DE69333930T2 - Lokalisierung von therapeutischen mitteln - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Verfahren und Mittel, die für die Behandlung von Virus- und anderen Erkrankungen geeignet sind.
  • Therapeutische Mittel zur Behandlung von Virusinfektionen oder -erkrankungen umfassen Antisense-Oligonukleotide, Ködernukleinsäuren und Ribozyme. Andere Mittel umfassen Arzneimittel, wie AZT, zur Behandlung von AIDS (verursacht durch Infektion mit dem HIV-Virus). Im allgemeinen werden diese therapeutischen Mittel an eine infizierte Stelle in einem Patienten verabreicht oder sie werden dazu gebracht, durch das vaskuläre System des Patienten zu zirkulieren.
  • Sullenger et al., 63 Cell 601, 1990, und 10 Mol. Cell Biol., 6512, 1990, beschreiben die Hemmung der Replikation von MoMLV oder HIV durch die Verwendung von chimäre tRNA codierenden Antisense- und/oder Ködermatrizen. "Die Lokalisierung des tRNA-TAR-Fusionstranskripts innerhalb der Zelle wurde nicht bestimmt; es wurde jedoch zuvor gezeigt, daß unverarbeitete tRNA-Transkripte im allgemeinen nicht zum Zytoplasma transportiert werden und auf den Zellkern beschränkt bleiben. Da im Zellkern tat-TAR-Interaktionen stattfinden, kann dies auch zu der beobachteten Hemmung der HIV-Replikation in Zellen, die die tRNA-TAR-Transkripte exprimieren, beigetragen haben." [Zitate ausgelassen]
  • Izant et al., 1 Antisense Research and Development 371, 1991, beschreiben chimäre snRNP-Gene, die an ein Antisense-CAT-Gen fusioniert sind. Die Transkripte wurden, wenn sie in Oozyten injiziert wurden, im Zytoplasma und im Zellkern gefunden. Die Autoren nehmen an, daß die Antisense-snRNP hauptsächlich im Zellkern wirken.
  • Gilboa und Sullenger, WO 90/13641, und Gilboa, WO 89/11539, beschreiben Systeme, die mit den oben diskutierten verwandt sind. All diese Referenzen sind durch Bezugnahme hierin aufgenommen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorherige Lokalisierung inhibitorischer RNAs, die im Zellkern verbleiben oder dorthin transportiert werden können, versucht, eine große Organelle mit einem Durchmesser von etwa 10 μM (Alberts et al., Molecular Biology of the Cell 16–17, Garland Publishing Inc. New York, NY 1983) mit entweder Antisense- oder Köder-RNA-Inhibitoren zu überschwemmen. Diese Strategien lokalisieren solche Inhibitoren nicht spezifisch an einem Ort mit irgendeinem spezifischen mRNA- und Prä-mRNA-Ziel, obwohl innerhalb des Nukleus etwa 105–106 verschiedene Ziele existieren (Alberts et al., Molecular Biology of the Cell 409, Garland Publishing Inc., New York, NY 1983).
  • Die vorliegende Erfindung lokalisiert jedoch eine inhibitorische RNA in einem viel kleineren Kompartiment, z.B. dem Kern eines retroviralen Partikels mit etwa 50 nM Durchmesser und dem 10–6- bis 10–7-fachen des Volumens des Zellkerns, in dem eine einzige große RNA- oder DNA-Spezies, die virale genomische RNA oder DNA, vorliegt (Telch, RNA Tumor Viruses (Hrsg. Weiss et al.) 25– 208, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1984). Dieser millionenfache Unterschied in der Lokalisierungsspezifität wird gemäß Anspruch 1 erzielt.
  • Im Gegensatz dazu richteten vorherige Lokalisierungsstrategien RNA-Therapeutika auf allgemeine zelluläre Sortierwege aus, die nicht zwischen einer großen Anzahl verschiedener RNAs unterscheiden (wobei die angezielte RNA oft nur einen Bruchteil eines Prozents des gesamten Pools aus RNAs umfaßt, die den angezielten Stoffwechselweg entlangströmen). Daher ist die vorliegende Erfindung dahingehend einzigartig, daß sie Therapeutika auf Stoffwechselwege lokalisiert, die für ihr Ziel spezifisch sind: bei denen frühere Lokalisierungsstrategien versuchten, allgemeine Stoffwechselwege, in denen neben dem korrekten Ziel Millionen inkorrekter Ziele existieren, zu überschwemmen, und die somit keine Lokalisierungssignale einsetzen, die ein korrektes Ziel von der großen Zahl an inkorrekten Zielen in der Zelle unterscheiden.
  • Die Anmelderin hat herausgefunden, daß es bei der Behandlung von Erkrankungen, wie z.B. Viruserkrankungen, vorteilhaft ist, eine Lokalisierung des zur Behandlung der Erkrankung geeigneten therapeutischen Mittels in einem spezifischen zellulären oder viralen Kompartiment, in dem die Zielkomponente, wie z.B. RNA, lokalisiert ist, zu bewirken. Ohne eine solche Lokalisierung des therapeutischen Mittels ist eine effektive Behandlung kaum oder überhaupt nicht zu beobachten. Die Anmelderin hat ermittelt, daß ein geeignetes virales Verpackungssignal an das therapeutische Mittel angebunden werden muß, um seine präzise Lokalisierung an einer Stelle innerhalb des Virus zu bewirken. Solche viralen Verpackungssignale identifizieren ein Ziel in einzigartiger Weise oder unterscheiden das Ziel von einer Mehrzahl inkorrekter Ziele innerhalb einer Zelle.
  • Beispielsweise können auf RNA basierende Inhibitoren für die Virusreplikation unter Verwendung eines viralen Verpackungssignals lokalisiert werden, um die inhibitorische RNA an derselben Stelle zu lokalisieren wie die Ziel-RNA.
  • In einem ersten Aspekt liefert die Erfindung somit ein Verfahren zum Verstärken der Wirkung eines viralen therapeutischen Mittels in vivo auf das virale Ziel dieses Mittels. Das Verfahren umfaßt die Stufe, bei der eine Lokalisierung des Mittels in vivo an einem Ort mit seinem Ziel bewirkt wird. In einem verwandten Aspekt liefert die Erfindung ein virales therapeutisches Mittel, das für eine Lokalisierung an einem Ort mit dem viralen Ziel des Mittels in vivo ausgestaltet ist.
  • Fachleute auf dem Gebiet erkennen, daß viele Verfahren zum Modifizieren existierender therapeutischer Mittel verwendet werden können, so daß deren Lokalisierung in einem geeigneten Kompartiment mit einem viralen Ziel bewirkt wird. Beispiele solcher Verfahren folgen, sie sollen die Erfindung jedoch nicht beschränken. So können beispielsweise RNA-Moleküle (die alle im Stand der Technik gut bekannt sind), wie Köder-RNAs, Ribozyme und Antisense-RNA- oder -DNA-Moleküle, in vivo aus DNA-Molekülen synthetisiert (oder in vitro gebildet) werden, so daß sie kovalent an ein virales Verpackungssignal gebunden werden, wofür unten Beispiele angegeben sind. Diese Mittel werden als "Lokalisierungssignale" bezeichnet. Alternativ können proteinartige oder Polypeptidmittel aus DNA oder RNA innerhalb einer Zelle in der Form eines chimären Polypeptids oder Proteins erzeugt werden, wobei ein Teil des Polypeptids eine antivirale Wirkung besitzt und der andere Teil eine Lokalisierung des Polypeptids an einem geeigneten viralen Kompartiment bewirkt. Zusätzlich können zahlreiche therapeutische Mittel in vitro synthetisiert und mittels irgendeinem von vielen Standardverfahren verabreicht werden, um eine Ausrichtung des verabreichten therapeutischen Mittels auf ein geeignetes zelluläres Kompartiment innerhalb eines Patienten zu bewirken.
  • Mit "Verstärken" der Wirkung eines therapeutischen Mittels in vivo ist gemeint, daß ein Lokalisierungssignal dieses Mittel auf eine bestimmte Stelle innerhalb einer Zelle ausrichtet und dadurch eine bessere Wirkung des Mittels bewirkt. Somit hat eine geringere Konzentration eines in vivo an eine Zelle verabreichten Mittels die gleiche Wirkung wie eine größere Konzentration eines nicht-lokalisierten Mittels. Eine solche gesteigerte Effizienz des ausgerichteten oder lokalisierten Mittels kann anhand irgendeines einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannten Standardverfahrens gemessen werden. Im allgemeinen wird die Wirkung des Mittels verstärkt, indem das Mittel näher an das Ziel gebracht wird, so daß es die gewünschte Wirkung auf das Ziel haben kann. Dies kann erzielt werden, indem eine Lokalisierung des Mittels in einem kleinen definierten Kompartiment mit dem Ziel bewirkt wird (z.B. innerhalb eines Viruspartikels).
  • Virale Verpackungssignale umfassen kleine organische Moleküle, die spezifische Zielsignale imitieren, wie z.B. ein das HIV-Verpackungssignal imitierendes organisches Molekül, und die dazu verwendet werden können, organische Inhibitoren an HIV-Verpackungsstellen auszuliefern.
  • Das Erhöhen der Konzentration eines Virusinhibitors an einer Stelle innerhalb der Zelle, die für die Virusreplikation oder den Virusaufbau wichtig ist, stellt eine allgemeine Art der Steigerung der Wirksamkeit antiviraler Mittel dar. Die oben beschriebene Colokalisierungsstrategie kann ein virales Verpackungssignal verwenden, um RNA oder ein Protein mit einem für die Virusreplikation zuständigen Ziel zu colokalisieren. Auf diese Weise kann die Virusreplikation reduziert oder verhindert werden. Dieses Verfahren kann zur Verbesserung der Wirksamkeit vieler antiviraler Mittel, einschließlich Antisense-RNA und Köder-RNAs eingesetzt werden, indem sie an ein geeignetes Lokalisierungssignal angebunden werden, um sie an den therapeutisch wichtigen intrazellulären und viralen Ort zu sortieren, an dem die Virusreplikationsmaschinerie aktiv ist.
  • Beispielsweise können das HIV-Verpackungssignal und/oder das rev-Antwortelement (RRE), um die Ribozym- und andere RNA-basierende Inhibition der HIV-Replikation zu verbessern (Cullen et al., 58 Cell 423, 1989), benachbart zu einer inhibitorischen RNA plaziert werden, um sie mit einer zu zerstörenden HIV-RNA zu colokalisieren (Lee et al., 4 New Biol. 66, 1992).
  • Die Lokalisierung kleiner antiviraler Moleküle an geeigneten Stellen innerhalb der Zelle steigert deren Nützlichkeit. Wenn beispielsweise AZT nur auf das intrazelluläre Kompartiment gerichtet wird, in welchem HIV sein Genom revers transkribiert, wird seine Wirksamkeit erheblich gesteigert, und seine Nebenwirkungen werden verringert oder eliminiert. Die Wirksamkeit anderer, nicht-viraler Arzneimittel kann durch die Schaffung von Systemen, die sie auf geeignete intrazelluläre Kompartimente, Zellarten oder Organe ausrichten, in welchen sie ihre spezielle Funktion am besten entfalten können, ebenfalls gesteigert werden.
  • In anderen Aspekten liefert die Erfindung Verfahren zum Steigern der Wirkung der auf Nukleinsäuren basierenden therapeutischen Mittel in vivo durch Colokalisieren derselben mit ihrem Ziel unter Verwendung eines geeigneten viralen Verpackungssignals.
  • Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Zunächst werden die Zeichnungen kurz beschrieben.
  • Zeichnungen
  • 1A ist eine schematische Darstellung der retroviralen Vektoren B2A und N2A:Hamβ; 1B ist eine schematische Darstellung der Bestimmung transkribierter B2A-RNAs in retroviralen Verpackungszellen; 1C ist eine schematische Darstellung einer Colokalisierungs-/Inhibitionsstrategie der vorliegenden Erfindung;
  • 2 ist eine schematische Darstellung verschiedener Hammerkopf-Ribozym-Motive, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, und
  • die 3 und 4 sind Histogramme, die die Hemmung einer viralen genomischen Ziel-RNA (gezeigt durch Reduzierung der Virustiter) durch ausgewählte Ribozyme in vivo darstellen, als ein Modell für das Zielen auf Viren durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung.
  • Zielrichten des therapeutischen Mittels
  • Es wurden mehrere antivirale Strategien postuliert, die RNAs als Inhibitoren für die Virusreplikation einsetzen. Sie umfassen die Verwendung von Antisense-RNA, Köder-RNAs und Ribozymen als Inhibitoren (Sullenger et al., 10 Mol. Cell. Biol. 6512; 1990; Sullenger et al., 63 Cell 601, 1990; Sarver et al., 247 Science 1222, 1990). Die Fähigkeit, Ribozyme auszurichten, um virale RNAs in vitro spezifisch zu spalten, hat zu großen Spekulationen über ihren potentiellen therapeutischen Wert als antivirale Mittel in vivo geführt (Cech, 260 JAMA 3030, 1988, und Rossi, 3 Curr. Opin. Biotech. 3, 1992). Um das Potential eines Ribozyms oder eines anderen Inhibitors als antivirales Mittel aus dem Reagenzglas erfolgreich auf Zellen und Organismen zu übertragen, müssen die Charakteristika berücksichtigt werden, die diese Umgebungen unterscheiden. Die Geschwindigkeit einer Ribozym-vermittelten trans-Spaltungsreaktion in vitro kann nahezu die Geschwindigkeit erreichen, mit der sich RNA-Duplexe in Lösung bilden, weil die RNA-Moleküle in Lösung im Reagenzglas frei diffundieren. In Zellen dagegen scheinen RNAs nicht frei zu diffundieren. Vielmehr scheinen sie hochgradig in Kompartimente unterteilt und aktiv bestimmten Orten innerhalb der Zelle zugeordnet zu sein (Lawrence et al., 87 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5420, 1990). Eine solche Unterteilung viraler RNAs in Kompartimente in vivo kann deren Verfügbarkeit für Ribozyme reduzieren.
  • Die Anmelderin schlägt eine Strategie vor, die die Neigung einer Zelle ausnutzt, biologische Moleküle in geordneter Weise in Kompartimente zu unterteilen und tatsächlich zwei Nukleinsäuremoleküle nah beieinander zu plazieren. Durch das Zuordnen von Inhibitoren an dieselben Stellen innerhalb von Zellen wie deren Ziele kann die Konzentration des Inhibitors an seinem benötigten Wirkort erhöht werden. Dies wiederum steigert die Wirksamkeit des Inhibitors und verringert seine Nebenwirkungen, da niedrigere Dosen an Inhibitor verabreicht werden können.
  • In ähnlicher Weise kann die Wirksamkeit von Inhibitoren für andere Arten von viralen Zielen gesteigert werden. Zusätzlich können auch andere Arten von Mitteln in geeigneter Weise ausgerichtet werden. So z.B. Mittel, die die Aktivität von Zellkomponenten steigern, was wiederum eine vorteilhafte Wirkung liefert. Somit kann irgendein virales therapeutisches Mittel innerhalb eines geeigneten Kompartiments lokalisiert oder konzentriert werden, und seine Wirksamkeit kann dadurch gesteigert werden. In ähnlicher Weise können auch andere Arten von therapeutischen Mitteln verbessert werden.
  • Fachleute auf dem Gebiet erkennen, daß das unten angegebene Beispiel ein die Erfindung nicht beschränkendes Beispiel ist und lediglich die allgemeine Verwendung der Erfindung veranschaulicht. Das Beispiel zeigt, daß das Verpackungssignal eines Virus verwendet werden kann, um ein Ribozym an einem Ort mit einer viralen Ziel-RNA zu lokalisieren. Die in diesem Beispiel erzielten außergewöhnlichen Ergebnisse sind veranschaulichend für die tiefgreifenden Auswirkungen, die die Verwendung der Erfindung auf Arzneimitteltherapien haben wird. Wie oben erwähnt, ist die Anwendbarkeit der Erfindung nicht auf irgendeine bestimmte Art einer RNA, eines Proteins oder eine andere Art eines therapeutischen Mittels beschränkt, sondern kann vielmehr in breitem Umfang auf die Lokalisierung irgendeines gewünschten therapeutischen Mittels angewendet werden. In dieser Erfindung ist es wünschenswert, daß die Lokalisierung so spezifisch wie möglich ist, damit die für die Behandlung eines Individuums erforderliche Konzentration des Mittels so niedrig wie möglich gehalten werden kann.
  • Beispiel:
  • Zur Veranschaulichung der beanspruchten Erfindung wurde ein experimentelles System entwickelt, um zu zeigen, daß die Ribozym-vermittelte trans-Spaltung viraler RNAs in vivo durch Colokalisierung eines Ribozyms in Bezug auf seine Ziel-RNA innerhalb einer Zelle in wirksamer Weise bereitgestellt werden kann. Dieses experimentelle System macht sich einige Eigenschaften der retroviralen Replikation sowie verschiedene technische Entwicklungen, die mit dem durch retrovirale Vektoren vermittelten Gentransfer in Verbindung stehen, zunutze. In dieser Studie wurden zwei Arten von retroviralen Vektoren (1A) verwendet. Der retrovirale Vektor B2A enthält das lacZ-Gen (Markowitz et al., 62 J. Virol., 1120, 1988).
  • Die lacZ-codierenden Transkripte wurden zur Spaltung mittels zweier Hammerkopf-Ribozyme ausgerichtet (Uhlenbeck, 328 Nature 596, 1987, und Haseloff und Gerlach, 334 Nature 585, 1988) und wurden somit verwendet, um eine Ribozym-vermittelte Inhibition zu berichten. Der retrovirale Vektor N2A:Hamβ1G codiert den selektierbaren Marker neoR und ein Hammerkopf-Ribozym. Der Vektor N2A:Hamβ2G ist identisch, mit Ausnahme von Veränderungen in der Sequenz der flankierenden Arme des Hammerkopfs, die ihn auf eine andere Region der lacZ-codierenden Sequenz ausrichten (2).
  • Diese Vektoren wurden verwendet, um Ribozym enthaltende RNAs in einer ökotropen, den retroviralen B2A-Vektor (E86/B2A) (Markowitz et al., 62 J. Virol. 1120, 1988) enthaltenden Verpackungszellinie zu übertragen und zu exprimieren. In E86/B2A-Zellen haben identische lacZ- codierende Transkripte zwei verschiedene Bestimmungen (1B). Einige der Transkripte dienen als mRNAs und werden zur Translation zum Zytoplasma transportiert. Die Menge dieser mRNAs kann durch Messen des Niveaus an β-Galactosidaseenzymaktivität innerhalb der Zellen bestimmt werden. Andere Transkripte dienen als genomische RNAs für die Replikation des retroviralen Vektors und sind in virale Partikel verpackt, die auf der Oberfläche der Verpackungszellen knospen (1B). Die Menge dieser genomischen RNAs kann durch Bestimmen des Titers des lacZ-codierenden Virus, der aus den Verpackungszellen entsteht, bestimmt werden.
  • Von B2A abgeleitete Transkripte sind in die knospenden Viruspartikel eingekapselt, weil sie das Verpackungssignal des Moloney-Maus-Leukämievirus (MoMLV), Ψ, enthalten. Dieser Verpackungsprozeß wird vermittelt durch die Fähigkeit der MoMLV-Einkapselungsmaschinerie, bereitgestellt durch die Verpackungszellen, Ψ enthaltende Transkripte zu erkennen und sie an Stellen zu transportieren, an denen Viren knospen (Mann et al., 33 Cell 153, 1983, Goff, Retroviruses and Disease (Hrsg. Hanafusa, H., Pinter, A. & Pullman, M. E.) 1–19 (Academic Press, Inc., 1989).
  • Diese MoMLV-Einkapselungsmaschinerie wurde verwendet, um das Anti-lacZ-Hammerkopf-Ribozym enthaltende Transkripte mit den das lacZ-Ziel codierenden Transkripten zu colokalisieren. In Verpackungszellen, die sowohl B2A als auch N2A:Hamβ enthalten, sind die von B2A und N2A:Hamβ abgeleiteten RNAs jeweils sowohl für eine Translation als auch für eine Verpackung ausgerichtet (1C). In solchen Zellen werden die genomischen RNA-Transkripte von B2A und N2A:Hamβ an Stellen viraler Knospung an der Oberfläche der Verpackungszellen durch die MoMLV-Einkapselungsmaschinerie colokalisiert. Da jedes retrovirale Partikel zwei genomische RNAs enthält, können Substrat und Ribozym enthaltende Genome zusammen verpackt werden (1C) (Varmus et al., RNA Tumor Viruses (Hrsg. Weiss, R., Teich, N., Varmus, H. & Coffin, J.) 369–512 (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1984, und Panganiban 241 Science 1064–1069 (1988). Wenn daher die Hammerkopf-Ribozyme aktiv und die Zielsequenzen auf diesen genomischen RNAs zugänglich sind, verstärkt die Colokalisierung die Effizienz der Spaltung, und der Titer des aus diesen Zellen entstehenden lacZ-codierenden Virus wird reduziert.
  • Darüber hinaus ist es unwahrscheinlich, daß die als mRNAs dienenden lacZ- und Hamβ-Transkripte colokalisiert werden, da die beiden Transkripte aus Proviren erzeugt werden, die an entfernt liegenden Stellen auf den zellulären Chromosomen integriert sind (Lawrence et al., 87 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5420, 1990, Varmus et al., RNA Tumor Viruses (Hrsg. Weiss, R., Teich, N., Varmus, H. & Coffin, J.) 369–512 (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1984). mRNAs werden für die Translation durch verschiedene Quadranten befördert, die durch die Stelle im Kern, an der sie transkribiert wurden, bestimmt werden (Raap et al., 197 Exp. Cell Res. 319, 1991). Wenn daher die Colokalisierung von Ribozym- und Substrat-RNAs die trans-Spaltung einer Substrat-RNA innerhalb einer Zelle verstärkt, sollte die Produktion des β-Galactosidaseproteins um einen kleineren Betrag reduziert werden als der lacZ-Virustiter in diesen Zellen.
  • Um dieses Phänomen zu veranschaulichen, wurden die retroviralen Vektoren N2A:Hamβ1G und N2A:Hamβ2G mittels ligierender Oligonukleotide, die zwei verschiedenen Hammerkopf-Ribozymen entsprechen, an die polyklonale Stelle des Vektors N2A kloniert (2) (Hantzopoulos et al., 86 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3519, 1989). Eine inaktive Hammerkopf-Sequenz, Hamβ1D (2), wurde in N2A eingefügt, um in diesen Experimenten als Kontrolle für die Bedeutung der Ribozymaktivität zu dienen. Hamβ1D enthält eine einzige Nukleotiddeletion im katalytischen Kern des Hammerkopf-Ribozyms (2). Es wurde gezeigt, daß eine solche Mutation die katalytische Aktivität eines Hammerkopf-Ribozyms in vitro nahezu eliminiert (Ruffner et al., 29 Biochem 10695, 1990).
  • Die retroviralen Vektoren N2A:Hamβ1G, N2A:Hamβ2G, N2A:Hamβ1D und elterlicher N2A wurden in die amphotrope Verpackungszellinie AM12 transfiziert (Markowitz et al., 167 Virology 400, 1988). Transfizierte Zellen wurden durch Zugabe von G418 zu dem Medium selektiert, und resistente Zellen wurden gepoolt. Vektor enthaltende virale Überstände wurden aus Zellen, die jedes Konstrukt enthielten, isoliert und verwendet, um 104 E86/B2A-Zellen mit einem Infektionsfaktor (Multiplicity of Infection, MOI) von 10 zu infizieren. Anstelle von Transfektion wurde Retroviren-vermittelter Gentransfer verwendet, um die Ribozyme enthaltenden Matrizen in die E86/B2A-Zellen einzubringen, um die möglichen Probleme einer variablen lacZ-Expression zu vermeiden, die mit klonaler Isolierung von E86/B2A-Zellinien einhergehen.
  • Die transduzierten E86/B2A-Zellen wurden vermehrt und auf β-Galactosidaseaktivität innerhalb der Zellen und auf neoR- und lacZ-Virustiter, die aus den Zellen entstanden waren, analysiert (3). In Zellen, die die funktionalen Hammerkopf-Vektoren N2A:Hamβ1G und N2A:Hamβ2G enthielten, wurde im Vergleich zu Zellen, die einen Kontrollvektor, N2A oder N2A:Hamβ1D, enthielten, keine signifikante Reduktion von β-gal-Aktivität beobachtet. In ähnlicher Weise wurde in neoR-Virustiter, der aus den viele Vektoren enthaltenden Zellen entstanden war, kein Unterschied gesehen. Die lacZ-Virustiter aus N2A:Hamβ1G und N2A:Hamβ2G enthaltenden Zellen wurden jedoch im Vergleich zu Kontrollvektor enthaltenden Zellen um 90–92% reduziert (3).
  • In dem oben beschriebenen Experiment wurden 104 E86/B2A-Zellen mit einem MOI von 10 infiziert, vermehrt und auf eine Reduktion von lacZ-Virustiter und Proteinproduktion getestet. Diese Zellen wurden nicht mittels G418 selektiert, um sicherzustellen, daß alle Zellen einen ein Ribozym enthaltenden retroviralen Vektor enthalten. Um zu bestimmen, ob irgendein Teil der 8–10% des austretenden Virus aus Zellen erzeugt wurde, denen ein Ribozym-Konstrukt fehlt, wurden mit N2A:Hamβ infizierte Zellen mittels G418 selektiert und auf eine Reduktion des lacZ-Virustiters und der Proteinproduktion getestet. Der aus den mittels G418 selektierten E86/B2A-Zellen, die N2A:Hamβ1G und N2A:Hamβ2G enthielten, erzeugte lacZ-Virustiter wird im Vergleich zu mittels G418 selektierten Zellen, die einen Kontrollvektor enthielten, um 95–97% verringert. Auch in diesen Zellen wird keine Reduktion der β-gal-Aktivität beobachtet.
  • Die letzten 3–5% des lacZ-Virus, die einer Hemmung entgehen, resultieren zumindest teilweise aus der Verpackung zweier lacZ-Genome in einem Viruspartikel (1C). Wäre die Verpackung der RNA-Genome völlig zufällig, so stünde zu erwarten, daß etwa 1% der Viruspartikel zwei lacZ-Genome enthält, da Ribozym enthaltende Genome gegenüber lacZ-Virusgenomen in den Zellen in 10-fachem Überschuß vorliegen.
  • Diese Ergebnisse liefern Hinweise darauf, daß die Colokalisierung eines Ribozyms mit seinem Substrat innerhalb einer Zelle für die wirksame Spaltung der Ziel-RNA in vivo wesentlich ist. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse darauf hin, daß eine solche Colokalisierung die Geschwindigkeit der Ribozym-vermittelten Spaltung von Ziel-RNAs in vivo beschränkt, und daß für eine Verbesserung der Ribozym-vermittelten Hemmung der viralen Genexpression die Geschwindigkeit, mit der ein Ribozym sein Substrat in vivo findet, gesteigert werden muß.
  • In einem zweiten Experiment wurden 104 E86/B2A-Zellen mit verschiedenen MOI infiziert, um zu bestimmen, wie das relative Verhältnis von Ribozym- zu Substrat-enthaltenden Transkripten innerhalb einer Zelle das Niveau der Inhibition von aus diesen Zellen entstandenem lacZ-Virustiter beeinflußt. Wie erwartet, nimmt mit N2A:Hamβ1G und N2A:Hamβ2G die Inhibition von lacZ-Virustiter ab, da der MOI von 10 auf 2 bis 0,4 abgesenkt wird. Im Gegensatz dazu tritt keine signifikante Veränderung des lacZ-Titers auf, wenn Kontrollvektoren verwendet werden, um mit diesen MOI zu infizieren (4). Dies veranschaulicht, daß die Inhibition von lacZ-Virustiter direkt mit dem Vorhandensein des chimären aus Lokalisierungssignal- und Virusinhibitor in Beziehung steht.
  • Dieses Beispiel zeigt deutlich, daß ein virales Lokalisierungssignal verwendet werden kann, um ein antivirales Mittel auszurichten, um eine fast 100%-ige Effizienz bei der Abtötung von Viren zu liefern. Obwohl die Verwendung eines Verpackungssignals veranschaulicht wird, werden Fachleute erkennen, daß gleichermaßen irgendeine andere RNA, eine DNA oder ein anderes Mittel lokalisiert und dadurch ihre bzw. seine Wirksamkeit gesteigert werden kann.
  • Verwendung
  • Das oben beschriebene System ist nicht nur für die Verabreichung therapeutischer Mittel in vivo, sondern auch für Zellkulturen in vitro geeignet, wobei es wichtig ist, virenfreie Zellen beizubehalten. Beispielsweise kann eine Zelle mit DNA versehen werden, die ein chimäres Antisense-RNA-Molekül codiert, welches an ein spezifisches virales Verpackungssignal gebunden ist. Es kann bewirkt werden, daß ein solches chimäres Konstrukt in irgendeiner gewünschten Weise von einem Promotor exprimiert wird, so daß die Zelle dazu gebracht werden kann, jegliches in die Zelle eindringende Virus abzutöten oder dessen Replikation zu verhindern. Auf diese Weise können Virusinfektionen in in vitro-Zellkulturen verhindert werden. Ein solches Konstrukt kann auch in einer Situation in vivo verwendet werden, bei der es wichtig ist, ein Individuum entweder prophylaktisch oder therapeutisch virenfrei zu halten. Eine solche DNA kann mittels standardmäßiger Gentherapietechniken eingebracht werden, oder die RNA kann mittels Elektroporation direkt an irgendeiner gewünschten Stelle injiziert werden. Fachleute auf dem Gebiet erkennen, daß auch andere Standardtechniken verwendet werden können, um die chimären Mittel dieser Erfindung einzubringen.
  • Antivirale Konstrukte können ebenfalls in einer Situation in vivo verwendet werden, bei der es wichtig ist, ein Individuum virenfrei zu halten oder die Virenbelastung eines Individuums zu reduzieren. Die Inhibition der Virusreplikation durch solche lokalisierten antiviralen Mittel kann entweder prophylaktisch oder therapeutisch eingesetzt werden. Beispielsweise können standardmäßige Gentherapietechniken eingesetzt werden, um eine Transkriptionseinheit in menschliche Lymphozyten oder Prälymphozyten einzubringen, was zur Expression einer RNA führt, die ein an das HIV-Verpackungssignal angebundenes Anti-HIV-Ribozym codiert. Wenn Zellen, die die Anti-HIV-Ribozyme enthalten, mit HIV infiziert werden, werden die Ribozyme an Stellen der HIV-Verpackung lokalisiert und hemmen die Virusreplikation durch Spaltung der genomischen RNA von HIV. Auf diese Weise kann die Ausbreitung von HIV in einem Individuum reduziert oder gehemmt werden. Gene, die andere antivirale Mittel codieren, die so ausgestaltet wurden, daß das exprimierte Mittel an ein geeignetes Lokalisierungssignal angebunden ist, um seine Effizienz zu verbessern, können mittels standardmäßiger Gentherapietechniken (z.B. unter Verwendung eines retroviralen oder eines anderen viralen Vektors) oder mittels zahlreicher physikalischer Übertragungstechniken (z.B. Liposomen) auf ein Individuum übertragen werden. Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, daß auch andere Standardtechniken verwendet werden können, um die chimären Mittel dieser Erfindung einzubringen.
  • Gene, die die in dieser Erfindung diskutierten chimären Mittel codieren, können auch zur Erzeugung transgener Pflanzen und Tiere verwendet werden, die gegen eine Virusinfektion oder -replikation resistent sind. Beispielsweise kann eine Transkriptionseinheit erzeugt werden, die zur Expression von RNAs führt, die jeweils ein Ribozym enthalten, welches dafür ausgestaltet ist, Geflügel-Leukose-Virus-(ALV-)RNAs und das ALV-Virusverpackungssignal zu spalten. DNA, die diese Transkriptionseinheit codiert, kann verwendet werden, um durch Übertragen einer solchen DNA in die Keimbahnzellen von Hühnern ein transgenes Huhn zu erzeugen. In dem transgenen Huhn enthalten und exprimieren alle Zellen das chimäre Anti-ALV-Transgen. Wird somit das transgene Huhn mit ALV infiziert, wird die Ausbreitung des Virus in dem Tier reduziert oder eliminiert, da chimäres Anti-ALV-Ribozym codierende Transkripte mit genomischen ALV-RNAs in den Zellen des Huhns colokalisiert werden und diese spalten. Auf diese Weise kann die Schwere der durch Viren verursachten Erkrankung sowohl in transgenen Pflanzen als auch in transgenen Tieren deutlich reduziert oder eliminiert werden.
  • Verabreichung
  • Ausgewählte Mittel, z.B. Oligonukleotide oder Ribozyme, können prophylaktisch verabreicht werden oder sie können an Patienten verabreicht werden, die an einer Ziel-Erkrankung leiden, und zwar z.B. durch exogene Verabreichung des Mittels an ein infiziertes Gewebe mittels eines geeigneten Verabreichungsvehikels, z.B. eines Liposoms, eines Vehikels mit kontrollierter Freisetzung, unter Verwendung von Iontophorese, Elektroporation oder mit Ionen gepaarten Molekülen, oder kovalent angehängten Addukten und anderen pharmakologisch anerkannten Verabreichungsverfahren. Die Verabreichungswege umfassen intramuskuläre, Aerosol-, orale (Tabletten- oder Pillenform), topische, systemische, okulare, intraperitoneale und/oder intrathekale Verabreichung. Expressionsvektoren für die Immunisierung mit Ribozymen und/oder die Verabreichung von Oligonukleotiden sind ebenfalls geeignet.
  • Der spezifische Verabreichungsweg für irgendein ausgewähltes Mittel ist von der Verwendung des Mittels abhängig. Im allgemeinen konzentriert sich ein spezifisches Verabreichungspro gramm für jedes Mittel auf die Aufnahme des nackten Mittels in Bezug auf die Lokalisierung innerhalb der Zelle, gefolgt von einer Demonstration der Effizienz. Alternativ kann die Verabreichung in einem Organ oder Gewebe eines Tiers an dieselben Zellen erfolgen. Aufnahmestudien umfassen Aufnahmetests, um z.B. die zelluläre Aufnahme von Oligonukleotiden zu testen, wobei das Verabreichungsvehikel oder die -strategie nicht berücksichtigt werden. Solche Tests bestimmen auch die Lokalisierung des Mittels innerhalb der Zelle nach der Aufnahme, was letztendlich die Anforderungen an die Aufrechterhaltung stabiler Konzentrationen innerhalb des die Zielsequenz enthaltenden zellulären Kompartiments (Zellkern und/oder Zytoplasma) vorgibt. Dann können die Wirksamkeit und die Zytotoxizität getestet werden. Die Toxizität umfaßt nicht nur die Lebensfähigkeit der Zellen, sondern auch die Zellfunktion.
  • Einige Verabreichungsverfahren, die verwendet werden können, umfassen folgende:
    • a. Einkapselung in Liposomen,
    • b. Transduktion mittels retroviraler Vektoren,
    • c. Konjugation mit Cholesterol,
    • d. Lokalisierung an Zellkern-Kompartiment unter Verwendung einer Antigen-Bindungsstelle, die an den meisten snRNAs zu finden ist,
    • e. Neutralisation der Ladung des Ribozyms unter Verwendung von Nukleotidderivaten und
    • f. Verwendung von Stammzellen aus dem Blut, um Ribozyme im ganzen Körper zu verteilen.
  • Wenigstens drei Arten von Verabreichungsstrategien sind in der vorliegenden Erfindung nützlich, einschließlich der folgenden: Modifizierung von Ribozymen, Arzneimittelverabreichungsvehikel in Form von Partikelträgern und retrovirale Expressionsvektoren. Wie die meisten kleinen Moleküle werden nicht-modifizierte Ribozyme und Antisense-Oligonukleotide, wenn auch langsam, von den Zellen aufgenommen. Um die Aufnahme in die Zellen zu verbessern, können die Ribozyme im wesentlichen zufällig modifiziert werden, und zwar so, daß ihre Ladung reduziert wird, daß sie jedoch spezifische funktionelle Gruppen behalten, die für die RNA-Spaltungsaktivität erforderlich sind. Dies führt zu einem Molekül, welches sich über die gesamte Zellmembran verteilen kann, wodurch die Permeabilitätsschranke entfernt wird.
  • Die Modifikation von Ribozymen zur Verringerung der Ladung ist nur ein Ansatz zur Verbesserung der zellulären Aufnahme dieser größeren Moleküle. Der zufällige Ansatz ist jedoch nicht ratsam, da Ribozyme strukturell und funktionell komplexer sind als kleine Arzneimittelmoleküle. Die strukturellen Anforderungen, die notwendig sind, um die katalytische Aktivität von Ribozymen aufrechtzuerhalten, sind für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich. (Siehe Cech, Curr. Op. Structural Biol., 1992). Diese Anforderungen werden bei der Ausgestaltung von Modifikationen zur Verbesserung der zellulären Verabreichung berücksichtigt. Die Modifikationen sind auch dafür ausgestaltet, die Empfindlichkeit gegenüber Nukleaseabbau zu reduzieren. Diese beiden Charakteristika sollten die Wirksamkeit des Ribozyms deutlich verbessern. Die zelluläre Aufnahme kann um verschiedene Größenordnungen gesteigert werden, ohne die für die Ribozymspaltungsaktivität notwendigen Phosphodiesterverbindungen verändern zu müssen.
  • Chemische Modifikationen des Phosphatgerüsts reduzieren die negative Ladung und erleichtern dadurch die Verteilung in der gesamten Membran. Dieses Prinzip wurde für Antisense-DNA-Technik erfolgreich demonstriert. Die Ähnlichkeiten in der chemischen Zusammensetzung zwischen DNA und RNA machen dies zu einem durchführbaren Ansatz. Im Körper ist die Aufrechterhaltung einer externen Konzentration notwendig, um die Verteilung des modifizierten Ribozyms in die Zellen des Gewebes voranzutreiben. Verabreichungswege, die die Aussetzung des erkrankten Gewebes an eine dauerhaft hohe Konzentration des Arzneimittels erlauben, welches durch systemische Adsorption langsam abgebaut wird, sind bevorzugt. Die intravenöse Verabreichung mit einem Arzneimittelträger, der dafür ausgestaltet ist, die Halbwertszeit des Ribozyms im Blutkreislauf zu verlängern, kann verwendet werden. Die Größe und die Zusammensetzung des Arzneimittelträgers beschränken die rasche Beseitigung aus dem Blutstrom. Der Träger, der dazu gebracht wird, sich an der infizierten Stelle anzusammeln, kann das Ribozym vor Abbauprozessen schützen.
  • Arzneimittelverabreichungsvehikel sind sowohl für die systemische als auch für die topische Verabreichung wirksam. Sie können so ausgestaltet werden, daß sie als ein Reservoir für eine langsame Freigabe dienen, oder sie können ihren Inhalt direkt an die Zielzelle abgeben. Ein Vorteil bei der Verwendung von Arzneimittelvehikeln zur direkten Verabreichung besteht darin, daß pro Aufnahme eine Vielzahl von Molekülen verabreicht wird. Es wurde gezeigt, daß solche Vehikel die Halbwertszeit von Arzneimitteln, die ansonsten rasch aus dem Blutstrom abgebaut würden, im Blutkreislauf verlängern. Einige Beispiele solcher in diese Kategorie fallender spezialisierter Arzneimittelverabreichungsvehikel umfassen Liposome, Hydrogele, Cyclodextrine, bioabbaubare Nanokapseln und bioadhäsive Mikrokügelchen.
  • Aus dieser Kategorie von Verabreichungssystemen sind die Liposome bevorzugt. Liposome erhöhen die intrazelluläre Stabilität, verbessern die Aufnahmeeffizienz und steigern die biologische Aktivität. Liposome sind hohle kugelförmige Vehikel, die aus Lipiden bestehen, die in ähnlicher Weise angeordnet sind wie die Lipide, die die Zellmembran bilden. Sie weisen einen wäßrigen inneren Raum zum Einfangen wasserlöslicher Verbindungen auf, und ihre Größe reicht von 0,05 bis zu mehreren Mikrometern Durchmesser. Mehrere Studien haben gezeigt, daß Liposomen RNA an Zellen verabreichen können und daß die RNA biologisch aktiv bleibt.
  • Beispielsweise wurde gezeigt, daß ein Liposomenverabreichungsvehikel, Lipofectin, das ursprünglich als Forschungswerkzeug ausgestaltet worden war, intakte mRNA-Moleküle an Zellen verabreicht und zu einer Produktion des entsprechenden Proteins führt.
  • Liposome bieten mehrere Vorteile: Sie sind nicht toxisch und von ihrer Zusammensetzung her biologisch abbaubar, sie haben eine lange Halbwertszeit im Blutkreislauf, und Erkennungsmoleküle können leicht an ihrer Oberfläche angebracht werden, um auf Gewebe zu zielen. Schließlich hat die kostengünstige Herstellung von Arzneimitteln auf Liposomenbasis entweder in flüssiger Suspension oder in Form eines lyophilisierten Produkts die Überlebensfähigkeit dieser Technik als geeignetes Arzneimittelverabreichungssystem gezeigt.
  • Andere Arzneimittelverabreichungssysteme mit kontrollierter Freisetzung, wie Nanopartikel und Hydrogele, können potentielle Verabreichungsvehikel für ein Ribozym sein. Diese Träger wur den für chemotherapeutische Mittel und Arzneimittel auf Proteinbasis entwickelt und können demzufolge für die Ribozymverabreichung ausgestaltet werden.
  • Die topische Verabreichung von Ribozymen ist vorteilhaft, da sie an der Verabreichungsstelle eine lokalisierte Konzentration mit minimaler systemischer Adsorption gestattet. Dies vereinfacht die Verabreichungsstrategie des Ribozyms an die erkrankte Stelle und verringert das Ausmaß der toxikologischen Charakterisierung. Darüber hinaus ist die zu verwendende Menge an Material weitaus geringer als die, die für andere Verabreichungswege erforderlich ist. Eine wirksame Verabreichung erfordert eine Diffusion des Ribozyms in die infizierten Zellen. Eine chemische Modifikation des Ribozyms zur Neutralisierung negativer Ladung kann alles sein, was für eine Penetration erforderlich ist. Falls jedoch diese Neutralisation der Ladung nicht ausreichend ist, kann das modifizierte Ribozym zusammen mit Permeabilitätsverbesserern, wie Azon oder Ölsäure, in einem Liposom formuliert werden. Die Liposome können entweder ein Verabreichungsvehikel mit langsamer Freisetzung, bei dem das modifizierte Ribozym und der Permeabilitätsverbesserer von dem Liposom in die infizierte Zelle übergehen, repräsentieren, oder die Liposomen-Phospholipide können zusammen mit dem modifizierten Ribozym und dem Permeabilitätsverbesserer direkt an der Vereinfachung der zellulären Verabreichung beteiligt sein. In einigen Fällen können für eine langsame Freisetzung sowohl das Ribozym als auch der Permeabilitätsverbesserer in Form eines Suppositoriums formuliert werden.
  • Ribozyme können auch systemisch verabreicht werden. Die systemische Absorption bezieht sich auf die Ansammlung von Arzneimitteln im Blutstrom, gefolgt von einer Verteilung im ganzen Körper. Verabreichungswege, die zu einer systemischen Absorption führen, umfassen intravenöse, subkutane, intraperitoneale, intranasale, intrathekale und ophthalmische Verabreichung. Jeder dieser Verabreichungswege bringt das Ribozym mit einem zugänglichen erkrankten Gewebe in Kontakt. Die subkutane Verabreichung verläuft in einen lokalisierten Lymphknoten, der sich durch das lymphatische Netz in den Blutkreislauf fortsetzt. Es wurde gezeigt, daß die Geschwindigkeit des Eintritts in den Blutkreislauf eine Funktion des Molekulargewichts oder der Größe ist. Die Verwendung eines Liposoms oder eines anderen Arzneimittelträgers lokalisiert das Ribozym am Lymphknoten. Das Ribozym kann so modifiziert werden, daß es in die Zelle diffundiert, oder das Liposom kann direkt an der Verabreichung entweder des unmodifizierten oder des modifizierten Ribozyms an die Zelle beteiligt sein.
  • Eine Liposomenformulierung, die Ribozyme mit der Oberfläche von Lymphozyten und Makrophagen verbinden kann, ist ebenfalls geeignet. Dies liefert eine verbesserte Verabreichung an HSV-infizierte Zellen, indem die Spezifität der Immunerkennung von Makrophagen und Lymphozyten in infizierten Zellen ausgenutzt wird. Gesamtblutstudien zeigen, daß die Formulierung nach 8 Stunden bei 37°C von 90% der Lymphozyten aufgenommen wurde. Vorläufige Bioverteilungs- und pharmakokinetische Studien lieferten eine Stunde nach intravenöser Verabreichung 70% der injizierten Dosis/g Gewebe in der Milz.
  • Die intraperitoneale Verabreichung führt ebenfalls zum Eintritt in den Blutkreislauf, wobei das Molekulargewicht oder die Größe des Komplexes aus Ribozym und Verabreichungsvehikel die Eintrittsgeschwindigkeit steuert.
  • Intravenös injizierte Liposome zeigen eine Ansammlung in der Leber, der Lunge und der Milz. Die Zusammensetzung und die Größe können so angepaßt werden, daß diese Ansammlung 30% bis 40% der injizierten Dosis ausmacht. Der Rest wird für bis zu 24 Stunden im Blutstrom zirkulieren gelassen.
  • Das ausgewählte Verabreichungsverfahren führt zu einer Ansammlung im Zellplasma der befallenen Zellen, und die Moleküle sollten für eine optimale Dosierung eine gewisse Nukleaseresistenz besitzen. Eine Verabreichung an den Zellkern kann durchgeführt werden, ist jedoch weniger bevorzugt. Die am meisten bevorzugten Verabreichungsmethoden umfassen Liposome (10–400 nm), Hydrogele, Polymere mit kontrollierter Freisetzung, Mikroinjektion oder Elektroporation (für Behandlungen ex vivo) und andere pharmazeutisch anwendbare Vehikel. Die Dosierung ist von der Indikation der Erkrankung und dem Verabreichungsweg abhängig, sollte jedoch zwischen 100–200 mg/kg Körpergewicht/Tag betragen. Die Dauer der Behandlung wird während des Verlaufs der Krankheitssymptome fortgeführt; sie beträgt für gewöhnlich wenigstens 14–16 Tage und möglicherweise länger. Mehrere tägliche Dosen sind für topische Anwendungen, okulare Anwendungen und vaginale Anwendungen vorgesehen. Die Anzahl der Dosen ist von der Erkrankung, dem Verabreichungsvehikel und den Wirksamkeitsdaten aus klinischen Versuchen abhängig.
  • Die Einstellung therapeutischer Mengen von Ribozymen innerhalb der Zelle ist abhängig von der Geschwindigkeit der Aufnahme und des Abbaus. Eine Herabsetzung des Umfangs des Abbaus verlängert die Halbwertszeit des Ribozyms innerhalb der Zelle. Chemisch modifizierte Ribozyme, z.B. mit einer Modifikation des Phosphatgerüsts oder mit einer Kappenbildung aus Nukleotidanalogen am 5'- und 3'-Ende des Ribozyms, können eine unterschiedliche Dosierung erfordern. Beschreibungen geeigneter Systeme werden im oben zitierten Stand der Technik angegeben, der durch Bezugnahme vollständig hierin aufgenommen ist.
  • Die Erfindung ist insbesondere geeignet für die Verabreichung von Ribozymen, Antisense-Molekülen und Köder-RNAs, und sie kann, wie das oben beschriebene Beispiel zeigt, in überaus vorteilhafter Weise in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bestimmte Erkrankungen, die auf diese Weise behandelt werden können, umfassen alle Erkrankungen, die durch solche RNAs behandelt werden können, wie z.B. HSV-, HBV-, EBV- und HIV-Infektion, sowie zahlreiche Träger (wobei das Zielmolekül in einem bekannten Zellkompartiment lokalisiert ist).
  • Andere Ausführungsformen werden von den folgenden Ansprüchen umfaßt.

Claims (6)

  1. Verfahren zur Verstärkung der Wirkung eines therapeutischen Mittels auf ein virales Ziel in einer Zelle in Kultur, worin das virale Ziel in einem Viruspartikel vorhanden ist, mit den Stufen, in denen man a) das therapeutische Mittel an ein virales Verpackungssignal unter Ausbildung eines Konstruktes aus therapeutischem Mittel und viralem Verpackungssignal anbindet, wobei das virale Verpackungssignal bewirkt, daß das therapeutische Mittel an einem Ort mit dem viralen Ziel lokalisiert wird, und b) das Konstrukt mit einer Zelle, die das virale Ziel enthält, in Kontakt bringt, wobei das therapeutische Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Antisense-Oligonukleotid, einem Köderoligonukleotid und einem Ribozym.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das virale Verpackungssignal eine Nukleinsäurekomponente oder eine Proteinkomponente umfaßt.
  3. Therapeutisches Konstrukt zum Hemmen eines viralen Ziels in einer Zelle, wobei das virale Ziel in einem Viruspartikel vorhanden ist, mit einem therapeutischen Mittel mit der Fähigkeit, das virale Ziel zu hemmen, und wenigstens einem viralen Verpackungssignal, wobei das virale Verpackungssignal bewirkt, daß das therapeutische Mittel an einem Ort mit dem viralen Ziel lokalisiert wird, wobei das therapeutische Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Antisense-Oligonukleotid, einem Köderoligonukleotid und einem Ribozym.
  4. Therapeutisches Konstrukt nach Anspruch 3, wobei das virale Verpackungssignal eine Nukleinsäurekomponente oder eine Proteinkomponente umfaßt.
  5. Expressionsvektor, welcher Nukleinsäure umfaßt, die das therapeutische Konstrukt nach Anspruch 3 in einer Art und Weise codiert, welche eine Expression des therapeutischen Mittels in einer Zelle erlaubt.
  6. Vektor nach Anspruch 5, wobei der Vektor von einem Retrovirus abgeleitet ist.
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