8碳烷烃、6-8碳芳烃、4-8碳脂肪醇等与水不互溶的有机溶剂，优选正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、甲基叔丁基醚等，更优选氯仿、二氯甲烷，最优选二氯甲烷；
合成路线如下：
可选地，上述4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的制备方法，进一步包括以下步骤：
(5)向所述粗品中加入粗品质量的20-50倍，优选25-35倍的溶剂溶解，
优选向溶液中加入活性炭并过滤除去，所述溶剂与步骤(4)中的溶剂相同；
(6)将溶液浓缩至原粗品质量的5-15倍，优选8-10倍，加热溶解澄清后放置析晶获得4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺纯品；
优选用溶剂洗涤该纯品，洗涤溶剂用量优选为始物料质量的0.1-1倍，优选0.4-0.6倍，所述溶剂与步骤(4)中的溶剂相同。
本发明还提供一种(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的制备方法，其包括以下步骤：
(1)以肌酐或其盐(例如盐酸肌酐)为起始物料，加入起始物料质量的0.01％-2％的水，作为诱导剂，与三氯氧磷进行回流反应。除去多余的三氯氧磷，优选减压蒸馏除去，优选将三氯氧磷回收利用；
(2)在常温下，向反应体系中加入起始物料质量的2-10倍，优选5-8倍的溶剂，搅拌后过滤，优选抽滤(滤液含有二氯磷酰肌酐为主要成分，可用于合成磷酸肌酐二钠)，得到的滤饼为(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺粗品；
所述溶剂为：卤代烃、醋酸烷基酯、2-8碳脂肪(芳基)醚、2-8碳烷烃、6-8碳芳烃，优选乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、1,2-二氯乙烷、甲基叔丁基醚等无水溶剂，更优选无水氯仿、无水二氯甲烷，最优选无水氯仿，
合成路线如下：
可选地，上述(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的制备方法，进一步包括以下处理步骤：
(3)将粗品用起始物料质量(即肌酐或其盐质量)的10-50倍，优选15倍的溶剂，在低于溶剂回流温度下加热溶解；优选向溶液中加入活性炭并过滤除去；所述溶液与步骤(2)溶剂相同。
(4)将滤液在-80～10℃，优选-20～0℃温度下冷冻析晶，获得(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺精制品。
可选地，在上述4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的制备方法中，所述三氯氧磷与肌酐或其盐(如肌酐盐酸盐)的体积重量比(ml/g)为：10～60:1，优选20～40:1。
本发明还提供一种(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的制备方法，其包括以下步骤：
(1)在合适的温度下将(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺加入水中进行水解反应，优选水加入量为(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺质量的2-5倍，更优选2.5-3.5倍；
(2)加入溶剂，溶剂加入量为水质量的5-10倍，优选8-10倍，搅拌至产生固体，过滤，优选抽滤，滤饼为(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸；
所述溶剂为：C1-C4的醇类、丙酮、丁酮以及水溶性醚类(如四氢呋喃、二氧六环、乙二醇单甲醚等)的至少一种，优选甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮的至少一种，最优选甲醇、丙酮的混合溶剂；
合成路线如下：
可选地，上述(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的制备方法，进一步包括以下处理步骤：
(3)向所得产物中加入溶剂并打浆洗涤，抽滤(优选抽滤)除去溶剂，固体加水溶解，优选向水溶液中加入活性炭处理后，过滤除去活性炭，所述水的量与步骤(1)相同，所述溶剂与步骤(2)中的溶剂相同；
(4)然后加入水溶液体积的20-60倍，优选30-36倍体积的溶剂，放置析晶，得到(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸精制品；优选用溶剂洗涤该精制品，所述溶剂与步骤(2)中的溶剂相同；
优选在步骤(4)之前，将水溶液加热浓缩至总体积的40-60％。
可选地，上述(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的制备方法中，所述水解在30℃以下进行，优选10℃以下进行，更优选在4℃以下进行，进一步优选在冰浴条件下进行，最优选以加入碎冰代替水进行反应。
本发明还提供一种(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐的制备方法，其包括以下步骤：
(1)以(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸或(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺、以及碱作为起始物料，加入水进行反应。在碱水解过程中，磷酰胺键相对稳定，并且低温可减少磷酰胺键水解，生成少量的4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺可在后面精制中溶于有机溶剂除去。
优选地，所述碱选自碱金属或碱土金属的氢氧化物、碳酸盐、磷酸盐，氨水，二甲胺，三乙胺，四丁基氢氧化铵，哌啶，吡啶，二甲氨基吡啶，优选为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化锂、氢氧化钡等；更优选氢氧化钠、氢氧化钾；进一步优选氢氧化钠；
优选加入水的质量为起始物料质量的2-5倍，优选3倍；
(2)加入水质量4-10倍，优选5-6倍的溶剂，析晶得到(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐；
所述溶剂选自：C1-C4的醇类、丙酮、丁酮以及水溶性醚类(如四氢呋喃、二氧六环、乙二醇单甲醚等)的至少一种，优选甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮的至少一种，最优选乙醇；
可选地，上述(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐的制备方法中，所述反应在30℃以下进行，优选10℃以下进行，更优选4℃以下进行，最优选在冰浴条件下进行。
本发明还提供上述氯代氨基咪唑类化合物或其盐在磷酸肌酸或其盐(优选磷酸肌酸二钠)、或它们的中间体、或它们的制剂的质量检测或控制中作为有关物质对照品的用途。所述氯代氨基咪唑类化合物的盐可以为以上所列举的盐。优选地，所述氯代氨基咪唑类化合物或其盐为4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸和/或(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐；优选地，所述(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐为(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠。
优选地，所述的磷酸肌酸或其盐(优选磷酸肌酸二钠)、或它们的中间体、或它们的制剂的质量检测或控制采用高效液相色谱法。
本发明还提供一种检测上述氯代氨基咪唑类化合物或其盐的方法，所述方法采用所述方法采用高效液相色谱法进行。
优选地，所述方法为检测上述氯代氨基咪唑类化合物或其盐的纯度或含量的方法。
优选地，所述方法为检测磷酸肌酸或其盐(优选磷酸肌酸二钠)、或它们的中间体、或它们的制剂中氯代氨基咪唑类化合物或其盐是否存在或含量的方法。
优选地，所述氯代氨基咪唑类化合物或其盐为4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸和/或(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐；优选地，所述(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐为(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠。
在高效液相色谱法中，所述盐与其对应的游离酸或碱的保留时间值是一致的。
优选地，在上述高效液相色谱法中，流动相为选自水、缓冲液、甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃中的一种或多种；优选地，所述缓冲液采用选自磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸、四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、庚烷磺酸钠、庚烷磺酸钾、戊烷磺酸钠、戊烷磺酸钾、辛烷磺酸钠或辛烷磺酸钠中的一种或多种配制的水溶液。优选地，流动相中以乙腈或甲醇为有机相，优选乙腈；以离子对试剂：磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸、四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、庚烷磺酸钠、戊烷磺酸钠或辛烷磺酸钠的水溶液为水相，优选四丁基氢氧化铵和磷酸二氢钾的水溶液用磷酸或氨试液调节至预定的pH值为水相。
有机相与水相的体积比为0-20:80-100；优选体积比为：0-5:95-100；
离子对试剂的浓度优选为0.01％～0.2％，进一步优选浓度为0.1％；
水相的pH为5.5-8.5，优选为6.0-7.5；
固定相优选为硅胶柱，优选为碳十八柱、碳八柱、碳四柱或苯基柱，更优选为碳十八柱。
优选地，检测器为紫外检测器、DAD检测器；
优选紫外检测器检测波长为180-250nm，更优选210nm。
可选地，上述检测方法用于测定：
(1)4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸和/或(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐的纯度，
其中，有机相:水相的比例为0-20:80-100，优选为：4:96；
或者(2)待测样品(例如磷酸肌酸或其盐(优选磷酸肌酸二钠)、或它们的中间体、或它们的制剂)中作为有关物质存在的4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸和/或(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐的含量，
其中，有机相:水相的比例为0-20:95-100，优选为：0:100
可选地，上述的检测方包括：
取待测样品适量，加流动相溶解稀释成规定浓度的溶液，作为供试品溶液；
取4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺或(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸或(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐适量，精密称定，分别用流动相溶解并定量稀释制成规定浓度的溶液，作为有关物质对照品溶液；
按照含量测定方法的色谱条件，精密量取有关物质对照品溶液、供试品溶液，注入液相色谱仪，测定待测品中4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸和/或(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐的含量，
优选地，所述(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐为锂、钠、钾、钙、镁、钡盐，更优选为(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠。
(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺为酰氯结构，在水溶液中容易降解为(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸；(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸与(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐可以通过调节溶液pH值相互转化。在测定时，可以依据测定样品的生产工艺和产品状态，确定产品中所含上述有关物质的存在形式，计算含量时，可以依据对照品和目标测定物的分子量进行换算。
下面以(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠为其盐的代表，将分子量列表如下：
当以上述任一化合物为对照品时，计算各化合物的含量时，其计算的校正因子列表如下：
有益效果
本发明人对磷酸肌酸二钠的生成工艺进行研究，确定其中存在的几种氯代氨基咪唑类化合物有关物质及其对终产物质量的影响，并提供了氯代氨基咪唑类化合物的制备和纯化方法，还提供了上述有关物质的高效液相色谱检测方法，将其作为对照品，控制、检测磷酸肌酸二钠产品纯度，从而能够有效地控制磷酸肌酸二钠原料药及其制剂的质量。
另外，本发明的制备方法，操作简单高效，反应条件较适中，安全性强，易于控制，所得化合物的高效液相检测纯度高：4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺为99％以上,(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺为95％以上，4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸为98％以上，4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠为98％以上。
附图说明
图1是4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的HPLC图谱。
图2是4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的核磁共振氢谱。
图3是4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的质谱。
图4是(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的HPLC图谱。
图5是(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的核磁共振氢谱。
图6是(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的质谱。
图7是(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的HPLC图谱。
图8是(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的核磁共振氢谱。
图9是(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的质谱。
图10是(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠的HPLC图谱。
图11是(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠的核磁共振氢谱。
图12是(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠的质谱。
图13是实施例5中系统适用性溶液的HPLC图谱。
图14是实施例5中供试品溶液HPLC图谱。
图15是实施例6中系统适用性溶液HPLC图谱。
图16是实施例6中二氯磷酰肌酐供试品溶液的HPLC图谱。
图17是实施例7中系统适用性溶液HPLC图谱。
图18是实施例7中供试品溶液HPLC图谱。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于示例性对本发明进行说明，并不用于限制本发明。
实施例1：4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的合成
肌酐60g投入反应瓶中，加入水0.5mL混合均匀后再加入三氯氧磷1.2L，反应液升温至130℃回流反应48h。将反应液降温至40℃，维持40-50℃减压回收三氯氧磷。向残留物中加入二氯甲烷300mL，搅拌2h，抽滤，滤饼缓慢投入240mL水中，加完后室温搅拌反应2h，反应液用20％氢氧化钠溶液调节pH 9-10，加入二氯甲烷600mL×3萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液于35℃减压蒸除干，并向残留物中加入二氯甲烷30mL，打浆30min，抽滤，滤饼用30mL二氯甲烷洗涤，于35℃减压干燥得4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺粗品10.8g。取4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺粗品，用二氯甲烷300mL溶解，加入活性炭1.2g搅拌15min，抽滤，滤液浓缩至约90mL，加热溶解澄清后放置析晶1天。抽滤，滤饼用30mL二氯甲烷洗涤。35℃减压干燥2h，得4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺精制品6.9g。
HPLC纯度99.15％(面积归一化法)(仪器：Waters e 2695；色谱柱：Welch C18柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：V(0.0125％磷酸水溶液)：V(乙腈)＝96:4；检测波长：210nm；温度：35℃；流速：1.0mL/min)。
HPLC峰结果如下：
峰结果
IR(cm-1)：3402,3300,3117,2891,1646,616；
1H NMR(DMSO-d6)δ(ppm):3.26(3H，s)，5.59(2H，s)，6.55(1H，s)；
13C NMR(DMSO-d6)δ(ppm):31.1，110.2，122.5，148.4；
ESI-HRMS(m/z)：132.0323[M+H]+，134.0285[M+2+H]+。
实施例2：(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的合成
肌酐盐酸盐60g投入反应瓶中，加入水0.6mL混合均匀后再加入三氯氧磷1.2L，反应液升温至130℃回流反应72h。将反应液降温至40℃，维持40-50℃减压回收三氯氧磷。残留物中加入无水氯仿300mL，密闭搅拌2h，抽滤，滤饼用无水氯仿900mL加热溶解，加入活性炭9g，搅拌30min，抽滤，滤液置于冰箱冷冻析晶24h，抽滤，氯仿100mL洗涤滤饼，35℃减压干燥得16.5g(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺精制品16.5g。
HPLC纯度95.70％(以(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸计，面积归一化法)(仪器：Waters e 2695；色谱柱：Welch C18柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：V(0.0125％磷酸水溶液)：V(乙腈)＝96:4；检测波长：210nm；温度：35℃；流速：1.0mL/min)。
HPLC峰结果如下：
峰结果
IR(cm-1)：3293，1635,964；
1H NMR(CDCl3)δ(ppm):3.11(3H，s)，5.20(1H，s)，6.62(1H，s)；
13C NMR(CDCl3)δ(ppm):32.1，112.5，117.4，142.9；
ESI-HRMS(m/z)：247.9310[M+H]+。
实施例3：(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的合成
取(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺15g，分批投入40g碎冰中，加完搅拌至澄清，反应液中加入丙酮320mL，反应液析出油状物，室温搅拌过夜固化，抽滤，滤饼用甲醇100mL×2打浆，抽滤，滤饼用水30mL溶解，活性炭0.6g脱色，抽滤，滤液于40℃浓缩至15mL左右，加入甲醇240mL后再加入丙酮240mL，室温放置析晶1h，抽滤，丙酮15mL洗涤滤饼，35℃减压干燥得1.08g(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸精制品。
HPLC纯度98.21％(面积归一化法)(仪器：Waters e 2695；色谱柱：Welch C18柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：V(0.0125％磷酸水溶液)：V(乙腈)＝96:4；检测波长：210nm；温度：35℃；流速：1.0mL/min)。
HPLC峰结果如下：
峰结果
IR(cm-1)：3446，3099，2813，1628，1101，965；
1H NMR(D2O)δ(ppm):3.08(3H，s)，6.85(1H，s)；
13C NMR(D2O)δ(ppm):32.9，113.9，115.4，141.5；
ESI-HRMS(m/z)：211.9992[M+H]+，213.9939[M+2+H]+。
实施例4：(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠的合成
取氢氧化钠0.32g溶解于3mL水中，加入(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸精制品0.84g，搅拌至澄清后，冰浴下加入乙醇15mL搅拌析晶8h，抽滤，滤饼用无水乙醇10mL洗涤，45℃减压干燥得0.65g(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠。
HPLC纯度98.11％(面积归一化法)(仪器：Waters e 2695；色谱柱：Welch C18柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：V(0.0125％磷酸水溶液)：V(乙腈)＝96:4；检测波长：210nm；温度：35℃；流速：1.0mL/min)。
HPLC峰结果如下：
峰结果
IR(cm-1)：3357，1605，1500，1095，984；
1H NMR(D2O)δ(ppm):3.06(3H，s)，6.80(1H，s)；
13C NMR(D2O)δ(ppm):32.5，112.9，117.4，143.5；
ESI-HRMS(m/z)：277.9449[M+Na]+,279.9421[M+2+Na]+。
实施例5
液相色谱法测定磷酸肌酸二钠中4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺与(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠的含量。
1.材料
1.1仪器和材料
岛津2010AT高效液相色谱系统；紫外检测器
1.2药品与试剂
水为纯化水；磷酸二氢钠、磷酸、四丁基氢氧化铵水溶液(10％)为分析纯。
对照品：4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺(纯度99.15％)、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠(纯度98.11％)。
供试品：磷酸肌酸二钠
2.方法
2.1色谱条件：
流动相：含0.1％磷酸二氢钾和0.1％四丁基氢氧化铵的溶液，用磷酸或氨试液调节pH值至6.6(注：市购的四丁基氢氧化铵试剂的浓度略有误差，加上配置的操作误差，会使相同的配置方法下的溶液的pH略有偏差。当测定pH低于预定值时，加氨试液调节，当测定pH高于预定值时，使用磷酸进行调节)；
波长：210nm；
流速：1ml/min；
进样量：20μl；
柱温：室温；
2.2专属性与系统适用性
取肌酐、肌酸、磷酸肌酐二钠、磷酸肌酸二钠、4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠对照品，配制成浓度分别为1μg/ml、1μg/ml、1μg/ml、1mg/ml、1μg/ml、1μg/ml的混合对照溶液，作为系统适用性溶液，在上述液相条件下进样，各对照品成分峰的分离度大于3.0。4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠与其他峰达到基线分离，峰形较好，理论塔板数4000以上。系统适用性溶液HPLC图谱见图13。
系统适用性溶液中各组分峰的名称和保留时间如下表所示。
| 保留时间 | 组分名 |
| 2.992 | 肌酸 |
| 3.587 | 肌酐 |
| 6.079 | 磷酸肌酐钠 |
| 13.832 | 磷酸肌酸二钠 |
| 18.422 | 4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺 |
| 32.428 | (4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠 |
2.3线性范围
用流动相将4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺配制成0.02μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml的对照品溶液，各取20μl在上述液相条件下进样；以各样品的峰面积为纵坐标，以4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的浓度为横坐标，进行线性回归，得到线性回归方程A＝46517x+2524.7(相关系数R2＝0.999)。
用流动相将(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠配制成0.02μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml的对照品溶液，各取20μl在上述液相条件下进样；以各样品的峰面积为纵坐标，以(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠的浓度为横坐标，进行线性回归，得到线性回归方程A＝51283x-1773.5(相关系数R2＝0.999)。
2.4精密度
分别取1.0μg/ml的4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺对照品溶液，连续进样6针，记录峰面积，精密度为0.13％。
分别取1.0μg/ml的(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠对照品溶液，连续进样6针，记录峰面积，精密度为0.55％。
2.5检测限与定量限
将4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠对照品溶液分别逐级稀释，当色谱图中主峰信噪比约为10时，该浓度记录为定量限；当色谱图中主峰信噪比约为3时，该浓度记录为检测限。测定4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的定量限为8ng/ml(RSD2.68％)；检测限为3ng/ml。测定(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠的定量限为28ng/ml(RSD2.23％)；检测限为9ng/ml。本方法灵敏度高。
2.6准确度
精密称取磷酸肌酸二钠供试品1g共6份，分别精密加入1mg/ml的4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺对照品和1mg/ml的(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠对照品溶液各1ml；加流动相溶解制成含磷酸肌酸二钠1mg/ml、含4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺1μg/ml、含(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸钠1μg/ml的测试溶液，在上述液相条件下进样，计算4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的回收率为98.86％，RSD为1.40％；(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠的回收率98.65％，RSD为0.72％。本方法准确度良好。
2.7重复性
鉴于磷酸肌酸二钠供试品中4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠的含量少于0.05％，故采用与准确度测定中相同的样品。测定的4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺平均含量为0.11％；RSD为1.68％；(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠的平均含量为0.10％，RSD为1.21％；重复性良好。
2.8溶液稳定性
精密量取浓度约为1μg/ml的4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺对照品溶液和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠对照品溶液，分别于冷藏0-4℃下放置0h、2h、4h、6h后进样，记录对照品主峰面积，考察4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠的稳定性。结果4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺对照品溶液在放置6h内稳定，6h后的回收率在98.82％；(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠对照品溶液在放置6h内稳定，6h后的回收率在98.25％；稳定性良好。
2.9供试品的测定
精密称取磷酸肌酸二钠供试品适量，用流动相制成1mg/ml的供试品溶液。同时，精密称取4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠对照品适量，用流动相制成含4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠各1μg/ml的混合对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪测定。
结果磷酸肌酸二钠中未检出4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠。
供试品溶液HPLC图谱如图14所示。
实施例6
液相色谱法测定二氯磷酰肌酐中4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺以及(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的含量。
1.材料
1.1仪器和材料
岛津2010AT高效液相色谱系统；紫外检测器
1.2药品与试剂
水为纯化水；磷酸二氢钠、磷酸、四丁基氢氧化铵水溶液(10％)为分析纯。
对照品：4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺(纯度99.15％)、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺(纯度95.70％)。
供试品：二氯磷酰肌酐
2.方法
2.1色谱条件：
流动相：(含0.1％磷酸二氢钾和0.1％四丁基氢氧化铵的溶液，用磷酸或氨试液调节pH值至7.0)；
波长：210nm；
流速：1ml/min；
进样量：20μl；
柱温：室温；
2.2专属性与系统适用性
取肌酐、肌酸、二氯磷酰肌酐、4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺对照品，配制成浓度分别为1μg/ml、1μg/ml、1mg/ml、1μg/ml、1μg/ml的混合对照溶液，作为系统适用性溶液，在上述液相条件下进样，各成分峰的分离度大于3.0。4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸(由(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺水解而来)与其他峰达到基线分离，峰形较好，理论塔板数4000以上。系统适用性溶液HPLC图谱见图15。
系统适用性溶液中各组分峰的名称和保留时间如下表所示。
2.3线性范围
用流动相将4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺配制成0.02μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml的对照品溶液，各取20μl在上述液相条件下进样；以各样品的峰面积为纵坐标，以4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的浓度为横坐标，进行线性回归，得到线性回归方程A＝45328x+1257.6(相关系数R2＝0.999)。
用流动相将(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺配制成0.02μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml的对照品溶液(实际水解成4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸，但换算成4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的量，以下类似的情况不再重复说明)，各取20μl在上述液相条件下进样；以各样品的峰面积为纵坐标，以(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的浓度为横坐标，进行线性回归，得到线性回归方程A＝47282x-1856.4(相关系数R2＝0.999)。
2.4精密度
分别取1.0μg/ml的4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺对照品溶液，连续进样6针，记录峰面积，精密度为0.22％。
分别取1.0μg/ml的(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺对照品溶液，连续进样6针，记录峰面积，精密度为1.12％。
2.5检测限与定量限
将4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺对照品溶液逐级稀释，当色谱图中主峰信噪比约为10时，该浓度记录为定量限；当色谱图中主峰信噪比约为3时，该浓度记录为检测限。测定4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的定量限为8ng/ml(RSD1.73％)；检测限为3ng/ml。测定(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的定量限为31ng/ml(RSD2.82％)；检测限为10ng/ml。本方法灵敏度高。
2.6准确度
精密称取二氯磷酰肌酐供试品1g共6份，分别精密加入1mg/ml的4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺对照品和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺对照品溶液各1ml；加流动相溶解制成含磷酸肌酸二钠1mg/ml、含4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺1μg/ml、含(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺1μg/ml的测试溶液，在上述液相条件下进样，计算4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的回收率为98.13％，RSD为1.10％；(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的回收率98.27％，RSD为1.36％。本方法准确度良好。
2.7重复性
精密称取6份二氯磷酰肌酐，用流动相溶解并制成含二氯磷酰肌酐1mg/ml的供试品溶液。取20μL，注入液相色谱仪，测定。二氯磷酰肌酐中4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的平均含量为0.55％；RSD为0.56％；(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的平均含量为0.68％，RSD为1.02％；重复性良好。
2.8溶液稳定性
精密量取浓度约为1μg/ml的4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺对照品溶液和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺对照品溶液，分别于冷藏0-4℃下放置0h、2h、4h、6h后进样，记录对照品主峰面积，考察4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的稳定性。结果4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺对照品溶液放置6h，回收率在98.65％；(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺对照品溶液放置6h，回收率在98.05％。
2.9供试品的测定
精密称取二氯磷酰肌酐供试品适量，用流动相制成1mg/ml的供试品溶液。同时，精密称取4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺对照品适量，用流动相制成含4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺各1μg/ml的混合对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定。
二氯磷酰肌酐中4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的平均含量为0.55％；换算后的(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的平均含量为0.68％。
二氯磷酰肌酐供试品溶液的HPLC图谱如图16所示。
实施例7：
液相色谱法测定磷酸肌酐中4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的含量
1.材料
1.1仪器和材料
岛津2010AT高效液相色谱系统；紫外检测器
1.2药品与试剂
水为纯化水；磷酸二氢钠、磷酸、四丁基氢氧化铵水溶液(10％)为分析纯。
对照品：4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺纯度99.15％、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸纯度98.21％。
供试品：磷酸肌酐
2.方法
2.1色谱条件：
流动相：(含0.1％磷酸二氢钾和0.1％四丁基氢氧化铵的溶液，用磷酸或氨试液调节pH值至6.3)；
波长：210nm；
流速：1ml/min；
进样量：20μl；
柱温：室温；
2.2专属性与系统适用性
取肌酐、肌酸、磷酸肌酐、磷酸肌酸二钠、4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸对照品，配制成浓度分别为1μg/ml、1μg/ml、1μg/ml、1mg/ml、1μg/ml、1μg/ml的混合对照溶液，作为系统适用性溶液，在上述液相条件下进样，各成分峰的分离度大于3.0。4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸与其他峰达到基线分离，峰形较好，理论塔板数4000以上。系统适用性溶液HPLC图谱如图17所示。
系统适用性溶液中各组分峰的名称和保留时间如下表所示。
| 保留时间 | 组分名 |
| 2.983 | 肌酸 |
| 3.535 | 肌酐 |
| 5.859 | 磷酸肌酐 |
| 13.505 | 磷酸肌酸二钠 |
| 18.123 | 4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺 |
| 28.039 | (4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸 |
2.3线性范围
用流动相将4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺配制成0.02μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml的对照品溶液，各取20μl在上述液相条件下进样；以各样品的峰面积为纵坐标，以4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的浓度为横坐标，进行线性回归，得到线性回归方程A＝45856x+2146.3(相关系数R2＝0.999)。
用流动相将(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸配制成0.02μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml的对照品溶液，各取20μl在上述液相条件下进样；以各样品的峰面积为纵坐标，以(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的浓度为横坐标，进行线性回归，得到线性回归方程A＝56725x-2131.1(相关系数R2＝0.999)。
2.4精密度
分别取1.0μg/ml的4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺对照品溶液，连续进样6针，记录峰面积，精密度为0.17％。
分别取1.0μg/ml的(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸对照品溶液，连续进样6针，记录峰面积，精密度为0.35％。
2.5检测限与定量限
将4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸对照品溶液逐级稀释，当色谱图中主峰信噪比约为10时，该浓度记录为定量限；当色谱图中主峰信噪比约为3时，该浓度记录为检测限。测定4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的定量限为8ng/ml(RSD1.88％)，检测限为3ng/ml。测定(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的定量限为25ng/ml(RSD1.81％)，检测限为8ng/ml。本方法灵敏度高。
2.6准确度
精密称取磷酸肌酐供试品1g共6份，分别精密加入1mg/ml的4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺对照品和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸对照品溶液各1ml；加流动相溶解制成含磷酸肌酐1mg/ml、含4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺1μg/ml、含(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸1μg/ml的测试溶液，在上述液相条件下进样，计算4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的回收率为98.46％，RSD为1.24％；(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的回收率98.98％，RSD为0.97％。本方法准确度良好。
2.7重复性
因磷酸肌酐中4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的含量少于0.05％，接近检测限，故采用与测定准确度时相同的样品。测定的4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺平均含量为0.11％，RSD为1.55％；(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的平均含量为0.10％，RSD为1.73％。重复性良好。
2.8溶液稳定性
精密量取浓度约为1μg/ml的4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺对照品溶液和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸对照品溶液，分别于冷藏0-4℃下放置0h、2h、4h、6h后进样，记录对照品主峰面积，考察4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺和(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的稳定性。结果4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺对照品溶液在放置6h内稳定，6h后的回收率在98.57％；(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸对照品溶液在放置6h内稳定，6h后的回收率在98.76％；稳定性良好。
2.9供试品的测定
精密称取磷酸肌酐适量，用流动相制成1mg/ml的供试品溶液。同时，精密称取4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸对照品适量，用流动相制成含4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸各1μg/ml的混合对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定。
结果磷酸肌酐中4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的平均含量为0.02％；(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸平均含量0.01％。
供试品溶液HPLC图谱如图18所示。
以上采用实施例进行了示例性说明，但本发明的保护范围不限于以上实施例，在没有脱离本发明构思的前提下，任何显而易见的改进和修饰均应归入本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种氯代氨基咪唑类化合物或其盐，所述氯代氨基咪唑类化合物具有如下式(I)所示的化学结构：
其中，R1为H或R为Cl或OH；
当R1为H时，化合物为：
4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺；
当R1为R为Cl时，化合物为：
(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺；
当R1为R为OH时，化合物为：
(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸；
优选地，所述的盐选自4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐、乳酸盐、醋酸盐、琥珀酸盐、枸橼酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐；或者(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的碱金属盐、碱土金属盐、铵(NH4 +)盐、二甲胺盐、三乙胺盐、四丁基铵盐、哌啶盐、吡啶盐、二甲氨基吡啶盐，(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的盐优选为其锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或钡盐，更优选为其钠盐，更优选为(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠。
2.一种4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的制备方法，
其合成路线图如下：
其包括以下步骤：
(1)以肌酐或其盐(例如盐酸肌酐)为起始物料，加入起始物料质量的0.01％-2％的水作为诱导剂，与三氯氧磷在回流下进行反应后，除去多余的三氯氧磷；
(2)向反应体系中加入起始物料质量的2-10倍，优选5-8倍的溶剂，搅拌后过滤；
所述溶剂选自卤代烃、醋酸烷基酯、2-8碳脂肪(芳基)醚、2-8碳烷烃、6-8碳芳烃；优选为卤代烃，更优选选自二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷；更优选二氯甲烷；
(3)向滤饼中加入水，或者加无机酸水溶液控制pH＜2，进行水解反应，优选室温加水水解，然后调节反应体系pH值至8-12，优选9-10，优选加入NaOH调节pH值；
(4)用起始物料质量的10-50倍，优选25-35倍的溶剂萃取，优选分2-3次萃取，然后，蒸馏除去萃取溶剂，得到4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺粗品；所述萃取溶剂选自：卤代烃、醋酸烷基酯、2-8碳脂肪(芳基)醚、2-8碳烷烃、6-8碳芳烃、4-8碳脂肪醇；优选选自正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、甲基叔丁基醚，更优选选自氯仿、二氯甲烷，更优选为二氯甲烷；
优选用与萃取相同的溶剂洗涤该粗制品，洗涤溶剂用量优选为始物料质量的0.1-1倍，更优选0.4-0.6倍；
可选地，所述4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的制备方法进一步包括以下步骤：
(5)向所述粗品中加入粗品质量的20-50倍，优选25-35倍的溶剂溶解，
优选向溶液中加入活性炭处理，然后过滤除去活性炭，所述溶剂与步骤(4)中的溶剂相同；
(6)将溶液浓缩至原粗品质量的5-15倍，优选8-10倍，加热溶解澄清后放置析晶，得4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺；
优选进一步用溶剂洗涤所得产物，洗涤溶剂用量优选为始物料质量的0.1-1倍，优选0.4-0.6倍，所述溶剂与步骤(4)中的溶剂相同；
可选地，在上述4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺的制备方法中，所述三氯氧磷与肌酐或其盐(如肌酐盐酸盐)的体积重量比(ml/g)为：10～60:1，优选20～40:1。
3.一种(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的制备方法，
其合成路线如下：
包括以下步骤：
(1)以肌酐或其盐(例如盐酸肌酐)为起始物料，加入起始物料质量的0.01％-2％的水作为诱导剂，与三氯氧磷在回流下进行反应后，除去多余的三氯氧磷；
(2)在常温下，向反应体系中加入起始物料质量的2-10倍，优选5-8倍的溶剂，搅拌后过滤，得到的滤饼为(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺粗品；
所述溶剂为：卤代烃、醋酸烷基酯、2-8碳脂肪(芳基)醚、2-8碳烷烃、6-8碳芳烃，优选乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、1,2-二氯乙烷、甲基叔丁基醚等无水溶剂，更优选无水氯仿、无水二氯甲烷，最优选无水氯仿；
可选地，上述(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的制备方法，进一步包括以下处理步骤：
(3)将粗品用起始物料质量的10-50倍，优选15倍的溶剂，在低于溶剂回流温度下加热溶解；优选向溶液中加入活性炭处理后，过滤除去活性炭；所述溶液与步骤(2)溶剂相同；
(4)将滤液在-80～10℃，优选-20～0℃温度下冷冻析晶，获得(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺精制品；
可选地，在上述(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺的制备方法中，所述三氯氧磷与肌酐或其盐(如肌酐盐酸盐)的体积重量比(ml/g)为：10～60:1，优选20～40:1。
4.一种(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的制备方法，其合成路线如下：
其包括以下步骤：
(1)在合适的温度下将(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺加入水中进行水解反应；优选水加入量为(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺质量的2-5倍，更优选2.5-3.5倍；
(2)加入溶剂，溶剂加入量为水质量的5-10倍，优选8-10倍，搅拌至产生固体，过滤，滤饼为(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸；
所述溶剂为：C1-C4的醇类、丙酮、丁酮以及水溶性醚类(优选四氢呋喃、二氧六环、乙二醇单甲醚)的至少一种，优选甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮的至少一种，最优选甲醇、丙酮的混合溶剂；
可选地，上述(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的制备方法，进一步包括以下处理步骤：
(3)向所得产物中加入溶剂并打浆洗涤，过滤除去溶剂，固体加水溶解，优选向水溶液中加入活性炭处理后，过滤除去活性炭，所述水的量与步骤(1)相同，所述溶剂与步骤(2)中的溶剂相同；
(4)然后加入水溶液体积的20-60倍，优选30-36倍体积的溶剂，放置析晶，得到(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸精制品；优选用溶剂洗涤该精制品，所述溶剂与步骤(2)中的溶剂相同；
优选在步骤(4)之前，将水溶液加热浓缩至总体积的40-60％；
可选地，上述(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸的制备方法中，所述水解在30℃以下进行，优选10℃以下进行，更优选在4℃以下进行，进一步优选在冰浴条件下进行，最优选以加入碎冰代替水进行反应。
5.一种(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐的制备方法，其包括以下步骤：
(1)以(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸或(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺、以及碱作为起始物料，加入水进行反应；
优选地，所述碱选自碱金属或碱土金属的氢氧化物、碳酸盐、磷酸盐，氨水，二甲胺，三乙胺，四丁基氢氧化铵，哌啶，吡啶，二甲氨基吡啶，优选为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化锂、氢氧化钡等；更优选氢氧化钠、氢氧化钾；进一步优选氢氧化钠；
优选加入水的质量为起始物料质量的2-5倍，优选3倍；
(2)加入水质量4-10倍，优选5-6倍的溶剂，析晶得到(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐；
所述溶剂选自：C1-C4的醇类、丙酮、丁酮以及水溶性醚类(优选四氢呋喃、二氧六环、乙二醇单甲醚)的至少一种，优选甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮的至少一种，最优选乙醇；
可选地，上述(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐的制备方法中，所述反应在30℃以下进行，优选10℃以下进行，更优选4℃以下进行，最优选在冰浴条件下进行。
6.权利要求1所述的氯代氨基咪唑类化合物或其盐在磷酸肌酸或其盐(优选磷酸肌酸二钠)、或它们的中间体、或它们的制剂的质量检测或控制中作为有关物质对照品的用途；优选地，所述氯代氨基咪唑类化合物或其盐为4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸和/或(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐；优选地，所述(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐为(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠；
优选地，所述的磷酸肌酸或其盐(优选磷酸肌酸二钠)、或它们的中间体、或它们的制剂的质量检测或控制采用高效液相色谱法。
7.根据权利要求6所述的用途，其中高效液相色谱法中，流动相为选自水、缓冲液、甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃中的一种或多种；优选地，所述缓冲液采用选自磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸、四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、庚烷磺酸钠、庚烷磺酸钾、戊烷磺酸钠、戊烷磺酸钾、辛烷磺酸钠或辛烷磺酸钠中的一种或多种配制的水溶液；优选地，流动相中以乙腈或甲醇为有机相，优选乙腈，以离子对试剂：磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸、四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、庚烷磺酸钠、戊烷磺酸钠或辛烷磺酸钠的水溶液为水相，优选四丁基氢氧化铵和磷酸二氢钾的水溶液用磷酸或氨试液调节至预定的pH值作为水相；
离子对试剂的浓度优选为0.01％～0.2％，进一步优选浓度为0.1％；
水相的pH为5.5-8.5，优选为6.0-7.5；
有机相与水相的体积比为0-20:80-100；优选体积比为：0-5:95-100。
8.一种检测权利要求1所述的氯代氨基咪唑类化合物或其盐的方法，所述方法采用所述方法采用高效液相色谱法进行；
优选地，所述方法为检测权利要求1所述的氯代氨基咪唑类化合物或其盐的纯度或含量的方法；
优选地，所述方法为检测磷酸肌酸或其盐(优选磷酸肌酸二钠)、或它们的中间体、或它们的制剂中权利要求1所述的氯代氨基咪唑类化合物或其盐是否存在或含量的方法；
优选地，所述氯代氨基咪唑类化合物或其盐为4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸和/或(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐；优选地，所述(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐为(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠。
9.根据权利要求8所述的方法，其中高效液相色谱法中，流动相为选自水、缓冲液、甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃中的一种或多种；优选地，所述缓冲液采用选自磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸、四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、庚烷磺酸钠、庚烷磺酸钾、戊烷磺酸钠、戊烷磺酸钾、辛烷磺酸钠或辛烷磺酸钠中的一种或多种配制的水溶液；优选地，流动相中以乙腈或甲醇为有机相，优选乙腈，以离子对试剂：磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸、四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、庚烷磺酸钠、戊烷磺酸钠或辛烷磺酸钠的水溶液为水相，优选四丁基氢氧化铵和磷酸二氢钾的水溶液用磷酸或氨试液调节至预定的pH值作为水相；
离子对试剂的浓度优选为0.01％～0.2％，进一步优选浓度为0.1％；
水相的pH为5.5-8.5，优选为6.0-7.5；
有机相与水相的体积比为0-20:80-100；优选体积比为：0-5:95-100。
10.根据权利要求9所述的方法，所述方法用于测定：
(1)4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸和/或(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐的纯度，其中，有机相:水相的比例为0-20:80-100，优选为：4:96；
或者(2)磷酸肌酸或其盐(优选磷酸肌酸二钠)、或它们的中间体、或它们的制剂中作为有关物质存在的4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸和/或(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐的含量，其中，有机相:水相的比例为0-20:95-100，优选为：0:100；
上述的检测方包括：
取待测样品适量，加流动相溶解稀释成规定浓度的溶液，作为供试品溶液；
取4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺或(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸或(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐适量，精密称定，分别用流动相溶解并定量稀释制成规定浓度的溶液，作为有关物质对照品溶液；
按照含量测定方法的色谱条件，精密量取有关物质对照品溶液、供试品溶液，注入液相色谱仪，测定待测品中4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)二氯磷酰胺、(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸和/或(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐的含量；
优选地，所述(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸盐为锂、钠、钾、钙、镁、钡盐，更优选为(4-氯-1-甲基-1H-咪唑-2-基)氨基磷酸二钠。
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