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Die
Erfindung betrifft ein nicht-virales Transfektionsmittel gemäß Anspruch
1, ein Verfahren zu dessen Herstellung gemäß Anspruch
17, die Verwendung gemäß den Ansprüchen
20 und 21, sowie ein Arzneimittel enthaltend ein nicht-virales Transfektionsmittel
und dessen Verwendung gemäß den Ansprüchen
22 und 23.
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Transfektionsmittel
sind allgemein bekannt und insbesondere im Hinblick auf die Anwendung von
Nukleinsäuremolekülen im Bereich der Gentherapie
von zunehmender Bedeutung. Ihre Aufgabe ist es, Nukleinsäuremoleküle,
die auf DNA basieren (bspw. Expressionsplasmide), – immer
häufiger aber auch kurzkettige Nukleinsäuremoleküle
auf RNA-Basis (bspw. siRNAs) – in die zu therapierenden
Zellen einer Kultur oder eines Zielgewebes zu transportieren.
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Zur
stabilen aber auch zur transienten Transfektion von eukaryotischen
Zellen mit DNA-Plasmiden werden üblicherweise physikalische
bzw. chemische Methoden oder Virus-basierte Systeme eingesetzt,
bspw. modifizierte Adeno- oder Retroviren. Während die
meisten physikalischen oder chemischen Methoden – insbesondere
bei Säugerzellen – häufig wenig effektiv
und auf den gesamten Organismus nur schwer anwendbar sind, weisen
die Virus-basierten Systeme normalerweise eine recht hohe Effizienz
auf. Allerdings haben auch diese entscheidende Nachteile. So sind
sie einerseits sehr aufwändig in der Präparation
und hoch sensibel in der Handhabung. Andererseits bergen sie nicht
unerhebliche Risiken, insbesondere im Hinblick auf drohende Abwehrreaktionen
des Immunsystems oder onkogene Erkrankungen.
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Man
hat daher versucht, nicht-virale Transfektionsmittel zu entwickeln.
So beschreibt die
WO 96/02655
A1 beispielsweise Polykation/DNA-Komplexe für
den in-vivo Transfer von DNA. Diese zeigen jedoch im Vergleich zu
viralen Transfektionsmitteln eine drastisch reduzierte Transfektionseffizienz.
Dies ist meist verbunden mit unspezifischen Interaktionen der Polykation/DNA-Komplexe – beispielsweise
mit Blutkomponenten – und Aggregatbildungen.
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Vor
allem um letzteres zu verhindern hat man in der
WO 98/59064 A1 die Polykation/DNA-Komplexe
weiterentwickelt, indem man die kationischen Polymere – speziell
Polyethylenimin (PEI) – modifiziert hat. Ziel dieser Entwicklung
war es eine Abschirmung der kationischen Polymeroberfläche
zu erreichen und mithin die Aggregatbildung zu erschweren.
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Es
zeigte sich jedoch, dass zur Herstellung dieser Komplexe relativ
hohe Molekulargewicht des modifizierten PEI benötigt werden
was in der Folge zu sterisch kleinen Polymer/Nukleinsäure-Komplexen
führt. Unglücklicherweise scheint allerdings die Transfektionseffizienz
umso geringer zu sein, je kleiner die Komplexe sind. Mithin ist
also der Einsatz einer höheren Konzentration der Komplexe
notwendig, was wiederum die Aggregatbildung begünstigt.
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Problematisch
ist außerdem die Lagerung der Komplexe. Zwar können
die Komplexe für einen begrenzten Zeitraum in der Lösung
gelagert werden. Dabei besteht jedoch erneut das Risiko der Aggregation
und damit verbunden ein enormer Verlust der Transfektionseffizienz.
Daneben ist in wenigen Fällen die Lagerung in lyophilisierter
oder tiefgefrorener Form möglich. Dies ist jedoch mit weiterem
nicht unerheblichem Präparationsaufwand verbunden. Darüber
hinaus ist dabei nicht unbedingt sichergestellt, dass das Präparat
beim erneuten Auflösen oder Auftauen eine vergleichbare
Bio-Aktivität wie das frisch hergestellte Präparat
aufweist.
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Im
Zuge der aufkommenden und vielversprechenden Möglichkeiten
im Bereich der Gentherapie ist es seit einiger Zeit außerdem
von hohem Interesse, nicht nur DNA sondern auch therapeutisch wirksame
RNA in Säugerzellen einbringen zu können. Diese
sind ungleich kritischer in der Handhabung als DNA, virale Systeme
sind hier nur begrenzt einsetzbar. So ist es beispielsweise nicht
möglich, sie für den Transport von siRNA's zu
verwenden. Die
WO 01/43777
A1 sieht daher die Komplexierung von RNA, insbesondere
von Ribozymen, mit PEI zu Polykation/RNA-Komplexen vor. Auch bei
diesen Komplexen besteht unter anderem das bereits genannte Problem
der Aggregatbildung. Ein weiteres wesentliches Problem ist, dass
diese Komplexe nur sehr schwer bis gar nicht lagerungsfähig
sind.
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Allen
diesen Lösungen wohnt darüber hinaus das Problem
inne, dass eine loko-regionale und vor allem zeitliche Steuerung
der Freisetzung der Nukleinsäuren nur schwer möglich
ist. Mithin ist auch die loko-regionale und vor allem zeitliche
Steuerung der zellulären Aufnahme von Polymer/Nukleinsäure-Komplexen
nur schwer möglich.
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Daneben
sind alle diese Systeme nur in Form von wässrigen oder
organischen Lösungen verwendbar. Dies bedingt wiederum – auch
im Hinblick auf die drohende Aggregation –, dass die Dosierung
der Nukleinsäuren schwierig und ungenau ist. Insbesondere
gestatten diese Systeme keine Kombination aus hinreichend effizienter
Aufnahme in die Zielzellen des Zielgewebes und gleichzeitiger hinreichend
loko-regional und zeitlich steuerbarer Freisetzung der Nukleinsäuren
im Zielgewebe.
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Es
ist daher Aufgabe der Erfindung, ein nicht-virales Transfektionsmittel
zur Verfügung zu stellen, welches die zuvor genannten Nachteile überwindet.
Insbesondere soll es die Protektion der Nukleinsäuren gegen
Degradation sowie deren effiziente Einschleusung in Gewebe und Zellen
ermöglichen, sowie eine verbesserte loko-regionale und
vor allem zeitliche Steuerung der Freisetzung der Nukleinsäuren.
Außerdem soll das Transfektionsmittel auf einfachem Wege
lagerbar sowie mit möglichst einfachen Mitteln und kostengünstig
herstellbar sein.
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Hauptmerkmale
der Erfindung sind in den Ansprüchen 1, 12 und 13 bis 16
angegeben. Ausgestaltungen sind Gegenstand der Ansprüche
2 bis 11.
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Die
Erfindung sieht ein nicht-virales Transfektionsmittel vor, bestehend
aus Polymer/Nukleinsäure-Komplexen und Nanofasern, wobei
die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure
und mindestens einem kationischen Polymer bestehen.
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Darüber
hinaus sieht die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines nicht-viralen
Transfektionsmittels vor, umfassend die Schritte
- • Bereitstellung
des Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes
- • Herstellung einer Spinnlösung enthaltend
die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe sowie mindestens ein
Trägerpolymer
- • Elektrospinnen.
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Ein
wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen nicht-viralen
Transfektionsmittels ist, dass es Nanofasern enthält, welche
die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe trägern. Dadurch
wird insbesondere die Aggregation der Komplexe vermieden und das Transfektionsmittel
ist ohne Probleme lagerbar. So können beispielsweise die
trockenen Nanofasern mit den Polymer-/Nukleinsäure-Komplexen
bei 4°C problemlos über mehrere Wochen gelagert
werden, ohne dass es zu einem Verlust der Bio-Aktivität kommt.
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Ein
weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass die Komplexe protrahiert
aus den Nanofasern freigesetzt werden. Dadurch wird die loko-regionale
und zeitliche Steuerung der Aufnahme der Komplexe in die Zielzellen
deutlich verbessert.
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Daneben
zeichnet sich das erfindungsgemäße Transfektionsmittel
dank der Trägerung der Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe
durch die Nanofasern durch eine sehr einfache Handhabung aus. Günstig ist
es dabei, wenn das nicht-virale Transfektionsmittel durch Elektrospinning
hergestellt wird. Dabei können die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe
gemeinsam mit einem Trägerpolymer versponnen werden. Die dabei
entstehenden Nanofasern werden zum Beispiel auf einem Glasplättchen
aufgefangen und können beispielsweise mit einer Pinzette
als Geflecht abgenommen und weiterverarbeitet werden. So kann das
Geflecht in eine Zellkulturschale oder auch direkt in oder auf ein
Gewebe – beispielsweise im Bereich eines erkrankten Organes – eingelegt
werden. Denkbar ist auch z. B. die Weiterverarbeitung zu oral, anal, subkutan,
intramuskulär, intraperitoneal oder inhalativ verabreichbaren
Formulierungen. Besonders vorteilhaft ist dann unter anderem, dass
die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe direkt an Ort und Stelle von
den Nanofasern abgegeben werden können, was das Risiko
der unerwünschten (und schädlichen) Mitbehandlung
von nicht betroffenen Organe und Körperpartien im Vergleich
zu einer Applikation mit Hilfe einer einfachen Lösung deutlich
reduziert.
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Ein
weiterer Vorteil ist es, dass die Konzentration der Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe
in den Nanofasern durch entsprechendes Zusammenmischen der Spinnlösung
gut einstellbar ist. Auf diese Weise ist auch eine sehr exakte Dosierung
der Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe möglich. Dabei
ist es insbesondere günstig, dass die Nanofasern, welche die
Komplexe trägern, in fester Form vorliegen und mithin beispielsweise
leicht wägbar sind. Vorteilhaft ist es auch, dass die Integrität
der Komplexe und die Freisetzung der Nukleinsäure aus den
Komplexen überraschenderweise durch vorheriges Elektrospinning
nicht beeinflusst werden.
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Zweckmäßig
ist es, wenn das kationische Polymer ein Polyimin, bevorzugt Polyethylenimin (PEI)
oder Polypropylenimin (PPI), besonders bevorzugt Polyethylenimin
(PEI) ist. Dabei kann das Polyethylenimin (PEI) ein lineares oder
verzweigtes Polyethylenimin (PEI) und/oder ein modifiziertes Polyethylenimin
(PEI) sein.
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Das
kationische Polymer kann insbesondere auch mit einem oder mehreren
daran gekoppelten hydrophilen Poylmeren modifiziert sein. Diese
sind beispielsweise – aber nicht erschöpfend – ausgewählt
aus der Gruppe Polyethylenglykole (PEG), Polyvinylpyrollidone, Polyacrylamide,
Polyvinylalkohole oder Copolymere davon. Bevorzugt ist das hydrophile
Polymer PEG.
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Denkbar
ist auch, dass das kationische Polymer mit einem oder mehreren Kohlenhydraten
gekoppelt ist.
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Um
eine zelltypspezifische Delivery und eine verbesserte Aufnahme der
Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe in die Zellen zu erreichen,
ist es vorteilhaft, wenn das kationische Polymer mit einem rezeptorspezifischen
Liganden gekoppelt ist, bevorzugt mit Transferrin oder EGF. Diese
Liganden binden an Rezeptoren, die spezifisch von den anzusteuernden Zellen
exprimiert werden, beispielsweise den EGF-Rezeptor. Vorstellbar
sind jedoch auch andere Liganden, die an andere Rezeptoren binden,
oder Antikörper, die Oberflächenstrukturen der
Zellen erkennen und an diese binden. Insgesamt können die über
das kationische Polymer an die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe
gekoppelten Liganden – je nach Art des Liganden – dann
unterschiedliche Funktionen erfüllen, beispielsweise die
Bindung an Zielzell-Strukturen auf der Außenseite der Zellmembran, die
Erhöhung der Aufnahmeeffizienz für nanoskalige Partikel
in die Zellen und/oder die gesteigerte Freisetzung der Polymer-/Nukleinsäure-Komlpexe
aus intrazellulären Organellen.
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Das
jeweilige Optimum für die Größe und Art des
Polymers ist dabei abhängig von der zu transportierenden
Nukleinsäure. Es ist jedoch insgesamt vorteilhaft, wenn
das Molekulargewicht des kationischen Polymers zwischen 0,6 kD und
2 000 kD, bevorzugt zwischen 0,6 kD und 800 kD, besonders bevorzugt zwischen
4 kD und 25 kD liegt. In diesem Bereich werden Komplexe aus Nukleinsäure
und Polymer erhalten, die bezüglich Komplexierung der Nukleinsäure,
biologischer Aktivität/Transfektionseffizienz und Toxizität
optimal sind. Die optimale Komplexierung der Nukleinsäure
ist insbesondere wichtig, wenn die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe
durch Elektrospinning verarbeitet werden sollen. Da die Komplexierung
auf elektrostatischen Wechselwirkungen beruht, muss sie eine gewisse
Stabilität aufweisen, um nicht im elektrischen Feld der
Spinnapparatur zerstört zu werden oder vorzeitig im wässrigen
Medium außerhalb der Zielzellen zu zerfallen. Gleichzeitig
darf sie allerdings auch nicht zu stabil sein, da sie ansonsten in
den Zielzellen nur schwer wieder gelöst werden könnte.
In der Folge könnten die Nukleinsäuren nicht wirksam
werden. Daneben beeinflusst die Stärke der Komplexbindung
die Größe des Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes.
Dabei ist der Komplex umso kleiner, je größer
das Polymer ist, da dann die DNA kompaktere Strukturen annimmt.
Die Größe des Komplexes ist jedoch unter anderem
bedeutsam für die Transfektionseffizienz. Bevorzugt haben
die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe eine Größe
zwischen 20 nm und ca. 800 nm, besonders bevorzugt zwischen 50 nm
und 500 nm.
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Erfindungsgemäß kann
bei dem nicht-viralen Transfektionsmittel die Nukleinsäure
eine DNA oder eine RNA oder ein DNA- oder RNA-Derivat sein. Günstig
ist es dabei, wenn die Nukleinsäure eine therapeutisch
wirksame Nukleinsäure ist.
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So
ist einerseits vorstellbar, dass die Nukleinsäure ein DNA-Plasmid
ist. Dieses kann beispielsweise 4.000 bis 10.000 bp umfassen und
eine zu exprimierende Gensequenz beinhalten, welche mit Hilfe des
Transfektionssystems in Zellkulturen eingebracht werden soll. Vorstellbar
sind auch DNA's welche 500 bis 25.000 bp umfassen, beispielsweise
kleinere Helfer- oder Markerexprimierende Plasmide oder besonders
große Plasmide zur stabilen Einbringung eines bestimmten
Gens inklusive Steuerungs- bzw. Exon-/Intron-Strukturen in die Zielzellen,
beispielsweise bei der Erzeugung transgener Organismen oder im Rahmen
einer Gentherapie.
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Daneben
ist es denkbar, dass auch antisense-DNA oder Decoy-DNA als Nukleinsäuren
im Polymer-/Nukleinsäure-Komplex verwendet werden. Diese
haben üblicherweise weniger als 500 bp, bevorzugt weniger
als 100 bp.
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Als
therapeutisch wirksame Nukleinsäuren kommen außerdem
insbesondere (aber bei weitem nicht erschöpfend) siRNA's,
längere doppelsträngige RNA-Moleküle,
bevorzugt 27–29mere, siLNAs, sisiLNAs und siRNA-Moleküle
mit anderen chemischen Modifikationen zur Erhöhung der
Stabilität, der Selektivität und/oder der Effizienz
in Frage. Auch Ribozyme sind vorstellbar, bevorzugt Hammerhead-Ribozyme,
aber auch Ribozyme mit Hairpin-Motiv oder HDV Ribozyme. Weiterhin
können messenger RNA's (mRNA) ebenso wie transfer RNA's
(tRNA) als Nukleinsäuren in dem Transfektionsmittel enthalten
sein und so in die gewünschten Zellen gebracht werden.
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Die
Nanofasern bestehen aus bioabbaubaren, bioverträglichen
Polymeren, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe Polylactide,
Polyvinylalkohole, Polyethylenglykole, Polycaprlacton, Polyhydroxybutyrate,
Polyesterurethane, Cellulose, Celluloseacetat, Chitosan, Alginate,
Collagen oder Co-Polymere und Elends davon. Die Zusammensetzung
der Polymere bestimmen dabei die Löslichkeitseigenschaften der
Nanofasern. Günstig ist es dabei, wenn die Fasern wasserlöslich
sind.
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Die
Löslichkeitseigenschaften der Nanofasern sind insbesondere
im Hinblick auf eine protrahierte Freisetzung der Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe
von Bedeutung. Je nachdem wie schnell sich die Nanofasern auflösen,
werden die Komplexe auch schnell oder langsam abgegeben und damit
dosiert. Mithin ist die Freisetzungskinetik der Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe über
die Wahl der Nanofaser-Polymere steuerbar.
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Diese
Freisetzungskinetik kann zusätzlich beeinflusst werden,
wenn das gesamte Transfektionsmittel, also die Nanofasern inklusive
der Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe mit einem zusätzlichen Überzug
aus einem bioabbaubaren Polymer versehen sind, bevorzugt mit einem
Polymer ausgewählt aus der Gruppe Polyethylenglykole (PEG),
Polyethylenimine (PEI), Poly(diallyldimethylammoniumchlorid) (PDDA),
Polylactide (PLA), Poly-p-xylylen (PPX), Copolymere und Elends davon
oder Lipide. Dieser Überzug kann eine Dicke von bspw. 10
nm bis zu vielen Mikrometern haben.
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Es
versteht sich von selbst, dass für die Menge an insgesamt
freigesetzten Polymer/Nukleinsäure-Komplexen auch die Größe
der Nanofasern eine Rolle spielt. Diese können beispielsweise
einen Durchmesser im Bereich von 1 nm bis 100 μm, bevorzugt
zwischen 10 nm und 10 μm, besonders bevorzugt zwischen
50 nm und 3 μm haben. Die Länge der Fasern kann
je nach Anwendung im Bereich zwischen etwa 2 μm und 100 μm
liegen, andere Dimensionen z. B. bis in den Zentimeterbereich und
darüber hinaus sind anwendungsabhängig denkbar.
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Ein
besonderer Vorteil des Verfahrens zur Herstellung des erfindungsgemäßen
nicht-viralen Transfektionsmittels ist es, dass die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe
gemeinsam mit den Trägerpolymeren zu den Nanofasern elektroversponnen
werden. Mithin sind lediglich die Bereitstellung der Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe
und die Bereitstellung einer Spinnlösung zur Vorbereitung
notwendig.
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Die
Bereitstellung des Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes umfasst
die Schritte
- – Herstellung einer Nukleinsäure-Lösung
- – Inkubation der Nukleinsäure-Lösung
- – Herstellung einer Polymer-Lösung
- – Inkubation der Polymer-Lösung
- – Zugabe der Polymer-Lösung zur Nukleinsäure-Lösung
- – Vermischen
- – Inkubation der Mischung
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Diese
Prozedur dauert in der Regel nicht länger als zwei Stunden
und ist damit wesentlich weniger aufwändig und kompliziert
als die Präparation eines Virus zur Transfektion. Das unten
beschriebene Beispiel 1 zeigt ein beispielhaftes Protokoll für
die Herstellung von PEI-F25LMW-Polymer-/Nukleinsäure-Komplexen.
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Auch
die Bereitstellung der Spinnlösung ist nicht besonders
aufwändig. Sie umfasst erfindungsgemäß die
Schritte:
- – Bereitstellung einer Lösung
enthaltend Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe in einem geeigneten
Medium:
- – Bereitstellung einer Lösung des Trägerpolymers,
bevorzugt einer wässrigen Lösung;
- – Zugabe der Polymer-/Nukleinsäure-Komplex-Lösung
zu der Trägerpolymer-Lösung;
- – Vermischen.
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Dabei
sei angemerkt, dass der erste Schritt, nämlich das Bereitstellen
der Lösung enthaltend Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe,
in der Praxis normalerweise bereits das Ergebnis der Bereitstellung
des Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes sein wird, da auch
die Bereitstellung des Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes
zweckmäßig in einem geeigneten Medium, bspw. in
'HEPES-Puffer' (10 mM bis 1 M HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4), erfolgt.
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Als
weiterer Schritt erfolgt das Elektrospinning.
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Man
erkennt insgesamt, dass das nicht-virale Transfektionsmittel nicht
nur gut lagerbar, sondern auch mit einfachen Mitteln und im Verhältnis
kostengünstig herstellbar ist. Durch die Komplexierung
der Nukleinsäuren mit den kationischen Polymeren sind die
Nukleinsäuren des Weiteren gegen Degradation geschützt.
Die loko-regionale und zeitliche Steuerung der Freisetzung der Nukleinsäuren
wird insbesondere durch die Trägerung durch die Nanofasern ermöglicht.
Dabei ist außerdem die einfache Handhabung des feststoffartigen
Transfektionsmittels von Vorteil.
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All
dies ist in Bezug auf die Verwendung des Transfektionsmittels besonders
günstig. So kann das erfindungsgemäße
nicht-virale Transfektionsmittel zur Transfektion von eukaryotischen
Zellen verwendet werden. Dabei sind sowohl Anwendungen beispielsweise
im Zellkulturlabor als auch unmittelbar im Organismus denkbar. Mit
Blick auf letzteres kann das nicht-virale Transfektionsmittel zur
Herstellung eines Arzneimittels verwendet werden.
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Ein
Arzneimittel enthaltend ein erfindungsgemäßes
nicht-virales Transfektionsmittel zeichnet sich wiederum vorteilhaft
durch die einfache Handhabung und gut steuerbare loko-regionale
Delivery von therapeutischen Nukleinsäuren aus. Auch eine
protrahierte Freisetzung ist dabei gut und einfach steuerbar.
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Mithin
ist die Verwendung eines solchen Arzneimittels für eine
gentherapeutische Behandlung zweckmäßig. Insbesondere,
da das erfindungsgemäße nicht-virale Transfektionsmittel
eine Vielzahl an Formulierungen und Verabreichungsformen problemlos
möglich macht, kann das Arzneimittel ganz gezielt auf die
entsprechende individuelle Behandlung abgestimmt werden.
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Weitere
Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus
dem Wortlaut der Ansprüche sowie aus der folgenden Beschreibung
von Ausführungsbeispielen anhand der Darstellungen. Es
zeigen:
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1 Transfektionseffizienz
eingesponnener Nanoplexe, entsprechend Beispiel 4,
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2 Lagerbarkeit
eingesponnener Nanoplexe, entsprechend Beispiel 5,
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3a Knockdown-Effizienz
(PEO-Lösung), entsprechend Beispiel 6a,
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3b Knockdown-Effizienz
(PEO/Dichlormethan-Lösung), entsprechend Beispiel 6b,
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3c Knockdown-Effizienz
(PVA-Lösung), entsprechend Beispiel 6c und
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3d Knockdown-Effizienz
(PEO/Wasser-Lösung), entsprechend Beispiel 6d
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Beispiel 1 – Herstellung von
Polymer-/Nukleinsäure-Komplexen (PEI-F25LMW)
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- a) Zur Herstellung eines Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes
zur frischen Anwendung oder zum Einfrieren sei beispielhaft die
bekannte Herstellung von PEI F25-LMW/DNA-Komplexen genannt.
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Dazu
werden 1,3 μg DNA in 80 μl ,HEPES-Puffer' (10
mM bis 1 M HEPES, 150 mM NaCL, pH 7,4) gelöst und für
10 Minuten inkubiert.
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22 μl
PEI F25-LMW (0,6 μg/μl) werden in 80 μl
,HEPES-Puffer' (10 mM bis 1 M HEPES, 150 mM NaCL, pH 7,4) gelöst
und nach Ablauf der 10 Minuten zu der DNA-Lösung pipettiert.
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Die
Komplexierung erfolgt durch Inkubation für bis zu 1 Stunde
bei Raumtemperatur. Die Komplexe können dann aliquotiert
und eingefroren werden. Zur weiteren Verarbeitung müssen
die Komplexe dann lediglich aufgetaut werden. Wenn die Komplexe aufgetaut
wurden, werden sie vor Verwendung durch kurzes Vortexen gemischt
und nochmals 30–60 min inkubiert.
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Je
nach Art und Größe der zu komplexierenden Nukleinsäure,
können selbstverständlich alle Mengen und Volumina-Angaben,
sowie die Mischungsverhältnisse der Polymer- und der Nukleinsäure-Lösung
den jeweiligen Bedürfnissen angepasst werden. Auch das
hergestellte Gesamtvolumen der Komplex-Lösung ist nur exemplarisch
zu verstehen und kann selbstverständlich auch im Midi- oder
Maxi- bzw. Industriellen Maßstab hergestellt werden.
- b) Zur Herstellung eines Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes
zur Lyophilisierung sei beispielhaft die bekannte Herstellung von
PEI F25-LMW/DNA-Komplexen genannt.
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Dazu
werden 260 μg DNA in 1040 μl 5% Glucose in Wasser
gelöst und für 10 Minuten inkubiert. 213 μl
PEI F25-LMW (6,1 μg/μl) werden in 1040 μl
5% Glucose in Wasser gelöst und nach Ablauf der 10 Minuten
zu der DNA-Lösung pipettiert. Nach kurzem Vortexen wird
1 h inkubiert und erneut kurz gevortext.
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Es
werden 26 Aliquots à 92 μl hergestellt und unter
Standardbedingungen lyophilisiert (erniedrigte Temperatur, Vakuum).
Die Rückstände können dann in verschiedenen
wässrigen oder organischen Lösungsmitteln wieder
aufgenommen werden.
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Auch
hier gilt: Je nach Art und Größe der zu komplexierenden
Nukleinsäure, können selbstverständlich
alle Mengen und Volumina-Angaben, sowie die Mischungsverhältnisse
der Polymer- und der Nukleinsäure-Lösung den jeweiligen
Bedürfnissen angepasst werden. Auch das hergestellte Gesamtvolumen
der Komplex-Lösung ist nur exemplarisch zu verstehen und
kann selbstverständlich auch im Midi- oder Maxi- bzw. Industriellen
Maßstab hergestellt werden.
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Beispiel 2 – Herstellung der
Spinnlösung
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Zur
Herstellung der Spinnlösung werden zwischen 0,2 und 20
Gew.-% des zu verspinnenden Polymers in einem Lösungsmittel
gelöst. Als Lösungsmittel kommen dabei bevorzugt
Wasser, aber auch organische Lösungsmittel, z. B. Dichlormethan
oder Hexafluorisopropanol in Frage. Die Auswahl richtet sich nach
dem gewählten Trägerpolymer.
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Beispiel 3 – Elektroverspinnen,
Herstellung des Transfektionsmittels für siRNA
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Zur
Immobilisierung wurden jeweils 165 μg der PEI/siRNA-Komplexe
(mit einer Luciferase-spezifischen bzw. mit einer unspezifischen
siRNA), gelöst in 100 μL HEPES-Puffer (10 mM HEPES,
150 mM NaCl), aufgetaut und zu 200 μL einer 6 Gew.-% PEO/Wasser-Lösung
gegeben. Nach der Vermischung in einem Kreisschüttler (2500
rpm) wurde die Spinnlösung bei einer Spannung von ca. 17
kV und einem Abstand von 14 cm auf Glasplättchen als Trägermatrix
versponnen. Die Flussrate betrug 0,2 mL/h.
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Beispiel 4 – Transfektionseffizienz
eingesponnener Nanoplexe im Vergleich zu Lösungen
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Man
erkennt in 1, dass mit Hilfe des erfindungsgemäßen
Transfektionsmittels eine deutlich feinere Steuerung der Transfektionseffizienz
und mithin der Dosierung eines in die Zellen einzubringenden Wirkstoffes
erreichbar ist als mit herkömmlichen Transfektionslösungen.
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Bei
dem dargestellten Experiment werden 100.000 SKOV-3 Ovarialkarzinom-Zellen/Well
einer Sixwell-Platte eingesät und 24 h in IMDM/10% FCS-Medium
kultiviert. Anschließend werden z. B. zwischen 1 μg
und 10 μg Nanofasern mit geträgerten PEI/Luciferase-DNA-Komplexen
mit der Pinzette vom Glas-Trägerplättchen abgenommen
oder mit Flüssigkeit abgespült und dem Medium
zugesetzt. Alternativ können die Glasplättchen
mit den aufgebrachten Nanofasern auch invertiert in das Well auf das
Medium gelegt werden. Die Messung der Luciferase-Aktivität
erfolgt typischerweise zwischen 48 h und 96 h nach Einbringen der
Nanofasern über Chemilumineszenz im Luminometer.
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Die
Säulen 1 und 2 zeigen, dass ein deutlicher Unterschied
in der Transfektionseffizienz auftritt, wenn bei einer Transfektion
mit Hilfe des erfindungsgemäßen Transfektionsmittels
die eingebrachte Menge DNA variiert wird. So wurden bei Säule
1 2,6 μg DNA und bei Säule 2 3,9 μg DNA
eingesetzt. Die resultierende Lumineszenz – und somit die
Wirksamkeit der in die Zellen gelangten Luciferase-Plasmide – unterscheidet
sich um etwa eine Zehnerpotenz zwischen beiden Transfektionen. Wird
die Menge der DNA dagegen auf herkömmliche Weise, etwa
in dem die Menge zugegebener Lösung vervielfältigt
wird, variiert, so zeigen die Säulen 3 und 4, dass nahezu kein
Unterschied in der Transfektionseffizienz auftritt. Man erkennt
deutlich, dass das erfindungsgemäße Transfektionsmittel
somit eine deutlich verbesserte Steuerung und Dosierung der Delivery
der Nukleinsäure-Wirkstoffe ermöglicht.
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Beispiel 5 – Lagerbarkeit eingesponnener
Nanoplexe
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Man
erkennt in 2, dass ein weiterer Vorteil
des erfindungsgemäßen Transfektionsmittels die verbesserte
Lagerbarkeit ist. Dadurch wird es beispielsweise vorstellbar, die
Polymer-/Nukleinsäure-Komplex enthaltenden Nanofasern in
einer Verabreichungsform wie beispielsweise Tabletten zu verarbeiten,
die es ermöglicht, das Transfektionsmittel als Therapeutikum
einem Patienten möglichst einfach zu verabreichen.
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Die
Nanofasern mit eingesponnenen Nanoplexen werden bei 4°C
oder bei RT über einen längeren Zeitraum, typischerweise
mehrere Wochen, trocken gelagert. Die Messung der Transfektionseffizienz
erfolgt dann wie in Beispiel 4.
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Während
die Transfektionseffizienz der herkömmlicherweise verwendeten
Lösung bei einer Lagerung über einen Zeitraum
um 7 Tage um über zwei Zehnerpotzenzen abnimmt, ist bei
den erfindungsgemäß in Nanofasern eingesponnenen
Polymer-/Nukleinsäure-Komplexen lediglich ein Rückgang
um etwas über einer Zehnerpotzenz feststellbar. Die Beispiele
6a bis 6d, deren Ergebnisse in den 3a bis 3d dargestellt
sind, zeigen darüber hinaus, dass mit Hilfe des erfindungsgemäßen
Transfektionsmittels ein gezielter Knockdown von Genen durch das Einbringen
von siRNA möglich ist. Dabei eignen sich einerseits verschiedene
Spinnlösungen (Bsp. 6a bis 6d, 3a bis 3d) andererseits
können die erhaltenen Nanofaser zusätzlich noch
mit einem Polymerüberzug versehen werden (vgl. Bsp. 6d, 3d).
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Beispiel 6a – Knockdown-Effizienz
von PEI/siRNA-Komplexen, die in PEO-Lösung elektroversponnen
werden
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Es
werden wie im Beispiel 1 beschrieben PEI/siRNA-Komplexe hergestellt.
Diese werden dann entsprechend Beispiel 3 versponnen. Das so erhaltene
Transfektionsmittel wird für folgendes Experiment verwendet:
Es
werden 40.000 stabil Luciferase-exprimierende SKOV-3/Luc Ovarialkarzinom-Zellen/Well
einer 24-Well-Platte eingesät und 24 h in IMDM/10% FCS-Medium
kultiviert. Anschließend werden z. B. zwischen 1 μg
und 10 μg Nanofasern mit geträgerten PEI/Luciferase-siRNA-Komplexen
mit der Pinzette vom Glas-Trägerplättchen abgenommen
oder mit Flüssigkeit abgespült und dem Medium
zugesetzt. Dabei kann es sich beispielsweise um PEO-Nanofasern mit
0,63 μg PEI-komplexierter Luciferase-siRNA bzw. einer unspezifischen
Kontroll-siRNA handeln. Die Messung der Luciferase-Aktivität
erfolgt typischerweise zwischen 48 h und 96 h nach Einbringen der
Nanofasern über Chemilumineszenz im Luminometer.
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Zur
Kontrolle auf Spezifität werden in parallelen Ansätzen
eine spezifische und eine unspezifische siRNA komplexiert und geträgert.
Die Targeting-Effizienz errechnet sich aus der prozentualen Abnahme der
Luciferase-Aktivität der mit Nanofaser-geträgerten
PEI/spez. siRNA-Komplexen behandelten Zellen versus der Luciferase-Aktivität
der mit Nanofaser-geträgerten PEI/unspez. siRNA-Komplexen
behandelten Zellen.
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Man
erkennt in 3a, dass die Chemilumineszenz
der mit spezifischer siRNA behandelten Zellen im Vergleich zu den
mit unspezifischer siRNA behandelten Zellen deutlich abnimmt. Dabei
zeigt Säule 9 die durch die Luciferase-Expression hervorgerufene
Chemilumineszenz der kultivierten Zellen, die mit der Kontroll-siRNA
behandelt wurden. Säule 10 zeigt die durch die Behandlung
mit spezifischer Luciferase-siRNA verminderte Chemilumineszenz.
Durch die Behandlung mit der Kontroll-siRNA werden unspezifische,
z. B. zytotoxische Effekte als Ursache für den Gen-Knockdown
ausgeschlossen.
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Beispiel 6b – Knockdown-Effizienz
von PEI/siRNA-Komplexen, die in PEO/Dichlormethan-Lösung elektroversponnen
werden
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Es
werden wie im Beispiel 1 beschrieben PEI/siRNA-Komplexe hergestellt.
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Zur
Herstellung von aus Dichlormethan gesponnenen Fasern wurden die
in Glucose-Lösung lyophilisierten PEI/siRNA-Komplexe mit
einer PEO/DCM-Lösung der Konzentration 1 Gew.-% aufgeschlämmt.
Die erhaltene Lösung wurde bei 7,5 kV und einem Elektroden-Abstand
von ca. 14 cm verarbeitet und auf Glasplättchen als Trägermatrix
aufgebracht.
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Die
Knockdown-Effizienz wurde entsprechend Beispiel 6a bestimmt.
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Wie
in Beispiel 6a bzw. 3a, erkennt man auch hier, dass
die spezifische Luciferase-siRNA im Gegensatz zur unspezifischen
Kontroll-RNA einen Knockdown der Luciferase-Expression bewirkt.
Dabei zeigt Säule 11 die durch die Luciferase-Expression
hervorgerufene Lumineszenz der kultivierten Zellen, die mit der
Kontroll-siRNA behandelt wurden. Säule 12 zeigt die durch
die Behandlung mit spezifischer Luciferase-siRNA verminderte Lumineszenz.
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Beispiel 6c – Knockdown-Effizienz
von PEI/siRNA-Komplexen, die in PVA-Lösung elektroversponnen
werden
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Es
werden wie im Beispiel 1 beschrieben PEI/siRNA-Komplexe hergestellt.
Diese werden wie folgt durch Elektrospinning weiter verarbeitet.
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Zur
Immobilisierung wurden 165 μg der PEI/siRNA-Komplexe (sowohl
der Luciferase-spezifischen, als auch der unspezifischen siRNA),
gelöst in 100 μL 'HEPES-Puffer' (10 mM HEPES und
150 mM NaCl), aufgetaut und zu 200 μL einer 12 Gew.-% PVA/Wasser-Lösung
gegeben. Nach der Vermischung in einem Kreisschüttler (2500
rpm) wurde die Spinnlösung bei einer Spannung von ca. 21
kV und einem Abstand von 14 cm auf Glasplättchen als Trägermatrix
versponnen. Die Flussrate betrug 0,15 mL/h.
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Die
Knockdown-Effizienz wurde entsprechend Beispiel 6a bestimmt.
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Wie
in den Beispielen 6a und 6b bzw. 3a und 3b,
erkennt man auch hier, dass die spezifische Luciferase-siRNA im
Gegensatz zur unspezifischen Kontroll-RNA einen Knockdown der Luciferase-Expression
bewirkt. Dabei zeigt Säule 13 die durch die Luciferase-Expression
hervorgerufene Lumineszenz der kultivierten Zellen, die mit der
Kontroll-siRNA behandelt wurden. Säule 14 zeigt die durch
die Behandlung mit spezifischer Luciferase-siRNA verminderte Lumineszenz.
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Beispiel 6d – Knockdown-Effizienz
nach vier und nach sieben Tagen von PEI/siRNA-Komplexen, die in PEO/Wasser-Lösung
elektroversponnen werden, wobei die Fasern mit PPX beschichtet werden
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Es
werden wie im Beispiel 1 beschrieben PEI/siRNA-Komplexe hergestellt.
Diese werden wie in Beispiel 3 beschrieben und elektroversponnen.
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Für
die PPX-Beschichtung der mit PEI/siRNA-Komplex beladenen PEO-Fasern
(siehe Beispiel 3) wurde der Beschichter Labcoater 1 PDS 2010 der Firma
SPECIALTY COATING SYSTEMS zur chemischen Gasphasenabscheidung (CVD,
chemical vapor deposition) verwendet. Die Fasermatten wurden an
einer gebogenen Metallstange fixiert, welche am Boden der Beschichtungsapparatur
befestigt wurde. Mit einer [2.2]Paracyclophan-Einwaage von 100 mg wurden
etwa 50 nm und mit 1 g wurden ca. 500 nm dicke PPX-Beschichtungen
erzeugt.
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Die
Knockdown-Effizienz wurde entsprechend Beispiel 6a bestimmt.
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Wie
in den vorangegangenen Beispielen 6a bis 6c bzw. 3a bis 3c,
erkennt man auch hier, dass die spezifische Luciferase-siRNA im
Gegensatz zur unspezifischen Kontroll-RNA einen Knockdown der Luciferase-Expression
bewirkt. Dabei zeigt Säule 15 die vier Tage nach der Transfektion durch
die Luciferase-Expression hervorgerufene Lumineszenz der kultivierten
Zellen, die mit der Kontroll-siRNA behandelt. Säule 16
zeigt die durch die Behandlung mit spezifischer Luciferase-siRNA
verminderte Lumineszenz im gleichen Zeitraum. Säule 17
und Säule 18 zeigen dagegen die entsprechende Lumineszenz
sieben Tage nach der Transfektion, wobei wiederum Säule
17 die durch die Luciferase-Expression hervorgerufene Lumineszenz
der kultivierten Zellen, die mit der Kontroll-siRNA behandelt wurden,
und Säule 18 die durch die Behandlung mit spezifischer
Luciferase-siRNA verminderte Lumineszenz zeigt.
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Man
erkennt dabei in 3d, dass die Verminderung der
Luciferase-Expression, die mit dem Knockdown einhergeht, bereits
nach vier Tagen deutlich feststellbar ist. Danach bleibt sie auf
einem konstant niedrigen Niveau erhalten (vgl. Säule 16
und Säule 18, Wirkung nach 4 und nach 7 Tagen). Dies zeigt,
dass das erfindungsgemäße Transfektionsmittel
auch eine gleichmäßige Wirkung über einen
längeren Zeitraum erlaubt.
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Die
Erfindung ist nicht auf eine der vorbeschriebenen Ausführungsformen
beschränkt, sondern in vielfältiger Weise abwandelbar.
So ist es beispielsweise vorstellbar, an die Nanofasern nach dem Verspinnen
Liganden zu koppeln.
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Die
Löslichkeit der der Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe
kann durch das zusätzliche Aufbringen einer äußeren
Hülle, bspw. aus Lipiden, beeinflusst werden.
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Vorstellbar
ist auch, mehrere unterschiedliche Nukleinsäuren in einen
Komplex einzubringen, bspw. Expressions- und Helferplasmide. Alternativ können
auch mehrere unterschiedliche Komplexe gleichzeitig versponnen werden.
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Man
erkennt, dass ein nicht-virales Transfektionsmittel vorteilhaft
aus Polymer/Nukleinsäure-Komplexen und Nanofasern besteht,
wobei die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe aus mindestens einer
Nukleinsäure und mindestens einem kationischen Polymer
bestehen. Die Nanofasern trägern die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe,
wobei das nicht-virale Transfektionsmittel zweckmäßig
durch Elektrospinning hergestellt ist.
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Man
erkennt weiter, dass das kationische Polymer günstigerweise
ein Polyimin bevorzugt Polyethylenimin ist und mit einem oder mehren
daran gekoppelten hydrophilen Polymeren modifiziert sein kann. Zweckmäßig
kann es auch sein, das kationische Polymer mit einem oder mehreren
Kohlenhydraten und/oder mit einem rezeptorspezifischen Liganden
zu koppeln. Die Nukleinsäure ist eine DNA oder eine RNA
oder ein DNA- oder RNA-Derivat, vorteilhaft eine therapeutisch wirksame
Nukleinsäure. Die Nanofasern bestehen aus bioabbaubaren,
bioverträglichen Polymeren. Sie bzw. das gesamte Transfektionsmittel
können mit einem Polymerüberzug versehen sein.
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Weiterhin
erkennt man, dass ein Verfahren zur Herstellung eines nicht-viralen
Transfektionsmittels die folgenden Schritte umfasst: Bereitstellung des
Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes, Herstellung einer Spinnlösung
enthaltend die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe, Elektrospinnen.
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Man
erkennt außerdem, dass das nicht-virale Transfektionsmittel
zur Transfektion von eurkaryotischen Zellen und zur Herstellung
eines Arzneimittels verwendet werden kann. Das Arzneimittel kann mit
Vorteil für gentherapeutische Behandlungen verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft mithin ein nicht-virales Transfektionsmittel
bestehend aus Polymer-/Nukleinsäure-Komplexen und Nanofasern,
wobei die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe aus mindestens
einer Nukleinsäure und mindestens einem kationischen Polymer
bestehen. Die Nanofasern trägern die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe,
wobei das nicht-virale Transfektionsmittel zweckmäßig durch
Elektrospinning hergestellt ist. Das kationische Polymer ist günstigerweise
ein Polyimin bzw. Polyethylenimin und kann mit einem oder mehren
daran gekoppelten hydrophilen Polymeren modifiziert sein. Zweckmäßig
kann es auch sein, das kationische Polymer mit einem oder mehreren
Kohlenhydraten und/oder mit einem rezeptorspezifischen Liganden zu
koppeln. Die Nukleinsäure ist eine DNA oder eine RNA oder
ein DNA- oder RNA-Derivat, vorteilhaft eine therapeutisch wirksame
Nukleinsäure. Die Nanofasern bestehen aus bioabbaubaren,
bioverträglichen Polymeren. Sie bzw. das gesamte Transfektionsmittel
können mit einem Polymerüberzug versehen sein.
Ein Verfahren zur Herstellung eines nicht-viralen Transfektionsmittels
umfasst die folgenden Schritte: Bereitstellung des Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes,
Herstellung einer Spinnlösung enthaltend die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe, Elektrospinnen.
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Man
erkennt, dass das nicht-virale Transfektionsmittel zur Transfektion
von eurkaryotischen Zellen und zur Herstellung eines Arzneimittels
verwendet werden kann. Das Arzneimittel kann mit Vorteil für gentherapeutische
Behandlungen verwendet werden.
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Sämtliche
aus den Ansprüchen, der Beschreibung und der Zeichnung
hervorgehenden Merkmale und Vorteile, einschließlich konstruktiver Einzelheiten,
räumlicher Anordnungen und Verfahrensschritten, können
sowohl für sich als auch in den verschiedensten Kombinationen
erfindungswesentlich sein.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - WO 96/02655
A1 [0004]
- - WO 98/59064 A1 [0005]
- - WO 01/43777 A1 [0008]