WO1998059064A1 - Komplexe für den transport von nukleinsäure in höhere eukaryotische zellen - Google Patents

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Manfred Ogris
Ralf Kircheis
Sylvia Brunner
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    • C12N2310/3513—Protein; Peptide

Definitions

  • the invention relates to the field of gene transfer.
  • the smallest possible size of the complexes pays for many applications.
  • the requirement for the smallest possible complexes is due, among other things, to the physical conditions in the organism, such as the small diameter of many blood vessels; certain tissues can only be reached by small, non-aggregating complexes. If the complexes are to be taken up by receptor-mediated endocytosis, one results Limit of max. 200 nm to allow inclusion in the "coated pits" (Stryer, 1990).
  • Polycation / DNA complexes have the advantage of low immunogenicity and low risks compared to viral systems, but are compared to viral ones
  • a limiting factor in gene transfer is also the non-specific immune defense in the bloodstream of the organism through so-called opsonization, which is one of the first barriers that gene transfer particles have to overcome in vivo.
  • Plasma proteins bind to invaded bacteria, viruses or other foreign bodies and thereby trigger further immune defense mechanisms (Roitt et al. 1991).
  • Chonn et al. Shown in 1992.
  • a direct correlation between the amount of bound protein and the half-life of the liposomes in the bloodstream could be demonstrated.
  • Another important component of non-specific immune defense is the activation of the complement system.
  • Many cationic lipids and other polycations used for gene transfer show strong complement activation (Chonn, et al., 1991; Plank et al., 1996).
  • So-called dysopsonins found in nature can prevent these proteins from attaching (Absolom, 1986). For example Bacteria escape opsonization by carrying highly hydrophilic sugar residues on their surface.
  • PEG polyethylene glycol
  • the amount of PEG used was usually between 2 and 10% PEG-coupled lipid in the liposome (m / m), the molecular weight of PEG between 750 and 5000 D (Klibanov et al., 1990; Blume et al, 1990; Mayhew et al, 1992; Papahad ⁇ opoulos et al, 1991; Senior et al, 1991; Mori et al, 1991; Yoshioka, 1991).
  • the importance of molecular weight was shown by Woodle et al., 1994 for the steric stabilization of particles. PEG denvates from a size of 2000 D to 5000 D proved to be suitable; in the work of
  • Klibanov et.al 1991 described the stabilizing effect of PEG 5000 D in liposomes that contain specific ligands (so-called immunoliposomes). However, it was found that this PEG leads to a somewhat poorer binding of the ligand to the receptor. In Torchilin et.al, 1992, is shown, however, that the prolonged half-life of the immunoliposomes by PEG-coatmg, thus • »a reduction in nonspecific uptake by the RES (reticuloendothelial system) which deteriorated ligand-receptor interaction more than compensated. Kirpotin et.al., 1997, describes the use of bifunctional PEGs, the production of which by Zalipsky et. al., 1997, is shown in more detail for the subsequent coupling of ligands to PEG liposomes.
  • the object of the present invention was to provide an alternative gene transfer system which efficient and very specific and suitable for in vivo applications.
  • the solution to this problem consists in complexes of nucleic acid and polyethyleneimine, which are characterized in that the polyethyleneimine is modified with a hydrophilic polymer covalently coupled thereto.
  • the complexes according to the invention are referred to below as DNA / PEI / polymer complexes.
  • the ratio of DNA to PEI is given below by indicating the molar ratio of the nitrogen atoms in the PEI to the phosphate atoms in the DNA (N / P value); an N / P value of 6.0 corresponds to a mixture of 10 ⁇ g DNA with 7.5 ⁇ g PEI. In the case of free PEI, only about every sixth nitrogen atom is protonated under physiological conditions. Results with DNA / PEI complexes show that these are approximately electroneutral with an N / P ratio of 2 to 3.
  • the N / P value of the complexes can be wide
  • Fluctuate range it can be in the range of about 0.5 to about 100.
  • the ratio is preferably about 2 to about 20, particularly preferably the ratio is 3 to 10.
  • the N / P value for the specific application can be determined by preliminary tests by increasing the ratio under otherwise identical conditions in order to determine the optimal ratio with regard to the transfection efficiency and one for the Exclude cells toxic effect.
  • the PEI contained in the complexes has a molecular weight of approximately 700 D to approximately 2,000,000 D. After complexing with DNA, larger PEI molecules give an optimum of transfection efficiency even at lower N / P ratios; they generally result in very good transfection efficiency. Smaller molecules, of which a larger amount is required for complexation per given amount of DNA, have the advantage of lower toxicity and less efficiency with less efficiency. Which PEI molecule is used in detail can be determined in m preliminary experiments.
  • PEI molecules in the molecular weight range between 2000 and 800000.
  • PEI 700 D PEI 2000 D, PEI 25000 D, PEI 750000 D (Aldrich), PEI 50000 D (Sigma), PEI 800000 D (Fluka ).
  • BASF also offers PEI under the brand name Lupasol® in various molecular weights (Lupasol® FG: 800 D; Lupasol® G 20 anhydrous: 1300 D; Lupasol® WF: 25000 D; Lupasol® G 20: 1300 D; Lupasol® G 35 : 2000 D; Lupasol® P: 750000 D; Lupasol® PS: 750000 D; Lupasol® SK: 2000000 D).
  • the hydrophilic polymer bound to PEI is preferably linear or only branched to a small extent, so that its mobility is largely retained. (Without wishing to be bound by this theory, the positive effect of the polymer, in addition to its hydrophilicity, could be attributed to its mobility.)
  • hydrophilic polymers coupled to PEI are selected from the group of polyethylene glycols (PEG), Polypyrollidones, polyacrylamides, polyalcohols, or copolymers of these polymers.
  • PEG is preferred as the hydrophilic polymer.
  • the molecular weight of the hydrophilic polymer is generally about 500 to about 20,000 D, preferably molecules with a molecular weight of 1,000 to 10,000 D are used.
  • the amount of polymer for coupling to PEI was determined on the basis of PEG m preliminary tests for the present invention from the analysis of the number of primary nurses in the PEI molecule using a Nmhydnn assay (Sarin et al, 1981). It was found that approximately every tenth nitrogen atom is in the form of a primary nurse. A weight ratio of PEG-5000 D derivative to PEI of 9.2 was therefore chosen as the starting point. This corresponds on the order of magnitude to a molar ratio of PEG: primary amino groups / PEI molecule of 1: 1.
  • a molar ratio of polymer: primary amino groups / PEI in a range from 1:10 to 10: 1 is suitable for the steric stabilization of DNA / PEI complexes, depending on the application.
  • the range is preferably 1: 5 to 5: 1, particularly preferably 1: 3 to 3: 1.
  • PEI is modified with a cellular ligand, if necessary, in order to effect the specific uptake of the complexes by binding to cell surface proteins, in particular receptors.
  • ligands are given in WO 93/07283; transferrin or EGF is preferably used as the ligand.
  • the type, molecular weight and amount of the polymer molecule most suitable for a particular transfection batch can be determined in preliminary tests, as can the suitability of modifying PEI with a cellular ligand.
  • Ligands are compared in terms of their transfection efficiency to complexes which are identical except for the presence or absence of a cellular ligand.
  • the ligand is coupled to PEI using conventional methods, e.g. by chemical means, as described in WO 93/07283 for the coupling of virus, virus proteins or peptides with polyamine compounds.
  • PEI is connected to the ligand via the hydrophilic polymer.
  • This embodiment has the advantage that there are fewer restrictions with regard to the polymer size, because the accessibility of the ligand, which is in this arrangement outside the polymer layer, and its binding to the receptor is not blocked by the polymer.
  • nucleic acid contained in the complexes according to the invention is primarily defined by the biological effect to be achieved in the cell, in the case of use in the context of gene therapy by the
  • the nucleic acids to be transported into the cell can be Act DNAs or RNAs, with no restrictions on the nucleotide sequence.
  • the complexes according to the invention have the advantage that they can be produced in a small size, this effect not being impaired by a ligand which may be coupled to PEI.
  • the modification with PEG can also be carried out on larger complexes without impairing their functionality.
  • the invention relates to a
  • DNA / PEI / polymer complexes can be produced in different ways.
  • DNA and PEI are preferably first complexed by mixing the solutions and then, e.g. after a ripening time of about 20-40 minutes, the reaction with the polymer (in the case of the reaction with PEG, the "PEGylation") can take place as was carried out in the examples of the present invention.
  • the reaction with the polymer in the case of the reaction with PEG, the "PEGylation”
  • PEGylation the reaction with the polymer
  • complexation at high concentrations of the complex partners provides a significantly higher proportion of aggregated complexes (see Example 3c). It has been found that in many cases this undesired aggregation can largely be prevented by mixing the complexes from very dilute solutions.
  • the reduction of the salt concentration below the physiological value reduces the effect of the aggregate formation (example 1).
  • Salt concentration can prevent aggregation (example 1). It has been shown that physiological glucose concentrations have no influence on the Have aggregate formation (see Fig. 1). It was found that an increase in the salt concentration to a value in the physiological range following the complexation did not have a negative effect on the stability of the complexes, while complexes without PEG quickly formed aggregates (FIG. 2a). It was also shown that the PEGylation of the complexes also leads to a reduced surface charge of the complexes (FIG. 14).
  • Complex partner preferably at about 5 to 50 ⁇ g DNA / ml, in particular 10 to 40 ⁇ g DNA / ml.
  • the PEI concentration is matched to the DNA concentration in accordance with the respective N / P value; it is e.g. 1.25 ⁇ g / ml PEI 800000 D at an N / P value of 2 and a DNA concentration of 5 ⁇ g / ml; at a DNA concentration of 50 ⁇ g / ml corresponding to 12.5 ⁇ g / ml PEI 800000 D.
  • the complexation is also carried out with the lowest possible ion concentration in order to prevent aggregates from occurring
  • the complexation is carried out in the presence of physiological sugar concentration (dextrose, glucose, sucrose).
  • complexes are obtained from dilute solutions, using PEI which is already covalently coupled to the polymer, for example PEG (example 2b). This was also evident here Stabilizing effect of PEG, which prevents the complexes from aggregating even after adding salt.
  • the covalent coupling of the polymer to PEI can be carried out by means of conventional methods, using polymer derivatives which can bind to the free amino groups of PEI.
  • polymer derivatives which can bind to the free amino groups of PEI.
  • Different derivatives are commercially available, e.g. the corresponding PEG derivatives (Shearwater Polymers, USA):
  • N-hydroxysuccinimidyl active esters (Abuchowski et al, 1984; Klibanov et al, 1990 showed the suitability of the corresponding PEG derivatives for the modification of liposomes);
  • Examples of commercially available PEG derivatives of this type are methoxy-SS-PEG, MW 5000 D; Methoxy-SSA-PEG, MW 5000 D); Succinimidyl succinate-propionic acid derivatives (methoxy-SPA-5000, MW 5000 D; methoxy-SPA-20000, MW 20000 D; methoxy-SSPA-PEG, MW 5000); Oxycarbonylimidazole derivatives that react to form urethane (the binding of PEG derivatives of this type to proteins was shown by Beauchamp et al, 1983, the use for PEGylation of liposomes by Allen et al, 1991; examples of commercial products are methoxy-PEG- CDI, MW 5000 D); Glycidyl ether (
  • the PEI is coupled to the ligand, as described in EP-AI 388 758 or by Kircheis et al., 1997, followed by complexation with the other reaction partners, as described above.
  • bifunctional polymers are used which have different reactive groups at both ends of the molecule.
  • Polymers e.g. PEG can be used, as they have been used for the cross-linking of different macromolecules, e.g. for the cross-linking of cofactor and apoenzyme (Nakamura et al, 1986), target control of polymeric active ingredients (Zalipsky and Barany, 1990) or PEG coating of surfaces and proteins (Harris et al, 1989).
  • Bifunctional derivatives that can be used are commercially available, they contain amino groups, hydroxyl groups or carboxylic acid groups at the molecular ends, e.g. such as products available from Shearwater Polymers.
  • Derivatives that can also be used are NHS-maleimide and NHS-vinylsulfone derivatives, which have their reaction optima at different pH values.
  • Biotin-PEG-maleimide or -NHS derivatives can also be used, with covalent coupling to the MAL or NHS group and the biotinylated side with
  • Streptavidin-containing molecules or particles can react.
  • the bifunctional polymer for example PEG
  • a ligand with a suitable functional group can be coupled to the second, remaining functional group on the polymer, optionally before or after complexing with DNA.
  • the PEG-PEI can be bound via the primary nurses of the PEI, although it is also possible to couple other reactive groups, such as SH groups, to PEI, which can act as reaction partners for PEG derivatives.
  • the previous coupling of ligands to bifunctional PEG is also possible, further binding to PEI being possible before or after complexing with DNA. In all of these cases, especially when using small ligands, there are advantages which can be shielded by the PEG in the event of a subsequent PEGylation.
  • the linear, hydrophilic polymer molecule functions as a kind of spacer between PEI and ligand.
  • the complexes according to the invention are present in high concentration, advantageously in a concentration of at least approx. 200 ⁇ g DNA / ml.
  • the complex concentration can be up to approx. 1 mg / ml with a higher content of hydrophilic polymer.
  • the complexes according to the invention surprisingly have the advantage that they can be brought to the required high concentration from dilute solutions without any significant formation of aggregates which would impair the gene transfer efficiency. It could also be shown that the modification of the complexes with PEG leads to an increased resistance of the Leads to complexes in the blood of mice. This effect also contributes to gene transfer in the subcutaneous tumor after, for example, intravenous application of the complexes.
  • the invention relates to a composition for the transfection of higher eukaryotic cells, which contains DNA / PEI / PEG complexes in a concentration, based on DNA, of about 200 ⁇ g / ml to about 1 mg / ml.
  • the composition is in the form of a pharmaceutical composition.
  • the composition is used to transfect mammalian cells in vivo; as an active ingredient it contains a complex which contains a therapeutically effective nucleic acid.
  • a high concentration of therapeutically active DNA can be achieved in the tissue.
  • the composition has the advantage that the complexes are not subject to non-specific binding or degradation because of the prevention of opsonization.
  • Complexes specific targeting to specific cells, organs or tissues (e.g. tumor tissue) and thus targeted gene expression (e.g. in tumor tissue) can be achieved after systemic administration (example 12).
  • the complexes stabilized by PEGylation according to the invention have the possibility, due to their longer circulation time in the blood, in areas with increased Vascular permeability or vascular damage from the blood vessel system m to emerge from the surrounding tissue and accumulate there. Areas where such "passive targeting" occurs more frequently are well-perfused tumors and inflammation areas.
  • the pharmaceutical composition can include can advantageously be used for the therapy of tumor diseases in order to administer mtratumoral DNA, containing, in particular on a plasmid, a sequence coding for one or more cytokymes, such as Interleukm-2, IFN- ⁇ , IFn- ⁇ , TNF- ⁇ , or A suicide gene that is used in combination with the substrate, such as the herpes simplex thymidmkmase gene (with ganciclovir) or the lmamarase gene (with linamarin), or a DNA coding for an apoptosis-reducing protein such as p53 or apoptm, or for a toxm, such as the diphtheria toxm, or for a cytotoxic enzyme.
  • cytokymes such as Interleukm-2, IFN- ⁇ , IFn- ⁇ , TNF- ⁇
  • a suicide gene that is used in combination with the substrate, such as the herpes simplex thymidmkmase gene (with ganci
  • compositions according to the invention come into play is the so-called genetic tumor vaccination.
  • the complexes used here contain DNA, coding for em or several tumor antigens or fragments thereof, optionally in combination with DNA, coding for em or several cytokomes.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is preferably in the form of a lyophilisate, optionally with the addition of sugar, such as sucrose or dextrose, in an amount which gives a physiological concentration in the ready-to-use solution.
  • the composition can also be in the form of a cryoconcentrate.
  • composition according to the invention can also be deep-frozen (cryopreserved) or as a chilled solution.
  • the invention relates to a method for producing a composition for the transfection of mammalian cells, in which first complexes are prepared from dilute solutions of the complex partners and then brought to a concentration of at least 200 ⁇ g / ml.
  • the complexes can be concentrated using conventional methods, e.g. by ultrafiltration or by ultracentrifugation.
  • compositions according to the invention can optionally be in the form of a kit, the individual components DNA on the one hand and polymer-modified PEI to which a ligand is optionally coupled, on the other hand, being present in separate containers.
  • Fig. 1 suppressing the aggregate formation of DNA / PEI complexes by mixing with salt-free
  • Fig. 2 Stabilizing DNA / PEI complexes with polyethylene glycol (PEG)
  • Fig. 6 Reduction of protein binding to DNA / PEI complexes by modification with PEG A) silver coloring B) checking the filterability
  • Fig. 7 Effect of PEG modification on gene transfer in K562 cells
  • Fig. 11 PEGylation of DNA / TfPEI complexes increases the stability of the complexes in the blood after in vivo use
  • Fig. 12 Determination of the biodistribution of PEGylated DNA / TfPEI complexes according to systemic
  • Fig. 14 Measurement of the zeta potential: reduced surface charge of PEGylated
  • Fig. 15 Effect of PEG modification of small and large complexes on gene transfer in mammalian cells
  • Fig. 16 Effect of PEG modification on EGF-mediated gene transfer in mammalian cells
  • Example 1 Suppressing the aggregate formation of DNA / PEI complexes by mixing under salt-free conditions
  • the complexes were formed by mixing equal volumes (250 ⁇ l) of dilute solutions of plasmid DNA, containing the sequence coding for the reporter gene luciferase (10 ⁇ g of the plasmid pCMVL, described in WO 93/07283) and 7.5 ⁇ g PEI ( N / P value: 6.0) or 9 ⁇ g PEI (N / P value 7.2) through rapid, repeated pipetting up and down of the solutions in order to achieve the fastest possible mixing of the two components.
  • PEI with a molecular weight of 800,000 daltons was used (Fluka).
  • the final concentration of DNA in the complex was 20 ⁇ g / ml.
  • Tf2PEI molar ratio of Tf / PEI 2/1
  • Tf4PEI molar ratio of Tf / PEI 4/1).
  • HBS 150mM NaCl, 20mM HEPES, pH 7.3
  • MQ deionized water
  • Fig. 1 The mean particle size was measured after various times using quasi-elastic laser light scattering (Brookhaven BI-90). It was found that complexes in HBS aggregated after a short time, while complexes that were prepared in deionized water had a stable size, which was not significantly affected by a physiological glucose concentration.
  • the DNA / PEI complexes with an N / P ratio of 6.0 were mixed as described in Example 1 and stored 40 mm at room temperature (RT) for complete complexation. Then 69 ⁇ g methoxy-succmimidyl-proprionate-PEG (M-SPA-PEG, molecular weight of 5000 Dalton, Shearwater Polymers, Inc., USA, stock solution 10 mg / ml in DMSO) were added to 50 ⁇ l MQ water. (A covalent bond is formed between M-SPA-PEG and the amino groups of the PEI.) The reaction time was 20 mm at RT; the weight ratio (w / w) of PEG to PEI was 9.2.
  • the complex size was measured after various times using quasi-elastic laser light scattering.
  • 250 ⁇ l aliquot of PBS 137 mM NaCl, 2.6 mM KC1, 6, 6 mM Na2HP04, 1.5 mM KH2PO4; pH 7.4
  • PBS 137 mM NaCl, 2.6 mM KC1, 6, 6 mM Na2HP04, 1.5 mM KH2PO4; pH 7.4
  • pre-PEGylation The PEGylation of PEI before the complexation (“pre-PEGylation”) was carried out as follows: 7.5 ⁇ g PEI were mixed with 6.9 ⁇ l M-SPA-PEG 10 mg / ml in DMSO and the reaction after 20 min at RT stopped by adding 0.2 ⁇ mol of glycine. (The free M-SPA-PEG still present reacts with the amino group of the glycine.) After a further 20 min, the solution was made up to 250 ⁇ l with MQ and, as described in Example 2a, complexed with 10 ⁇ g DNA. The further procedure was also carried out as described in Example 2a.
  • the complexes used had an N / P value of 6.0 and the ratio of PEG / PEI was 9.2 (w / w).
  • the complexes were mixed in MQ, modified with PEG and the average particle diameter was measured by means of LLS.
  • the DNA concentration during complex formation was 20 or 320 ⁇ g / ml.
  • the size measurement took place after the PEGylation. It was clearly shown that more aggregates are formed by mixing in higher concentrations (FIG. 2c).
  • Example 3 The covalent binding of PEG is decisive for the stabilization of the complexes
  • the complexes were mixed as described in Example 1 and, as described in Example 2, stabilized with M-SPA-PEG. After the stabilization and addition of 250 ⁇ l PBS, the complex solution (approx. 800 ⁇ l) in micro-concentrators (Vivaspm 500, molecular exclusion volume 100000 Dalton) with 12000 g to a volume of approx. 25 ⁇ l and thus a DNA concentration of approx. 400 ⁇ g / ml of DNA concentrated. Then was again set a concentration of 20 ⁇ g / ml with MQ and measured the size using quasi-elastic laser light scattering.
  • Fig. 4 shows that without PEG modification after concentration due to aggregation and / or absorption of the complexes on the membrane no more meaningful particle sizes could be measured, while the stabilized complexes did not form an aggregate even after concentration.
  • This experiment served to determine the interaction of plasma proteins with the PEI complexes, the proteins bound to the complexes being separated together with these.
  • Filtrate the complex / plasma solution ("filtrate") after adding an aliquot of five-fold concentrated non-reducing sample buffer (25% glycerol (w / v); 290 mM TRIS pH 6.8; 0.25% SDS (w / v); 0, 1 mg / ml bromophenol blue) on an SDS polyacrylamide gel with a polymer gradient of 2.5 to 12%.
  • the gel was blotted in a "semi dry" blot apparatus (Bio Rad) onto a nitrocellulose membrane, non-specific binding sites with a 1% strength
  • Goat anti-human complement C3 fractionated antiserum, Sigma, Order No. C-7761, Lot Number 054H8842), dilution 1: 3000.
  • Goat anti-human fibrinogen fractionated antiserum, Sigma, Order No. F-2506, Lot Number 115H8828
  • Goat anti-human fibronectin fractionated antiserum, Sigma, Order No. F-1909, Lot Number 094H8868
  • dilution 1: 3000 Goat anti-human fibrinogen, Sigma, Order No. F-2506, Lot Number 115H8828
  • Goat anti-human fibronectin fractionated antiserum, Sigma, Order No. F-1909, Lot Number 094H8868
  • the immunoblot is shown in Fig. 5.
  • Complement C3, fibrinogen, and fibronectin were found to bind to the DNA / PEI complexes in the eluate; an effect which after PEGylation (the complexes were as in
  • Example 2 PEGylated is significantly reduced (see lanes 4 and 5).
  • the controls (lanes 6 and 7) were used to determine the extent to which these proteins bind to the filter membrane without the presence of complex.
  • the protein is mainly found in the filtrate; no significant amounts of the proteins were found in the eluate (lane 1: human plasma, 3 ⁇ l, diluted 1:50; lane 2: DNA / PEI + plasma, filtrate , 6 ⁇ l; lane 3: DNA / PEI + plasma, eluate, 20 ⁇ l; lane 4: 150 ⁇ l plasma, 1:70 diluted, filtrate, 6 ⁇ l; lane 5: 150 ⁇ l plasma, 1:70 diluted, eluate, 20 ⁇ l).
  • PEG-modified complexes (lane 5, eluate) bind significantly less (not visible) amounts of protein than on unmodified complexes (lane 3).
  • Lane 1 human plasma, 3 ⁇ l, diluted 1:50;
  • Lane 2 DNA / PEI + plasma, filtrate, 6 ul;
  • Lane 3 DNA / PEI + plasma, eluate, 20 ul;
  • Lane 4 DNA / PEI-PEG PEG / PEI 9.2 / 1 (w / w) + plasma, filtrate, 6 ul;
  • Lane 5 DNA / PEI-PEG PEG / PEI 9.2 / 1 (w / w) + plasma, eluate, 20 ul;
  • Lane 6 150 ul plasma, diluted 1:70, filtrate, 6 ul;
  • Lane 7 150 ⁇ l plasma, diluted 1:70, eluate, 20 ⁇ l.
  • complexes (DNA concentration of 320 ⁇ g / ml) were mixed as described in Example 5a and PEGylated. The complexes were then filtered through a membrane saturated with BSA and washed 3 times with 300 ⁇ l HBS each. The absorption of the solution (A260; (maximum absorption of nucleic acids) before filtration (A260 before filtration), the filtrate (A260 filtrate) and the three washing solutions (wash 1 to wash 3) was measured.
  • Fig. 6b shows that unmodified complexes are complete and PEGylated complexes are largely retained.
  • the complexes were mixed as described in Example 1 and modified as described in Example 2 with M-SPA-PEG.
  • the DNA concentration during complex formation was 20 ⁇ g / ml, the ratio of DNA to PEI, N / P was 7.2.
  • PEI or Tf-PEI conjugates were used for DNA complexation, the molar ratio of Tf to PEI in the conjugate was 2/1 (Tf2PEI).
  • the ratio of PEG / PEI was 2.3 / 1 or 3.7 / 1 and 7.4 / 1 (w / w); this corresponds to a molar ratio of 0.25: 1, 0.4: 1 or 0.8: 1.
  • the cells were cultivated (ATCC CCL-243 K-562) in RPMI 1640 medium with 100 lU / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycm and 10% fetal calf serum (FCS).
  • FCS fetal calf serum
  • 500,000 cells were sown in 24-well plates (diameter 22.6 mm, Costar). The transfection was carried out in serum-free medium. After four hours, the medium was replaced with serum-containing medium.
  • the cells were centrifuged, harvested in 100 ⁇ l harvest buffer (250 mM TRIS, pH 7.2, 0.5% Triton X 100), homogenized, centrifuged and 10 ⁇ l each from the supernatant for the determination of luciferase activity in 100 ⁇ l sample buffer (25 mM Glycylglycm pH 7.8, 5 mM ATP, 15 mM MgC12) diluted. The measurement was made after
  • the complexes were mixed as described in Example 1 and, as described in Example 2, modified with M-SPA-PEG.
  • the ratio of DNA to PEI was N / P 7.2.
  • the ratio of PEG / PEI was 3.5 / 1 and 7.0 / 1 (w / w); this corresponds to a molar ratio of 0.38: 1 or 0.76: 1.
  • PEI or Tf-PEI conjugates were used for DNA complexation, the molar ratio of Tf to PEI in the conjugate was 2/1 (Tf2PEI).
  • the cells were cultivated (ATCC CCL 131 Neuro 2A) in RPMI 1640 medium with 100 iU / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 10% fetal calf serum (FCS).
  • FCS fetal calf serum
  • 300,000 cells were sown in 6-well plates (diameter 35 mm, Costar). The transfection was carried out in serum-free medium. After four hours, the medium was changed to serum-containing medium.
  • the cells were harvested in 100 ⁇ l harvest buffer (250 mM TRIS, pH 7.2, 0.5% Triton X 100), homogenized, centrifuged and 10 ⁇ l each from the supernatant for the determination of luciferase activity in 100 ⁇ l sample buffer (25 mM glycylglycm pH 7.8, 5 mM ATP, 15 mM MgC12) diluted.
  • 100 ⁇ l injection buffer 200 ⁇ M Lucifer (Sigma), 20 mM 25 mM glycylglycm pH 7.8) into a Berthold Lumat LB 9507.
  • Figures 7 and 8 show that modification of DNA / PEI
  • Example 7 Reduction of the non-specific uptake of the complexes by P388 mouse macrophages by modifying the complexes with PEG
  • the uptake of the complexes by the cells was carried out using a fluorescence-activated cell sorter (FACS) (FACScan, Becton Dickinson).
  • FACS fluorescence-activated cell sorter
  • the Excitation wavelength of the laser was 488 nm.
  • the fluorescence was measured at 515 nm.
  • the DNA concentration during complex formation was 320 ⁇ g / ml, the N / P value 6.0.
  • the PEG / PEI ratio was 9.2: 1; this corresponds to a molar ratio of 01: 1.
  • the complexes were mixed as described in Example 5a and, as described in Example 2, modified with M-SPA-PEG.
  • the DNA was pre-complexed with YOYOl (1, 1 '- (4, 4, 7, 7, -tetramethyl-4, 1 - diazaundecamethylene) -bis-4- [3-methyl-2, 3-dihydro- (benzo - 1,3-oxazole) -2-methylidene] -quinolinium tetraiodide; Molecular Probes) in a molar ratio of 100: 1 (base pairs DNA: YOYOl).
  • the cells were cultivated in DMEM (Dulbeccos modified eagle medium) with 4500 mg / ml glucose, 100 iU / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 10% fetal calf serum (FCS). 300,000 cells were sown in 35 mm petri dishes (Falcon No 1008) per batch. The complexes were incubated in serum-free medium at 37 ° C. After one hour the cells were washed with PBS and harvested with 5 mM EDTA in PBS.
  • DMEM Dynamic fetal calf serum
  • FIG. 9 The result of the FACS analysis is shown in FIG. 9 (A: DNA / PEI +/- M-SPA-PEG 37 ° C., PEG / PEI 9.2 / 1 w / w).
  • B DNA / Tf2PEI +/- M-SPA-PEG 37 ° C; PEG / PEI 9.2 / 1 w / w).
  • the X-axis shows the fluorescence intensity of the measured cells, the Y-axis the number of measured events.
  • the FACS data show that PEGylation significantly reduces the binding and uptake of the complexes to macrophages. This is reflected in the significantly reduced fluorescence of the cells.
  • Example 8 Reduction of the interaction with
  • DNA / Tf2-PEI complexes were prepared as described in Example 1 (mixed in water) and, as described in Example 2, modified with PEG.
  • the DNA concentration was 20 ⁇ g / ml, the N / P value was 7.2.
  • the ratio of PEG: PEI was 3.5: 1 and 7.0: 1 (w / w); this corresponds to a molar ratio of 0.38: 1 or 0.76: 1.
  • 500 ⁇ l of complex were incubated with 7.2 ⁇ l of plasma at 37 ° C. At the times indicated in FIG. 10, the particle size was measured by means of LLS.
  • DNA / TfPEI complexes were prepared and PEGylated as described in Examples 1 and 2, respectively.
  • Standard DNA / TfPEI complexes TfPEI conjugate: molar ratio of approx. 4 transferrin molecules, bound to PEI,
  • PEGylated DNA / TfPEI complexes (DNA / TfPEI / PEG; N / P 6.0, PEG / PEI 10/1 w / w, 1 h PEGylation at room temperature) were mixed at a DNA concentration of 50 ⁇ g / ml.
  • the complexes were mixed in water, 0.3 x HBS (50 mM NaCl, 7 mM HEPES pH 7.4) or 0.5 x HBS.
  • glucose was added at a final concentration of 5%, 3.3% and 2.5% (w / v).
  • the PEGylated DNA / TfPEI complexes were concentrated using a VIVA spin 4000 microconcentrator to a final DNA concentration of 200 ⁇ g / ml, as described in Example 4.
  • Example 10 PEGylation of DNA / TfPEI complexes increases the stability of the complexes in the blood after in vivo use
  • the DNA was isolated using the QIAamp tissue kit protocol (Quiagen Cat. No. 29304). For each aliquot (100 ⁇ l) of blood or plasma during the initial incubation at 70 ° C 10 ul Heparm (Hepa ⁇ n "Novo", 1000 IU / ml, Novo Nordisk) to ensure the quantitative isolation of plasmid DNA (it had been shown that the complexes in the presence of Heparm dissociate).
  • the agarose gel was denatured according to standard instructions (Sambrook et al., 1989) 45 mm long (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH), washed with distilled water and rinsed 30 mm long in 1 M T ⁇ s / 1.5 M NaCl 30 mm long.
  • the transfer to nylon membranes (Gene Screen, DuPont, NEF983) was carried out by capillary transfer in 10 x SSC; the DNA was cross-linked to the filters using UV radiation.
  • the hybridization and washing were carried out according to the recommendations of the DIG High Prime DNA Labelmg and Detection Starter Kit II (Boehrmger Mannheim; Cat. No. 1585614).
  • the filters were prehyb ⁇ dized for 4 h and overnight with the DIG-labeled probe at 42 ° C in 50% formamide, 5 x SSC, 0.1% N-lauroyl sarcosm, 0.02% SDS, 2% blocking reagent and 100 ⁇ g / ml yeast tRNA hybridizes.
  • the final wash was carried out at 0.5 x SSC, 0.1% SDS at 68 ° C.
  • the hybridization probe was obtained from the plasmid pCMVL (Plank et al., 1992) by means of DIG labeling according to the manufacturer's instructions (DIG High Prime DNA Labelmg and Detection Starter Kit II; Boehrmger Mannheim).
  • the immunological detection was carried out with the substrate contained in the kit or preferably with Vistra ECF substrate (Amersham Cat. No. RPN5785), which can be determined quantitatively in a phosphor imager (Molecular Dynamics). Incubation with the Vistra substrate was carried out overnight.
  • Estimation of the amount of plasmid DNA Different amounts of pCMVL (5 ng, 500 pg, 50 pg, 5 pg and 0.5 pg) were loaded onto each agarose gel in order to directly compare the intensity of the bands detected on the blots. The total amount of DNA in the plasma was calculated from the values obtained. The result is shown in Fig. 11.
  • the PEGylated DNA / TfPEI complexes were prepared as described in Example 9; the animal model used was analogous to that of Example 10, but these and all other in vivo studies were carried out in tumor-bearing mice.
  • Female A / J mice were subcutaneously with 2 x 10 6
  • Neuroblastoma cells Neuroblastoma cells (Neuro2a, ATCC CCL 131) injected. After two weeks, when the tumors had reached approximately 10 to 14 mm in size, the transfection complexes were injected into the tail vein. a) Administration of the transfection complexes in vivo
  • DNA isolation was carried out in a manner similar to Example 10 according to the QIAamp Tissue Kit. Unlike in Example 10, no heparin was added in this case (the lysis buffer for tissues in the kit was sufficient to dissociate the complexes). The exact weight of the mouse organs was determined.
  • FIG. 12A shows the amounts of pCMVL (intact plus partially degraded) which were detectable in the different tissues by means of Southern blot analysis.
  • Figure 12B shows the detectable levels of intact pCMVL.
  • the tissues were homogenized in a buffer containing 250 mM TRIS pH 7.5 using an IKA homogenizer (“Ultraturax”) and in liquid nitrogen snap frozen. The samples were stored at -80 ° C until the luciferase assay.
  • the transfection efficiency was determined by means of the luciferase assay. For this, samples of homogenized tissue were subjected to three freeze / thaw cycles and centrifuged 10 mm at 10,000 g to pellet the precipitate. The luciferase light units were recorded using a Lumat LB9501 / 16 (Berthold, Germany) from an aliquot of the supernatant (50 ⁇ l) with 10 s integration after automatic injection of the Luciferm solution. The luciferase background (300-400 light units) was subtracted from each value and the transfection efficiency was printed out as relative light units (RLU) per organ / tissue.
  • RLU relative light units
  • the complexes were mixed as described in Example 1 and modified as described in Example 2 with M-SPA-PEG.
  • 10 ug of pCMVL DNA was in 250 ul buffer mixed with 7.5 ⁇ g PEI (800 kDa) or Tf-PEI conjugate (molar ratio of Tf to PEI in conjugate 2/1, Tf2PEI) in 250 ⁇ l buffer.
  • Either HBG (5% glucose in 10 mM HEPES pH 7.4) - for the small complexes - or HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7.4) - for the large complexes - was used as buffer.
  • 75 ⁇ g M-SPA-PEG5000 were added and incubated for a further hour at room temperature. As a control, complexes without PEG modification were produced.
  • the K-562 cells (ATCC CCL-243) were transfected in RPMI 1640 medium with 100 iU / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycm and the presence or absence of 10% fetal calf serum (FCS). For each transfection batch, 500,000 cells were sown in 24-well plates (diameter 22.6 mm, Costar). The transfection was carried out with 2.5 ⁇ g DNA complex in 125 ⁇ l (-FCS approach) or 5 ⁇ g DNA complex in 250 ⁇ l
  • Example 15 Effect of PEG modification on EGF-mediated gene transfer in mammalian cells
  • Epidermal growth factor (EGF) conjugates with PEI 25 kDa were prepared by modifying the components with SPDP (Pharmacia 17-0458-01), converting the modified PEI to the mercaptopropionate form and coupling via disulfide bridging, in an analogous manner to that described by Kircheis et al, 1997.
  • EGF EGF1, Serotec, murine
  • 1 ml of 16 mM aqueous HEPES buffer (pH 7.9) 4 mg (0.67 ⁇ mol) EGF (EGF1, Serotec, murine) in 1 ml of 16 mM aqueous HEPES buffer (pH 7.9) were reacted with 0.5 ml of a 20 mM ethanolic h at room temperature.
  • the mixture was then dialyzed against 50% aqueous ethanol for two days (membrane with molecular weight cutoff MWCO 1 kDa, Spectropor 7).
  • the yield of modified EGF was 3.5 mg (87%) with a molar ratio EGF / Pydridinyldithiopropionat of 1: 0.8.
  • modified EGF in an amount of 0.7 mg was produced from 1 mg EGF.
  • EGF Pydridinyldithiopropionate-modified EGF (4.2 mg EGF, 0.56 ⁇ mol pyridinyldithiopropionate) in 2.2 ml 50% aqueous ethanol was reacted with mercaptopropionate-modified PEI (7.5 mg PEI, 0.90 ⁇ mol mercapto groups) in 1.1 ml 0.25 mM NaCl, 20 mM HEPSS pH 7.3 under argon .
  • PEI mercaptopropionate-modified PEI
  • reaction solution was adjusted to 0.5 M NaCl and a total volume of 4 ml by adding 3M NaCl and water and using ion exchange chromatography (Biorad Macroprep High S, 100 x 10 mm, buffer A: 20 mM HEPES pH 7.3; buffer B: 3 M NaCl, 20 mM HEPES pH 7.3; gradient 22% B to 78% B) separated.
  • the product fraction (elution between 2-3 M NaCl) was dialyzed against HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7.3) and gave a conjugate of 1.9 mg EGF modified with 6.35 mg PEI. This corresponds to an EGF / PEI molar ratio of 1.28: 1.
  • the complexes were mixed in a manner analogous to that described in Example 1 and, as described in Example 2, modified with M-SPA-PEG.
  • 5 ⁇ g of pCMVL DNA were in 125 ⁇ l buffer with 3.75 ⁇ g PEI (25 kDa) as unmodified PEI (hydrochloride), or as a 1: 1 (w / w) mixture of unmodified PEI (hydrochloride) with EGF-PEI (see a) ), mixed in 125 ⁇ l buffer.
  • Either HBS 150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7.4
  • 0.5x HBS 75 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7.4 were used as buffers.
  • 500000 KB cells (ATCC CCL-17) were sown in T25 bottles (Costar) per transfection batch.
  • the transfection was carried out in 2 ml of DMEM medium with 10% fetal calf serum (FCS) with 5 ⁇ g DNA complex and 250 ⁇ l solution. After four hours, the medium was supplemented with a further 2 ml of medium containing serum.
  • FCS fetal calf serum

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Abstract

Komplexe aus Nukleinsäure und Polyethylenimin (PEI), in denen PEI mit einem daran kovalent gekoppelten hydrophilen Polymeren, wie Polyethylenglykol, modifiziert ist sowie Verfahren zu deren Herstellung. An PEI ist gegebenenfalls ein zellulärer Ligand wie Transferrin gekoppelt. Die Komplexe können zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen für den Transfer von therapeutisch wirksamen Genen in Säugetierzellen verwendet werden.

Description

Komplexe für den Transport von Nukleinsaure in höhere eukaryotische Zellen
Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet des Gentransfers .
Es ist bekannt, daß die Komplexierung von DNA mit Polyethylenimm (PEI) erfolgreich eingesetzt werden kann, um Gene in die Zelle zu transportieren (Boussif et al., 1995; Boussif et al., 1996; Abdallah et al . , 1996). Der Gentransfer erfolgt dabei dadurch, daß die Komplexe ungerichtet an Zellen gebunden und aufgenommen werden. Um eine Spezifitat der Bindung zu erreichen, wurden verschiedene Liganden, z.B. Transferrin (Tf) oder Antikörper kovalent an PEI gekoppelt, um die Gene über den Mechanismus der rezeptorvermittelten Endozytose in die Zelle zu transportieren (Kircheis et al., 1997). Auch bei dieser Methode bleibt πedoch ein gewisser Anteil des erzielten Gentransfers unspezifisch, was auf eine Aufnahme der Komplexe in die Zelle unabhängig vom Liganden zurückzuführen ist.
Für die effiziente Anwendung der Gentherapie m vivo gibt es, neben der Spezifitat, weitere Voraussetzungen, die es zu erfüllen gilt. Dazu zahlt für viele Anwendungen eine möglichst geringe Große der Komplexe. Das Erfordernis möglichst kleiner Komplexe ist u.a. durch die physikalischen Gegebenheiten im Organismus bedingt, wie zum Beispiel den geringen Durchmesser vieler Blutgefäße; ein Erreichen bestimmter Gewebe ist nur durch kleine, nicht aggregierende Komplexe möglich. Soll die Aufnahme der Komplexe durch rezeptorvermittelte Endozytose erfolgen, so ergibt sich eine Großenlimitierung von max. 200 nm, um eine Aufnahme in die "coated pits" zu ermöglichen (Stryer, 1990) .
Polykation/DNA-Komplexe weisen gegenüber viralen Systemen den Vorteil geringer Immunogenitat und geringer Risken auf, sind jedoch im Vergleich zu viralen
Gentransfermethoden weniger effizient (Hodgson, 1995) . Dieser Nachteil kann grundsatzlich durch den Einsatz größerer Mengen an zu transferierender DNA ausgeglichen werden. In Vorversuchen zur vorliegenden Erfindung zeigte sich jedoch, daß durch Erhöhung der Konzentration an DNA und Polykation die Tendenz zur Aggregatbildung bei der Ko plexierung zunimmt.
Ein limitierender Faktor beim Gentransfer ist ferner die unspezifische Immunabwehr im Blutstrom des Organismus durch sog. Opsonisierung, welche eine der ersten Barrieren ist, die Gentransferpartikel in vivo überwinden müssen. Dabei binden Plasmaproteine an eingedrungene Bakterien, Viren oder andere Fremdkörper und losen dadurch weitere Abwehrmechanismen des Immunsystems aus (Roitt et al. 1991). Die Bedeutung der Proteinbindung an Liposomen, wie sie für den Gentransfer verwendet werden können, wurde von Chonn et al . , 1992 gezeigt. Hier konnte ein direkter Zusammenhang zwischen der Menge an gebundenem Protein und der Halbwertszeit der Liposomen im Blutstrom nachgewiesen werden.
Eine weitere wichtige Komponente der unspezifischen Immunabwehr ist die Aktivierung des Komplementsystems. Viele kationische Lipide und andere Polykationen, die für den Gentransfer verwendet werden, zeigen eine starke Komplementaktivierung (Chonn, et al., 1991; Plank et al., 1996). In der Natur vorkommende sogenannte Dysopsonine können ein Anheften dieser Proteine verhindern (Absolom, 1986) . So können zum Beispiel Bakterien der Opsonisierung entgehen, indem sie an ihrer Oberflache hoch hydrophile Zuckerreste tragen.
Es wurden bereits verschiedene Methoden entwickelt, um eine Opsonisierung von Partikeln zu verhindern. Eine der am häufigsten angewandten Methoden ist die Verwendung von kovalent gekoppeltem Polyethylenglykol (PEG) (Mori et al., 1991; Chonn et al . , 1992; oodle et al . , 1994). Dabei konnte sowohl eine reduzierte Proteinbindung als auch eine verlängerte Halbwertszeit der verwendeten Liposomen im Blutstrom gezeigt werden.
Die Menge des eingesetzten PEG betrug meist zwischen 2 und 10 % PEG-gekoppeltem Lipid im Liposom (m/m) , das Molekulargewicht von PEG zwischen 750 und 5000 D (Klibanov et al . , 1990.; Blume et al, 1990; Mayhew et al, 1992; Papahadπopoulos et al, 1991; Senior et al, 1991; Mori et al, 1991; Yoshioka, 1991) . Für die sterische Stabilisierung von Partikeln wurde von Woodle et al., 1994, die Bedeutung des Molekulargewichts gezeigt. Dabei erwiesen sich PEG-Denvate ab einer Große von 2000 D bis 5000 D geeignet; in der Arbeit von
Torchilin et al., 1992 zeigten sich PEG-Denvate mit einem Molekulargewicht 5000 D als geeignet.
Klibanov et.al 1991 beschrieb die stabilisierende Wirkung von PEG 5000 D in Liposomen, die spezifische Liganden enthalten (sog. Immunoliposomen). Dabei konnte aber festgestellt werden, daß dieses PEG zu einer etwas verschlechterten Bindung des Liganden an den Rezeptor fuhrt. In Torchilin et.al 1992, wird jedoch gezeigt, daß die verlängerte Halbwertszeit der Immunoliposomen durch PEG-coatmg und somit •»eine Verringerung der unspezifischer Aufnahme durch das RES (retikuloendotheliale System) die verschlechterte Ligand-Rezeptor Interaktion mehr als kompensiert. Von Kirpotin et.al., 1997, wird die Anwendung bifunktioneller PEG's, deren Herstellung von Zalipsky et. al., 1997, naher dargestellt wird, für die nachtragliche Kopplung von Liganden an PEG-Liposomen gezeigt.
Ahnliche Ergebnisse wie mit PEG konnten f r Liposomen mit Gangliosiden von Mori et al., 1991), und für Polystyren- und Goldpartikel mit Co-Polymeren aus Polyoxyethylen und Polyoxypropylen (Moghimi et al., 1993) erreicht werden. Um die Aktivierung des Komplementsystems zu verringern, wurden DNA/Polylysinkomplexe ebenfalls mit PEG modifiziert (Plank et al . , 1996). Eine Erhöhung der Spezifitat sogenannter Immunoliposome konnte von Torchilin et al., 1992, gezeigt werden. Dabei zeigten Liposomen, die sowohl Antikörper für ein bestimmtes Gewebe als auch PEG enthalten, eine deutlich bessere Spezifitat als Liposomen ohne PEG.
Versuche von Torchilin et al., 1994, ergaben, daß amphiphile Vinylpolymere die Halbwertszeit von Liposomen in vivo deutlich verlangern können. Torchilin und Papisov, 1994, zeigten, daß für den Schutzeffekt von PEG und die dadurch bewirkte längere Halbwertszeit von Liposomen die Beweglichkeit der Polymerkette verantwortlich sein durfte.
Die bisherigen Versuche zur Verringerung der Interaktion von DNA/Polykationkomplexen mit dem Komplementsystem beschrankten sich auf Polylysin enthaltende Komplexe (Plank et al., 1996). Dabei wurde der Effekt beobachtet, daß durch das Koppeln von PEG an positiv geladene DNA/Polylysin Komplexe eine Verringerung der Komplementaktivierung erreicht werden kann.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein alternatives Gentransfersystem bereitzustellen, das effizient und sehr spezifisch sowie für in vivo Anwendungen geeignet ist.
Die Losung dieser Aufgabe besteht in Komplexen aus Nukleinsäure und Polyethylenimin, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das Polyethylenimin mit einem daran kovalent gekoppelten hydrophilen Polymeren modifiziert ist.
Im folgenden werden die erfindungsgemaßen Komplexe der Einfachheit halber als DNA/PEI/Polymer-Komplexe bezeichnet.
Das Verhältnis von DNA zu PEI wird im folgenden durch die Angabe des molaren Verhältnisses der Stickstoffatome im PEI zu den Phosphatatomen in der DNA angegeben (N/P-Wert) ; ein N/P-Wert von 6.0 entspricht einer Mischung von 10 μg DNA mit 7 , 5 μg PEI. Im Falle von freiem PEI ist unter physiologischen Bedingungen nur etwa jedes sechste Stickstoffatom protoniert. Ergebnisse mit DNA/PEI Komplexen zeigen, daß diese bei einem N/P- Verhaltnis von 2 bis 3 annähernd elektroneutral sind.
Der N/P-Wert der Komplexe kann über einen breiten
Bereich schwanken, er kann im Bereich von etwa 0.5 bis etwa 100 gelegen sein. Bevorzugt betragt das Verhältnis etwa 2 bis etwa 20, besonders bevorzugt betragt das Verhältnis 3 bis 10.
Im einzelnen kann der N/P-Wert für den speziellen Anwendungsfall, z.B. für den zu transfizierenden Zelltyp, durch Vorversuche ermittelt werden, indem unter ansonsten identischen Bedingungen das Verhältnis erhöht wird, um das im Hinblick auf die Transfektionseffizienz optimale Verhältnis festzustellen und einen für die Zellen toxischen Effekt auszuschließen. Das m den Komplexen enthaltene PEI weist ein Molekulargewicht von ca. 700 D bis ca 2000000 D auf. Größere PEI-Molekule ergeben nach Komplexierung mit DNA bereits bei niedrigeren N/P Verhaltnissen ein Optimum der Transfektionefflzienz, sie resultieren im allgemeinen m einer sehr guten Transfektionsefflzienz . Kleinere Moleküle, von denen pro vorgebenener DNA-Menge eine größere Menge zur Komplexierung erforderlich ist, haben, bei geringerer Effizienz, den Vorteil einer geringeren Toxizitat. Welches PEI-Molekul im einzelnen verwendet wird, kann m Vorversuchen ermittelt werden.
Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind PEI-Molekule im Molekulargewichtsbereich zwischen 2000 und 800000.
Beispiele für kommerziell erhältliches PEI mit unterschiedlichen Molekulargewichten, das im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet ist, sind PEI 700 D, PEI 2000 D, PEI 25000 D, PEI 750000 D (Aldrich) , PEI 50000 D (Sigma), PEI 800000 D (Fluka). Von BASF wird PEI unter dem Markennamen Lupasol® ebenfalls m verschiedenen Molekulargewichten angeboten (Lupasol® FG: 800 D; Lupasol® G 20 wasserfrei: 1300 D; Lupasol® WF: 25000 D; Lupasol® G 20: 1300 D; Lupasol® G 35: 2000 D; Lupasol® P: 750000 D; Lupasol® PS: 750000 D; Lupasol® SK: 2000000 D) .
Das hydrophile, an PEI gebundene Polymere ist vorzugsweise linear bzw. in einem nur geringen Ausmaß verzweigt, so daß seine Beweglichkeit weitgehend erhalten bleibt. (Ohne auf diese Theorie festgelegt sein zu wollen, durfte die positive Wirkung des Polymeren, neben seiner Hydrophilie, auf seine Beweglichkeit zurückzuführen sein.)
Beispiele für hydrophile, an PEI gekoppelte Polymere, sind ausgewählt aus der Gruppe Polyethylenglykole (PEG), Polyvmylpyrollidone, Polyacrylamide, Polyvmylalkohole, oder Copolymere dieser Polymere.
Bevorzugt als hydrophiles Polymer ist PEG.
Das Molekulargewicht des hydrophilen Polymeren betragt im allgemeinen etwa 500 bis etwa 20000 D, vorzugsweise werden Moleküle mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 10000 D eingesetzt.
Die Menge an Polymer für die Kopplung an PEI wurde anhand von PEG m Vorversuchen zur vorliegenden Erfindung aus der Analyse der Anzahl primärer Amme im PEI-Molekul mittels Nmhydnn-Assay (Sarin et al, 1981) bestimmt. Dabei konnte festgestellt werden, daß ca. jedes zehnte Stickstoffatom in Form eines primären Ammes vorliegt. Daher wurde als Ausgangspunkt ein Gewichtsverhaltnis von PEG-5000 D-Derivat zu PEI von 9.2 gewählt. Dieses entspricht großenordnungsmaßig einem molaren Verhältnis PEG: primäre Ammogruppen/PEI-Molekul von 1:1.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Experimente sowie Begleitversuche zeigten, daß ein molares Verhältnis Polymer: primäre Ammogruppen/PEI m einem Bereich von 1:10 bis 10:1 für die sterische Stabilisierung von DNA/PEI Komplexen, je nach Anwendungsfall, geeignet ist. Bevorzugt betragt der Bereich 1:5 bis 5:1, besonders bevorzugt 1:3 bis 3:1.
PEI ist gegebenenfalls mit einem zellularen Liganden modifiziert, um die spezifische Aufnahme der Komplexe durch Bindung an Zelloberflachenproteme, insbesondere Rezeptoren, zu bewirken. Beispiele für Liganden sind m der WO 93/07283 angeführt, bevorzugt wird als Ligand Transferrin oder EGF verwendet. Das für einen bestimmten Transfektionsansatz jeweils am besten geeignete Polymermolekul kann, nach Typ, Molekulargewicht und Menge, in Vorversuchen ermittelt werden, ebenso die Zweckmäßigkeit der Modifikation von PEI mit einem zellularen Liganden. Bei derartigen
Vorversuchen wird von einem vorgegebenen DNA/PEI Komplex ausgegangen und das Polymere hinsichtlich Art und Menge variiert, dann wird die Stabilität der Komplexe unter den gewählten Transfektionsbedingungen verglichen. Im Hinblick auf die Notwendigkeit bzw. Auswahl eines
Liganden werden Komplexe, die bis auf das Vorhandensein oder Fehlen eines zellularen Liganden identisch sind, hinsichtlich ihrer Transfektionseffizienz miteinander verglichen.
Der Ligand wird an PEI mittels herkömmlicher Methoden gekoppelt, z.B. auf chemischem Weg, wie in der WO 93/07283 für die Kopplung von Virus, Virusproteinen oder -peptiden mit Polyaminverbindungen beschrieben.
In einer Ausfuhrungsform der Erfindung ist PEI mit dem Liganden über das hydrophile Polymere verbunden. Diese Ausfuhrungsform weist den Vorteil auf, daß hinsichtlich der Polymergroße geringere Einschränkungen auftreten, weil die Zuganglichkeit des Liganden, der sich in dieser Anordnung außerhalb der Polymerschicht befindet, und dessen Bindung an den Rezeptor nicht durch das Polymere blockiert wird.
Die in den erfindungsgemaßen Komplexen enthaltene Nukleinsaure wird vor allem durch den in der Zelle zu erzielenden biologischen Effekt definiert, im Falle der Anwendung im Rahmen der Gentherapie durch das zur
Expression zu bringende Gen bzw. den Genabschnitt, z.B. zwecks Substitution eines defekten Gens, oder durch die Zielsequenz eines zu inhibierenden Gens. Bei den in die Zelle zu transportierenden Nukleinsäuren kann es sich um DNAs oder RNAs handeln, wobei hinsichtlich der Nukleotidsequenz keine Beschrankungen bestehen.
Die erfindungsgemaßen Komplexe haben den Vorteil, daß sie in geringer Größe herstellbar sind, wobei dieser Effekt durch einen gegebenenfalls an PEI gekoppelten Liganden nicht beeinträchtigt wird.
Die Modifikation mit PEG kann auch an größeren Komplexen durchgeführt werden, ohne dabei ihre Funktionalitat zu beeinträchtigen.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt ein
Verfahren zur Herstellung der DNA/PEI-Polymer-Komplexe .
Die Herstellung von DNA/PEI/Polymer-Komplexen kann auf unterschiedliche Art und Weise erfolgen.
Bevorzugt werden zuerst DNA und PEI durch Mischen der Losungen komplexiert und anschließend, z.B. nach einer Reifungszeit von etwa 20-40 Minuten, kann die Reaktion mit dem Polymeren (im Fall der Reaktion mit PEG die "PEGylierung" ) erfolgen, wie sie in den Beispielen der vorliegenden Erfindung durchgef hrt wurde. Im Zuge der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß Komplexierung bei hohen Konzentrationen der Komplexpartner einen deutlich höheren Anteil an aggregierten Komplexen liefert (siehe Beispiel 3c). Es wurde festgestellt, daß diese in vielen Fällen unerwünschte Aggregation durch Mischen der Komplexe aus sehr verdünnten Losungen weitgehend hintangehalten werden kann. Die Verringerung der Salzkonzentration unter den physiologischen Wert verringert den Effekt der Aggregatbildung (Beispiel 1). Die Verwendung von entionisiertem Wasser anstatt physiologischer
Salzkonzentration kann die Aggregation verhindern (Beispiel 1). Es hat sich gezeigt, daß physiologische Glukosekonzentrationen keinen Einfluß auf die Aggregatbildung haben (s. Fig. 1) . Es zeigte sich, daß eine Erhöhung der Salzkonzentration auf einen Wert im physiologischen Bereich im Anschluß an die Komplexierung sich nicht negativ auf die Stabilität der Komplexe auswirkt, während Komplexe ohne PEG rasch Aggregate bildeten (Fig. 2a) . Es zeigte sich ferner, daß die PEGylierung der Komplexe auch zu einer verringerten Oberflächenladung der Komplexe führt (Fig.14).
In einer alternativen, bevorzugten Methode wird daher die Komplexierung bei niedrigen Konzentrationen der
Komplexpartner, vorzugsweise bei ca. 5 bis 50 μg DNA/ml, insbesondere 10 bis 40 μg DNA/ml, durchgeführt. Die PEI- Konzentration wird, entsprechend dem jeweiligen N/P-Wert, auf die DNA-Konzentration abgestimmt; sie beträgt z.B. 1,25 μg/ml PEI 800000 D bei einem N/P-Wert von 2 und einer DNA-Konzentration von 5 μg/ml; bei einer DNA-Konzentration von 50 μg/ml entsprechend 12,5 μg/ml PEI 800000 D. Die Komplexierung wird außerdem bei möglichst niedriger Ionenkonzentration durchgeführt, um ein Auftreten von Aggregaten bereits bei der
Komplexierung oder unmittelbar anschließend daran zu verhindern. Gegebenenfalls wird, im Hinblick auf die weitere direkte Verwendung der Komplexe in vivo, die Komplexierung in Gegenwart physiologischer Zuckerkonzentration (Dextrose, Glukose, Saccharose) durchgeführt .
Die Verhinderung der Aggregation der Komplexe ist vermutlich durch die Ausbildung einer dickeren Hydratationshülle bewirkt, die das Zusammenklumpen der Komplexe verhindert.
In einer alternativen Methode werden Komplexe aus verdünnten Lösungen erhalten, wobei PEI eingesetzt wird, das bereits mit dem Polymeren, z.B. PEG, kovalent gekoppelt ist (Beispiel 2b) . Auch hier zeigte sich der stabilisierende Effekt von PEG, welches das Aggregieren der Komplexe auch nach Salzzugabe verhindert.
Die kovalente Kopplung des Polymeren an PEI kann mittels herkömmlicher Methoden durchgeführt werden, wobei Polymer-Derivate verwendet werden, die an die freien Aminogruppen von PEI binden können. Unterschiedliche Derivate sind kommerziell erhaltlich, z.B. die entsprechenden PEG-Derivate (Shearwater Polymers, USA) :
N-Hydroxysuccinimidylaktivester (Abuchowski et al, 1984; Klibanov et al, 1990 zeigten die Verwendbarkeit der entsprechenden PEG-Derivate für die Modifizierung von Liposomen) ; Beispiele für kommerziell erhaltliche PEG- Derivate dieses Typs sind Methoxy-SS-PEG, MW 5000 D; Methoxy-SSA-PEG, MW 5000 D) ; Succinimidylsuccinat- Proprionsaure-Derivate (Methoxy-SPA-5000, MW 5000 D; Methoxy-SPA-20000, MW 20000 D; Methoxy-SSPA-PEG, MW 5000); Oxycarbonylimidazol-Derivate, die unter Urethanbildung reagieren (die Bindung von PEG-Derivaten dieses Typs an Proteine wurde von Beauchamp et al, 1983, gezeigt, die Verwendung zur PEGylierung von Liposomen von Allen et al, 1991; Beispiele für Handelsprodukte sind Methoxy-PEG-CDI, MW 5000 D) ; Glycidylether (Pita et al, 1970; Elling et al, 1991); Tresylate (die Bindung von PEG-Tresylaten an Proteine und Liposomen wurde beschrieben von Nilsson et al, 1984; Yoshinaga et al, 1989; Delgado et al, 1990; Dust et al, 1990; Senior et al., 1991; Klibanov et al, 1991; Beispiele für kommerziell erhaltliche PEG-Tresylate sind Methoxy-PEG- Tres, MW 5000; Methoxy-PEG-Tres, MW 200); Aldehyde, deren Bindung mit Natriumcyanborhydrid an Aminogruppen erfolgt (Wirth et al, 1991; Handelsprodukte sind Methoxy-PEG-ald, MW 5000; M-ALD-PEG-200 : Methoxy-PEG- ald, MW 2000) . Im Falle der Gegenwart eines zellularen Liganden in den Komplexen wird bei der Herstellung wie folgt vorgegangen:
In einer Ausfuhrungsform wird das PEI an den Liganden gekoppelt, wie in der EP-AI 388 758 bzw. von Kircheis et al., 1997, beschrieben, im Anschluß daran wird die Komplexierung mit den übrigen Reaktionspartnern vorgenommen, wie oben beschrieben.
Um Komplexe herzustellen, in denen die Bindung des Liganden an PEI über das Polymere erfolgt, werden bifunktionelle Polymere verwendet, die an beiden Molekulenden unterschiedliche reaktive Gruppen aufweisen. Dazu können Polymere, z.B. PEG, verwendet werden, wie sie bisher für die Kreuzvernetzung unterschiedlicher Makromoleküle verwendet wurden, z.B. für die Vernetzung von Cofaktor und Apoenzym (Nakamura et al, 1986) , Zielsteuerung polymerer Wirkstoffe (Zalipsky und Barany, 1990) oder PEG-Beschichtung von Oberflachen und Proteinen (Harris et al, 1989) . Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung u.a. verwendbaren bifunktionellen Derivate sind kommerziell erhaltlich, sie enthalten Aminogruppen, Hydroxygruppen oder Carbonsauregruppen an den Molekulenden, z.B. wie von Shearwater Polymers erhältliche Produkte. Ebenfalls verwendbare Derivate sind NHS-Maleinimid- und NHS- Vinylsulfonderivate, die ihre Reaktionsoptima bei unterschiedlichen pH-Werten haben. Auch Biotin-PEG- Maleinimid oder -NHS Derivate können verwendet werden, wobei an die MAL bzw. NHS Gruppe eine kovalente Kopplung erfolgen kann und die biotinylierte Seite mit
Streptavidin enthaltenden Molekülen oder Partikel reagieren kann.
Bei Verwendung bifunktioneller Polymere ergeben sich für die Bildung von DNA/PEI/Ligand/Polymer-Komplexen mehrere Möglichkeiten: Dabei kann die Kopplung von bifunktionellem Polymer, z.B. PEG, an PEI erfolgen und ein Ligand mit passender funktioneller Gruppe an die zweite, freigebliebene funktioneile Gruppe am Polymer, wahlweise vor oder nach Komplexierung mit DNA, gekoppelt werden. Die Bindung PEG-PEI kann über die primären Amme des PEI erfolgen, wobei jedoch auch die vorhergehende Kopplung anderer reaktiver Gruppen, wie SH-Gruppen, an PEI möglich ist, die als Reaktionspartner für PEG-Derivate fungieren können. Auch ist die vorhergehende Kopplung von Liganden an bifunktionelles PEG möglich, wobei die weitere Bindung an PEI vor oder nach Komplexierung mit DNA möglich ist. In all diesen Fallen ergeben sich dabei, besonders bei der Verwendung kleiner Liganden, Vorteile, die bei einer eventuellen nachtraglichen PEGylierung durch das PEG abgeschirmt werden können.
Durch die Verwendung bifunktioneller PEG Derivate funktioniert das lineare, hydrophile Polymer-Molekül gewissermaßen als Abstandhalter zwischen PEI und Ligand.
Für bestimmte m vivo Anwendungen ist es im Hinblick auf eine hohe Gentransfereffizienz erforderlich, daß die erfindungsgemaßen Komplexe in hoher Konzentration, zweckmäßig m einer Konzentration von mindestens ca. 200 μg DNA/ml, vorliegen. Die Komplexkonzentration kann, bei höherem Gehalt an hydrophilem Polymer, bis zu ca. 1 mg/ml betragen.
Die erfindungsgemaßen Komplexe weisen uberrascherweise den Vorteil auf, daß sie aus verdünnten Losungen auf die erforderliche hohe Konzentration gebracht werden können, ohne daß eine nennenswerte Aggregatbildung, die die Gentransfereffizienz beeinträchtigen wurde, auftritt. Es konnte auch gezeigt werden, daß die Modifikation der Komplexe mit PEG zu einer erhöhten Beständigkeit der Komplexe im Blut von Mausen fuhrt. Dieser Effekt tragt auch dazu bei, daß nach z.B. intravenöser Applikation der Komplexe ein Gentransfer im subkutanen Tumor erzielt wird.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt eine Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen, die DNA/PEI/PEG Komplexe in einer Konzentration, bezogen auf DNA, von etwa 200 μg/ml bis etwa 1 mg/ml enthält.
Insbesondere liegt die Zusammensetzung in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung vor. In dieser Ausgestaltung dient die Zusammensetzung zur Transfektion von Saugetierzellen in vivo; sie enthalt als aktiven Bestandteil einen Komplex, der eine therapeutisch wirksame Nukleinsaure enthalt. Mit Hilfe der erfindungsgemaßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann, bei lokaler Anwendung, eine hohe Konzentration an therapeutisch wirksamer DNA im Gewebe erzielt werden. Bei der systemischen Anwendung hat die Zusammensetzung den Vorteil, daß die Komplexe wegen der Verhinderung der Opsonierung weder unspezifischer Bindung noch Abbau unterliegen .
Durch Verhinderung bzw. Verringerung von unspezifischen Bindungen und durch das Einbringen von ( zelltypspezifischen) zellbindenden Liganden in die
Komplexe kann ein spezifisches Targeting zu bestimmten Zellen, Organen oder Geweben (z.B. Tumorgewebe) und damit eine zielgerichtete Genexpression (z.B. im Tumorgewebe) nach systemischer Verabreichung erzielt werden (Beispiel 12).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, daß die erfindungsgemaßen, durch PEGylierung stabilisierten Komplexe aufgrund ihrer längeren Zirkulationszeit im Blut die Möglichkeit haben, in Bereichen mit erhöhter Gefaßpermeabilitat bzw. Gefaßschadigungen aus dem Blutgefaßsystem m die umliegenden Gewebe auszutreten und dort zu akkumulieren. Bereiche, wo em solches „passives Targeting" verstärkt auftritt, sind gut durchblutete Tumore sowie Entzundungsbereiche .
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann u.a. vorteilhaft für die Therapie von Tumorerkrankungen verwendet werden, um mtratumoral DNA zu verabreichen, enthaltend, insbesondere auf einem Plasmid, eine Sequenz, kodierend für em oder mehrere Zytokme, wie Interleukm-2, IFN-α, IFn-γ, TNF-α, oder em Selbstmordgen, das in Kombination mit dem Substrat zur Anwendung kommt, wie das Herpes Simplex Thymidmkmase- Gen (mit Ganciclovir) oder das Lmamarase-Gen (mit Linamarin) , oder eine DNA, kodierend für e apoptosemduzierendes Protein, wie p53 oder Apoptm, oder für em Toxm, wie das Diphterietoxm, oder für em zytotoxisch wirkendes Enzym.
Eine weitere Anwendung, bei der die Vorteile der erfindungsgemaßen Zusammensetung zum Tragen kommen, ist die sog. genetische Tumorvakzmierung . Die dabei zur Anwendung kommenden Komplexe enthalten DNA, kodierend für em oder mehrere Tumorantigene oder Fragmente davon, gegebenenfalls in Kombination mit DNA, kodierend für em oder mehrere Zytokme.
Die erf dungsgemaße pharmazeutische Zusammensetzung liegt bevorzugt als Lyophilisat vor, gegebenfalls unter Zusatz von Zucker, wie Saccharose oder Dextrose, einer Menge, die m der gebrauchsfertigen Losung eine physiologische Konzentration ergibt. Die Zusammensetzung kann auch in Form eines Kryokonzentrats vorliegen.
Die erfmdungsgemaße Zusammensetzung kann auch tiefgefroren (kryokonserviert ) oder als gekühlte Losung vorliegen. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung em Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Transfektion von Saugetierzellen, bei dem zunächst Komplexe aus verdünnten Losungen der Komplexpartner hergestellt und anschließend auf eine Konzentration von mindestens 200 μg/ml gebracht werden.
Das Aufkonzentrieren der Komplexe kann mittels herkommlicner Methoden, z.B. durch Ultraflltration oder durch Ultrazentπfugation, vorgenommen werden.
Die erfindungsgemaßen Zusammensetzungen können gegebenenfalls m Form eines Kits vorliegen, wobei die Einzelkomponenten DNA einerseits und Polymer- modiflziertes PEI, an das gegebenenfalls em Ligand gekoppelt ist, andererseits, in getrennten Behaltern vorliegen.
Figurenubersieht
Fig. 1: Unterdrucken der Aggregatbildung von DNA/PEI- Komplexen durch Mischen unter salzfreien
Bedingungen
Fig. 2: Stabilisieren von DNA/PEI-Komplexen mit Polyethylenglykol (PEG)
a) Kovalente Kopplung von PEG nach der
Komplexierung der DNA mit PEI b) Kovalente Kopplung von PEG an PEI vor der Komplexbildung mit DNA c) Abhängigkeit der Partikelgroße von der Konzentration an DNA und PEI bei der
Komplexbildung Fig. 3: Für die Stabilisierung der Komplexe ist die kovalente Bindung von PEG entscheidend
Fig. 4: Konzentrierung von PEG-stabilisierten DNA/PEI Komplexen
Fig. 5: Interaktion von DNA/PEI Komplexen mit humanem Plasma (Immunoblot)
Fig. 6: Verringerung der Proteinbindung an DNA/PEI Komplexe durch Modifizierung mit PEG A) Silberfarbung B) Überprüfung der Filtrierbarkeit
Fig. 7: Effekt der PEG-Modifizierung auf den Gentransfer in K562-Zellen
Fig. 8: Effekt der PEG-Modifizierung auf den
Gentransfer in murine Neuroblastomzellen
Fig. 9: Verringerung der unspezifischen Aufnahme der Komplexe durch P388 Mausmakrophagen durch Modifizieren der Komplexe mit PEG
Fig. 10: Verringerung der Wechselwirkung mit
Plasmaproteinen durch Modifizieren von DNA/Tf-PEI Komplexen mit PEG
Fig. 11: PEGylierung von DNA/TfPEI-Komplexen erhöht die Beständigkeit der Komplexe im Blut nach der in vivo Anwendung
Fig. 12: Bestimmung der Bioverteilung von PEGylierten DNA/TfPEI-Komplexen nach systemischer
Verabreichung mittels Southern-Blot
A) intaktes plus teilweise abgebautes Reportergen-Plasmid
B) intaktes Reportergen-Plasmid Fig. 13: Zielgerichtete Genexpression im Tumorgewebe nach systemischer Verabreichung von PEGylierten DNA/TfPEI-Komplexen
Fig. 14: Messung des Zeta-Potentials : verringerte Oberflachenladung von PEGylierten
DNA/TfPEI-und DNA/PEI-Komplexen
Fig. 15: Effekt der PEG-Modifizierung kleiner und großer Komplexe auf den Gentransfer in Säugerzellen
Fig. 16: Effekt der PEG-Modifizierung auf den EGF- vermittelten Gentransfer Säugerzellen
Beispiel 1: Unterdrucken der Aggregatbildung von DNA/PEI-Komplexen durch Mischen unter salzfreien Bedingungen
Die Bildung der Komplexe erfolgte durch Mischen von gleichen Volumina (250 μl) verdünnter Losungen von Plasmid-DNA, enthaltend die für das Reportergen Luciferase kodierende Sequenz (lOμg des Plasmids pCMVL, beschrieben in der WO 93/07283) und 7,5 μg PEI (N/P- Wert: 6.0) bzw. 9 μg PEI (N/P-Wert 7,2) durch rasches, mehrfaches Auf- und Abpipettieren der Losungen, um eine möglichst schnelle Mischung der beiden Komponenten zu erreichen. Es wurde PEI mit einem Molekulargewicht von 800000 Dalton verwendet (Fluka) . Die Endkonzentration an DNA im Komplex betrug 20 μg/ml. Für Transferrin (Tf) enthaltende Komplexe wurden Konjugate mit kovalent an PEI gebundenem Tf verwendet, deren Herstellung von Kircheis et al., 1997, beschrieben wurde. Es wurden zwei verschiedene Konjugate verwendet: Tf2PEI (molares Verhältnis von Tf/PEI 2/1) und Tf4PEI (molares Verhältnis von Tf/PEI 4/1). Der Vergleich der Komplexmischung in HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,3); m entionisiertem Wasser (MQ) allem und in MQ mit 5 % Glukose ist in Fig. 1 dargestellt. Die mittlere Partikelgroße wurde nach verschiedenen Zeiten mittels quasielastischer Laserlichtstreuung (Brookhaven BI-90) gemessen. Es zeigte sich, daß Komplexe in HBS schon nach kurzer Zeit aggregierten, wahrend Komplexe, die in entionisiertem Wasser hergestellt wurden, eine stabile Große aufwiesen, die durch eine physiologische Glukosekonzentration nicht wesentlich beeinträchtigt wurde .
Beispiel 2: Stabilisieren von DNA/PEI-Komplexen mit Polyethylenglykol (PEG)
a) Kovalente Kopplung von PEG nach der Komplexierung der
Figure imgf000021_0001
Die DNA/PEI-Komplexe mit einem N/P Verhältnis von 6.0 wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, gemischt und zur vollständigen Komplexierung 40 mm bei Raumtemperatur (RT) gelagert. Anschließend wurden 69 μg Methoxy- succmimidyl-proprionat-PEG (M-SPA-PEG, Molekulargewicht von 5000 Dalton, Shearwater Polymers, Inc., USA, Stammlosung 10 mg/ml in DMSO) m 50μl MQ Wasser zugesetzt. (Dabei entsteht zwischen M-SPA-PEG und den Aminogruppen des PEI eine kovalente Bindung.) Die Reaktionsdauer betrug 20 mm bei RT; das Gewichtsverhaltnis (w/w) von PEG zu PEI betrug 9,2.
Die Komplexgroße wurde nach verschiedenen Zeiten mittels quasielastischer Laserlichtstreuung gemessen. Um die erfolgreiche Stabilisierung der Komplexe zu zeigen, wurden der Komplexlosung em 250μl Aliquot PBS (137 mM NaCl, 2,6 mM KC1, 6, 6 mM Na2HP04, 1,5 mM KH2PO4; pH 7,4) zugesetzt. Durch diese Erhöhung der Salzkonzentration wurde die Aggregation von sterisch nicht stabilen Komplexen hervorgerufen, wahrend die PEG-modifizierten Komplexe keine Großenveranderung zeigten (Fig. 2a).
b) Kovalente Kopplung von PEG an PEI vor der Komplexbildung mit DNA
Die PEGylierung von PEI vor der Komplexierung ("pre- PEGylierung" ) wurde wie folgt durchgeführt: 7,5 μg PEI wurden mit 6,9 μl M-SPA-PEG 10 mg/ml in DMSO gemischt und die Reaktion nach 20 min bei RT durch Zugabe von 0,2 μMol Glycin abgestoppt. (Dabei reagiert das noch vorhandene freie M-SPA-PEG mit der Aminogruppe des Glycin.) Nach weiteren 20 min wurde die Losung mit MQ auf 250 μl aufgefüllt und, wie in Beispiel 2a beschrieben, mit 10 μg DNA komplexiert. Die weitere Vorgangsweise erfolgte ebenfalls wie in Beispiel 2a beschrieben.
Die verwendeten Komplexe wiesen einen N/P-Wert von 6,0 auf, das Verhältnis von PEG/PEI betrug 9,2 (w/w) .
Die nachtragliche PEGylierung ( "post-PEGylierung" ) der Komplexe erfolgte wie in Beispiel 2a beschrieben. Die Ergebnisse zeigen, daß auch mit vorhergehender PEGylierung von PEI sterisch stabile Komplexe gebildet werden können, der durchschnittliche Durchmesser der Partikel ist aber etwas großer als bei nachtraglicher PEGylierung (Fig. 2b) .
c) Abhängigkeit der Partikelgroße von der Konzentration und DNA und PEI bei der Komplexbildung
Die Komplexe wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, in MQ gemischt, mit PEG modifiziert und der mittlere Partikeldurchmesser mittels LLS gemessen. Die DNA- Konzentration bei der Komplexbildung betrug 20 bzw. 320 μg/ml. Die Großenmessung erfolgte nach der PEGylierung. Es zeigte sich deutlich, daß durch Mischen in höheren Konzentrationen mehr Aggregate enstehen (Fig. 2c) .
Beispiel 3: Für die Stabilisierung der Komplexe ist die kovalente Bindung von PEG entscheidend
In diesem Experiment wurde em Gewichtsverhaltnis von PEG zu PEI von 9,2 gewählt. Es wurde einerseits, wie m den vorigen Beispielen, Methoxy-succmimidyl-propπonat- PEG (M-SPA-PEG 5000) verwendet, andererseits PEG unterschiedlichen Molekulargewichtes ohne reaktive Gruppen (6000 D: Merck, No. 807491; 4000 d: Loba Feinchemie, No. 81252; 1500 d: Merck, No. 807489) mit mittleren Molekulargewichten von 6000, 4000 und 1500 Dalton verwendet. Die Komplexgroße wurde nach verschiedenen Zeiten mittels quasielastischer Laser Lichtstreuung gemessen. Nach PEGylierung wurde der Komplexlosung em 250 μl Aliquot PBS zugesetzt. Fig. 3 zeigt, daß nur kovalente Bindung von PEG an den Komplex die Aggregierung der Komplexe nach Salzzugabe verhindert .
Beispiel 4: Konzentrierung von PEG-stabilisierten DNA/PEI Komplexen
Die Komplexe wurden, wie m Beispiel 1 beschrieben, gemischt und, wie m Beispiel 2 beschrieben, mit M-SPA- PEG stabilisiert. Nach der Stabilisierung und Zugabe von 250 μl PBS wurde die Komplexlosung (ca. 800 μl) in Mikrokonzentratoren (Vivaspm 500, molekulares Ausschlußvolumen 100000 Dalton) mit 12000 g bis auf em Volumen von ca 25 μl und somit eine DNA Konzentration von ca 400 μg/ml DNA konzentriert. Anschließend wurde mit MQ wieder eine Konzentration von 20 μg/ml eingestellt und die Große mittels quasielastischer Laser Lichtstreuung gemessen. Fig. 4 zeigt, daß ohne PEG- Modifizierung nach dem Konzentrieren aufgrund Aggregation und/oder Absorption der Komplexe an die Membran keine sinnvollen Partikelgroßen mehr gemessen werden konnten, wahrend die stabilisierten Komplexe auch nach Konzentrierung keine Aggregatbildung aufwiesen.
Beispiel 5: Interaktion von DNA/PEI Komplexen mit humanem Plasma
Dieses Experiment diente dazu, die Interaktion von Plasmaproteinen mit den PEI-Komplexen zu bestimmen, wobei die an die Komplexe gebundenen Proteine zusammen mit diesen abgetrennt wurden.
Es wurde humanes Citratplasma (Sigma) verwendet. In diesem Experiment wurden die Komplexe in folgender Weise gemischt: 12,8 μg DNA in 20 μl MQ wurden mit 9,6 μg PEI m ebenfalls 20 μl MQ gemischt und wie m Beispiel 2 beschrieben modifiziert. Anschließend wurden die
Komplexe mit einem Aliquot verdünntem Plasma 30 mm bei 37 °C mkubiert.
a) Identifizierung der an DNA/PEI Komplexe bindenden Plasma-Proteine
In diesem Experiment wurden 40 μl Komplex mit einer DNA- Konzentration von 320 μg/ml mit 140 μl 1:70 verdünntem Plasma 30 mm bei 37 °C mkubiert. Die Komplex/Plasma Losung wurde auf Mikroflltrationsemheiten mit einer Filter-Porengroße von 0,2 μm (Whatman, England, Anopore membrane) aufgetragen. Die Membran wurde vorher mit einer BSA Losung (1 mg/ml) abgesattigt und dreimal mit HBS (20 mM HEPES pH 7.3, 145 mM NaCl) gewaschen, um unspezifische Proteinbindung zu reduzieren. Die aufgetragene Losung wurde bei 12000 g filtriert und dreimal mit HBS gewaschen. Das am Filter zurückgebliebene Material (Komplexe plus Plasmaproteine) wurde mit HBS + 5% SDS eluiert ("Eluat") und wie das
Filtrat der Komplex/Plasmalosung ("Filtrat") nach Zugabe von einem Aliquot fünffach konzentrierten nichtreduzierendem Probenpuffer (25 % Glyzerin (w/v) ; 290 mM TRIS pH 6,8; 0,25 % SDS (w/v); 0,1 mg/ml Bromphenolblau) auf einem SDS-Polyacrylamidgel mit einem Polymergradienten von 2,5 bis 12 % aufgetrennt.
Für die immunologische Identifizierung der Proteine wurde das Gel m einer "semi dry" Blot-Apparatur (Bio Rad) auf eine Nitrozellulosemembran geblottet, unspezifische Bindungsstellen mit einer l%igen
Milchpulverlosung abgesattigt und mit den entsprechenden Antikörpern inkubiert. Die Antikörper wurden in TBST (150 mM NaCl; 10 mM TRIS pH 8,0; 0,1 % TWEEN 20) verdünnt .
1. Antikörper:
Ziege anti-human Complement C3 (fraktioniertes Antiserum, Sigma, Best. No. C-7761, Lot Number 054H8842), Verdünnung 1:3000.
Ziege anti-human Fibrinogen (fraktioniertes Antiserum, Sigma, Best. No. F-2506, Lot Number 115H8828), Verdünnung 1:3000. Ziege anti-human Fibronectin (fraktioniertes Antiserum, Sigma, Best. No. F-1909, Lot Number 094H8868), Verdünnung 1:3000.
2. Antikörper:
Maus anti-Ziege IgG, HRP konjugiert (polyklonal, Jackson Laboratories, Best. No . 205-035-108, Lot Number 33740) , Verdünnung 1:25000 Nach Inkubation mit dem zweiten Antikörper wurde die Nitrozellulosemembran mehrfach mit TBST gewaschen und anschließend in Luminol/Enhancer Losung (Pharmacia, No. 1856135) und Stabiler Peroxid Losung (Pharmacia, No. 1856136) 1/1 (v/v) 10 min bei RT inkubiert, mehrfach mit TBST gewaschen und ein Film auf dem Blot exponiert.
Der Immunoblot ist in Fig. 5 dargestellt. Es zeigte sich, daß Komplement C3, Fibrinogen, und Fibronectin an die DNA/PEI Komplexe im Eluat binden; ein Effekt, der nach PEGylierung (die Komplexe wurden, wie in
Beispiel 2, PEGyliert) deutlich verringert wird (s. Spuren 4 und 5) . Die Kontrollen (Spuren 6 und 7) dienten dazu festzustellen, in welchem Ausmaß diese Proteine ohne Anwesenheit von Komplex an die Filtermembran binden. Bei der Plasmaprobe ohne DNA-Komplexe findet sich das Protein erwartungsgemäß hauptsachlich im Filtrat, im Eluat konnten keine nennenswerte Mengen der Proteine gefunden werden (Spur 1: Humanplasma, 3 μl, 1:50 verdünnt; Spur 2: DNA/PEI + Plasma, Filtrat, 6 μl; Spur 3: DNA/PEI + Plasma, Eluat, 20 μl; Spur 4: 150 μl Plasma, 1:70 verdünnt, Filtrat, 6 μl; Spur 5: 150 μl Plasma, 1:70 verdünnt, Eluat, 20 μl).
b) Verringerung der Proteinbindung an DNA/PEI Komplexe durch Modifizierung mit M-SPA-PEG
Es wurden Komplexe wie in a) beschrieben gemischt und wie in Beispiel 2 beschrieben mit M-SPA-PEG modifiziert. Die Inkubation mit Plasma, Filtration, Eluierung und elektrophoretische Auftrennung erfolgte wie in Beispiel 5a beschrieben. Zum semiquantitativen Nachweis wurden die aufgetrennten Proteine mit Silberfarbung (geingfugig modifizierte Methode nach Bloom et al., 1987) angefärbt.
Wie aus Fig. 6a ersichtlich, binden an PEG-modifizierte Komplexe (Spur 5, Eluat) deutlich weniger (nicht sichtbare) Proteinmengen als an unmodifizierte Komplexe (Spur 3) . Spur 1: Humanplasma, 3 μl, 1:50 verdünnt; Spur 2: DNA/PEI + Plasma, Filtrat, 6 μl; Spur 3: DNA/PEI + Plasma, Eluat, 20 μl; Spur 4: DNA/PEI-PEG PEG/PEI 9,2/1 (w/w)+ Plasma, Filtrat, 6 μl; Spur 5: DNA/PEI-PEG PEG/PEI 9,2/1 (w/w) + Plasma, Eluat, 20 μl; Spur 6: 150 μl Plasma, 1:70 verdünnt, Filtrat, 6 μl; Spur 7: 150 μl Plasma, 1:70 verdünnt, Eluat, 20 μl.
c) Überprüfung der Filtrierbarkeit von DNA/PEI Komplexen:
Um sicherzugehen, daß nach der Filtration ein Großteil der Komplexe auf der Membran zurückgehalten wird, wurden Komplexe (DNA-Konzentration von 320 μg/ml), wie in Beispiel 5a beschrieben, gemischt und PEGyliert. Anschließend wurden die Komplexe durch eine mit BSA abgesattigte Membran filtriert und 3 mal mit je 300 μl HBS gewaschen. Die Absorption der Losung (A260; (Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren) vor der Filtration (A260 vor Filtration), des Filtrates (A260 Filtrat) und der drei Waschlosungen (Wasch 1 bis Wasch 3) wurde gemessen. Fig. 6b zeigt, daß unmodifizierte Komplexe vollständig und PEGylierte Komplexe zum Großteil zurückgehalten werden.
Beispiel 6: Effekt der PEG-Modifizierung auf den
Gentransfer in Saugerzellen
a) Transfektion der humanen Zellinie K562 mit PEG- modifizierten DNA/ (Tf) PEI-Komplexen
Die Komplexe wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, gemischt und wie in Beispiel 2 beschrieben mit M-SPA-PEG modifiziert. Die DNA-Konzentration bei der Komplexbildung betrug 20 μg/ml, das Verhältnis von DNA zu PEI betrug N/P 7,2. Es wurden PEI bzw. Tf-PEI Konjugate zur DNA-Komplexierung verwendet, das molare Verhältnis von Tf zu PEI im Konjugat betrug 2/1 (Tf2PEI) . Das Verhältnis von PEG/PEI betrug 2,3/1 bzw. 3,7/1 und 7,4/1 (w/w) ; das entspricht einem molaren Verhältnis von 0.25:1, 0.4:1 bzw 0.8:1.
Die Kultivierung der Zellen (ATCC CCL-243 K-562) erfolgte in RPMI 1640 Medium mit 100 lU/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycm und 10 % fötalem Kalberserum (FCS) . Pro Transfektionsansatz wurden 500000 Zellen in 24-well Platten (Durchmesser 22,6 mm, Costar) ausgesät. Die Transfektion erfolgte in serumfreiem Medium. Nach vier Stunden wurde das Medium durch serumhaltiges Medium ersetzt. 24 Stunden nach Transfektionsbegmn wurden die Zellen abzentrifugiert , m 100 μl Erntepuffer geerntet (250 mM TRIS, pH 7.2, 0,5 % Triton X 100), homogenisiert, zentrifugiert und je 10 μl aus dem Überstand für die Luciferaseaktivitatsbestimmung m 100 μl Probenpuffer (25 mM Glycylglycm pH 7.8 , 5 mM ATP, 15 mM MgC12) verdünnt. Die Messung erfolgte nach
Injektion von 100 μl Injektionspuffer (200 μM Luziferm (Sigma), 20 mM 25 mM Glycylglycm pH 7.8) m eine Berthold Lumat LB 9507, die Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt .
b) Transfektion einer murinen Neuroblastom-Zellmie mit PEG-modifizierten DNA/ (Tf) PEI Komplexen
Die Komplexe wurden, wie m Beispiel 1 beschrieben, gemischt und, wie m Beispiel 2 beschrieben, mit M-SPA-PEG modifiziert.
Die DNA-Konzentration bei der Komplexbildung betrug
20 μg/ml, das Verhältnis von DNA zu PEI betrug N/P 7,2. Das Verhältnis von PEG/PEI betrug 3,5/1 bzw. 7,0/1 (w/w) ; das entspricht einem molaren Verhältnis von 0.38:1 bzw. 0.76:1. Es wurden PEI bzw. Tf-PEI Konjugate zur DNA- Komplexierung verwendet, das molare Verhältnis von Tf zu PEI im Konjugat betrug 2/1 (Tf2PEI) .
Die Kultivierung der Zellen (ATCC CCL 131 Neuro 2A) erfolgte in RPMI 1640 Medium mit 100 iU/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 10 % fötalem Kalberserum (FCS) . Pro Transfektionsansatz wurden 300000 Zellen in 6-well Platten (Durchmesser 35 mm, Costar) ausgesät. Die Transfektion erfolgte in serumfreiem Medium. Nach vier Stunden wurde das Medium durch serumhaltiges Medium gewechselt. 24 Stunden nach Transfektionsbeginn wurden die Zellen in 100 μl Erntepuffer geerntet (250 mM TRIS, pH 7.2, 0,5 % Triton X 100), homogenisiert, zentrifugiert und je 10 μl aus dem Überstand für die Luciferaseaktivitatsbestimmung in 100 μl Probenpuffer (25 mM Glycylglycm pH 7.8, 5 mM ATP, 15 mM MgC12) verdünnt. Die Messung erfolgte nach Injektion von 100 μl Injektionspuffer (200 μM Luziferm (Sigma) , 20 mM 25 mM Glycylglycm pH 7.8 ) in eine Berthold Lumat LB 9507.
Fig.7 und 8 zeigen, daß Modifizieren von DNA/PEI und
DNA/TfPEI Komplexen den unspezifischen Gentransfer (über PEI vermittelt) stark reduziert , wahrend der rezeptorvermittelte spezifische Gentransfer (über TfPEI vermittelt) nicht (Fig. 7) bzw. in Abhängigkeit vom Zelltyp nur geringfügig (Fig. 8) beeinträchtigt wird.
Beispiel 7: Verringerung der unspezifischen Aufnahme der Komplexe durch P388 Mausmakrophagen durch Modifizieren der Komplexe mit PEG
Die Aufnahme der Komplexe durch die Zellen wurde mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsorter (FACS) durchgeführt (FACScan, Becton Dickinson) . Die Anregungswellenlänge des Lasers betrug 488 nm. Die Fluoreszenz wurde bei 515 nm gemessen.
Die DNA-Konzentration bei der Komplexbildung betrug 320 μg/ml, der N/P-Wert 6,0. Das Verhältnis von PEG/PEI betrug 9,2:1; das entspricht einem molaren Verhältnis von 01:1.
Die Komplexe wurden, wie in Beispiel 5a beschrieben, gemischt und, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit M-SPA-PEG modifiziert. Die DNA wurde vor der Komplexierung mit YOYOl (1, 1 ' - (4 , 4 , 7 , 7 , -tetramethyl-4 , 1 - diazaundecamethylen) -bis-4- [3-methyl-2, 3-dihydro- (benzo- 1, 3-oxazol) -2-methyliden] -quinolinium tetraiodid; Molecular Probes) in einem molaren Verhältnis von 100:1 (Basenpaare DNA: YOYOl) markiert. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in DMEM (Dulbeccos modified eagle medium) mit 4500 mg/ml Glucose, 100 iU/ml Penizillin, 100 μg/ml Streptomycin und 10 % fötalem Kälberserum (FCS) . Pro Ansatz wurden 300000 Zellen in 35 mm Petrischalen (Falcon No 1008) ausgesät. Die Inkubation mit den Komplexen erfolgte in serumfreiem Medium bei 37 °C. Nach einer Stunde wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit 5 mM EDTA in PBS geerntet.
Das Ergebnis der FACS-Analyse ist in Fig. 9 dargestellt (A: DNA/PEI +/- M-SPA-PEG 37°C, PEG/PEI 9,2/1 w/w). B: DNA/Tf2PEI +/- M-SPA-PEG 37°C; PEG/PEI 9,2/1 w/w). Die X-Achse zeigt die Fluoreszenzintensität der gemessenen Zellen, die Y-Achse die Anzahl der gemessenen Ereignisse. Die FACS Daten zeigen, daß durch die PEGylierung die Bindung und Aufnahme der Komplexe an Makrophagen deutlich reduziert wird. Dies zeigt sich in der deutlich verringerten Fluoreszenz der Zellen. Beispiel 8: Verringerung der Wechselwirkung mit
Plasmaproteinen durch Modifizieren von DNA/Tf-PEI Komplexen mit PEG
Es wurden DNA/Tf2-PEI-Komplexe hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben (in Wasser gemischt), und, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit PEG modifiziert. Die DNA- Konzentration betrug 20 μg/ml, der N/P-Wert betrug 7,2. Das Verhältnis von PEG: PEI betrug 3,5:1 bzw. 7,0:1 (w/w) ; das entspricht einem molaren Verhältnis von 0,38:1 bzw. 0,76:1. Nach der PEGylierung wurden 500 μl Komplex mit 7,2 μl Plasma bei 37 °C inkubiert. Zu den in Fig. 10 angegebenen Zeitpunkten wurde die Partikelgröße mittels LLS gemessen. Es wurde festgestellt, daß unmodifizierte Komplexe nach Inkubation mit Plasma Aggregate bilden, während PEGylierte Komplexe hinsichtlich ihrer Größe nicht von verdünntem Plasma unterscheidbar waren. Da die Versuche in entionisiertem Wasser durchgeführt wurden, konnte ein etwa durch Salz hervorgerufener Effekt ausgeschlossen werden.
Beispiel 9 Herstellung von Transfektionskomplexen
DNA/TfPEI-Komplexe wurden hergestellt und PEGyliert, wie in den Beispielen 1 bzw. 2 beschrieben. Standard- DNA/TfPEI-Komplexe (TfPEI-Konjugat : molares Verhältnis von ca. 4 Transferrinmolekülen, gebunden an PEI,
800 kDa) wurden mit einem N/P-Verhältnis von 6.0 bei einer DNA-Konzentration von 100 μg/ml gemischt. Die Komplexe wurden in Wasser oder 0.5 x HBS (75 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7.4) gemischt. Um Iso-Osmolarität zu gewährleisten, wurde Glukose bei einer Endkonzentration von 5 % bzw. 2.5 % (w/v) zugegeben.
PEGylierte DNA/TfPEI-Komplexe (DNA/TfPEI/PEG; N/P 6.0, PEG/PEI 10/1 w/w, 1 h PEGylierung bei Raumtemperatur) wurden bei einer DNA-Konzentration von 50 μg/ml gemischt. Die Komplexe wurden in Wasser, 0.3 x HBS (50 mM NaCl, 7 mM HEPES pH 7.4) oder 0.5 x HBS gemischt. Um Iso-Osmolarität zu gewährleisten, wurde Glukose bei einer Endkonzentration von 5 %, 3.3 % bzw. 2.5 % (w/v) zugegeben. Die PEGylierten DNA/TfPEI- Komplexe wurden mittels VIVA-spin-4000- Microkonzentrator auf eine DNA-Endkonzentration von 200 μg/ml konzentriert, wie in Beispiel 4 beschrieben.
Beispiel 10 PEGylierung von DNA/TfPEI-Komplexen erhöht die Beständigkeit der Komplexe im Blut nach der in vivo Anwendung
a) Anwendung der Transfektionskomplexe in vivo im Tiermodell
250 μl PEGylierte Komplexe (enthaltend 50 μg DNA) oder 250 μl Standardkomplexe (enthaltend 25 μg DNA) wurden in die Schwanzvene von weiblichen A/J Mäusen (9-12 Wochen alt) injiziert. Zu den in Fig. 11 angegebenen Zeiten nach der Verabreichung der Transfektionskomplexe wurden die Tiere mittels zervikaler Dislokation getötet. Das Blut wurde in Eppendorf-Röhrchen gesammelt und sofort mit Natriumeitrat bei einer Endkonzentration von 25 mM gemischt. Das Plasma wurde von den Blutzellen durch Zentrifugation (10 min, 1000 g bei Raumtemperatur) getrennt .
b) Isolierung von genomischer und Plasmid-DNA aus Blut und Plasma
Die Isolierung der DNA wurde nach dem QIAamp Tissue Kit Protokol (Quiagen Cat . No. 29304) durchgeführt. Zu jedem Aliquot (100 μl) von Blut bzw. Plasma wurden wahrend der anfanglichen Inkubation bei 70°C 10 μl Heparm (Hepaπn „Novo", 1000 IE/ml, Novo Nordisk) gegeben, um die quantitative Isolierung von Plasmid-DNA zu gewährleisten (es hatte sich gezeigt, daß die Komplexe in Gegenwart von Heparm dissoziieren) .
c) Southern Blottmg
Das Agarose-Gel wurde nach Standardvorschrift (Sambrook et al., 1989) 45 mm lang denaturiert (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH) , mit destilliertem Wasser gewaschen und 30 mm lang in 1 M Tπs/1.5 M NaCl 30 mm lang gespult. Der Transfer auf Nylonmembranen (Gene Screen, DuPont, NEF983) wurde mittels Kapillartransfer in 10 x SSC vorgenommen; die DNA wurde mittels UV-Strahlung auf die Filter quervernetzt. Die Hybridisierung und das Waschen wurde nach den Empfehlungen des DIG High Prime DNA Labelmg and Detection Starter Kit II (Boehrmger Mannheim ; Cat . No. 1585614) durchgeführt. Die Filter wurden 4 h lang prahybπdisiert und über Nacht mit der DIG-markierten Sonde bei 42 °C in 50 % Formamid, 5 x SSC, 0.1 % N-Lauroylsarcosm, 0.02 % SDS, 2 % Block erungsreagens und 100 μg/ml Hefe-tRNA hybridisiert. Die abschließende Waschung wurde m 0.5 x SSC, 0.1 % SDS bei 68 °C vorgenommen.
Die Hybridisierungssonde wurde vom Plasmid pCMVL (Plank et al., 1992) mittels DIG-Markierung nach Vorschrift des Herstellers (DIG High Prime DNA Labelmg and Detection Starter Kit II; Boehrmger Mannheim) erhalten.
Der immunologische Nachweis wurde mit dem im Kit enthaltenen Substrat oder bevorzugt mit Vistra ECF Substrat (Amersham Cat. No . RPN5785) , das in einem Phosphor Imager (Molecular Dynamics) quantitativ bestimmt werden kann, durchgeführt. Die Inkubation mit dem Vistra-Substrat wurde über Nacht durchgeführt. Schätzung der Plasmid-DNA-Menge : auf jedes Agarose-Gel wurden unterschiedliche Mengen von pCMVL (5 ng, 500 pg, 50 pg, 5 pg bzw. 0.5 pg) geladen, um die Intensität der auf den Blots nachgewiesenen Banden direkt zu vergleichen. Die Gesamtmenge an DNA im Plasma wurde aus den erhaltenen Werten berechnet. Das Ergebnis ist in Fig. 11 dargestellt. Es zeigt, daß mit Standard- DNA/TfPEI-Komplexen (ohne PEGylierung) nach 30 min nur 1 % der injizierten DNA (ca. 300 ng) im Plasma nachweisbar ist. Zum selben Zeitpunkt können im Fall der PEGylierten DNA/TfPEI-Komplexe noch mehr als 20 % DNA (10000 ng) nachgewiesen werden. Zwei Stunden nach der Injektion kann mit PEGylierten Komplexen eine mehr als 10-fach höhere DNA-Menge (1500 ng) nachgewiesen werden als mit nicht-PEGylierten Standard- Komplexen (100 ng) . In beiden Fällen ist ein Teil der DNA abgebaut. Bei Einsatz von nicht-PEGylierten Standardkomplexen mit 50 μg (statt 25 μg) DNA wurden vergleichbare Ergebnisse (0.5% DNA im Plasma) wie mit 25 μg erzielt.
Beispiel 11 Bioverteilung von PEGylierten
DNA/TfPEI-Komplexen nach systemischer Verabreichung
Die PEGylierten DNA/TfPEI-Komplexe wurden hergestellt, wie in Beispiel 9 beschrieben; das verwendete Tiermodell war analog zu dem von Beispiel 10, jedoch wurden diese, sowie alle weiteren in vivo Studien in tumortragenden Mäusen durchgeführt. Dazu wurden weibliche A/J Mäuse subkutan mit 2 x 106
Neuroblastomzellen (Neuro2a, ATCC CCL 131) injiziert. Nach zwei Wochen, als die Tumore ca. 10 bis 14 mm Größe erreicht hatten, wurden die Transfektionskomplexe in die Schwanzvene injiziert. a) Verabreichung der Transfektionskomplexe in vivo
250 μl PEGylierte DNA/TfPEI-Komplexe (enthaltend 50 μg DNA; N/P=4.8 oder 6) wurden in die Schwanzvene von A/J Mäusen injiziert. Einen Tag nach der Verabreichung der Transfektionskomplexe wurden die Tiere getötet und die in Fig. 12 angegebenen Gewebe entnommen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert .
b) Isolierung von genomischer und Plasmid-DNA
Die DNA-Isolierung wurde ähnlich wie in Beispiel 10 nach der Vorschrift des QIAamp Tissue Kit vorgenommen. Anders als im Beispiel 10, wurde in diesem Fall kein Heparin zugegeben (der im Kit vorhandene Lysepuffer für Gewebe war ausreichend, die Komplexe zu dissoziieren) . Es wurde das genaue Gewicht der Mausorgane bestimmt.
Pro 25 mg (Milz: 10 mg) wurden 80 μl PBS/10 mM EDTA zur Homogenisierung der Gewebe in Dounce-Homogenisatoren verwendet. 100 μl Aliquots (Milz: 250 μl) wurden verwendet, um die DNA zu isolieren.
Um das Blotten der Gesamt-DNA zu erleichtern, wurde die Hälfte der eluierten DNA (1/10 der DNA aus den Mausschwänzen) mit EcoRI (Gibco BRL; 5 h in einem Gesamtvolumen von 300 μl mit 35 Einheiten EcoRI) verdaut. Die DNA wurde daraufhin mit Ethanol gefällt, einige Stunden in 25 μl TE (4°C) gelöst und auf ein 0.8 % Agarosegel geladen.
Der Southern Blot wurde wie in Beispiel 10 durchgeführt. Die Gesamtmenge an DNA aus jedem Organ wurde unter Berücksichtigung des Gesamtgewichts des Gewebes berechnet. Fig. 12A zeigt die Mengen von pCMVL (intakt plus teilweise abgebaut), die mittels Southern Blot Analyse in den verschiedenen Geweben nachweisbar waren.
Fig. 12B zeigt die nachweisbaren Mengen von intaktem pCMVL. Nach systemischer Verabreichung von PEGylierten DNA/TfPEI-Komplexe wurden beträchtliche Mengen an DNA in der Leber, der Milz, dem Schwanz, der Lunge sowie im Tumor gefunden (geringe Mengen wurden auch in den Nieren gefunden) . Interessanterweise wurden die größten Mengen an intakter DNA im Tumor, gefolgt von Schwanz und Leber, gefunden, während der größte Anteil an Gesamt-DNA, die in anderen Organen nachgewiesen wurde, abgebaut war (Fig. 12A) .
Beispiel 12 Zielgerichtete Genexpression im Tumorgewebe nach systemischer Verabreichung von PEGylierten DNA/TfPEI-Komplexen
Die PEGylierten DNA/TfPEI-Komplexe wurden hergestellt, wie in Beispiel 9 beschrieben; das verwendete Tiermodell war identisch mit dem von Beispiel 10.
a) Verabreichung der Transfektionskomplexe in vivo
PEGylierte DNA/TfPEI-Komplexe (enthaltend 60-80 μg DNA/200-400 μl; N/P=6; Komplexe gemischt in 0.3 x oder 0.5 x HBS) oder nicht-PEGylierten Standard-DNA/TfPEI- Komplexe (enthaltend 80 μg DNA/300 μl; N/P=6; Komplexe gemischt in 0.3 x oder 0.5 x HBS) wurden in die Schwanzvene von A/J Mäusen injiziert. Zwei Tage nach der Verabreichung der Transfektionskomplexe wurden die Tiere getötet und die in Fig. 13 angegebenen Gewebe entnommen. Die Gewebe wurden in einem Puffer, enthaltend 250 mM TRIS pH 7.5 mittels eines IKA- Homogenisators („Ultraturax" ) homogenisiert und in flussigem Stickstoff schockgefroren. Die Proben wurden bis zum Luciferase-Assay bei -80°C gelagert.
b) Luciferase-Assay
Die Transfektionsefflzienz wurde mittels Luciferase- Assay bestimmt. Dazu wurden Proben von homogenisiertem Gewebe drei Gefrier/Auftauzyklen unterworfen und 10 mm bei 10000 g zentrifugiert, um den Niederschlag zu pelletieren. Die Luciferase-Lichtemheiten wurden unter Verwendung eines Lumat LB9501/16 (Berthold, Deutschland) aus einem Aliquot des Uberstandes (50 μl) mit 10 s Integration nach automatischer Injektion der Luciferm-Losung aufgezeichnet. Der Luciferase- Background (300-400 Lichteinheiten) wurde von jedem Wert abgezogen und die Transfektionsefflzienz als relative Lichteinheiten (Relative Light Units, RLU) pro Organ/Gewebe ausgedruckt. Fig. 13 zeigt, daß mit nicht- PEGylierten Standard-DNA/TfPEI-Komplexen im Schwanz und m der Lunge eine betrachtliche Reportergenexpression stattfindet. Dies konnte darauf zurückzuführen sein, daß die Komplexe entweder nahe der Injektionsstelle (Schwanz) lokalisiert bleiben oder daß sie rasch mit Plasmaproteinen aggregieren und folglich durch die Lungenkapillaren ausfiltriert werden. Die Verabreichung der Standard-Transfektionskomplexe ging mit einer schweren akuten Toxizitat einher. Diese resultierte m einer ca. 50 %ιgen Lethalltat der Mause, die eine Folge der Verstopfung der Lungenkapillaren durch die aggregierten Komplexe sein konnte. Im Tumor wurde nur eine äußerst niedrige Genexpression gefunden. Im Gegensatz dazu resultierte die systemische
Verabreichung der PEGylierten DNA/TfPEI-Komplexe in einer beträchtlichen Reportergenexpression im Tumor und im Schwanz. In der Lunge wurde eine nur niedrige Expression nachgewiesen; m den anderen Organen wurde überhaupt keine Expression festgestellt. Die Toxizitat war im Vergleich zu den Standardkomplexen deutlich verringert .
Beispiel 13 Messung des Zeta-Potentials : verringerte Oberflachenladung von PEGylierten
DNA/TfPEI- und DNA/PEI-Komplexen
63 μg DNA in 100 μl Wasser wurden mit verschiedenen Mengen TfPEI (N/P 1.5: 12 μg; N/P 3.0: 23 μg; N/P 6.0: 47 μg) in 100 μl komplexiert. Nach 30 min Komplexbildung wurden die Komplexe mit M-SPA-PEG5000 I (N/P 1.5:
120 μg; N/P 3.0: 230 μg; N/P 6.0: 470 μg . Stammlosung 20 mg/ml in DMSO) PEGyliert. Nach 1 h PEGylierung wurden die Komplexe mit Wasser (MQ) auf eine End-DNA- Konzentration von 50 μg/ml verdünnt. Die Zeta- Potentialmessung wurde in fünf Serienmessungen mit einem ZetaPALS Zeta-Potential-Analysators (Brookhaven) bei einer Feldstärke von 13.9 V/cm und 10 Hz nach der von Miller et al . , 1991, beschriebenen Methode vorgenommen. Das Ergebnis der Messung, das in Fig. 14 dargestellt ist, zeigt, daß der Einbau von Transferrin in den
Komplex bei N/P>3.0 die Oberflachenladung reduziert. Außerdem fuhrt die PEGylierung zu einer weiteren Abschirmung der Oberflächenladung von negativ und positiv geladenen Komplexen.
Beispiel 14: Effekt der PEG-Modifizierung auf den Gentransfer in Saugerzellen
a) Herstellung von kleinen bzw. großen Transfektions omplexen
Die Komplexe wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, gemischt und wie in Beispiel 2 beschrieben mit M-SPA-PEG modifiziert. 10 μg of pCMVL DNA wurden in 250 μl Puffer mit 7.5 μg PEI (800 kDa) oder Tf-PEI Konjugat (molares Verhältnis von Tf zu PEI im Konjugat 2/1, Tf2PEI) m 250 μl Puffer gemischt. Als Puffer wurde entweder HBG (5% Glukose in 10 mM HEPES pH 7.4 ) - für die kleinen Komplexe - oder HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7.4 ) - für die großen Komplexe - verwendet. Nach 40 Minuten wurden 75μg M-SPA-PEG5000 zugesetzt und eine weitere Stunde bei Raumtemperatur mkubiert. Als Kontrolle wurden Komplexe ohne PEG-Modifikation hergestellt.
b) Transfektion der humanen Zellinie K562 mit
PEG-modifizierten kleinen bzw. großen DNA/ (Tf) PEI- Komplexen
Die Transfektion der K-562 Zellen (ATCC CCL-243) erfolgte in RPMI 1640 Medium mit 100 iU/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycm und Anwesenheit bzw. Abwesenheit von 10 % fötalem Kalberserum (FCS). Pro Transfektionsansatz wurden 500000 Zellen in 24-well Platten (Durchmesser 22.6 mm, Costar) ausgesät. Die Transfektion erfolgte mit je 2.5 μg DNA Komplex in 125 μl (-FCS Ansatz) oder 5 μg DNA Komplex in 250 μl
(+FCS Ansatz) . Nach vier Stunden wurde das Medium durch serumhaltiges Medium ersetzt. 24 Stunden nach Transfektionsbegmn wurden die Zellen abzentrifugiert , in 100 μl Erntepuffer geerntet und die Luciferaseexpression bestimmt. Die Ergebnisse sind in
Fig. 15 dargestellt (RLU = Relative Lichteinheiten) . Die Ergebnisse zeigen, daß die PEGylierung weder bei den kleinen noch den großen DNA-Komplexen einen negativen Einfluß auf die Gentransfereffizienz hat und daß man in beiden Fallen einen wesentlich höheren Gentransfer mit PEG-Transferrm-modiflzierten Komplexen erzielt. Beispiel 15: Effekt der PEG-Modifizierung auf den EGF-vermittelten Gentransfer in Säugerzellen
a) Herstellung von EGF-PEI-Konjugaten
Konjugate von Epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) mit PEI (25 kDa) wurden hergestellt durch Modifikation der Komponenten mit SPDP (Pharmacia 17-0458-01), Überführung des modifizierten PEI in die Mercaptopropionat-Form und Kopplung über Disulfidbrückenbildung, in analoger Weise wie beschrieben von Kircheis et al, 1997.
4 mg (0.67 μmol) EGF (EGF1, Serotec, murin) in 1 ml 16 mM wäßrigem HEPES Puffer (pH 7.9) wurden mit 0.5 ml einer 20 mM ethanolischen h bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Anschließend wurde zwei Tage lang gegen 50% wäßriges Ethanol dialysiert (Membran mit Molekulargewichtsausschlußgrenze MWCO 1 kDa, Spectropor 7) . Die Ausbeute an modifiziertem EGF betrug 3.5 mg (87%) bei einem molarem Verhältnis EGF/Pydridinyldithiopropionat von 1:0.8. In analoger Weise wurde aus 1 mg EGF modifiziertes EGF in einer Menge von 0.7 mg hergestellt.
Mercaptopropionat-modifiziertes PEI (10.5 mg, molares Verhältnis PEI/ Pydridinyldithiopropionat von 1:2.8) wurde erhalten durch Modifikation von 50 mg PEI (25 kDa, Aldrich, über Pharmacia Sephadex G25 gelfiltriert, in 0.76 ml 0.25 M NaCl, als Hydrochloridform, pH 7) mit 0.39 ml einer 20 mM ethanolischen SPDP Lösung, nach einer Stunde bei Raumtemperatur gefolgt von einer Gelfiltration (Sephadex G25, 10 x 300 mm Säule, Eluens 0.25 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7.3), Umsetzung eines Teils des Zwischenprodukts (20 mg PEI, enthaltend 1.45 μmol Pyridinyldithiopropionat ) mit 11 mg Dithiothreitol für eine Stunde unter Argon und Reinigung über Gelfiltration (Sephadex G25, 10 x 100 mm Säule, Eluens 0.25 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7.3, Argon-begast) .
Pydridinyldithiopropionat-modifiziertes EGF (4.2 mg EGF, 0.56 μmol Pyridinyldithiopropionat) in 2.2 ml 50% wäßrigem Ethanol wurde mit Mercaptopropionat- modifiziertem PEI (7.5 mg PEI, 0.90 μmol Mercaptogruppen) in 1.1 ml 0.25 mM NaCl, 20 mM HEPSS pH 7.3 unter Argon umgesetzt. Nach vier Tagen bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung durch Zugabe von 3M NaCl und Wasser auf 0.5 M NaCl und ein Gesamtvolumen von 4 ml eingestellt und mittels Ionenaustauschchromatographie (Biorad Macroprep High S, 100 x 10 mm, Puffer A: 20 mM HEPES pH 7.3; Puffer B: 3 M NaCl, 20 mM HEPES pH 7.3; Gradient 22% B bis 78% B) aufgetrennt. Die Produktfraktion (Elution zwischen 2-3 M NaCl) wurde gegen HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7.3) dialysiert und ergab ein Konjugat von 1.9 mg EGF modifiziert mit 6.35 mg PEI. Dies entspricht einem molaren Verhältnis EGF/PEI von 1.28:1.
b) Herstellung von Transfektionskomplexen
Die Komplexe wurden, analog wie in Beispiel 1 beschrieben, gemischt und, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit M-SPA-PEG modifiziert. 5 μg of pCMVL DNA wurden in 125 μl Puffer mit 3.75 μg PEI (25 kDa) als unmodifiziertes PEI (Hydrochlorid), oder als 1:1 (w/w) Mischung von unmodifiziertem PEI (Hydrochlorid) mit EGF-PEI (siehe a) ) , in 125 μl Puffer gemischt. Als Puffer wurden entweder HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7.4) oder 0.5x HBS (75 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7.4) verwendet. Nach 30 Minuten wurden 37.5 μg M-SPA-PEG5000 zugesetzt und eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Als Kontrolle wurden Komplexe ohne PEG-Modifikation hergestellt. Um Iso-Osmolarität zu gewährleisten, wurde bei den 0.5 x HBS Komplexen Glukose bei einer Endkonzentration von 2.5 % (w/v) zugegeben.
c) Transfektion der humanen Zellmie KB mit PEG-modiflzierten DNA/ (EGF) PEI-Komplexen
Pro Transfektionsansatz wurden 500000 KB Zellen (ATCC CCL-17) m T25 Flaschen (Costar) ausgesät. Die Transfektion erfolgte in je 2 ml DMEM Medium mit 10 % fötalem Kalberserum (FCS) mit je 5 μg DNA Komplex m 250μl Losung. Nach vier Stunden wurde das Medium durch weitere 2 ml an serumhaltigem Medium ergänzt.
24 Stunden nach Transfektionsbegmn wurden die Zellen geerntet und die Luciferaseexpression bestimmt. Die Ergebnisse sind m Fig. 16 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß auch bei PEGylierung der in HBS bzw 0.5 x HBS hergestellten DNA Komplexen die
Gentransfereffizienz erhalten bleibt, und daß man beiden Fallen einen wesentlich höheren Gentransfer mit EGF-modiflzierten Komplexen erzielt.
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Claims

Patentansprüche
1. Komplexe aus Nukleinsäure und Polyethylenimin (PEI), dadurch gekennzeichnet, daß das PEI mit einem daran kovalent gekoppelten hydrophilen Polymeren modifiziert ist.
2. Komplexe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure DNA ist und das Verhältnis DNA zu PEI, ausgedrückt durch das molare Verhältnis der Stickstoffatome im PEI zu den Phosphatatomen in der DNA (N/P-Wert) etwa 0.5 bis etwa 100 beträgt.
3. Komplexe nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der N/P-Wert etwa 2 bis etwa 20 beträgt.
4. Komplexe nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der N/P-Wert etwa 3 bis etwa 10 beträgt.
5. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das PEI ein Molekulargewicht von etwa 700 D bis etwa 2000000 D aufweist .
6. Komplexe nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das PEI ein Molekulargewicht von etwa 2000 D bis etwa 800000 D aufweist.
7. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile Polymer linear ist.
8. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe Polyethylenglykole (PEG), Polyvinylpyrollidone, Polyacrylamide, Polyvinylalkohole, oder Copolymeren davon.
9. Komplexe nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile Polymer PEG ist.
10. Komplexe nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekulargewicht des hydrophilen Polymeren etwa 500 D bis etwa 20000 D betragt .
11. Komplexe nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekulargewicht des hydrophilen Polymeren etwa 1000 D bis etwa 10000 D betragt.
12. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das molare Verhältnis
Polymer: primäre Aminogruppen/PEI etwa 1:10 bis etwa 10 : 1 betragt .
13. Komplexe nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis etwa 1:5 bis etwa 5:1 betragt.
14. Komplexe nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis etwa 1:3 bis etwa 1:1 betragt.
15. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß PEI mit einem zellularen Liganden modifiziert ist.
16. Komplexe nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand Transferrin ist.
17. Komplexe nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand EGF ist.
18. Komplexe nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß PEI mit dem Liganden über das hydrophile Polymere verbunden ist.
19. Komplexe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Nukleinsäure eine therapeutisch wirksame Nukleinsäure enthalten.
20. Komplexe nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die therapeutisch wirksame Nukleinsäure für em oder mehrere Zytokine kodiert.
21. Komplexe nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die therapeutisch wirksame Nukleinsäure für em oder mehrere Tumorantigene oder Fragmente davon kodiert .
22. Komplexe nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die therapeutisch wirksame Nukleinsäure ein
Selbstmordgen ist.
23. Komplexe nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Selbstmordgen das Herpes Simplex Thymidinkmasegen ist.
24. Verfahren zur Herstellung von Komplexen nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß zuerst DNA und, gegebenenfalls mit einem zellularen Liganden modifiziertes, PEI durch Mischen der verdünnten Losungen komplexiert und anschließend das hydrophile Polymere an PEI gebunden wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, daß die DNA- Konzentration etwa 5 bis 50 μg DNA/ml betragt.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Konzentration etwa 10 bis 40 μg DNA/ml betragt .
27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Komplexierung bei einer Salzkonzentration unterhalb des physiologischen Werts durchgeführt wird.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Komplexierung in entionisiertem Wasser durchgeführt wird.
29. Verfahren zur Herstellung nach einem der Anspuche 24 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß im Anschluß an die Komplexierung von DNA und, gegebenenfalls modifiziertem, PEI die Komplexe aus der verdünnten Losung auf eine Konzentration von etwa 200 μg/ml bis 1 mg/ml, bezogen auf DNA, gebracht werden.
30. Zusammensetzung für die Transfektion von Saugetierzellen, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen oder mehrere Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 23 in einer Konzentration von 200 μg/ml bis 1 mg/ml, bezogen auf DNA, enthalt.
31. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen oder mehrere Komplexe nach Anspruch 19.
32. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Komplexe in einer Konzentration von etwa 200 μg/ml bis etwa 1 mg/ml, bezogen auf DNA, enthalt.
33. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Komplexe DNA enthalten, die für ein oder mehrere Zytokine kodiert .
34. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 31 oder 32 in Form einer Tumorvakzine, dadurch gekennzeichnet, daß die Komplexe DNA enthalten, die für ein oder mehrere Tumorantigene oder Fragmente davon kodiert, gegebenenfalls in Kombination mit DNA, die für ein oder mehrere Zytokine kodiert.
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