JP2013529181A - 神経障害を治療するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2010年3月25日に出願した米国仮特許出願第61/317,598号の利益を請求し、その出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所から与えられた補助金第RO1 NS039074号および第PO1 AG022074号による政府の援助を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
本明細書で使用する「治療(treatment)」、および「治療(treating)」などの用語は、所望の薬理学的および/または生理学的効果を得ることを指す。この効果は、疾患またはその症状の完全なもしくは部分的な防止の観点から予防的であり得、かつ/または疾患および/もしくはその疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒の観点から治療的であり得る。本明細書で使用する「治療」は、哺乳類、特にヒトの疾患の全ての治療を包含し、(a)その疾患にかかりやすい可能性があるが、まだそれを有すると診断されていない対象においてその疾患が生じるのを防止すること、(B)その疾患を抑制すること、すなわち、その進行を止めること、および(c)その疾患を軽減すること、すなわち、その疾患の退縮を引き起こすことを含む。
本開示は、神経障害を治療する方法であって、一般に、それを必要としている個体の神経細胞および/またはグリア細胞内のプロテインキナーゼD1(PKD1)活性レベルを調節することを含む方法を提供する。本開示は、PKD1に特異的な抗体を提供する。本開示は、PKD1活性を欠く遺伝子組換え非ヒト動物を提供する。
本開示は、神経障害を治療する方法であって、一般に、かかる治療を必要としている個体の神経細胞および/またはグリア細胞内のPKD1活性レベルを調節することを含む方法を提供する。
本治療法は、それを必要としている個体に、個体の神経細胞および/またはグリア細胞内のPKD1活性を調節する有効量の活性薬剤を投与することを含む。適切な活性薬剤には、神経細胞および/またはグリア細胞内のPKD1レベルを調節する小分子、PKD1に特異的な抗体、ならびに核酸の薬剤が含まれる。
適切な活性薬剤には、PKD1キナーゼ活性を調節する小分子薬剤が含まれる。適切な小分子薬剤には、アミノ−エチル−アミノ−アリール(AEAA)(例えば、米国特許公開第2009/0247519号参照)、イミダゾピラジン化合物(例えば、米国特許公開第2009/0175852号参照)、インダゾール化合物(例えば、米国特許公開第2006/0004043号参照)が含まれるが、これらに限定されない。
(1)R8およびR9のそれぞれは、独立して、−Hまたは環Bの置換基であるか、または、
(2)R8およびR9は、それらが結合している原子と共に、正確に5個の環原子もしくは正確に6個の環原子を有する芳香環Cを形成し、それぞれの環原子は炭素環原子または窒素環原子であり、環Cは正確に0個、正確に1個、または正確に2個の環窒素原子を有し、環Cは環Bと縮合しており;かつ式中、
(1)R10、R11、R12、およびR13のそれぞれは、独立して、−Hまたは環Aの置換基であるか、または
(2)R12およびR13のそれぞれは、独立して、−Hまたは環Aの置換基であり、R10およびR11は、それらが結合している原子と共に、正確に6個の原子を有する芳香環Dを形成し、それぞれの環原子は炭素環原子であり、環Dは環Aと縮合しているか、または、
(3)R10およびR13のそれぞれは、独立して、−Hまたは環Aの置換基であり、R11およびR12は、それらが結合している原子と共に、正確に6個の環原子を有する芳香環Eを形成し、それぞれの環原子は炭素環原子であり、環Eは環Aと縮合しているか、または、
(4)R10およびR11のそれぞれは、独立して、−Hまたは環Aの置換基であり、R12およびR13は、それらが結合している原子と共に、正確に6個の環原子を有する芳香環Fを形成し、それぞれの環原子は炭素環原子であり、環Fは環Aと縮合しており;かつ式中、
R1、R2、R3、R4、R5、R6、およびR7のそれぞれは、独立して、−Hまたは基Gであり;さらに
R3、R4、R5、およびR6のそれぞれは、基Yであってもよく;
R1、R2、およびR7のそれぞれは、基Zであってもよく;
R3およびR4は、共に、基=Oを形成してもよく;
R5およびR6は、共に、基=Oを形成してもよく;
R14は、独立して、−Hまたは基Wである。
適切な活性薬剤には、PKD1に特異的に結合する抗体が含まれる。いくつかの実施形態において、PKD1に特異的に結合する抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、PKD1に特異的に結合する抗体はポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、PKD1に特異的に結合する抗体は抗体フラグメント、例えば、一本鎖Fv(scFv)抗体である。いくつかの実施形態において、PKD1に特異的に結合する抗体は、1つまたは複数の修飾を含む。
ここで、Rは、水素、またはアルキル基もしくはアルカノール基などの保護基であり、nは、1〜1000の整数である。Rが保護基である場合、一般に、Rは1〜8個の炭素を有する。
適切な活性薬剤には、神経細胞および/またはグリア細胞内のPKD1レベルを特異的に低下させる核酸薬剤が含まれる。本開示は、さらに、細胞、例えば、神経細胞および/またはグリア細胞内のPKD1レベルを特異的に低下させる単離した干渉核酸を提供する。
1)5’−AAAGAGTGTTTGTTGTTATGG−3’(配列番号17)
2)5’−ACGCCTGAAAGAGTGTTTGTTGTTATGGAA−3’(配列番号18)
3)5’−ACGCCTGAAAGAGTGTTTGT−3’(配列番号19)
4)5’−GAGTGTTTGTTGTTATGGAA−3’(配列番号20)
5)5’−GAGTGTTTGTTGTTATGGAAAAACTCCATG−3’(配列番号21)
いくつかの実施形態において、本方法は、神経細胞および/またはグリア細胞においてPKD1ポリペプチドのレベルを低下させる核酸の産生をもたらす有効量の組換え発現ベクター、例えば、PKD1を産生する神経細胞またはグリア細胞内のPKD1ポリペプチドのレベルを選択的に低下させる干渉核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを、それを必要としている個体に投与することを含む。したがって、いくつかの実施形態において、組換え発現ベクターが、細胞(例えば、神経細胞またはグリア細胞)内のPKD1転写物および/またはPKD1ポリペプチドを特異的に低下させる干渉RNAをコードするヌクレオチド配列を含む場合、この組換え発現ベクターを、それを必要としている個体に投与する。いくつかの実施形態において、細胞内のPKD1転写物および/またはPKD1ポリペプチドを特異的に低下させる干渉RNAをコードするヌクレオチド配列を、神経細胞またはグリア細胞内で活性のある転写制御エレメント(例えば、プロモーター)に作動可能に連結する。
いくつかの実施形態において、本治療法は、細胞(例えば、神経細胞および/またはグリア細胞)内のPKD1活性レベルを調節する活性薬剤を、それを必要としている個体に投与することを含み、さらに、少なくとも1つの追加的治療薬を投与することを含む。
上記のように、本治療法は、一般に、神経細胞および/またはグリア細胞内のPKD1活性レベルを調節する有効量の薬剤を、それを必要としている個体に投与することを含む。製剤化、投与量、および投与経路を以下に記載する。製剤化、投与量、および投与経路の詳解の目的のために、「活性薬剤」という用語は、本抗体、本干渉核酸、およびPKD1活性の小分子モジュレーターの1つまたは複数を指す。
本方法において、活性薬剤(複数可)は、所望の治療効果または臨床転帰が生じることが可能な任意の便利な手段を用いて宿主に投与することができる。したがって、活性薬剤は、治療的投与のための様々な製剤に組み入れることができる。より具体的には、活性薬剤は、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて医薬組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体または気体の形態で調製物に製剤化することができる。
いくつかの実施形態において、活性薬剤を、かかる薬剤を必要としている個体への経口送達のために製剤化する。
いくつかの実施形態において、活性薬剤は制御放出製剤に製剤化される。
いくつかの実施形態において、活性薬剤を、吸入経路のための薬剤送達システムによって患者に投与する。活性薬剤は、吸入による投与に適した形態に製剤化することができる。吸入の投与経路は、吸入薬が、血液脳関門をバイパスすることができるという利点を提供する。この薬剤送達システムは、気管支の粘膜内層への活性薬剤の送達による呼吸療法に適したシステムである。本発明は、容器から活性薬剤を排出するために圧縮ガスの力に頼るシステムを利用することができる。エアロゾルまたは加圧されたパッケージを、この目的のために用いることができる。
使用用量は、達成すべき臨床目標によって異なるが、適切な投与量範囲は、活性薬剤の約1μg〜約1,000μgまたは約10,000μgまで提供し、単回用量で投与することができる範囲である。あるいは、活性薬剤の目標投与量は、その薬剤の投与後の最初の24〜48時間以内に採血された宿主血液試料において、約0.1〜1000μM、約0.5〜500μM、約1〜100μM、または約5〜50μMの範囲であると考えられ得る。
活性薬剤を、インビボ法およびエキソビボ法、ならびに全身投与経路および局所投与経路を含む薬物送達に適した任意の利用可能な方法および経路を用いて個体に投与する。
本方法を用いて治療することができる対象には、神経変性障害、脱髄疾患、急性脳損傷、脊髄損傷、または神経細胞の死または機能不全を伴う他の障害または状態を有すると診断された個体が含まれる。本方法を用いる治療に適した対象には、神経変性障害または脱髄疾患の治療を受けており、その治療への応答に失敗したか、または最初は治療に応答したが、再発した個体も含まれる。
本開示は、PKD1が欠損している遺伝子組換え非ヒト哺乳動物を提供する。かかる遺伝子組換え非ヒト動物は、本明細書で「PKD1ノックアウト非ヒト哺乳動物」とも呼ばれる。本PKD1ノックアウト非ヒト哺乳動物は、1)神経障害におけるPKD1の役割に関して研究を実施するために;2)神経障害を治療するための候補である化合物を試験するために;かつ3)候補化合物を評価するためにインビトロで用いることができる単離されたPKD1ノックアウト細胞の供給源として用いることができる。いくつかの実施形態において、本PKD1ノックアウト非ヒト哺乳動物はマウスである。
トランスジェニック実験に適した動物は、標準的な商業的供給源から得ることができる。これらには、遺伝子操作手順の試験のためのマウスおよびラットなどの動物、ならびに当業者に公知の技術を用いて遺伝子工学処理されたブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、および他の動物などの大型動物が含まれる。これらの技術を、主に、マウスおよびラットの操作に基づいて以下に簡単にまとめるが、これらは、類似の技術が開発された時に、簡単に他の種に拡張することができる。
胚の操作手順およびDNAのマイクロインジェクション手順は、Hogan et al.Manipulating the mouse embryo,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1986)に詳細に記載されており、その教示は、本明細書に組み込まれる。
ES細胞の培養法ならびにその後のトランスジェニック動物の作製、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム/DNA沈殿、および直接注入などの様々な方法によるDNAのES細胞への導入については、E.J.Robertson編集の「Teratocarcinomas and embryonic stem cells,a practical approach」(IRL Press 1987)に詳細に記載されており、この教示は本明細書に組み込まれる。遺伝子導入は、相同組換えにより行うことができる。導入遺伝子を含むES細胞の所望のクローンの選択を、いくつかの手段の1つを介して行う。トランスフェクションを、Current Protocols in Molecular Biology:Ch.9 Introduction of DNA into Mammalian Cells;John Wiley&Sons,New York,N.Y.,2001の中で詳細に記載されているいくつかの方法の1つによって行う。カルシウムリン酸/DNA沈殿、直接注入、およびエレクトロポレーションは、適切な方法の例である。これらの手順では、多くの、例えば、0.5×106個のES細胞を、組織培養皿に播種し、目的の遺伝子を含む直線化した核酸コンストラクトの混合物でトランスフェクトする。G418に耐性を示す細胞のコロニーを、クローニングリングを用いて単離し、増殖させた。DNAを薬物耐性クローンから抽出し、プローブとしてこの核酸配列を用いるサザンブロッティング実験を用いて、所望の核酸配列を保有するそれらのクローンを同定する。いくつかの実験では、PCR法を用いて、目的のクローンを同定する。
雄と交尾させた自然周期の雌または過排卵した雌を用いて、ES細胞を注入するための胚を採取する。適切な年齢の胚を、交尾が成功した後に回収する。胚を、交配した雌の子宮角から洗い流し、ES細胞を注入するために、10%ウシ血清を含むダルベッコ改変必須培地に入れる。約10〜20個のES細胞を、約20メートルの内径を有するガラス製マイクロニードルを用いて胚盤胞に注入する。
ランダム周期の成体の雌を、精管を切除した雄とペアにする。レシピエント雌が、ES細胞を含む胚盤胞での移植に必要とされる時に交尾後2.5〜3.5日(マウスの場合、または大型動物の場合はもっと後)となるように交配させる。胚移植の時に、これらのレシピエント雌を麻酔する。卵巣を、卵管のすぐ外側の体壁に切り込みを入れることによってむき出しにし、卵巣および子宮を外面化させる。針を用いて、子宮角に穴を作り、その針を通して、胚盤胞を移植する。移植後は、卵巣および子宮を体内に押し戻し、切開部を縫合することによって閉じる。追加の移植を行う場合は、この手順を反対側で繰り返す。
試料(1〜2cmのマウスの尾)を、若い動物から除去する。大型動物の場合には、血液または他の組織を用いることができる。相同組換え実験でキメラについて試験するために、すなわち、標的化したES細胞のこれらの動物への寄与を調べるために、大型動物では血液を用いて調べることができるが、マウスでは毛色が用いられている。DNAを調製し、サザンブロットおよびPCRの両方によって解析し、トランスジェニック樹立(F0)動物およびそれらの子孫(F1およびF2)を検出する。
このPKD1ノックアウトおよびダブルノックアウトを、遺伝子組換え動物(自然発生突然変異かまたは遺伝子工学処理された動物のいずれか)の他の種類と交配することができる。多くのかかる動物は、文献に記載されており、Jackson Laboratories、バーハーバー、メイン州などの会社から入手できる。
本開示は、さらに、本PKD1ノックアウト哺乳動物から単離した細胞を提供する。本単離細胞は、内在性PKD1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子に欠陥を含み、その結果、この遺伝子は不完全であり、PKD1はこの細胞によって合成されない。
実験手順
皮質培養
記載されるとおり(Bradley et al.,2006)、マウス胎児初代皮質神経細胞を培養し、NR1−/−神経細胞の遺伝子型を同定した。NR1−/−神経細胞を含まない実験では、野生型C57/BL6マウス(Charles River)を用いた。El8〜19胚の神経細胞を、ポリD−リシンでコーティングした12mmのガラス製カバーガラス上に0.6×106細胞/cm2の密度で播種し、B27を補充した神経細胞培養用基礎培地(インビトロジェン社)で維持した。実験を、インビトロ(DIV)で8〜14日間行った。神経細胞を、リン酸カルシウム法(Bradley et al.,2006)を用いてトランスフェクトした。
全RNAを、RNEasyキット(Qiagen)を用いてC57/BL6マウス脳から抽出した。相補DNA(cDNA)を、スーパースクリプトII逆転写酵素を用いて作製した。プロテインキナーゼD1(PKD1)、D2(PKD2)、およびD3(PKD3)を、記載されるとおり(Oster et al.,2006)、アイソフォーム特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。
PKD1特異的抗体
PKD1特異的抗体については、PKD1の3つの領域(アミノ酸203〜261、333〜410、および875〜918)をクローニングし、GST融合タンパク質として発現させた。全ての3つのタンパク質を混合し、ウサギに注射し、ポリクローナル抗体を作製した。
タンパク質配列(6.3kDa,pI=6.62)
SNVSLTGLGTVRTASAEFSTSVPDEPLLSPVSPGFEQKSPSESFIGREKRSNSQSYIGR(配列番号3)
タンパク質配列(8.6kDa,pI=3.46)
NGELLSPGAESDVVMEEGSDDNDSERNSGLMDDMDEAMVQDTEMALAEGQSGGAEMQDPDADQEDSNRTISPSTSNNI(配列番号4)
タンパク質配列(4.9kDa,pI=4.63)
WEQYAGEQGLQYPAHLISLS ASHSDSPEAEEREMKALSERVSIL(配列番号5)
PKD2およびPKD3に特異的な抗体については、PKD2およびPKD3の最初の80個のアミノ酸をクローニングし、GST融合タンパク質として発現させた。
タンパク質配列(8.0kDa,pI=6.77)
MAAAPSHPAGLPGSPGPGSPPPPGGLDLQSPPPLLPQIPAPGSGVSFHIQIGLTREFVLLPAASELAHVKQLACSIVDQK(配列番号22)
タンパク質配列(8.2kDa,pI=9.16)
MSANNSPPSAQKSVFPATVSAVLPAPSPCSSPKTGLSARLSNGSFSAPSLTNSRGS VHTVSFLLQIGLTRESVTIEAQEL(配列番号23)
神経細胞を、氷冷RIPA緩衝液(1%トリトンX−100、0.1%SDS、50mMのTris−HCl、150mMのNaCl、1mMのEDTA、10mMのNaF、およびプロテアーゼ阻害剤混合物;ロッシュ社)で溶解した。サンプルを遠心分離し、上清をゲルに添加し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)により分離し、ニトロセルロース膜に移し、pan−PKD1(1:1000,Cell Signaling社または1:5000,HJK)、リン酸−S744/8PKD1(1:1000,Cell Signaling社)、リン酸−S916 PKD1(1:1000,Cell Signaling社)、β−アクチン(1:4000,シグマ社)または抗チューブリン(1:500,000,シグマ社)に対する抗体で探索した。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた抗ウサギ2次抗体または抗マウス2次抗体を全てのブロット上に用い、高感度化学発光(アマシャムバイオサイエンス社)によって、またはスーパーシグナルウェストフェムト(SuperSignal West Femto)基質(Pierce社)を用いて画像化した。
細胞を、10分間、4%ショ糖を含む4%パラホルムアルデヒドで固定し、3%ウシ血清アルブミン、ヤギまたはロバの2%血清、および0.1%トリトン−X100を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でブロッキングした。表面染色については、固定する前に45分間、1次抗体を生細胞に加え、界面活性剤をブロッキングステップから取り除いた。1次抗体の濃度は以下のとおりであった:PKD1(1:5000、HJK)、PKD2(1:2000、Bethyl Laboratories社)、PKD3(1:5000、HJK)、MAP2(1:400、ケミコン社)、HA(1:1000、Cell Signaling社)、GluR2(1:300、ミリポア社)、Rab5(1:100、PKD1は、NMDARおよびmGluRと異なるシグナルを受け取り、α−アミノ−3−ヒドロキシ−5−メチル−4−イソキサゾールプロピオン酸受容体(AMPAR)の輸送およびサブユニット組成を調節する、BDバイオサイエンス社)、LAMP1(1:200,Stressgen社)、またはシンタキシン13(1:50、AbCam社)。全ての蛍光2次抗体を、1:250で用いた(インビトロジェン社)。
室温で、HEPES緩衝生理食塩水(HBS:119mMのNaCl、2.5mMのKCl、2mMのMgCl2、2mMのCaCl2、25mMのHEPES、30mMのグルコース、1μΜのテトロドトキシン、10μMのNBQX、pH7.4)中で刺激を行った。高レベルのK+を使用するものを除くすべての刺激では、25μMのニモジピンをHBSに含めた。神経細胞を、刺激前に30〜60分間、HBS中でインキュベートした。(特に示さない限り)以下の用量を用いた:ホルボール12−ミリステート13−アセテート(PMA、100nM);グルタミン酸(10μΜグリシンを含む30μM)、D,L−2−アミノ−5−ホスホノ吉草酸(APV;100μM);N−メチル−D−アスパラギン酸(NMDA、10μMグリシンを含む100μM);α−メチル−4−カルボキシフェニルグリシン(MCPG;1mM);(1S,3R)−l−アミノシクロペンタン−1,3−ジカルボン酸(ACPD;100μM);およびK+(55mM)。
14DIVの時に、カバーガラス中のトランスフェクトした神経細胞を、細胞単層から約1mmの培地に懸垂させた2つの平行白金電極を有するカスタム設計したフィールド刺激装置に移した。Mg2+を除去したことを除いて、神経細胞を上記に記載のとおりにHBS中で刺激した。刺激(15分間、5Hz、パルス幅1ms)を、D330 MultiStim(Digitimer社)を用いて与えた。
斑点分析では、倒立落射蛍光顕微鏡(ニコン、日本)および冷却した電荷結合素子(CCD)デジタルカメラ(Hamamatsu Orca II)を用いて画像を取得した(Arrasate and Finkbeiner,2005)。刺激の前後に、同じフィールドのビーナス−PKD1およびmCherryの画像を取得した。以前の研究(Bradley et al.,2006)に基づいて、斑点指数(PI)を計算した。MetaMorphソフトウェア(Molecular Devices社)を用いて、樹状突起の領域に沿ったビーナス蛍光の標準偏差(SD)を同じ領域に沿ったmCherry蛍光のSDで割ることによって、PIを計算した。グルタミン酸での60分間の刺激の前後の両方のPIを計算することによって、斑点形成を測定し、PI(時間60)/PI(時間0)の割合として表した。それらのmCherry強度のSDが刺激後に変化した場合、樹状突起を分析から除外した。自然の斑点形成では、縦断的解析を、以前の研究(Arrasate and Finkbeiner,2005)から適合させた。神経細胞のフィールドを画像化の初日に位置付け、その後、ロボットの顕微鏡を用いて毎日調べた。13DIVの時に開始し、21DIVの時に終わる画像を取得した。共局在化の研究では、Zeiss LSM 510レーザースキャニング共焦点顕微鏡を用いて画像を取得した。画像を、ImageJを用いて最小限に処理した。斑点の閾値を、それぞれのチャネルの平均バックグラウンド強度の5倍に設定した。閾値化および重ね合わせた部分の定量化をMetaMorphソフトウェアで行った。
GWl−ビーナス−PKD1を、前記の緑色蛍光タンパク質−プロテインキナーゼD1(GFP−PKD1)を含むクロンテックベクターから作製した。46個のアミノ酸ストレッチが、マウスPKD1のN末端にビーナスを結合させる。ビーナス−PKD1内の点変異を、部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を用いて作り出し、DNA配列決定によって確認した。CFP−TGN38について、HA−GluR1およびHA−GluR2(Passafaro et al.,2001)と同様に記載された(McNamara et al.,2004)。
PKD1shRNAを、標的PKD1配列AAAGAGTGTTTGTTGTTATGG(配列番号17)、続いて9bpのリンカーおよび21bpの逆配列を用いて、哺乳動物発現ベクターpSilencer 2.0の中に低分子ヘアピンRNAとして構築した。対照m−shRNAには、4つの変異(下線)を有する同じ標的配列AAAGTGTGATTGTTGTTTAGG(配列番24)用いた。shRNAのレンチウイルスコンストラクトを作製するために、pSilencerコンストラクトのU6プロモーター配列および低分子ヘアピン配列をPCRにより増幅し、ウイルスベクターFUGW2にサブクローニングし、ウイルスパッケージングタンパク質Δ8.9およびVSVGとともに、HEK293FT細胞(インビトロジェン社)中で発現させた。記載のとおりに(Cronshaw et al.,2002)、ウイルスを収集し、力価を測定し、感染に用いた。感染後5〜7日目に、神経細胞を採取し、分析した。
YFP−Hトランスジェニックマウス(Feng et al.,2000)の脳組織のアレイを、記載のとおりに(Micheva and Smith,2007)、70nmのスライスを用いて準備した。以下のとおりに、1次抗体を4℃で一晩、アレイ上でインキュベートした:PKD1(1:300、HJK)、PSD95(1:50、NeuroMabs社)シナプシン(1:100、ミリポア社)、GluR2(1:30、ケミコン社)、Rab5(1:100、BDバイオサイエンス社)、およびGM130(1:50、BDバイオサイエンス社)。目的のチャンネルの空間的関係を調べるために、van Steenselおよびその仲間の分析(van Steensel et al.,1996)と似た相互相関分析を用いた。チャンネルのそれぞれのペアについて、神経網のパッチを回旋し、横方向オフセットの範囲の生の共局在化スコアSrを獲得した。異なるチャネルの平均の明るさの違いを補正するために、置き換えた(したがって、補正されていない)1つのチャネルを用いてこの分析を繰り返し、ベースラインスコアStを得た。2つのチャネルの共局在化指数(Ci)を、Sr−St/Sr+St=Ciとして合計の中の違いにより標準化することによって決定した。Ci=1は理想的共局在化を示し、Ci=0は、偶然を超える共局在化を示さず、かつCi<0は反局在を示す。この方法を用いて、異なるラベルの共局在化を、チャネルに依存しない方法で客観的に比較することができる。
このアッセイは、以前の研究(Park et al.,2004)から適合させた。神経細胞を、(アンタゴニストを含まない)HBS中で60分間、Alexa647を結合させたトランスフェリン(50μg/mL;インビトロジェン社)とインキュベートし、内部移行した蛍光結合トランスフェリンの定常状態の濃度に達した。その後、共焦点顕微鏡のために、細胞外の蛍光トランスフェリンを過剰の非標識トランスフェリン(5mg/ml、シグマ社)で洗い流し、細胞を数回固定した。神経細胞を、mCherry画像に基づいて選択した;実験者はこれらの細胞のAlexa647内容物が分からなかった。定量比較を可能にするために、mCherryチャンネルの共焦点画像を取得し、それぞれの細胞に対して同一のレーザー設定でAlexa647の画像を取得した。mCherry陽性ピクセル中のトランスフェリンの平均ピクセル強度を、Zeiss LSM 510ソフトウェアを用いて決定した。細胞体を分析から除外した。
初代皮質神経細胞(7DIV)を、PKD1に対するshRNAまたは対照shRNAのいずれかをコードするレンチウイルスで感染させた。感染後5日目に、細胞を氷上に置き、氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS:137mMのNaCl、3mMのKCl、2mMのKH2PO4、10mMのNa2HPO4)で2回すすいだ。スルホ−NHS−LC−ビオチン(2mg/ml、Pierce社)を添加し、細胞を4℃で穏やかに振盪しながらインキュベートした。30分後、細胞を氷冷PBSで3回すすぎ、1%トリトンX−100、0.1%SDS、およびEDTA(ロッシュ社)を有するプロテアーゼ阻害剤混合物を含むPBSで収集した。溶解物を短時間超音波処理し、4℃の卓上遠心機で、13,000rpmで遠心分離した。タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイにより測定し、溶解物を、PBS+1%NP−40で200μg/mlに希釈した。アビジンセファロースビーズ(50μlスラリー、Pierce社)を希釈溶解物(500μl)に添加し、4℃で一晩インキュベートした。ビーズを氷冷PBSで3回洗浄し、ビオチン化タンパク質を、2×Laemmli緩衝液中で煮沸することによって溶出した。表面タンパク質を、抗GluR2(1:1000,Neuromabs社)、抗GluR1(1:200,ミリポア社)、抗NR1(1:1000,Upstate Biotechnology社)、または抗mGluR1/5(1:1000,Neuromabs社)を用いて、ウェスタンブロットにより分析した。総タンパク質(試料あたり40μg)を準備し、試料間の発現を制御するために並列ウェスタンブロットを続けた。バンドの強度を、ImageJ Gel Analyzer tool(Abramoff MD,2004)を用いて定量化した。
25℃で、(毎日新鮮なものを添加した)1μΜのテトロドトキシン(TTX)、10μΜのガバジン、および100μMのD−APVの存在下で、HBS(119mMのNaCl、2mMのKCl、1mMのMgCl2、1.5mMのCaCl2、10mMのHEPES、15mMのグルコース、pH7.35、235mOsm)中、電圧固定モードで、Axon Multiclamp増幅器およびClampex acquisitionソフトウェアを用いて記録を行った。電極抵抗は3〜6MOhmであった。細胞内記録液は、(毎日新鮮なものを添加した)50μΜスペルミンを含むセシウムベースの溶液(120mMのCsMeSO3、6mMのNaCl、2mMのMgCl2、10mMのHEPES、0.2mMのEGTA、2mMのNa2ATP、0.3mMのGTP−Tris)であった。I/V曲線については、5mMのカイニン酸のパフを用いて刺激を得、−80〜+40mVの保持電位中の10mVごとの増加分について一時的な記録を取得した。直列抵抗を代償し、それぞれの電位における最大電流応答を、AxoGraph解析ソフトウェアを用いて測定した。それぞれの細胞について少なくとも3つの記録を取得した。+40mVでの最大電流振幅を−60mVでの最大電流振幅で割ることによって、整流指数(rectification index)を計算した。有意性を、独立t検定を用いて決定した。
superecliptic pHluorinでタグを付けたラットのGluR2を、pGWl哺乳類発現ベクターにクローニングした。mCherryをサブクローニングし、FUGW PKD1 shRNAおよび対照ベクター中の高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)と置換した。mCherryは、細胞の全体的な調子を監視するための形態マーカーとして機能した。pHluorin−GluR2およびPKD1 shRNAまたは変異体対照を、リポフェクタミン2000(インビトロジェン社)を用いてマウス皮質神経細胞にトランスフェクトした。ニモジピンは除外したこと以外は上記のとおり、12DIVの時に、HBS中の神経細胞を、40倍の浸水レンズを有するZeiss LSM 510共焦点顕微鏡で画像化した。ベースラインの画像化の20分後、30μΜのグルタミン酸および10μΜグリシンを重力流でまき散らすことによって5分間細胞を洗浄し、続いて、対照HBS溶液で洗い流した。画像を5分毎に収集した。細胞体のpH−GluR2の平均ピクセル強度をMetaMorphで計算し、バックグラウンドを画像の無細胞領域で測定し、さらに計算する前に蛍光強度から差し引いた。蛍光強度のわずかな変化(ΔF/F0)をFt−F0/F0として計算したが、ここでFtは、時間tのpHGluR2の強度であり、F0は、グルタミン酸適用前の4つの時点での平均のpH−GluR2蛍光強度である。
内在性PKD1はPKD2およびPKD3とは異なる神経細胞の分布を有する。
神経系におけるPKDの役割を発見するために、PKDが見られる場所を最初に決定した。PKDの3つの既知のアイソフォームをコードする転写産物は、皮質、海馬、線条体、および小脳を含む成体マウスの脳で広く発現していた(図1A)。最も豊富なアイソフォームであるPKD1は、シナプス可塑性(Bradley et al.,2006:Rao et al.,2006)およびタンパク質輸送(Horton and Ehlers,2003:Horton et al.,2005)の機構研究のために十分に確立されたモデル系であるマウスの大脳皮質および海馬の初代神経培養物中で高発現していた。シナプスが形成し、成熟したときに、PKD1レベルは、インビトロ(DIV)で2日、7日、および14日目に高く、比較的一定であった(図1B)。
HEK細胞を、PKD1、PKD2、またはPKD3でトランスフェクトし、溶解物を用いて、抗血清の免疫反応性を試験した。(A)αPKD1を、マウスPKD1のアミノ酸203〜261、333〜410、および875〜918に対してウサギで抗体産生させた。免疫前血清(上)および抗PKD1抗血清(中央)を用いて、特異性を確認するために、HEK細胞溶解物の過剰発現させたPKD1、PKD2、およびPKD3に対してブロットした。抗PKD1抗体(Cell Signaling社、1:2000、下)は陽性対照として役立った。PKD1に対する反応性および特異性を確認した後、PKD1抗体を、ウサギ抗血清からアフィニティー精製した。(B)αPKD3を、マウスPKD3のアミノ酸1〜80に対してウサギで抗体産生させた。免疫前血清(上)および抗PKD3抗血清(下)を用いて、特異性を確認するために、HEK細胞溶解物の過剰発現させたPKD1、PKD2、およびPKD3に対してブロットした。PKD3に対する反応性および特異性を確認した後、PKD3抗体を、ウサギ抗血清からアフィニティー精製した。
シナプス機能におけるPKD1の潜在的役割を調べるために、PKD1が神経伝達物質であるグルタミン酸によって活性化されるのか否かが問われた。マウス皮質培養を、バスアプリケーションのグルタミン酸(30μΜ)で刺激し、ウェスタンブロット解析のための抽出物を調製した。刺激の10分後に、PKD1が、活性化ループ(S744/8)および自己リン酸化(S916)部位で急速にしかも確実にリン酸化された(図2A)ことは、PKD1が活性化されたことを示す(Matthews et al.,1999b)。リン酸化は、最大60分の刺激の間持続した。これとは対照的に、K+脱分極(Bradley et al.,2006)での電位依存性Ca2+チャネルの活性化または脳由来神経栄養因子(BDNF)でのTrkB受容体の活性化は、PKD1を活性化しなかった(図10A)。したがって、PKD1活性は、急速であるが、選択的にシナプス刺激によって制御される。
非神経細胞の刺激後のPKD1の細胞内局在が、その機能についての手がかりを提供してきた。特定の刺激が、細胞質から細胞膜(Matthews et al.,2000:Rey et al.,2004)、核(Rozengurt et al.,2005)、ミトコンドリア(Hausser et al.,2005)、およびトランスゴルジ綱(TGN)へとPKD1を移動させる。グルタミン酸に応答する神経細胞内のPKD1の移動を評価した。これらの研究を促進するために、蛍光タンパク質ビーナスをPKD1のN末端に融合させたPKD1(ビーナス−PKD1)をコードするプラスミドを作製した。トランスフェクトしたビーナス−PKD1は、基本条件下で神経細胞内の細胞質全体に拡散して局在していたが、グルタミン酸に応答して、樹状突起全体の別々の斑点へ移行した(図3A)。コトランスフェクトしたmCherry、拡散した蛍光タンパク質は、斑点形成時に、神経形態が正常で、不変のままであることを示した。樹状突起の斑点へのPKD1の移行は、細胞外フィールド電極でのより生理的なシナプス刺激によって強力に誘発された(図3A)。これらの斑点が生理的に関連している場合、それらは、自発的なシナプス活性によって誘発される場合があり得る。実際、PKD1は、樹状突起内の斑点を自発的かつ可逆的に形成した。
NMDARがPKD1の移行を誘導するシグナル伝達経路をより理解するために実験を行った。非神経細胞において、PKD1は、プラズマおよび細胞内膜中でそのN末端のシステインリッチドメインを介して新たに生成したジアシルグリセロール(DAG)に結合した後に再分布する(Chen et al.,2008;Maeda et al.,2001;Oancea et al.,2003)。神経細胞におけるNMDAR依存的なPKD1の移行が、PLC依存的なDAG産生を必要とするか否かを試験するために、PLC阻害剤U73122を用いた。このU73122は、グルタミン酸誘導性斑点形成を阻止することが判明した(図4A)。PKCアンタゴニストGF109203XまたはGo6983がPKD1の移行を妨げなかったことは、NMDARがPKD1キナーゼ活性を誘発しないという発見と一致した。
PKD1のC1bドメインは原形質膜との結合を媒介し(Matthews et al.,1999a)、C1aドメインは、TGNなどの細胞内膜への結合を媒介する(Baron and Malhotra,2002;Maeda et al.,2001)。したがって、斑点形成にC1bが要求されることは驚くべきことであり、中間にある別の移行ステップを示唆した。他の細胞の種類では、PKD1は、最初にPLC活性化に応答して原形質膜へ移行する(Matthews et al.,2000;Rey et al.,2001)。斑点形成の前に、PKD1が膜と結合するか否かを調べた。共焦点像は、斑点形成が、2段階プロセスであることを明らかにした。刺激の10分後に、ビーナス−PKD1は、細胞体の原形質膜および多くの神経細胞の樹状突起に局在し、細胞質には比較的存在しなかった(図4C)。30分後に、ビーナス−PKD1が、グルタミン酸の連続したバスアプリケーションで生き残った細胞質で斑点を形成した。これとは対照的に、P287G変異体は原形質膜に移行せず(図4C)、斑点を形成しなかった。したがって、先の原形質膜結合は、PKD1の斑点への局在化に必要である。
ビーナス−PKD1の斑点を特徴づけるために、PKD1が確立された役割を有するビーナス−PKD1およびTGNの共局在化を試験した。TGNマーカーTGN38(CFP−TGN38)のCFPタグ付きバージョン(Sanchez−Ruiloba et al.,2006;Yeaman et al.,2004)は、グルタミン酸誘導性ビーナス−PKD1斑点とある程度の重複を示した。TGN38が、時折、他の樹状突起エンドソームに見られるので(McNamara et al.,2004)、内在性エンドソームタンパク質マーカーに対する抗体を用いて、グルタミン酸誘導性共局在化を試験した。試験したマーカーのうち、ビーナス−PKD1斑点は、初期エンドソームのマーカーRab5と最高に共局在化し(図5A)、リサイクリングエンドソームマーカーのシンタキシン13、およびリソソームマーカーのLamp1とはあまり共局在化しなかった(図5B)。ビーナス−PKD1斑点の樹状突起での共局在化を、オーバーラップ法(Manders et al.,1992)においてエンドソームマーカーを用いて定量化した。ビーナス−PKD1は、Rab5と最高のオーバーラップ係数(平均43.3±6.3%)を有し、シンタキシン13とは最低の係数(平均21.4±9.3%)であった。これらの共局在研究は、PKD1が樹状突起のエンドソーム経路に局在し、初期エンドソームに対してある程度の特異性を有することを示す。
上述のインビボおよびインビトロの共局在化研究は、PKD1が、エンドソームにおいてAMPARサブユニットGluR2と結合することを示す。PKD1は、樹状突起のAMPAR輸送に関与している可能性があるか否かが問われた。この可能性を評価するために、TGNおよびTGN由来の小胞に構成的に局在するPKD1の触媒能がなく、優勢干渉バージョンであるビーナス−PKD1 K618N(Sanchez−Ruiloba et al.,2006;Yeaman et al.,2004)を試験した。キナーゼデッド(Kinase−dead)PKD1は、特定のタンパク質が原形質膜に輸送されるのを防ぎ、PKD1が局在するエンドソームにそれらのタンパク質を捕捉する(Sanchez−Ruiloba et al.,2006;Yeaman et al.,2004)。刺激されていない神経細胞では、ビーナス−PKD1 K618Nは、共発現したHA−GluR2の細胞内局在を変え、HA−GluR2は、ビーナス−PKD1 K618Nと共局在する斑点を形成した(図6A)。これら斑点がRab5陽性であった(図6B)ことは、キナーゼデッドPKD1が、GluR2をエンドソームにおいて異常に蓄積させることを示した。
PKD1が、PKD1:NMDARおよびグループIのmGluRを調節する2種類の他のグルタミン酸受容体の輸送を調節するか否かが問われた。前述のとおり、レンチウイルス感染によるPKD1ノックダウン後の表面ビオチン化アッセイは、GluR2の表面発現の減少を示したが、必須のNMDARサブユニットのNR1もしくはmGluRまたはGluR1の表面発現の減少は示さなかった(図7Aおよび7B)。後者の結果を確認するために、ホモマーのAMPAR(Shi et al.,2001)を形成することできる細胞外で発現させたGluR1の輸送に対する優勢干渉PKD1の効果を試験した。細胞外で発現させたHA−GluR2とは異なり、ビーナス−PKD1 K618Nは、HA−GluR1と共局在しなかったか、またはHA−GluR1局在に影響を及ぼさなかった(図7C)。
PKD1が、GluR2の表面発現を調節し、GluR1サブユニットの表面発現を調節しない場合、PKD1は、成熟AMPARのサブユニット組成を決定する可能性がある。GluR2は、AMPARのCa2+透過性および他の生物物理学的特性に決定的な影響を与える(Isaac et al.,2007)。したがって、シナプスがGluR2欠損AMPARを含むか否かが、mEPSCサイズおよびシナプス後のカルシウムシグナル伝達の重要な決定因子である。これは、特定の種類のAMPAR依存的可塑性を表す細胞の能力を決定する可能性がある(Isaac et al.,2007;Liu and Zukin,2007)。GluR2欠損AMPARは、スペルミンなどのポリアミンの存在下で内向き整流を示す(Bowie and Mayer,1995;Geiger et al.,1995;Jonas et al.,1994)。PKD1ノックダウンが、原形質膜でGluR2欠損AMPARの割合を増加させるか否かを試験するために、PKD1に対するshRNAまたは変異対照を発現する細胞のI/V曲線を測定した。PKD1を欠く細胞が著しい内向き整流を示したことは、PKD1機能の破壊が、AMPARサブユニット組成を変え、GluR2を欠く機能的AMPARの相対的な増加につながることを示す(図7Dおよび図7E)。
ドミナントネガティブPKD1およびPKD1ノックダウンが、GluR2の細胞内保持をもたらすので、PKD1が、GluR2のエンドサイトーシスを減少させるか、またはそのエキソサイトーシスを促進するという仮説を立てた。前者の可能性を試験するために、グルタミン酸誘導性エンドサイトーシス後の表面GluR2レベルを測定した(図8Aおよび図8B)。PKD1が、正常にGluR2エンドサイトーシスを減少させる場合、表面GluR2の相対的な減少が、対照の神経細胞内よりもPKD1ノックダウン後に大きくなることが予想された。しかし、対照細胞とPKD1ノックダウン細胞との間で、グルタミン酸後の表面GluR2減少における違いは認められなかった(図8C)。したがって、PKD1は、グルタミン酸に応答して、GluR2エンドサイトーシスを調節しない。
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方法
細胞培養
El8マウス胚の皮質を切り裂き、パパイン(10ユニット/ml-1、30分;Worthington Biochemical社)、その後、トリプシン阻害剤(10mg/ml-1、15分;シグマ社)で処理した。摩砕した後、解離させた神経細胞を、ポリ−D−リジン(BDバイオサイエンス社)でコーティングしたプラスチック製組織培養プレート(1cm2当たり3.4×105個の細胞)または12mmのガラス製カバーガラス上に播種した(1cm2当たり6.8×105個の細胞)。神経細胞を、B27(インビトロジェン社)を含むNeurobasal−Aで増殖させた。特に述べない限り、神経細胞を、インビトロで12日目(DIV)の実験に用いた。HEK293T細胞を、10%の加熱不活性化ウシ胎児血清(インビトロジェン社)、100U/mLのペニシリン、および100U/mLのストレプトマイシンを含む、グルタマックス添加ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で、37℃、5%CO2に維持した。
リン酸−PKD1(Ser744/748)、リン酸−PKD1(Ser916)、およびHDAC5抗体を、Cell Signaling社から購入した。フラッグ抗体、α−チューブリン抗体、およびβ−アクチン抗体をシグマ社から購入した。2次抗体をJackson ImmunoResearch社から購入した。DHPG、ACPD、MCPG、MPEP、CPCCOEt、AP5、NBQX、ニモジピンをTocris社から購入した。TTXをCalbiochem社から購入した。全ての他の化学物質をシグマ社から購入した。
細胞を、プロテアーゼ阻害剤(ロッシュ社)を含む氷冷RIPA緩衝液(150mMのNaCl、50mMのトリス緩衝液、pH7.5、1mMのEDTA、1%NP−40、0.5%デオキシコール酸および0.1%SDS)中に回収した。タンパク質濃度を、BCAアッセイによって決定した。等量の総タンパク質を10%SDS−PAGEにより分離し、ニトロセルロース(アマシャムバイオサイエンス社)に移した。膜を、5%脱脂乳(Bio−Rad社)でブロックし、1次抗体およびペルオキシダーゼ結合2次抗体で探索し、高感度化学発光試薬(Perkin Elmer社)を用いて可視化した。ブロットを、55℃で50分間、緩衝液(100mMの2−メルカプトエタノール、2%SDSおよび62.5mMトリス、pH6.7)中で剥離した。
細胞を、10分間、4%スクロースを含む4%パラホルムアルデヒドで固定し、3%ウシ血清アルブミン、ヤギまたはロバの2%血清、および0.1%Triton−X100を含むPBSでブロッキングした。核を、Hoechst 33342(2.5g/ml、10分;Tocris社)で染色した。
皮質神経細胞(10DIV)を、レポーター遺伝子の1つおよびpRLO−Renilla(1:1モル比)でコトランスフェクトした。トランスフェクション後20〜24時間の時点で、神経細胞を薬物で刺激し、溶解物を収集して、2重ルシフェラーゼキット(Dual Luciferase Kit)(プロメガ社)およびルミノメーター(Thermo Electron社)を用いて分析した。
全RNAを、Qiagen RNEasy(キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州)キットを用いて、メーカーの指示書に従ってマウスの脳から抽出した。cDNAを、メーカーの指示書に従って、スーパースクリプトII逆転写酵素を用いて作製した。PKD1、PKD2、およびPKD3を、(1)に記載のアイソフォーム特異的プライマーで増幅した。
細胞を薬物で6時間刺激し、以下の遺伝子特異的プライマーを用いて、qfRT−PCRによりmRNAレベルを決定した:Arcについては5’−cctgagccacctggaagagta−3’(配列番号25)および5’−ggcccattcatgtggttctg−3’(配列番号26)、PKD1については5’−ctgtgacctcaagccagaaa−3’(配列番号27)および5’−gtacccaccactgacctcct−3’(配列番号28)、PKD2については5’−catcgacctcatcaacaacc−3’(配列番号29)および5’−tggctgagagacttgtccac−3’(配列番号30)、PKD3については5’−cccagaaatctgtgttccct−3’(配列番号31)および5’−agagagccgagctgagagtc−3’(配列番号32)、GAPDH(標準化のための内部対照遺伝子)については5’−ccccaatgtgtccgtcgt−3’(配列番号33)および5’−gcctgcttcaccaccttct−3’(配列番号34)。新生Arc転写物の検出については、プライマー対は以下のとおりであった:イントロン1(プライマーはイントロン1内でアニールする)、5’−ccctgcaccgtgtatcttagagtg−3’(配列番号35)および5’−tccacccttgcaactaatttg−3’(配列番号36);イントロン2(プライマーは、イントロン−エクソン境界に隣接する)、5’−taacctggtgtccctcctggatc−3’(配列番号37)および5’−gcaaagacttctcagcagccttga−3’(配列番号38)。
全ての動物を扱う手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の研究機関における動物の世話と利用に関する委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)によって承認された。本研究で用いた遺伝子組換えマウスであるPKD1fl/fl(2)、Nestin::Cre(3)、およびCaMKII::Cre(4)は前記した。
マウスを、4%パラホルムアルデヒド(W/V)で灌流した。脳を4℃で一晩固定した。凍結切片については、脳を30%ショ糖で凍結保存し、ティッシュテック最適切断温度化合物(Tissue−Tek Optimal Cutting Temperature compound)(Sakura社)に埋め込み、12mmの切片に切断した。ポリエチレングリコール(PEG)の切片については、脳をエタノール系で脱水し、PEG1,000およびPEG1,500の2:1混合物に埋め込み、10mmの切片に切断した。免疫染色については、切片を4℃で一晩、1次抗体とインキュベートし、その後、20〜23.5℃で2時間、2次抗体とインキュベートした。
フィールドEPSP(fEPSP)を、1MのNaClおよび25mMのHEPES、pH7.3で満たしたガラス電極(3Mチップ抵抗)で記録し、双極タングステン電極(FHC)で20秒ごとに誘起した。2kHz(−3dBで、8極ベッセル)でろ過し、Multiclamp 700A増幅器(Molecular Devices社)を用いて、20kHzでデジタルサンプリングし、Digidata−1322AデジタイザーおよびpClamp 9.2ソフトウェアを用いて記録を取得した。pClamp9ソフトウェアおよびOriginPro 8.0(OriginLab)を用いて、データをオフラインで分析した。CA1で実行した記録については、刺激電極を、CA3とCA1の境界の放射線状の層に置き、記録電極を、CA1の放射線状の層に150μm離しておいた。それぞれの切片で評価したシナプス強度および可塑性の測定は、入出力(I−O)関係、ペアパルス比(paired−pulse ratios)、LTPおよびLTDからなっていた。シナプス伝達強度を、fEPSPのI−O曲線を作成することによって評価した。入力はファイバーボレーの最大振幅であり、出力はfEPSPの初期勾配であった。50ms離して2つのfEPSPを惹起し、第2のfEPSPBの初期勾配を第1のfEPSPの初期勾配で割る(fEPSP2/fEPSP1)ことによって、ペアパルス比を決定した。15分間安定したベースラインを確立した後、LTPを、高頻度刺激(100回の刺激のうち4回の100Hzトレイン)によってCA1に誘導した。15分間安定したベースラインを確立した後、NMDA−LTDを、3分間、5Hzの刺激トレインによって誘起し、mGluR−LTDを、5分間、50μMのDHPGのバスアプリケーションによって誘起した。
オスのマウスのみ、行動遂行の変動性を低下させるために分析した。マウスの1つのコホートを、生後3ヶ月の時点で行動の面で評価した。それぞれのコホートは、2つのグループ:PKD1ヌルマウスおよび同腹の対照マウスを含んでいた。
オープンフィールド試験については、個々のマウスを、15分間、41×41×30cmのアクリルの動物ケージに入れ、その間、それらの水平方向および垂直方向の移動を、ミリ秒ごとにそれらの位置を記録するコンピューターと接続した16個の赤外線ビームセンサ(Flex−Field/Open Field Photobeam Activity System(PAS)、San Diego Instruments社、サンディエゴ、カリフォルニア州)の2つのアレイによって監視した。次に、PASソフトウェアを用いて、移動の総数、走行距離、移動に費やした時間、それぞれのマウスについての赤外線ビーム切断の総数を、水平面および縦軸に沿って計算した。この装置を、それぞれのマウスの試験後に70%アルコールで洗浄した。
高架式十字迷路は、地上63cmの高さで、2つのオープン(壁なし)アームおよび2つのクローズド(壁あり)アームからなっていた(Hamilton−Kinder社)。マウスを、試験前の1時間、薄暗い光の下で試験室に慣れさせた。試験中に、マウスを、十字迷路のオープンアームとクローズドアームとの間の接合部に入れ、5分間探索させた。この迷路を、それぞれのマウスの試験後に70%アルコールで洗浄した。オープンアームおよびクローズドアームの両方での総走行距離およびそれに費やした時間を、赤外線フォトビーム切断に基づいて計算した。
各遺伝子型の雄マウスを、1日目に30分間、丸型の試験活動領域(30cm×30cm)の中で慣らした。2日目に、マウスに、特定の領域内の2つの物体(なじみのもの)を提示し、マウスにその領域および物体を10分間自由に探索させ、次に、それらのケージに戻した。4時間後、これらの物体のうち1つを、新しい物体(新奇物体)と交換し、マウスに10分間その環境を探索させた。チャンバー内のなじみの物体および新奇物体の位置を、異なるマウスの試験の合間には半無作為に変更したが、どのマウスでも、ある特定のマウスの訓練および試験のセッション間では一定に保った。行動を、ビデオトラッキングシステム(Noldus社)で記録した。これらの物体との相互作用の頻度および各物体の探索に費やした時間を、その後のデータ解析のために記録し、認識記憶を最終トライアルで評価した。活動領域および物体を、それぞれのマウスの試験後に70%エタノールで洗浄した。
この水迷路は、無毒の白テンペラ絵の具の粉末で不透明にした水(21±1℃)で満たしたプール(直径122cm)からなっていた。このプールは、異なる迷路外(空間)手がかりに囲まれた部屋に位置していた。隠れプラットフォーム訓練の前に、マウスに2つの事前訓練トライアルを与え、その中で、マウスは、矩形チャネル(15×122cm)内を泳ぎ、このチャネルの真ん中にある水面下1.5cmに隠れたプラットフォームを登らなければならなかった。90秒以内にこのプラットフォームを登らなかったマウスをそのプラットフォームにやさしく導びき、10秒間その上に座らせ、その後、実験者がマウスを取り除いた。事前訓練の次の日、マウスを円形水迷路で訓練した。隠れプラットフォーム訓練のために、このプラットフォーム(14×14cm)を、水面下1.5cmに沈めた。このプラットフォームの位置は、隠れプラットフォーム訓練の間同じままであったが、ドロップ位置は、トライアルの間、半無作為に変化させた。マウスに、連続した5日間、3時間のインターセッションの間隔を有する2つの訓練のセッションを受けさせた。それぞれのセッションは、10分のトライアル間隔を有する2つのトライアルからなっていた。60秒以内にこのプラットフォームを見つけられなかったマウスを、そこに導き、10秒間その上に座らせた。空間プローブトライアルでは、このプラットフォームを除去し、マウスを60秒間泳がせた後、マウスを取り除いた。ドロップ位置は、このプラットフォームが隠れプラットフォーム訓練中に置かれた場所から180°であった。同じドロップ位置を、全ての空間プローブトライアルに用いた。最後のプローブトライアル後、マウスを1日休ませ、その後、手掛かりを与えたプラットフォーム訓練を行った。この試験において、このプラットフォームを、目に見える手がかり(プラットフォームの上部に置かれた15cmの高さの黒と白の縞のある棒)でマークした。マウスに、2〜3時間のトライアル間隔で、1日あたり2つの訓練セッションを受けさせた。それぞれのセッションは、20分のトライアル間隔を有する2つの訓練トライアルからなっていた。それぞれのセッションでは、このプラットフォームを新しい場所へ移動し、ドロップ位置を、トライアルの間、半無作為に変えた。トライアルを60秒後に中止した。行動を、ビデオトラッキングシステム(Noldus社)で記録した。逃避潜時、走行距離、水泳コース、水泳速度、前記4つのそれぞれに費やした時間の割合、およびプラットフォームの横断を、その後の分析のために記録した。
一方向ANOVAおよび事後のテューキーt検定を、Prism(GraphPad Software社)を用いて行った。
これらの結果を図13〜18に示す。一連の行動試験を、CNS(PKD1Nes/Cre:PKD1flox/flox×NestinCre/Cre)からPKD1を選択的に除去したマウスで行った。通常の水泳速度にもかかわらず、モリス水迷路試験で、マウスが隠れプラットフォームの位置を学習できなかったことによって示されるとおり、これらのマウスは、重度の海馬依存性空間学習障害を示した(図13)。これらのマウスが、迅速に目に見えるプラットフォームを見つけたことは、それらのマウスの視力、知覚、意欲が正常であることを示す(図13)。これらのマウスは、中程度の皮質依存的な新奇物体認識異常も示した(図14)。オープンフィールド試験において、このオープンフィールドの中央での立ち上がり総数および移動量は、対照動物と有意差はなかったが、PKD1Nes/Creマウスでは、移動の合計において対照マウスと小さいが統計的に有意な差が認められた(図15)。運動機能のロータロッド試験(図16)、不安についての高架式十字迷路試験(図17)、およびうつ病についての2つの試験(図18)を含む他の行動試験は、正常であった。まとめると、これらの結果は、海馬依存的学習および皮質依存的学習におけるPKD1の重要で、かなり選択的な役割を示唆する。
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神経障害に対するPKD1モジュレーター(例えば、PKD1阻害剤)の効果は、この障害の非ヒト動物モデルを用いて決定することができる。
Claims (20)
- 個体の神経障害または神経変性疾患を治療するための方法であって、前記個体の神経細胞および/またはグリア細胞内のプロテインキナーゼD1(PKD1)の活性を調節する有効量の薬剤を前記個体に投与することを含む方法。
- 前記薬剤がPKD1の小分子モジュレーターである、請求項1に記載の方法。
- 前記薬剤が神経細胞内の活性のあるPKD1のレベルを低下させる抑制性核酸である、請求項1に記載の方法。
- 前記薬剤が特異的にPKD1に結合する抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記神経変性疾患が、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症またはアルツハイマー病である、請求項1に記載の方法。
- 前記神経障害が脳卒中、脊髄損傷、または頭部外傷である、請求項1に記載の方法。
- 細胞内のプロテインキナーゼD1(PKD1)のレベルを特異的に低下させる単離された干渉核酸。
- 前記干渉核酸が低分子干渉RNA(siRNA)である、請求項7に記載の干渉核酸。
- 請求項7に記載の干渉核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組換えコンストラクト。
- プロテインキナーゼD1(PKD1)に特異的に結合する単離された抗体。
- 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項10に記載の抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項10に記載の抗体。
- 前記抗体が、少なくとも約10−7Mの親和性でPKD1ポリペプチドに結合する、請求項10に記載の抗体。
- 内在性プロテインキナーゼD1(PKD1)遺伝子に欠陥を含む遺伝子組換え非ヒト哺乳動物であって、前記遺伝子組換え非ヒト哺乳動物が、前記内在性PKD1遺伝子に安定的に組み込まれた異種核酸を含み、その結果、前記遺伝子組換え非ヒト哺乳動物が、同じ種の対照哺乳動物におけるPKD1活性レベルと比較して、PKD1活性レベルを減少させるという欠陥が、前記内在性PKD1遺伝子にもたらされる、遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。
- 前記哺乳動物が、内在性PKD1遺伝子欠損についてヘテロ接合である、請求項14に記載の遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。
- 前記哺乳動物が、内在性PKD1遺伝子欠損についてホモ接合である、請求項14に記載の遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。
- 前記哺乳動物が齧歯類である、請求項14に記載の遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。
- 前記哺乳動物が、空間記憶障害を呈する、請求項14に記載の遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。
- 内在性PKD1遺伝子の欠陥が神経細胞特異的である、請求項14に記載の遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。
- 請求項14に記載の遺伝子組換え非ヒト哺乳動物から単離された細胞であって、破壊された内在性PKD1遺伝子を有する細胞。
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