EP1326646A2 - Transferrin-polykation/dns-komplexe für die systemische therapie von tumorerkrankungen mit zytotoxischen proteinen - Google Patents

Transferrin-polykation/dns-komplexe für die systemische therapie von tumorerkrankungen mit zytotoxischen proteinen

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Publication number
EP1326646A2
EP1326646A2 EP01986268A EP01986268A EP1326646A2 EP 1326646 A2 EP1326646 A2 EP 1326646A2 EP 01986268 A EP01986268 A EP 01986268A EP 01986268 A EP01986268 A EP 01986268A EP 1326646 A2 EP1326646 A2 EP 1326646A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
pei
tnf
transferrin
polycation
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01986268A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ralf Kircheis
Ernst Wagner
Lionel Wightman
Elinborg Ostermann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boehringer Ingelheim International GmbH
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim International GmbH filed Critical Boehringer Ingelheim International GmbH
Publication of EP1326646A2 publication Critical patent/EP1326646A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
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    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide

Definitions

  • the present invention relates to systemic gene therapy for tumor diseases.
  • the aim of all existing anti-tumor therapies is to efficiently kill the tumor cells or destroy the living conditions of the tumor.
  • the most important condition of a therapeutically effective therapy is the highest possible, in the best case complete damage to the tumor tissue with the lowest possible damage or influence on normal tissue.
  • biological agents such as for the therapeutic use of biologically highly active mediators such as cytokines.
  • Necrosis factor TNF ⁇ as well as the cytokines tumor-necrosis factor-ß (lymphotoxin), interleukin-1 (IL-1), and interleukin-6), which are closely related to it, are characterized by particularly high biological effectiveness, which is characterized, on the one hand, by a high effect already in a very low dose range (pg - ng range) (Hohmann et al., 1990; Kramer et al., 1986), as well as by an extremely broad spectrum of activity on a variety of target cells (“target cells”) (Beutler and Cerami, 1986; Bendtzen, 1988).
  • target cells target cells
  • TNF- ⁇ is a protein that is mainly used by activated monocytes and macrophages
  • TNF- ⁇ was originally discovered for its special ability to induce hemorrhagic necrosis in tumors (Carswell et al., 1975; Old, 1985). Hemorrhagic necrosis is primarily due to the damage and destruction of the blood vessels supplying the tumor, followed by coagulopathies, which lead to the interruption of the blood supply to the tumor and ultimately to tumor necrosis (Old, 1985; Van deWiel et al., 1989).
  • TNF- ⁇ Activation and, at higher doses of TNF- ⁇ , damage to the endothelial cell (Pober, 1988; Watanabe et al., 1988; Anderson et al. , 1994).
  • TNF- ⁇ induces decreased thrombomodulin secretion and increased plasminogen activator inhibitor secretion. This causes disorders of the coagulation and fibrinolytic system, which leads to impaired blood flow (Van de Wiel et al., 1989; Anderson et al., 1994). This is exacerbated by the vasodilating effects of released prostaglandins and other mediators (such as PAF) (Bachwich et al., 1986; Quinn and Slotman, 1999).
  • capillary leakage syndrome In parallel with hemostasis and coagulopathies, there is an increase in the permeability of the capillaries and the escape of liquid and macromolecules into the tissue (known as "capillary leakage syndrome") (Old, 1985; Van de Wiel et al., 1989; Edwards et al., 1992; Ferrero et al., 1996; Renard et al., 1994; 1995).
  • TNF- ⁇ 's anti-tumor activity is the activation of inflammatory cells (such as macrophages, granulocytes) and immune cells such as T and B lymphocytes. Macrophages are stimulated by TNF- ⁇ to increased cytotoxicity and to release IL-1, prostaglandins, M-CSF, GM-CSF and other mediators (Bachwich et al., 1986). Neutrophil granulocytes are activated by TNF- ⁇ for increased phagocytosis and increased release of lysozymes and oxygen radicals (Klebanoff et al.,
  • T lymphocytes for increased expression of IL-2 and TNF- ⁇ Receptors, HLA-DR antigens and for the release of interferon- ⁇ (Scheurich et al., 1987).
  • TNF- ⁇ also increases the adherence of inflammatory and immune cells.
  • the chemotactic activity of TNF- ⁇ and the mediators induced by it (such as IL-8), as well as stimulation of the expression of a number of adhesion molecules (CDU, ELAM; ICAM) and HLA antigens play an important role (Collins et al., 1986; Renard et al., 1994; Westerman et al., 1999).
  • TNF- ⁇ also shows a direct cytotoxic effect on various tumor cell lines (Sugarman et al., 1985, Kircheis et al. 1992a).
  • TNF- ⁇ doses were visible, while doses that were too low showed hardly any effects (Van de Dahl et al., 1989; Kircheis et al., 1992a). It soon became apparent that the high TNF- ⁇ doses required for therapeutic effects are associated with pronounced systemic toxicities, which ranged from acute liver toxicity (Bradham et al., 1998; Künstle et al., 1999) to shock syndrome with a lethal outcome (Natanson et al., 1989; Kircheis et al. , 1992a, b).
  • TNF- ⁇ not only leads to tumor necrosis in high doses, but is also the central mediator of endotoxin shock (Beutler et al., 1985; Hirota and Ogawa, 1999; Murphey et al., 2000). In contrast to locally limited tumor necrosis, systemic release of large amounts occurs during endotoxin shock
  • TNF- ⁇ Amounts of TNF- ⁇ . This leads to the failure of a number of regulatory functions of the organism and has life-threatening conditions such as hypotension, fever, metabolic acidosis, disseminated intravascular coagulopathies, as well as the failure of the functions of the kidneys, liver and lungs (Lenk et al., 1989; Kline et al ., 1999; Mori et al., 1999; Ter 1998).
  • the pathogenesis proceeds via mechanisms very analogous to those of the local one
  • TNF- ⁇ -related shock symptoms showed that permanent secretion of TNF- ⁇ into the bloodstream leads to disorders of the fat metabolism (via the inhibition of key enzymes such as lipoprotein lipase), which in extreme cases lead to
  • TNF- ⁇ on many normal tissues (Brockhaus et al., 1990), on the other hand the fact that the anti-tumor effects such as inflammatory reactions and hemorrhagic tumor necrosis, and TNF- ⁇ -related shock syndrome are based on the same pathophysiological mechanisms (Beutler and Cerami, 1986; Bendtzen, 1988; Kircheis, 1991; Anderson et al., 1994; Edwars et al., 1992; Ferrero et al., 1996; Renard et al., 1994, 1995; Westermann et al., 1999; Yi and Ulich, 1992). Although the sensitivity of the capillaries in the tumor area is greater than that of the capillaries in normal tissue, due to the large number of normal tissues and vital organs damaged by TNF- ⁇ , the desired therapeutic effect should at least be offset by undesirable toxic side effects.
  • TNF- ⁇ For a therapeutic application of TNF- ⁇ , it therefore appears to be necessary to separate antitumor activity and systemic toxicity by aiming for the greatest possible localization or focusing of the TNF- ⁇ effects on the tumor.
  • TNF- ⁇ directly to tumors was in some cases able to induce visible anti-tumor effects without major systemic toxicities (Jakubowski et al., 1989; Pfreundschuh et al., 1989; Van der Veen et al., 1999).
  • the possibilities of direct application to the tumor are severely limited in practice, especially in the case of tumors or metastases in internal organs.
  • such a treatment could only be successful if all metastases are accessible for direct application.
  • a special type of application is the so-called "isolated limb perfusion", in which the blood supply to entire limbs affected by tumors or metastases is decoupled from the systemic blood supply for a certain time.
  • TNF- ⁇ This short-term separate blood supply to the limbs makes it possible to apply higher doses of TNF- ⁇ , which are sufficient for a therapeutic effect, and to limit the toxic side effects to a relatively small part of the organism (the corresponding limb) (Eggermont et al., 1996a, 1996b; Bickels et al., 1999; Vrouenraets et al., 1999).
  • the main advantage of this application is that vital TNF- ⁇ -sensitive organs such as the liver and lungs are largely spared direct TNF- ⁇ effects.
  • the TNF- ⁇ doses cannot be set at any high level with this application form, because even in this case a certain amount of TNF- ⁇ escapes into the systemic bloodstream comes (Stam et al. 2000).
  • the maximum dose that can be applied is limited by the toxicity to normal tissue in the limbs, such as the capillary vascular system, muscles, etc.
  • the main disadvantage of this type of application is its limited applicability to limited tumor locations (in the limbs).
  • TNF-ß the related cytokines TNF-ß, IL-1 and IL-6, were considered for tumor therapy.
  • TNF-ß, or lymphotoxin is evolutionarily and functionally closely related to TNF- ⁇ (Granger et al., 1968).
  • TNF- ⁇ mainly from activated monocytes
  • TNF-ß When macrophages are secreted, TNF-ß is mainly secreted by NK cells, T and B lymphocytes. TNF- ⁇ and TNF-ß bind to the same receptors (Hohmann et al., 1990) and have an almost identical spectrum of activity (Gray et al., 1984; Kramer et al. 1986; Kircheis et al., 1992b). The spectrum of action of TNF- ⁇ shows larger overlaps with two other cytokines, namely with Interleukin-1 and Interleukin-6 (Bendtzen,
  • IL-1 and IL-6 are inflammation mediators, which are also act on endothelial cells, macrophages, immune cells.
  • IL-1 Like TNF- ⁇ , IL-1 induces fever in the hypothalamus and both cytokines can play a role in shock syndrome as mediators (Bentzen, 1988; Yi and Ulich, 1992; Mori et al., 1999; Hirota and Ogawa, 1999).
  • the direct anti-tumor activity of IL-1 and IL-6 is weaker than that of TNF- ⁇ in similar pro-inflammatory and immunostimulatory activities, as is the induction of hemorrhagic tumor necrosis by these two
  • TNF- ⁇ related cytokines TNF-ß, IL-1 and IL-6 problems also occur with these cytokines due to the similar spectrum of activity or overlapping with TNF- ⁇ .
  • TNF- ⁇ or the cytokines TNF- ⁇ , IL-1 and IL-6 related to TNF- ⁇ is generally only possible if the disease is limited to a primary tumor and if this tumor is directly accessible for application.
  • the diseases to be treated are metastatic tumors, the majority of which are localized in the visceral organs and are therefore not directly accessible. In these cases, the tumors are effective for treatment with the
  • Protein only accessible via a systemic administration route In the case of proteins, however, as already stated, this application is associated with systemic toxicity. Also are Because of the short half-lives of the therapeutically active proteins in the blood, the concentrations ultimately available on the tumor itself are too low to produce the desired therapeutic effects.
  • TNF- ⁇ TNF- ⁇ with the help of a tissue and cell cycle specific promoter (Jerome and Muller, 1998).
  • the positive charge also enables the binding of the DNA complex to negatively charged structures on the cell surface (via electrostatic adsorption) and the subsequent uptake of the DNA complex by adsorptive endocytosis.
  • the positive charge of the polycation / DNA complexes poses a serious problem for systemic application in vivo, since they also lead to a broad one
  • Luciferase reporter gene replaced by a gene encoding TNF- ⁇ , a potentiation of the toxicities from gene transfer-related toxicity and TNF- ⁇ -mediated toxicity can be expected, with the high gene expression in the lungs and liver also proving to be particularly unfavorable , since these organs are particularly sensitive to TNF- ⁇ -mediated toxicity (Lenk et al., 1989; Bradha et al., 1998; Künstle et al., 1999; Mori et al., 1999).
  • Dash et al. , 2000 described a method for shielding polylysine / DNA complexes using a polymethacrylic polymer (pHPMA).
  • the object of the present invention was to solve the problems which arise in the systemic use of DNA in the therapy of tumor diseases, in particular the problem of non-specific expression in normal tissue and the associated problems
  • Toxicity e.g. in the case of TNF- ⁇ , by providing a new delivery system for DNA.
  • TNF- ⁇ and / or the cytokines TNF- ⁇ , IL-1 and IL- related to TNF- ⁇ 6 after the application of the DNA coding for these cytokines into the bloodstream or via the systemic bloodstream, gene expression and the resulting cytokine-mediated effects in a targeted manner, ie specifically to the tumor tissue, with the greatest possible cutout of normal tissue. This targeted orientation to the tumor tissue is referred to below as "tumor targeting”.
  • the present invention relates to a complex for the treatment of tumor diseases by means of systemic application of DNA, containing, in expressible form, one or more DNA molecules coding for one or more therapeutically active proteins with cytotoxic activity, and a polycation that condenses the DNA and is wholly or partially conjugated with transferrin, characterized in that the complex has a surface charge corresponding to a zeta potential of ⁇ + 15mV, obtained by measurement in aqueous solution at a concentration of> 10mM NaCl, the shielding of the positive charges in the More than 50% of the complex is made by transferrin.
  • the complexes preferably have a zeta potential of + 10 mV to -10 mV, particularly preferably +5 mV to -5 mV.
  • systemic application in addition to the systemic application
  • Administration over the entire bloodstream also includes regional application via the blood vessels supplying the tumor, i.e. any administration that not directly into the tumor, but via the bloodstream.
  • Cytotoxic activity means a direct cytotoxic effect of the protein (e.g. as in the case of TNF- ⁇ ), but also an indirect one as described e.g. is caused by the release of a cytotoxic substance from a non-toxic substrate caused by the protein with enzymatic activity, which corresponds to the effect of the so-called "suicide genes".
  • the zeta potential can be determined using standard methods, e.g. as described by Müller RH, 1996.
  • the DNA preferably codes for TNF- ⁇ and / or for TNF- ⁇ and / or IL-1 and / or IL-6, TNF- ⁇ being particularly preferred.
  • DNA molecules coding for other proteins with anti-tumor activity and cytotoxic activity are also suitable, for example selected from the group of cytokines IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , or toxins such as diphtheria toxin (Massuda et al., 1997); also so-called suicide genes (Aghi et al., 2000), which are used in combination with the substrate, such as the herpes simplex thymidine kinase gene (with ganciclovir; Nagamachi et al., 1999), the cytochrome P450 (with cyclophosphamide) ( Aghi et al., 2000), or the linamarase gene (with linamarin; Cortes et al., 1998).
  • suicide genes Aghi et al., 2000
  • the DNA molecules coding for cytotoxic anti-tumor proteins can be used individually or in combination, e.g. B. a TNF- ⁇ plasmid in combination with a plasmid coding for a suicide gene, such as the thymidine kinase gene.
  • the DNA coding for a protein with cytotoxic activity can be combined with one or more further DNA molecules which code for a protein with anti-tumor activity, e.g. for an immunotherapeutically effective cytokine such as interleukin-2 or interferon-gamma, for an apoptosis-inducing protein such as p53 (Xu et al., 1999) or apoptin, for a caspase, for FasL (FasLigand) (Gajate et al., 2000) or for inhibitors of tumor neoangiogenesis, such as endostatin (O'Reilly et al., 1997); angiostatin
  • the expression plasmid must meet the requirement that it be expressible in mammalian cells.
  • it contains a strong promoter, e.g. the CMV promoter or the SV-40 promoter, which ensures the strong expression desired for the therapeutic effect.
  • expression plasmids can be used which ensure tumor-specific expression, e.g. using a tumor-specific, cell cycle-specific or tissue-specific promoter, or by means of hypoxia-responsive elements; furthermore are physical (by radiation) or chemical (e.g. by
  • Tetracycline inducible regulatory elements (Jerome, et al., 1993 ;, Dachs et al., 1997). If several proteins are used, the complex preferably contains several expression plasmids, coding for a single therapeutic protein in each case.
  • the DNA sequence coding for the therapeutic protein is preceded by a leader sequence which enables the protein to be secreted.
  • suitable leader sequences are type II or type II leader sequences, e.g. in the case of TNF- ⁇ , the endogenous TNF- ⁇ type II leader sequence (Utsumi et al., 1995).
  • TypII leader sequences typically consist of a cytoplasmic portion, a transmembrane domain and a linker domain that is adjacent to the mature protein.
  • the endogenous pro-TNF- ⁇ leader sequence is 76 amino acids long; their use requires that the transfected cells can properly process the pro-TNF- ⁇ form.
  • the coding sequence can be preceded by another leader sequence which brings about the secretion of the protein, for example a human type immunoglobulin leader sequence.
  • the type leader sequences described for numerous proteins are secretory leaders with a length of mostly 18-23 amino acids. These leader sequences from the Typl effect the binding of the proteins to the endoplasmic reticulum, where the proteins are then transported through the membrane with the leader being split off become.
  • Examples of leader sequences suitable in the context of the present invention are, for example, immunoglobulin leader sequences, such as Acc.No. AF174024.1, which are described in the Kabat database, or synthetic immunoglobulin leaders, consisting of a consensus leader sequence derived from the immunoglobulin leader sequences described above.
  • leader sequence of type II has the advantage that the secretion can take place to a lesser, possibly delayed extent than in the case of type leader sequences, which is particularly advantageous in the case of a toxic protein. In cases where a high toxic concentration is required, type leader sequences can be superior to type II leader sequences.
  • all polycations are suitable which fulfill the function in the complex to compensate for the negative charge of the plasmid DNA and to condense the plasmid DNA into compact particles.
  • polycations are polyethyleneimines, (PEI), homologous polycationic polypeptides such as polylysine, polyarginine, histones, spermines, spermidines, cationic lipids, dendrimers, (Boussif et al., 1995; Abdallah et al., 1996; Goula et al., 1998 a, b; Haensler, et al., 1993; Kukowska-Latallo, et al., et al. 1996; Lee, et al., 1996; Li, et al.
  • PEI polyethyleneimines
  • homologous polycationic polypeptides such as polylysine, polyarginine, histones, spermines, spermidines, cationic lipids, dendrimers
  • the complex according to the invention preferably contains a polyethylenimine (PEI) as the polycation.
  • PEI polyethylenimine
  • the PEI can have a linear or branched structure, the molecular weight range can vary over a wide range, namely between approximately 0.7 kDa and approximately 2000 kDa, preferably approximately 2 kDa to approximately 50 kDa.
  • PEI molecules often cause a stronger condensation of the DNA and, after complexing with DNA, result in an optimum of transfection efficiency even at lower N / P ratios. They generally result in very good transfection efficiency, but can also be associated with greater toxicity. Smaller molecules, of which a larger amount is required for complexation per given amount of DNA, may have the advantage of lower toxicity, with possibly lower efficiency. Which PEI molecule is used in detail can be determined in preliminary tests.
  • PEI molecules in an average molecular weight range between 2000 D and 800000 D.
  • PEI 700 D PEI 2000 D, PEI 25000 D, PEI 750000 D (Aldrich), PEI 50000 D (Sigma), PEI 800000 D (Fluka ).
  • PEI is also sold under the brand name Lupasol® Different molecular weights are available (Lupasol® FG: 800 D; Lupasol® G 20 anhydrous: 1300 D; Lupasol® WF: 25000 D; Lupasol® G 20: 1300 D; Lupasol® G 35: 2000 D; Lupasol® P: 750000 D; Lupasol® PS: 750000 D; Lupasol® SK: 2000000 D).
  • Transferrin coupled to the polycation which serves both as a ligand for cell binding and to shield non-specific interactions with non-target cells or non-target structures, is preferred human transferrin (Wagner et al., 1993; Kircheis et al., 1997) ,
  • the transferrin can be coupled to the polycation in a conventional manner, e.g. as described in EP 388 758 or WO 92/19281 for the preparation of transferrin-polycation conjugates.
  • the procedure for determining the complex composition is appropriately as follows: Starting from a defined amount of DNA, e.g. is in the form of a reporter gene plasmid (luciferase, beta-gal plasmid), the amount of polycation added in
  • the ratio of DNA to PEI is given below by stating the molar ratio of the nitrogen atoms in the PEI to the phosphate atoms in the DNA (N / P value or N / P ratio); an N / P value of 6.0 corresponds to one Mix 10 ⁇ g DNA with 7.5 ⁇ g PEI. In the case of free PEI, only about every sixth nitrogen atom is protonated under physiological conditions. Results with DNA / PEI-transferrin complexes show that these are approximately electroneutral with an N / P ratio of 2 to 3.
  • the N / P value of the complexes can vary over a wide range, it can be in the range from about 0.5 to about 100.
  • the N / P ratio is preferably about 2 to about 20, particularly preferably the ratio is 4 to 10.
  • the N / P value for the special application e.g. for the cell type to be transfected, be determined by preliminary experiments by increasing the ratio under otherwise identical conditions in order to determine the optimal ratio with regard to the transfection efficiency and to rule out a toxic effect on the cells.
  • the formulation of the complex according to the invention is also selected so that the positive charge of the
  • the quantity ratio transferrin / polycation is determined in coordination with the respective polycation by titrating the amount of conjugated transferrin-polycation conjugate with a different polycation / transferrin ratio in series tests using serial tests for a given DNA / polycation ratio, with a view to an optimal one Condensation of the DNA into compact particles, maximum transfection efficiency in tumor cells and minimal cytotoxicity.
  • An important parameter for the choice of the polycation / transferrin ratio is the shielding of the surface charge of the complex by the transferrin contained in the conjugate, corresponding to a zeta potential of ⁇ + 15mV.
  • the ratio of transferrin: polycation in the transfection complex ultimately obtained is preferably 3: 1 to 1: 4 (w / w).
  • the proportion of non-transferrin-conjugated polycation ("free polycation") in the complex depends on the molecular weight of the polycation and can range between 0% and 95% (molar ratio) of the total polycation content.
  • PEI 800kDa e.g. when using the conjugate Tf8PEI800kDa (conjugate with a molar ratio of 8 transferrin molecules per PEI molecule, branched, with average molecular weight 800kDa, see Kircheis et al., 1997)
  • a dilution with 2-10 times the amount of PEI25 or PEI22 is appropriate (particularly preferred dilution with 3- 5 times the amount of PEI25 or PEI22).
  • the molar ratio of conjugated polycation: free polycation is preferably about 1: 0 to 1:20.
  • the polycation conjugated with transferrin can be identical to the free polycation which may be present in the complex, but the polycations can also be different.
  • the positive charge is completely shielded by the high transferrin content of the conjugate.
  • transferrin is mainly responsible for the shielding, the following must be taken into account: Although the majority of the shielding (> 50%) of the positive charge of the complex is due to the high transferrin content of the conjugate, to a lesser extent , the reduction of zeta potential also through specific adaptation of others Complex parameters are brought about, for example by reducing the N / P ratio or incorporating negatively charged molecules into the formulation, for example negatively charged fusogenic peptides, as described, for example, in WO 93/07283 (such peptides also have the effect of releasing the complexes from the endosomes, see the next paragraph).
  • hydrophilic polymers e.g. Polyethylene glycols (PEG), polyvinyl pyrollidones, polyacrylamides, polyvinyl alcohols, or copolymers of these polymers.
  • PEG is preferred as the hydrophilic polymer.
  • the molecular weight of the hydrophilic polymer is generally about 1000 to about 40,000 Da, preferably molecules with a molecular weight of 5000 to 40,000 D are used.
  • the hydrophilic polymer preferably PEG, is preferably covalently bound to the polycation, in particular PEI.
  • the covalent binding takes place either by conjugation with the free polycation, in particular PEI, or by incorporation into the transferrin-PEI conjugate. In the latter case, the hydrophilic polymer is arranged between transferrin and the polycation; Such a molecule is obtained by using a bifunctional polymer which has different reactive groups at both ends of the molecule and by reacting with transferrin on the one hand and with the polycation on the other.
  • bifunctional polymers are, for example, PEGs which have hitherto been used for the crosslinking of different macromolecules, for example for the crosslinking of cofactor and apoenzyme (Nakamura et al, 1986), target control of polymeric active ingredients (Zalipsky and Barany, 1990) or PEG coating of surfaces and proteins (Harris et al, 1989).
  • the bifunctional derivatives which can be used in the context of the present invention are commercially available, they contain amino groups, hydroxyl groups or carboxylic acid groups at the ends of the molecules, for example products obtainable from Shearwater Polymers.
  • Shielding the positive charge is less than 50%, preferably at most 30%.
  • Zeta potential of complexes with several shielding factors, each with or without a transferrin component, is measured, from which the contribution of transferrin results from the difference in the zeta potential.
  • the complex may further contain elements for enhancing the release of the DNA complexes from the endosomes of the target cell, e.g. fusogenic peptides (WO 93/07283), or elements which increase the uptake of DNA in the cell nucleus, such as so-called “nuclear targeting sequences" (Vacik, et al., 1999; Zanta, et al., 1999).
  • elements for enhancing the release of the DNA complexes from the endosomes of the target cell e.g. fusogenic peptides (WO 93/07283), or elements which increase the uptake of DNA in the cell nucleus, such as so-called “nuclear targeting sequences" (Vacik, et al., 1999; Zanta, et al., 1999).
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing one or more of the complexes according to the invention.
  • the complexes are in this composition preferably taken up in an isotonic aqueous solution, for example in 0.5x HBS (HEPES (20mM) -buffered salt solution (75mM NaCl) with 2.5% glucose, as described in the examples.
  • HBS HBS
  • Buffered salt solution 75mM NaCl
  • the complexes are used in aqueous solutions in a wide range at salt concentrations (0-150 mM NaCl), concentrations of the HEPES buffer (0-1M), as well as with other buffer systems (phosphate buffer, ...)
  • the formulations of the complexes according to the invention are stored deep-frozen in aqueous solution and thawed before use, or stored as a lyophilisate, which enables stable storage over longer periods of time, and reconstituted in one of the salt buffer solutions described before use.
  • the complexes according to the invention are able, after application into the bloodstream, to express a therapeutically active gene (for example coding for
  • TNF- ⁇ -coding expression plasmid in a tumor-targeted gene transfer system in syngeneic tumor models in the mouse causes the TNF- ⁇ -typical hemorrhagic tumor necrosis followed by a significant inhibition of tumor growth, however without the occurrence of systemic TNF- ⁇ -mediated toxicity, as is known from systemic applications of TNF- ⁇ .
  • incorporating a sufficient amount of transferrin into the polycation / DNA complex can also shield the positive surface charge.
  • the shielding of the positive surface charge also shields the unspecific electrostatic interactions.
  • the incorporation of a sufficient amount of transferrin inhibits the aggregation of erythrocytes, while unshielded polycation / DNA complex lead to strong erythrocyte aggregation.
  • shielded complexes for the sake of simplicity, the term “shielded complexes” is used below for complexes in which the positive charge is shielded - predominantly by transferrin) via the tail vein of the mouse leads to a predominant gene expression in the tumor ( shown using the example of the luciferase reporter gene) and negligible expression in other organs. In contrast to unshielded gene transfer complexes, no systemic toxicity was observed.
  • TNF- ⁇ -mediated effects were specifically focused on the tumor without visible systemic toxicity, as is known from systemic TNF- ⁇ (protein) administration (Beutler and Cerami, 1986; Bendtzen, 1988; Haranaka, 1988; Natanson et al., 1989; Lenk et al., 1989; Kircheis et al., 1992) (experiments corresponding to Figs. 5, 6).
  • Tumor necrosis after administration of the described TNF- ⁇ gene transfer systems was found in tumors of completely different histological origins (e.g. Neuro2a neuroblastoma, MethA fibrosarcoma).
  • TNF- ⁇ -mediated antitumor activities such as hemorrhagic tumor necrosis and inhibition of tumor growth
  • TNF- ⁇ -mediated antitumor activities can also be achieved after systemic administration into the bloodstream, without the features of a systemic TNF- ⁇ -mediated toxicity, as is known from systemic applications of TNF- ⁇ .
  • the complexes according to the invention or the pharmaceutical compositions containing them can be used for the treatment of diseases which are associated with solid tumors, in particular metastatic tumors of malignant melanoma,
  • Soft tissue sarcoma fibrosarcoma, adenocarcinoma of the gastrointestinal tract, colon carcinoma, liver cell carcinoma, pancreatic carcinoma, lung carcinoma, breast carcinoma, osteosarcoma, glioblastoma, neuroblastoma.
  • tumor-targeting gene transfer complexes containing a therapeutically active gene with cytotoxic activity or a combination of such a gene with one or more other genes by means of systemic gene therapy, can advantageously be carried out using conventional standard therapies for the treatment of cancer, such as chemotherapy (Blumenthal et al., 1994) or radiotherapy (Xu et al., 1999; Rosenthal et al., 1999) can be combined.
  • chemotherapeutic agents which can be used (by preceding, simultaneous or subsequent administration) in combination with the complexes according to the invention are doxorubicin, taxol, 5-fluorouracil, cisplatin, vinblastine or formulations of these chemotherapeutic agents, for example doxil (liposomal formulation of doxorubicin) .
  • doxil liposomal formulation of doxorubicin
  • the chemotherapeutic agent is preferably applied in a dose which is lower and therefore better tolerated than that usually used in the case of montherapy with this therapeutic agent.
  • a combination of a complex according to the invention containing TNF-alpha-DNA with Doxil was more effective than a Doxil Monotherapy. This effect was particularly pronounced when Doxil was administered in a lower dose than the maximum dose that could be applied due to the toxicity (cf. Example 15 with Example 14).
  • Fig. 1 Non-specific gene expression in various organs and systemic toxicity with systemic application of positively charged polycation / DNA complexes in the bloodstream
  • Fig. 2 aggregation of erythrocytes by positive surface charge of polycation / DNA complexes
  • Fig. 3 Shielding the positive surface charge and associated inhibition of erythrocyte aggregation by incorporating a high proportion of transferrin in polycation / DNA complexes
  • Fig. 4 Systemic application of shielded transferrin-containing polycation / DNA complexes
  • Fig. 5 Systemic application of shielded transferrin-containing polycation / DNA complexes in a neuroblast model
  • Fig. 6 Systemic application of shielded transferrin-containing polycation / DNA complexes in a fibrosar chest of drawers11
  • Fig. 12 Systemic application of shielded transferrin-containing polycation / DNA complexes, in the melamine model B16F10
  • Fig. 15 Shielded transferrin-containing polycation / DNA complexes can be stored stably over longer periods.
  • PEI Polyethyleneimine
  • PEI (25) Polyethyleneimine
  • PEI (25) was from Aldrich, Milwaukee WI; based.
  • PEI with a molecular weight of 800 kDa, PEI (800) (in the form of a 50% w / v solution) was obtained from Fluka, Buchs.
  • PEI (22) Linear PEI with a molecular weight of 22 kDa was obtained from Euromedex, Soufferlweyersheim, France, or from MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany.
  • Liquid chromatography was performed using a Merck-Hitachi L-6220 pump and an L-4500A UV-VIS detector. The amount of PEI in the individual fractions was determined using the ninhydrin test and measured spectrophotometrically at 570 nm. The amount of transferrin was determined spectrophotometrically at 280 nm.
  • the reaction mixture was applied to a cation exchange chromatography column (Bio-Rad Macro-Prep high S) and fractionated with a gradient of 0.5-3.0M sodium chloride (with a constant content of 20 mM HEPES pH 7.3).
  • the coupling product was eluted at a salt concentration between 2.0M and 3.0M.
  • Tf-PEI conjugate
  • the concentration was adjusted to 1 mg PEI / ml by adding HBS, pH 7.3.
  • Iron incorporation was achieved by adding 1.25 ⁇ L of 10 mM iron (III) citrate buffer (containing 200 mM citrate, adjusting the pH to 7.8 by adding sodium bicarbonate) per mg of transferrin content carried out.
  • the Tf-PEI conjugate in iron-containing form was portioned into suitable aliquots, these were deep-frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C.
  • pCMVL also referred to as pCMVLuc
  • pCMVLuc The plasmid pCMVL (also referred to as pCMVLuc) described in WO 93/07283 was used as the luciferase reporter gene plasmid.
  • the DNA insert for murine TNF- ⁇ with the endogenous leader was produced by means of overlapping PCR reactions.
  • the leader sequence was amplified from exon 1 and exon 2 from mouse genomic DNA.
  • the sequence coding for mature TNF- ⁇ was amplified by TNF- ⁇ cDNA.
  • the cDNA was obtained from RNA from LPS-activated monocytes by RT-PCR. The individual fragments were combined by an overlapping PCR reaction ("splice overlap reaction").
  • SEQ ID NO: 1 contains Xhol and BglII cloning sites.
  • SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 with genomic mouse DNA as template.
  • the primer SEQ ID NO: 6 contains the cloning sites Kpnl and BamHI.
  • the pGS-hIL-2 (tet) vector was digested with Bglll and Kpnll and the hIL-2 insert was exchanged for the murine TNF- ⁇ insert, which was also digested with Bglll-Kpnl.
  • the resulting plasmid was named pGS-muTNF- ⁇ .
  • the pWS2m vector was digested with BamHI and the muIL-2 insert was exchanged for the murine TNF- ⁇ insert, which was digested with BglII-BamHI.
  • Synthetic oligonucleotides for human immunoglobulin leader sequences were prepared according to the sequence Acc. No. AF174024.1 or produced according to a synthetic leader sequence and upstream of the mature TNF- ⁇ sequence in a PCR reaction.
  • the DNA sequence for the synthetic immunoglobulin leader corresponds to the sequence of Acc. No. Z69026.1 in the first 53 nucleotides plus appears before the sequence of the mature TNF- ⁇ .
  • the respective leader sequence was fused to the mature TNF- ⁇ in a PCR reaction.
  • TNF- ⁇ cDNA served as DNA template.
  • SEQ ID NO: 7 contains Xhol and Bglll restriction sites. The resulting fragment was cloned into the plasmids pGS-hIL-2 (tet) and pWS2m.
  • the pGS-hIL-2 (tet) vector was digested with Bglll and Kpnll and the hIL-2 insert was exchanged for the murine TNF- ⁇ insert with IgG leader, which was also digested with Bglll-Kpnl.
  • the resulting plasmid was named pGS-muTNF- ⁇ lgL.
  • the pWS2m vector was digested with BamHI and the muIL-2 insert was exchanged for the murine TNF- ⁇ insert with IgG leader, which had previously been digested with BglII-BamHI. After checking the correct ones Orientation of the insert was called the resulting plasmid pWS2-muTNF- ⁇ IgL.
  • TNF- ⁇ cDNA served as DNA template.
  • SEQ ID NO: 8 contains Xhol and Bglll restriction sites. The resulting fragment was cloned into the plasmids pGS-hIL-2 (tet) and pWS2m.
  • the pGS-hIL-2 (tet) vector was digested with Bglll and Kpnll and the hIL-2 insert was exchanged for the murine TNF- ⁇ insert with synthetic IgG leader, which was also digested with Bglll-Kpnl.
  • the resulting plasmid was named pGS-muTNF- ⁇ -sIgL.
  • the pWS2m vector was digested with BamHI and the muIL-2 insert was exchanged for the murine TNF- ⁇ insert with synthetic IgG leader, which had previously been digested with BglII-BamHI. After checking the correct orientation of the insert, the resulting plasmid was named pWS2-muTNF- ⁇ -sIgL.
  • Polycations, P phosphate of the DNA
  • P phosphate of the DNA
  • a PEI (800) solution 156 ⁇ g PEI (800) / ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES
  • a solution of the DNA in a concentration of 200 ⁇ gDNS / ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES manufactured.
  • transfection complexes were incubated for 20 minutes at room temperature. To ensure isotonicity, glucose was added (to a final concentration of 2.5%).
  • the particle size of the PEI / DNA complexes was measured using a Malvern Zetasizer 3000 as standard.
  • the surface charge of the PEI / DNA complexes was determined by physical measurement of the zeta potential using a Malvern Zetasizer 3000 determined. (The method of measuring the zeta potential is described in Müller RH, 1996, zeta potential and particle loading in laboratory practice,ticianliche Verlagsgesellschaft WVG Stuttgart.)
  • transfection complexes (containing 50 ⁇ g DNA / 250 ⁇ l) were systemically in the tail vein in tumor-bearing
  • mice (neuroblastoma growing subcutaneously in the flank, Neuro2a) syngeneic A / J mice (with at least 4 animals per application group). To this end, the mice had 10 6 Neuro2a tumor cells 2 weeks beforehand
  • mice A control group of mice was injected with an equal amount of uncondensed DNA (50 ⁇ g DNA / 250 ⁇ l).
  • Reporter gene expression was measured 24 hours after application of the transfection complexes using a luciferase assay (described in Kircheis et al., 1999).
  • PEI / DNA complexes A strongly positive surface charge was found for all PEI / DNA complexes, which is expressed in a strongly positive zeta potential.
  • the zeta potential of the PEI / DNA complexes was accordingly + 30mV, + 35mV, and + 32mV for PEI (800) / DNS, PEI (25) / DNS, and
  • FIG. 1 a In the case of normal systemic injection, the unpackaged, unprotected DNA (FIG. 1 a) is rapidly broken down in the bloodstream and does not lead to any significant gene expression in the organs examined, with the exception of the injection site (not shown in FIG. 1 a).
  • Fig. Lb PEI (800)
  • Fig. Lc PEI25
  • Fig. 1 d PEI (22) protects the DNA from immediate degradation.
  • the resulting complexes have a strongly positive surface charge (positive zeta potential> + 30mV).
  • transfection complexes with the luciferase reporter gene were prepared in 75 mM NaCl, 20 mM HEPES at a DNA concentration of 200 ⁇ g / ml.
  • the zeta potential of the PEI / DNS complexes was correspondingly + 30mV, + 35mV, and + 32mV for PEI (800) / DNS, PEI (25) / DNS, and PEI (22) / DNS complexes.
  • Fresh blood was obtained from A / J mice and 20 ⁇ l of heparin was added to prevent coagulation.
  • the erythrocytes were washed three times in cold Ringer's solution and sown in 6-well cell culture plates.
  • the freshly mixed polycation / DNA gene transfer complexes were added to the erythrocytes.
  • the final DNA concentration was 17 ⁇ g / ml, which corresponds to the order of magnitude of the amount of DNA applied in vivo (50 ⁇ g DNA) per mouse blood volume (2.5-3ml).
  • the erythrocytes were incubated with the gene transfer complexes for 1 hour at + 37 ° C. and the aggregation of the erythrocytes was assessed. Untreated erythrocytes are shown as controls (Fig. 2a).
  • Transfection complexes in the bloodstream is one of the pathogenetic mechanisms of the toxicities described in Example 1, including pulmonary embolism.
  • the PEI (25) was partially (for example 1/10, 1/5, or 1/2) or completely by a corresponding amount of transferrin-PEI (25) conjugate (Tf-PEI , with the very high molar ratio transferrin: PEI of 1: 1, described in materials and methods).
  • the transfection complexes, in which PEI (25) has been partially replaced by transferrin-PEI conjugate thus consist of transferrin-PEI (25) conjugate (abbreviated as: Tf-PEI), PEI (25) and DNA, they are described below referred to as "Tf-PEI / PEI (25) / DNA complexes".
  • Tf-PEI transferrin-PEI
  • PEI (25) DNA
  • Tf-PEI transferrin-PEI
  • DNA DNA
  • the zeta potential (as an expression of the surface charge) was measured using a Malvern Zetasizer 3000 (as described in Example 1). The effect of incorporating an increasing amount of transferrin conjugate on the zeta potential of the
  • Tf-PEI / PEI (25) / DNA transfection complexes or Tf-PEI / PEI (22) / DNA transfection complexes were correspondingly higher PEI amounts mixed per constant amount of DNA
  • PEI / DNA complexes have a high positive surface charge, which is expressed in a strongly positive zeta potential ( ⁇ + 30mV).
  • Transfection complexes shielded by transferrin (containing the luciferase reporter gene) were prepared in 75 mM NaCl, 20 mM HEPES at a DNA concentration of 200 ⁇ g / ml and incubated for 20 minutes at room temperature.
  • Tf-PEI 1: 3 were obtained by rapidly mixing a polycation solution (consisting of 31 ⁇ g / ml Tf-PEI and 94 ⁇ g PEI (22) / ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) and a solution of the DNA (200 ⁇ g DNA / ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES).
  • Isotonicity of the transfection complex solutions was adjusted by adding glucose to a final concentration of 2.5%.
  • transfection complexes (containing 50 ⁇ g DNA / 250 ⁇ l) were systemically administered via the tail vein in tumor-bearing A / J mice (neuroblastoma, Neuro2a growing subcutaneously in the flank) (as described in Example 1). Transferrin-containing transfection complexes were tested using PEI25 (FIG. 4a) and PEI22 (FIG. 4b).
  • Isotonicity of the transfection complex solutions was adjusted by adding glucose to a final concentration of 2.5%.
  • mice had been injected subcutaneously into the flank with 10 6 tumor cells (neuroblastoma) (Neuro2a ATCC CCL 131) 8 days beforehand and had a subcutaneously growing tumor with a diameter of 6-8 mm at the time of the first application of the transfection complexes.
  • nerveroblastoma Neuro2a ATCC CCL 131
  • the tumor growth was followed over the following 3 weeks.
  • Transfection complexes shielded by transferrin with the gene for TNF- ⁇ were prepared in 75mM NaCl, 20mM HEPES at a DNA concentration of 200 ⁇ g / ml and incubated for 20 minutes at room temperature.
  • the transfection complexes (each containing 50 ⁇ gDNS / 250 ⁇ l) were systemically administered via the tail vein into tumor-bearing Balb / c mice with methA fibrosarcoma growing subcutaneously in the flank.
  • the mice had been injected subcutaneously into the flank 8 days beforehand with 10 6 methA tumor cells (methA fibrosarcoma) and, at the time of the first application of the transfection complexes, had a subcutaneously growing tumor with a diameter of 6-8 mm.
  • Isotonicity of the solutions was adjusted by adding glucose to a final concentration of 5%.
  • the transfection complexes (containing 50 ⁇ g DNA / 250 ⁇ l) were systemically transferred into tumor-bearing A / J mice (4 animals per application group) via the tail vein.
  • the mice had been injected subcutaneously into the flank with 10 6 tumor cells (neuroblastoma) (Neuro2a ATCC CCL 131) 12 days beforehand, and had a subcutaneously growing tumor with a diameter of 10-15 mm at the time of the first application of the transfection complexes.
  • TNF- ⁇ The expression of the gene product, TNF- ⁇ , in the tumor and in the various organs, and TNF- ⁇ serum levels were measured 24 hours after application of the transfection complexes with the aid of an ELISA (specific for murine TNF- ⁇ ) (FIGS. 7a and b).
  • the values given are mean values ⁇ SEM of 4 animals.
  • the abbreviations of the organs have the same meaning as in Fig. 1.
  • high expression of TNF- ⁇ was found in the lungs, followed by the liver, heart, tumor, and spleen. This non-specific expression in various organs also resulted in significant systemic TNF ⁇ levels in the animal's blood serum (FIG. 7a).
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • Glucose adjusted to a final concentration of 2.5%.
  • Isotonicity of the solutions was adjusted by adding glucose to a final concentration of 5%.
  • transferrin-shielded or unshielded transfection complexes were also prepared which contained the pSP65 plasmid which was not expressing in mammalian cells instead of the TNF- ⁇ -coding plasmid.
  • the transfection complexes (each containing 50 ⁇ g DNA / 250 ⁇ l) were systemically administered via the tail vein into the bloodstream of tumor-bearing A / J mice (8 animals per application group).
  • the mice had been injected subcutaneously into the flank with 10 6 tumor cells (neuroblastoma) (Neuro2a ATCC CCL 131) 8 days beforehand, and had a subcutaneously growing tumor with a diameter of approx. 6-8 mm at the time of the first application of the transfection complexes , The tumor growth was followed over the following 3 weeks.
  • the weight of the animals was determined as a parameter for a possible influence on the general condition of the animals. While there was no significant weight loss after systemic application of transferrin-shielded transfection complexes, the application of non-shielded transfection complexes with TNF- ⁇ led to significant weight loss (p ⁇ 0.05 vs. Untreated control). In contrast to the unshielded complexes, they are transferrin-shielded
  • Transfection complexes are able to express an therapeutic gene (eg coding for TNF- ⁇ ), and thus also to localize the activity of the therapeutic protein, TNF- ⁇ , on the target site, the tumor, and thus the undesirable effects on normal tissue, as is the case with systemic TNF- ⁇ protein therapy are known to switch off.
  • an therapeutic gene eg coding for TNF- ⁇
  • Transfection complexes shielded by transferrin, containing a plasmid coding for TNF- ⁇ , the plasmid pGS-muTNF- ⁇ with the authentic TNF- ⁇ leader sequence being used, were produced in 75 mM NaCl, 20 mM HEPES at a DNA concentration of 200 ⁇ g / ml and incubated for 20 minutes at room temperature.
  • the transfection complexes (each containing 50 ⁇ g DNA / 250 ⁇ l) were systemically administered via the tail vein into the bloodstream of tumor-bearing A / J mice (6 animals per application group).
  • the mice had been injected subcutaneously into the flank with 10 6 tumor cells (neuroblastoma) (Neuro2a ATCC CCL 131) 8 days beforehand, and had a subcutaneously growing tumor with a diameter of approx. 6-8 mm at the time of the first application of the transfection complexes ,
  • the tumor growth was followed over the following 3 weeks.
  • Transfection complexes shielded by transferrin, containing a plasmid coding for TNF- ⁇ , the Plasmid pGS-muTNF- ⁇ with the authentic TNF- ⁇ leader sequence was used in 75mM NaCl, 20mM HEPES at a DNA concentration of 200 ⁇ g / ml and incubated for 20 minutes at room temperature.
  • Isotonicity of the transfection complex solutions was adjusted by adding glucose to a final concentration of 2.5%.
  • transferrin-shielded transfection complexes which, instead of the TNF- ⁇ -coding plasmid, contain a therapeutically irrelevant reporter gene (for ⁇ -galactosidase) or the pSP65 plasmid which is not expressing in mammalian cells ,
  • mice 50 ⁇ g DNA / 250 ⁇ l) systemically administered via the tail vein into the bloodstream of tumor-bearing A / J mice.
  • the mice had been injected subcutaneously into the flank with 10 6 tumor cells (neuroblastoma) (Neuro2a ATCC CCL 131) 8 days beforehand, and had a subcutaneously growing tumor with a diameter of approx.
  • Transfection complexes shielded by transferrin containing 20 ⁇ g / 250 ⁇ l, 10 ⁇ g / 250 ⁇ l, or 5 ⁇ g / 250 ⁇ l of a plasmid encoding TNF- ⁇ , wherein the plasmid pGS-muTNF- ⁇ with the authentic TNF- ⁇ leader sequence was used, were in 150mM NaCl, 20mM HEPES prepared and incubated for 20 minutes at room temperature.
  • the transfection complexes (each containing 20 ⁇ g DNS / 250 ⁇ l, 10 ⁇ g DNS / 250 ⁇ l, or 5 ⁇ g DNA / 250 ⁇ l) systemically via the tail vein into the bloodstream of tumor-bearing A / J mice (12 animals per application group).
  • the mice had been injected subcutaneously into the flank with 10 6 tumor cells (neuroblastoma) (Neuro2a ATCC CCL 131) 8 days beforehand, and had a subcutaneously growing tumor with a diameter of approx. 6-8 mm at the time of the first application of the transfection complexes ,
  • the tumor growth was followed over the following 3 weeks.
  • Transfection complexes shielded by transferrin, containing a plasmid coding for TNF- ⁇ , the plasmid pGS-muTNF- ⁇ with the authentic TNF- ⁇ leader sequence being used, were prepared in 75 mM NaCl, 20 mM HEPES at a DNA concentration of 200 ⁇ g / ml and incubated for 20 minutes at room temperature.
  • Isotonicity of the transfection complex solutions was adjusted by adding glucose to a final concentration of 2.5%.
  • transferrin-shielded transfection complexes which contain a therapeutically irrelevant reporter gene (for ⁇ -galactosidase) instead of the TNF- ⁇ -coding plasmid.
  • the transfection complexes (each containing 50 ⁇ g DNA / 250 ⁇ l) were systemically administered via the tail vein into the bloodstream of tumor-bearing BALB / c mice.
  • the mice had been injected subcutaneously into the flank 8 ⁇ beforehand with 2 ⁇ 10 6 methA tumor cells (fibrosarcoma) and, at the time of the first application of the transfection complexes, had a subcutaneously growing tumor with a diameter of approximately 6-8 mm.
  • Table 2 is a summary of two independent systemic experiments Application of shielded transferrin-containing polycation / DNA complexes containing TNF- ⁇ plasmid DNA, shown in the MethA fibrosar model.
  • Isotonicity of the transfection complex solutions was adjusted by adding glucose to a final concentration of 2.5%.
  • the transfection complexes (each containing 50 ⁇ g DNA / 250 ⁇ l) were systemically administered via the tail vein into the bloodstream of tumor-bearing DBA / 2 mice (10 animals per application group).
  • the mice had been injected subcutaneously into the flank with 10 6 M-3 tumor cells (melanoma) 8 days beforehand and, at the time of the first application of the transfection complexes, had a subcutaneously growing tumor with a diameter of approximately 6-8 mm.
  • the tumor growth was followed over the following 3 weeks.
  • Transfection complexes shielded by transferrin, containing a plasmid coding for TNF- ⁇ , the plasmid pGS-muTNF- ⁇ with the authentic TNF- ⁇ leader sequence being used, were produced in 75 mM NaCl, 20 mM HEPES at a DNA concentration of 200 ⁇ g / ml and incubated for 20 minutes at room temperature.
  • Isotonicity of the transfection complex solutions was adjusted by adding glucose to a final concentration of 2.5%.
  • the transfection complexes (each containing 50 ⁇ g DNA / 250 ⁇ l) were systemically injected into the bloodstream of tumor-bearing C57B1 / 6 mice via the tail vein (10 animals per application group) applied.
  • the mice had been injected subcutaneously into the flank with 10 6 B16F10 tumor cells (melanoma) 8 days beforehand, and at the time of the first application of the transfection complexes had a subcutaneously growing tumor with a diameter of approximately 6-8 mm.
  • the tumor growth was followed over the following 3 weeks.
  • Transfection complexes shielded by transferrin, containing a plasmid coding for TNF- ⁇ , the Plasmid pGS-muTNF- ⁇ with the authentic TNF- ⁇ leader sequence was used in 75mM NaCl, 20mM HEPES at a DNA concentration of 200 ⁇ g / ml and incubated for 20 minutes at room temperature.
  • Isotonicity of the transfection complex solutions was adjusted by adding glucose to a final concentration of 2.5%.
  • mice 50 ⁇ g DNA / 250 ⁇ l) systemically via the tail vein into the bloodstream of tumor-bearing C57B1 / 6 mice (8 animals per application group) as single therapy or in combination with Doxil (first application: 4.5 mg / kg, all other applications: 1.5 mg / kg).
  • the mice had been injected subcutaneously into the flank with 10 6 B16F10 tumor cells (melanoma) 8 days beforehand, and at the time of the first application of the transfection complexes had a subcutaneously growing tumor with a diameter of approximately 6-8 mm.
  • the tumor growth was followed over the following 3 weeks.
  • Transfection complexes shielded by transferrin, containing a plasmid coding for TNF- ⁇ , the plasmid pGS-muTNF- ⁇ with the authentic TNF- ⁇ leader sequence being used, were prepared in 150mM NaCl, 20mM HEPES at a DNA concentration of 160 ⁇ g / ml and incubated for 20 minutes at room temperature.
  • the transfection complexes (each containing 40 ⁇ g DNA / 250 ⁇ l) were systemically injected into the bloodstream of tumor-bearing C57B1 / 6 mice (8 animals per application group) via the tail vein as individual therapy or in every second application in combination with Doxil ( 1.5 mg / kg).
  • the mice had been injected subcutaneously into the flank with 10 6 B16F10 tumor cells (melanoma) 8 days beforehand, and at the time of the first application of the transfection complexes had a subcutaneously growing tumor with a diameter of approximately 6-8 mm.
  • the tumor growth was followed over the following 3 weeks.
  • a part (0.5 ml) of the DNA complexes was further stored at room temperature after the mixture, while the remaining part was snap-frozen in aliquots of 250 ⁇ l and further stored at -80 ° C. Aliquots of both components, the DNA complexes stored at room temperature and the DNA complexes stored at -80 ° C, were taken at the appropriate times and the zeta potential and particle size were measured. The frozen aliquots were quickly thawed at +37 ° C. The particle sizes of the DNA complexes measured at the corresponding times are shown in FIG. 15. It can be seen that both the DNA complexes stored at room temperature and the frozen ones are stable over long periods of time. A stable shielding of the zeta potential of the complexes was also measured at all times ( ⁇ + 10mV).
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Abstract

Komplex von DNS, enthaltend ein oder mehrere DNS-Moleküle, kodierend für ein oder mehrere therapeutisch wirksame Proteine mit zytotoxischer Aktivität, und ein mit Transferrin konjugiertes Polykation mit einem Zetapotenzial von ≤+15mV. Der Komplex, in dem ein hoher Transferrinanteil die positive Ladung abschirmt, bewirkt bei der systemischen Behandlung von Tumorerkrankungen einen zielgerichteten Transport der therapeutischen DNS zu den Tumoren.

Description

Transferrin-Polykation/DNS-Komplexe für die systemische Therapie von Tumorerkrankungen mit zytotoxischen Proteinen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die systemische Gentherapie von Tumorerkrankungen.
Das effiziente Abtöten der Tumorzellen bzw. die Zerstörung der Lebensbedingungen des Tumors sind das Ziel aller bestehenden Antitumortherapien. Wichtigste Bedingungen einer therapeutisch wirksamen Therapie ist eine möglichst hohe, im günstigsten Fall komplette Schädigung des Tumorgewebes bei möglichst niedriger Schädigung bzw. Beeinflussung von Normalgewebe.
Mit Ausnahme der chirurgischen Entfernung des Tumors sind die zur Zeit bestehenden Ansätze zur Krebstherapie, wie Radiotherapie und Chemotherapie, vor allem durch ihre Toxizität gegenüber dem Normalgewebe bzw. dem Gesamtorganismus in ihrer Anwendbarkeit und Effizienz limitiert.
Die Notwendigkeit, bei größtmöglicher Schädigung des Tumorgewebes eine möglichst geringe Schädigung bzw. Beeinflussung des Normalgewebes bzw. Gesamtorganismus herbeizuführen, gilt auch für die therapeutische
Anwendung von biologischen Wirkstoffen, wie z.B. für die therapeutische Anwendung von biologisch hochaktiven Mediatoren wie Zytokinen.
Unter den bekannten Zytokinen zeichnen sich der Tumor-
Nekrose-Faktor TNFα, sowie die mit ihm eng verwanden Zytokine Tumor-Nekrose-Faktor-ß (Lymphotoxin) , Interleukin-1 (IL-1) , und Interleukin-6) durch besonders hohe biologische Wirksamkeit aus, welche sich zum einen durch eine hohe Wirkung bereits in einem sehr niedrigen Dosisbereich (pg - ng Bereich) (Hohmann et al., 1990; Kramer et al . , 1986), als auch durch ein äußerst breites Wirkungsspektrum auf eine Vielfalt von Zielzellen ("Targetzellen") ausdrückt (Beutler und Cerami, 1986; Bendtzen, 1988) .
TNF-α ist ein Protein, das vor allem von aktivierten Monozyten und Makrophagen unter bestimmten
Stresssituationen produziert wird (Männel et al . , 1980) . TNF-α wurde ursprünglich aufgrund seiner besonderen Fähigkeit entdeckt, hämorrhagische Nekrosen in Tumoren zu induzieren (Carswell et al . , 1975; Old, 1985) . Die hämorrhagische Nekrose ist in erster Linie auf die Schädigung und Zerstörung der den Tumor versorgenden Blutgefäße zurückzuführen, gefolgt durch Koagulopathien, welche zur Unterbrechung der Blutversorgung des Tumor und letztlich zur Tumornekrose führen (Old, 1985; Van deWiel et al . , 1989).
Am Anfang der Schädigung der Blutgefäße steht eine
Aktivierung und bei höheren TNF-α-Dosen die Schädigung der Endothelzelle (Pober, 1988; Watanabe et al . , 1988; Anderson et al . , 1994). TNF-α induziert eine verringerte Sekretion von Thrombomodulin und eine erhöhte Sekretion von Plasminogenaktivator Inhibitor. Dies bewirkt Störungen des Gerinnungs- und Fibrinolytischen Systems, was zur Beeinträchtigung des Blutflusses führt (Van de Wiel et al . , 1989; Anderson et al . , 1994). Dies wird noch durch die vasodilatierende Wirkung von freigesetzten Prostaglandinen und anderen Mediatoren (wie z.B. PAF) verstärkt (Bachwich et al . , 1986 ; Quinn und Slotman, 1999). Parallel zu Hämostase und Koagulopathien kommt es zur Erhöhung der Permeabilität der Kapillaren und zum Austreten von Flüssigkeit und Makromolekülen ins Gewebe (bekannt als "capillary leakage syndrome") (Old, 1985; Van de Wiel et al . , 1989; Edwards et al . , 1992; Ferrero et al . , 1996; Renard et al . , 1994; 1995).
Eine weitere Komponente der Antitumorwirksamkeit von TNF-α ist die Aktivierung von Entzündungszellen (wie Makrophagen, Granulozyten) und Immunzellen wie T-, und B-Lymphozyten. Makrophagen werden durch TNF-α zu erhöhter Zytotoxizität und zur Freisetzung von IL-1, Prostaglandinen, M-CSF, GM-CSF und anderen Mediatoren stimuliert (Bachwich et al . , 1986). Neutrophile Granulozyten werden durch TNF-α zu verstärkter Phagozytose und verstärkter Freisetzung von Lysozymen und Sauerstoffradikalen aktiviert (Klebanoff et al . ,
1986; Yi und Ulich, 1992) . TNF-α aktiviert auch
T-Lymphozyten zu erhöhter Expression von IL-2 und TNF-α Rezeptoren, HLA-DR Antigenen und zur Freisetzung von Interferon-γ (Scheurich et al . , 1987).
TNF-α bewirkt auch eine gesteigerte Adhärenz von Entzündungs- und Immunzellen. Dabei spielen die chemotaktische Aktivität von TNF-α bzw. der durch ihn induzierten Mediatoren (wie IL-8) , sowie eine Stimulierung der Expression einer Reihe von Adhäsionsmolekülen (CDU, ELAM; ICAM) und von HLA-Antigenen eine wichtige Rolle (Collins et al . , 1986; Renard et al . , 1994; Westerman et al . , 1999).
TNF-α zeigt auch eine direkte zytotoxische Wirkung auf verschiedene Tumorzelllinien (Sugarman et al . , 1985, Kircheis et al . 1992a).
Die Antitumoraktivität wurde vorwiegend in Tierversuchen demonstriert. Es konnten nach Injektion von TNF-α ausgeprägte hämorrhagische Tumornekrosen in verschiedenen Transplantationstumoren in Mausmodellen gezeigt werden (Old, 1985; Van de Wiel et al . , 1989; Kircheis et al . , 1992a). Allerdings waren ausgeprägte therapeutische Effekte erst nach Applikation hoher
TNF-α-Dosen sichtbar, während zu geringe Dosen kaum Effekte zeigten (Van de Viel et al . , 1989; Kircheis et al . , 1992a). Bald wurde sichtbar, dass die für therapeutische Effekte benötigten hohen TNF-α-Dosen mit ausgeprägten systemischen Toxizitäten verbunden sind, die von akuter Lebertoxizität (Bradham et al . , 1998; Künstle et al . , 1999) bis hin zum Schocksyndrom mit letalem Ausgang reichten (Natanson et al . , 1989; Kircheis et al . , 1992a, b) . Der Grund dafür liegt darin, dass TNF-α in hohen Dosen nicht nur zu Tumornekrosen führt, sondern gleichzeitig auch der zentrale Mediator des Endotoxinschocks ist (Beutler et al . , 1985; Hirota und Ogawa, 1999; Murphey et al . , 2000). Im Gegensatz zur lokal begrenzten Tumornekrose kommt es beim Endotoxinschock zur systemischen Freisetzung großer
Mengen von TNF-α. Das führt zum Ausfall einer Reihe von Regulationsfunktionen des Organismus und hat lebensbedrohliche Zustände wie Hypotension, Fieber, metabolische Azidose, disseminierte intravaskuläre Koagulopathien, sowie den Ausfall der Funktionen von Nieren, Leber und Lunge zur Folge (Lenk et al . , 1989; Kline et al . , 1999; Mori et al . , 1999; Ter 1998).
Die Pathogenese verläuft dabei über Mechanismen ganz analog zu denen, die auch der lokalen
Entzündungsreaktion bzw. hämorrhagischen Tumornekrose zugrunde liegen, mit dem Unterschied, dass diese Reaktionen hier nicht lokal begrenzt sind, sondern systemisch ablaufen (Beutler und Cerami, 1986;
Bendtzen, 1988; Kircheis, 1991) ; sie umfaßt ausgedehnte Koagulopathien, diffuse Kapillartrombose, Austritt größerer Mengen Flüssigkeit, Proteine und Elektrolyten aus dem Blut in die Gewebe (Jahr et al . , 1996; Hirota und Ogawa, 1999) . Potenziert werden diese Störungen der Hämodynamik durch verringerte Blutversorgung und gestörten Stoffwechsel und damit verringerter Leistung des Herzens (Natanson et al . , 1989; Kline et al . , 1999) . Die Folge sind Hypotonie, Ausfälle lebensnotwendiger Organe, allgemeine Störung des Metabolismus, potenziert noch durch sekundär freigesetzte Katecholamine. Geringe Mengen TNF-α gelangen auch ins Gehirn und induzieren über eine Stimulierung der Prostaglandinsynthese im Thermoregulationszentrum des Hypothalamus Fieber (Dinarello et al . , 1986; Bendtzen, 1988).
Weitere Tierversuche zeigten, dass TNF-α-Dosen mit ausgeprägter Antitumorwirksamkeit bereits deutliche Toxizität aufweisen, und dass selbst in der relativ TNF-α-resistenten Maus nur ein schmaler Abstand zwischen therapeutisch wirksamer Dosis und letaler Dosis besteht, so dass eine systemische Behandlung mit TNF-α in vielen Fällen keinen signifikanten therapeutischen Nutzen hatte (Kircheis et al . , 1992a; Kircheis et al . , 1992b). Zusätzlich zur akuten
TNF-α-bedingten Schocksymptomatik zeigte sich, dass es bei permanenter Sekretion von TNF-α in den Blutkreislauf zu Störungen des Fettstoffwechsels kommt (über die Hemmung von Schlüsselenzymen wie der Lipoproteinlipase) , die im äußersten Fall zur
Auszehrung (Kachexie) führen (Beutler et al . , 1986).
Trotz akuter und chronischer TNF-α-bedingter Toxizität konnten in einigen ausgewählten ModellSystemen nach einer Behandlung mit TNF-α ausgeprägte hämorrhagische Tumornekrosen mit anschließenden Tumorregressionen festgestellt werden.
Die in einigen Fällen beobachteten hämorrhagisehen Tumornekrosen führten zu etlichen klinischen Studien für die Anwendung von TNF-α zur Behandlung maligner Tumore. Studien an Krebspatienten zeigten jedoch bald, dass eine systemische Anwendung von TNF-α bei geringem therapeutischen Effekt starke Nebenwirkungen aufweist (Creaven et al . , 1889; Lenk et al . , 1989; Otto et al . , 1990; Renard et al . , 1994, 1995). Dabei waren vor allem akute toxische Effekte wie Hypotension, Störungen der Hämodynamik und Lebertoxizität kritisch, während Kachexie aufgrund der kurzen Halbwertzeit von exogen appliziertem TNF-α im Blutkreislauf sich nur bei
Langzeitinfusionen als problematisch erwies (Sherman et al . , 1988). Durch die Limitierung in den TNF-α-Dosen aufgrund der hohen Toxizität sowie aufgrund der kurzen
Zirkulationszeiten von TNF-α im Blut nach systemischer Applikation waren die TNF-α-Dosen, die letztlich in den Tumor gelangten, meistens zu gering, um dort therapeutisch wirksame Antitumoreffekte zu induzieren.
Diese Studien zeigten mit aller Deutlichkeit, dass es für eine effektive klinische Anwendung erforderlich ist, die Toxizität von TNF-α zu verringern und die Antitumoraktivität zu erhöhen (Haranaka, 1988; Kircheis, 1991). Versuche, die Toxizität und
Antitumoraktivität durch Modifikationen am TNF-α Molekül voneinander zu trennen, waren wenig erfolgreich (Kircheis et al . , 1992a). Der Grund dafür sind einerseits die breite Expression der Rezeptoren für
TNF-α auf vielen Normalgeweben (Brockhaus et al . , 1990) , andererseits der Umstand, dass den Antitumoreffekten, wie Entzündungsreaktionen und hämorrhagischer Tumornekrose, und dem TNF-α-bedingten Schocksyndrom dieselben pathophysiologischen Mechanismen zugrunde liegen (Beutler und Cerami , 1986; Bendtzen, 1988; Kircheis, 1991; Anderson et al . , 1994; Edwars et al . , 1992; Ferrero et al . , 1996; Renard et al., 1994, 1995; Westermann et al . , 1999; Yi und Ulich, 1992). Wenngleich die Empfindlichkeit der Kapillaren im Tumorgebiet größer ist als die der Kapillaren im Normalgewebe, dürfte aufgrund der Vielzahl der durch TNF-α geschädigten Normalgewebe und lebensnotwendigen Organe der erwünschte therapeutische Effekt durch unerwünschte toxische Nebenwirkungen zumindest aufgewogen werden.
Damit erscheint es für eine therapeutische Anwendung von TNF-α erforderlich zu sein, Antitumoraktivität und systemische Toxizität zu trennen, indem die größtmögliche Lokalisierung bzw. Fokussierung der TNF-α Effekte auf den Tumor angestrebt wird. Durch lokale
Applikation von TNF-α direkt in Tumore war man in einigen Fällen in der Lage, sichtbare Antitumoreffekte ohne größere systemische Toxizitäten zu induzieren (Jakubowski et al . , 1989; Pfreundschuh et al . , 1989; Van der Veen et al . , 1999). Allerdings sind die Möglichkeiten einer direkten Applikation in den Tumor in der Praxis stark eingeschränkt, besonders im Falle von Tumoren bzw. Metastasen in inneren Organen. Bei metastasierenden Tumoren könnte eine derartige Behandlung nur dann erfolgreich sein, wenn alle Metastasen einer direkten Applikation zugänglich sind. Eine besondere Applikationsart stellt die sogenannte "isolated limb perfusion" dar, bei der die Blutversorgung ganzer, von Tumoren bzw. Metastasen befallener Gliedmaßen für eine gewisse Zeit von der systemischen Blutversorgung abgekoppelt wird. Diese kurzzeitige separate Blutversorgung der Gliedmaßen ermöglicht es, höhere, für einen therapeutischen Effekt ausreichende TNF-α-Dosen zu applizieren und die toxischen Nebenwirkungen auf einen relativ geringen Teil des Organismus (das entsprechende Glied) einzuschränken (Eggermont et al . , 1996a, 1996b; Bickels et al., 1999; Vrouenraets et al . , 1999). Der Vorteil bei dieser Applikation besteht vor allem darin, dass lebenswichtige TNF-α-sensitive Organe wie Leber und Lunge von einer direkten TNF-α-Wirkung größtenteils verschont bleiben. Trotz der größtmöglichen Aussparung der inneren Organe vor einem direkten TNF-α Effekt können auch bei dieser Applikationsform die TNF-α-Dosen nicht beliebig hoch angesetzt werden, weil es auch in diesem Fall zum Austritt einer gewissen Menge an TNF-α in den systemischen Blutkreislauf kommt (Stam et al . 2000) . Außerdem wird die maximal applizierbare Dosis limitiert durch die Toxizität gegenüber dem Normalgewebe in den Gliedmaßen, wie Kapillarvaskularsystem, Muskeln, usw.. Es wurde versucht, durch eine Kombination von TNF-α mit IFNγ, sowie dem Zytostatikum Melphalan die therapeutische Effizienz dieser Applikationsform zu erhöhen (Eggermont et al., 1996a, 1996b; Lienard et al . , 1999; Oliemann, 1999) . Wichtigster Nachteil dieser Applikationsart ist ihre limitierte Einsetzbarkeit auf begrenzte Tumorlokalisationen (in den Gliedmaßen) .
In den meisten Fällen metastasierender Tumorerkrankungen jedoch sind Patienten mit
Tumormetastasen auch an schwer bzw. nicht zugänglichen Lokalisationen bzw. mit einer Vielzahl von breit gestreuten Metastasen zu behandeln, die nur über die Blutbahn (oft sogar lediglich über den systemischen Blutkreislauf) erreichbar sind.
Neben TNF-α wurden die mit ihm verwandten Zytokine TNF-ß, IL-1 und IL-6, für die Tumortherapie in Betracht gezogen. TNF-ß, oder Lymphotoxin, ist evolutionär sowie funktioneil eng verwandt mit TNF-α (Granger et al . , 1968). TNF-α (157 Aminosäuren) und TNF-ß
(171 Aminosäuren) haben 50% Homologie auf der
Aminosäurenebene) (Gray et al . , 1984). Während TNF-α hauptsächlich von aktivierten Monozyten oder
Makrophagen sezerniert wird, wird TNF-ß hauptsächlich von NK-Zellen, T- , B-Lymphozyten sezerniert. TNF-α und TNF-ß binden an dieselben Rezeptoren (Hohmann et al . , 1990) und haben ein fast identisches Wirkungsspektrum (Gray et al . , 1984; Kramer et al . 1986; Kircheis et al . , 1992b) . Das Wirkungsspektrum von TNF-α weist noch mit zwei weiteren Zytokinen größere Überlappungen auf, nämlich mit Interleukin-1 und Interleukin-6 (Bendtzen,
1988) . Ebenso wie mit TNF-α handelt es sich bei IL-1 und IL-6 um Entzündungsmediatoren, die gleichfalls auch auf Endothelzellen, Makrophagen, I munzellen wirken.
IL-1 induziert ebenfalls wie TNF-α Fieber im Hypothalamus und beide Zytokine können als Mediatoren eine Rolle im Schocksyndrom spielen (Bentzen, 1988; Yi und Ulich, 1992; Mori et al . , 1999; Hirota und Ogawa, 1999) . Die direkte Antitumoraktivität von IL-1 und IL-6 ist, bei ähnlichen proentzündlichen und immunstimulierenden Aktivitäten, schwächer als diejenige von TNF-α, ebenso ist die Induktion von hämorrhagischen Tumornekrosen durch diese beiden
Zytokine weniger typisch. Die mit der systemischen
Anwendung der mit TNF-α verwandten Zytokine TNF-ß, IL-1 und IL-6 verbundenen Probleme treten aufgrund des ähnlichen bzw. mit TNF-α überlappenden WirkungsSpektrums auch bei diesen Zytokinen auf.
Die direkte Verabreichung von TNF-α bzw. der mit TNF-α verwandten Zytokine TNF-ß, IL-1 und IL-6 ist im allgemeinen nur möglich, wenn die Erkrankung auf einen Primärtumor beschränkt und wenn dieser Tumor direkt der Applikation zugänglich ist. In den meisten Fällen handelt es sich jedoch bei den zu behandelnden Erkrankungen um metastasieriende Tumoren, die zum Großteil in den visceralen Organen lokalisiert und daher nicht direkt zugänglich sind. In diesen Fällen sind die Tumore für Behandlung mit dem wirksamen
Protein nur über eine systemische Administrationsroute zugänglich. Bei den Proteinen ist diese Applikation jedoch, wie bereits ausgeführt wurde, mit einer systemischen Toxizität verbunden. Außerdem sind aufgrund der kurzen Halbwertszeiten der therapeutisch wirksamen Proteine im Blut die letztlich am Tumor selbst verfügbaren Konzentrationen zu niedrig, um die erwünschten therapeutischen Effekte hervorzurufen.
Als Alternative wurde daher vorgeschlagen, statt der Proteine die dafür kodierenden DNS-Moleküle zu verabreichen, wobei es entscheidend ist, dass die Expression des Proteins, unter Ausschaltung von toxizitätsgefährdeten Normalgeweben, möglichst ausschließlich am Zielort, nämlich am Tumor, erfolgt. Es wurden bereits verschiedene Ansätze für die zielgerichtete Genexpression in Tumoren vorgeschlagen, z.B. Targeting des TNF-α-Gens mittels einem Konjugat aus einem synthetischen TNF-α-Gen und einem Antikörper gegen ein vermehrt auf Tumorzellen exprimiertes Zelloberflächenprotein, z.B. einem anti- Transferrinrezeptor-Antikörper (Hoogenboom et al . , 1991) , oder mittels eines in fusogene Liposomen inkapsulierten TNF-α-Gens (Mizuguchi et al . , 1998). Alternativ wurde vorgeschlagen, eine zielgerichtete
Expression von TNF-α mit Hilfe eines gewebs- und zellzyklusspezifischen Promotors zu erwirken (Jerome und Muller, 1998) .
Bei der Therapie mittels DNS führt unter normalen Bedingungen die Applikation von ungeschützter DNS, z.B. in Form eines Plasmids, in den Blutkreislauf jedoch zu einer rapiden Inaktivierung und dem Abbau der DNS. Einer der Ansätze, die DNS vor zu raschem Abbau zu schützen, besteht in der Komplexierung der DNS mit positiv geladenen Polykationen (Boussif et al . , 1995; Abdallah et al . , 1996; Goula et al . , 1998), oder, alternativ, kationischen Lipiden (Song et al . , 1997; Liu et al., 1997; Li und Huang, 1997; Templeton et al . , 1997; Liu et al . , 1997; Lee et al . , 1996). Durch Kondensierung der DNS durch das Polykation werden kompakte partikuläre DNS-Komplexe gebildet, die die DNS weitgehend vor Abbau schützen und die Aufnahme in die Zellen erleichtern. Eine effektive, i.e. möglichst vollständige Kondensierung der DNS erfolgt jedoch im allgemeinen bei einem Überschuss an Polykation im Vergleich zur DNS, d.h. bei einem Überschuss an positiver Ladung (Boussif et al . , 1995; Liu F, 1997; Liu Y, 1997) . Der resultierende DNS-Komplex ist demzufolge ebenfalls positiv geladen. Neben seiner
Bedeutung für die Kondensierung der DNS ermöglicht die positive Ladung auch die Bindung des DNS-Komplexes an negativ geladene Strukturen an der Zelloberfläche (über elektrostatische Adsorption) und die darauffolgende Aufnahme des DNS-Komplexes durch adsorptive Endozytose. Die positive Ladung der Polykation/DNS Komplexe stellt jedoch ein ernstes Problem für die systemische Applikation in vivo dar, da sie auch zu einer breiten
Palette an unspezifischen elektrostatischen Wechselwirkungen mit Blutkomponenten, extrazellulärer Matrix und Nicht-Targetzellen führt (Plank et al . , 1996; Ogris et al . , 1999; Kircheis und Wagner, 2000). Bei einer Applikation in vivo führt dies unweigerlich zur Erkennung durch das KomplementSystem (Plank et al . , 1996) sowie durch das retikuloendotheliale System (Gregoriadis, 1988; Mahato et al . , 1995), gefolgt von rascher Inaktivierung und Abbau. Darüberhinaus führt die unspezische Aufnahme in Nicht-Targetzellen zu ungewollter, unkontrollierter Genexpression, verbunden mit unkontrollierten biologischen Effekten und Toxizität (Kircheis et al . , 1999).
Die systemische Applikation von Polykation/DNS Komplexen, in denen die positive Ladung nicht abgeschirmt ist, führt, wie an Hand des Luciferase- Reportergens gezeigt wurde, zu unspezischer
Genexpression in verschiedenen lebenswichtigen Organen, hauptsächlich Lunge, Leber, sowie zu Toxizität, die in den schwersten Fällen zur akuten Lungenembolie und zum Tode führten (Kircheis et al . , 1999). Die in in vi tro Assays gezeigten unspezifischen Interaktionen von positiv geladenen Polykation/DNS Komplexen mit Plasmaproteinen, wie Fibrinogen und dem Komplementsystem, sowie die Aggregation von Erythrozyten dürften unter anderem für diese toxischen Effekte in vivo verantwortlich sein (Ogris et al . ,
1999; Kircheis et al . , 1999; Kircheis und Wagner, 2000) . Wird das biologisch als inert einzustufende
Luziferase-Reportergen durch ein TNF-α-kodierendes Gen ersetzt, ist mit einer Potenzierung der Toxizitäten aus Gentransfer-bedingter Toxizität und TNF-α-vermittelter Toxizität zu rechnen, wobei sich darüber hinaus noch die hohe Genexpression in Lunge und Leber besonders ungünstig erweisen dürfte, da diese Organe besonders sensitiv gegenüber TNF-α-vermittelter Toxizität sind (Lenk et al . , 1989; Bradha et al . , 1998; Künstle et al., 1999; Mori et al . , 1999).
Es wurde bereits versucht, die positive Oberflächenladung von Polykation/DNS Komplexen, die durch physikalische Messung des Zetapotenzials (Müller RH, 1996) bestimmt werden kann, sowie die daraus resultierenden unspezifischen Interaktionen mit Hilfe einer Polyethylenglykol-Hülle abzuschirmen (Ogris et al., 1999; Kircheis et al . , 1999; WO 98/59064).
Darüberhinaus wurde von Dash et al . , 2000, eine Methode beschrieben, Polylysin/DNS-Komplexe mittels eines Polymethacrylpolymers (pHPMA) abzuschirmen.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die bei der systemischen Anwendung von DNS in der Therapie von Tumorerkrankungen auftretenden Probleme, insbesondere das Problem der unspezischen Expression in Normalgewebe und die damit gegebenenfalls verbundene
Toxizität, z.B. im Fall von TNF-α, zu beseitigen, indem ein neues Verabreichungssystem für DNS bereitgestellt wird.
Bei der Lösung der gestellten Aufgabe wurde von der Überlegung ausgegangen, im Hinblick auf die therapeutische Wirkung von therapeutisch wirksamen Proteinen mit zytotoxischer Aktivität, insbesondere TNF-α und/oder der mit TNF-α verwandten Zytokine TNF-ß, IL-1 und IL-6, nach der Applikation der für diese Zytokine kodierenden DNS in die Blutbahn bzw. über den systemischen Blutkreislauf die Genexpression und die daraus resultierenden Zytokin-vermittelten Effekte zielgerichtet, d.h. spezifisch auf das Tumorgewebe, unter größtmöglicher Aussparung der Normalgewebe, zu bewirken. Diese zielgerichtete Ausrichtung auf das Tumorgewebe wird im folgenden als "Tumor Targeting" bezeichnet .
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Komplex für die Behandlung von Tumorerkrankungen mittels systemischer Applikation von DNS, enthaltend, in exprimierbarer Form, ein oder mehrere DNS-Moleküle, kodierend für ein oder mehrere therapeutisch wirksame Proteine mit zytotoxischer Aktivität, und ein Polykation, das die DNS kondensiert und ganz oder teilweise mit Transferrin konjugiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex eine Oberflächenladung aufweist, die einem Zetapotenzial von <+15mV, erhalten durch Messung in wässeriger Lösung bei einer Konzentration von >10mM NaCl, entspricht, wobei die Abschirmung der positiven Ladungen im Komplex zu mehr als 50% durch Transferrin erfolgt.
Bevorzugt weisen die Komplexe ein Zetapotenzial von +10mV bis -10 mV, besonders bevorzugt +5 mV bis -5mV auf .
Unter "systemischer Applikation" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung neben der systemischen
Verabreichung über den gesamten Blutkreislauf auch die regionale Anwendung über die den Tumor versorgenden Blutgefäße, mitumfaßt, also jegliche Verabreichung, die nicht direkt in den Tumor, sondern über die Blutbahn erfolgt.
Unter "zytotoxischer Aktivität" wird eine direkte zytotoxische Wirkung des Proteins verstanden (z.B. wie im Fall von TNF-α) , ebenso aber auch eine indirekte, wie sie z.B. durch die durch das Protein mit enzymatischer Aktivität bewirkte Freisetzung einer zytotoxischen Substanz aus einem nicht-toxischen Substrat hervorgerufen wird, was der Wirkung der sog. "Selbstmordgene" entspricht.
Das Zetapotenzial kann mit Hilfe von Standardmethoden bestimmt werden, z.B. wie von Müller RH, 1996, beschrieben.
Bevorzugt kodiert die DNS für TNF-α und/oder für TNF-ß und/oder IL-1 und/oder IL-6, wobei TNF-α besonders bevorzugt ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind ferner DNS-Moleküle, kodierend für andere Proteine mit Antitumorwirksamkeit und zytotoxischer Aktivität, geeignet, z.B. ausgewählt aus der Gruppe der Zytokine IFN-α, IFN-γ, oder Toxine, wie das Diphterietoxin (Massuda et al., 1997); ferner sog. Selbstmordgene (Aghi et al., 2000), die in Kombination mit dem Substrat zur Anwendung kommen, wie das Herpes Simplex Thymidinkinase- Gen (mit Ganciclovir; Nagamachi et al., 1999), das Cytochrom P450 (mit Cyclophosphamid) (Aghi et al., 2000) , oder das Linamarase-Gen (mit Linamarin; Cortes et al., 1998) . Die für zytotoxische Anti-Tumor-Proteine kodierenden DNS-Moleküle können einzeln oder in Kombination zur Anwendung kommen, z. B. ein TNF-α-Plasmid in Kombination mit einem Plasmid, kodierend für ein Selbstmordgen, z.B. das Thymidinkinasegen.
Die für ein Protein mit zytotoxischer Aktivität kodierende DNS kann mit einem oder mehreren weiteren DNS-Molekülen kombiniert werden, die für ein Protein mit Anti-Tumoraktivität kodieren, z.B. für ein immuntherapeutisch wirksames Zytokin wie Interleukin-2 oder Interferon-gamma, für ein apoptoseinduzierendes Protein, wie p53 (Xu et al., 1999) oder Apoptin, für eine Caspase, für FasL (FasLigand) (Gajate et al . , 2000) oder für Inhibitoren der Neoangiogenese im Tumor, wie Endostatin (O'Reilly et al., 1997); Angiostatin
(Griscelli et al., 1998), oder Kringle 1-5 (Cao et al., 1999) .
Das Expressionsplasmid muss die Anforderung erfüllen, dass es in Säugetierzellen exprimierbar ist. Vorzugsweise enthält es einen starken Promotor, z.B. den CMV-Promotor oder den SV-40-Promotor, der die für die therapeutische Wirkung erwünschte starke Expression gewährleistet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können Expressionsplasmide verwendet werden, die eine tumorspezifische Expression gewährleisten, z.B. unter Verwendung eines tumorspezifischen, zellzyklusspezifischen oder gewebsspezifischen Promotors, oder mittels Hypoxie- responsiver Elemente; des weiteren sind physikalisch (durch Strahlung) oder chemisch (z.B. durch
Tetrazyklin) induzierbare regulatorischer Elemente (Jerome, et al., 1993;, Dachs et al.,1997) geeignet. Im Fall der Anwendung mehrerer Proteine enthält der Komplex bevorzugt mehrere Expressionsplasmide, kodierend für jeweils ein einziges therapeutisches Protein.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist der für das therapeutische Protein kodierenden DNS-Sequenz eine Leader-Sequenz vorgeschaltet, die die Sekretion des Proteins ermöglicht. Beispiele für geeignete Leadersequenzen sind Typl- bzw. TypII Leadersequenzen, z.B. im Falle von TNF-α die endogene TNF-α TypII Leader-Sequenz (Utsumi et al . , 1995). TypII- Leadersequenzen bestehen typischerweise aus einem zytoplasmatischen Teil, einer Transmembran-Domäne und einer Linker-Domäne, die an das reife Protein angrenzt. Im Fall von TNF- α ist die endogene pro-TNF- α Leader- Sequenz 76 Aminosäuren lang; ihre Verwendung bedingt, dass die transfektierten Zellen die pro-TNF- α Form richtig prozessieren können.
Alternativ zu einer TypII-Leadersequenz kann der kodierenden Sequenz eine andere die Sekretion des Proteins bewirkende Leader-Sequenz vorgeschaltet werden, z.B. eine humane Typl Immunglobulin-Leader- Sequenz . Die Typl Leader-Sequenzen, die für zahlreiche Proteine beschrieben sind (von Heijne, 1983), sind sekretorische Leader mit einer Länge von meistens 18-23 Aminosäuren. Diese Leader-Sequenzen vom Typl bewirken die Bindung der Proteine an das endoplasmatische Retikulum, wo die Proteine anschliessend unter Abspaltung des Leaders durch die Membran transportiert werden. Beispiele für im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Leader-Sequenzen sind z.B. Immunglobulin Leader-Sequenzen, wie Acc.No. AF174024.1, welche in der Kabat Datenbank beschrieben sind, oder synthetische Immunglobulin Leader, bestehend aus einer Konsensus-Leader-Sequenz abgeleitet von oben beschriebenen Immunglobulin-Leader-Sequenzen.
Die Verwendung einer endogenen Leader-Sequenz von TypII hat den Vorteil, dass die Sekretion in geringerem, gegebenenfalls verzögerten Ausmaß als bei Typl Leader- Sequenzen erfolgen kann, was insbesondere im Fall eines toxischen Proteins von Vorteil ist. In Fällen, in denen eine hohe toxische Konzentration benötigt wird, können Typl Leader-Sequenzen den TypII Leader-Sequenzen überlegen sein.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind sämtliche Polykationen geeignet, die im Komplex die Funktion erfüllen, die negative Ladung der Plasmid-DNS auszugleichen und die Plasmid-DNS zu kompakten Partikeln zu kondensieren.
Beispiele für Polykationen sind Polyethylenimine, (PEI) , homologe polykationische Polypeptide wie Polylysin, Polyarginin, Histone, Spermine, Spermidine, kationische Lipide, Dendrimere, (Boussif et al . , 1995; Abdallah et al., 1996; Goula et al . , 1998 a,b; Haensler, et al., 1993; Kukowska-Latallo, et al., et al. 1996; Lee, et al., 1996; Li, et al. 1997; Liu, et al., 1997; Feigner, et al., 1994; Fritz, et al., 1996; Schwartz, et al., 1995; Tang, et al., 1996; Thurston, et al., 1998; Van de Wetering, et al., 1998; Wagner, et al., 1990; Wagner, et al., 1991).
Bevorzugt enthält der erfindungsmäße Komplex als Polykation ein Polyethylenimin (PEI) .
Das PEI kann eine lineare oder verzweigte Struktur aufweisen, der Molekulargewichtsbereich kann über einen weiten Bereich schwanken, nämlich zwischen ca. 0.7 kDa und ca. 2000 kDa, vorzugsweise ca. 2 kDa bis ca. 50 kDa.
Größere PEI-Moleküle bewirken oft eine stärkere Kondensierung der DNS und ergeben nach Komplexierung mit DNA bereits bei niedrigeren N/P Verhältnissen ein Optimum der Transfektionseffizienz, sie resultieren im allgemeinen in einer sehr guten Transfektionseffizienz, können aber auch mit stärkerer Toxizität assoziiert sein. Kleinere Moleküle, von denen pro vorgegebener DNS-Menge eine größere Menge zur Komplexierung erforderlich ist, haben, bei eventuell geringerer Effizienz, den Vorteil einer geringeren Toxizität. Welches PEI-Molekül im einzelnen verwendet wird, kann in Vorversuchen ermittelt werden.
Besonders bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind PEI-Moleküle in einem mittleren Molekulargewichtsbereich zwischen 2000 D und 800000 D.
Beispiele für kommerziell erhältliches PEI mit unterschiedlichen Molekulargewichten, das im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet ist, sind PEI 700 D, PEI 2000 D, PEI 25000 D, PEI 750000 D (Aldrich) , PEI 50000 D (Sigma), PEI 800000 D (Fluka) . Von BASF wird PEI unter dem Markennamen Lupasol® ebenfalls in verschiedenen Molekulargewichten angeboten (Lupasol® FG: 800 D; Lupasol® G 20 wasserfrei: 1300 D; Lupasol® WF: 25000 D; Lupasol® G 20: 1300 D; Lupasol® G 35: 2000 D; Lupasol® P: 750000 D; Lupasol® PS: 750000 D; Lupasol® SK: 2000000 D) .
Bevorzugt ist das an das Polykation gekoppelte Transferrin, welches sowohl als Ligand für die Zellbindung als auch zur Abschirmung unspezifischer Wechselwirkungen mit Nicht-Targetzellen bzw. Nicht- Targetstrukturen dient, humanes Transferrin (Wagner et al., 1993; Kircheis et al . , 1997).
Das Transferrin kann an das Polykation auf konventionellem Weg gekoppelt werden, z.B. wie in der EP 388 758 oder WO 92/19281 für die Herstellung von Transferrin-Polykation-Konjugate beschrieben.
Zur Festlegung der Komplexzusammensetzung wird zweckmäßig wie folgt vorgegangen: Ausgehend von einer definierten DNS-Menge, die z.B. in Form eines Reportergenplasmids (Luciferase-, beta-gal-Plasmid) vorliegt, wird die Menge an zugesetztem Polykation in
Serienversuchen titriert, und zwar im Hinblick auf eine optimale Kondensierung der DNS in kompakte Partikel, maximale Transfektionseffizienz in Tumorzellen und minimale Zytotoxizität .
Im Falle der Verwendung von PEI als Polykation wird das Verhältnis von DNS zu PEI im folgenden durch die Angabe des molaren Verhältnisses der Stickstoffatome im PEI zu den Phosphatatomen in der DNA angegeben (N/P-Wert bzw. N/P-Verhältnis) ; ein N/P-Wert von 6.0 entspricht einer Mischung von 10 μg DNA mit 7,5 μg PEI. Im Falle von freiem PEI ist unter physiologischen Bedingungen nur etwa jedes sechste Stickstoffatom protoniert. Ergebnisse mit DNA/PEI-Transferrin-Komplexen zeigen, dass diese bei einem N/P-Verhältnis von 2 bis 3 annähernd elektroneutral sind.
Der N/P-Wert der Komplexe kann über einen breiten Bereich schwanken, er kann im Bereich von etwa 0.5 bis etwa 100 gelegen sein. Bevorzugt beträgt das N/P-Verhältnis etwa 2 bis etwa 20, besonders bevorzugt beträgt das Verhältnis 4 bis 10.
Im einzelnen kann der N/P-Wert für den speziellen Anwendungsfall, z.B. für den zu transfizierenden Zelltyp, durch Vorversuche ermittelt werden, indem unter ansonsten identischen Bedingungen das Verhältnis erhöht wird, um das im Hinblick auf die Transfektionseffizienz optimale Verhältnis festzustellen und einen für die Zellen toxischen Effekt auszuschließen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die Effizienz von Komplexen, die lineares PEI mit einem Molekulargewicht von 22kDa und verzweigtes PEI mit einem Molekulargewicht von 25kDa enthalten, gezeigt.
Die Formulierung des erfindungsgemäßen Komplexes ist ferner so gewählt, dass die positive Ladung des
Polykation-Transferrin/DNS-Komplexes zu einem großen
Teil, entsprechend dem Zetapotenzial von <+15mV, vom hohen Transferrinanteil im Polykation-Konjugat abgeschirmt wird. In Abstimmung auf das jeweilige Polykation wird das Mengenverhältnis Transferrin/Polykation bestimmt, indem mittels Serienversuchen bei gegebenem DNS/Polykationverhältnis die Menge an konjugierten Transferrin-Polykation-Konjugat mit unterschiedlichem Polykation/Transferrin-Verhältnis in Serienversuchen titriert wird, und zwar im Hinblick auf eine optimale Kondensierung der DNS in kompakte Partikel, maximale Transfektionseffizienz in Tumorzellen und minimale Zytotoxizität . Ein wesentlicher Parameter für die Wahl des Polykation/Transferrin-Verhältnisses ist die Abschirmung der Oberflächenladung des Komplexes durch das im Konjugat enthaltene Transferrin, entsprechend einem Zetapotenzial von <+15mV.
Das Verhältnis Transferrin: Polykation im letztlich erhaltenen Transfektionskomplex beträgt bevorzugt 3:1 bis 1:4 (w/w) .
Der Anteil von nicht Transferrin-konjugiertem Polykation ("freies Polykation") im Komplex ist abhängig vom Molekulargewicht des Polykations und kann im Bereich zwischen 0% und 95% (molares Verhältnis) des Gesamtpolykationengehalts liegen .
Je kleiner das Polykationmolekül ist, desto eher ist eine Verdünnung mit freiem Polykation zweckmäßig. Beispielsweise ist bei Einsatz von PEI 800kDa, z.B. bei Verwendung des Konjugats Tf8PEI800kDa (Konjugat mit molarem Verhältnis von 8 Transferrinmolekülen pro PEI-Molekül, verzweigt, mit durchschnittlichem Molekulargewicht 800kDa, siehe Kircheis et al., 1997) kein zusätzliches freies PEI erforderlich, während bei Einsatz von Tf-PEl25kDa (Konjugat mit einem molaren Verhältnis Transferrin: PEI=1, verzweigt, mit durchschnittlichem Molekulargewicht von 25kDa, siehe vorliegende Erfindung) eine Verdünnung mit 2-10 fachen Mengen an PEI25 oder PEI22 zweckmäßig ist (besonders bevorzugt Verdünnung mit 3-5 facher Menge an PEI25 oder PEI22) .
Das molare Verhältnis konjugiertes Polykation: freies Polykation beträgt bevorzugt etwa 1:0 bis 1:20.
Das mit Transferrin konjugierte Polykation kann identisch mit dem gegebenenfalls im Komplex vorhandenen freien Polykation sein, die Polykationen können aber auch verschieden sein.
Weitere Anforderungen an den Komplex sind eine gute Verträglichkeit bei der Applikation in den systemischen Blutkreislauf (auch bei Versuchstieren, z.B. tumortragenden Mäusen) , maximale Genexpression im Tumor bei möglichst geringer Expression in lebenswichtigen Normalgeweben wie Leber, Lunge, Niere, Milz, und Herz.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die positive Ladung zur Gänze durch den hohen Transferrinanteil des Konjugats abgeschirmt. Für den Fall, dass Transferrin nur zum überwiegenden Teil für die Abschirmung verantwortlich ist, ist folgendes zu berücksichtigen: Wenngleich der Hauptanteil der Abschirmung (>50%) der positiven Ladung des Komplexes durch den hohen Transferrinanteil des Konjugats erfolgt, kann, zu einem geringeren Anteil, die Verringerung des Zetapotenzials auch durch spezifische Anpassung anderer Komplexparameter bewirkt werden, z.B. durch Verringerung des N/P Verhältnisses oder Inkorporierung negativ geladener Moleküle in die Formulierung, z.B. negativ geladener fusogener Peptide, wie sie z.B. in der WO 93/07283 beschrieben sind (derartige Peptide haben gleichzeitig die Wirkung, die Freisetzung der Komplexe aus den Endosomen zu bewirken, vgl . den nächsten Absatz) .
Weitere Substanzen, die im Komplex enthalten sein können, um - neben Transferrin - einen Anteil der
Abschirmung der positiven Ladung zu übernehmen, sind hydrophile Polymere, z.B. Polyethylenglykole (PEG), Polyvinylpyrollidone, Polyacrylamide, Polyvinylalkohole, oder Copolymere dieser Polymere. Bevorzugt als hydrophiles Polymer ist PEG. Das Molekulargewicht des hydrophilen Polymeren beträgt im allgemeinen etwa 1000 bis etwa 40000 Da, vorzugsweise werden Moleküle mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 40000 D eingesetzt.
Vorzugsweise ist das hydrophile Polymer, vorzugsweise PEG, an das Polykation, insbesondere PEI, kovalent gebunden. Die kovalente Bindung erfolgt entweder durch Konjugation mit dem freien Polykation, insbesondere PEI, oder durch Inkorporierung in das Transferrin-PEI Konjugat. In letzterem Fall ist das hydrophile Polymer zwischen Transferrin und dem Polykation angeordnet; ein solches Molekül wird erhalten, indem ein bifunktionelles Polymer, das an beiden Molekülenden unterschiedliche reaktive Gruppen aufweist, eingesetzt und einerseits mit Transferrin und andererseits mit dem Polykation reagieren gelassen wird. Beispiele für solche bifunkionelle Polymere sind z.B. PEGs, wie sie bisher für die Kreuzvernetzung unterschiedlicher Makromoleküle verwendet wurden, z.B. für die Vernetzung von Cofaktor und Apoenzym (Nakamura et al, 1986) , Zielsteuerung polymerer Wirkstoffe (Zalipsky und Barany, 1990) oder PEG-Beschichtung von Oberflächen und Proteinen (Harris et al, 1989) . Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung u.a. verwendbaren bifunktionellen Derivate sind kommerziell erhältlich, sie enthalten Aminogruppen, Hydroxygruppen oder Carbonsäuregruppen an den Molekülenden, z.B. wie von Shearwater Polymers erhältliche Produkte.
Der Beitrag, den diese hydrophilen Polymere an der
Abschirmung der positiven Ladung übernehmen, beträgt unter 50 %, vorzugsweise höchstens 30%.
Der Anteil an Abschirmung durch Transferrin gegenüber den durch andere Faktoren erzielten Abschirmungseffekten kann bestimmt werden, indem das
Zetapotenzial von Komplexen mit mehreren abschirmenden Faktoren jeweils mit oder ohne Transferrin-Anteil gemessen wird, woraus sich der Beitrag von Transferrin aus der Differenz der Zeta-Potenziale ergibt.
Der Komplex kann ferner, im Hinblick auf eine optimale Genexpression, Elemente zur Verstärkung der Freisetzung der DNS Komplexe aus den Endosomen der Zielzelle enthalten, z.B. fusogene Peptide (WO 93/07283), oder Elemente, die die Aufnahme der DNS in den Zellkern verstärken, wie sog. "nuclear-targeting sequences" (Vacik, et al., 1999; Zanta, et al., 1999).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Komplexe. In dieser Zusammensetzung sind die Komplexe bevorzugt aufgenommen in einer isotonen wässerigen Lösung, z.B. in 0.5x HBS (HEPES (20mM) -gepufferter Salzlösung (75mM NaCl) mit 2.5% Glukose, wie in den Beispielen beschrieben. In weiteren bevorzugten Anwendungen werden die Komplexe in wässerigen Lösungen in einem breiten Bereich an Salzkonzentrationen (0-150 mM NaCl), Konzentrationen des HEPES-Puffers (0-1M), als auch mit anderen Puffersystemen (Phosphatpuffer,...) aufgenommen. Die Isotonie der Lösungen kann generell entweder durch einen entsprechenden Salzgehalt (150 mM NaCl = isoton) oder durch einen entsprechenden Zuckergehalt (5% Glukose, oder 10% Saccharose = isoton), oder durch entsprechende Zugaben von Salz und Zucker (z.B. 75 mM NaCl und 2.5% Glukose) erreicht werden.
Im Zuge der durchgeführten Experimente (vgl. Beispiel 10) wurde festgestellt, dass bei einer geringeren Konzentration des Komplexes in der Formulierung bzw. bei einer geringeren Menge an letztlich applizierter Formulierung (vlgl. Beispiel 10 und Beispiel 9 bzw. 8) die geringere Menge an applizierter DNA durch eine erhöhte Salzkonzentration (≥80mM, vorzugsweise ≥lOOmM, insbesondere ≥ 150mM NaCl, wobei die maximale Salzkonzentration ca. IM beträgt) in der Formulierung kompensiert werden kann. Es zeigte sich, dass die Effizienz einer Formulierung, in der die DNA-Menge auf 10% verringert wurde, bei Verdoppelung der Salzkonzentration von 75mM auf 150mM annähernd gleich war wie bei einer Formulierung mit der 10-fach höheren DNA- Menge, die bei niedriger Salzkonzentration gemischt worden war, beide Formulierungen bewirkten eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums (vlg. Beispiel 10 gegenüber Beispiel 8 und 9) .
In einer weiteren Anwendungsform werden die Formulierungen der erfindungsgemäßen Komplexe in wässeriger Lösung tiefgefroren gelagert und vor Anwendung aufgetaut, oder als Lyophilisat gelagert, was eine stabile Lagerung über längere Zeiträume ermöglicht, und vor der Anwendung in einem der beschriebenen Salz-Puffer- Lösungen rekonstituiert.
Im Gegensatz zu Gentransfersystemen, in denen die positive Ladung des Polykations nicht abgeschirmt ist (Zetapotenzial >+20mV) (Goula et al . , 1998b; Song et al., 1997; Liu et al . , 1997; Li und Huang, 1997; Templeton et al . , 1997; Liu et al . , 1997; Lee et al . , 1996) , sind die erfindungsgemäßen Komplexe in der Lage, nach Applikation in den Blutkreislauf die Expression eines therapeutisch wirksamen Gens (z.B. kodierend für
TNF-α) spezifisch in Tumoren zu erzielen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, dass die Verwendung eines TNF-α-kodierenden Expressionsplasmids in einem tumor-zielgerichteten Gentransfersystem in syngenen Tumormodellen in der Maus die für TNF-α typische hämorrhagische Tumornekrose, gefolgt von einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums bewirkt, jedoch ohne das Auftreten einer systemischen TNF-α-vermittelten Toxizität, wie sie von systemischen Applikationen von TNF-α bekannt ist. Es wurde gefunden, dass Inkorporierung einer genügend hohen Menge an Transferrin in den Polykation/DNS Komplex ebenfalls die positive Oberflächenladung abschirmen kann. Durch die Abschirmung der positiven Oberflächenladung kommt es auch zu einer Abschirmung der unspezifischen elektrostatischen Interaktionen. Der Einbau einer genügend hohen Menge an Transferrin inhibiert die Aggregation von Erythrozyten, während nicht-abgeschirmte Polykation/DNS Komplex zu einer starken Erythrozytenaggregation führen.
Systemische Applikation derartiger abgeschirmter Gentransferkomplexe (der Ausdruck "abgeschirmte Komplexe" wird im Folgenden der Einfachheit halber für Komplexe verwendet, in denen die positive Ladung - zum überwiegenden Anteil durch Transferrin - abeschirmt ist) über die Schwanzvene der Maus führt zu einer überwiegenden Genexpression im Tumor (gezeigt am Beispiel des Luziferase-Reportergens) und einer zu vernachlässigbaren Expression in anderen Organen. Im Gegensatz zu nicht-abgeschirmten Gentransferkomplexen wurde keine systemische Toxizität beobachtet.
Versuche mit diesen Gentransferkomplexen, die in der Lage sind, Expression eines Reportergens spezifisch in den Tumor zu bringen, stellten die Basis für weitere Versuche dar, in denen Expressionsplasmide welche für das biologisch hochaktive TNF-α kodieren, über systemische Applikation in den Blutkreislauf verabreicht wurden. Nach mehrfacher Applikation wurde eine hämorrhagische Tumornekrose in 60-70% der behandelten Tiere spezifisch im Tumor gefunden (Experimente entsprechend Fig. 5a, 6a) . Die hämorrhagische Tumornekrose (eine der Charakteristika der Antitumor-TNF-α Aktivität bewirkte in der Folge ein Abtöten großer Teile der betroffenen Tumoren sowie eine nachfolgende signifikante Hemmung des Tumorwachstums (Experimente entsprechend
Fig. 5b, 6b) . Die zu beobachtenden TNF-α-vermittelten Effekte waren dabei spezifisch auf den Tumor fokusiert ohne sichtbare systemische Toxizität, wie sie von systemische TNF-α (Protein) Gabe bekannt ist (Beutler und Cerami, 1986; Bendtzen, 1988; Haranaka, 1988; Natanson et al . , 1989; Lenk et al . , 1989; Kircheis et al . , 1992) (Experimente entsprechend Fig. 5, 6).
Tumornekrosen nach Verabreichung beschriebener TNF-α- GentransferSysteme wurden in Tumoren völlig unterschiedlicher histologischer Herkunft gefunden (z.B. Neuro2a Neuroblastom, MethA Fibrosarkom) .
Mit der in Anwendung des tumor-zielgerichteten Systems für den Gentransfer des TNF-α-Gens können
TNF-α-vermittelte Antitumoraktivitäten, wie die hämorrhagische Tumornekrose und Hemmung des Tumorwachstums, auch nach systemischer Verabreichung in den Blutkreislauf erzielt werden, ohne die Merkmale einer systemischen TNF-α-vermittelten Toxizität, wie sie von systemischen Applikationen von TNF-α bekannt ist . Die er indungsgemäßen Komplexe bzw. die sie enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur Behandlung von Erkrankungen, die mit soliden Tumoren einhergehen, verwendet werden, insbesondere von metastasierenden Tumoren des malignen Melanoms,
Weichteilsarkomen, Fibrosarkomen, Adenokarzinomen des gastro-intestinalen Traktes, Kolonkarzinom, Leberzellkarzinom, Pankreaskarzinom, Lungenkarzinomen, Mammakarzinom, Osteosarkomen, Glioblastom, Neuroblastom.
Die Anwendung der erfindungsgemäßen tumorzielgerichteten Gentransferkomplexe, enthaltend ein therapeutisch wirksames Gen mit zytotoxischer Wirkung oder eine Kombination eines solchen Gens mit einem oder mehreren weiteren Genen mittels systemischer Gentherapie kann vorteilhaft mit üblichen Standardtherapien zur Behandlung von Krebs, wie Chemotherapie (Blumenthal et al., 1994) oder Radiotherapie (Xu et al., 1999; Rosenthal et al., 1999) kombiniert werden.
Beispiele für Chemotherapeutika, die (durch vorangehende, gleichzeitige oder nachfolgende Verabreichung) in Kombination mit den erfindungsgemäßen Komplexen angewendet werden können, sind Doxorubicin, Taxol, 5-Fluoruracil, Cisplatin, Vinblastin bzw. Formulierungen dieser Chemotherapeutika, z.B. Doxil (liposomale Formulierung von Doxorubicin) . Bevorzugt wird das Chemotherapeutikum in einer Dosis appliziert, die geringer und somit besser verträglich ist als die bei der Montherapie mit diesem Therapeutikum üblicherweise verwendete. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass eine Kombination eines TNF-alpha-DNA enthaltenden erfindungsgemäßen Komplexes mit Doxil eine höhere Wirksamkeit zeigte als eine Doxil- Monotherapie. Dieser Effekt war besonders ausgeprägt, wenn Doxil in einer geringeren als der auf Grund der Toxizität begrenzten maximal applizierbaren Dosis verabreicht wurde (vgl. Beispiel 15 mit Beispiel 14).
Figurenübersicht :
Fig. 1: Unspezifische Genexpression in verschiedenen Organen sowie systemische Toxizität bei systemischer Applikation von positiv geladenen Polykation/DNS- Komplexen in den Blutkreislauf
Fig. 2: Aggregation von Erythrozyten durch positive Oberflächenladung von Polykation/DNA-Komplexen
Fig. 3: Abschirmung der positiven Oberflächeladung und damit verbunden Hemmung der Erythrozytenaggregation durch Inkorporierung eines hohen Transferrin-Anteils in Polykation/DNS Komplexe
Fig. 4: Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin-haltigen Polykation/DNS-Komplexen
Fig 5: Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin-haltigen Polykation/DNS-Komplexen in einem Neuroblastommodell
Fig.6: Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin-haltigen Polykation/DNS-Komplexen in einem Fibrösarkommode11
Fig 7 -10: Systemische Applikation von abgeschirmten
Transferrin-haltigen Polykation/DNS-Komplexen in einem Neuroblastommodell Fig. 11: Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin-haltigen Polykation/DNS-Komplexen im Melanommodell M-3
Fig. 12: Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin-haltigen Polykation/DNS-Komplexen, im Melanommodell B16F10
Fig. 13 und 14: Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin-haltigen Polykation/DNS- Komplexen, enthaltend TNF-α Plasmid-DNS, in Kombination mit einem Chemotherapeutikum
Fig. 15: Abgeschirmte Transferrin-haltige Polykation/DNS-Komplexe können über längere Zeiträume stabil gelagert werden.
In den folgenden Beispielen wurden, wenn nicht anders angegeben, die folgenden Materialien und Methoden verwendet :
Materialien
1) Ausgangsmaterialien für die Transferrin- Polykation-Konjugate
a) PEI
Polyethylenimin (PEI) mit einem Molekulargewicht von 25 kDa, (PEI (25)), wurde von Aldrich, Milwaukee WI; bezogen. PEI mit einem Molekulargewicht von 800kDa, PEI (800) (in Form einer 50% w/v Lösung) , wurde von Fluka, Buchs, bezogen.
Lineares PEI mit einem Molekulargewicht von 22kDa (PEI (22)) wurde von Euromedex, Soufferlweyersheim, Frankreich, bzw. von MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland, bezogen.
b) Humanes Transferrin (Eisenfrei) wurde von Biotest, Dreieich, Germany bezogen.
2) Herstellung eines Transferrin-PEI (25) Konjugates
Ein Transferrin-PEI (25) Konjugat wurde synthetisiert, wie beschrieben in Kircheis et al., 1997, mit einigen Modifikationen:
Eine Lösung von PEI (25kDa) als HCl-Salz in Wasser wurde gelfiltriert über eine Sephadex G-25 Superfine Chromatographiesäule (Pharmacia, Uppsala) .
Flüssigchromatographie wurde mittels einer Merck- Hitachi L-6220 Pumpe und eines L-4500A UV-VIS Detektors durchgeführt. Die Menge an PEI in den einzelnen Fraktionen wurde mit Hilfe des Ninhydrin-Tests bestimmt und spektrophotometrisch bei 570 nm gemessen. Die Menge an Transferrin wurde spektrophotometrisch bei 280 nm bestimmt .
Eine Lösung von Transferrin in 150 mM NaCl wurde durch Gelfiltration über eine Sephadex G-25 Superfine
Chromatographiesäule (Pharmacia, Uppsala) gegen 30 mM Natriumazetatpuffer (pH 5) gereinigt. Das gelfiltrierte Transferrin wurde auf 0°C gekühlt, und 3 Äquivalente an Natriumperiodat in 30 mM Natriumazetatpuffer (pH 5) wurden zugemischt. Das Reaktionsgemisch wurde 90 Minuten in der Dunkelheit auf Eis inkubiert. Niedrigmolekulare Nebenprodukte wurden durch Gelfiltration über eine Sephadex G-25 Superfine
Chromatographiesäule (mit 30 mM Natriumazetatpuffer, pH 5) abgetrennt. Das oxidierte Transferrin [Mengenbestimmung durch: UV Absorption bei 280 nm] (in 30 mM Natriumazetatpuf er, pH 5) wurde sofort (innerhalb von 15 Minuten) unter energischem Mischen zu der PEI (25) Lösung (in 0.25 M Natriumchlorid) in einem molaren Verhältnis von 1:1.2 zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde durch Zugabe von 2M HEPES pH 7.9 auf 7.3 eingestellt. Danach wurden 4 Portionen an Natriumzyanborhydrid (1 mg per 10 mg Transferrin) in 1-stündigen Intervallen zugegeben. Nach 19 Stunden wurde die Salzkonzentration durch Zugabe von 3M Natriumchlorid auf 0.5M Salz eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Kationenaustausch- Chromatographiesäule (Bio-Rad Macro-Prep high S) aufgetragen und mit einem Gradienten von 0.5-3.0M Natriumchlorid (mit einem konstanten Gehalt von 20 mM HEPES pH 7.3) fraktioniert. Das Kopplungsprodukt wurde bei einer Salzkonzentration zwischen 2.0M und 3.0M eluiert. Nach der Dialyse gegen 21 HBS pH 7.3 (150 mM Natriumchlorid, 20 mM HEPES pH 7.3) wurde das Konjugat (bezeichnet als: Tf-PEI) mit einem molaren Verhältnis von Transferrin: PEI = 1/1.0-1.1 erhalten. Die Konzentration wurde durch Zugabe von HBS, pH 7.3, auf lmg PEI/ml eingestellt.
Der Eiseneinbau wurde durch Zugabe von 1.25 μL 10 mM Eisen(III) zitrat-Puffer (enthaltend 200 mM Zitrate, Einstellung des pH auf 7.8 durch Zugabe von Natriumbikarbonat) pro lmg Transferrin Gehalt durchgeführt. Das Tf-PEI Konjugat in eisenhaltiger Form wurde in geeignete Aliquots portioniert, diese in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bei -80°C gelagert.
3) Plasmide
a) Als Luciferase-Reportergenplasmid wurde das in der WO 93/07283 beschriebene Plasmid pCMVL (auch pCMVLuc bezeichnet) verwendet.
b) TNF-α-Plasmide
i) Expressionsplasmide, kodierend für murines TNF-α mit endogener Leader-Sequenz:
Das DNA Insert für murines TNF-α mit dem endogenen Leader wurde mittels überlappenden PCR Reaktionen hergestellt. Die Leader-Sequenz wurde von Exon 1 und Exon 2 von genomischer Maus DNA amplifiziert . Die für reifes TNF-α kodierende Sequenz wurde von TNF-α cDNA amplifiziert . Die cDNA wurde aus RNA von LPS-aktivierten Monozyten durch RT-PCR gewonnen. Die einzelnen Fragmente wurden durch eine überlappende PCR Reaktion ("splice overlap reaction") vereint.
Spezifische Klonierungsstellen wurden mittels PCR-Primer eingefügt. Die DNS-Sequenz des Inserts wurde ermittelt und mit der TNF-α Sequenz in Acc. No. NM013693 verglichen.
Folgende PCR Reaktionen wurden durchgeführt: 1) Amplifikation von Exon 1 mit den PCR-Primern SEQ ID NO:l und SEQ ID NO: 2 mit genomischer Maus DNA als Template. SEQ ID NO:l enthält Xhol und Bglll Klonierungsstellen.
2) Amplifikation von Exon 2 mit den PCR-Primern
SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 mit genomischer Maus DNA als Template.
3) Amplifikation des reifen TNF-α mit den PCR-Primern SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 ; und Maus cDNA als Template. Der Primer SEQ ID NO: 6 enthält die Klonierungsstellen Kpnl und BamHI.
Alle 3 PCR Fragmente wurden in einer kombinierten PCR-Reaktion (splice overlap reaction) mit den Endprimern SEQ ID NO:l und SEQ ID NO: 6 vereint. Das resultierende Fragment wurde in die eukaryontische Expressionsplasmide pGS-hIL-2 (tet) (Buschle et al., 1995) und pWS2m (Schmidt et al., 1995) kloniert.
Der pGS-hIL-2 (tet) Vektor wurde mit Bglll und Kpnll verdaut und das hIL-2 Insert gegen das murine TNF-α Insert, welches ebenfalls mit Bglll-Kpnl verdaut wurde, ausgetauscht. Das resultierende Plasmid wurde pGS-muTNF-α genannt.
Der pWS2m Vektor wurde mit BamHI verdaut und das muIL-2 Insert gegen das murine TNF-α Insert, welches mit Bglll-BamHI verdaut wurde, ausgetauscht. Nach
Überprüfung der korrekten Orientierung des Inserts wurde das resultierende Plasmid pWS2-muTNF-α genannt. ii) Expressionsplasmide, kodierend für murines TNF-α mit Immunglobulin-Leader
Synthetische Oligonukleotide für humane Immunoglobulin- Leader-Sequenzen wurden entsprechend der Sequenz Acc. No. AF174024.1 bzw. entsprechend einer synthetischen Leader-Sequenz hergestellt und in einer PCR-Reaktion der reifen TNF-α Sequenz vorgeschaltet. Die DNA Sequenz für den synthetischen Immunglobulin- Leader entspricht der Sequenz von Acc. No. Z69026.1 in den ersten 53 Nukleotiden plus acgatgt vor der Sequenz des reifen TNF-α. In einer PCR-Reaktion wurde die jeweilige Leader-Sequenz an das reife TNF-α fusioniert.
Um den Immunglobulin Leader entsprechend der Sequenz von Acc. No. AF174024.1 an murines TNF-α zu fusionieren, wurde folgende PCR Reaktion durchgeführt:
Amplifikation des reifen murinen TNF-α mit den PCR-Primern SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 6, als DNA Template diente TNF-α cDNA. SEQ ID NO: 7 enthält Xhol und Bglll Restriktionsstellen. Das resultierende Fragment wurde in die Plasmide pGS-hIL-2 (tet) und pWS2m kloniert.
Der pGS-hIL-2 (tet) Vektor wurde mit Bglll und Kpnll verdaut und das hIL-2 Insert gegen das murine TNF-α Insert mit IgG-Leader, welches ebenfalls mit Bglll-Kpnl verdaut wurde, ausgetauscht. Das resultierende Plasmid wurde pGS-muTNF-αlgL genannt.
Der pWS2m Vektor wurde mit BamHI verdaut und das muIL-2 Insert gegen das murine TNF-α Insert mit IgG Leader, welches vorher mit Bglll-BamHI verdaut worden war, ausgetauscht. Nach Überprüfung der korrekten Orientierung des Inserts wurde das resultierende Plasmid pWS2-muTNF-αIgL genannt.
Um den synthetischen Immunglobulin-Leader an murines TNF-α zu fusionieren, wurde folgende PCR Reaktion durchgeführt:
Amplifikation des reifen murinen TNF-α mit den PCR- Primern SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 6, als DNA Template diente TNF-α cDNA. SEQ ID NO: 8 enthält Xhol und Bglll Restriktionsstellen. Das resultierende Fragment wurde in die Plasmide pGS-hIL-2 (tet) und pWS2m kloniert.
Der pGS-hIL-2 (tet) Vektor wurde mit Bglll und Kpnll verdaut und das hIL-2 Insert gegen das murine TNF-α Insert mit synthetischen IgG Leader, welches ebenfalls mit Bglll-Kpnl verdaut wurde, ausgetauscht. Das resultierende Plasmid wurde pGS-muTNF-α-sIgL genannt.
Der pWS2m Vektor wurde mit BamHI verdaut und das muIL-2 Insert gegen das murine TNF-α Insert mit synthetischen IgG Leader, welches vorher mit Bglll-BamHI verdaut worden war, ausgetauscht. Nach Überprüfung der korrekten Orientierung des Inserts wurde das resultierende Plasmid pWS2-muTNF-α-sIgL genannt.
Beispiel 1
Unspezifische Genexpression in verschiedenen Organen sowie systemische Toxizität bei systemischer
Applikation von positiv geladenen Polykation/DNS- Komplexen in den Blutkreislauf Transfektionskomplexe, bestehend aus PEI und DNS (in Form eines Expressionsplasmids, kodierend für das Luziferase-Reportergen) wurden in 75mM NaCl, 20mM HEPES bei einer DNS Konzentration von 200μg/ml hergestellt.
PEI (800) /DNS Komplexe (N/P=6, N=Stickstoff des
Polykations, P=Phosphat der DNS) wurden durch schnelles Mischen einer PEI (800) Lösung (156μg PEI (800) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS in einer Konzentration von 200μgDNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES hergestellt.
PEI (25) /DNS Komplexe (N/P=4.8) wurden durch schnelles Mischen einer PEI (25) Lösung (125μg PEI (25) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt.
PEI (22) /DNS Komplexe (N/P=4.8) wurden durch schnelles Mischen einer PEI (22) Lösung (125μg PEI (22) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt.
Die Transfektionskomplexe wurden nach Mischung 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Um Isotonie zu gewährleisten, wurde Glukose zugesetzt (auf eine Endkonzentration von 2.5%).
Die Partikelgröße der PEI/DNS Komplexe wurde standardmäßig mit Hilfe eines Malvern Zetasizers 3000 gemessen.
Die Oberflächenladung der PEI/DNS Komplexe (1:30 verdünnt in einer lOmM NaCl Lösung) wurde durch physikalische Messung des Zetapotenzials mittels eines Malvern Zetasizer 3000 bestimmt. (Die Methode der Messung des Zetapotenzials ist beschrieben in Müller RH, 1996, Zetapotenzial und Partikelladung in der Laborpraxis, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft WVG Stuttgart. )
Die Transfektionskomplexe (enthaltend 50μg DNS/250μl) wurden über die Schwanzvene systemisch in tumortragende
(subkutan in der Flanke wachsenden Neuroblastoma, Neuro2a) syngene A/J Mäuse (mit mindestens 4 Tieren pro Applikationsgruppe), appliziert. Die Mäuse waren dazu 2 Wochen vorher mit 106 Neuro2a Tumorzellen
(ATCC CCL 131) subkutan injiziert worden, und hatten zum Zeitpunkt der Applikation der Transfektionskomplexe subkutan wachsende Tumore mit Durchmessern von 10-13mm.
Eine Kontrollgruppe von Mäusen wurde mit einer gleichen Menge an nicht-kondensierter DNS (50μgDNS/250μl) inj iziert .
Die Reportergenexpression wurde 24 Stunden nach Applikation der Transfektionskomplexe mit Hilfe eines Luziferaseassays gemessen (beschrieben in Kircheis et al., 1999). Die angegebenen Luziferasewerte (RLU = "Relative Light Units" RLU; relative Lichteinheiten) sind Mittelwerte + SEM von >4 Tieren.
Die Messung der physikalischen Parameter der PEI/DNS Komplexe ergab folgende Partikelgrößen: PEI (800): 130nm, PEI (25) /DNS: 180nm; PEI (22) /DNS: 1-2 μm.
Für alle PEI/DNS Komplexe wurde eine stark positive Oberflächenladung festgestellt, die sich in einem stark positiven Zetapotenzial ausdrückt. Das Zetapotenzial der PEI/DNS Komplexe betrug entsprechend +30mV, +35mV, und +32mV für PEI (800) /DNS, PEI (25) /DNS, und
PEI (22) /DNS Komplexe. Nicht-kondensierte DNS bildet keine Partikel und hat ein negatives Zetapotenzial.
Bei normaler systemischer Injektion wird die nicht- verpackte, ungeschützte DNS (Fig. la) rasch im Blutkreislauf abgebaut und führt zu keiner signifikanten Genexpression in den untersuchten Organen, mit Ausnahme der Injektionsstelle (nicht in Fig. la gezeigt) .
Kondensierung der DNS mit Polykationen, gezeigt hier für 3 Polykationen: Fig. lb) PEI (800), Fig. lc) PEI25, Fig.l d) PEI (22) schützt die DNS vor unmittelbaren Abbau. Die resultierenden Komplexe haben eine stark positive Oberflächenladung (positives Zetapotenzial >+30mV) .
Nach systemischer Gabe in den Blutkreislauf wurden mit diesen Polykation/DNS Transfektionskomplexen (beinhalten in allen Fällen 50μg DNS, Applikationsvolumen: 250μl pro Maus) signifikante Genexpressionswerte gemessen. Das Expressionsmuster ist unspezifisch und breit gefächert, mit den höchsten Expressionswerten meistens in der Lunge; zum Teil wird auch Genexpression im Tumor sowie in anderen Organen wie Herz, Leber, Niere und Milz gemessen. Es wurden schwere Toxizitäten in der Gruppe b) (Fig. lb) beobachtet, 2 von 4 Tieren starben kurz nach der Applikation mit Anzeichen von Lungenembolie . Die restlichen Tiere erholten sich nach deutlichen Anzeichen von akuter Toxizität. Auch für die in diesem Beispiel verwendeten Polyethylenimin/DNS-Komplexe ist die applizierbare Dosis limitiert durch akute Toxizitäten nach systemischer Gabe. Die Daten zeigen, dass die Genexpression in der Lunge und die Toxizität mit einer positiven Oberflächenladung (positives Zetapotenzial >+30mV) korrelieren. (In Fig. 1 bedeuten: He = Herz, Lu = Lunge, Mi = Milz, Le = Leber, Ni = Niere, Tu = Tumor)
Beispiel 2
Aggregation von Erythrozyten durch positive Oberflächenladung von Polykation/DNA-Komplexen
Transfektionskomplexe mit dem Luziferase-Reportergen wurden, wie im Beispiel 1 beschrieben, in 75mM NaCl, 20mM HEPES bei einer DNS Konzentration von 200μg/ml hergestellt .
PEI (800) /DNS Komplexe (N/P=6) wurden durch schnelles Mischen einer PEI (800) Lösung (156μg PEI (800) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μgDNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt.
PEI (25) /DNS Komplexe (N/P=6) wurden durch schnelles Mischen einer PEI (25) Lösung (156μg PEI (25) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt.
PEI (22) /DNS Komplexe (N/P=6) wurden durch schnelles Mischen einer PEI (22) Lösung (156μg PEI (22) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μgDNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt. Die Transfektionskomplexe wurden nach Mischung 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Um Isotonie zu gewährleisten, wurde Glukose zugesetzt (auf eine Endkonzentration von 2.5 w/v %).
Das Zetapotenzial der PEI/DNS Komplexe (gemessen wie in Beispiel 1 beschrieben) betrug entsprechend +30mV, +35mV, und +32mV für PEI (800) /DNS, PEI (25) /DNS, und PEI (22) /DNS Komplexe.
Von A/J Mäusen wurde Frischblut gewonnen und zur Verhinderung der Gerinnung mit 20μl Heparin versetzt. Die Erythrozyten wurden dreimal in kalter Ringer' s Lösung gewaschen und in 6-Loch Zellkulturplatten eingesät .
Die Erythrozyten wurden mit den frisch gemischten Polykation/DNS Gentransferkomplexen versetzt. Die DNS-Endkonzentration betrug 17μg/ml, was größenordnungsmäßig der in vivo applizierten DNS-Menge (50μg DNS) pro Blutvolumen der Maus (2.5-3ml) entspricht. Die Erythrozyten wurden mit den Gentransferkomplexen 1 Stunde lang bei +37°C inkubiert und die Aggregation der Erythrozyten bewertet. Unbehandelte Erythrozyten sind als Kontrolle gezeigt (Fig. 2a) .
Es zeigte sich, dass die Inkubierung von Erythrozyten mit Polykation/DNS Komplexen (mit positiver Oberflächenladung, Zetapotenzial: >+30mV) zu Aggregation von Erythrozyten führt (Fig. 2b: PEI (800) /DNS Komplexe; Fig. 2c: PEI (25) /DNS Komplexe; Fig. 2d: PEI (22) /DNS Komplexe. Obzwar deutliche Unterschiede im Schweregrad der Aggregation zwischen den unterschiedlichen Polyethylenimin-Molekülen zu beobachten war, war die Aggregation in allen Fällen signifikant und illustriert das Potenzial für unerwünschte Effekte in vivo. Aggregation von Erythrozyten nach Applikation von
Transfektionskomplexen in den Blutkreislauf ist einer der pathogenetischen Mechanismen der im Beispiel 1 beschriebenen Toxizitäten, einschließlich Lungenembolie .
Beispiel 3
Hemmung der Erythrozytenaggregation durch Inkorporierung eines hohen Transferrin-Anteils in Polykation/DNS Komplexe
a) PEI (25) /DNS-Transfektionskomplexe (N/P=4.8; N=Stickstoff des PEI, P=Phosphate der DNS) wurden analog wie in Beispiel 1 beschrieben durch schnelles Mischen einer PEI (25) Lösung (125μg PEI (25) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt.
Bei der Mischung der Komplexe wurde im Unterschied zu Beispiel 1 das PEI (25) teilweise (z.B. 1/10, 1/5, oder 1/2) oder vollständig durch eine entsprechende Menge an Transferrin-PEI (25) Konjugat (Tf-PEI, mit dem sehr hohen molaren Verhältnis Transferrin : PEI von 1:1, beschrieben in Materialien und Methoden) ersetzt. Die Transfektionskomplexe, bei denen PEI (25) teilweise durch Transferrin-PEI-Konjugat ersetzt wurde, bestehen somit aus Transferrin-PEI (25) Konjugat (kurz bezeichnet als: Tf-PEI), PEI (25) und DNS, sie werden im folgenden als "Tf-PEI/PEI (25) /DNS-Komplexe" bezeichnet. Die Transfektionskomplexe wurden nach Mischung 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Um Isotonie zu gewährleisten, wurde Glukose zugesetzt (auf eine Endkonzentration von 2.5%).
Das Zetapotenzial (als Ausdruck der Oberflächenladung) wurde mit Hilfe eines Malvern Zetasizers 3000 gemessen (wie im Beispiel 1 beschrieben) . Der Effekt der Inkorporierung einer steigenden Menge an Transferrin- Konjugat auf das Zetapotenzial des
Transfektionskomplexes wurde gemessen (Fig. 3a) .
b) Tf-PEI/PEI (25) /DNS-Transfektionskomplexe (molares Verhältnis Tf-PEI : PEI=1 : 3) , u.a. N/P=4.8, wurden durch schnelles Mischen einer Polykation Lösung (bestehend aus 31μg/ml Tf-PEI und 94μg PEI (25) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μgDNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt.
Tf-PEI/PEI (22) /DNS-Transfektionskomplexe (molares Verhältnis Tf-PEI : PEI=1 : 3) , u.a. N/P=4.8, wurden durch schnelles Mischen einer Polykation Lösung (bestehend aus 31 μg/ml Tf-PEI und 94μg PEI (22) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt.
Tf-PEI/PEI (25) /DNS-Transfektionskomplexe bzw. Tf-PEI/PEI (22) /DNS-Transfektionskomplexe (mit höherem N/P-Verhältnis (u.a. N/P=6, 7.2, 9.6) wurden mit entsprechend höheren PEI-Mengen pro konstanter DNS-Menge gemischt. In allen Fällen wurde, ebenso wie bei den oben beschriebenen Komplexen, ein Viertel der PEI-Menge durch die entsprechende Menge an Tf-PEI- Konjugat ersetzt, d.h. auch in allen diesen Komplexen betrug das molare Verhältnis Tf-PEI : PEI=1 : 3.
Das Zetapotenzial von abgeschirmten Tf-PEI/PEI (25) /DNS- Komplexen bzw. von Tf-PEI/PEI (22) /DNS-Komplexen sowie von nicht-abgeschirmten PEI (25) /DNS- bzw. PEI (22) /DNS- Komplexen wurde über einen größeren Bereich von N/P Verhältnissen gemessen (wie in Beispiel 1 beschrieben) . In Fig. 3b sind die Zetapotenziale von Transfektionskomplexen unter Verwendung von PEI25 und PEI22 mit und ohne Abschirmung durch Tf-PEI gezeigt.
Von den in den nachfolgenden Beispielen verwendeten, bevorzugten Komplexen (N/P=4.8; molares Verhältnis Tf-PEI :PEI=1: 3, wobei PEI25 oder PEI22 verwendet wurde) , die für jedes Experiment frisch hergestellt wurden, wurde in sämtlichen Messungen ein Zetapotenzial von ≤ +10mV gemessen.
c) Einfluss von Transferrin-Inkorporierung in die Komplexe auf das Aggregationsverhalten von Erythrozyten
Tf-PEI/PEI (25) /DNS-Transfektionskomplexe (N/P=4.8, Tf-PEI : PEI=1 : 3) wurden durch schnelles Mischen einer Polykation-Lösung (bestehend aus 31μg/ml Tf-PEI und 94μg PEI (25) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt .
PEI (25) /DNS-Komplexe (N/P=4.8) wurden durch schnelles Mischen einer PEI (25) Lösung (125μg PEI (25) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt. Isotonie der Lösungen wurde durch Zugabe von Glukose in einer Endkonzentration von 2.5% eingestellt.
Gewaschene frische Erythrozyten wurden mit nicht- abgeschirmten PEI25/DNS-Komplexen oder mit abgeschirmten Tf-PEI/PEI (25) /DNS-Komplexen (N/P=4.8) für 1 Stunde bei +37 °C inkubiert und die Aggregation der Erythrozyten bewertet. Die Ergebnisse sind in Fig. 3c gezeigt, unbehandelte Erythrozyten sind als Kontrolle gezeigt.
Es zeigte sich, dass PEI/DNS-Komplexe eine hohe positive Oberflächenladung haben, die sich in einem stark positiven Zetapotenzial (≥+30mV) ausdrückt.
Inkorporierung einer genügend hohen Menge Transferrin- PEI-Konjugat (z.B. 10%, 80% oder 50%, bezogen auf PEI) in den Polykation/DNS Komplex bewirkt eine signifikante Abschirmung der positiven Oberflächenladung (siehe Fig. 3a) .
Durch Inkorporierung einer großen Menge Transferrin (1/4 bezogen auf die molare Menge an Gesamt PEI im Komplex) in den Polykation/DNS-Komplex wird die positive Oberflächenladung der PEI/DNS-Komplexe über einen breiten N/P Bereich deutlich abgeschirmt. Dies gilt sowohl für PEI (25)- als auch für PEI (22) -hältige Tf-PEI/PEI/DNS-Komplexe (Fig. 3b) .
Die Abschirmung der positiven Oberflächenladung bewirkt eine Abschirmung von unspezifischen Interaktion, gezeigt am Beispiel der Hemmung der Erythrozytenaggregation (Fig. 3c) . Beispiel 4
Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin- haltigen Polykation/DNS-Komplexen
Mittels Transferrin abgeschirmte Transfektionskomplexe (enthaltend das Luziferase-Reportergen) wurden in 75mM NaCl, 20mM HEPES bei einer DNS Konzentration von 200μg/ml hergestellt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert .
Tf-PEI/PEI (25) /DNS-Transfektionskomplexe (N/P=4.8, Tf-PEI : PEI=1 : 3) wurden durch schnelles Mischen einer Polykation-Lösung (bestehend aus 31μg/ml Tf-PEI und 94μg PEI (25) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt .
Tf-PEI/PEI (22) /DNS-Transfektionskomplexe (N/P=4.8,
Tf-PEI : PEI=1: 3) wurden durch schnelles Mischen einer Polykation-Lösung (bestehend aus 31μg/ml Tf-PEI und 94μg PEI (22) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt.
Isotonie der Transfektionskomplexlösungen wurde durch Zugabe von Glukose in einer Endkonzentration von 2.5% eingestellt.
Die Transfektionskomplexe (enthaltend 50μg DNS/250μl) wurden über die Schwanzvene systemisch in tumortragende A/J Mäuse (subkutan in der Flanke wachsenden Neuroblastom, Neuro2a) appliziert (wie in Beispiel 1 beschrieben) . Es wurden Transferrin-haltige Transfektionskomplexe unter Verwendung von PEI25 (Fig. 4a) und PEI22 (Fig. 4b) getestet.
Die Reportergenexpression im Tumor und in den verschiedenen Organen wurde 24 Stunden nach Applikation der Transfektionskomplexe mit Hilfe eines Luziferaseassays gemessen (Fig. 4a und b) . Die angegebenen Luziferasewerte sind Mittelwerte ±SEM von 9 Tieren. (Die Abkürzungen der Organe haben dieselbe Bedeutung wie in Fig. 1.)
Systemische Applikation von Transfektionskomplexen, in denen die Ladung mittels Transferrin abgeschirmt ist, in die Blutbahn der Maus führte zu einer bevorzugten Reportergenexpression im Tumor, während in den anderen Organen vernachlässigbare Genexpression gefunden wurde (siehe logarithmische Skala in Fig. 4).
Es trat keine systemische Toxizität nach Applikation der Gentransferkomplexe auf.
Beispiel 5
Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin- haltigen Polykation/DNS-Komplexen, enthaltend TNF-α Plasmid-DNS, in einem Neuroblastommodell
Mittels Transferrin abgeschirmte Transfektionskomplexe, enthaltend ein für TNF-α kodierendes Plasmid, wobei das Plasmid pGS-muTNF-α mit der authentischen TNF-α- Leadersequenz verwendet wurde, wurden in 75mM NaCl, 20mM HEPES bei einer DNS-Konzentration von 200μg/ml hergestellt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Tf-PEI/PEI (25) /DNS-Transfektionskomplexe (N/P=4.8, Tf-PEI :PEI=1: 3) wurden durch schnelles Mischen einer Polykation-Lösung (bestehend aus 31μg/ml Tf-PEI und 94μg PEI (25) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt.
Isotonie der Transfektionskomplexlösungen wurde durch Zugabe von Glukose in einer Endkonzentration von 2.5% eingestellt.
In vier Applikationen in 2-3 tägigem Abstand wurden die
Transfektionskomplexe (enthaltend jeweils
50μg DNS/250μl) über die Schwanzvene systemisch in tumortragende A/J Mäuse (10 Tiere pro
Applikationsgruppe) . Die Mäuse waren dazu 8 Tage vorher mit 106 Tumorzellen (Neuroblastom) (Neuro2a ATCC CCL 131) subkutan in die Flanke injiziert worden, und hatten zum Zeitpunkt der ersten Applikation der Transfektionskomplexe einen subkutan wachsenden Tumor mit einem Durchmesser von 6-8mm.
Das Tumorwachstum wurde über die folgenden 3 Wochen verfolgt .
Systemische Applikation von mittels Transferrin abgeschirmten TNF-α-Gen-haltigen Transfektionskomplexen in die Blutbahn der Maus führte zu hämorrhagischer Tumornekrose in 7 von 10 der behandelten Tiere. Die hämorrhagische Nekrose - ein TNF-α-spezischer - antitumoralen Effekt - wurde streng lokalisiert nur im Bereich der Tumore gefunden. Es traten keine Nekrosen an Normalgeweben und auch keine systemischen TNF-α- vermittelte Toxizitäten auf (Beispiel 5a) .
In weiterer Folge bedingte die Behandlung mit den TNF-α-Gen-kodierenden Transfektionskomplexen ein teilweises Abtöten großer Bereiche innerhalb der betreffenden Tumoren und resultierte letztendlich in einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich mit unbehandelten Kontrolltieren wie auch im Vergleich zu Tieren, die mit denselben Gentransferkomplexen, jedoch mit anderen Genen (z.B. dem ß-Galaktosidasereportergen) behandelt worden waren (Experiment gemäß Fig. 5b) .
Auch in weiterer Folge wurden keine systemischen TNF-α- vermittelten Toxizitäten festgestellt.
Beispiel 6
Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin- haltigen Polykation/DNS-Komplexen, enthaltend TNF-α Plasmid-DNS in einem Fibrosarkommodell
Mittels Transferrin abgeschirmte Transfektionskomplexe mit dem Gen für TNF-α wurden in 75mM NaCl, 20mM HEPES bei einer DNS Konzentration von 200μg/ml hergestellt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Tf-PEI/PEI (25) /DNS-Transfektionskomplexe (N/P=4.8, Tf-PEI: PEI=1 : 3, Fig. 6b) wurden durch schnelles Mischen einer Polykation Lösung (bestehend aus 31μg/ml Tf-PEI und 94μg PEI (25) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt. Isotonie wurde durch Zugabe von Glukose in einer Endkonzentration von 2.5% eingestellt.
Tf-PEI/PEI (22) /DNS-Transfektionskomplexe (N/P=4.8, Tf-PEI: PEI=1: 3, Fig. 6a, c) wurden durch schnelles Mischen einer Polykation-Lösung (bestehend aus 31μg/ml Tf-PEI und 94μg PEI (22) /ml in 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μgDNS/ml in 20mM HEPES) hergestellt. Isotonie wurde durch Zugabe von Glukose in einer Endkonzentration von 5% eingestellt.
In vier Applikationen wurden die Transfektionskomplexe (enthaltend jeweils 50μgDNS/250μl) über die Schwanzvene systemisch in tumortragende Balb/c Mäuse mit einem subkutan in der Flanke wachsenden MethA Fibrosarkom, appliziert. Die Mäuse waren dazu 8 Tage vorher mit 106 MethA Tumorzellen (MethA Fibrosarkom) subkutan in die Flanke injiziert worden, und hatten zum Zeitpunkt der ersten Applikation der Transfektionskomplexe einen subkutan wachsenden Tumor mit einem Durchmesser von 6-8mm.
Tumorwachstum wurde verfolgt über die folgenden 3 Wochen.
Systemische Applikation von TNF-α-Gen-haltigen Transfektionskomplexen, in denen die Ladung mittels Transferrin abgeschirmt ist, in die Blutbahn der Mäuse führte zu hämorrhagischen Tumornekrosen in 6 von 10 der behandelten Tiere. Die hämorrhagische Nekrose - ein TNF-α-spezischer, antitumoraler Effekt - wurde streng lokalisiert nur im Bereich der Tumore gefunden (Fig. 6a) . Es wurden keine Nekrosen an Normalgeweben sowie keine systemischen TNF-α-vermittelte Toxizitäten festgestellt (Beispiel 6a,b,c). In weiterer Folge bewirkte die Behandlung mit TNF-α- Gen-kodierenden Transfektionskomplexen ein teilweises Abtöten großer Bereiche innerhalb der betreffenden Tumoren und resultierte letztendlich in einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich mit unbehandelten Kontrolltieren als auch im Vergleich zu Tieren, die mit denselben Gentransferkomplexes jedoch mit anderen Genen (z.B. dem ß-Galaktosidasereportergen) behandelt worden waren (Fig. 6b) . In 5 von 10 Tieren, die mit TNF-α-Gen- kodierenden Transfektionskomplexen behandelt worden waren, wurden komplette Tumorregressionen beobachtet (Fig. 6c) .
Auch in weiterer Folge wurden keine systemischen TNF-α- vermittelten Toxizitäten festgestellt.
Beispiel 7
Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin- haltigen Polykation/DNS-Komplexen, enthaltend TNF-α Plasmid-DNS, in einem Neuroblastommodell führt zu einer bevorzugten/ vorwiegenden/ Expression von TNF-α im Tumor, ohne detektierbare TNF-α Serumspiegel.
Mittels Transferrin abgeschirmte Transfektionskomplexe, enthaltend ein für TNF-α kodierendes Plasmid, wobei das Plasmid pGS-muTNF-α mit der authentischen TNF-α-
Leadersequenz verwendet wurde, wurden in 75mM NaCl, 20mM HEPES bei einer DNS-Konzentration von 200μg/ml hergestellt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Tf-PEI/PEI (25) /DNS-Transfektionskomplexe (N/P=4.8, Tf-PEI :PEI=1: 3) wurden durch schnelles
Mischen einer Polykation-Lösung (bestehend aus 31μg/ml Tf-PEI und 94μg PEI (25) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt. Isotonie der Transfektionskomplexlösungen wurde durch Zugabe von Glukose in einer Endkonzentration von 2.5% eingestellt.
Zum Vergleich wurden nicht-abgeschirmte PEI (22) /DNS- Komplexe (N/P=7) enthaltend das selbe TNF-α kodierende Plasmid wie die Transferrin-abgeschirmten Komplexe, durch schnelles Mischen einer PEI (22) Lösung (182μg PEI (22) /ml in 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 20mM HEPES) hergestellt.
Isotonie der Lösungen wurde durch Zugabe von Glukose in einer Endkonzentration von 5% eingestellt.
Die Transfektionskomplexe (enthaltend 50μg DNS/250μl) wurden über die Schwanzvene systemisch in tumortragende A/J Mäuse (4 Tiere pro Applikationsgruppe) . Die Mäuse waren dazu 12 Tage vorher mit 106 Tumorzellen (Neuroblastom) (Neuro2a ATCC CCL 131) subkutan in die Flanke injiziert worden, und hatten zum Zeitpunkt der ersten Applikation der Transfektionskomplexe einen subkutan wachsenden Tumor mit einem Durchmesser von 10-15mm.
Die Expression des Genproduktes, TNF-α, im Tumor und in den verschiedenen Organen, sowie TNF-α Serumspiegel wurden 24 Stunden nach Applikation der Transfektionskomplexe mit Hilfe eines ELISA (spezifisch für murines TNF-α) gemessen (Fig. 7a und b) . Die angegebenen Werte sind Mittelwerte ±SEM von 4 Tieren. (Die Abkürzungen der Organe haben dieselbe Bedeutung wie in Fig. 1. ) Nach systemischer Applikation von nicht-abgeschirmten Komplexen in die Blutbahn von Mäusen wurde hohe Expression von TNF-α in der Lunge gefunden, gefolgt von Leber, Herz, Tumor, und Milz. Diese unspezifische Expression in verschiedenen Organen resultierte auch in signifikanten systemischen TNFα Spiegeln im Blutserum der Tiere (Fig. 7a).
Im Unterschied dazu führte die systemische Applikation von Transfektionskomplexen, in denen die Ladung mittels Transferrin abgeschirmt ist, zu einer bevorzugten
Expression von TNF-α im Tumor, geringere Genexpression wurde in der Leber und Milz festgestellt (siehe Fig. 7b). Mit Transferrin-abgeschirmten Transfektionskomplexen wurden keine signifikanten TNFα Spiegel im Blutserum der Tiere festgestellt.
Beispiel 8
Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin- haltigen Polykation/DNS-Komplexen, enthaltend TNF-α Plasmid-DNS, in einem Neuroblastommodell führt zu signifikanter Hemmung des Tumorwachstums ohne systemische TNF-α bedingte Toxizität.
Mittels Transferrin abgeschirmte Transfektionskomplexe, enthaltend ein für TNF-α kodierendes Plasmid, wobei das Plasmid pGS-muTNF-α mit der authentischen TNF-α-
Leadersequenz verwendet wurde, wurden in 75mM NaCl, 20mM HEPES bei einer DNS-Konzentration von 200μg/ml hergestellt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Tf-PEI/PEI (22) /DNS-Transfektionskomplexe (N/P=4.8, Tf-PEI :PEI=1: 3) wurden durch schnelles Mischen einer Polykation-Lösung (bestehend aus 31μg/ml Tf-PEI und 94μg PEI (22) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt. Isotonie der Transfektionskomplexlösungen wurde durch Zugabe von
Glukose in einer Endkonzentration von 2.5% eingestellt.
Zum Vergleich wurden nicht-abgeschirmte PEI (22) /DNS- Komplexe (N/P=7) enthaltend das gleiche TNF-α kodierendes Plasmid wie die Transferrin-abgeschirmten Komplexe durch schnelles Mischen einer PEI (22) Lösung (182μg PEI (22) /ml in 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 20mM HEPES) hergestellt.
Isotonie der Lösungen wurde durch Zugabe von Glukose in einer Endkonzentration von 5% eingestellt.
Als Kontrollen wurden, analog zu den TNF-α-kodierenden Komplexen, auch entsprechende Transferrin-abgeschirmte bzw. nicht-abgeschirmte Transfektionskomplexe hergestellt, die anstelle des TNF-α-kodierenden Plasmids das in Säugerzellen nicht exprimierende pSP65 Plasmid enthielten.
In acht Applikationen in 2-3 tägigen Abständen wurden die Transfektionskomplexe (enthaltend jeweils 50μg DNS/250μl) über die Schwanzvene systemisch in die Blutbahn tumortragender A/J Mäuse (8 Tiere pro Applikationsgruppe) appliziert. Die Mäuse waren dazu 8 Tage vorher mit 106 Tumorzellen (Neuroblastom) (Neuro2a ATCC CCL 131) subkutan in die Flanke injiziert worden, und hatten zum Zeitpunkt der ersten Applikation der Transfektionskomplexe einen subkutan wachsenden Tumor mit einem Durchmesser von ca. 6-8 mm. Das Tumorwachstum wurde über die folgenden 3 Wochen verfolgt .
Systemische Applikation von mittels Transferrin abgeschirmten TNF-α-Gen-haltigen Transfektionskomplexen in die Blutbahn der Maus führte zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich mit unbehandelten Kontrolltieren wie auch im Vergleich zu Tieren, die mit denselben Gentransferkomplexen, jedoch anstelle des TNFα kodierenden Plasmids das nicht- exprimierenden pSP65 Plasmid enthaltend, behandelt worden waren (** p<0.01) (Experiment gemäß Fig. 8) .
Es wurden keine systemischen TNF-α-vermittelten Toxizitäten nach Applikation von Transferrin- abgeschirmten Transfektionskomplexen festgestellt.
Systemische Applikation von nicht-abgeschirmten TNF-α- Gen-haltigen Transfektionskomplexen in die Blutbahn der Maus führte zu einer signifikant geringeren Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich zu Transferrin- abgeschirmten Komplexen (# p<0.05).
Parallel zum Tumorwachstum wurde das Gewicht der Tiere, als ein Parameter für eine mögliche Beeinflussung des Allgemeinzustandes der Tiere, bestimmt. Während nach systemischer Applikation von Transferrin-abgeschirmten Transfektionskomplexen keine signifikante Gewichtsabnahme festzustellen war, führte die Applikation von nicht-abgeschirmten Transfektionskomplexen mit TNF-α zu signifikanten Gewichtsverlusten (p<0.05 vs . unbehandelte Kontrolle). Im Unterschied zu den nicht-abgeschirmten Komplexen, sind damit Transferrin-abgeschirmte
Transfektionskomplexe in der Lage, die Expression eines therapeutische Gens (z.B. kodierend für TNF-α), und damit auch die Aktivität des therapeutischen Proteins, TNF-α, auf den Zielort, den Tumor, zu lokalisieren, und damit die unerwünschten Wirkungen auf die Normalgewebe, wie sie von einer systemischen TNF-α Protein Therapie bekannt sind, auszuschalten.
Beispiel 9
Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin- haltigen Polykation/DNS-Komplexen, enthaltend TNF-α Plasmid-DNS, in einem Neuroblastommodell führt zu hämorrhagischer Tumornekrose und signifikanter Hemmung des Tumorwachstums.
Mittels Transferrin abgeschirmte Transfektionskomplexe, enthaltend ein für TNF-α kodierendes Plasmid, wobei das Plasmid pGS-muTNF-α mit der authentischen TNF-α- Leadersequenz verwendet wurde, wurden in 75mM NaCl, 20mM HEPES bei einer DNS-Konzentration von 200μg/ml hergestellt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Tf-PEI/PEI (22) /DNS-Transfektionskomplexe (N/P=4.8, Tf-PEI: PEI=1: 3) wurden durch schnelles Mischen einer Polykation-Lösung (bestehend aus 31μg/ml Tf-PEI und 94μg PEI (22) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt.
Isotonie der Transfektionskomplexlösungen wurde durch Zugabe von Glukose in einer Endkonzentration von 2.5% eingestellt . In sechs Applikationen wurden die Transfektionskomplexe (enthaltend jeweils 50μg DNS/250μl) über die Schwanzvene systemisch in die Blutbahn tumortragender A/J Mäuse (6 Tiere pro Applikationsgruppe) appliziert. Die Mäuse waren dazu 8 Tage vorher mit 106 Tumorzellen (Neuroblastom) (Neuro2a ATCC CCL 131) subkutan in die Flanke injiziert worden, und hatten zum Zeitpunkt der ersten Applikation der Transfektionskomplexe einen subkutan wachsenden Tumor mit einem Durchmesser von ca. 6-8 mm.
Das Tumorwachstum wurde über die folgenden 3 Wochen verfolgt .
Systemische Applikation von mittels Transferrin abgeschirmten TNF-α-Gen-haltigen Transfektionskomplexen in die Blutbahn der Maus führte zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich mit unbehandelten Kontrolltieren wie auch im Vergleich zu Tieren, die mit denselben Gentransferkomplexen, jedoch anstelle des TNFα Gens mit anderen Genen (z.B. dem ß-Galaktosidasereportergen) , behandelt worden waren (Experiment gemäß Fig. 9) .
Es wurden keine systemischen TNF-α-vermittelten Toxizitäten festgestellt.
In Tabelle 1 ist eine Zusammenfassung von drei unabhängigen Experimenten einer systemischen
Applikation von abgeschirmten Transferrin-haltigen Polykation/DNS-Komplexen, enthaltend TNF-α Plasmid DNS, im Neuroblastommodell gezeigt.
Mittels Transferrin abgeschirmte Transfektionskomplexe, enthaltend ein für TNF-α kodierendes Plasmid, wobei das Plasmid pGS-muTNF-α mit der authentischen TNF-α- Leadersequenz verwendet wurde, wurden in 75mM NaCl, 20mM HEPES bei einer DNS-Konzentration von 200μg/ml hergestellt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Tf-PEI/PEI (25) /DNS- bzw. Tf-PEI/PEI (22) /DNS- Transfektionskomplexe (N/P=4.8, Tf-PEI :PEI=1: 3) wurden durch schnelles Mischen einer Polykation-Lösung (bestehend aus 31μg/ml Tf-PEI und 94μg PEI (25) /ml bzw. PEI (22) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt .
Isotonie der Transfektionskomplexlösungen wurde durch Zugabe von Glukose in einer Endkonzentration von 2.5% eingestellt .
Als Kontrolle wurden, analog zu den TNF-α-kodierenden Komplexen, auch entsprechende Transferrin-abgeschirmte Transfektionskomplexe hergestellt, die anstelle des TNF-α-kodierenden Plasmids ein therapeutisch nichtrelevantes Reportergen (für ß-galaktosidase) oder das in Säugerzellen nicht exprimierende pSP65 Plasmid enthalten.
In Mehrfach-Applikationen wurden die
Transfektionskomplexe (enthaltend jeweils
50μg DNS/250μl) über die Schwanzvene systemisch in die Blutbahn tumortragender A/J Mäuse appliziert. Die Mäuse waren dazu 8 Tage vorher mit 106 Tumorzellen (Neuroblastom) (Neuro2a ATCC CCL 131) subkutan in die Flanke injiziert worden, und hatten zum Zeitpunkt der ersten Applikation der Transfektionskomplexe einen subkutan wachsenden Tumor mit einem Durchmesser von ca. 6-8 mm. Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin- haltigen Polykation/DNS-Komplexen, enthaltend TNF-α Plasmid-DNS, führte in 17 von 20 Tieren zu hämorrhagischer Tumornekrose und unterscheidet sich damit signifikant (P<0.01) von den unbehandelten Kontrolltieren bzw. von Kontrolltieren, die mit analogen Transfektionskomplexen, enthaltend therapeutisch nicht-relevante Plasmid DNS (ß-galaktosidase oder pSP65) , behandelt worden waren.
Beispiel 10
Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin- haltigen Polykation/DNS-Komplexen, enthaltend geringe Mengen an TNF-α Plasmid-DNS, in einem Neuroblastommodell führt zu signifikanter Hemmung des Tumorwachstums .
Mittels Transferrin abgeschirmte Transfektionskomplexe, enthaltend 20μg/250μl, 10μg/250μl, oder 5μg/250μl eines TNF-α kodierendes Plasmid, wobei das Plasmid pGS-muTNF- α mit der authentischen TNF-α-Leadersequenz verwendet wurde, wurden in 150mM NaCl, 20mM HEPES hergestellt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Tf-PEI/PEI (22) /DNS-Transfektionskomplexe (N/P=4.8, Tf-PEI : PEI=1 : 3) wurden durch schnelles Mischen gleicher Volumen einer Polykation-Lösung (bestehend aus 31μg/ml Tf-PEI und 94μg PEI (22) /ml in 150mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (in 150mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt .
In acht Applikationen wurden die Transfektionskomplexe (enthaltend jeweils 20μg DNS/250μl, lOμg DNS/250μl, bzw. 5μg DNS/250μl) über die Schwanzvene systemisch in die Blutbahn tumortragender A/J Mäuse (12 Tiere pro Applikationsgruppe) appliziert. Die Mäuse waren dazu 8 Tage vorher mit 106 Tumorzellen (Neuroblastom) (Neuro2a ATCC CCL 131) subkutan in die Flanke injiziert worden, und hatten zum Zeitpunkt der ersten Applikation der Transfektionskomplexe einen subkutan wachsenden Tumor mit einem Durchmesser von ca. 6-8 mm.
Das Tumorwachstum wurde über die folgenden 3 Wochen verfolgt.
Systemische Applikation von mittels Transferrin abgeschirmten TNF-α-Gen-haltigen Transfektionskomplexen in die Blutbahn der Maus führte bei allen verwendeten DNS Mengen (20μg, lOμg, und 5μg pro Maus) zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich mit unbehandelten Kontrolltieren (Experiment gemäß Fig. 10) .
Es wurden keine systemischen TNF-α-vermittelten Toxizitäten festgestellt.
Beispiel 11
Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin- haltigen Polykation/DNS-Komplexen, enthaltend TNF-α Plasmid-DNS, in einem Fibrosarkommodell führt zu hämorrhagischer Tumornekrose und zu kompletten Tumorregressionen. Mittels Transferrin abgeschirmte Transfektionskomplexe, enthaltend ein für TNF-α kodierendes Plasmid, wobei das Plasmid pGS-muTNF-α mit der authentischen TNF-α- Leadersequenz verwendet wurde, wurden in 75mM NaCl, 20mM HEPES bei einer DNS-Konzentration von 200μg/ml hergestellt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Tf-PEI/PEI (22) /DNS-Transfektionskomplexe (N/P=4.8, Tf-PEI: PEI=1 : 3) wurden durch schnelles Mischen einer Polykation-Lösung (bestehend aus 31μg/ml Tf-PEI und 94μg PEI (22) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt.
Isotonie der Transfektionskomplexlösungen wurde durch Zugabe von Glukose in einer Endkonzentration von 2.5% eingestellt.
Als Kontrolle wurden, analog zu den TNF-α-kodierenden Komplexen, auch entsprechende Transferrin-abgeschirmte Transfektionskomplexe hergestellt, die anstelle des TNF-α-kodierenden Plasmids ein therapeutisch nicht- relevantes Reportergen (für ß-galaktosidase) enthalten.
In Mehrfachapplikationen in 2-3 tägigen Abständen wurden die Transfektionskomplexe (enthaltend jeweils 50μg DNS/250μl) über die Schwanzvene systemisch in die Blutbahn tumortragender BALB/c Mäuse appliziert. Die Mäuse waren dazu 8 Tage vorher mit 2xl06 MethA- Tumorzellen (Fibrosarkom) subkutan in die Flanke injiziert worden, und hatten zum Zeitpunkt der ersten Applikation der Transfektionskomplexe einen subkutan wachsenden Tumor mit einem Durchmesser von ca. 6-8 mm.
In Tabelle 2 ist eine Zusammenfassung von zwei unabhängigen Experimenten einer systemischen Applikation von abgeschirmten Transferrin-haltigen Polykation/DNS-Komplexen, enthaltend TNF-α Plasmid DNS, im MethA Fibrosarkommodell gezeigt.
Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin- haltigen Polykation/DNS-Komplexen, enthaltend TNF-α Plasmid-DNS, führte in 11 von 19 Tieren zu hämorrhagischer Tumornekrose und unterscheidet sich damit signifikant (** P<0.05) von den unbehandelten Kontrolltieren bzw. von Kontrolltieren, die mit analogen Transfektionskomplexen, enthaltend therapeutisch nicht-relevante für ß-Galaktosidase kodierende Plasmid DNS, behandelt worden waren.
Außerdem führte die Applikation von abgeschirmten Transferrin-haltigen Polykation/DNS-Komplexen, enthaltend TNF-α Plasmid-DNS, in 12 von 19 Tieren zu vollständigen Tumorrückbildungen (Kompletten Tumorregressionen) . Es ergibt sich damit ein statistisch signifikanter Unterschied (# P<0.05) gegenüber den unbehandelten Kontrolltieren.
Beispiel 12
Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin- haltigen Polykation/DNS-Komplexen, enthaltend TNF-α Plasmid-DNS, im Melanommodell M-3 führt zu signifikanter Hemmung des Tumorwachstums.
Mittels Transferrin abgeschirmte Transfektionskomplexe, enthaltend ein für TNF-α kodierendes Plasmid, wobei das Plasmid pGS-muTNF-α mit der authentischen TNF-α- Leadersequenz verwendet wurde, wurden in 75mM NaCl, 20mM HEPES bei einer DNS-Konzentration von 200μg/ml hergestellt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Tf-PEI/PEI (22) /DNS-Transfektionskomplexe (N/P=4.8, Tf-PEI :PEI=1: 3) wurden durch schnelles
Mischen einer Polykation-Lösung (bestehend aus 31μg/ml Tf-PEI und 94μg PEI (22) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt.
Isotonie der Transfektionskomplexlösungen wurde durch Zugabe von Glukose in einer Endkonzentration von 2.5% eingestellt .
In sechs Applikationen wurden die Transfektionskomplexe (enthaltend jeweils 50μg DNS/250μl) über die Schwanzvene systemisch in die Blutbahn tumortragender DBA/2 Mäuse (10 Tiere pro Applikationsgruppe) appliziert. Die Mäuse waren dazu 8 Tage vorher mit 106 M-3 Tumorzellen (Melanom) subkutan in die Flanke injiziert worden, und hatten zum Zeitpunkt der ersten Applikation der Transfektionskomplexe einen subkutan wachsenden Tumor mit einem Durchmesser von ca. 6-8 mm.
Das Tumorwachstum wurde über die folgenden 3 Wochen verfolgt.
Systemische Applikation von mittels Transferrin abgeschirmten TNF-α-Gen-haltigen Transfektionskomplexen in die Blutbahn der Maus führte zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich zu den unbehandelten Kontrolltieren wie auch im Vergleich zu Tieren, die mit denselben Gentransferkomplexen, jedoch mit therapeutisch nicht-relevanter Plasmid DNS (z.B. dem ß-Galaktosidasereportergen) behandelt worden waren (* p<0.01) (Experiment gemäß Fig. lli) .
Es wurden keine systemischen TNF-α-vermittelten Toxizitäten gefunden.
Beispiel 13
Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin- haltigen Polykation/DNS-Komplexen, enthaltend TNF-α Plasmid-DNS, führt im Melanommodell B16F10 zu signifikanter Hemmung des Tumorwachstums.
Mittels Transferrin abgeschirmte Transfektionskomplexe, enthaltend ein für TNF-α kodierendes Plasmid, wobei das Plasmid pGS-muTNF-α mit der authentischen TNF-α- Leadersequenz verwendet wurde, wurden in 75mM NaCl, 20mM HEPES bei einer DNS-Konzentration von 200μg/ml hergestellt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Tf-PEI/PEI (22) /DNS-Transfektionskomplexe (N/P=4.8, Tf-PEI :PEI=1: 3) wurden durch schnelles Mischen einer Polykation-Lösung (bestehend aus 31μg/ml Tf-PEI und 94μg PEI (22) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt.
Isotonie der Transfektionskomplexlösungen wurde durch Zugabe von Glukose in einer Endkonzentration von 2.5% eingestellt .
In sechs Applikationen wurden die Transfektionskomplexe (enthaltend jeweils 50μg DNS/250μl) über die Schwanzvene systemisch in die Blutbahn tumortragender C57B1/6 Mäuse (10 Tiere pro Applikationsgruppe) appliziert. Die Mäuse waren dazu 8 Tage vorher mit 106 B16F10 Tumorzellen (Melanom) subkutan in die Flanke injiziert worden, und hatten zum Zeitpunkt der ersten Applikation der Transfektionskomplexe einen subkutan wachsenden Tumor mit einem Durchmesser von ca. 6-8 mm.
Das Tumorwachstum wurde über die folgenden 3 Wochen verfolgt .
Systemische Applikation von mittels Transferrin abgeschirmten TNF-α-Gen-haltigen Transfektionskomplexen in die Blutbahn der Maus führte zu einer geringen, jedoch signifikanten Hemmung des Tumorwachstums im
Vergleich mit unbehandelten Kontrolltieren wie auch im
Vergleich zu Tieren, die mit denselben
Gentransferkomplexen, jedoch mit therapeutisch nicht- relevanter Plasmid DNS (z.B. dem ß-Galaktosidasereportergen) behandelt worden waren
(Experiment gemäß Fig. 12).
Es wurden keine systemischen TNF-α-vermittelten Toxizitäten festgestellt.
Beispiel 14
Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin- haltigen Polykation/DNS-Komplexen, enthaltend TNF-α Plasmid-DNS, in Kombination mit einem Chemotherapeutikum
Mittels Transferrin abgeschirmte Transfektionskomplexe, enthaltend ein für TNF-α kodierendes Plasmid, wobei das Plasmid pGS-muTNF-α mit der authentischen TNF-α- Leadersequenz verwendet wurde, wurden in 75mM NaCl, 20mM HEPES bei einer DNS-Konzentration von 200μg/ml hergestellt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Tf-PEI/PEI (22) /DNS-Transfektionskomplexe (N/P=4.8, Tf-PEI :PEI=1: 3) wurden durch schnelles Mischen einer Polykation-Lösung (bestehend aus 31μg/ml Tf-PEI und 94μg PEI (22) /ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (200μg DNS/ml in 75mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt.
Isotonie der Transfektionskomplexlösungen wurde durch Zugabe von Glukose in einer Endkonzentration von 2.5% eingestellt .
In sieben Applikationen in 2-3 tägigen Abständen wurden die Transfektionskomplexe (enthaltend jeweils
50μg DNS/250μl) über die Schwanzvene systemisch in die Blutbahn tumortragender C57B1/6 Mäuse (8 Tiere pro Applikationsgruppe) als Einzeltherapie oder in Kombination mit Doxil (erste Applikation: 4.5 mg/kg, alle weiteren Applikationen: 1.5 mg/kg) appliziert. Die Mäuse waren dazu 8 Tage vorher mit 106 B16F10 Tumorzellen (Melanom) subkutan in die Flanke injiziert worden, und hatten zum Zeitpunkt der ersten Applikation der Transfektionskomplexe einen subkutan wachsenden Tumor mit einem Durchmesser von ca. 6-8 mm.
Das Tumorwachstum wurde über die folgenden 3 Wochen verfolgt .
Systemische Applikation von mittels Transferrin abgeschirmten TNF-α-Gen-haltigen Transfektionskomplexen allein in die Blutbahn der Maus führte zu einer geringen Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich mit unbehandelten Kontrolltieren (Experiment gemäß Fig. 13) . In der Kombination mit Doxil jedoch führte die Applikation von mittels Transferrin abgeschirmten TNF-α-Gen-haltigen Transfektionskomplexen zu ausgeprägten Tumornekrosen in 7/8 Tieren und einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums (p<0.01) gegenüber den unbehandelten Kontrolltieren.
Es wurden keine systemischen TNF-α-vermittelten Toxizitäten festgestellt.
Beispiel 15
Systemische Applikation von abgeschirmten Transferrin- haltigen Polykation/DNS-Komplexen, enthaltend TNF-α Plasmid-DNS, in Kombination mit einem Chemotherapeutikum
Mittels Transferrin abgeschirmte Transfektionskomplexe, enthaltend ein für TNF-α kodierendes Plasmid, wobei das Plasmid pGS-muTNF-α mit der authentischen TNF-α- Leadersequenz verwendet wurde, wurden in 150mM NaCl, 20mM HEPES bei einer DNS-Konzentration von 160μg/ml hergestellt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Tf-PEI/PEI (22) /DNS-Transfektionskomplexe (N/P=4.8, Tf-PEI:PEI=1:4) wurden durch schnelles Mischen einer Polykation-Lösung (bestehend aus 20μg/ml Tf-PEI und 80μg PEI (22) /ml in 150mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (160μg DNS/ml in 150mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt. In acht Applikationen in 2-3 tägigen Abständen wurden die Transfektionskomplexe (enthaltend jeweils 40μg DNS/250μl) über die Schwanzvene systemisch in die Blutbahn tumortragender C57B1/6 Mäuse (8 Tiere pro Applikationsgruppe) als Einzeltherapie oder bei jeder zweiten Applikation in Kombination mit Doxil (1.5 mg/kg) appliziert. Die Mäuse waren dazu 8 Tage vorher mit 106 B16F10 Tumorzellen (Melanom) subkutan in die Flanke injiziert worden, und hatten zum Zeitpunkt der ersten Applikation der Transfektionskomplexe einen subkutan wachsenden Tumor mit einem Durchmesser von ca. 6-8 mm.
Das Tumorwachstum wurde über die folgenden 3 Wochen verfolgt .
Systemische Applikation von mittels Transferrin abgeschirmten TNF-α-Gen-haltigen Transfektionskomplexen allein in die Blutbahn der Maus führte zu einer geringen Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich mit unbehandelten Kontrolltieren (Experiment gemäß Fig. 14) . In der Kombination mit Doxil jedoch führte die Applikation von mittels Transferrin abgeschirmten TNF-α-Gen-haltigen Transfektionskomplexen zu ausgeprägten Tumornekrosen in allen 8 Tieren und einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums (p<0.01) gegenüber den unbehandelten Kontrolltieren als auch gegenüber den Tieren, die entweder nur TNF-α Gentherapie oder nur Doxil als Monotherapie erhalten hatten.
Es wurden keine systemischen TNF-α-vermittelten Toxizitäten festgestellt. Beispiel 16
Lagerung von abgeschirmten Transferrin-haltigen Polykation/DNS-Komplexen über einen längeren Zeitraum
Mittels Transferrin abgeschirmte Transfektionskomplexe, enthaltend ein für TNF-α kodierendes Plasmid, wurden in 150mM NaCl, 20mM HEPES bei einer DNS-Konzentration von 80μg/ml hergestellt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Tf-PEI/PEI (22) /DNS-Transfektionskomplexe (N/P=4.8, Tf-PEI: PEI=1:4) wurden durch schnelles Mischen einer Polykation-Lösung (bestehend aus lOμg/ml Tf-PEI und 40μg PEI (22) /ml in 150mM NaCl, 20mM HEPES) und einer Lösung der DNS (80μg DNS/ml in 150mM NaCl, 20mM HEPES) hergestellt. Insgesamt wurden 2.5 ml DNS- Komplexe hergestellt.
Direkt nach Komplexbildung wurde von einem Aliquot der frisch formulierten DNS-Komplexe Zetapotenzial und Partikelgröße mit Hilfe eines Zetasizers 3000 gemessen (wie im Beispiel 1 beschrieben) .
Ein Teil (0.5 ml) der DNS-Komplexe wurde nach der Mischung weiter bei Raumtemperatur gelagert, während der restliche Anteil in Aliquoten von 250μl schockgefroren wurde und im Weiteren bei -80 °C gelagert wurde. Von beiden Anteilen, den bei Raumtemperatur gelagerten sowie den bei -80°C gelagerten DNS-Komplexen, wurden zu den entsprechenden Zeitpunkten Aliquote entnommen und Zetapotenzial und Partikelgröße gemessen. Die eingefrorenen Aliqote wurden dazu bei +37 °C schnell aufgetaut. Die zu den entsprechenden Zeitpunkten gemessenen Partikelgrößen der DNS-Komplexe sind in Fig. 15 gezeigt. Es ist zu sehen, dass sowohl die bei Raumtemperatur gelagerten als auch die eingefrorenen DNS-Komplexe über längere Zeiträume stabil sind. Ebenso wurde zu allen Zeitpunkten eine stabile Abschirmung des ZetaPotenzials der Komplexe gemessen (<+10mV) .
Tabelle 1
Tabelle 2
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Claims

Patentansprüche
1. Komplex für die Behandlung von Tumorerkrankungen mittels systemischer Applikation von DNS, enthaltend, in exprimierbarer Form, ein oder mehrere DNS-Moleküle, kodierend für ein oder mehrere therapeutisch wirksame Proteine mit zytotoxischer Aktivität und ein Polykation, das die DNS kondensiert und ganz oder teilweise mit Transferrin konjugiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex eine Oberflächenladung aufweist, die einem
Zetapotenzial von <+15mV, erhalten durch Messung in wässeriger Lösung bei einer Konzentration von >10mM NaCl, entspricht, wobei die Abschirmung der positiven Ladungen im Komplex zu mehr als 50% durch Transferrin erfolgt.
2. Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Zetapotenzial +10mV bis -10 mV beträgt.
3. Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Zetapotenzial +5 mV bis -5mV beträgt.
4. Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS für TNF-α und/oder für TNF-ß und/oder IL-1 und/oder IL-6 kodiert.
5. Komplex nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS für TNF-α kodiert.
6. Komplex nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der DNS-Sequenz eine sekretorische Leader-Sequenz vorgeschaltet ist.
7. Komplex nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Leader-Sequenz die TNF-α TypII Leader-Sequenz ist.
8. Komplex nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Leader-Sequenz eine Typl Immunglobulin-
Leader-Sequenz ist.
9. Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS für IFN-α oder für IFN-γ kodiert.
10. Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS für ein Toxin kodiert.
11. Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS für ein Selbstmordgen kodiert.
12. Komplex nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Selbstmordgen das Herpes Simplex Thymidinkinase-Gen ist.
13. Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das mit Transferrin konjugierte Polykation ausgewählt ist aus der Gruppe Polyethylenimine, homologe polykationische Polypeptide, Histone, Spermine, Spermidine, kationische Lipide und Dendrimere .
14. Komplex nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Polykation ein lineares oder verzweigtes Polyethylenimin mit einem mittleren Molekulargewicht von ca. 2000 D und 800000 D ist.
15. Komplex nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das homologe polykationische Polypeptid Polylysin ist.
16. Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das N/P-Verhältnis etwa 0.5 bis etwa 100 beträgt.
17. Komplex nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das N/P-Verhälntis etwa 2 bis etwa 20 beträgt .
18. Komplex nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass N/P-Verhältnis etwa 4 bis etwa 10 beträgt.
19. Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis Transferrin: Polykation (w/w) etwa 3:1 bis etwa 1:4 beträgt.
20. Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex einen Anteil von nicht-
Transferrin-konjugiertem Polykation enthält, wobei das molare Verhältnis Transferrin-konjugiertes Polykation:nicht-konjugiertes Polykation etwa 1:0 bis etwa 1:20 beträgt.
21. Komplex nach Anspruch 1 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Transferrin-konjugierte oder das nicht-konjugierte Polykation mit einem hydrophilen Polymer konjugiert ist.
22. Komplex nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile Polymer ein Polyethylenglykol ist .
23. Komplex nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Abschirmung der positiven Ladungen zu höchstens 30% durch das hydrophile Polymer erfolgt.
24. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als wirksamen Bestandteil einen oder mehrere der in einem der Anprüche 1 bis 23 definierten Komplexe.
25. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 24, enthaltend außerdem ein Chemotherapeutikum.
26. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Chemotherapeutikum ausgewählt ist aus der Gruppe Doxorubicin, Taxol, 5-Fluoruracil, Cisplatin und Vinblastin.
27. Verwendung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 23 zur Verabreichung bei der Behandlung von Krebs in Kombination mit einer vorangehenden, gleichzeitigen oder nachfolgenden Verabreichung eines Chemotheapeutikums .
28. Verwendung eines Komplexes nach Anspruch 27, wobei das Chemotherapeutikum ausgewählt ist aus der Gruppe Doxorubicin, Taxol, 5-Fluoruracil, Cisplatin und Vinblastin.
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