WO2002024231A1 - Utilisation d'un complexe acide nucleique/pei - Google Patents

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WO2002024231A1
WO2002024231A1 PCT/FR2001/002952 FR0102952W WO0224231A1 WO 2002024231 A1 WO2002024231 A1 WO 2002024231A1 FR 0102952 W FR0102952 W FR 0102952W WO 0224231 A1 WO0224231 A1 WO 0224231A1
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animal
nucleic acid
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stem cells
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PCT/FR2001/002952
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Barbara Demeneix
Grégory LEMKINE
Giovanni Levi
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
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    • A01K2217/00—Genetically modified animals
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to biology, and more particularly to gene therapy.
  • the present invention relates to a new use of a nucleic acid / cationic polymer complex, and in particular nucleic acid / polyethylenimine for the preparation of a composition intended for targeting brain stem cells.
  • a composition is particularly intended for the preparation of a medicament intended for the treatment of neurodegenerative and / or demyelinating diseases.
  • the invention also also relates to a process for obtaining an animal with the exception of man, at least one brain stem cell of which has undergone a site-specific recombination event targeted at the level of a DNA sequence of interest.
  • the invention also relates to the animal capable of being obtained by the process.
  • Neurodegenerative diseases are a major and growing public health problem among the aging population. This is the reason why a lot of efforts are currently directed towards the development of gene transfer protocols in the brain. Such protocols are difficult to develop since, among other things, they require efficient and safe transfer vectors, and to overcome the difficulties specific to DNA delivery in the brain, namely the existence of the blood-brain barrier. , which aims to prevent vascular delivery of vectors, and the post-mitotic state of the neuronal population.
  • adenoviruses Akli et al., 1994 ; Bajocchi et al., 1993; • Davidson et al., 1993; Le Gai La Salle, et al., 1993
  • vectors derived from the herpes virus Boviatsis et al., 1994; Pakzaban et al., 1994; ood et al., 1994
  • AAV adenovirus associated viruses
  • HIV human immunodeficiency virus
  • cationic lipids such as DOGS (Diocade cylamidoglycyl spermine or Transfectam® (Behr et al., 1989) or Lipofectin® (Felgner et al., 1987)
  • polymeric cations binding DNA such as poly-L-Lysine (PLL), protamine, "cationized” albumin, polyethylenimine (PEI) (Boussif et al., 1995), "blocks copolymers ”(Read et al., 2000; Oupicky et al., 2000; Wolfert et al., 1999), and polyamidoamine dendrimers (Tang et al., 1996; Planck et al., 1999).
  • DOGS Diocade cylamidoglycyl spermine or Transfectam® (Behr et al., 1989) or Lipofectin® (Felgner et al., 1987)
  • cationic polymers and in particular PEI for the delivery of genes in vivo has shown that these vectors can provide high levels of expression in the brain (Abdallah et al., 1996; Boussif et al., 1995; Goula et al., 1998; Lemkine et al., 1999).
  • the present invention therefore proposes to solve this problem by specifically targeting the cells of the central nervous system (CNS) which have retained their ability to divide and differentiate.
  • CNS central nervous system
  • the cells which correspond to neuronal stem cells have recently been demonstrated in vivo by the use of retroviruses, or by the use of a marker such as thymidine or bromodeoxy-uridine.
  • the resolution of the technical problem was obtained by introducing, preferably by injecting, the composition according to the invention into the adult brain, and preferably into one or more cerebral ventricles, near or in the ventricular stem cells of the brain, preferably from the adult brain.
  • the composition according to the invention is injected into the cerebral ventricle (s) where the embryonic stem cells of the brain have been located (that is to say the cerebral ventricular stem cells). Even more preferably, it is one or more lateral ventricles.
  • the composition according to the invention can be injected into the 3 rd or 4 th ventricle and then diffused into the cephalic fluid to reach the ventricular embryonic stem cells.
  • the composition according to the invention is introduced, preferably by intraventricular injection into the adult brain, the injection of said composition being carried out stereotaxically and said injection lasting at least 10 minutes, possibly at least 15 minutes, or at least 20 minutes .
  • the resolution of the technical problem was also obtained by using quantities of nucleic acids and reduced injection volumes.
  • the amount of said nucleic acid present in said composition must be at least less than 2.5 ⁇ g. Thus, it can be less than 2 ⁇ g, 1.75 ⁇ g, 1.5 ⁇ g, 0.75 ⁇ g, 0.5 ⁇ g, 0.25 ⁇ g, 0.1 ⁇ g, 0.05 ⁇ g, 0.01 ⁇ g.
  • the volume of composition injected into the brain of adult mice is less than 5 ⁇ l, possibly less than 4 ⁇ l, less than 3 ⁇ l, less than 2 ⁇ l, less than 1 ⁇ l.
  • the present invention relates to the use of a nucleic acid / cationic polymer complex for the preparation of a composition intended for targeting stem cells.
  • ventricular of the adult brain of an animal characterized in that the quantity of said nucleic acid present in said composition is adapted as a function of the volume of the cerebral ventricle of said animal and determined in proportion to the quantity used to target the stem cells of the brain of adult mice, the concentration of said nucleic acid present in the ventricle of said animal being less than or equal to that used for targeting the stem cells of the brain of adult mice.
  • the present invention also relates to the use of a nucleic acid / cationic polymer complex for the preparation of a composition intended for targeting ventricular stem cells of the adult brain, characterized in that the volume of said composition is adapted as a function of the volume. of the cerebral ventricle of said animal and is determined in proportion to the volume used to target the stem cells of the brain of adult mice.
  • the cell targeted by the compound of the present invention is a eukaryotic cell from an animal.
  • the animal according to the invention is a vertebrate, more preferably a mammal, preferably chosen from the group composed of mice, rats, rabbits, hamsters, guinea pigs, cattle, goats, sheep, horses, primates, including humans.
  • the animal is a human, the brain stem cell being a human cell.
  • the animal is a mouse and the stem cell is a murine cell.
  • the present invention is not limited only to the targeting of brain stem cells, but also to brain cells which are not in the post-mitotic state and which are capable of dividing; in this connection, mention may be made of brain tumor cells, such as, for example, gliomas, astrocytomas.
  • the introduction of said composition is carried out stereotaxically.
  • any means making it possible to deliver the composition of the invention close to or in the stem cells of the brain can be envisaged; in this regard, mention should be made of all the targeting systems across the blood / brain barrier by the systemic route.
  • said cationic polymer is chosen from the group composed of polycationic polymers such as polyethyleneimine (PEI), poly-L-lysine, poly-D-lysine, polyamidoamine, polyamine, block copolymers (Read et al., 2000; Oupicky et al., 2000; Wolfert et al., 1999), and polyamidoamine dendrimers (Tang et al., 1996; Plank et al., 1999).
  • the polycationic polymer is polyethyleneimine (PEI).
  • it is PEI of low molecular weight, more preferably, it is PEI having an average molecular weight less than or equal to 88 kDa, less than or equal to 44 kDa, less than or equal to 35 kDa , less than or equal to 30 kDa, less than or equal to 22 kDa, less than or equal to 11 kDa. Even more preferably, the PEI used is a PEI 22 kDa (EXG ⁇ NE 500 ®, EUROMETEX Soufflemeyersheim, France).
  • cationic polymers can optionally be used such as nucleic acid binding proteins, among which mention should be made of histones, protamine, ornithine, putrescine, spermidine, spermine.
  • nucleic acid binding proteins among which mention should be made of histones, protamine, ornithine, putrescine, spermidine, spermine.
  • grafting the cationic polymer with proteins, antibodies or ligands of membrane receptors making it possible to specifically target cells by facilitating the internalization of the complexes.
  • the nucleic acid / cationic polymer complex according to the invention is intended for the preparation of a medicament intended for the treatment of neurodegenerative and / or demyelinating diseases.
  • diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, multiple sclerosis.
  • the complex according to the invention can also be used for the preparation of a medicament intended to modify the fate of brain stem cells and / or to increase the survival of brain stem cells.
  • said nucleic acid is chosen from single-strand DNA, double-strand DNA, single-strand RNA, double-strand RNA, RNA / DNA hybrid.
  • said nucleic acid is double-stranded DNA or single-stranded RNA which codes at least for a protein product of interest which is expressed effectively in said stem cell. of the brain.
  • Said protein product of interest is chosen from the group composed of pro-apoptotic or anti-apoptotic proteins, survival factors, differentiation factors, cytokines, lymphokines, interleukins, growth factors, transcription factors , killer proteins, recombinases, integrases, transposases, enzymes involved in nucleic acids, proteins "report”.
  • pro or anti-apoptotic proteins which may or may not be involved in the mitochondrial pathway
  • said protein product of interest is the BclX L protein.
  • interleukins, cytokines and lymphokines are chosen from a group preferably composed of interleukins 11-1, 11-2, 11-3, 11-4, 11-5, 11-6, 11-7, 11-8, 11- 9, 11-10, 11-11, 11-12, 11-13, 11-14, 11-15,
  • the growth factors are preferably the epithelial growth factor (EGF, Epithelial Gro th Factor), the fibroblast growth factor (FGF, Fibroblast Growth Factor and bFGF, basic fibroblast Growth Factor), the platelet-derived growth factor ( PGDF, Platelet Derived Growth Factor), Nerve Growth Factor (NGF, Nerve Growth Factor), Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), Derived Growth Factor glia (Glial Derived Growth Factor); colony stimulating factors (such as G-CSF, GM-CSF, M-CSF) and erythropoietin should also be mentioned. Mention should also be made of the growth factors which interact by inhibiting them, with nuclear transcription factors such as NF-K ⁇ .
  • transcription factors which make it possible to direct the expression of a gene in a particular cell type or at a given point in the differentiation of brain cells and it is worth mentioning the factors of transcription particularly involved in the differentiation of neuronal cells, such as neurogenins, and glial cells, such as GCM (Glial Cell Missing).
  • neuronal cells such as neurogenins, and glial cells, such as GCM (Glial Cell Missing).
  • GCM Glial Cell Missing
  • a nucleic acid molecule which codes for a protein product of interest chosen from killer proteins among the killer proteins, mention should be made of kinases, and preferably thymidine kinase, and pro-apoptotic proteins; the term “pro-apoptotic proteins” is intended to denote the proteins which intervene in apoptosis or promote apoptosis.
  • pro-apoptotic proteins mention should be made of the proteins BIK (“Bcl2-interacting protein”), BAX (Oltvai et al. 1993), BAK (Chittenden et al.
  • protein recombinase is meant the recombinases of the integrase family which catalyze the excision, insertion, inversion or translocation of DNA fragments at specific recognition sites for said recombinases (Sternberg et al ., 1986; Sauer, et al., 1990; Barbonis et al., 1993; Kilby et al., 1993; Sauer, 1994; Denisen et al., 1995). These recombinases are active in animal cells (Sauer, 1994).
  • the protein recombinase of the invention is preferably selected from the group of site-specific recombinases composed of the recombinase Cre of bacteriophage PI, the recombinase FLP of Saccharomyces cerevisiae, the recombinase R of pSR1 of Zygosaccharomyces rouxii, the recombinase A of pKDl of Kluyveromyces drosophilarium, recombinase A from pKWl from Kluyveromyces wal tii, integrase ⁇ Int, recombinase from the GIN recombination system of phage Mu, or a variant thereof.
  • the recombinase is the Cre recombinase (“cyclization recombination”) which is a 38 KDa integrase from bacteriophage Pi which catalyzes, in the absence of cofactors, the recombination between two DNA sequences of 34 base pairs called "loxP site” (Sauer et al., 1990).
  • Cre recombination a 38 KDa integrase from bacteriophage Pi which catalyzes, in the absence of cofactors, the recombination between two DNA sequences of 34 base pairs called "loxP site" (Sauer et al., 1990).
  • the position on one or more DNA molecules, and the orientation of loxP sites with respect to each other, determine the type of function of the Cre recombinase: excision, insertion, inversion or translocation.
  • the Cre recombinase activity is an inversion when two loxP sites are head to tail on the same DNA fragment and an excision, when the loxP sites are in direct repetition on the same DNA fragment.
  • the recombinase activity is an insertion when a loxP site is present on a DNA fragment, a DNA molecule such as a plasmid containing a loxP site can be inserted at said loxP site. Cre recombinase can also induce translocation between two chromosomes provided that a loxP site is present on each of them (Babinet, 1995).
  • the Cre recombinase is therefore capable of catalyzing the recombination between one or more different DNA molecules, provided that they carry loxP sites. It is therefore one of the objects of the present invention to use a nucleic acid / PEI complex for targeting stem cells to introduce therein a vector expressing the site-specific recombinase, in which the site-specific recombinase, encoded, is expressed. by said nucleic acid, to catalyze the recombination of a DNA fragment from the genome of said brain stem cell.
  • transposases mention should be made of the patented “transposon sleeping beauty” system (Kay and al. , 2000) or any other system making it possible to introduce, by co-transfection, a plasmid with IR (“Inverted Repeat”) sequences framing a nucleic acid sequence of interest with another plasmid expression vector for a transposase specific for IR sequences.
  • IR Inverted Repeat
  • Such transposases catalyze the transposition and / or integration of a DNA sequence of interest into the genome of said stem cell; this DNA sequence of interest can be introduced into said cell using the complex according to the invention.
  • RNA polymerase-DNA RNA polymerase-DNA. dependent, reverse transcriptases.
  • the nucleic acid molecule is an antisense RNA, a double-stranded RNA, or a DNA / RNA chimera; Such RNA molecules can be used to inhibit the expression of a protein product of interest.
  • the compound according to the invention has multiple applications depending on the nature of the DNA sequence. These multiple applications are easily conceivable by a person skilled in the art and cannot be mentioned in an exhaustive manner. Nevertheless, it should be emphasized that the protein of interest encoded by the nucleic acid, or the antisense RNA, can be used to alter the expression of at least one cellular or mitochondrial gene, that is in other words, to decrease, to increase, to modulate, to annihilate the expression of said gene.
  • the protein of interest may also be used to induce expression of at least one gene of interest, in this case the a protein of interest is preferably a transcription factor.
  • the protein of interest is a “report” protein.
  • reporter proteins it should be mentioned in a non-exhaustive manner, luciferase, green fluorescence protein (GFP, for Green fluorescence protein), ⁇ -galactosidase ( ⁇ -gal), chloramphenicol-acetyl-transferase (CAT).
  • GFP green fluorescence protein
  • ⁇ -gal ⁇ -galactosidase
  • CAT chloramphenicol-acetyl-transferase
  • Such "report” proteins can be used to track the fate of stem cells in the brain. It is therefore one of the objects of the present invention to use the complex according to the invention to target brain stem cells, in which the nucleic acid codes for a “report” protein or constitutes a signal generator marker, in order to to enable the detection, localization and imaging of brain stem cells.
  • the nucleic acid constitutes a signal generator marker when the latter is marked by radioactive isotopes or by non-isotopic entities;
  • the non-isotopic entities can be selected from enzymes, dyes, haptens, luminescent agents such as radioluminescent, chemiluminescent, bioluminescent, fluorescent, phosphorescent agents, ligands such as biotin, avidin, streptavidin, digoxygenin .
  • the methods for revealing and detecting these markers are well known to those skilled in the art.
  • the present invention therefore provides an efficient system which enables active or passive transport of the nucleic acid molecule through the cytoplasmic cell membrane, transport to the nucleus, entry into the nucleus and maintenance of the functional state of this molecule in the nucleus.
  • the persistence of the expression of the protein product encoded by the DNA molecule is obtained either by the stable integration of the DNA molecule into the chromosomal DNA of the target cell, or by maintaining the DNA molecule under the episomal form. For certain applications, transient expression with a plasmid in episomal form may suffice to obtain the desired results.
  • the subject of the invention is also a process for obtaining an animal, with the exception of humans, at least one brain stem cell of which has undergone at least one site-specific recombination event targeted at the level of 'a DNA sequence of interest, characterized in that said method comprises the steps of:
  • DNA sequence (s) of interest located in one or more chromosomes by homologous recombination; (b) introducing said modified totipotent embryonic stem cell into an embryo of said organism; (c) selection of individuals who have integrated genetic modification into germ cells;
  • step (d) development of said animal;
  • step (e) introduction of at least one said nucleic acid / cationic polymer complex into the brain of said animal obtained in step (d) near or in ventricular stem cells, said nucleic acid coding at least for a recombinase protein capable of catalyzing recombination between said recognition sequences of said recombinase;
  • At least one second nucleic acid / cationic polymer complex can be introduced into the brain of said animal in step (e), said second nucleic acid is a gene of interest as previously described.
  • said second nucleic acid is a gene of interest as previously described.
  • the invention also relates to another mode of production of an animal, with the exception of man, at least one cell with a high mitotic power of the brain, preferably a stem cell of the brain, has undergone at least one site-specific recombination event targeted at a DNA sequence of interest, characterized in that said method comprises the steps of: a) obtaining a modified somatic cell by inserting recognition site (s) of said protein recombinase into said DNA sequence (s) of interest located in one or more chromosome (s), by homologous recombination ; b) transfer of the nucleus of said modified somatic cell into the cytoplasm of an enucleated recipient oocyte (nuclear cloning); c) development of the embryo obtained in step b); d) introduction of at least one said nucleic acid / cationic polymer complex into the brain of said animal obtained in step (c) near or in ventricular stem cells, said nucleic acid coding at least for a protein recombina
  • the insertion of the specific recognition sites, in particular of the LoxP site (s) for the Cre recombinase in the DNA sequence of interest is preferably done by homologous recombination; according to another embodiment, it can be performed randomly.
  • the invention also relates to a process for obtaining an animal intended for the screening of compounds intended to modify the fate of stem cells of the brain, characterized in that it comprises the following stages:
  • said complex is introduced by intraventricular stereotaxic route; the nucleic acid of said complex is preferably double-stranded DNA which integrates into the genome of brain stem cells.
  • said nucleic acid is a double-stranded nucleic acid which is present in the episomal state, in this case, the nucleic sequence may be capable of self-replicating and may or may not be amplified extra -chromosomique.
  • the nucleic acid of the complex according to the invention is introduced in the form of an expression vector.
  • vector we mean a nucleotide sequence capable of being transcribed.
  • the vector may in particular be a bacterial plasmid DNA, a cosmid, phage DNA, viral DNA, in particular of retroviruses or adeno-associated viruses, a mini-chromosome (BAC, YAC, HAC, etc.). .), a transposon.
  • the vector or one of its fragments comprises at least one gene coding for a protein of interest or an RNA antisense, and a promoter or expression elements making it possible to direct and control the expression of said protein of interest or of said antisense RNA in at least one stem cell of the brain of said organism.
  • the expression vector further comprises signals for initiating and terminating translation, as well as suitable regions for regulating transcription. These different control signals are chosen according to the cell type.
  • expression elements is meant all the DNA sequences involved in the regulation of gene expression, that is to say the minimal promoter sequence, the upstream sequences, the activator sequences (“enhancers”), possibly the inhibitor sequences (“silencers”), the “insulator” sequences.
  • tissue-specific expression elements or tissue-specific promoters are chosen from promoters which make it possible to obtain a specific, and preferably strong, expression in one or more cell (s), tissue (s), type (s) cell (s), of the brain and in particular in neurons, astrocytes, oligodendrocytes, glial cells. These promoters may or may not be heterologous to the organism and may or may not be naturally present in the genome of the organism.
  • tissue-specific promoters By way of nonlimiting example of tissue-specific promoters, mention may be made of the promoter of the “Myelin Basic Protein” (MBP) gene specific for oligodendrocytes, the promoter of the gene coding for neuron-specific Enolase (NSE) specific for neurons.
  • MBP Myelin Basic Protein
  • NSE neuron-specific Enolase
  • the expression elements consist of inducible promoters such as for example the tetracycline system (Goossen et al, 1992).
  • the invention also relates to a method for screening for compounds intended to modify the fate of stem cells of the brain, characterized in that it comprises the steps:
  • the compound capable of being obtained by the above process can be used for the preparation of a medicament intended for the treatment of neurodegenerative and / or demyelinating diseases.
  • Figure 1 Distribution and morphology of cells expressing ⁇ -galactosidase after intraventricular injection of CMV-LacZ / PEI complexes.
  • Panel A shows a composite view of the distribution of positive cells observed in six independent experiments.
  • Transfected cells are particularly abundant in the striatal part of the lateral ventricles where they can be found in the anterior and posterior subventricular zone (SVZ) (C).
  • Groups of positive cells are also present in the hippocampal region (hp) of the posterior lateral ventricle (C, C) and along the third ventricle
  • H 40 ⁇ m; (D), 100 ⁇ m; (E-G and P), 20 ⁇ m.
  • ep ependyma; hip, seahorse; lu, lateral ventricle; svz, subventricular area.
  • Figure 2 Expression of GFAP and Nestine in transfected cells. Sections (8 ⁇ m) of brain of adult mouse transfected, one week before being sacrificed, with CMV-LacZ / PEI complexes.
  • the sections were doubly colored in order to detect the expression of Lac Z and of GFAP (A, B) or of Lac Z and of Nestine (C, D).
  • ⁇ -galactosidase positive cells are only present in GFAP and Nestine expression regions. At higher magnification, it appears that at least in some cells, GFAP
  • Figure 3 Ultrastructural analysis of the SVZ one week after the intra-ventricular injection of CMV-LacZ / PEI complex.
  • the sections are stained with BluoGal to reveal the expression of the transgene (cell circled in black).
  • Figure 4 Transfection by DNA / PEI complexes of cells with slow and rapid division in the SVZ.
  • mice were treated with BrdU according to different protocols in order to identify cells in the slow and fast dividing SVZ.
  • mice are treated with BrdU continuously for three weeks before being transfected and then sacrificed; in this case, all dividing cells incorporate the BrdU.
  • mice are treated for eighteen days with BrdU then by a purge period of three days without treatment with BrdU, before being analyzed.
  • the slow-dividing cells are marked intensely with anti-BrdU antibodies, while the fast-dividing cells exhibit less intense BrdU signal labeling since they continue to divide during the purge period.
  • mice only received a four-day treatment with BrdU; in this case, the rapidly dividing neuroblasts are positively labeled with BrdU. In all cases, the transduction of the cells is carried out in areas of intense cell proliferation.
  • Figure 5 Bcl-Xj transfection. in SVZ prolongs the survival of transfected cells.
  • BclX L allows a change in the expression profile of the Lac reporter gene to be observed one week after injection.
  • the plasmid CMV-GFP was cotransfected by intraventricular injection with a control plasmid or with the plasmid CMV-Bcl -X L. Immunodetection of the activated form of Caspase-3 was carried out on sections with cryostat (10 ⁇ m). The immunopositive cells were counted from 0.8 to 1.2 mm from the anterior part to bregma for each animal. The number of positive cells is reduced significantly in animals transfected with CMV-Bcl -X Dd compared to control animals injected or not injected (A) or not injected (see text). The means + SD (SD: standard deviation) are presented, with n> 4 animals per group.
  • CMV-CRE is transfected by a single intraventricular injection in R26R mice and the lacZ expression resulting from the recombination is observed 3 months after injection. Many lacZ-expressing cells can be detected at distances of 250 ⁇ m from the subventricular area. IV, lateral ventricle. Bar: 50 ⁇ m.
  • the purified DNA without endotoxin, is prepared using affinity columns (Genomed, Research Triangle Park, NC, USA). The DNA is washed with 70% ethanol, resuspended in Tris-EDTA buffer, and stored at 4 ° C.
  • plasmids comprising either the coding sequence of ⁇ -galactosidase for the histological study, or the coding sequence of firefly luciferase (Photinus pyralis) for biochemical quantification of transgene expression. Both genes are under the control of the Cytomegalovirus (CMV) promoter and obtained from Vical Inc., San Diego, CA, USA.
  • CMV Cytomegalovirus
  • the inventors constructed the expression vector pCMV-.Bcl-.Xj , containing the gene coding for the chicken protein Bcl-X L under the control of the CMV promoter in the plasmid pcDNA 3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was built in the laboratory (Sachs et al., 1997).
  • the plasmid DNA is diluted in 5% glucose at the desired concentration and then complexed with the appropriate amount of linear PEI 22 Kd (ratio of 6 between the protonable amines of PEI and the DNA phosphates, knowing that 1 ⁇ l of PEI 1M represents 1000 nmol of protonal amines and 1 ⁇ g of DNA represents 3 nmol of phosphates).
  • the complex solution is injected into the lateral ventricle (0.2 mm posterior to the bregma line, 1.1 mm laterally from the saggital suture and 2.2 mm deep relative to the surface of the skull) of mice approximately two years old months, anesthetized with Pentobarbital (Sanofi 65 mg / kg). The injection needle is left in place for at least 10 minutes.
  • mice are sacrificed, the brains are dissected and post-fixed in 2% Paraformaldehyde.
  • the ⁇ -galactosidase reaction is carried out on vibratome sections (50 ⁇ m) by immersion in an X-Gal solution at 30 ° C for five hours (0.4 mg / ml X-gal, Genaxis, Montigny le Bretonneux, France). After staining, the sections are mounted on gelatin slides. BrdU labeling is observed on parafin sections (5 ⁇ m) with an anti-BrdU mouse monoclonal antibody (Dako) at a 1:50 dilution in PBS with 1% bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the primary antibody is raised with a biotinylated anti-mouse antibody before its application to prevent endogenous reactivity (Dako Kit ARK).
  • the antigenic sites are unmasked by two microwave cycles (5 min. At 750W in a 10 mMol citrate buffer). Staining is then completed by incubation with peroxidase coupled to streptavidin and the reaction is carried out in the presence of diaminobenzidine as chromogenic substrate (Dako Kit ARK).
  • the primary anti-GFAP monoclonal antibody (Boehringer) is used at 1: 400 on parafin sections and detected as previously with the revelation system coupled with peroxidase (Dako Kit ARK).
  • the primary anti-Nestine monoclonal antibody (Chemicon) is used at 1: 500 on cryostat sections (10 ⁇ m) and detected as previously with the revelation system coupled with peroxidase (Dako Kit ARK).
  • mice treated with BrdU for three weeks are injected with the expression vector LacZ complexed with PEI, sacrificed four days post-injection, perfused with 3% paraformaldehyde and 0.2% glutaraldehyde.
  • the brains are dissected and postfixed. Sections are made using a vibratome (90 ⁇ m) and stained with a solution of BluoGal substrate (Gibco) for five hours at 30 ° C.
  • the sections are rinsed with cacodylate buffer (0.1 M, pH 7.2; Prolabo) and the aldehyde groups are blocked with NHC1 50mMol (Merck).
  • the sections After rinsing with a veronal buffer (pH6), the sections are contrasted with a 0.5% uranyl acetate solution (Fluka) in the same buffer, then dehydrated in a series of baths with an increasing ethanol gradient . The sections are finally included in an LRWhite resin (Sigma).
  • LRWhite resin Sigma
  • the immunodetection of BrdU and GFAP are carried out on the same face of the grid carrying the tissue.
  • the sections are incubated for thirty minutes in a saturation buffer (Sorensen buffer with bovine serum albumin (BSA) 1%).
  • BSA bovine serum albumin
  • the primary antibodies, rabbit polyclonal anti-GFAP at 1: 750 (Dako) and anti-BrdU mouse monoclonal at 1:25 (Caltag) are applied to the tissue in the Sorensen buffer containing 0.2% BSA and 0.025% Tween 20 (overnight at 4 ° C).
  • the secondary antibodies anti-rabbit goat IgG and anti-mouse goat IgG coupled to gold beads of 20 and 10 nm respectively, are applied to the specimens at a dilution of 1:50.
  • the counterstain corresponds to a fifteen-minute treatment in 4% uranyl acetate.
  • the sections are observed at 75 kV with a Hitachi H7100 electron microscope.
  • the inventors selected the sections corresponding to the vibratome (100 ⁇ m ). Blue cells are counted on six different brains to calculate the average number of cells for each site of expression of the transgene. Representative regions of the sections are chosen to be drawn on each of the coronal representations making up the cartography.
  • the R26R mouse line exhibits constitutive ⁇ -Gal expression in all cells where recombination by CRE recombinase takes place (Soriano, 1999). Thus, this provides an ideal system for long-term monitoring of the expression of a reporter gene expressing itself following the transfection of the CRE gene by the gene transfer using PEI.
  • CM1 polyclonal rabbit antibody, CM1 which specifically recognizes the pl8 subunit of cleaved Caspase-3 (given by the company IDUN
  • Caspase-3 is an effector caspase (Budihardjo et al., 1999) which acts downstream of Bcl -X L in post-mitotic neurons and which independently regulates apoptosis in neural stem cells of the subventricular zone in the new - born mouse (Roth et al., 2000).
  • the inhibitory action of Bcl -X L on programmed cell death must be reflected in a reduction in the number of cells expressing active Caspase-3 in the subventricular zone.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'un complexe acide nucléique/polymère cationique, de préférence le polyéthylènéimine (PEI) pour la préparation d'une composition destinée au ciblage par voie stéréotaxique intraventiculaire de cellules souches du cerveau pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies neurodégénératives et/ou démyélinisantes. L'invention concerne en outre un procédé d'obtention d'un animal dont le génome des cellules souches du cerveau sont modifiés par l'utilisation dudit complexe. L'invention concerne également un procédé d'obtention d'un animal destiné au criblage de composés destinés à modifier le devenir des cellules souches du cerveau.

Description

UTILISATION D ' UN COMPLEXE ACIDE NUCLEIQUE/ PEI
La présente invention est relative à la biologie, et plus particulièrement à la thérapie génique. La présente invention concerne une nouvelle utilisation d'un complexe acide nucléique / polymère cationique, et notamment acide nucléique / polyéthylènimine pour la préparation d'une composition destinée au ciblage de cellules souches du cerveau. Une telle composition est particulièrement destinée à la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies neurodégénératives et/ou démyélinisantes . L'invention concerne encore également un procédé d'obtention d'un animal à l'exception de l'homme dont au moins une cellule souche du cerveau a subi un événement de recombinaison site-spécifique ciblée au niveau d' une séquence ADN d'intérêt. L'invention porte également sur l'animal susceptible d'être obtenu par le procédé.
Les maladies neurodégénératives constituent un problème majeur et croissant de santé publique au sein de la population veillissante. C'est la raison pour laquelle beaucoup d'efforts sont actuellement dirigés vers le développement de protocoles de transfert de gènes dans le cerveau. De tels protocoles sont difficiles à développer car ils nécessitent entre autres de disposer de vecteurs de transfert efficaces et sûrs, et de surmonter les difficultés propres à la délivrance de l'ADN dans le cerveau, à savoir l'existence de la barrière sang-cerveau, qui vise à empêcher une délivrance vasculaire des vecteurs, et l'état post-mitotique de la population neuronale. Concernant les vecteurs de transfert, des succès significatifs de délivrance d'ADN dans le cerveau mature ont été obtenus par des approches expérimentales utilisant l'injection directe de vecteurs viraux basés sur des virus à ADN tels que les adenovirus (Akli et al . , 1994 ; Bajocchi et al . , 1993 ;• Davidson et al . , 1993 ; Le Gai La Salle, et al . , 1993), les vecteurs dérivés du virus de l'herpès (Boviatsis et al . , 1994 ; Pakzaban et al . , 1994 ; ood et al . , 1994) et les virus associés aux adenovirus (AAV) (Kaplitt et al . , 1994). Plus récemment, un système rétroviral basé sur le virus de 1 ' immunodéficience humaine (VIH) a été utilisé pour médier la transduction stable de neurones dans le cerveau de rat (Naldini et al . , 1996). Bien que les efforts soient majoritairement dirigés vers les vecteurs viraux, les techniques non virales constituent des alternatives variées et pleines de potentiels. En effet, les transporteurs chimiques de l'ADN présentent de nombreux avantages sur les vecteurs viraux. Ils sont d'une plus grande flexibilité dans leur utilisation, plus simples à préparer, à purifier, à stocker. Les données de sécurité et de toxicité sont également plus faciles à obtenir. Ils peuvent être employés avec toutes sortes d'ADN permettant ainsi l'utilisation de longues séquences nucléiques, telles un gène entier, associées avec les vecteurs plasmidiques .
Parmi les vecteurs non viraux, deux classes principales de molécules peuvent être globalement distinguées : les lipides cationiques tels que les DOGS (Diocade cylamidoglycyl spermine ou Transfectam® (Behr et al . , 1989) ou Lipofectin® (Felgner et al . , 1987), et les cations polymériques liant l'ADN tels que la poly-L-Lysine (PLL) , la protamine, l'albumine "cationisée", le polyéthylénimine (PEI) (Boussif et al . , 1995), les «blocks copolymères» (Read et al . , 2000; Oupicky et al . , 2000 ; Wolfert et al . , 1999), et les dendrimères polyamidoamine (Tang et al . , 1996; Planck et al . , 1999) .
L'utilisation de polymères cationiques et en particulier de PEI pour la délivrance de gènes in vivo a montré que ces vecteurs peuvent fournir des taux élevés d'expression dans le cerveau (Abdallah et al . , 1996 ; Boussif et al . , 1995 ; Goula et al . , 1998 ; Lemkine et al . , 1999) .
Pour contourner la difficulté que constitue la barrière "sang-cerveau", d'autres voies d'administration ont été développées telles que l'injection directe de virus tel le virus de l'herpès simplex atténué (Chambers et al . , 1995) ou l'injection stéréotaxique, telle l'injection de complexe ADN/PEI (Abdallah et al . , 1996). Une autre voie d' administration possible est constituée par la production locale de peptide thérapeutique ou de protéine ; ainsi des lignées cellulaires transformées par des rétrovirus ont été utilisées pour produire des protéines thérapeutiques pour corriger une maladie lysosomale affectant le cerveau (Snyder et al . , 1995) et des tumeurs cérébrales ont été traitées par des cellules produisant des rétrovirus (Culver et al . , 1992; Barba et al . , 1994). Le troisième obstacle majeur à la délivrance d'ADN dans le SNC, constitué par l'état post-mitotique de la grande majorité des cellules neuronales, représente jusqu'à présent un obstacle difficilement surmontable.
La présente invention se propose donc de résoudre ce problème en ciblant spécifiquement les cellules du système nerveux central (SNC) qui ont conservé leur aptitude à se diviser et à se différencier. En effet, les cellules qui correspondent aux cellules souches neuronales ont récemment été mises en évidence in vivo par l'utilisation de rétrovirus, ou par l'utilisation de marqueur tel la thymidine ou la bromodésoxy-uridine
(BrdU) ; les rétrovirus n'intégrant que les cellules en division, ils permettent de suivre toute la descendance cellulaire, reflétant ainsi un lignage particulier.
Après plusieurs années de recherches, deux sites sont maintenant reconnus comme étant les principaux lieux de prolifération cellulaire dans le cerveau adulte : la zone sub-ventriculaire et la zone sub-granulaire du denta te gyrus de l'hippocampe. Cependant toutes les cellules de ces régions n' ont pas le potentiel prolifératif de la sous-population cellulaire particulière que sont les cellules souches. Le phénotype exact de la cellule la plus primitive dans ces régions est encore mal connu, mais de récents articles ont éclairé cette question complexe. Johansson et al . (1999), ont apporté une démonstration qu'une sous-population de cellules épendymaires bordant le troisième ventricule était des cellules souches. Par la suite, Doetsch et al . (1999) ont présenté de plus clairs arguments en faveur d'une appartenance des cellules progénitrices à une classe de cellules sub- ventriculaires qui expriment le marqueur GFAP («Glial Fibrilly Acidic Protein») , ce qui indique que les cellules souches seraient des astrocytes sub- épendymaires . Par ailleurs, un troisième groupe a montré que même si ces deux types de cellules étaient capables de division, seules les astrocytes sub- épendymaires pouvaient se renouveler et donner naissance à des neurones et des cellules gliales (Chiasson et al . , 1999). Un autre marqueur permet de caractériser les cellules progénitrices du système nerveux central : la protéine nestine qui constitue un filament intermédiaire du cytosquelette ( cKay et al . , 1997) .
Il apparaît donc d'un intérêt majeur de développer un protocole permettant de cibler spécifiquement un transgène dans les cellules souches embryonnaires du cerveau adulte. C'est le problème que se propose de résoudre la présente invention. Les travaux de l'art antérieur, et notamment ceux de Goula et al . (1998), n'ont pas permis d'atteindre cet objectif. En effet, l'article de Goula et al . (1998), qui relate des travaux préliminaires de mise au point de l'utilisation de la PEI dans le système nerveux central de façon générale (c'est-à-dire aussi bien chez le nouveau-né que chez l'adulte), décrit une procédure de transfection ne permettant pas de cibler spécifiquement la population des cellules souches neurales adultes ; l'article de Goula et al . (1998) montre que les différents types cellulaires majeurs du cerveau, c'est- à-dire les cellules gliales et les neurones, sont indistinctement transfectés et expriment le transgène. De manière tout à fait fortuite, les inventeurs ont résolu le problème posé en utilisant un complexe acide nucléique/polymère cationique pour la préparation d'une composition destinée au ciblage de cellules souches du cerveau adulte.
La résolution du problème technique a été obtenue en introduisant, de préférence en injectant, la composition selon l'invention dans le cerveau adulte, et de préférence dans l'un ou les ventricules cérébraux, à proximité ou dans les cellules souches ventriculaires du cerveau, de préférence du cerveau adulte. De préférence, la composition selon l'invention est injectée dans le ou les ventricules cérébraux où ont été localisées les cellules souches embryonnaires du cerveau (c'est-à-dire les cellules souches ventriculaires cérébrales) . De manière encore plus préférée, il s'agit de l'un ou des ventricules latéraux. Egalement, la composition selon l'invention peut être injectée dans le 3eme ou 4eme ventricule puis diffusée dans le liquide céphalique pour atteindre les cellules souches embryonnaires ventriculaires. La composition selon l'invention est introduite, de préférence par injection intraventriculaire dans le cerveau adulte, l'injection de ladite composition se faisant par voie stéréotaxique et ladite injection durant au moins 10 minutes, éventuellement au moins 15 minutes, ou au moins 20 minutes. La résolution du problème technique a également été obtenue en utilisant des quantités d' acides nucléiques et des volumes d'injection réduits. En effet, pour réaliser le ciblage des cellules souches du cerveau de souris adulte, la quantité dudit acide nucléique présent dans ladite composition doit être au moins inférieure à 2,5 μg. Ainsi, elle peut être inférieure à 2 μg, à 1,75 μg, à 1,5 μg, à 0,75 μg, à 0,5 μg, à 0,25 μg, à 0,1 μg, à 0,05 μg, à 0,01 μg. Egalement, le ciblage des cellules souches du cerveau de souris adulte, nécessite de ne pas injecter un volume de ladite composition trop important qui ne doit en aucun cas excéder 5 μl, des volumes supérieurs entraînant un reflux au moment de l'injection et sont susceptibles de provoquer des lésions au niveau des tissus. Ainsi, le volume de composition injectée dans le cerveau de souris adulte est inférieure à 5 μl, éventuellement inférieure à 4 μl, inférieure à 3 μl, inférieure à 2 μl, inférieure à 1 μl .
Ces différents volumes, temps d'injection, quantité d' acide nucléique présente dans la composition selon l'invention, doivent être adaptés par l'homme du métier lorsque l'injection est réalisée chez un animal, autre que la souris. Cette adaptation est à la portée de l'homme du métier qui sans effort excessif peut déterminer rapidement les paramètres d'utilisation de la composition selon l'invention pour cibler les cellules souches embryonnaires ventriculaires d'un cerveau adulte. Il peut ainsi, avant de procéder expérimentalement déterminer le volume des ventricules cérébraux et notamment des ventricules latéraux chez la souris et chez l'animal cible (par imagerie par résonance magnétique par exemple) et par une simple règle de trois déterminer la quantité d'acides nucléiques, le volume ainsi que le temps d'injection nécessaire pour reproduire les résultats obtenus chez la souris. C'est la raison pour laquelle, la présente invention concerne l'utilisation d'un complexe acide nucléique/polymère cationique pour la préparation d'une composition destinée au ciblage de cellules souches ventriculaires du cerveau adulte d'un animal caractérisée en ce que la quantité dudit acide nucléique présent dans ladite composition est adaptée en fonction du volume du ventricule cérébral dudit animal et déterminée proportionnellement à la quantité utilisée pour cibler les cellules souches du cerveau de souris adulte, la concentration dudit acide nucléique présent dans le ventricule dudit animal étant inférieure ou égale à celle utilisée pour le ciblage des cellules souches du cerveau de souris adulte. La présente invention porte également sur l'utilisation d'un complexe acide nucléique/polymère cationique pour la préparation d'une composition destinée au ciblage de cellules souches ventriculaires du cerveau adulte caractérisée en ce que le volume de ladite composition est adaptée en fonction du volume du ventricule cérébral dudit animal et est déterminée proportionnellement au volume utilisé pour cibler les cellules souches du cerveau de souris adulte. La cellule ciblée par le composé de la présente invention est une cellule eucaryote d'un animal. De préférence, l'animal selon l'invention est un vertébré de manière encore préférée un mammifère, choisi de préférence dans le groupe composé de la souris, du rat, du lapin, du hamster, du cochon d'Inde, des bovins, des caprins, des ovins, du cheval, des primates, dont l'homme. De manière préférée l'animal est un homme, la cellule souche de cerveau étant une cellule humaine. Selon un autre mode préféré, l'animal est une souris et la cellule souche est une cellule murine.
Les exemples et résultats ci-après démontrent la transfection de façon privilégiée des cellules souches neurales adultes dans des régions particulières du cerveau.
La présente invention ne se limite pas uniquement au ciblage des cellules souches du cerveau, mais également aux cellules du cerveau qui ne sont pas à l'état post-mitotique et qui sont capables de se diviser ; à ce propos on peut citer les cellules de tumeurs du cerveau, telles par exemple les gliomes, les astrocytomes . Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'introduction de ladite composition se fait par voie stéréotaxique. Néanmoins, tout moyen permettant de délivrer la composition de l'invention à proximité ou dans les cellules souches du cerveau peut être envisagé; à ce propos il convient de citer l'ensemble des systèmes de ciblage au travers de la barrière sang/cerveau par voie systémique.
Selon un mode préféré de réalisation, ledit polymère cationique est choisi dans le groupe composé des polymères polycationiques tels que le polyéthylènimine (PEI) , la poly-L-lysine, la poly-D- lysine, la polyamidoamine, la polyamine, les blocks copolymères (Read et al . , 2000; Oupicky et al . , 2000; Wolfert et al . , 1999), et les dendrimères polyamidoamine (Tang et al . , 1996; Plank et al . , 1999) . De préférence, le polymère polycationique est polyéthylènimine (PEI). De préférence, il s'agit de PEI de faible poids moléculaire, de manière plus préférée, il s'agit de PEI ayant un poids moléculaire moyen inférieur ou égal à 88 kDa, inférieur ou égal à 44 kDa, inférieur ou égal à 35 kDa, inférieur ou égal à 30 kDa, inférieur ou égal à 22 kDa, inférieur ou égal à 11 kDa. De manière encore plus préférée, la PEI utilisée est un PEI de 22 kDa (EXGÈNE 500®, EUROMETEX Soufflemeyersheim, France). D'autres polymères cationiques peuvent être facultativement utilisés telles que les protéines de liaison aux acides nucléiques, parmi lesquels il convient de citer les histones, la protamine, l'ornithine, la putrescine, la spermidine, la spermine. D'autre part, il existe la possibilité de greffer le polymère cationique avec des protéines, anticorps ou ligands de récepteurs membranaires, permettant de cibler spécifiquement des cellules en facilitant l' internalisation des complexes.
Le complexe acide nucléique / polymère cationique selon l'invention est destiné à la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies neurodégénératives et/ou démyélinisantes . Parmi ces maladies, il convient de citer de manière non exhaustive des maladies, telles la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la chorée de Huntington, la sclérose en plaque. Le complexe selon l'invention peut également être utilisé pour la préparation d'un médicament destiné à modifier le devenir des cellules souches du cerveau et/ou à augmenter la survie des cellules souches du cerveau. Pour la préparation de ces médicaments, ledit acide nucléique est choisi parmi l'ADN simple brin, l'ADN double brin, l'ARN simple brin, l'ARN double brin, l'hybride ARN/ADN.
Selon un mode préféré de réalisation, ledit acide nucléique est l'ADN double brin ou de l'ARN simple brin qui code au moins pour un produit protéique d' intérêt qui s'exprime efficacement dans ladite cellule souche du cerveau. Ledit produit protéique d'intérêt est choisi dans le groupe composé des protéines pro- apoptotiques ou anti-apoptotiques, des facteurs de survie, des facteurs de différenciation, des cytokines, des lymphokines, des interleukines, des facteurs de croissance, des facteurs de transcription, des protéines tueuses, des recombinases, des intégrases, des transposases, des enzymes intervenant sur les acides nucléiques, des protéines "rapporter". Parmi les protéines pro ou anti-apoptotiques intervenant ou non dans la voie mitochondriale, il convient de citer de manière non exhaustive, outre les protéines de la famille Bcl2 (comme BclXL, BclXs, Bcl , Bid, Bax, Bak), les protéines IAP, SMAC et Diablo. De préférence, ledit produit protéique d'intérêt est la protéine BclXL.
Les interleukines, cytokines et lymphokines sont choisies dans un groupe composé de préférence des interleukines 11-1, 11-2, 11-3, 11-4, 11-5, 11-6, 11-7, 11-8, 11-9, 11-10, 11-11, 11-12, 11-13, 11-14, 11-15,
11-16, 11-17 et 11-18, des interférons α-IFN, β-IFN et γ-IFN.
Les facteurs de croissance sont de préférence le facteur de croissance épithélial (EGF, Epithelial Gro th Factor) , le facteur de croissance des fibroblastes (FGF, Fibroblast Growth Factor et bFGF, basic fibroblast Growth Factor) , le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PGDF, Platelet Derived Growth Factor) , le facteur de croissance des nerfs (NGF, Nerve Growth Factor) , le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF, Brain Derived Neurotrophic Factor) , le facteur de croissance dérivé de la glie (GDGF, Glial Derived Growth Factor) ; il convient également de citer les facteurs stimulateurs des colonies (« colony stimulating factors ») , tels que G-CSF, GM-CSF, M-CSF) et l' érythropoïétine. Il convient également de citer les facteurs de croissance qui interagissent en les inhibant, avec les facteurs de transcription nucléaires tels NF-Kβ.
Parmi les facteurs de transcription, il convient de citer les facteurs de transcription qui permettent de diriger l'expression d'un gène dans un type cellulaire particulier ou à un moment donné de la différenciation des cellules du cerveau et il convient de citer les facteurs de transcription intervenant particulièrement sur la différenciation des cellules neuronales, tels que les neurogenines, et gliales, tels que GCM (Glial Cell Missing) . Parmi ces facteurs, il convient de citer de manière non exhaustive les familles Dix, Otx, Emx, Hox.
Il peut être également d'un intérêt de cibler l'expression de protéines tueuses dans les cellules souches du cerveau, ou dans des cellules du cerveau en phase de division active. Dans ce cas, il est intéressant d'utiliser une molécule d'acide nucléique qui code pour un produit protéique d' intérêt choisi parmi les protéines tueuses ; parmi les protéines tueuses, il convient de citer les kinases, et de préférence la thymidine kinase, et les protéines pro- apoptotiques ; on entend désigner par protéines pro- apoptotiques les protéines qui interviennent dans l'apoptose ou promeuvent l'apoptose. Parmi les protéines pro-apoptotiques, il convient de citer les protéines BIK (« Bcl2-interacting protein ») , BAX (Oltvai et al . 1993), BAK (Chittenden et al . 1995; Kiefer et al . 1995,) et BID (« BH3-interacting domain death agonist ») (Wang et al . 1996). Parmi les protéines pro-apoptotiques, il convient également de citer les caspases, la protéine AIF (« apoptosis- inducing factor ») (Susin et al . 1999, ) et les protéines de la famille du facteur nécrosant des tumeurs (TNF, tumor necrosing factor) , et plus particulièrement le TNF lui-même (Old 1985) , la protéine FASL (FAS-ligand) (Takahashi et al . 1994).
Par « protéine recombinase », on entend désigner les recombinases de la famille des intégrases qui catalysent l'excision, l'insertion, l'inversion ou la translocation de fragments d'ADN au niveau de sites spécifiques de reconnaissance desdites recombinases (Sternberg et al . , 1986 ; Sauer, et al . , 1990 ; Barbonis et al . , 1993; Kilby et al . , 1993 ; Sauer, 1994 ; Denisen et al . , 1995). Ces recombinases sont actives dans les cellules animales (Sauer, 1994). La protéine recombinase de l'invention est sélectionnée de préférence dans le groupe des recombinases sites- spécifiques composé de la recombinase Cre du bactériophage PI, la recombinase FLP de Saccharomyces cerevisiae, la recombinase R de pSRl de Zygosaccharomyces rouxii, la recombinase A de pKDl de Kluyveromyces drosophilarium, la recombinase A de pKWl de Kluyveromyces wal tii , l'intégrase λ Int, la recombinase du système de recombinaison GIN du phage Mu, ou une variante de celles-ci. Selon un mode préféré de réalisation, la recombinase est la recombinase Cre (« cyclization recombination ») qui est une intégrase de 38 KDa du bactériophage Pi qui catalyse, en l'absence de cofacteurs, la recombinaison entre deux séquences d'ADN de 34 paires de bases appelées « site loxP » (Sauer et al . , 1990). La position sur une ou plusieurs molécules d'ADN, et l'orientation de sites loxP l'un par rapport à l'autre, déterminent le type de fonction de la recombinase Cre : excision, insertion, inversion ou translocation. Ainsi l'activité recombinase de Cre est une inversion lorsque deux sites loxP sont tête-bêche sur un même fragment d'ADN et une excision, lorsque les sites loxP sont en répétition directe sur un même fragment d'ADN. L'activité de la recombinase est une insertion lorsqu'un site loxP est présent sur un fragment d'ADN, une molécule d'ADN telle qu'un plasmide contenant un site loxP pouvant être insérée au niveau dudit site loxP. La recombinase Cre peut également induire une translocation entre deux chromosomes à condition qu'un site loxP soit présent sur chacun d'eux (Babinet, 1995) . De manière plus générale, la recombinase Cre est donc capable de catalyser la recombinaison entre une ou plusieurs molécules d'ADN différentes, à condition qu'elles soient porteuses de sites loxP. C'est donc un des objets de la présente invention d'utiliser un complexe acide nucléique/PEI pour le ciblage de cellules souches pour y introduire un vecteur exprimant la recombinase site-spécifique, dans lesquelles s'exprime la recombinase site- spécifique, codée par ledit acide nucléique, pour catalyser la recombination d'un fragment d'ADN du génome de ladite cellule souche du cerveau.
Parmi les transposases, il convient de citer le système «transposon sleeping beauty» breveté (Kay et al . , 2000) ou tout autre système permettant d'introduire par co-transfection un plasmide avec des séquences IR («Inverted Repeat») encadrant une séquence d'acide nucléique d'intérêt avec un autre plasmide vecteur d'expression pour une transposase spécifique des séquences IR.
De telles transposases catalysent la transposition et/ou l'intégration d'une séquence d'ADN d'intérêt dans le génome de ladite cellule souche ; cette séquence d'ADN d'intérêt pouvant être introduite dans ladite cellule en utilisant le complexe selon l'invention.
Parmi les enzymes intervenant sur les acides nucléiques, il convient de citer les enzymes intervenant sur l'ADN, telles que les enzymes de restriction, les ADN polymerases, les ligases, et les enzymes intervenant sur l'ARN telles que les ARN polymérases-ADN dépendantes, les reverse- transcriptases .
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la molécule d'acide nucléique est un ARN antisens, un ARN double brin, ou une chimère ADN/ARN; De telles molécules d'ARN peuvent être utilisées pour inhiber l'expression d'un produit protéique d'intérêt.
Il est évident que le composé selon l'invention a de multiples applications selon la nature de la séquence d'ADN. Ces multiples applications sont facilement envisageables par une personne de l'art et ne peuvent être mentionnées de manière exhaustive. Néanmoins, il convient de souligner que la protéine d'intérêt codée par l'acide nucléique, ou l'ARN antisens , peut être utiliser pour altérer l'expression d'au moins un gène cellulaire ou mitochondrial , c'est à dire, de diminuer, d'augmenter, de moduler, d'annihiler l'expression dudit gène. La protéine d'intérêt peut également être utilisée pour induire l'expression d'au moins un gène d'intérêt, dans ce cas l'a protéine d' intérêt est de préférence un facteur de transcription .
Selon un autre mode de réalisation, la protéine d'intérêt est une protéine « rapporter ». Parmi les protéines « rapporter », il convient de citer de manière non-exhaustive, la luciferase, la protéine de fluorescence verte (GFP, pour Green fluorescence protein) , la β-galactosidase (β-gal) , la chloramphénicol-acétyl-transférase (CAT) . De telles protéines « rapporter » peuvent être utilisées pour suivre le devenir des cellules souches dans le cerveau. C'est donc un des objets de la présente invention d'utiliser le complexe selon l'invention pour cibler des cellules souches du cerveau, dans lequel l'acide nucléique code pour une protéine « rapporter » ou constitue un marqueur générateur de signal, afin de permettre la détection, la localisation et l'imagerie de cellules souches du cerveau.
L' acide nucléique constitue un marqueur générateur de signal lorsque celui-ci est marqué par des isotopes radioactifs ou par des entités non isotopiques ; Les entités non isotopiques peuvent être sélectionnées parmi les enzymes, les colorants, les haptènes, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémiluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents, les ligands tels que la biotine, l'avidine, la streptavidine, la digoxygénine. Les méthodes de révélation et de détection de ces marqueurs sont bien connues de l'homme de l'art.
La présente invention fournit donc un système efficace qui permet le transport actif ou passif de la molécule d' acide nucléique à travers la membrane cellulaire cytoplasmique, le transport vers le noyau, l'entrée dans le noyau et le maintien à l'état fonctionnel de cette molécule dans le noyau. La persistance de l'expression du produit protéique codé par la molécule d'ADN est obtenue soit par l'intégration stable de la molécule d'ADN dans l'ADN chromosomique de la cellule cible, soit par maintien de la molécule d'ADN sous la forme episomale. Pour certaines applications l'expression transitoire avec un plasmide sous forme episomale peut suffire à obtenir les résultats recherchés.
L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'un animal, à l'exception de l'homme, dont au moins une cellule souche du cerveau, a subi au moins un événement de recombinaison site-spécifique ciblée au niveau d'une séquence d'ADN d'intérêt, caractérisé en ce que ledit procédé comporte les étapes de :
(a) obtention d'une cellule souche embryonnaire
(ES) totipotente modifiée par insertion de site (s) de reconnaissance de ladite protéine recombinase site-spécifique dans ladite
(lesdites) séquence (s) d'ADN d'intérêt, localisé dans un ou plusieurs chromosomes par recombinaison homologue ; (b) introduction de ladite cellule souche embryonnaire totipotente modifiée dans un embryon dudit organisme ; (c) sélection des individus ayant intégré dans les cellules germinales la modification génétique ;
(d) développement dudit animal; (e) introduction d'au moins undit complexe acide nucléique / polymère cationique dans le cerveau dudit animal obtenu à l'étape (d) à proximité ou dans les cellules souches ventriculaires, ledit acide nucléique codant au moins pour une protéine recombinase susceptible de catalyser la recombinaison entre lesdites séquences de reconnaissance de ladite recombinase ;
(f) expression de ladite protéine recombinase dans ladite cellule.
Selon un mode de réalisation particulier, au moins un second complexe acide nucléique / polymère cationique peut être introduit dans le cerveau dudit animal à l'étape (e) , ledit second acide nucléique est un gène d'intérêt tel que précédemment décrit. Un tel mode de réalisation permet de cibler l'intégration d'une molécule d'ADN d'intérêt dans le génome cellulaire.
L' invention concerne également un autre mode d'obtention d'un animal, à l'exception de l'homme, dont au moins une cellule à fort pouvoir mitotique du cerveau, de préférence une cellules souche du cerveau, a subi au moins un événement de recombinaison site- spécifique ciblée au niveau d'une séquence d'ADN d'intérêt, caractérisé en ce que ledit procédé comporte les étapes de : a) obtention d'une cellule somatique modifiée par insertion de site (s) de reconnaissance de ladite protéine recombinase dans ladite (lesdites) séquence (s) d'ADN d'intérêt localisées dans un ou plusieurs chromosome (s) , par recombinaison homologue ; b) transfert du noyau de ladite cellule somatique modifiée dans le cytoplasme d'un oocyte receveur énucléé (clonage nucléaire) ; c) développement de l'embryon obtenu à l'étape b) ; d) introduction d' au moins undit complexe acide nucléique / polymère cationique dans le cerveau dudit animal obtenu à l'étape (c) à proximité ou dans les cellules souches ventriculaires, ledit acide nucléique codant au moins pour une protéine recombinase susceptible de catalyser la recombinaison entre lesdites séquences de reconnaissance de ladite recombinase ; (e) expression de ladite protéine recombinase.
Les technologies de clonage nucléaire sont connues de l'homme du métier ; il convient de citer celles qui font l'objet des demandes de brevet WO 95 17500, WO 97 07668, WO 97 07669, WO 98 30683, WO 99 01163, WO 99 37143.
L'insertion des sites de reconnaissance spécifique, notamment du ou des sites LoxP pour la recombinase Cre dans la séquence d'ADN d'intérêt se fait de préférence par recombinaison homologue ; selon un autre mode de réalisation, elle peut être réalisée de manière aléatoire. L' invention concerne également un procédé d'obtention d'un animal destiné au criblage de composés destinés à modifier le devenir des cellules souches du cerveau, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes :
(a) Préparation du complexe acide nucléique / polymère cationique ;
(b) Introduction dudit complexe dans le cerveau dudit animal à proximité ou dans les cellules souches ventriculaires ;
(c) Pénétration dudit acide nucléique dans lesdites cellules souches.
Selon un mode préféré de réalisation, ledit complexe est introduit par voie stéréotaxique intraventriculaire ; l'acide nucléique dudit complexe est de préférence de l'ADN double brin qui s'intègre dans le génome des cellules souches du cerveau. Selon un autre mode de réalisation, ledit acide nucléique est un acide nucléique double brin qui est présent à l'état episomal, dans ce cas, la séquence nucléique peut être capable de s' autorépliquer et susceptible ou non d'être amplifiée de manière extra-chromosomique.
L'acide nucléique du complexe selon l'invention est introduit sous la forme d'un vecteur d'expression Par vecteur, on entendra désigner une séquence nucléotidique capable d'être transcrite. Le vecteur peut être en particulier un ADN plasmidique bactérien, un cosmide, de l'ADN de phage, de l'ADN viral, notamment de rétrovirus ou de virus adéno-associés, un mini-chromosome (BAC, YAC, HAC,...),un transposon. Le vecteur ou un de ses fragments comporte au moins un gène codant pour une protéine d' intérêt ou un ARN antisens, et un promoteur ou éléments d'expression permettant de diriger et de contrôler l'expression de ladite protéine d'intérêt ou dudit ARN antisens dans au moins une cellule souche du cerveau dudit organisme. Le vecteur d'expression comporte en outre des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction du type cellulaire. Par éléments d'expression, on entend désigner toutes les séquences d'ADN impliquées dans la régulation de l'expression génique, c'est-à-dire la séquence promotrice minimale, les séquences amonts, les séquences activatrices (« enhancers ») , éventuellement les séquences inhibitrices (« silencers ») , les séquences « insulator ».
De préférence, le gène d'intérêt est placé sous le contrôle d'éléments d'expression tissus-spécifiques ou cellules-spécifiques ou ubiquitaires . Les éléments d'expression tissus-spécifiques ou promoteurs tissus-spécifiques sont choisis parmi les promoteurs qui permettent d'obtenir une expression spécifique, et de préférence forte, dans une ou plusieurs cellule (s), tissu (s), type (s) cellulaire (s) , du cerveau et notamment dans les neurones, les astrocytes, les oligodendrocytes, les cellules gliales. Ces promoteurs peuvent être ou non heterologues à l'organisme et être naturellement présents ou non dans le génome de l'organisme. A titre d'exemple non limitatif de promoteurs tissus-spécifiques, on peut citer le promoteur du gène de la « Myelin Basic Protein »(MBP) spécifique des oligodendrocytes, le promoteur du gène codant pour la « Neuron Spécifie Enolase »(NSE) spécifique des neurones.
Selon un autre mode de réalisation, les éléments d'expression sont constitués par des promoteurs inductibles tels par exemple le système tétracycline (Goossen et al , 1992) .
Enfin, est également dans la portée de l'invention, un animal susceptible d'être obtenu par l'un des procédés selon l'invention. L'invention concerne également un procédé de criblage de composés destinés à modifier le devenir de cellules souches du cerveau, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes :
(a) Mise en présence d'un animal susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention avec ledit composé à cribler,
(b) Analyse du devenir des cellules souches du cerveau.
Entre également dans la portée de la présente invention, le composé susceptible d'être obtenu par le procédé précédent. Un tel composé peut être utilisé pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies neurodégénératives et/ou démyélinisantes .
D' autres caractéristiques et avantages de la présente invention seront mieux mis en évidence à la lecture des exemples suivants.
Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes : Figure 1 : Distribution et morphologie des cellules exprimant la β-galactosidase après injection intraventriculaire de complexes CMV-LacZ/PEI .
Une semaine après l'injection intraventriculaire dans une souris adulte, des sections vibratome de 100 μm ont été utilisées pour révéler les sites d'expression de la β-galactosidase (marquage noir).
Le panneau A montre une vue composite de la distribution de cellules positives observées dans six expériences indépendantes. Des cellules transfectées sont particulièrement abondantes dans la partie striatale des ventricules latéraux où elles peuvent être trouvées dans la zone sous-ventriculaire (SVZ) antérieure et postérieure (C) . Des groupes de cellules positives (marquage noir) sont également présents dans la région de l'hippocampe (hp) du ventricule latéral postérieur (C, C) et le long du troisième ventricule
(D) . Dans le SVZ, les cellules positives (marquage noir) présentent soit la morphologie typique des astrocytes sub-épendymales (E, F) ou sont présentes en groupe de petites cellules rondes (G, H) . Dans le troisième ventricule, la plupart des cellules projettent de longues excroissances à partir de la couche épendymale (P) . Echelle : (B-C) , 200 μm ; (C et
H), 40 μm ; (D), 100 μm ; (E-G et P) , 20 μm. ep, épendyme ; hip, hippocampe ; lu, ventricule latéral ; svz, zone subventriculaire.
Figure 2 : Expression de la GFAP et de la Nestine dans les cellules transfectées . Sections (8 μm) de cerveau de souris adulte transfectée, une semaine avant d'être sacrifiée, avec des complexes CMV-LacZ/PEI .
Les sections ont été doublement colorées afin de détecter l'expression de Lac Z et de la GFAP (A, B) ou de Lac Z et de la Nestine (C, D) . Les cellules positives pour la β-galactosidase sont seulement présentes dans des régions d'expression de la GFAP et de la Nestine. A un plus fort grossissement, il apparaît que au moins dans certaines cellules, la GFAP
(B) ou la Nestine (D) sont co-exprimées avec le gène rapporter Lac Z. Echelle : (A, C) , 40 μm ; (B, D) ,
12 μm.
Figure 3 : Analyse ultrastructurale du SVZ une semaine après l'injection intra-ventriculaire de complexe CMV-LacZ/PEI .
A' ) Section semi-fine de la région SVZ du cerveau de souris adulte, traitées avec du BrdU présent dans l'eau de boisson, puis transfectées avec des complexes CMV-LacZ/PEI quatre jours avant d'être sacrifiées.
Les sections sont colorées avec du BluoGal pour révéler l'expression du transgène (cellule cerclée de noir) .
A) Section adjacente ultra-fine immunocolorée pour la détection du BrdU (or colloïdal de 10 n ) et de la GFAP (or colloïdal de 20 nm) . Le BrdU est exclusivement localisé dans le noyau (n) alors que la GFAP est associée avec des régions riches en fibres du cytosquelette (flèches blanches) . Les précipités de BluoGal électroniquement denses sont indiqués par des têtes de flèches. Cette image montre la transfection des complexes ADN/PEI dans les astrocytes sous- ventriculaires qui se sont divisés. Echelle : 100 nm.
Figure 4 : Transfection par les complexes ADN/PEI de cellules à division lente et rapide dans le SVZ.
Des souris ont été traitées avec le BrdU selon différents protocoles afin d'identifier les cellules du SVZ à division lente et rapide.
En A, les souris sont traitées avec du BrdU continuellement pendant trois semaines avant d'être transfectées puis sacrifiées ; dans ce cas, toutes les cellules en division incorporent le BrdU.
En B, les souris sont traitées pendant dix-huit jours avec du BrdU puis par une période de purge de trois jours sans traitement au BrdU, avant d'être analysées. Dans ce cas, les cellules à division lente sont marquées intensément avec les anticorps anti-BrdU, alors que les cellules à division rapide présentent un marquage du signal BrdU moins intense puisqu'elles continuent à se diviser pendant la période de purge.
Finalement en C, les souris ont seulement reçu un traitement de quatre jours au BrdU ; dans ce cas, les neuroblastes à division rapide sont marqués positivement au BrdU. Dans tous les cas, la transduction des cellules est réalisée dans des zones d'intense prolifération cellulaire. Figure 5 : La transfection de Bcl-Xj. dans le SVZ prolonge la survie des cellules transfectées .
La co-transfection du gène anti-apoptotique, Bcl- XL, a été réalisée avec le gène reporter luciferase pour quantifier la viabilité cellulaire. Une augmentation significative de l'expression de luciferase au-dessus du niveau d'expression des cellules-contrôle a été observée une semaine après la transfection. En présence de Bcl-XLl il n'existe pas de diminution de l'expression de la luciferase tout au long de la durée de l'expérience (RLU = Unité relative de luminescence; 0E+00 = 0; 5E+06 = 5.106; IE+07 = 107; 2E+07 = 2.107) .
Figure 6 : L' expression dans les cellules sub- ventriculaires du gène anti-apoptotique
BclXL permet d' observer une semaine après injection une modification du profil d' expression du gène rapporteur Lac .
Co-transfection du vecteur CMV-lacZ avec un plasmide contrôle (A,C) ou portant le gène Bcl-XL (B, D et E) . Avec Bcl-XL, le nombre de cellules exprimant le transgène à une semaine post-injection est plus important. Parmi, ces cellules transfectées avec le gène anti-apoptotique qui survivent, on observe de nombreux groupes de cellules qui semblent avoir migré ou qui peuvent être dérivées les unes des autres. Echelle : (A,B)100μm ; (C à E)40μm. Figure 7 : La surexpression de Bcl-XL diminue le nombre de cellules immunopositives pour la forme activée de la Caspase-3 (A, B, C) .
Le plasmide CMV-GFP a été cotransfecté par injection intraventriculaire avec un plasmide contrôle ou avec le plasmide CMV-Bcl -XL. L' immunodétection de la forme activée de la Caspase-3 a été réalisée sur des coupes au cryostat (10 μm) . Les cellules immunopositives ont été comptées de 0.8 à 1.2 mm de la partie antérieure à bregma pour chaque animal. Le nombre de cellules positives est réduit de façon significative chez les animaux transfectés avec CMV-Bcl -XJj comparativement aux animaux contrôles injectés ou non injectés (A) ou non injectés (voir texte) . Les moyennes + SD (SD : déviation standard) sont présentées, avec n > 4 animaux par groupe. Observation par immunofluorescence des cellules positives pour la forme activée de la Caspase-3 positive dans les cerveaux transfectés avec CMV-GFP co-transfecté avec un plasmide contrôle (B) ou avec CMV-Bcl -XL (C) . Les cellules immunopositives pour la forme activée de la Caspase-3 (flèches blanches) souvent présentes sous forme de doublets chez le contrôle (B) . En présence de Bcl-XL (C) on observe une diminution du nombre de cellules positives pour la forme activée de la Caspase-3 tandis que le nombre de cellules exprimant le transgène GFP est augmenté. Iv, ventricule latéral. Barre : (B-C) , 40 μm. Figure 8 : Expression Lac Z dans le cerveau de souris transgéniques 3 mois après recombinaison induite par transfection de pCMV-CBE complexé avec la PEI .
CMV-CRE est transfecté par une seule injection intraventriculaire dans les souris R26R et l'expression lacZ résultant de la recombinaison est observée 3 mois après injection. De nombreuses cellules exprimant lacZ peuvent être détectées à des distances de 250 μm de la zone subventriculalire . Iv, ventricule latéral. Barre : 50 μm.
EXEMPLES
1) MATERIELS ET METHODES
1.1) Préparation des plasmides, formulation des complexes ADN/PEI, et injection stéréotaxique .
L'ADN purifié, sans endotoxine, est préparé grâce à des colonnes d'affinité (Genomed, Research Triangle Park, NC, USA). L'ADN est lavé avec de 1 ' éthanol 70%, resuspendu dans un tampon Tris-EDTA, et stocké à 4°C.
Pour suivre l'expression des gènes exogènes après injection dans le cerveau de souris, les inventeurs ont utilisé des plasmides comprenant soit la séquence codante de la β-galactosidase pour l'étude histologique, soit la séquence codante de la luciferase firefly ( Photinus pyralis) pour la quantification biochimique de l'expression du transgène. Les deux gènes sont sous contrôle du promoteur du Cytomegalovirus (CMV) et obtenu auprès de Vical Inc., San Diego, CA, USA.
Les inventeurs ont construit le vecteur d'expression pCMV-.Bcl-.Xj,, contenant le gène codant pour la protéine Bcl-XL de poulet sous contrôle du promoteur CMV dans le plasmide pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a été construit au laboratoire (Sachs et al . , 1997) .
L'ADN plasmidique est dilué dans du glucose 5% à la concentration voulue et ensuite complexé avec la quantité appropriée de PEI 22 Kd linéaire (rapport de 6 entre les aminés protonables de la PEI et les phosphates de l'ADN, sachant que 1 μl de PEI 1M représente 1000 nmol d'aminés protonales et 1 μg d'ADN représente 3 nmol de phosphates) .
La solution de complexes est injectée dans le ventricule latéral (0,2 mm postérieur à la ligne bregma, 1.1 mm latéralement de la suture saggitale et 2,2 mm de profondeur par rapport à la surface du crâne) de souris âgées d'environ deux mois, anesthésiées avec du Pentobarbital (Sanofi 65 mg/kg) . L'aiguille pour l'injection est laissée en place au moins 10 minutes.
Un microgramme de chaque plasmide complexé avec la PEI est suffisant pour obtenir un niveau d'expression nécessaire à la réalisation de l'invention.
Toutes les procédures impliquant des animaux ont été réalisées dans le respect des recommandations établies par les institutions nationales et européennes .
1.2) Etude de la prolifération Le BrdU est administré dans l'eau de boisson (1 mg/ml Fluka) pendant trois semaines ou par injection intrapéritonéale (150 mg/kg) .
1.3) Etude histologique Les souris sont sacrifiées, les cerveaux sont disséqués et post-fixes dans du Paraformaldéhyde 2%. La réaction β-galactosidase est réalisée sur des coupes vibratome (50 μm) par immersion dans une solution X-Gal à 30°C pendant cinq heures (0,4 mg/ml X-gal, Genaxis, Montigny le Bretonneux, France) . Après coloration, les coupes sont montées sur des lames gélatinées. Le marquage BrdU est observé sur des coupes parafines (5 μm) avec un anticorps monoclonal de souris anti-BrdU (Dako) à une dilution 1:50 dans du PBS avec 1% de sérum albumine bovine (SAB) . L'anticorps primaire est relevé avec un anticorps anti-souris biotinylé avant son application pour empêcher la réactivité endogène (Dako Kit ARK) . Les sites antigéniques sont démasqués par deux cycles de micro-ondes (5 min. à 750W dans un tampon citrate 10 mMol) . La coloration est alors complétée par une incubation avec la péroxidase couplée à la streptavidine et la réaction est faite en présence de diaminobenzidine comme substrat chromogène (Dako Kit ARK) .
L'anticorps primaire monoclonal anti-GFAP (Boehringer) est utilisé au 1:400 sur des coupes parafines et détecté comme précédemment avec le système de révélation couplé à la péroxidase (Dako Kit ARK) .
L'anticorps primaire monoclonal anti-Nestine (Chemicon) est utilisé au 1:500 sur des coupes cryostat (10 μm) et détecté comme précédemment avec le système de révélation couplé à la péroxidase (Dako Kit ARK) .
1.4) Etude en microscopie électronique
Les souris traitées avec du BrdU pendant trois semaines sont injectées avec le vecteur d'expression LacZ complexé à la PEI, sacrifiées quatre jours postinjection, perfusées avec 3% paraformaldéhyde et 0,2% glutaraldéhyde . Les cerveaux sont disséqués et postfixés. Des coupes sont réalisées au vibratome (90 μm) et colorées avec une solution de substrat BluoGal (Gibco) pendant cinq heures à 30 °C. Les coupes sont rincées avec un tampon cacodylate (0,1 M, pH7,2 ; Prolabo) et les groupements aldéhyde sont bloqués avec NHC1 50mMol (Merck) . Après un rinçage avec un tampon véronal (pH6) , les coupes sont contrastées avec une solution d'acétate d'uranyle 0,5% (Fluka) dans le même tampon, puis déshydratées dans une série de bains avec un gradient d'éthanol croissant. Les coupes sont finalement incluses dans une résine LRWhite (Sigma) . Pour sélectionner les régions d'expression du transgène, des coupes semi-fines de 1 μm sont réalisées à partir des coupes vibratomes, pour ensuite collecter les coupes, ultra-fines (100 nm) adjacentes sur des grilles en nickel (200 mesh) afin d'effectuer 1 ' immuno- histologie.
L' immuno-détection du BrdU et de GFAP sont réalisées sur la même face de la grille portant le tissu. Les coupes sont incubées trente minutes dans un tampon de saturation (tampon Sôrensen avec de la sérum albumine bovine (SAB) 1%). Les anticorps primaires, polyclonal de lapin anti-GFAP à 1:750 (Dako) et monoclonal de souris anti-BrdU à 1:25 (Caltag) , sont appliqués au tissu dans le tampon Sôrensen contenant 0,2% de SAB et 0,025% de Tween 20 (toute la nuit à 4°C) . Après lavage, les anticorps secondaires, IgG de chèvre anti-lapin et IgG de chèvre anti-souris couplés à des billes d'or de respectivement 20 et 10 nm, sont appliqués aux spécimens à une dilution de 1:50. La contre-coloration correspond à un traitement de quinze minutes dans l'acétate d'uranyle 4%. Les coupes sont observées à 75 kV avec un microscope électronique Hitachi H7100.
1.5) Quantification luciferase L'activité du transgène est mesurée sur le tissu homogénéisé comme spécifié dans Lemkine et al . (1999).
1.6) Cartographie du cerveau et comptage des cellules
Pour obtenir une représentation de la localisation des cellules exprimant le transgène sur des coupes coronales successives (depuis 1,3 mm antérieur à 2,7 mm postérieur par rapport à la ligne bregma) , les inventeurs ont sélectionné les coupes correspondantes au vibratome (100 μm) . Les cellules bleues sont comptées sur six cerveaux différents pour calculer le nombre moyen de cellules pour chaque site d'expression du transgène. Des régions représentatives des coupes sont choisies pour être dessinées sur chacune des représentations coronales composant la cartographie.
1.7) Lignée murine R26R
La lignée de souris R26R présente une expression β-Gal constitutive dans toutes les cellules où une recombinaison par la CRE recombinase a lieu (Soriano, 1999) . Ainsi, cela offre un système idéal pour suivre à long terme l'expression d'un gène rapporteur s' exprimant à la suite de la transfection du gène CRE par le transfert de gène à l'aide de la PEI.
1.8) Anticorps anti-Caspase-3
Pour détecter la Caspase-3 sous sa forme active, les inventeurs ont employé un anticorps polyclonal de lapin, CMl qui reconnaît spécifiquement la sous-unité pl8 de la Caspase-3 clivée (donné par la société IDUN
Pharmaceuticals, Inc. au Dr. G. Levi) . 2) RESULTATS
2.1) La surexpression de Bcl-Xi diminue le nombre de cellules immunopositives pour la forme activée de la Caspase-3
La Caspase-3 est une caspase effectrice (Budihardjo et al . , 1999) qui agit en aval de Bcl -XL dans les neurones post-mitotiques et qui régule indépendamment l'apoptose dans les cellules souches neurales de la zone subventriculaire chez le nouveau-né souris (Roth et al . , 2000). L'action inhibitrice de Bcl -XL sur la mort cellulaire programmée doit se refléter par une réduction du nombre de cellules exprimant la Caspase-3 active dans la zone subventriculaire. Pour vérifier cette hypothèse, les inventeurs ont employé un anticorps détectant la forme activée de la Caspase-3 (Roth et al . , 2000) et comparé les nombres de cellules immunopositives dans les cerveaux de souris non-transfectés et transfectés avec ou sans Bcl-XL . Comme le montrent les résultats (figure 7), la surexpression de la protéine anti-apoptotique diminue le nombre de cellules positives pour la Caspase-3 activée dans la zone subventriculaire, tandis que le nombre de cellules exprimant le transgène rapporteur GFP augmente. La quantification montre 105+11 et 78+9 cellules (moyennes + S.D. ; n = 4) respectivement dans les cerveaux contrôles et ceux injectés avec Bel-XL (p<0.01) dans des séries de coupes anatomiquement équivalentes. L'activation de Caspase-3 n'est pas due à la procédure de transfection puisque le nombre de cellules positives n'est pas significativement différent entre les animaux témoins non injectés (95+2 cellules/cerveau) et ceux transfectés avec un plasmide contrôle (105+11 cellules/ cerveau) . Ces résultats font la démonstration de l'efficacité de la méthode pour modifier le devenir des cellules ciblées.
2.2) L'expression stable de lacZ après transfection de la Cre-recombinase montre que la progénie des cellules transfectées est capable de migrer.
Pour analyser le destin des cellules transfectées, nous avons utilisé des souris transgéniques, R26R (Soriano, 1999) . Dans ce modèle, la transfection et l'expression de cre-recombinase produit un réarrangement du gène lacZ, induisant l'expression stable de lacZ dans les cellules transfectées et leur descendance. Comme montré dans la figure, 3 mois après mois après injection intraventriculaire de CMV-CRE, de nombreuses cellules exprimant lacZ sont présentes dans le cerveau des souris traitées. Sur la plupart des coupes, les cellules exprimant lacZ sont souvent situées dans le parenchyme à des distances de 250 μm de la zone subventriculaire. Ces observations montrent que les cellules issues de la population cellulaire transfectée possède une capacité migratoire, propriété démontrée de la descendance des cellules souches neurales (Doetsch et al . , 1996). REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un complexe acide nucléique / polymère cationique pour la préparation d'une composition destinée au ciblage de cellules souches du cerveau adulte, caractérisée en ce que ladite composition est introduite dans le cerveau adulte par voie intraventriculaire à proximité ou dans les cellules souches ventriculaires.
2. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'injection de ladite composition se fait par voie stéréotaxique, ladite injection durant au moins 10 minutes .
3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit polymère cationique est le PEI.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que pour le ciblage des cellules souches du cerveau de souris adulte, la quantité dudit acide nucléique présent dans ladite composition est inférieure à 2,5 μg.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que pour le ciblage des cellules souches du cerveau de souris adulte, le volume de ladite composition n'excède pas 5 μl.
6. Utilisation selon les revendications 1 à 3 pour le ciblage des cellules souches du cerveau d' animal adulte, caractérisée en ce que la quantité dudit acide nucléique présent dans ladite composition est adaptée en fonction du volume du ventricule cérébral dudit animal et déterminée proportionnellement à la quantité utilisée pour cibler les cellules souches du cerveau de souris adulte, la concentration dudit acide nucléique présent dans le ventricule dudit animal étant inférieure ou égale à celle utilisée pour le ciblage des cellules souches du cerveau de souris adulte.
7. Utilisation selon les revendications 1 à 3, et 6 pour le ciblage des cellules souches du cerveau d'animal adulte, caractérisée en ce que le volume dé ladite composition est adaptée en fonction du volume du ventricule cérébral dudit animal et est déterminée proportionnellement au volume utilisé pour cibler les cellules souches du cerveau de souris adulte.
8. Utilisation selon les revendications 6 et 7, caractérisée en ce que ledit animal est un homme.
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies neurodégénératives et/ou démyélinisantes .
10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite maladie est choisie dans le groupe composé de la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la chorée de Huntington, la sclérose en plaque .
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la préparation d'un médicament destiné à modifier le devenir des cellules souches du cerveau.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter la survie des cellules souches du cerveau.
13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit acide nucléique est choisi parmi l'ADN simple brin, l'ADN double brin, l'ARN simple brin, l'ARN double brin, l'hybride ARN/ADN.
14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit acide nucléique est l'ADN double brin ou de l'ARN simple brin qui code au moins pour un produit protéique d'intérêt qui s'exprime efficacement dans ladite cellule.
15. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que ledit produit protéique d' intérêt est choisi dans le groupe composé des cytokines, des lymphokines, des interleukines, des facteurs de transcription, des facteurs de survie, des protéines anti-apoptotiques, des protéines pro- apoptotiques, des protéines tueuses, des facteurs de croissance, des recombinases, des intégrases, des transposases, des enzymes intervenant sur les acides nucléiques, des facteurs de différenciation, des protéines "rapporter" .
16. Utilisation selon la revendication _ 15, caractérisée en ce que ledit polypeptide est la protéine anti-apoptotique BCI -XL -
17. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit polypeptide est choisi dans la famille des Neurogenines.
18. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit polypeptide est une recombinase sélectionnée dans le groupe des recombinases sites spécifiques composé de la recombinase Cre du bacteriophage Pi, la recombinase FIP de Saccharomyces cerevisiae, la recombinase R de pSRl de Zygosaccharomyces rouxii , la recombinase A de pKDl de Kluyveromyces drosophilarium, la recombinase A de pKWl de Kluyveromyces waltii, l'intégrase λ Int, la recombinase du système de recombinaison GIN du phage Mu, ou une variante de celles-ci.
19. Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que ladite recombinase site- spécifique catalyse la recombinaison d' un fragment d'ADN du génome de ladite cellule souche du cerveau.
20. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit polypeptide est une transposase.
21. Utilisation selon la revendication 20, caractérisée en ce que ladite transposase catalyse la transposition et l'intégration d'une séquence d'ADN dans le génome de ladite cellule souche du cerveau.
22. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que ledit acide nucléique est un ARN anti-sens.
23. Utilisation selon les revendications 20, 21 et 22 pour altérer l'expression d'un gène.
24. Utilisation selon les revendications 20 et 21 pour induire l'expression d'un gène.
25. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la détection, la localisation et l'imagerie de cellules souches du cerveau, caractérisé en ce que ledit acide nucléique code pour une protéine « rapporter » ou constitue un marqueur générateur de signal.
26. Utilisation selon la revendication 25, caractérisé en ce que ladite protéine "rapporter" est choisie dans le groupe composé de la luciferase, la protéine de fluorescence verte (GFP) , la β- Galactodidase (β-Gal) , la chloramphénicol acétyl- tranférase (CAT) .
27. Animal, à l'exception de l'homme, dont au moins une cellule souche du cerveau, a subi au moins un événement de recombinaison site-spécifique ciblée au niveau d'une séquence d'ADN d'intérêt, caractérisé en ce que ledit animal est obtenu par un procédé qui comporte les étapes de : a) obtention d'une cellule souche embryonnaire (ES) totipotente modifiée par insertion de site (s) de reconnaissance de ladite protéine recombinase site- spécifique dans ladite (lesdites) séquence (s) d'ADN d'intérêt, localisé dans un ou plusieurs chromosomes par recombinaison homologue; b) introduction de ladite cellule souche embryonnaire totipotente modifiée dans un embryon dudit organisme; c) sélection desdits animaux ayant intégré dans les cellules germinales la modification génétique; d) développement dudit animal; e) introduction d'au moins un complexe acide nucléique / polymère cationique dans le cerveau dudit animal obtenu à l'étape (d) à proximité ou dans les cellules souches ventriculaires, ledit acide nucléique codant au moins pour une protéine recombinase susceptible de catalyser la recombinaison entre lesdites séquences de reconnaissance de ladite recombinase; f) expression de ladite protéine recombinase dans ladite cellule.
28. Animal selon la revendication 27, caractérisé en ce qu'au moins un second complexe acide nucléique / polymère cationique est introduit dans le cerveau dudit animal à l'étape du procédé d'obtention (e) , ledit second acide nucléique codant pour un produit protéique d'intérêt choisi dans le groupe composé des cytokines, des lymphokines, des interleukines, des facteurs de transcription, des facteurs de survie, des protéines anti-apoptotiques, des protéines pro-apoptotiques, des facteurs de croissance, des recombinases, des intégrases, des transposases, des enzymes intervenant sur l'ADN, des facteurs de différenciation, des protéines "rapporter".
29. Animal destiné au criblage de composés destinés à modifier le devenir des cellules souches du cerveau, caractérisé en ce que ledit animal est obtenu par un procédé qui comporte les étapes suivantes : a) préparation d'un complexe acide nucléique / polymère cationique ; b) introduction dudit complexe dans le cerveau dudit animal à proximité ou dans les cellules souches ventriculaires ; c) pénétration dudit acide nucléique dans lesdites cellules souches.
30. Animal selon la revendication 29, caractérisé en ce que ledit complexe est introduit par voie stéréotaxique intraventriculaire.
31. Animal selon la revendication 29 ou 30, caractérisé en ce que ledit acide nucléique est de l'ADN double brin qui s'intègre dans le génome des cellules souches du cerveau.
32. Animal selon la revendication 31, caractérisé en ce que ledit ADN double brin est un vecteur choisi dans le groupe composé des transposons, des vecteurs rétroviraux, des vecteurs dérivés de virus adéno- associés .
33. Animal selon les revendications 29 ou 30, caractérisé en ce que ledit acide nucléique est un acide nucléique double brin qui est présent à l'état episomal .
34. Animal selon la revendication 33, caractérisé en ce que ledit vecteur est auto-réplicatif .
35. Animal selon l'une quelconque des revendications 27 à 34, caractérisé en ce que ledit acide nucléique code pour un produit protéique d'intérêt dont l'expression est placée sous le contrôle d'un promoteur ou d'une région promotrice permettant l'expression du transgène de manière constitutive ou de manière spécifique d'un tissu ou d'un type cellulaire.
36. Animal selon la revendication 35, caractérisé en ce que ledit promoteur spécifique d'un tissu ou d'un type cellulaire est choisi parmi le promoteur spécifique des oligodendrocytes, de préférence le promoteur du gène codant pour la "Myelin Basic Protein"
(MBP) , le promoteur spécifique des neurones, de préférence le promoteur du gène codant pour la "Neuron
Spécifie Enolase" (NSE) , le promoteur spécifique des astrocytes .
37. Procédé de criblage de composés destinés à modifier le devenir de cellules souches du cerveau, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes : a) Mise en présence d'un animal selon les revendications 29 à 36 avec ledit composé à cribler, b) Analyse du devenir des cellules souches du cerveau.
38. Composé obtenu par le procédé selon la revendication 37.
39. Composé selon la revendication 38 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies neurodégénératives et/ou démyélinisantes.
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