ES2385276B1 - Compuestos para el tratamiento de alzheimer. - Google Patents

Abstract

Compuestos para el tratamiento de Alzheimer.#Los compuestos inhibidores de PDKI pueden ser utilizados para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos, entre las que se encuentra la enfermedad de Alzheimer. Los niveles de activación de PDKI en una célula tratada con una proteína amiloidea pueden ser utilizados para identificar compuestos capaces de inhibir la muerte celular inducida por depósitos amiloideos potencialmente útiles en el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos.

Description

COMPUESTOS PARA EL TRATAMIENTO DE ALZHEIMER

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se encuadra dentro del campo de las enfermedades ocasionadas por

5 la acumulación de depósitos ami lo ideos, más concretamente, en el campo de la identificación de nuevas dianas terapéuticas y el desarrollo de nuevas terapias para estas enfermedades .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

10 La amiloidosis es un término genérico, utilizado para hacer referencia a un grupo de enfermedades de etiología di versa y pronóstico y tratamiento variables, con una característica común: todas ellas están causadas por el depósito cxtracc1ular de un material, denominado material amiloidc, de naturaleza proteica, insoluble y resistente a la protcolisis. Uno de los múltiples péptidos que aparecen en los acúmulos o depósitos

15 amiloideos es el péptido beta-amiloide (~-amiloide. AB o A~) que proviene de la proteína precursora amiloidea (APP, del inglés "Amyloid Precursor Protein").

Estudios in vifl'o indican que el procesamiento por la vía no amiloidogénica de la APP (sA PPa) puede actuar como señal autocrina para estimular la proliferación y adhesión celular y apoyar el crecimiento nervioso en células pe 12. Sin embargo, si la

20 APP se procesa por la vía amiloidogénica, se genera un péptido de 39-43 aminoácidos, concretamente el péptido beta-amiloide (péptido ~-amiloide o péptido A~) al que se le ha señalado como el factor neurotóxico primario en la patogenia de procesos neurodegenerativos, e.g., Alzheimer. Dicho péptido, in vitro, es tóxico para células endoteliales, células musculares lisas, astrocitos, neuronas y oligodendrocitos. Los

25 mecanismos por los que el péptido A~ ejerce su acción citotóxica no están definidos aunque todo apunta a que los procesos oxidativos pueden estar implicados en la generación de esta toxicidad induciendo la muerte celular.

Se ha relacionado la presencia de depósitos de péptido A~ en el cerebro con numerosas enfermedades, tales como la enfermedad de Alzheimer (EA), pérdida de 30 memoria, síntomas de déficit de atención asociados con la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Alzheimer de tipo cuerpos de Lewy difusos, deterioro cognitivo leve, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis de tipo holandés, angiopatía ~-amjloide

y hemorragia cerebral tal como hemorragia cerebral debida a angiopatía amiloidc cerebral solitaria, infecciones por priones, diabetes tipo 11, demencias degenerativas, incluyendo demencias de origen degenerativo y vascular mixto, demencia frontotemporal, demencia prcsenil, demencia senil, demencia asociada con el síndrome de la inmunodcficicncia adquirida (SIDA), trastornos parkinsonianos tales como la enfermedad de Parkinson (EP), parkinsonismo pancnccfalítico csclcrosantc subagudo, parkinsonismo poscnccfalítico, encefalitis pugilística, complejo parkinsonismodemencia de Guarn, la enfermedad de Piek, atrofia sistémica múltiple (ASM), parálisis supranuclcar progresiva (PSP), degeneración corticobasal (DCB), síndrome de Down, la enfermedad de cuerpos de Lewy, la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple y enfermedades neurotraumáticas tajes como accidente cerebrovascular agudo, epilepsia, trastornos del estado de ánimo tales como depresión, esquizofrenia y trastOrnOS bipolares, isquemia, lesión cerebral, especialmente lesión cerebral traumática, inflamación y enfennedades inflamatorias crónicas.

En la actualidad, los esfuerzos se centran en descubrir las posibles cascadas de señalización que podrían estar mediadas por el péptido Ap. Hay varias vías de señalización que podrían estar implicadas en el daño celular y que parecerían activarse por el péptido Ap. Por ejemplo, parece claro que los efectos del pépt ido Ap están asociados con estrés oxidativo, disfunción mitocondrial, alteración de la homeostasis del ci+,generación de NO, activación de la microglía y otras. Sin embargo, aún existe controversia en la explicación de la relación causal o la secuencia exacta de estos eventos.

En cultivos neuronales primarios, los oligómeros de péptido A~ y los ligandos difusibles derivados del péptido A~ (ADDL, del inglés "A~-derived diffusible ligands") pueden unirse con avidez a receptores de membrana o regiones específicas de membrana plasmática neuronales e inducir muerte celular rápida a través de la ruta apoptótica mitocondrial. Por el contrario, las fibrillas de péptido A~ parecen inducir una forma más crónica de distrofia neurítica y muerte neuronal. Se han asociado los rápidos efectos tóxi cos del péptido A~ con un efecto pro-oxidante del péptido y pueden mediarse en parte a través de RAGE (del inglés "Receptor for Advaneed Glyeation End products" o receptor para productos finales de glicosilación avanzada). El péptido A~ también puede inducir apoptosis a través de la activación de caspasas y calpaína. Otro

mecanismo de toxicidad puede implicar la activación aberrante de la re-entrada del ciclo celular en neuronas, que se ha observado en cultivos neuronales tratados con péptido AP y en la EA. Se conoce poco sobre los factores que regulan la generación de agregados de péptido A~ tóxicos en el cerebro envejecido, aunque estudios recientes sugieren 5 posibles papeles para la señalización del factor J de crecimiento similar a la insulina/insulina (lGF-I) y la horncostasis del calcio. Otra clase de rutas de señalización activadas por el péptido AJ3 está implicada en la respuesta inflamatoria de la microglía. Los depósitos amiloideos están estrechamente asociados con activación de la microglía en la EA y en ratones transgénicos para APP [para una revisión veáse Yankner B.A. &

10 Lu T. 2009. Journal ofBiological Chcmistry 284 (8): 4755-4759].

En W009/087568A se describen composiciones que comprenden compuestos, tales como quercetina, kaemfenol y bipigcnina, que reducen la muerte neuronal causada por la exposición al péptido Ap.

En US5948800A se describe el uso de drogas para prevenir o tratar la EA; 15 dichas drogas contienen el compuesto activo 2-fenil-I,2-benzisoselenazol-3(2H)-ona, cuyo efecto se basa en la reducción de la toxicidad neuronal causada por el péptido Ap.

En US20021 02259 se describe un método para inhibir los efectos del péptido Ap en el cerebro de un animal que comprende la administración de un compuesto que modula de manera efectiva la actividad de CD45.

20 Por tanto, debido a la participación del péptido AP en múltiples enfermedades, existe una necesidad de identificar nuevas dianas así como compuestos que actúen sobre dichas dianas para desarrollar agentes terapéuticos que reduzcan de manera eficaz la muerte celular provocada por la deposición del péptido Ap.

25 COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Ahora, los inventores han observado usando modelos celulares y organotípicos de la enfermedad de Alzheimer (EA) que el péptido (1-42)AP provoca la muerte celular. Los inventores han observado que dicho péptido (1-42)AP transduce la señales de muerte celular a través de la ruta PJ3Kinasa/PDK llnuevas PKCs/Racllmuerte neuronal. 30 Los inventores han propuesto a PDKI, a las nuevas PKCs y a Rael como dianas terapéuticas para frenar el proceso de muerte celular y neuronal dirigido por el péptido

(1-42)A~.

Los inventores también han observado cómo la activación de la GTPasa Racl por el péptido (1-42)AP se ve inhibida al prc-tratar las células con inhibidorcs de PDK 1, lo que pone de manifiesto que PDK 1 forma parte de la cascada de señalización que desencadena el péptido (1-42)AP y que conduce a la activación de Racl , y que su función en esta vía parece ser la de ejercer de puente entre PJ3K y PKC.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con el uso de un inhibidor de PDKI , como agente neuroprotcctor, para producir un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos arniloidcos.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de un compuesto capaz de inhibir la muerte celular inducida por depósitos amilo idcos para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos que comprende:

a) poner en contacto una célula con una proteína amiloidea;

b) poner las células resultantes de a) en contacto con un compuesto candidato; y

c) determinaren dicha célula los niveles de activación de PDKI. en donde si los niveles de activación de PDKI en la célula después de haber sido tratada con un compuesto candidato son menores que antes del tratamiento, el compuesto candidato es capaz de inhibir la muerte neuronal inducida por proteínas amiloid eas y útil para el tratamiento de enferm edades asociadas a la formación de depósitos amiloideos.

BREVE DESCRlPCION DE LAS FIGURAS

La Figura l es un diagrama de barras que muestra la toxicidad cel ular causada por el péptido (1-42)AP en células SN474 l determinada por un ensayo de toxicidad celular mediante MTT (3-4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium); la gráfica muestra la toxicidad celular inducida por concentraciones crecientes del péptido tras 24 horas de tratamiento. En la figura se representan las medi as de 3 experimentos independientes y las barras de error se han calculado mediante la desviación estándar de los valores.

La Figura 2 muestra la apoptosis inducida por el péptido (I-42)A~ en células SN474 1. Mediante tinción con ioduro de propidio y anexina Vy posterior análisis por citometría de flujo, se puede corroborar que las células SN4741 son sensibles al pépt ido

(1-42)A~, que produce un incremento de las células apoptóticas que son positivas para la tinción con Ancxina V. En los paneles superiores se observa un dot plot de las células control (izqujcrda) y tratadas con el péptido (1-42)AP (derecha). El eje de abscisas corresponde a las células marcadas con ¡oduro de propidio y el eje de ordenadas corresponde a las células marcadas con Anexina V. En los paneles inferiores, se muestran las curvas de la Ancxina Y, separándose las poblaciones Ancxina V negativas O viables (P2) y AncxÍna V positivas o apoptéticas (P3). Los valores corresponden a la cantidad de eventos registrados en cada una de estas poblaciones, representados como porcentaje del total. Se muestra un resultado representativo de tres experimentos independientes.

La Figura 3 muestra los resultados de la curva dosis-respuesta de activación de Rael por el péptido (1-42)AP en células SN474 I (A) yen cultivos primarios de neuronas (B); la dosis mínima de péptido (1-42)AP a la que se encuentra un efecto sobre la activación de Rac l es 1,25 J.1M. La figura que se muestra es representati va de 3 experimentos independientes.

La Figura 4 muestra la cinética de activación de Racl por el péptido (J-42)AP en 2 líneas celulares neuronales, las células SN474 l (A) e IMR32 (B); en ambos casos la mayor activación de Racl se produce tras 30 minutos de exposición al péptido (142)Ap. La figura muestra resultados representativos de 3 experimentos independientes.

La Figura 5 muestra la implicación de PKC en la activación de Racl por el péptido (l-42)AP; las células SN474 1 fueron pretratadas con GF (un inhibidor fannacológico de las PKCs) l ~tM Yposteriormente tratadas con péptido (1-42)AI3 1,25 ¡.tM. Se realizaron ensayos de precipitación por afinidad para estudiar la activación de Racl , seguidos de Western blot anti-Racl. El resultado mostrado es representativo de tres experimentos independientes.

La Figura 6 muestra la implicación de PKC en la activación de Rac 1 por el péptido (l-42)AI3; los cul.tivos primarios de neuronas fueron pretratadas con GF I09203X (a partir de ahora lo denominaremos GF) 1 ~lM Y posteriormente tratadas con péptido Ap 1.25 J.1M. Se realizaron ensayos de precipitación por afinidad para estudiar la activación de RacJ , seguidos de Western blot anti-Racl. El resultado mostrado es representativo de tres experimentos independientes.

La Figura 7 muestra la implicación de PKC en la activación de Rae]; las células SN4741 (A) y los cultivos primarios de neuronas (B) fueron prctratadas 1 hora con GF 1 ~lM. Y posteriormente tratadas con PMA 1 ~LM durante 15 minutos, para inducir la activación de las PKCs. Posteriormente se estudió la activación de Rae 1 mediante

5 ensayos de precipitación por afmidad. El resultado mostrado es representativo de tres experimentos independientes.

La Figura 8 muestra la implicación de PJ3K en la activación de Racl por el péptido (1-42)AP; las células neuronales fueron pretratadas con Ly 294002 (un inhibidor farmacológico de PI3K, denominado a partir de ahora " Ly") 20 ~tM, Y

10 posteriormente tratadas con 1,25 ~lM de péptido ( I-42)Ap. Se realizaron ensayos de precipitación por afinidad para estudiar la activación de Rac 1, seguidos de Western blot anti-Rac l cn células SN474 I (panel izquierdo) y en cultivos primarios de neuronas (panel derecho). La figura muestra un resultado representativo de tres experimentos independientes.

15 La Figura 9 muestra a PDKI como el vínculo entre PI3K y PKC; al inhibir la kinasa PDK I con su inhibidor farmacológico OSU 03012 (denominado a partir de ahora OSU), tanto la activación de Rac 1 como la fosforilación de PKD mediada por el péptido (l-42)AP se ve inhibida -este efecto sc puede observar tanto en células SN474 1 (panel izquierdo) como en cultivos primarios de neuronas (panel derecho).

20 La Figura 10 esquematiza la cascada de señalización que emplea el péptido ( 142)AP para mediar en la activación de la GTPasa Rac 1 en neuronas. La Figura 1I es un diagrama de barras que muestra la implicación de la vía P13K1PDKl/AKT en la toxicidad celular inducida por el péptido (1-42)AP; las células SN4741 se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 105 células por pocillo; al día

25 siguiente se sometieron a ayuno de suero durante 24 horas antes de añadir los diferentes pre-tratamientos de I hora con los inhibi.dores de PJ3K, AKT Y PDKI; posteriormente se trataron con péptido (1-42)AP 1,25 J.-LM durante 24 horas y la toxicidad se analizó mediante ensayos de MTT. Los valores se calcularon como porcentajes sobre el control sin tratar. En la figura se representan las medias de 5 experimentos independientes y las

30 barras de error se han calculado mediante la desviación estándar de los valores. La Figura 12 es un diagrama de barras que muestra la inhibición de las PKCs en la toxic idad neuronal inducida por el péptido (1-42)AP; las células SN4741 se

sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 105 células por pocillo; al día siguiente se sometieron a ayuno de suero durante 24 horas antes de añadir los diferentes prctratamientos de 1 hora con distintas concentraciones O dosis de GF, un inhibidor de las PKCs; posteriormente se trataron con péptido (1-42)AI3 1,25 ¡.tM durante 24 horas, y la toxicidad se analizó mediante ensayos de MTT. Los valores se calcularon como porcentajes sobre el control sin tratar. En la gráfica se representan las medias de 5 experimentos independientes y las barras de error se han calculado mediante la desviación estándar de los valores.

La Figura 13 es un diagrama de barras que muestra la implicación de la inhibición de Rae! en la toxicidad neuronal mediada por el péptido (1-42)Af3; las células SN4741 se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 105 células por pocillo; al día siguiente se sometieron a ayuno de suero durante 24 homs antes de añadir los diferentes pretratamientos de I hora con distintas dosis de 6-mercaptopurina (6-MP), que inhibe la activación de la GTPasa Racl; posteriormente se trataron con péptido (142)Af3 1,25 ~lM durante 24 horas, y la toxicidad se analizó mediante ensayos de MTT. Los valores se calcularon como porcentajes sobre el control sin tratar. En la gráfica se representan las medias de 5 experimentos independientes y las barras de error se han calculado mediante la desviación estándar de los valores.

La Figura 14 cs un diagrama dc barras que muestra el efccto dc los inhibidorcs de PKC, PDK l YRael en la apoptosis neuronal inducida por cl péptido (1-42)A~ (A); las células SN474 I fueron pretratadas con GF I IlM, OSU I ~lM Y 6-MP 5 J.LM, y su efecto sobre la apoptosis inducida por el péptido (1-42)Af3 se estudió mediante tinción con ioduro de propidio y Anexina V y análisis por citometría de flujo. La gráfica presenta la apoptosis y la viabilidad celular como porcentaje; se muestran los valores medios y las desviaciones estándar de 3 experimentos independientes presentadas como barms de error. También se muestm la implicación de las PKCs clásicas en la toxicidad inducida por el péptido (l-42)AP (B). Las células SN474 l se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 105 células por pocillo; al día siguiente se sometieron a ayuno de suero durante 24 horas antes de añadir los diferentes pretratamientos de 1 hora con distintas dosis de 06 6967 (en adelante 06) un inhibidor de las PKCs disieas; posteriormente se trataron con péptido (1-42)Af3 1,25 ~M durante 24 horas, y la toxicidad se analizó mediante ensayos de MTT. l<>s valores se calcularon como porcentajes sobre el control sin tratar. En la gráfica se representan las medias de 5 experimentos independientes y las barras de error se han calculado mediante la desviación estándar de los valores.

La Figura 15 es un diagrama de barras que muestra la implicación de las PKCs nuevas o y e en la toxicidad inducida por el péptido (I-42)A~; las células SN4741 se sembraron en placas de 96 pocillos a mzón de lOs células por pocillo, al día siguiente se sometieron a ayuno de suero durante 24 horas antes de añadir los diferentes pretratamicntos de 1 hora con distintas dosis de Rottlcrin, un inhibidor selectivo de las PKCs nuevas o y 9; posterionncntc se trataron con péptido (1-42)AP I ,25 ~lM durante 24 horas, y la toxicidad se analizó mediante ensayos de MTT. Los valores se calcularon como porcentajes sobre el control sin tratar. En la figura se representan las medias de 5 experimentos independientes y las barras de error se han calculado mediante la desviación estándar de los valores.

La Figura 16 es un diagrama de barras que muestra la implicación de las PKCs nuevas en la apoptosis inducida por el péptido (l-42)A~; las células SN474 l fueron pretratadas con Rottlerin 7,5 J.lM Y su efecto sobre la apoptosis inducida por el péptido A~ se estudió mediante tinción con ioduro de propidio y Anexina V y aná lisis por eitometría de flujo. La gráfica presenta la apoptosis y la viabilidad celular como porcentaje; se muestran los valores medios y las barras de error se han calculado mediante la desviación estándar de los valores de 3 experimentos independientes.

La Figura 17 muestra la impli cación de las nuevas PKCs en la activación de Racl inducida por e l péptido (1-42)A~ en células SN4741 ; las célu las fu eron pretratadas con Rottlerin 15 ~lM Y su efecto sobre la activación de Rac l inducida por el péptido (1-42)A~ 1,25 J.lM se estudió mediante ensayos de precipitación por afinidad. Las bandas inmunorreactivas fueron visualizadas utilizando un anticuerpo anti-Racl. Los resultados que se muestran son representativos de 3 experimentos independientes.

La Figura 18 muestra la implicación de las iso formas nuevas 8 y ede PKC en la toxicidad celular inducida por el péptido ( 1-42)A~ en cultivos organotípicos de cerebro. Los cultivos organotípicos de hipocampo (A) y de corteza entorrinal (B) se trataron con péptido (1-42)A~ 100 nM. En el panel inferior se observa la fluorescencia emitida por unión del ioduro de propidio al ADN en las células que han perdido la integridad de la membrana plasmática en el proceso de muerte celular. C-control sin tratar; Dtratamiento con péptido (1-42)AP 100 nM; E-Rottlerin 2,5 ¡LM; F-Rottlerin 7,5 ¡tM. ECx, corteza cerebral cntorrinal; CA 1 Y CA2-3, regiones hipocampalcs CA 1, CA2 y CA3; DG, giro dentado.

La Figura 19 muestra la caracterización de la ruta de señalización que emplea el péptido (I-42)AP para inducir muerte neuronal.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Usos terapéuticos

Los autores de la presente invención, usando líneas celulares de origen neuronal, tales como las células SN4741 (Figura 2), y cultivos organotípicos de cerebro (Figura 18), han observado que el péptido (1-42)AP induce muerte celular. Los inventores han observado que, sorprendentemente, dicho péptido (1-42)AP transducc las señales de muerte celular a través de la ruta PI3K1PDK llnucvas PKCslRacllmucrtc neuronal y han propuesto a dichas PI3A, POK 1, nuevas PKCs, y Rac 1 como potenciales dianas terapéuticas para frenar el proceso de muerte neuronal dirigido por eJ péptido (1-42)A~. Asimismo, los inventores han comprobado que la inhibición de POK I en neuronas tanto en líneas celulares como en cultivos primarios bloqueaba la activación de Rac 1 mediada por el péptido (I-42)A~, lo que apunta a que POKI está implicada en la ruta de señalización que conduce a la activación de Racl y potencialmente actúa como vínculo entre PI3K y PKC en esta vía (Figura 9). Adicionalmente, han observado que el pretratamiento de las monocapas celulares con inhibidores de PDKI , y posterior tratamiento con el péptido (1-42)A~, el inhibidor de PDKI bloquea la fosforilación de PKD, una serin treonin quinasa sustrato de las PKCs, por lo que se pone de manifiesto una vez más que las PKCs están por debajo de la ruta de señalización gobernada por PI3K1PDK 1 (Figura 9).

Además, los inventores han demostrado (Figura 11) que un inhibidor de POKI, tal como el OSU (OSU 03012) previene el efecto tóxico inducido por el péptido (142)A~, con lo que la viabilidad celular pasa a ser de un 50,28%, en las células tratadas con el péptido (1-42)AP (1 ,25 ~M), a un 78,83% en las células pretratadas con OSU (1 ¡tM) p<O,OO 1.

Por otro lado, como se puede observar en la Figura 14A, el tratamiento con el péptido (1-42)A~ a una concentración de I,25 ~lM durante 24 horas produjo, un incremento de la apoptosis en las células SN4741 alcanzándose un 37,88%; sin embargo, cuando las célu las se prc-trataron con los inhibidorcs farmacológicos de PDK1, PKC y Rae I correspondientes, se consiguió proteger al 100% de las células del daño inducido por el péptido (l-42)AI3, ya que la viabilidad alcanzó unos valores similares a aquellos de las células control (sin tratar). Estos resultados indican que la toxicidad inducida por el péptido (1-42)AP en las células SN4741 se puede bloquear in vitro bloqueando las activid.ades de PDK 1, PKCs y Rae l.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con el uso de un inhibidor de POK I para producir un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos. En una realización particular, dicho inhibidor de PDKI actúa como agente ncuroprotector para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos de péptido Ap.

La PDKI O PDPKI (proteina kinasa I dependiente de 3-fosfoinositido) es una kinasa que participa en diversas vías de señalización. La estructura de la PDK I se puede dividir en dos dominios: el dominio PH y el dominio kinasa o catalítico. El dominio PH está envuelto mayoritariamente en la interacción de la PDK I con el fosfatidilinositol (3,4)-bifosfato y con el fosfatidilinositol (3,4,5)-trifosfato lo cual es importante para la localización y activación de algunos sustratos de PDKI asociados a membrana (e.g., AKT). El dominio kinasa presenta tres sitios de unión al ligando: el sitio de unión del sustrato, el sitio de unión al ATP, yel sitio de acoplamiento O bolsillo PIF. Múltiples sustratos de PDKI , incluidos AKT y la proteína kinasa C, requieren la unión a dicho sitio de acoplamiento [Fr6din M, et al. 2002. EMBO J. 21 (20): 5396-407].

El gen humano de PDKI está localizado en el cromosoma 16 en la región 16pI3.3; tiene dos variantes de transcripción que dan lugar a dos iso formas: la isoforrna 1 (NM_0026 1 3.3, SEQ ID NO: 1) y la isoforma 2 (NM_031268.4, SEQ ID NO:2).

El término «POKI " tal y como se usa en esa descripción no se refiere únicamente al gen y a la proteína humanos sino también a los ortólogos de otras especies, como por ejemplo, ratón (NM_OII062), y la isoforma 2 de ratón (NM 001080773), rata (NM_031081), gallina NM_OOIOI2529.1, macaco (AS 170104.1), etc.

El término "enfermedades asociadas a la formación de depósitos ami lo ideos" (o "enfermedades asociadas con amiloidosis" O "enfermedades amilo idcas") se refiere a, e

incluye, pero no se limita a, enfermedades asociadas con amiloidosis sistémica, local, crónica y senil. Las amiloidosis se caracterizan por los "depósitos amiloidcos" que están constituidos de fibrillas proteicas, conocidas como fibrillas de péptido amiloidc, en la región extracclular. La enfermedad de Alzheirncr (EA) es uno de los ejemplos de 5 amiloidosis más conocidos. Las fibrillas de amiloidc tienen una serie de características en común aunque estén formadas por distintas proteínas; todas presentan una morfología alargada, se tiñen con Rojo Congo y presentan un patrón de difracción de rayos X característico, llamado patrón "cross-bcta". Las fibrillas se forman por la unión cooperativa de moléculas con una cinética de formación característica que incluye una

10 fase inicial más lenta de nucleación y una fase posterior más rápida de elongación O crecimiento. Se pueden encontrar diferentes tipos de depósitos ami lo ideos; así, se pueden encontrar: depósitos de fibrill as de amiloide que se asocian a la demencia en la EA, a la

15 demencia asociada a los cuerpos de Lewy, al síndrome de Down, al complejo de la demencia de Guam asociada al parkinsonismo, a la hemorragia cerebral hereditaria del tipo holandés con amiloidosis, y a otros procesos similares (en donde el amiloide específico se refiere a la proteína precursora del amiloide O APP);

amiloidosis asociada a la inflamación crónica, por ejemplo, osteomielitis,

20 tuberculosis, fiebre mediterránea familiar, hemorragia cerebral hereditaria, artritis reumatoide, enfennedad de Crohn, espondilitis anquilosante, enfennedad de Castleman, y similares (en donde el a miloide específico se refiere al amiloide del tipo AA o proteína amilo ide A (proteína AA), con una estructura no inmunoglobulinica compuesta por 76 aminoácidos con peso molecular de 8.500 daltons; la proteína AA deriva de un

25 precursor de síntesis hepática denominado "precursor sérico de la proteína amiloide A" (SAP), que circula en plasma unido a la lipoprotcína HOL3); amiloidosis asociada al mieloma múltiple, por ejemplo, a discrasias de la células B, y similares, (en donde el amiloide específico se refiere al amiloide del tipo AL, formado por cadenas ligeras de inmunoglobulinas con predominio de las Lambda (A.)

30 sobre las Kappa (K), en una proporción 2: 1, con tendencia a formar estructuras fibrilares que adoptan una distribución beta plegada);

amiloi.dosis asociada a la diabetes tipo 2 (en donde el amiloidc específico es la amilina del islote pancreático);

amiloidosis asociada a las enfermedades priónicas, por ejemplo, la enfermedad de Creutzfcldt-Jacob, el Kuru, la enfermedad de Gersmann-Straüsslcr-Schcinker, el "scrapie" animal, y similares (en donde el amiloidc específico se refiere al amiloide PrP

o proteína prión);

amiloidosis asociada a la hcmodiálisis crónica, amiloidosis asociada a la hemodiálisis a largo plazo, al síndrome del túnel carpal, ya otros procesos similares, (en donde el amiloide específico se refiere a la ss2-microglobulina);

amiloidosis cardiaca senil, polincuropatía familiar amiloidótica, y a procesos similares (en donde el ami loide específico se refiere a la transtirretina o prealbúmina); y

amiloidosis asociada a tumores endocrinos como el carcinoma medular del tiroides y a otros procesos similares (en donde el amiloide específico es una variante de la procalcitonina).

El término "formación y/o acumulación u organización molecular del amiloide", en forma de dímeros, oligómeros, protofibrillas, fibrillas, filamentos, ovillos o placas se refiere a, e incluye, pero no se limita, al depósito de varias proteínas insolubles, fibrilares, placas amiloideas de la proteina, proteinas ami lo ideas, depósitos de amiloide formados por la agregación de "proteínas amiloideas". Por "proteínas ami lo ideas" se entiende cualquier proteína o péptido insoluble, fibrilar, que resulte en la formación y/o acumulación u organización molecular del amiloide, de placas amiloideas o depósitos de amiloide que incluye, sin estar limitado, las proteínas o fragmentos de: APP, amiloide del tipo AA, amiloide PrP, amiloide del tipo AL, ss2-microglobulina, transtirretina o prealbúmina, o una variante de la procalcitonina. El término "depósito de amilo ide" se refiere al depósito (acúmulo) extracelular de depósitos formados por la agregación de proteínas amiloideas seguida de la combinación posterior de agregados y/o de proteínas amiloideas, formación de depósitos amiloides y similares.

El término "enfermedades asociadas al depósito amiloideo" se refiere a, e incluye, pero no se lim ita, enfermedad de Alzheimer, la demencia asociada a los cuerpos de Lewy, síndrome de Down, complejo de la demencia de Guam asociada al parkinsonismo, hemorragia cerebral hereditaria del tipo holandés con amiloidosis, amiloidosis asociada a la inflamación crónica, por ejemplo, osteomielitis, tuberculosis,

la fi ebre mediterránea familiar, hemorragia cerebral hereditaria, artritis reumatoide,

enfermedad de e rohn, cspondilitis anquilosantc, enfermedad de Castlcman, amiloidosis

asociada al micloma múltiple, por ejemplo, a discrasias de células B y similares,

amiloidosis asociada a la di abetes tipo 2, amiloidos is asociada a las enferm edades

5

priónicas, por ejemplo, la enfermedad de Crcutzfeldt-Jacob, el Kuru, la enfermedad de

Gcrsmann-Straüsslcr-Schcinkcr, el "scrapic" animal, y similares, amiloidosis asociada a

hcmodiálisis crónica, amiloidosis asociada a la hcmodiálisis a largo plazo, síndrome del

túne l carpal , amiloidos is cardiaca se nil , polin europatía fami liar amiloidóti ca,

amiloidosis asociada a tumores endocrinos como el carcinoma medular del tiroides, etc.

lO

En una rcalización particular, los depósitos amiloideos son depósitos

extracelul ares de péptido beta amiloide; en una realización concreta, el péptido que

forma los depósitos amiloideos es el pépt ido (1-42)Ap.

La "proteína precursora amiloide" O "APP" es una glicoproteína transmembrana

que es sustrato de la famili.a de proteasas denominadas presilinas. Dependiendo de las

15

proteasas que pal1icipen en el procesamiento de la APP se van a generar productos de

reacción con diferente acti vidad a nivel de la fi siología neuronal.

Por "péptido beta amiloide" o "péptido AB" se entiende un péptido de 39 a 43

aminoácidos deri vado de la APP (APP: SEQ ID NO:3 NM-000484.3 variante 1,

NM_20141 3.2 va riante 2, NM _201414.2 variante 3, NM_OOI1 36129.2 variante 5,

20

N M_OOI1 361 30.2 variante 6). En condiciones fisiológicas, este péptido se genera a

partir de la APP por medio del procesamiento de la APP por la vía amiloidogénica.

El "péptido (I-42)beta amiloide" o "péptido (l-42)AB" se refi ere a un péptido

A~ compuesto por los primero s 42 aminoácidos resultantes del procesami ento de la

A PP por la v ía amiloidogé nica. [Zain Sb et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 1988

25

february; 85(3):929-933].

En una realización particular, las enfermedades asociadas a depósitos amiloideos

del péptido A~ inclu yen, pero no se limitan a, EA, pérdida de memoria, síntomas de

déficit de atención asociados con la EA, EA de tipo cuerpos de Lewy difusos, deterioro

cogniti vo leve, hemorragia cerebral he reditaria con amiloidosis de tipo holand és,

30

angiopatía ~-amiloide y hemorragia cerebral tal como hemorragia cerebral debida a

angiopatía arniloid e cerebral solitaria, infecc ion es por prion es , di abetes tipo 1] ,

demencias degenerativas, incluye ndo demencias de origen degenerativo y vascular

mixto, demencia frontotcmporal, demencia prcscnil, demencia senil, demencia asociada

con SIDA, trastornos parkinsonianos tales como la e nfermedad de Parkinson (EP),

parkinsonismo pancnccfalítico csclcrosantc subagudo, parkinsonismo poscnccfalítico,

encefalitis pugilística, complejo parkinsonismo-dcmencia de Guam , la enfermedad de

5

Piek, atrofia sistémica múltiple (ASM), parálisis supra nuclear progresiva (PSP) y

degeneración corticohasal (DCB), síndrome de Down, la enfermedad de cuerpos de

Lewy, la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple y

enfcnnedades neurotraumáticas tales corno accidente cerehrovascular agudo, epilepsia,

trastornos de l estado de án imo tales como depresión , esquizofrenia y trastornos

ID

bipolares, isquemia, lesión cerebral, especialmente lesión cerebral traumática,

inflamación y enfermedades inflamatorias crónicas.

En realizaciones preferidas, dicha enfermedad asociada a depósitos amiloidcos

se selecciona ent re la EA, EP, esclerosis lateral am iotrófica, esclerosis múltiple,

accidente cerebrovascular agudo e isquemia.

15

El término "tratar" o "tratamiento" designa tanto tratamiento terapéutico como

profiláctico O medidas preventivas, en el que el objeto es prevenir o frenar (reduc ir) un

cambio fi siológico indeseado o trastorno, tal como la muerte celular asociada a la

formación de depósitos amiloideos y más en concreto a la muerte neuronal inducida por

el péptido (1-42)AP en el sistema nervioso central (SNC). Para el fin de esta invención,

20

resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, sin limitación, alivio de síntomas,

reducción de la extensión de la enfermedad, estado patológico estabilizado

(concretamente no empeorado), retardo o freno de la progresión de la enfermedad,

mejora o paliación del estado patológico y remisión (tanto parcial como total), tanto

detectable como no detectable. "Tratamiento" puede significar también prolongar la

25

supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento.

Aquellos sujetos que necesitan de tratami ento incluyen aquellos sujetos que sufren ya la

afección o trastorno, así como aquellos con tendencia a sufrir la afección o trastorno o

aquellos en los que ha de prevenirse la afección o trastorno.

Como "método de tratamiento" se entiende la administración a un individuo en

30

necesidad de dicho tratamiento, de una composición farmacéutica que comprende un

inhibidor de PDKI según la invención.

Por "muerte cel ular inducida por el péRtido AB" se entiende la respuesta en forma de muerte de celular por parte de las células que han sido expuestas al péptido Ap. En una realización particular, la muerte celular inducida por el péptido Af} es a través de la ruta PJ3KJPKD l/nuevas PKCs/Rac l/muerte celular. En una realización preferida, la muerte celular es muerte neuronal y está inducida por el péptido Ap a través de la ruta PI3KJPKD l/nuevas PKCs/Rac l/muerte neuronal.

En una realización particular, dicho inhibidor de PDKI actúa como un agente neuroprotcctor en el tratamiento de enfermedades asociadas a la fonnación de depósitos amiloidcos asociados al péptido Ap.

El término "ncuroprotcctor", tal como aquí se utiliza, se refiere a la atenuación de los efectos de la degeneración o muerte neuronal mediante cualquier mecanismo conocido o por conocer, por ejemplo, necrosis, apoptosis, autofagia, daño oxidativo, deposición de subproductos, pérdida de La arquitectura celular, etc., O a la desaparición de los efectos de la degeneración o muerte neuronal mediante cualquier mecanismo conocido o por conocer, por ejemplo, necrosis, apoptosis, autofagia, daño oxidativo, deposición de subproductos, pérdida de la arquitectura celular, etc., o a la disminución O desaparición de sus efectos secundarios.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un inhibidor de PDKI para producir un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos del péptido beta amiloide, especialmente el péptido (1-42)A~, en donde el medicamento reduce la muerte neuronal inducida por el péptido (1-42)A~ en el SNC. En una rea lización particular, el péptido (l-42)A~ transduce la señales de muerte celular a través de la ruta PJ3Kinasa/PKD l/ nuevas PKCslRacl/muerte neuronal.

En el contexto de la presente invención se entiende por "inhibidor de POKI" a un compuesto que disminuye la actividad de POK 1 en contacto con dicha proteína, así como cualquier sustancia o compuesto que sea capaz de impedir o bloquear la transcripción y la traducción del gen que codifica POK l (es decir, impedir O bloquear la expresión de dicho gen), o que sea capaz de impedir que la proteína codificada por dicho gen realice su función (actividad).

A modo ilustrativo, no limitativo, entre los agentes inhibido res de la expresión de PDKI adecuados para su uso en la presente invención se incluyen, por ejemplo,

oligonucleótidos antiscntido específicos para el gen que codifica PDKI , microARNs específicos, ARNs catalíticos o ribozimas específicos, ARNs de interferencia (ARNips) específicos, ARN con actividad "dccoy", es decir, con capacidad para unirse específicamente a un factor (proteico generalmente) importante para la expresión del 5 gen, de manera que la expresión del gen de interés, en este caso PDK 1 sea inhibida, ctc. Asimismo, ejemplos ilustrativos, no limitativos, de agentes inhibidorcs de POKI capaces de impedir que la proteína PDKI realice su función incluyen, péptidos inhibidorcs de PDK 1, anticuerpos dirigidos específicamente contra epítopos de PDK 1 esenciales para desempeñar su función, O contra POK 1, como las regiones de unión a 10 ATP, el sitio de acoplamiento O bolsillo PIF, el sitio de unión al sustrato o el dominio PH, etc. Se conocen numerosos compuestos químicos (mol éculas pequeñas) que reducen la actividad de PDK I cuando se ponen cn contacto con dicha proteína ["small molecule inhibitors of PDKI J, por ejemplo, staurosporine y sus dcrivados, fenotiacina y sus derivados, derivados de urca, celecoxib y sus deri vados, compuestos 15 piridinonílicos, compuestos poliheterocíclicos, etc., los cuales pueden ser utilizados en la presente invención. Adicionalmente, otros compuestos con capacidad de inhibición de la expresión de PDK 1 que pueden ser utilizados en la puesta en práctica de la presente invención incluyen aptámeros y espiegélmeros, es decir, ácidos nucleicos Do L de cadena sencilla o doble que se unen específicamente a la proteína diana (PDK 1 en 20 este caso), dando como resultado una modificación de la actividad biológica de ésta. Los aptámeros y espiegélmeros tienen una longitud de entre 15 y 80 nucleótidos y, preferiblemente, de entre 20 y 50 nucleótidos. Los compuestos que provocan la reducción de los niveles de ARNm pueden ser identificados usando ensayos estándar para determinar los niveles de expresión de ARNm tales como transcripción reversa

25 reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), análisis de protección de ARN, Northem blot, hibridación in situ, microarrays, etc. Los compuestos que provocan la reducción de los niveles proteicos de PDKI pueden ser identificados usando ensayos estándar para la determinación de niveles de expresión proteica tales como Western-blot O Western transfer, EU SA ("enzyme-linked

30 immunosorbcnt assay"), RIA (radioinmunoensayo), EIA compctitivo (inmunoensayo dc enzima competitivo), DAS-ELlSA ("double antibody sandwich ELlSA"), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el uso de biochips de

proteínas o microarrays que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en la

precipitación coloidal en formatos tales como los "dipsticks".

La capacidad inhibidora en la actividad kinasa de PDKI puede ser determinada

utilizando ensayos convcncjonalcs para medir la acti vidad kinasa, por ejemplo, métodos

5

basados en la medi ción de la acti vación de otras proteínas conocidas por ser activadas

por POK 1, c.g., PKD O Rae l . Así, se pueden real izar ensayos de acti vación de Rae 1

usando ex perimentos de precipitación por afinidad o de fosforil ación de PKD como los

mostrados en la Figura

9 yen el ejemplo qu e acompaña a la presente descripción

(apartado "Ensayo de la activación de las GTPasas de la supcrfamilia Ras").

ID

La Tabla I recoge ejemplos ilustrativos, no limitativos, de inhibidores de POK I

que pueden ser usados en la presente invención.

Tabla I

Inhibidores de POK I

15

Tipo de inhibidor

I

Oligonucleótido antisent ido específico para la secuencia del gen que codifica PDKI , e .g., 5'-TGAATGATGCCCTTGCCGTG-3' (SEQ ID NO: 4) (Flynn P et Current Bio logy, Volume 10, Issue 22, 1439-1442, 14 Nove mber 2000)

JI

Enzima de ADN específica para la secuencia de POKI

111

Ribozima específica para el gen que cod ifi ca POK 1

IV

M icroRNA específico para el gen que codifi ca POKI, e.g.: 5'TGCTGCCCCGCGACGAGCCCCTCGCACAAACCGG ACCTGAGCGTT TTGTTCGTTCGGCTCGCGTGAGGC-3' (SEQ ID NO: 5) 5'-CCTGGCCTCACGCGAGCCGAACGAACAAAACGCTCAGGTCCGGT TTGTGCGAGGGGCTCGTCGCGGGGC-3' (SEQ ID NO : 6) (El Quaamari et al.. Diabetes October 2008 vol. 57 no. 10 2708-27 17)

V

ARN de interfe rencia espec ífico para la secuencia del gen que codifica PDKI , e.g. : 5'-GCACATCCAGATCACAGA-3' (SEQ 10 NO: 7)

,.

5'-GGGTTTATTTGCAAGACGA-3 ' (SEQ ID NO: 8) (Pinncr S. & Sa hai E Naturc Cell Biology JO, 127 -137 (2008); Kharcbava G et aL 2008. The Journal of Neurosciencc. Octobcr 29; 28(44):1140911420)

V I

Péptido con capacidad para unirse específi camente a PDKI e inhibir su actividad

V II

Anticuerpo con capacidad para unirse específicamente a PDKI e inhibir la actividad kinasa de dicha enzima (PDKl) (Lawlor, MA et al. EMBO J. 2002 Jul y 15; 21(14): 372 8-3738; Collins B. J. et al EMBO J. 2003 August 15; 22(16): 4202-42 11 ; Kh arebava G. J. Neurosci. 2008 28: 11409-11420; Nakamura K. et aL J. Bio!. Chem 2008 283: 17702-177 11)

VlII

Staurosporine o sus deri vados, C.g., 7-hidroxistaurosporine (UCN-O 1)

H J "y"y" )=i I '" NY;! \h tt '''<CI<, Staurosporine (R=H) UCN-01 (R=OH) (Ko mander D. et aL Biochem. 1. 375(2):255 (2003); Sato et al, Oncogene, 2002, 21 , 1727-1738)

IX

Fenotiacina y sus derivados, c.g., cloropromacina, proclorperacina, trifluorpcrac ina o tioridazina H(XN h'8ú//

(Choi JH , et al. Ann N Y Aead Sei. 2008 Scp;11 38:393-403)

X

Derivados de urea de fórmula f"'""~ ;) ¡", 1 .A..~ "'1I~.....) !,,1.... 'Ü" , ;; ....A::,.. ~ 'fA-",¡.o 'S'''''':ii .' , Z",A ....."'-J.<,.,./,\~",............,,~,.~$.~ ¡ ",ji , . " u·"t'St~ eXAU2 (""1 ~ f'"" J..-"#'-"--~~ ' ;Z V~ >(~''''''''-''K'' .. . . .1'" gJ(.yit:!

(R I Fcldman et al. Novel Small Mo lcculc Inhibitors of3-Phosphoinos itidcdepcndcnt Kinasc-l. 1. Bio l. Chcm. , 2005, 280, 20, 19867-19874; J Bain et al. Thc sclcctivity ofprotcin kinasc inhibitors: a furthcr updatc. Biochcm. J. 2007, 408,297-3 15; C Peifer, D R. Alessi, Small-Molceule Inhibi tors of PDK 1. ChcmMcdChcm. 2008, 3 (10), Rcvicw; J.Q. Chcng et al. The AktlPKB pathway: mo lecul ar target for cancer drug discovery. Oncogcne (2005) 24, 7482-7492)

Xl

Celecoxib (Cclcbrcx) y sus derivados de tónnula

r~{'"",,,,~,N"

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., ¡Cj¡ (>l"'~l POK?C·;? % . A ¡qp(>l"'~i pt!¡<.• P:;;'·21

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N... OH l!.. " NI"!;: 40 ::!5 33 H~tl.,-e' ~ ,,--,¡ o 45 :!7

"

---<."--¡ 52 J2 34 ~..... Nr;2 -~ , 5

" 30

,,-" OHN" /lH --C= N I-i 'NH~ 25 16 14 10 3:J' (OSl.'03Ull)NH _ NJ .... NH"H ' (OSC0301.3) o -~)'NHl 40 3 14

NOTA: La estructura general de los compuestos 25-36 se mu estra en la fó rmula situada en la parte superio r, en do nd e Ar es 2-fcnantrcnilo y R representa la sustitución correspondie nte en el lugar del grupo sulfonamida. (Zhu, Jiuxia ng. From cclebrcx to a novel class of phosphoinositdc-dcpcndcnt kinase-l (PDK-I) inhibitors fo r androgen-indcpendent prostatc cancer; hltp://ctd.ohiolink.cdu/scarch.cgi?q=PDK 1 +inhibilors& ficld=&pa gcs¡zc= 3 O; http://ctd.ohiolink.edu/scarch.cgi?q=acccssion_ numbcr:osu 124 3948876&mlt=y). (Hsu AL et al. J Biol Chem. 275; 11 397-11403, 2000. Song X. et al. J Nat l. Caneer Inst, 94:585-59 1, 2002. Ar ico S. et al. J Bio l. Chem. 277:276 132762 1, 2002)

XlI

Piridinonil derivados de fórmula o o R7 R8 N~R2).-:7 .... RSV n R5 do nde n, Ll , L2 , X, Rl , R2 , R3 , R4 , R5 , R6 , R1 , Y R8 , tienen los signi ficados indicados en WO 2008005 457A2 (compuesto de fórmula (1 )) , cuyo contenido sc in corpora aquí como referencia en su tota lidad.

XJlI

Compuestos hetcro po licíclicos de fórmula do nde v, w, x, y, z, R1 , R2 , R3 Y R\ tienen los signi ficados indicados en EP 1296985, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

1. Oligonuclcótidos antiscntido En una realización particular, se utiliza un oligonuclcótido antiscntido específico para inhibir Ja expresión del gen que codifica PDKI , por ejemplo, inhibiendo la

5 transcripción y/o traducción del ácido nuclcico que codifica PDKI (cuya activid.ad se desea inhibir). Los oligonudcótidos antiscntido se pueden unir a su diana potencial mediante complcmcntaricdad de bases convencional, 0 , por ejemplo, en el caso de unirse a ADN bicatcnario, a través de interacciones especificas en el surco mayor de la doble hélice.

10 Para su empleo en la presente invención, una construcción que comprende un oligonuclcótido antisentido se puede distribuir, por ejemplo, como un plásmido de expresión que, cuando se transcribe en la célula, produce ARN que es complementario a al menos una parte única del ARNm celular que codifica PDKI. Alternativamente, la construcción antisentido es una sonda de oligonucleótidos que se genera ex vivo y que,

15 cuando se introduce en la célula, produce inhibición de la expresión génica hibridando con el ARNm y/o secuencias genómicas del ácido nucleico diana. Tales sondas de oligonucleótidos son preferiblemente oligonucleótidos modificados, que son resistentes a las nucleasas endógenas, por ejemplo, exonucleasas y/o endonucleasas, y que son por lo tanto estables in vivo. Moléculas de ácidos nucleicos ilustrativas para su uso como

20 oligonuclcótidos antisentido incluyen análogos de ADN de fosforamidaro, fosfotionato y metilfosfonato (véanse, por ejemplo, US5176996, US5264564 y US5256775). Adicionalmente, para una revisión de las aproximaciones generales para construir oligómeros útiles en terapia antisentido véanse, por ejemplo, Van der Krol et al., BioTeehniques 6: 958-976, 1988; Y Stein et al., Caneer Res 48: 2659-2668, 1988.

25 Respecto al oligonuclcótido antisentido, son preferidas las regiones de oligodesoxirribonucleótidos derivadas del sitio de inicio de la traducción, por ejemplo, entre -10 y + 10 del gen diana. Las aproximaciones antisentido implican el diseño de oligonucleótidos (bien ADN o bien ARN) complementarios al ARNm que codifica el polipéptido diana. Los oligonucleótidos antisentido se unirán a los transcritos de ARNm

30 y evitarán la traducción. También se podrían usar oligonucleótidos complementarios bien a las regiones 5' ó 3' no traducidas, no codificantes, de un gen en una aproximación antisentido para

inhibir la traducción de ese ARNm. Los oligonuclcótidos complementarios a la región 5' no traducida del ARNm deberían incluir el complemento del codón de iniciación AUG. Los oligonuclcótidos complementarios a las regiones codificantes del ARNm son inhibidores de la traducción menos eficaces pero también se podrían usar según la invención. Si están diseñados para hibridar con la región 5', 3' o codifica nte del ARNm, los ácidos nuclcicos antiscntido deberían tener al menos 6 nuclcótidos de longitud y tener preferiblemente menos de alrededor de 100 Y más preferiblemente menos de alrededor de 50, 25, 17 ó 10 nueleótidos de longitud.

Preferentemente, se deben realizar estudios in vitro para cuantificar la capacidad de los oligonuclcótidos antisentido de inhibir la expresión génica. Ventajosamente, dichos estudios utilizarán controles que distingan entre inhibición génica antisentido y efectos biológicos no específicos de los oligonuc1cótidos. También se prefiere que esos estudios comparen los niveles del ARN O proteína diana con los de un control interno de ARN o proteína. Los resultados obtenidos usando los oligonucleótidos antisentido se pueden comparar con los obtenidos usando un oligonucleótido control. Se prefiere que el oli gonucleótido control sea aproximadamente de la misma longitud que el oligonucleótido a ensayar y que la secuencia del oligonucleótido difiera de la secuencia antisentido no más de lo que sea necesario para prevenir la hibridación específica a la secuencia diana.

Los oligonucleótidos antisentido pueden ser de A ON o ARN o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos, de cadena sencilla o de cadena doble. El oligonucleótido se puede modificar en la base, en el azúcar o en el esqueleto de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, su capacidad de hibridación etc. El oligonucleótido puede incluir otros grupos unidos, tales como péptidos (por ejemplo, para dirigirlos a receptores de células huésped) o agentes para faci litar el transporte a través de la membrana celular (Letsinger et al., Proc. Nat!. Aead. Sei. U.S.A. 86: 6553-6556, 1989; Lemaitre et al., Proe. Natl. Aead. Sei. 84: 648652, 1987; W088/0981O) o la barrera hematoeneefáliea (W089/1 O 134), agentes intercalantes (Zon, Pharm. Res. 1988.5: 539-549). Para este fin, el oligonucleótido puede estar conjugado a otra molécula, por eje mplo, un péptido, un agente transportador, un agente de corte desencadenado por hibridación, cte.

En algunos casos, puede ser difíc il alcanzar las concentraciones intracelulares del oligonuc1cótido antiscntido suficientes para suprimir la traducción de los ARNm endógenos. Por tanto, una aproximación preferida usa una construcción de ADN recombinante en la que se coloca el oligonuclcótido antiscntido bajo el control de un

5 promotor fuerte de pol]1I o poi 11 .

Alternativamente, se puede reducir la expresión del gen diana dirigiendo secuencias de desoxirribonuclcótidos complementarias a la región reguladora del gen (es decir, el promotor y/o potenciadores) para formar estructuras de triple hélice que previenen la transcripción del gen en las células diana en el cuerpo (Hclcnc et al

10 Anticaneer Drug Des. 6(6): 569-84, 1991). En ciertas formas de realización, Los oligonuclcótidos antiscntido son morfolinos antiscntido. En una realización particular, el oligonuclcótido antiscntido específico tiene la secuencia de nuclcótidos mostrada en la Tabla 1 (l). 15

11. Enzimas de AON

En otra realización particular, se utiliza una enzima de ADN específica para inhibir la expresión del gen que codifi.ca PDKI. Las enzimas de ADN incorporan algunas de las características meca nísti cas tanto de las tecnologías de los

20 oligonuclcótidos antiscntido como de las tecno logías de los ribozimas. Las enzimas de ADN se diseñan de modo que reconozcan una secuencia diana del ácido nucleico particular (en este caso, la secuencia que codifica a PDKI), parecido al oligonucleótido antisentido; sin embargo, de forma similar a la ribozima, son cataliticas y cortan específicamente el ácido nucleico diana.

111. Ribozimas

En otra realización particular, se utiliza una ribozima específica diseñada para cortar de forma catalítica transcritos de un ARNm diana para prevenir la traducción de los ARNms que codifican PDKI cuya actividad se desea inhibir. Las ribozimas son

30 moléculas enz imáticas de ARN capaces de catalizar el corte específico de ARN [para una revisión véase Rossi, 1994. Current Biology 4: 469-471]. La secuencia de las moléculas de ribozima preferiblemente incluye una o más secuencias complementarias

al ARNm diana, y la bien conocida secuencia responsable del corte del ARNm o una secuencia funcionalmente equivalente [véase, por ejemplo, US5093246]. Las ribozimas usadas en la presente invención incluyen las ribozimas de cabeza de martillo, las ARN cndorribonuclcasas, etc. [Zaug et al., 1984. Sciencc 224:574-578].

Las ribozimas pueden estar compuestas de oligonuclcótidos modificados (por ejemplo, para mejorar la estabilidad, direccionamiento, ctc.) y se deberían distribuir a células que expresan el gen diana in vivo. Un método preferido de distribución implica usar una construcción de ADN que "codifica" la ribozirna bajo el control de un promotor constitutivo fuerte de poi 111 Ó poi 11, de modo que las células transfectadas producirán cantidades suficientes de la ribozima para destruir los mensajeros diana endógenos e inhibir la traducción. Puesto que las ribozimas, contrariamente a otras moléculas antisentido, son catalíticas, se requiere una concentración intracelular menor para su eficacja.

JV. MicroARNs

En otra realización particular, se utiliza un microARN específico para la secuencia que codifica PDKI. Como es conocido, un microARN (miARN o miRNA por sus siglas en inglés) es un ARN monocatenario, de una longitud de entre 21 y 25 nuc1eótidos, y que tiene la capacidad de regular la expresión de otros genes mediante diversos procesos, utilizando para ello la ruta de ribointerferencia. En una realización particular, el microARN se selecciona del g rupo formado por los microARNs especifieos mostrados en la Tabla I (IV) [SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6].

VARNi

En otra realización particular, se utiliza un ARN de interferencia (ARN i), tal como un ARN de interferencia pequeño (ARNip) específico para la secuencia que codifica PDK 1 cuya actividad se desea inhibir.

Los ARN de interferencia pequeños o ARNip (siRNA en su denominación en inglés) son agentes capaces de inhibir la expresión de un gen diana mediante interferencia del ARN. Un ARNip se puede sintetizar químicamente, o, alternativamente, se puede obtener mediante transcripción in vilro O bien se puede sintetizar in vivo en la célula diana. Típicamente, los ARNip consisten en una cadena doble de ARN de entre 15 y 40 nuclcótidos de longitud, que puede contener una región protuberante 3' y/o 5' de 1 a 6 nuclcótidos. La longitud de la región protuberante es independiente de la longitud total de la molécula de ARNip. Los ARNip actúan mediante la degradación o el silcnciamicnto post-transcripcional del mensajero diana.

Los ARN ip pueden ser los llamados shRNA (short hairpin RNA), caracterizados porque las cadenas antiparalclas que forman el ARNip están conectadas por una región bucle u horquilla. Los shRNAs pueden estar codifi cados por plásmidos o virus, particularmente retrovirus, y estar bajo el control de promotores tales corno el promotor U6 de la ARN polirncrasa 111.

En una realización particular, los ARNip que pueden ser utilizados en la presente invención son sustancialmente homólogos al ARNm del gen que codifica PDKl o a la secuencia genómica que codifica dicha proteína. Por "sustancialmente homólogos" se entiende que tienen una secuencia que es suficientemente complementaria o similar al ARNm diana, de forma que el ARN ip sea capaz de provocar la degradación de éste por interferencia de ARN. Los ARN ip adecuados para provocar dicha interferencia incluyen ARN ip fonnados por ARN, así como ARNip que contienen distintas modificaciones químicas tales como:

ARNip en los que los enlaces entre los nucleótidos son distintos a los que aparecen en la naturaleza, tales corno enlaces fosforotioato; conjugados de la cadena de ARN con un reactivo funcional, tal como un tluoróforo; modificaciones de los extremos de las cadenas de ARN, en particular el extremo 3' mediante la modificación con distintos grupos funcionales del hidroxilo en posición 2'; nucleótidos con azúcares modificados tales como restos O-alquilados en posición 2' tales como 2'-O-metilribosa O 2'-O-fluorosibosa; nucleótidos con bases modificadas tales como bases halogenadas (por ejemplo 5-bromouracilo y 5-iodouracilo), bases alquiladas (por ejemplo 7-metilguanosina).

Los ARNip y ARNsh que pueden ser utilizados en la presente invención se pueden obtener usando una serie de técnicas conocidas para el experto en la materia. La región de la secuencia de nuclcótidos que codifica POKl que se toma como base para diseñar los ARNip no es limitantc y puede contener una región de la secuencia codificantc (entre el codón de iniciación y el codón de tcnninación) o, alternativamente, puede contener secuencias de la región no traducida 5' 03'. preferentemente de entre 25 y 50 nuclcótidos de longitud y en cualqui er posición en posición sentido 3' con respecto al codón de iniciación. Una forma de diseñar un ARNip implica la identificación de los motivos AA(N 19)TT, en donde N puede ser cualquier nuclcótido en la secuencia que codifica PDKI, y la selección de aquellos que presenten un alto contenido en G/C. Si no se encuentra dicho motivo, es posible identificar el motivo NA(N21), en donde N puede ser cualquier nuclcótido.

En una realización particular, el inhibidor de POKI es un ARN i específico para PDKI, tal como un ARNi específico seleccionado del grupo formado por los ARNi específicos mostrados en la Tabla 1 (V) [SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9].

VI. PéRtidos inhibidores

En otra realización particular, se utiliza un péptido inhibidor de PDKI para impedir que dicha proteína ejerza alguna de sus funciones, en particular, una actividad relacionada con su capacidad de fosforilar a otras proteínas. El término "pértido inhibidor", tal como aquí se utiliza. hace referencia a aquellos péptidos capaces de unirse a PDK l e inhibir su actividad según se ha explicado anteriormente, es decir, impedir que POK 1 pueda fosfor ilar a otras proteínas. Seki T et aL, han construido una proteína quimérica SAL-PIF, constituida por el loop de

activación de la PKCS y la región de interacción de PDKI, funciona como un péptido inhibidor para POK I cuando se expresa en células eucariotas (Scki T. et al 2006 Genes toCells 11, 1051-1070)

VII. Anticuerpos inhibidores

En otra realización particular, se utiliza un anticuerpo inhibidor de POK I para impedir que dicha proteína ejerza alguna de sus funciones, en particular, una actividad relacionada con su capacidad de fosforilación a otras proteínas.

Por tanto, un anticuerpo "inhibidor" de PDKI tal como aquí se utiliza se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a POK 1 de manera específica e inhibir una o más de las funciones de PDKI, preferiblemente las relacionadas con la fosforilación de otras

2.

proteínas. Un anticuerpo inhibidor es también todo aquel anticuerpo que es capaz de unirse a PDKI de manera específica y bloquear los sitios de fosforilación de PDKI o los sitios de unión de PDKl con otras proteínas. Los anticuerpos pueden ser preparados usando cualquiera de los métodos que son conocidos para el experto en la materia. Una vez identificados anticuerpos con capacid.ad de unión a PDKI, se seleccionarán aquellos capaces de inhibir la actividad de esta proteína usando un ensayo de identificación de agentes inhibidorcs [véase, por ejemplo, Metz; S. et al. 2008. J.Biol.Chcm. 283:59855995].

En una realización particular, dicho anticuerpo inhibidor de POK 1 es un anticuerpo con capacidad para unirse a POKI e inhibir específicamente la actividad kinasa de dicha enzima (PDKI); ejemplos ilustrativos de dichos anticuerpos se describen en las referencias citadas en la Tabla l (VII), cuyos contenidos se incorporan a la presente descripción por referencia.

VlII-XIJI. Compuestos químicos En otra realización particular, se utiliza un compuesto químico que disminuye la actividad de PDKI cuando se pone en contacto con dicha proteína.

Ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichos compuestos quimicos incluyen los compuestos mencionados en la Tabla l (VUI-XIIf) e incluyen staurosporine y sus derivados, fenotiacina y sus derivados, derivados de urea (e.g., BX-320, BX795 y BX912), celecoxib y sus de rivados, compuestos piridinonílicos, compuestos poliheterociclicos, etc., los cuales pueden ser utilizados en la presente invención.

Entre los derivados de urea útiles como inhibidores de PDKl se encuentran los compuestos: BX-320; pyrrolidinc-I-carboxyl ic acid [3-(5-iodo-4-(3-[(thiophene-2carbonyl)-amino ]-propylamino }-pyrimidin-2-ylamino )-phenyl]-am ide (BX -795); y pyrrolidine-I-carboxylic acid (3-{ 5-bromo-4-[2-( l H-imidazol-4-yl)-cthylamino]pyrimidin-2-ylamino)-phcnyl)-amide (BX-912) [R 1 Fcldman et al. Novel Small Molecule Inhibitors of 3-Phosphoinositide-dependent Kinase-l. J. Biol. Chem., 2005, 280,20, 19867-19874; J Bain ct al. The selectivity ofprotein kinasc inhibitors: a further update. Biochcm. J. 2007,408,297-3 15; C reifc r, DR. Alessi, Small-Molcculc lnhibitors of PDKI. ChernMedChem. 2008, 3 (lO), Review; J.Q. Cheng et al. The Akt/PKB pathway: molecular target for cancer drug discovery. Oncogene (2005) 24,

7482-7492].Aunque, en general, los de rivados de Celecoxib tienen actividad sobre PDK 1, entre los más potentes se encuentran los compuestos identificados como OSU02067 (4-[5-(2-fcnantrcnil)-3-(trifluorornctil)-1 H-pirazol-l-il]bcncenosulfonamida, que corresponde al compuesto 23, Tabla I (XI); OSU-03012 (2-amino-N-(4-(5-(25 fcnantrenil)-3-(trifluorornctil)-JH-pirazol-l-i l)feni I)acctamida), que corrcspon de al compucsto 34, Tabla 1 (XI); Y OSU-03013 (4-[5-(2-fenantrcnil)-3-(trifluoromctil)-IHpirazol-I-il]-fcnil-guanidina), que corresponde al compuesto 35, Tabla 1 (XI) [Zhu, Jiuxiang. From cclcbrcx to a novel c1ass ofphosphoinositdc-dcpcndcnt kinasc-I (PDK1) inhibitors for androgcn-indcpcndcnt prostate canccr;

10 http://ctd.ohiolink.cdu/scarch.cgi?q=PD K 1 +inh ibitors&field=&pagesize=30; http://etd.ohiolink.edu/seareh.egi?q=aeeession number:osu 12439488 76&mlt=y]

En una realización particular, el inhibidor de PDK 1 es el compuesto identificado como OSU-03012 que actúa inhibiendo la vía PI3K1Akt y presenta una le 50 de 5 J.1.M para inhibir PDK 1, con una inhibición no determinada por encima de 50 J..lM. Esta

15 molécula ha s ido desarrollada por sus efectos antitumorales, bloqueando la actividad POK-I , la espec ificidad se ha demostrado in vitro realizando ensayos in vitro kinasa (ivk) en presencia o ausencia de diferentes inhibidores de kinasas; para ello se inmunoprecipita la POK-l que previamente ha sido acti vada y se determina la fosforilación de un sustrato exógcno, c.g., péptidos sintéticos quc se fosforilan por la

20 acción de determinadas kinasas. La mezcla de reacción lleva una batería de inhibido res de kinasas y se establece la especificidad en fun ción de la conce ntración. A las concentraciones indicadas, el compuesto OSU-03012 actúa como un inhibidor específico de POK1.

Entrc los compuestos polihctcrocíclicos inhibidorcs de PDKI [Tabla I (XIII)] 25 merece la pena destacar al compuesto identificado como KP 372-1 (EP 1296985), de fórmula:

o

Composiciones farmacéuticas de la invención El experto en la materia entiende que los inhibidorcs de POK I pueden ser 5 utilizados para preparar un medicamento que será administrado de manera adecuada al sujeto en necesidad de tratamiento.

En una realización particular, dicho medicamento reduce La muerte neuronal inducida por el péptido (1-42)AP en el SNC; en una realización concreta, dicho medicamento se administra a un sujeto que padece la enfermedad de Alzhcirner (EA).

10 En una realización particular, el inhibidor de POKI es un compuesto mostrado en la Tabla l. En otra realización particular, el inhibidor de PDKl se selecciona del grupo formado por:

un oligonuc1eótido antiscntido específico para el gen que codifica POKI, C.g., el oligonuclcótido cuya secuencia dc nucleótidos se 15 muestra en la SEQ ID NO: 4;

un microARN específico para el gen que codifica POKl, e.g., un

microARN cuya secuencia de nuc1eótidos se muestra en la SEQ ID

NO: 5 o en la SEQ ID NO: 6;

un ARN de interferencia específico para el gen quc codifica POKI , e.g., un ARN dc interferencia cuya secuencia dc nuclcótidos se muestra en la SEQ ID NO: 7 o en la SEQ ID NO: 8;

25 un péptido inhibidor de POK 1;

un anticuerpo inhibidor de POK 1;

un compuesto seleccionado del grupo formado por staurosporinc y sus derivados, fenotiacina y sus derivados, derivados de urea (e.g., BX320, BX-795 o BX-912), cclecoxib y sus derivados, piridinonil derivados, compuestos polihctcrocíclicos, y combinaciones de los

mismos.

En una realización particular, el inhibidor de PDKl es OSU-03012.

Para su administmción a un sujeto, los inhibidorcs de POK 1 se formularán junto con un vehículo farmacéuticarncntc aceptable para su administración según la vía de administración elegida.

Como un experto en la materia entiende, en los casos en los que los inhibidores de POK I sean ácidos nudeicos, estos pueden estar incluidos en vectores. Los medios para la distribución de genes a una célula O tejido in vivo o ex vivo incluyen (pero no están limitados a) inyección directa de ADN desnudo, métodos balísticos, transferencia mediada por liposomas, transferencia mediada por receptores (complejo ligando-AON), electroporación, y precipitación con fosfato cálcico. Ver la patente de EE.UU. Nos. 4970154, WO 96/40958, patente de EE.UU. No. 5679559, patente de EE.UU. No. 5676954, y patente de EE.UU. No. 5593875. También incluyen el uso de vectores virales tales como un retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado, poxvirus, lentivirus, virus del papiloma o el herpes simplex virus, uso de un conjugado ADN-proteina y el uso de un liposoma. El uso de los vectores se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. No. 5672344, patente de EE.UU. No. 5399346, patente de EE.UU. No. 5631236, y patente de EE.UU. No. 5635399.

Cuando se administran solos, los inhibidores de POK I pueden administrarse en combinación con vehículos farmacéuticamente aceptables y en las dosificaciones aquí descritas. Dichos inhibido res de PDKl también pueden usarse en combinación con uno

o más compuestos adicionales eficaces contra la patología específica fijada como objetivo para el tratamiento. Los agentes terapéuticos y/o los compuestos adicionales diferentes pueden administrarse simultáneamente con, posteriormente a, o antes de la administración del compuesto descrito en la Tabla l.

En una realización particular, un inhibidor de POK I contenido en la Tabla l se usa combinado con otro fármaco útil para el tratamiento de una enfermedad asociada a la formación de depósitos amiloideos, particularmente enfermedades asociadas a

depósitos de un péptido beta amiloide En una realización particular, el péptido beta amiloidc es el pértido (I-42)AB. En una realización particular, el otro fármaco se selecciona entre un inhibidor de Rael o un inhibidor de una PKC, preferentemente, de una PKC nueva.

En una realización particular, dicho medicamento comprende uno o más de los inhibidorcs de POK 1 mostrados en la Tabla l. En este sentido, se podrían combinar dichos inhibidores en proporciones iguales o distintas, y podrían formar parte de la misma formulación o podrían formularse en formulaciones diferentes para su administración secuencial o simultánea.

Las composiciones farmacéuticas conteniendo uno O más inhibidorcs de POK 1 pueden presentarse en cualquier forma fannacéutica de administración que se considere adecuada para la vía de administración elegida, por ejemplo, por vía sistémica, oral, parenteral O tópica, para lo cual incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios pam la formulación de la fonna de administmción deseada.

La cantidad efectiva de inhibidor de PDKI puede variar dentro de un amplio intervalo y, en general, variará en función de circunstancias particulares de aplicación, la duración de la exposición y consideraciones de este tipo.

Las formas de dosjficación sóli.das para administración oral pueden incluir cápsulas convenciona les, cápsulas de liberación sostenida, comprimidos convencionales, comprimidos de liberación sostenida, comprimidos masticables, comprimidos sublinguales, comprimidos efervescentes, píldoras, suspensiones, polvos, gránulos y geles. En dichas formas de dosificación sólidas, los compuestos activos pueden mezclarse con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Dichas formas de dosificación también pueden comprender, como en la práctica normal, sustancias adicionales distintas de diluyentes inertes, por ejemplo, agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. En el caso de cápsulas, comprimidos, comprimidos efervescentes y píldoras, las fonnas de dosificación también pueden comprender agentes tamponantes. Los comprimidos y píldoras pueden prepararse con recubrimientos entéricos.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes habitualmente usados en la técnica, tales como agua.

Dichas composiciones también pueden comprender adyuvantes, tales como agentes hurncctantcs, agentes cmulsionantcs y de suspensión, y agentes edulcorantes, aromatizantcs y perfuman tes.

Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables y estériles pueden formularse de acuerdo con la técnica conocida usando agentes dispcrsantcs adecuados, agentes humcctantcs y/o agentes de suspensión. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden usarse están agua, solución de Ringer, y solución isotónica de cloruro sódico. Los aceites estériles también se usan

convencionalmente como disolventes o medios de suspensión.

Para su administrac ión tópica, los inhibidores de POKI pueden formularse en forma de cremas, geles, lociones, líquidos, pomadas, soluciones de pulverización, dispersiones, barras sólidas, emulsiones, microemulsiones y similares, que pueden formularse de acuerdo con los métodos convencionales que usan excipientes adecuados, tales como, por ejemplo, emulsionantes, tensioactivos, agentes espesantes, , colorantes y combinaciones de dos o más de los mismos.

Adicionalmente, los inhibidores de POKI pueden administrarse por vía transdérmica en forma de parches transdérmicos o dispositivos de iontoforesis. En una realización, el inhibidor de POKI se administra en forma de un parche transdérmico, por ejemplo, en forma de parche transdérmico de liberación sostenida. Se describen parches transdérmicos adecuados con más detalle en, por ejemplo, US5262165, US5948433, US6010715 yUS607153 1.

Las composiciones conteniendo los inhibidores de PDK l pueden incluir adicionalmente excipientes convencionales, es decir, vehículos farmacéuticarnente aceptables adecuados para la aplicación parenteral que no reaccionan de forma nociva con los compuestos activos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, agua, soluciones salinas, alcohol, aceites vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, tensioactivos, ácido silícico, parafina viscosa, aceite perfumante, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos petroetrales, hidroxim etilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

Se conocen diversos sistemas de suministro de fármacos y pueden usarse para administrar los compuestos o composiciones de la invención, incluyendo, por ejemplo, encapsulación en ¡iposomas, microburbujas, emulsiones, micropartículas, microcápsulas y similares. La dosificación necesaria puede administrarse en forma de una única unidad

o en una forma de liberación sostenida. Las formas de liberación sostenida adecuadas así como los materiales y métodos

5 para su preparación se describen en, por ejemplo, "Modificd-Release Drug Delivery Tcchnology", Rathbonc, M. J. Hadgraft, J. and Robcrls, M. S. (cds.), Maree! Dckkcr, Jnc., New York (2002); "Handbook of Pharmaccutical Controlled Rclcasc Tcchnology", Wise, D, L, (ed,), Mareel Dekker, Ine, New York, (2000); En una realización de la invención, la forma administrable por vía oral de los inhibidorcs de POK I está en una

10 forma de liberación sostenida que comprende adicionalmente al menos un recubrimiento O matriz. El recubrimiento o matriz de liberación sostenida incluye, pero sin limitación, polímeros naturales, semisintéticos o sintéticos insolubles en agua, modificados, ceras, grasas, alcoholes grasos, ácidos grasos, plasüficantes naturales semisintéticos o sintéticos, O una combinación de dos o más de los mismos.

15 Los recubrimientos entéricos pueden aplicarse usando procesos convencionales conocidos por los especia listas en la técnica, como se describe en, por ejemplo, Johnson, J. L., "Pharmaceutical tablet coating", Coatings Technology Handbook (Segunda Edición), Satas, D. and Traeton, A. A. (eds), Mareel Dekker, Ine. New York, (2001); Carstcnsen, T., "Coating Tablets in Advanccd Pharmaceutical Solids",

20 Swarbrick, J. (ed,), Marecl Dekker, Ine, New York (2001), 455-468; Aunque las necesidades individuales pueden variar, la determinación de los intervalos óptimos para cantidades eficaces de los inhibidores de PDKI pertenece a la experiencia habitual de los especialistas en la técnica. En general, la dosificación necesaria para proporcionar una cantidad eficaz de dichos inhibidores de PDK1 , que

25 pueda ajustarse por un especialista en la técnica, variará dependiendo de la edad, salud, estado físico, sexo, dicta, peso, grado de la alteración del receptor, frecuencia de tratamiento y la naturaleza y alcance de la alteración o enfermedad, afección médica del paciente, la vía de administración, consideraciones farmacológicas tales como la actividad, eficacia, perfil farmacocinético y de toxicología del compuesto particular

30 usado, si se usa un sistema de suministro del fármaco, y si el compuesto se administra como parte de una combinación de fármacos.

La cantidad de inhibidor de PDKI que será eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección, y puede determinarse por técnicas clínicas convencionales, incluyendo la referencia a Goodman and Gilman, supra; The Physician's Desk Rcfcrence, Medical Economics

5 Company, ]nc., Oradell, NJ., 1995; Y Drug Facts and Comparisons, Inc., Sto Louis, MO, 1993. La dosis exacta a usar en la formulación también dependerá de la vía de administración, y la gravedad de la enfermedad o trastorno, y debe decidirse a criterio del médico y de las circunstancias del paciente.

10 Métodos de screening de la invención

Los inventores han observado que en células de origen neuronal yen cultivos organotípicos (Figura 1, 2 Y 18) la adición del pé ptido (1-42)A~ reproduce las características patológicas de una enfermedad asociada a depósitos amiloideos tal como la EA. En consecuencia, aquellos agentes que provoquen una mejora de los estadios

15 patológicos observados en un cultivo celular o en un cultivo organotípico podrían ser potencialmente útiles en el tratamiento enfennedades asociada a depósitos amiloidcos en general, y, en particular, en el tratamiento de la EA.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de un compuesto capaz de inhibir la muerte celular inducida por depósitos 20 amiloidcos para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos

amiloideos que comprende: a) poner en contacto una célula con una proteína amiloidea; b) poner las células resultantes de a) en contacto con un compuesto candjdato;

y

25 c) determinar en dicha célula los niveles de activación de PDKI, en donde si los niveles de activación de POKI en la célula después de haber sido tratada con un compuesto candidato son menores que antes del tratamiento, el compuesto candidato es capaz de inhibir la muerte celular neuronal inducida por proteínas amiloideas y útil para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de

30 depósitos ami loideos.

Los términos "enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloidcos", y "proteína amiloidca" han sido descritos ant eriorme nte en el apartado de composiciones de la invención.

El experto en la materia entiende que para determinar si una proteína es una proteina amiloidea, dicha proteína o péptido debe aparecer en los depósitos amiloideos de enfermedades asociadas con los depósitos am iloidcos arriba citadas teniendo por tanto una morfología alargada, se tiñen con Rojo Congo, que presenten un patrón de difracción de rayos X característico, llamado patrón "cross-bcta". Inouye H. et al Biophys J. 199364(2):502-519.

En una realización particular, la proteína amiloidca es un péptido beta amiloide; en consecuencia, el método sería un método para la identificación de compuestos capaces de inhibir la muerte celular inducida por un péptido beta amiloide para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos de un péptido beta amiloide que comprende:

a) poner en contacto una célula con un péptido beta amiloide;

b) poner las células resultantes de a) en contacto con un compuesto candidato;

y

c) determinar en dicha célula los niveles de activación de PDKI, en donde si los niveles de activación de PDKI en la célula después de haber sido tratada con un compuesto candidato son mcnores que antes del tratamiento, el compuesto candidato es capaz de inhibir la muerte celular neuronal inducida por un péptido beta amiloide y útil para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos del péptido beta amiloide. En una realización particular, el péptido es el péptido (1-42)A~.

Los términos "péptido beta amiloide ", "mucrte celular inducida por un péptido beta ami loide" y y "enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos asociadas a péptido A~" han sido definidos con anterioridad.

Así, en una primera etapa [etapa a)), el método de rastreo de agentes terapéuticos de la invención comprende poner en contacto una célula con una proteína amiloidea. En una realización particular en una primera etapa [ctapa a)], el método de rastreo de agentes terapéuticos de la invención comprende poner en contacto una célula con un péptido A~, tal como el péptido (1-42)A~.

En la presente invención, se entiende por célula a una célula aislada en cultivo así como a una pluralidad de células tanto asiladas (cultivo celular) como formando parte de un cultivo organotípico. Así, en la presente invención, el término "cultivo" incluye todas las posibilidades anteriormente citadas.

Ejemplos de células que pueden ser usadas en la presente invención son tanto cultivos primarios obtenidos de diversos tejidos como la piel, la sangre, corazón, cerebro etc como células inmortalizadas o de cultivos primarios provenientes de osteoblastos, mioblastos, neuroblastos, fibriblastos, glioblastos, células madre, hcpatocitos, condrocitos, células de musculo liso y estriado, células de tejido conectivo, células gliales, cpiteliales, endoteliales, neuronas, etc. En una realización particular, las células usadas son células de origen neuronal, tanto de cultivos primarios de neuronas como de cultivos inmortalizados de origen neuronal como las células SN474 I , IMR32, N-TERA, PCJ2, ONII, C1300.

En otra realización particular, las células forman parte de una estructura tridimensional denominada cultivo organotípico. En la presente invención, por "cultivo organotípico" se entiende un cultivo tridimensional de tejido que mantiene en gran parte la estructura, conexiones celulares y fisiología similares a las presentes en el órgano del que ha sido extraído en este caso cerebro (Gahwiler, 1981 J. Neurosci. Meth. 4, 329-42; Gahwiler 1984 Neuroscience. 11 :751-60; Gahwiler 1988 Trends Neurosc. II :484-9; Stoppini et al. 1991 J. Neuroseienee Methods 37: 173-82).

Los cultivos organotípicos pueden ser extraídos de cualquier órgano en donde se pretenda estudiar la influencia de la muerte celular inducida por una proteína amiloidea como el péptido ( 1-42)A~, como, por ejemplo el cerebro, el corazón, los riñones, etc. En una realización particular, el cultivo organotípico es de origen cerebral. El cultivo organotípico puede contener diversas zonas del cerebro y será realizado seleccionando las zonas según los intereses particulares de cada ensayo.

Métodos para generar cultivos organotípicos son conocidos por el experto en la materia (Gahwiler, 1981 J. Neurosci. Meth. 4, 329-42; Gahwiler 1984 Neuroscience. II :751-60; Oahwiler 1988 Trends Neurose. II :484-9; Stoppini et al. 1991 J. Neuroseienee Methods 37: 173-82). El animal no-humano al que se le disecciona el cerebro u otro órgano, puede ser cualquier animal, preferentemente, un vertebrado, tal como un mamífero, por ejemplo, un roedor, preferiblemente, un ratón O una rata. Dicho

3.

animal no-humano puede ser un animal con un fondo gené tico modificado genéticamente, es decir, cuyo material genético ha sido manipulado y diseñado o alterado deliberadamente con el fin de otorgarle alguna característica de interés, O puede ser un animal no modificado genéticamente. Dichos animales no humanos 5 genéticamente modificados pueden ser animales transgénicos, es decir, animales que presentan, insertada en su gcnoma, la secuencia de un gen de interés, c.g., EYFP (Winler SM el al., 2007 Respir Physiol Neurobiol. 159:108-14) o genes-GFP para la expresión de la proteína tluorescente GFP bajo el control del promotor de nestina (Friling el al., 2009 Proe Natl Aead Sei U S A 106(18):7613-8). También puede ser un

10 animal que presenta bloqueada la expresión de un gen específico (c.g., ratones knockout). Los métodos para la generación de animales de este tipo son bien conocidos por un experto en la materia.

Un ejemplo de cultivo organotípico cerebral sería el cultivo organotípico mostrado en la Figura 18 y descrito en los ejemplos de la presente invención.

15 Los cultivos usados en el método de la invención, son mantenidos en condiciones que permitan la supervivencia celular. Dichas condiciones adecuadas para la supervivencia de dicho cultivo incluyen las condiciones que garantizan que el cultivo no se necrose y se mantenga vivo. Dichas condiciones incluyen el mantenimiento de los cultivos en condiciones de humedad, temperatura y concentraciones de gases

20 (habitualmente, 37°C, 5% CO2 y 95% O2) adecuadas, condiciones que pueden ser conseguidas manteniendo los cultivos en incubadores especialmente diseñados para dicho fin. El estado de la técnica incluye numerosos ejemplos de incubadores adecuados para mantener vivo un cultivo organotípico. Las condiciones de cultivo varían ampliamente para cada tipo de cultivo organotípico.

25 Además de la temperatura y la mezcla de gases, el factor más comúnmente variado en los sistemas de cultivo es el medio de crecimiento. Las recetas para los medios de crecimiento pueden variar en pH, concentración de glucosa, factores de crecimiento y la presencia de otros componentes nutritivos. Se conocen diversas recetas de medios utilizados para el mantenimiento de cultivos organotípicos (Vergni et al.,

30 2009 PLoS ONE4(4):e5278, Chechneva el al., 2006 Ncurobiol ofOis. 23(2):247-59). Además, es necesario mantener los cultivos bajo condiciones de esterilidad usando métodos apropiados, por ejemplo, esterilización, cte., así como llevando a cabo

el manejo del cultivo en condiciones de esterilidad. El objetivo de todo ello es evitar la contaminación microbiana (c.g., bacterias, levaduras, micoplasmas, ctc.) que competirían con las células de la porción de cerebro por los nutrientes y/o podrían infectar y eliminar dichas células. En una realización particular, toda manipulación se lleva a cabo, típicamente, en una campana de flujo laminar para evitar la entrada de microorganismos contaminantes. También pueden añadirse antibióticos al medio de cultivo.

Asimismo, para la correcta supervivencia del cultivo puede ser necesario, en ocasiones, realizar cambios del medio de culti vo de manera regular; así, en una realización particular, se realizan cambios del medio dc cultivo cada 3 ó 4 días.

La expresión "poner en contacto", tal como aquí se usa, se refiere al proceso por el cual una proteína amiloidea como por ejemplo el péptido A~ entra en contacto con una célula O cultivo organotípico, e incluye cualquier posible fonna "in vil/'O" de poner en contacto una proteína amiloidea de manera extracelular así como cualquier método que permita la introducción de una proteina amiloidea a las células aisladas o que fonnan parte de un cultivo organotípico.

Las proteínas amiloideas pueden ser obtenidas de manera comercial o ser producidas usando síntesis química O biológica.

El péptido AP, en especial el péptido (1-42)AP puede ser obtenido de manera comercial o ser producido usando síntesis química o bio lógica tal y como sc describe en el ejemplo I en el apartado " Preparación del péptido ~-Amiloide (A~)" de la presente invención. Aunque trabajar con proteínas amiloides siempre implica problemas en la preparación de muestras (baja solubilidad, dificil reproducibilidad, etc.), el péptido ~(142) es especialmente dificil de manipular, ya que presenta una insolubilidad muy elevada, lo que dificulta también su purificación. En condiciones cromatográficas estándar dicha proteína eluye dando lugar a picos extremadamente anchos, con poca resolución (Zagorski et al (1999) Methods Enzymol 309, 189-2359), por lo que requiere el uso de sistemas cromatográficos no habituales en la química de péptidos, como mezclas de eluyentes de ACN/isopropanol y condiciones básicas (Snyder S:W: el al Biophys J 1994,67, 1216-1228, http://www.WesternAnalytical.comlvydaclbamyloid. N¡¡slund J el al J. Neuroehem. 1996,67,294-301).

Las concentraciones del péptido A~. especialmente del péptido (1-42)A~ usados en el método de la invención, en el caso de que se utilicen cultivos celulares varían de entre 0,001 ,uM y 40 ~M. 0,05 JlM Y 30 ,uM, preferiblemente entre 0, 15 JlM Y 10 JlM, 0,3 Y 5 JlM, 0,1 JlM Y 2 ,uM. En una realización preferida, el cultivo es un cultivo

5 celular y la concentración del péptido AI3 es de entre 0,5 ,uM y 3 ,uM y preferiblemente de 1,25 ¡.tM. En otra realización particular, el cultivo es un cultivo organotípico y la concentración del péptido AI3 es de entre 10 nM y 1 ,uM, preferentemente 100 nM.

En una segunda etapa [etapa b)], el método de rastreo de agentes terapéuticos de la invención comprende poner las células resultantes de a) con un compuesto candidato.

10 Los compuestos utilizados en el método de rastrCQ pueden ser compuestos químicos tanto orgánicos como inorgánicos. Entre los compuestos orgánicos, dicho compuesto puede ser un polímero biológico tal como un ácido nuc1eico O una proteína.

En una realización particular, el compuesto a ensayar no se encuentra aislado sino que se encuentra formando parte de una mezcla más O menos compleja, bien 15 derivada de una fuente natural o bien formando parte de una biblioteca de compuestos. Ejemplos de bibliotecas de compuestos que pueden ser ensayadas según el método de la presente invención incluyen, sin limitación, bibliotecas de péptidos formadas tanto por péptidos como por análogos peptídicos que comprenden O-aminoácidos O péptidos que comprenden enlaces no peptídicos, bibliotecas de ácidos nuc1cicos formadas por ácidos 20 nuclcicos con enlaces no fosfodiéster del tipo de fosforotioato o ácidos nucleicos peptídicos, bibliotecas de anticuerpos, de carbohidratos, de compuestos de bajo peso molecular, preferiblemente moléculas orgánicas, de peptidomiméticos, y similares. En el caso de que se use una biblioteca de compuestos orgánicos de bajo peso molecular, la biblioteca puede haber sido preseleccionada para contener compuestos que puedan 25 acceder al interior celular con mayor facilidad. Así, los compuestos se pueden seleccionar en base a dete rminados parámetros tal es como tamaño, lipofilicidad, hidrofilicidad. capacidad de formar puentes de hidrógeno. En caso de que el compuesto candidato se encuentre formando parte de una mezcla de mayor O menor complejidad, la invención comprende adicionalmente una O varias etapas de fraccionamiento de dicha 30 mezcla y la repetición del método de la invención un número variable de veces hasta que el compuesto de la mezcla responsable de la separación de los elementos que forman el primer complejo de la invención se encuentre aislado. Métodos para el

fraccionamiento de compuestos presentes en una mezcla incluyen cromatografía (en capa fina, de gases o de exclusión molecular en gel, de afinidad), cristalización, destilación, filtración, precipitación, sublimación, ex tracción, evaporación, centrifugación, cspectrornctría de masas, adsorción y similares.

5 Alternativamente, los compuestos a ensayar pueden estar formando parte de un extracto obtenido de una fuente natural. La fuente natural puede ser animal o vegetal y estar obtenida de cualquier entorno, incluyendo, sin limitación, extractos de organismos terrestres, aéreos, marinos y similares.

Un experto en la materia entiende que para la realización de un ensayo "in

10 vitro", se pueden utilizar péptidos aislados de lisados de fracciones o de células enteras derivados sin limitación de células primari as, transformadas, líneas celulares, recombinantes, bacterias etc.

La incubación con el agente a ensayar se realiza a diferentes concentraciones y tiempos de incubación. Por otro lado, el uso de reacciones control negativas (sin agente) 15 y positivas es recomendable.

En una realización particular de la invención, el agente a ensayar se trata de un péptido. Para la introducción del péptido en las células del cultivo de la invención se pueden usar diversos procedimientos bien descritos en el estado de la técnica. También se puede introducir el fragmento de ADN que codifica dicho péptido. Métodos de

20 clonaje y propagación de d icho fragmento de ADN son bien conocidos en el estado de la técnica. Los medios para la distribución de genes a una cé lula o tejido in vivo incluyen (pero no están limitados a) inyección directa de ADN desnudo, métodos balísticos, transferencia mediada por liposomas, transferencia mediada por receptores (complejo ligando-ADN), electroporación, y precipitación con fosfato cálcico (véase,

25 por ejemplo, US 49701 54, WO 96/40958, US 5679559, US 5676954 y US 5593875). También se incluye el uso de vectores virales tales como un retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado, poxvirus, lentivirus, virus del papiloma o el herpes simplex virus, uso de un conjugado ADN-protcína y el uso de un liposoma.

En una tercera etapa [etapa c)], el método de rastrCQ de agentes terapéuticos de 30 la invención comprende determinar en dicha célula los niveles de activación de POK l. Existen múltiples métodos que pueden ser usados para detenninar la activación de kinasas, particularmente de PDKI , conocidos por el experto en la materia. Por

ejemplo, se puede utilizar I.a habilidad de la kinasa para fosfofilar su substrato natural. Dic ha fosforilación puede ser detectada usando por ejemplo una unión radio/químicaJfotoquímica de un fosfato y la detección posterior de su incorporación en el substrato. En el caso particular de PDKI el substrato serían proteínas como

5 AKT/PKB Y otras AGC kinasas como PKC, S6K, SGK etc.

Alternativamente, se pueden usar bioscnsorcs que como los bioscnsorcs basados en la transmisión de energía de resonancia (FRET -del inglés "Forstcr resonancc encrgy transfer) para medir la activación de PDK 1 en tiempo real. (Jin Zhang & Allen

M. D.; 2007. Molecular bioSystems, vol. 3, n 11, pp.759-765). 10 Otros ensayos para medir la modulación de las kinasas son conocidas por el experto en la materia tales como los descritos en W0I2004/0358 11.

Adicionalmente, la detección de la actividad de PDK 1 puede ser medida usando sustratos cxógenos como los polipéptido T308tidc O PIFtidc (Engci M et al 2006 EMBO J November 29(23):5469-5480. Otro sistema que puede ser ut ilizado para medir la

15 actividad de PDKI es el determinar la fosforilación de PKCzeta y PKCdelta in vitro tal y como se describe en Le Good, l A, et al,; (Sciencc 1998 Sep 25,281(5385):20422045).

En una rea lización particular, el tercer paso del método de la invención comprende de manera adicional, la medición de los niveles de muerte celular o la 20 viabilidad del cultivo. Métodos para medir los niveles de muerte celular o viabilidad de

un cultivo o célula son conocidos por el experto en la materia.

Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de tales métodos incluyen la inspección visual bajo microscopio usando criterios morfológicos tales como la conservación de la estructura, el uso de colorantes vitales, la cuantificación de la expresión de marcadores

25 de viabilidad celular, la determinación de la muerte celular por apoptosis, cte. La muerte celular puede ser dete rminada usando métodos bien descritos en el estado de la técnica tales como la incorporación de ioduro de propidio o el marcaje con anexina V. La cuantificación de las células que se están degenerando se puede realizar midiendo la incorporación de dichas sustancias a la célula tal y como se describe en el

30 apartado de métodos en los ejemplos de la presente invención. Otro método que puede ser utilizado es la medida de la actividad mitocondria corno el ensayo de la reducción de MTT tal y como se describe en la invención en el apartado ensayo de la reducción de MTT.

La cuantificación de los niveles de expresión de los marcadores de viabilidad celular, se puede realizar usando diferentes métodos bien conocidos en el estado de la técnica. El término "expresión", tal como aquí se utiliza, se refiere a un proceso mediante el cual se produce una proteína a partir del AON. Este proceso implica la transcripción del gen a un ARN mensajero (ARNm) y la traducción de este ARNm a proteína. Los términos proteína o polipéptido son utilizados en la presente invención de manera equivalente. En el contexto de la invención "cambios en los niveles de expresión" de los marcadores de viabilidad celular se refiere a cualquier cambio cn la producción del ARNm, de la proteína o de ambos, que produce niveles relativos alterados del ARNm, proteína O ambos, en una muestra con respecto a otras moléculas en la misma muestra. Se apreciará que los niveles de expresión de un marcador de viabilidad celular se puede determinar mediante la determinación de los niveles de ARNm en una muestra o mediante la determinación de los niveles del polipéptido correspondiente. De forma alternativa, los marcadores de viabilidad polipeptídicos pueden ser variantes resultantes de modificaciones postraduccionales, incluyendo fragmentos de los mismos.

Los niveles de expresión de los marcadores de viabilidad celular se pueden evaluar mediante cualquiera de una amplia variedad de métodos bien conocidos para detectar la expresión de una molécula transcrita (ARNrn) o su proteína correspondiente. Métodos para determinar la mol écula transcrita o la proteína son ampliamente conocidos por un experto en la materia, tales como PCR cuantitativa o usando anticuerpos con capacidad de unirse a las proteín as que codifican dichos genes y posterior cuantificación de los complejos formados usando por ejemplo técnicas como el Western-bl.ot o transferencia Western, ELlSA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), RJA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELl SA (ELlSA sandw ich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips

o mi croarrays de proteínas ctc. , Aunque prácticamente cualquier marcador de viabilidad celular puede ser utilizado, en una realización particular, se determinan los niveles de fosfatidil serina en la cara externa de la membrana plasmática. En condiciones fisiológicas el fosfolípido fosfatidi lserina se encuentra en la cara interna de la membrana plasmática, cuando comienza el proceso de apoptosis este fosfolípido se posiciona en la cara externa de la membrana plasmática y puede ser detectado con la proteína ancxina-V. Esta proteína se une específicamente a la fosfatidilscrina y como está etiquetada con un tluorocromo, el complejo fosfatidil serina-AnexinaV se puede detectar por citomctría de flujo.

En otra realización particular de la Invención, la viabilidad celular se puede determinar usando colorantes vitales bien conocidos por un experto en la materia, c.g., el crisol violeta. Para su detección, se pueden utilizar diversas técnicas de inmunoensayo y microscopía descritas anteriormente.

El experto en la materia entiende que dichos métodos para determinar la viabilidad celular del cultivo bajo estudio se pueden utilizar independientemente entre sí O en combinación.

En general, se considerará que un compuesto es potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos como por ejemplo enfermedades asociadas a depósitos de AP, cuando los niveles de activación de PDKI en la célula después de haber sido tratada con un compuesto candidato son menores que antes del tratamiento.

Se considera que los niveles de activación de PDK 1 en la célula o cultivo después de haber sido tratada con un compuesto cand idato son menores que antes del tratamiento cuando se produce una activación menor de 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 veces y/o una disminución de los niveles de muerte celular.

Un experto en la materia entiende que si el método de medición de la actividad de PDK I requiere la lisis de la célula (ej extracción de proteínas, ARN etc), entonces sería necesario el uso de una segunda célula O cultivo que no ha sido tratada con el compuesto a estudio en donde será medida la activación de POKI (cultivo control naif). Así, se considerará que un compuesto es potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos, en particular de enfermedades asociadas a péptidos beta amiloides, más especialmente el péptido (1 42)A~ cuando los niveles de activación de PDKly!o los niveles de muerte celular en la célula o cultivo después de haber sido tratada con un compuesto candidato son menores que antes del tratamiento, el compuesto candidato es capaz de inhibir la muerte celular

inducida por el depósitos amiloidco, en particular la muerte celular inducida por péptidos beta amiloidcs, más especialmente por el péptido (1-42)A~. Se considera que los niveles de activación de PDKI y/o de muerte celular en la célula o cultivo después de haber sido tratada con un compuesto candidato son menores que antes del tratamiento cuando se produce una activación menor de 2, 5, 10, 15, 20,30, 40,50, 100 veces y/o una disminución de los niveles de muerte celular en la célula o cultivo tratada con el compuesto candidato en referencia a la célula O cultivo control naif (es decir que no ha sido tratado con el compuesto potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos pero sí con una proteína amiloidea como por ejemplo el péptido ( 1-42)A~).

Adicionalmente, si se desea, en una realización particular, el método de rastreo de compuestos potcncialmente útiles como agentes terapéuticos para el tratamicnto de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos de la invención comprende una etapa adicional [etapa c)] en la que se analiza la activación de PDKI en un cultivo celular u organotípico control. Diversos tipos de cultivos control (celular u organotípico) pueden ser utilizados: a) cultivo control naif-naif, es decir que no ha sido tratado con el compuesto potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos am iloideos ni con una proteína amiloidea como el péptido (l-42)A~ , b) cultivo control naif, no ha sido tratado con el compuesto pero si con proteína amiloidea como el péptido (1-42)A~, c) un cultivo positivo-naif, es decir, que ha sido tratado con un compuesto bien descrito conocido por activar PDKI pero no con una proteína amiloidea como el péptido (1-42)A~, d) un cultivo positivo, es decir, que ha sido tratado con un compuesto bien descrito conocido por activar PDKI y con una proteína amiloidea como el péptido (l-42)AP, e) un control negativo naif, es decir, que ha sido tratado con un compuesto bien descrito conocido por inhibir PDKI pero no con una proteína amiloidea como el péptido (1-42)A~, f) un control negativo es decir, que ha sido tratado con un compuesto bien descrito conocido por inhibir PDKI pero no con una proteína amiloidea como el péptido (1-42)A~.

Diversos compuestos que activan PDKI aparecen descritos en Engel M et al 2006 EMBO J 29(23):5469-5480; Hindie V, et al Na! Chem Biol. 2009 ;5( tO):758-64.

Stockman BJ. ct al. Chcmical Biology and Drug Dcsign (2009) 73:2, Pago 179-188. Compuestos que inhiben a PDKI son conocidos por el experto en la material. Otros ejemplos de inhibidorcs específicos de PDK 1 aparecen descritos en la Tabla l.

El siguiente ejemplo ilustra la invención y no debe ser considerado en sentido limitativo de la misma.

EJEMPLO I

1. Materiales y Métodos

1.1 Cultivos celulares

Se utilizaron células SN4741, que provienen de la Sustancia Nigm de mtón [Son

J. H. et aL; 1999 J Neurosci 19(1):10-20; Son J.H. et al. 2005. J. Neurochem 94(4): 1040-53]. Sc cultivaron cn DMEM (mcdio Eagle modificado de Dulbccco) modificado con L-glutamina 4 mM, 3,7g1L de bicarbonato de sodio y 4,SglL de glucosa sin piruvato de sodio (Cambrcx) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibco) y una mezcla de antibióticos constituida por 10.000 u/mi de penicilina y 10 mg/ml de estreptomicina (Gibco) a 37°C y 5% de CO2.

Se utilizó también la línea derivada de neuroblastoma JMR32, disponible, por ejemplo, en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo (ATCC) con el número de acceso CCI 127. Estas células se cultivaron en MEM modificado por Earl (Gibco), suplementado con 10% de FBS, y una mezcla de antibióticos constituida por 10.000 U/mi de penicilina y lO mg/ml de estreptomicina (Gibco) a 37°C y 5% C02.

Las dos líneas celulares utilizadas crecían en monocapa y para su expansión se lavaron 2 veces con DPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco -del inglés "Dulbecco's Phosphate Buffered Saline") sin Ca2+ y sin Mg2+ (Gibco) precalentado a 37°C. Se cubrieron con Tripsina-EDTA (ácido etilendiaminotetracético) 1 X Y se dejó actuar durante unos minutos. Para parar la reacción se añadió el med io de crecimiento completo.

También se utilizaron cultivos primarios de células neuronales obtenidas de cerebros de embriones de rata en la segunda semana de gestación. Se sembraron] x 1 OS células por pocillo, en medio neurobasal (Gibco) suplementado con 10% de FBS y 1 % de gentamicina. Previamente las placas de 6 pocillos se trataron con fibronectina para facilitar la adhesión de las células neuronales. Al cabo de 24 horas se cambió el medio a uno sin suero para evitar que creciesen y proliferasen otros tipos celulares que no fuesen neuronas propiamente dichas y se le añadió el factor 827 el cual favorece la diferenciación y crecimiento de dendritas y axones. Finalmente, las células se mantuvieron en cultivo 8 días a 37°C en atmósfera de C02 al 5% antes de ser utilizadas para los experimentos.

1.2 Cultivos organotípicos

Se prepararon a partir de cortes coronales de 400 J.lm de grosor del hipocampo y corteza entorrinal de ratas Spraguc-Dawlcy de 2-3 días de edad [Cavalierc F. el al.; 2005. Ncuroscicncc;136(3):615-23]. Los cortes se adhirieron a membranas Milliccll CM (Millipore, Schwalbach, Alemania) y se mantuvieron en medio de cultivo HME al 75% (Cel! Concept, Berlin, Alemania), L-glutamina (Biochrom, Berlin, Alemania) 2 mM , 25% de suero de caba llo (Gibco) y 25 mg/ml de gentamicina durante 3 días a 37°C. Posteriormente, los cultivos se cambiaron a medio neurobasal suplementado con B27 al 0,5% (ambos de Gibco). Los ensayos de toxicidad se llevaron a cabo en cultivos de 7 días que se incubaron con oligómeros del péptido (1-42)AP durante 72 horas en presencia o au sencia de Rottlerin [3'-[(8-cinamoil-5,7-dihidroxi-2,2-dimetil-2H-Ibenzopiran-6-il)metil]-2',4' ,6'-trihidroxi-5' -metilacetofenona]. La mu erte cel u I ar se evaluó mediante incubación con ioduro de propidio (10 llM) durante 2 horas a 37°C. Finalmente, los cu ltivos se examinaron mediante fluorescencia (luz de excitación a 510560 nm; emisión a 610 nm) empleando un filtro de rodamina en un microscopio invertido (CeH Observer, Zeiss). Las imágenes se adquirieron con una cámara CCD (ORCA; Hamamatsu, Barcelona) y se analizaron con sofware Axovision (Zeiss).

1.3 Transfección de SN474:I por electroooración

Para consegu ir la mayor eficiencia de transfección por este método, se necesita que las células se encuentren en fase de crecimiento exponencial y que el pase no sea muy reciente. Las células se tripsinizaron, se contaron, se lavaron con PBS (solución salina tamponada por fosfatos) y se centrifugaron. Se resuspendieron a razón de 5x I 06 en 200 JlL del medio de crecimiento completo enfriado previamente en hielo y se pusieron en la cubeta de electroporación también enfriada previamente en hielo. Se añadieron a cada cubeta 10 Jlg del ADN a transfectar, y se colocaron las cubetas en el hielo. Las células se sometieron a un único pulso eléctrico de 260 V Y 950 ).1F (Elcctroporator BIORAD) y las cubetas se volvieron a colocar en el hielo. Realizando todo el procedimiento en frío, se consigue que los poros en las membranas celulares permanezcan abiertos y que penetre así el ADN con mayor facilidad. Posteriormente, las células transfcctadas se colocaron en placas de 100 mm en las que había 10 mi de medio de crecimiento completo prccalcntado a 37°C. Las células permanecieron sin cambiar el medio durante 24 horas, tras las cuales fueron lisadas con buffer de Lacrnli 2X si lo que se desea es ver la expresión de las proteínas sobreexpresadas, o fueron sometidas a ayuno de suero, si lo que se desea es realizar algún experimento que así lo requiera.

lA Ensayos de activación de las GTrasas de la superfamilia Ras

Los experimentos de precipitación por afinidad de Ras, Rho, Racl y Cdc42, se llevaron a cabo utilizando proteínas de fusión GST (glutatión-S-transferasa) que tiene el dominio de unión específico para cada una de ellas (RBD); así se utilizó GST-RBD de Raf para Ras, GST-RBD de Rhotekin para RhoA, GST-RBD de PAKI para Rael y GST-RBD de WASP para Cdc42. La determinación del estado de activación de estas GTPasas se llevó a cabo de la siguiente manera: las células transfectadas O no fueron estimuladas o no como se indica en el capítulo de resultados. Tras la est imulación, las células se lavaron con PBS y se lisaron como ya se había descrito anteriormente [Maillet, Robert et al. 2003 Nat Cell Biol. Jul;5(7):633-639]. Los lisados se centrifugaron a 4°C durante 15 min a 14.500 rpm y se incubaron durante I hora a 4°C con 50 llg de proteína de fusión previamente acoplada a bolas de glutatión sefarosa. Las proteínas precipitadas fueron disociadas de las bolas utilizando un buffer de carga 2X SDS-PAGE y fueron ana lizadas por inmunoblot. Las bandas inmunoreactivas fueron visualizadas con ECL (General Eleetrie Healtheare).

1.5 Preparación del péptido (1-42)AB

La preparación del péptido se realizó de acuerdo con el protocolo descrito por Klein y col. [Klein W.L et al.; 2001 Brain Res 24(4):219-24] para formar ADDLs (del inglés "A~-Dcrived Diffusible Ligando"). El péptido (1-42)A~ (Bachem) se retiró del congelador y se puso en hielo para preparar el stock. Se colocó en hielo HF1P

(1, 1, 1,3,3,3,-hexafluoro-2-propanol) (Sigma) y se dejó enfriar. Se añadió HFIP al vial que contenía 1 mg del péptido (1-42)AP para obtener una concentración de 1 mM. Se incubó a temperatura ambiente hasta su completa disolución manteniendo el via l cerrado, ya que el HF1P es altamente volátil. Cuando el péptido se había solubilizado por completo. se puso en hielo durante 15 minutos. Una vez transcurrido ese tiempo, se hicieron alícuotas de la solución y se dejaron los tubos sin cerrar en una campana de extracción toda la noche para permitir la evaporación del HFIP. Se secaron los tubos en el Spccdvac durante 10 minutos para eliminar los restos de HFIP por completo. El stock se guardó a -800C. Se hizo un stock de péptido (1-42)AP a 5 mM en dimetilsulfóxido (DMSO) 100% asegurando la completa resuspensión del péptido (este stock se debía preparar cada vez que se necesitase, ya que no se podía guardar el péptido en DMSO porque se formarían protofibrillas). Se diluyó esta mezcla en medio Ham's F12 sin rojo fenol (PromoCell), la concentración máxima en esta disolución fue de 100 ).1M. Esta solución se incubó a 5°C durante 24 horas, posteriormente se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 minutos en frío, y se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo. Este sobrenadante era la preparación de ADDLs, que se iba a utilizar para los experimentos.

1.6 Ensayos para la determinación de la toxicidad y muerte celular por el pértido (1

421AB

1.6.1

Ensayo de la reducción del MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5

difeniltetrazolio]

La muerte neuronal fue cuantitativamente evaluada mediante el ensayo del MTT

[Mosmann T. et aL; 1983 J Immunol Methods 65(1-2):55-63]. Para ello, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 104 células por pocillo. Al día siguiente se lavaron y se cambiaron de medio para mantenerlas 24 horas en medio sin FBS. Transcurrido ese tiempo, se sometió a las células a los diferentes tratamientos con los inhibidores y el péptido (1-42)A~, y se mantuvo el tratamiento durante 24 horas. Para realizar el ensayo, se utilizó el kit de MTT de Promega (CcllTiter 96 Non-Radioactive cell proliferation assay kit) según las recomendaciones del fabricante: La medida espectrofotométrica se realizó en un lector de microplacas. En cada ensayo se realizaron todas las condiciones por triplicado; además, cada estudio se repitió un mínimo de 3 veces. Los valores obtenidos se transformaron en porcentajes dando el valor 100% de

viab ilidad a la absorbancia neta de las células control. El resto de valores correspondientes a los distintos tratamientos, se presentan como porcentajes sobre el

control.

1.6.2 Ensayos de apoptosis mediante doble marcaje con ¡oduro de propidio y ancxina V para citornctría de flujo

Para realizar los ensayos con anexÍna V se utilizó un kit de SD (FITC AnncxÍn V Apoptosis detection kit) en el que la anexina V estaba combinada con el f1uorocromo FITC. Para estos experimentos se cultivaron las células SN4741 en placas de 100 mm de diámetro a una densidad de 3x 106 células por placa. Al día siguiente, se sometieron a ayuno de FBS durante 24 horas, y una vez transcurrido este tiempo, se realizaron los distintos tratamientos con los inhibidores, con el péptido ( 1-42)A~ O con el vehículo, y se incubaron las células durante 24 horas. Al finalizar la incubación, las células se lavaron 2 veces con PBS, se tripsini zaron, y se recogieron en tubos de 15 mL. Las células se centrifugaron y se lavaron 2 veces con PBS frío para retirar los restos de tripsina, que puede interferir con la marcación con anexina V, se contabilizaron y se resuspendieron en la solución de anexina Va razón de Ixl06 células/mL. De esta solución, se cogieron 100 .!J.L Yse pasaron a un tubo de citometría tapado con papel aluminio para proteger las células de la luz, y se añadieron 5 ~lL de anexina V y 5 ~lL de ioduro de propidio, se agitó suavemente y se dcjó incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos protegido de la luz. La adquisición de los datos en el citó metro debe realizarse dentro de la hora posterior a la realización del marcaje.

La citometría de flujo permitió diferenciar y cuantificar las distintas poblaciones formadas por células vivas (AnV-/PJ-), células apoptóticas tempranas (AnV+/PI-) y células apoptóticas avanzadas o necróticas (AnV+/PI+).

2. Resultados

El péptido (l-42)A~ es uno de los actores principales que intervienen en el proceso de muerte neuronal en los cerebros de los pacientes con la enfermedad de Alzheimer. Del mismo modo, un gran número de líneas celulares de origen neuronal, también son sensibles al tratamiento con este péptido [Loo D.T. et al. 1993 Proc Natl Aead Se; U S A 90(17):7951-5; Allen J. W. el al.; 1999. Neuropharmacology 38(8): 1243-52; Xu J. S. et al.; 2001. J Neurosei 21( 1):RC I18; Lee J. T. et al. 2004. J Cell Biol 164( 1): 123-31) Y la mayor o menor sensibilidad a la toxieidad del péptido (142)AP es dependiente del tipo celular [Gschwcnd M. H. et al.; 1995 J Neurochcm 65(1):292-300; Simakova S. B. et al.; 2007. J Neurosei 27(50): 13719-29]. Lo primero que se estudió fue si la línea neuronal SN4741, proveniente de la Sustancia Nigra de ratón, era sensible a la toxicidad inducida por el tratamiento con el péptido (l-42)Ap.

El proceso de muerte en las células SN4741 fue cuantitativamente evaluado mediante el ensayo del MTT, una medida de la actividad mitocondrial [Mosmann T. et al.; 1983 J ¡mmunol Methods 65(1-2):55-63]. El MTT es una sal de tetrazolio hidrosolublc que se reduce a formazán al ser mctabolizado por las dcshidrogcnasas rnitocondrialcs de las células viables. El formazán solubilizado se puede medir cspcctrofotométricarncntc a una longitud de onda de 570 nm, correlacionando la absorbancia obtenida con la viabilidad celular.

El pépt ido ( 1-42)A~ se preparó para formar ADDLs según el procedimiento descrito en el apartado de Materiales y Métodos. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 104 células por pocillo. Al día siguiente se lavaron y se cambiaron de medio para mantenerlas 24 horas en med io sin FBS. Transcurrido ese tiempo, se sometió a las células a concentraciones creci.entes del péptido (1-42)A~ como se indica en la Figura I y se mantuvo el tratamiento durante 24 horas. Para realizar el ensayo, se utilizó el kit de MTT de Promega (CelITiter 96 Non-Radioactive cell proliferation assay kit) según las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se retiró el med io y se añadieron I 00 ~LL de medio fresco sin FBS y 15 J.!L de la solución de MTT y se incubaron las células durante 5 horas a 37°C en atmósfera de C02al 5% para permitir que las células viables realizasen la reacción metabólica descrita. Posteriormente, se añadieron IDO J.-LL de la solución de solubilización que lleva DMSO y se dejó toda la noche a 37°C para disolver los cristales de formazán formados. La detenninación espectro fotométrica se realizó en un lector de microplacas y los valores obtenidos se transformaron en porcentajes dando el valor del 100% de viabilidad al control.

Como puede verse en la Figura 1, las células SN4741 son sensibles a la toxicidad inducida por el péptido (1-42)A~. La viabilidad celular, medida como actividad mitocondrial, disminuye como consecuencia de la exposición al péptido (1

42)A~ durante 24 horas, y la toxicidad aumenta de manera dependiente de la dosis, a

concentraciones mayores de péptido, se produce una mayor muerte celular.

La determinación de la toxicidad celular mediante colorimetría permite detectar

porcentaje de células viables, sin embargo, no permite discriminar si las células muertas

5

mueren por necrosis o por apoptosis. Por lo tanto, para discriminar entre apoptosis y

necrosis, se utilizó la tinc ión con Ancx ina V comb inada con ¡oduro de propidio y

posterior análisis por citomctría de flujo, ya que esta técnica permite la detección de la

apoptosis mediante la pérdida de asimetría de la membrana en las células apoptóticas.

Las células viables mantienen una asimetría entre la cara externa e interna de la

ID

membrana plasmática, de modo que la fosfat idilserina se observa só lo en la cara interna.

Esta asimetría de membrana se mantiene por la acción de los enzi mas denominados

tlipasas. La fos fatidil seri na tiene la habilidad de translocar a la cara externa de la

membrana plasmát ica en determinadas condic iones, como sucede al inic io de la

apoptosis, sirviendo como diana de reconocimiento específica para los macrófagos que

15

deben fagocitar a las células en degeneración. De este modo, la detección de la

fosfatidi lserina en la cara externa de la membrana puede servir como ind icador de

apoptosis.

Para realizar los ensayos con Anexina V, se utilizó un kit de SD (FlTC Annexin

V Apoptosis detection kit) en el que la Anexina Y estaba combinada con el tluorocromo

20

FITC (isotioc ianato de fluoresccína). Para estos experimentos se cultivaron las célu las

SN474 I en placas de IDO mm de diámetro a una densidad de 3xl06 células por placa. Al

dia sigui ente, se sometieron a ayuno durante 24 horas, y una vez transcurrido este

tiempo, se les trató con el péptido (1-42)A~ o el vehículo, y se incubaron las células

durante 24 horas. Al finalizar la incubación, las células se lavaron 2 veces con PBS, se

25

tripsin izaron, y se recogieron en tubos de 15 mL. Las célu las se centrifugaron y se

lavaron 2 veces con PBS frío para retirar los restos de tripsina, que puede interferir con

la marcación con Anexina Y, se contabi lizaron y se resuspendieron en la solución de

Anex ina Y a razón de 1 x I 06 células/mL. De esta solución, se cogieron 100 ).lL Yse

añad ieron 5 ).lL de Anexina Y y 5 ).lL de ioduro de propidio, y se dejó a temperatura

30

ambiente durante 15 minutos protegido de la luz. La adqu isición de los datos en el

citómetro se realizó dentro de la hora posterior a la realización del marcaje.

El péptido (1-42)AP induce la apoptosis en las células SN474 1 (Figura 2). En los paneles superiores se observan dot plots de las células control (izquierda) y las células tratadas con el péptido (1-42)AP (derecha). El eje de abscisas corresponde a las células marcadas con ioduro de propidio y el eje de ordenadas, las marcadas con Anexina V. Al utilizar a la vez los tluorocromos FlTC (AnexinaV-FlTC) (AnV/F1TC) y el ioduro de propidio (Pl) se pueden diferenciar y cuantificar las distintas poblaciones formadas por células vivas (AnV-/PJ-) en el cuadrante Q3, células apoptóticas tempranas (AnV+/PJ-) en el cuadrante Q4 y células apoptóticas avanzadas o nceróticas (AnV+/PI+) en el cuadrante Q2 (Figura 2).

Además, se puede observar que la población celular en las condiciones control (panel superior izquierdo) se encuentra predominantemente en el cuadrante Q3, que corresponde a la población viable, mientras que el tratamiento con el péptido (l-42)A~ (panel superior derecho), induce la apoptosis temprana y tardía detectada como un aumento de las células Anexina Y positivas en los cuadrantes Q2 y Q4. En los paneles inferiores de la Figura 2, se muestran las curvas de la Anexina Y, separando las poblaciones Anexina V negativas o viables (P2) y Anexina Y positivas o apoptóticas (P3). Los valores corresponden a la cantidad de eventos registrados en cada una de estas poblaciones, representados como porcentaje del total. Se puede observar que el tratamiento de las células SN474 I con el péptido (l-42)AP produce un incremento de la apoptosis de más de un 30%.

Una vez comprobado que las células SN474 I eran sensibles a la toxicidad celular inducida por péptido (l-42)A~, se concluyó que, por lo tanto, esta línea celular era un buen modelo neuronal por su procedencia de la sustancia negra para el estudio de las vías de señalización que conducen a la muerte celular mediada por el péptido ( 142)Ap.

Para poder estudiar con más detalle el efecto que el péptido (1-42)A~ ejercía sobre la activación de Rac 1, se determinó tanto la cinética de activación como las concentraciones necesarias para activar a Rac 1. Para ello, se trataron las células con concentraciones crecientes del péptido (l-42)A~ tal como se indica en la Figura 3. La Figura 3A muestra la curva dosis-respuesta realizada en las células SN4741, en la cual, se puede observar que la activación de Rac I es dependiente de la concentración del péptido (1-42)Ap. La concentración mínima del péptido que produce la máxima activación de Rael es 1,25 ~LM. Este resultado se confirmó en cultivos primarios de neuronas, en los que también se pudo observar que la dosis mínima de péptido (1-42)AP para inducir la máxima activación de Rae I es 1,25 pM (Figura 3B).

Por otra parte la activación de Rae 1 med iada por el péptido (1-42)A~ se inició a los 15 minutos de exposición al péptido, y alcanzó su máxima activación a los 30 minutos para posteriormente ir disminuyendo hasta retornar a los niveles basales a los 60 minutos (Figura 4A). Estos resultados se confirmaron utilizando otro modelo celular como es la línea de ncuroblastoma IMR32 y en la que se obtuvieron resultados similares, el péptido (1-42)AP activaba Rae 1 siendo la máxima activación al cabo de 30 minutos de tratamiento (Figura 4B).

Estos resultados mostraban por primera vez que el tratamiento con el péptido (142)A~ sobre las monocapas de líneas celulares neuronales y cultivos primarios de neuronas inducía la activación de Rac 1, Y ésta era dependiente tanto del tiempo como de la concentración de péptido. En base a esto, se abordó el estudio de la caracterización de las cascadas de señalización que utiliza el péptido (I-42)A~ para activar a Racl y que probablemente están relacionadas con la muerte celular.

Para caracterizar la potencial vía de señalización que conduce a la activación de Rael, se empezó por estudiar una de las grandes fami lias de serintreonin quinasas implicadas en la señalización intracelular temprana como son las PKCs, para lo cual se utilizó un inhibidor farmacológico, concretamente GFI09203X (GF) [3-[1-[3(dimetilamino )propil]-I H-indo 1-3-il]-4-( IH-indo 1-3-il)-IH-pirrolil-2,5 -d iona)].

Las células SN4741 fueron pre-tratadas durante I hora con GF I J.!M, posteriormente se realizó el tratamiento con el péptido (J-42)A~ durante 30 minutos. Transcurrido el tiempo de tratamiento, las células se lavaron 3 veces con PBS frío y se lisaron con el tampón de lisis para realizar una precipitación por afinidad con el dominio RED del efector PAK. Las muestras fueron separadas mediante SDS-PAGE y transferidas a membranas de nitrocelulosa. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando el anticuerpo anti-Rac l. La Figura 5 muestra que, el tratamiento en las células SN4741 con el GF, bloqueaba la activación de Racl , lo que sugería que la activación de la OTPasa Racl por parte del péptido (1-42)A~ requeria la activación de la fami lia PKC.

Al igual que ocurría en las células SN4741 , el prctratarniento de las monocapas de cultivos primarios con el inhibidor GF, bloqueaba la activación de la GTPasa Rae 1 mediada por el péptido (1-42)AP (Figura 6). Estos resultados sugieren que la familia PKC podría estar implicada en las vías de señalización que el péptido (l-42)AP induce

5 y que conllevan la activación de la GTPasa Rae l.

Para comprobar si se pueden activar las PKCs con ésteres de forbol y ver si Rae I se activa, las células SN4741 se mantuvieron en ayuno de suero durante 24 horas, y tras el tratamiento con GF durante 1 hora, las células se trataron con Forbol-12miristato 13-acctato (PMA -del inglés "Phorbol 12-myristate 13-acctatc") I ~lM

10 durante 15 minutos. Como se puede observar en la Figura 7, el PMA media en la activación de Rac l y al pre-tratar las células SN474 l con el GF, y estimular después con PMA, la activación de Rac! no se indujo (Figura 7A) [lo que corroboraba los resultados de que la familia de las PKCs podría estar implicada en la vía de señalización iniciada por el péptido (l-42)AP y que conduce a la activación de Racl]. Se realizó la

15 misma aproximación experimental en neuronas primarias de rata y los resultados obtenidos mostraron que la activación de Rac 1 era dependiente de la actividad de las PKCs, ya que utilizando GF se bloqueaba la activación de esta GTPasa (Figura 78).

Por otro lado, para estudiar la posible implicación de PI3K en la muerte celular causada por el péptido (I-42)AP, las células SN474 1 se pre-trataron durante 1 hora con 20 2-morfolin-4-il-8-fenilcromen-4-ona (L y 294002 o, en ocasiones, "L y" en esta descripción) 20 ~LM, un inhibidor de la PI3K, y posteriormente se realizó el tratamiento de 30 minutos con el péptido ( 1-42)AP (1 ,25 ~LM). Transcurrido este tiempo, se colocaron las placas sobre hielo, se lavaron las células 3 veces con PBS frío y se li.saron con el tampón de lisis para rea lizar una precipitación por afinidad con el dominio

25 efector de PAK (Ras binding domain de PAK (RBD)). Las muestras fueron separadas mediante SDS-PAGE y transferidas a membranas de nitrocelulosa y las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando el anticuerpo anti-Rac l.

Los resultados obtenidos muestran que el pretratamiento de las monocapas con Ly bloqueaba la activación de Rael mediada por el péptido (1-42)AP (Figura 8 panel 30 izquierdo). Al igual que ocurría en la línea celular SN474! , también en los cultivos primarios de neuronas se producía una inhibición de la activación de la GTPasa Rac!

mediada por el péptido (1-42)A~ tras el pretratamicnto de las células con Ly (Figura 8, panel derecho). Estos resultados mostraban que la PI3K se encontraba dentro de la vía de señalización que utiliza el péptido (1-42)AP para activar la GTPasa Rae l.

Para establecer cuál era el orden jerárquico entre estas dos kinasas, PI3K y PKC, se analizó el estado de fosforilación de PKD. PKD es una serin trconin kinasa sustrato de la familia de las PKCs, y por lo tanto, se fosfofila cuando estas kinasas se activan. En la Figura 8 tercer panel se puede observar que el tratamiento con el péptido (1-42)AP de las células SN4741 , como en las neuronas primarias, produce una fosforilación de PKD y que esta fosforilación se ve inhibida cuando las monocapas celulares son pretratadas con el inhibidor de PI3K y posterionnente expuestas al péptido ( 1-42)Ap. Este resultado significaba, por una parte, que tanto la PJ3Kinasa como las PKCs se encontraban en la misma ruta de señalización que conducía a la activación de Rac 1 y, por otra parte, que la PJ3K se encontraba por encima de PKC en la vía de señalización.

Para explicar la conexión entre PI3K y PKC se estudió una de las moléculas que potencialmente tienen capacidad para unir a estas dos kinasas: otra proteína con actividad enzimática, la kinasa dependiente de fosfoinositoles, PDK l . PDK J es sustrato de PJ3K y que a su vez, es activadora de las PKCs.

Para verificar la hipótesL>; de que ambas kinasas PI3K y PKC se encontraban conectadas mediante PDKI , se procedió a utilizar OSU-03012 (OSU) un inhibidor farmacológico de esta última kinasa. Para ello, las células SN474 l se mantuvieron en ayuno de suero durante 24 horas, al cabo de las cuales se realizó un pretratamiento con OSU 10 fIM , posteriormente se trataron con el péptido (l-42)AP (1,25 fIM) durante 30 minutos y se realizaron ensayos de precipitación por afinidad para comprobar el estado de activación de la GTPasa Rac!. Como se puede observar en la Figura 9 (panel izqui erdo), el inhibidor de PDK l bloqueaba la activación de Rae I mediada por el péptido (1-42)AP, lo que apuntaba a que PDKI estaba implicada en la ruta de señalización que conducía a la activación de Rac l y potencialmente actuaba como vínculo entre PI3K y PKC en esta vía. Estos ensayos se realizaron también en cultivos primarios de neuronas procedentes dc cerebros de embriones de rata. Los resultados obtenidos con estos cultivos primarios (Figura 9 -panel derecho), son consistentes con los obtenidos para las células SN474 l : la activación de la GTPasa Rac 1 por el péptido (1-42)A~, se ve inhibida al pretratar las células con OSU; por tanto, se puede concluir

que PDKI forma parte de la cascada de señalización que desencadena el péptido (142)AP Y que conduce a la activación de Rael, y que su función en esta vía seria la de ejercer de puente entre PJ3K y PKC. Ya que el pretratamicnto de las monocapas celulares con OSU y posterior tratamiento con el péptido (l-42)A~, el inhibidor de

5 PDKI bloquea la fosforilación de PKD, se pone una vez más de manifiesto que las PKCs están por debajo de la ruta de señalización gobernada por PI3KJPOK l.

Con estos resultados se propone, tal y como muestra la Figura 10, una novedosa cascada de señalización que descifraría cómo el péptido (1-42)AP media en la activación de Rae l yen esta ruta se verían implicadas las kinasas Pl3Kinasa, POK I y la

10 familia de proteína kinasa C.

Para tratar de establecer si esta vía de señalización intervenía en la muerte celular causada por el péptido (1-42)AP, se decidió estudiar la implicación de PI3K, Akt y PDKI en este proceso de muerte celular. Para ello, las células SN4741 se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 105 células por pocillo y al día siguiente se les

15 sometió a ayuno de suero permaneciendo así 24 horas antes de añadir los diferentes tratamientos. En todos los casos, los pre-tratamientos con los diferentes inhibidorcs se mantuvieron durante las 24 horas de tratamiento posterior con el péptido (1-42)Ap.

Como puede observarse en la Figura 11, los inhibidores Ly y AkUI, produjeron un descenso de la viabilidad per se ya que son por sí mismos tóxicos para las células. 20 Esto se podría deber a que I,a vía PI3KJAKT es una de las principales vías de regulación de la supervivencia en muchos tipos celulares, entre ellos en las neuronas, si se tratan las células con inhibidores farmacológicos de PI3K y AKT, el bloqueo de la actividad basal de estas kinasas puede ser suficiente para que las células entren en un proceso de muerte. Por el contrario, la inhibición de la actividad de PDKI no modificó la viabilidad 25 celular por lo que PDK l parece tener un espectro de acción más reducido que PI3K y/o Akt sobre la supervivencia celular ya que bloqueando su actividad basal no se manifestó toxicidad. Se observó que el inhibidor de PDKI (OSU) prevenía el efecto tóxico inducido por el péptido (1-42)AP, pasando de ser la viabilidad celular de un 50,28% en las células tratadas con el péptido (1-42)A~ (1 ,25 ~,M), a un 78,83% en las células

30 prctmtadas con OSU (1 ¡tM). p<O,OOI. De estos resultados se deduce que PDKI estaría relacionada con vías implicadas en la muerte celular y POKI podría ser una diana con potencial terapéutico ya que

5.

bloqueando su actividad se prevenía la muerte neuronal inducida por el péptido (142)Ap.

Por otro lado, se estudió cuál cra el potencial grado de implicación de las PKCs en este proceso de muerte celular regulado por la acumulación del péptido (l-42)Ap. Para ello, las células se pretrataron con el inhibidor GF durante I hora, y posteriormente se realizó el tratamiento con el péptido (l-42)AP (1 ,25 ~lM) durante 24 horas. Como se muestra en la Figura 12, el prctratamicnto de las células SN4741 con GF, fue capaz de proteger de la toxicidad causada por el péptido (1-42)Ap. La viabilidad celular en las células tratadas con el péptido (1-42)AP (1,25 ¡.¡.M) fue del 50,28%, Y esta viabilidad aumentó mediante el prctratamicnto con GF hasta alcanzar un 77,96% en las células pre-tratadas con GF (5 [tM).

Estos datos sugerirían, al igual que para PKD 1, que las PKCs estarían interviniendo de manera activa en la cascada de señalización que desembocaba en la muerte celular mediada por el péptido (1-42)AB, por lo que se observó, por primera vez, que bloqueando su actividad mediante el uso de inhibidorcs farmacológicos específicos, se podía revertir el fenotipo de muerte.

También se determinó el papel de Rae 1 en este proceso de muerte celular mediado por el péptido (l-42)Ap. Las monocapas se pretrataron con 6-mercaptopurina (6-MP) durante 1 hora y posteriormente durante 24 horas de tratamiento con el péptido (l-42)Ap. En la Figura 13, se puede observar que, de la misma manera que ocurría cuando se inhibían PDK 1 Y PKCs, la inhibición de Rac l en estas condiciones hizo que las células SN474 1 resistieran a la acción tóxica del péptido (1-42)A~. La viabilidad aumentó desde un 50,28% en las células tratadas con el péptido (1-42)A~, hasta un 75,5 1 % al pre-tratar las monocapas con 6-MP (5 ~lM). Estos resultados indican que la GTPasa Rac I podría ser, al igual que POK 1 y la familia de las PKCs, una potencial diana tempéutica que retrasara o bloqueara los efectos de la acumulación del péptido (142)Ap.

Para verificar estos resultados se procedió a cuantificar la apoptosis mediante tinción combinada con ioduro de propidio y Anexina V y se analizaron las muestras por citometría de flujo, ya que ésta es una metodología más específica y precisa para cuantificar apoptosis.

Como se puede observar en la Figura 14A, el tratamiento con el péptido (142)AP a una concentración de 1,25 )lM durante 24 horas produjo un incremento de la apoptosis en las células SN4741 que alcanzó así un 37,88%. Cuando las células se pretrataron con los inhibidores farmacológicos de PDKI, PKC, y Racl, se consiguió

5 proteger al 100% a las células del daño inducido por el péptido (1-42)A~, ya que la viabilidad alcanzó unos valores similares a aquellos de las células control sin tratar. Estos resultados indican que la toxicidad inducida por el péptido (I-42)AP en las células SN4741 , se puede bloquear in vil1'o bloqueando las actividades de PDKI , PKCs y Rae 1.

Este res ultado, es muy importante ya que demuestra que la cascada de

10 señalización descrita en estos experimentos interviene en la toxicidad celular inducida por el péptido (1-42)A~ y que las moléculas implicadas en esta vía, son potenciales dianas terapéuticas que pueden proteger a las monocapas de la muerte celular inducida por el péptido ( 1-42)A~.

El hecho de que GF fuera capaz tanto de inhibir la activación de Rac I como de

15 proteger a las células de la toxicidad inducida por el péptido (1-42)A~, llevó a los inventores a descartar las PKCs atípicas como las posibles implicadas en esta cascada de señalización, ya que este inhibidor es específico de las PKCs clásicas y nuevas [Toullec D. et al. 1991 J Biol Chem 266(24): 15771-81; Mal1iny-Baron G. et al. 1993 J Biol Chcm 268(13):9194-7; Jacobson P. et al. 1995 J Pharmacol Exp Thcr 275(2):995

20 1002; Coultmp S. et al. 1999 J Phannacol Exp Ther 290( 1): 76-82]. Por lo tanto, estos resultados indican que las PKCs implicadas pudieran ser las clásicas o las nuevas y se planteó realizar los ensayos de toxicidad por MTT con distintos inhibidores más específicos para las distintas isoformas. Para ello, se utilizó G6 6967, un inhibidor de las PKCs clásicas, principalmente a y ~; y el inhibidor

25 Rottlerin, que inicialmente se describió como un inhibidor selectivo de la PKC nueva o [Gschwendt, M. et al. 1994 J Neurochem 65(1):292-300], sin embargo, posteriormente se vio que también tenía efecto sobre PKC e[Villalba M. et al. 1999 J Immunol 163( 11 ):5813-9; Cordey and Pikc 2006 J Neurochem 96( 1 ):204-17].

El pretratamiento de las células SN4741 con concentraciones crecientes de G6 30 6967, produjo un aumento en la viabilidad celular del 13% (Figura 14 B). La viabilidad aumentó de un 50,28% en las células tratadas con el péptido (l-42)A~ hasta un 63,07%

en las células pre-tratadas con 00 6967 (4,5 nM), sin embargo, este aumento no fue significativo según el análisis estadístico por T de Studcnt. A continuación, se procedió a tratar las monocapas celulares con diferentes concentraciones de Rottlcrin y a determinar su efecto sobre la viabilidad celular

5 mediante ens,ayos de MTT. Como puede observarse en la Figura 15, con una concentración de 1,5 )lM de Rottlcrin, no se apreciaba ningún efecto ni posi tivo, protección, ni negativo, toxicidad. En el otro extremo a una concentración de 30 ~LMde Rottlcrin, esta concentración pe,. se resultaba tóxica para las células SN4741 . A concentraciones que van desde 7,5 a 15 ¡.tM se observó un efecto protector absoluto,

10 llegando a ser la viabilidad celular la misma que las monocapas control, no tratadas. A esas concentraciones, la viabilidad pasó de un 50,28% en las células tratadas con el péptido ( 1-42)AP y a un 90-95% en las células tratadas con Rottlerin.

Para verificar estos resultados se procedió a cuantificar la apoptosis mediante tinción combinada con ioduro de propidio y Anexina V y se analizaron las muestras por 15 citometría de flujo, ya que ésta es una metodologia más específica y precisa para cuantificar apoptosis. Las células SN474 I se pre-trataron con Rottlerin 7,5 ).lM durante l hora, y posteriormente se indujo la apoptosis tratando con el péptido (1-42)AP (1 ,25 ¡.tM) durante 24 horas. Una vez transcurrido este tiempo, se realizó la tinción mediante ioduro de propidio y Anexina V y la apoptosis se analizó por citometría de flujo. Como 20 puede observarse en la Figura 16, el pre-tratamiento de las células SN4741 con el inhibidor Rottlerin, tuvo un efecto protector total frente a la apoptosis inducida por el péptido (1-42)AP, y la viabilidad de las células SN474 l fue completa. La apoptosis inducida por el péptido (1-42)AP fue de un 43,52% y mediante el pretratamiento con Rottlerin 7,5 ).lM, esta apoptosis se redujo hasta alcanzar los niveles basales de las

25 células sin tratamiento (15,15%).

Estos resultados confirman la implicación de las PKCs en la cascada de señalización que conduce a la muerte celular inducida por el péptido (1-42)Ap. Una vez demostrada esta implicación, estos resultados muestran por primera vez que estas moléculas pueden ser potenciales dianas terapéuticas que sirvan para frenar O bloquear

30 la muerte celular inducida por el péptido (I-42)A~. Para consolidar este resultado y ver si Rottlerin tenía también efecto sobre la activación de Rac! mediada por el péptido ( 1-42)AP, se procedió a realizar ensayos de

precipitación por afmidad. Para ello, se pre-trataron las células SN474 1 con Rottlerin 15

¡.cM durante I hora, y posteriormente se añadió péptido ( 1-42)A~ ( 1,25 ¡.cM) durante 30

minutos. Transcurrido ese tiempo, se procedió a real izar los ensayos de precipitación

por afinidad con las proteínas de fu sión que ll evan e l dominio CRIB de la proteína

5

efectora Pak. La Figura 17 muestra que el prctratamicnto de las células SN4741 con

Rottlerin bloqueaba la activación de la GTrasa Rae I mediada por el péptido ( 1-42)AP

sugiriendo la implicación de las nuevas PKCs, en la activación de la GTrasa Racl

inducida por el péptido (1-42)AP, e implicando a Rae 1 en la cascada de muerte celular

regulada por dicho péptido (1-42)A~.

lO

Con objeto de determinar si estos resultados podían reproducirse en condiciones

más fi siológicas, se procedió a estudiar los efectos de la inhibición de las nuevas PKCs

en cultivos organotípicos de hipocampo y corteza entorrina!. Ambas estructuras

cerebrales son vulnerables en los estadías iniciales de la enfermedad de Alzheimer. Los

cultivos organotípicos procedían de ratas de 4 días, se extrajo el cerebro y se realizaron

15

cortes del tejido cerebral que pennanecieron 7 días in vitro. Transcurrido ese período de

tiempo, se añadió el péptido (J -42)AP a una concentración de J00 nM y se mantuvo con

este tratamiento durante 72 horas. Los cortes de cerebro se tiñe ron con ioduro de

propidio, que no es permeable para las membranas de células vivas y solamente puede

penetrar al interior de las células cuando la membrana celular pierde su integridad en el

20

proceso de muerte celular. El ioduro de propidio que penetra en las célu las se intercala

en el ADN emitiendo fluorescencia roja con un máximo a 6 10 nm cuando son excitadas

a una longitud de onda de 540 nm. Los núcleos de las cé lulas qu e han perdido la

integridad de su membrana, se tiñen, por tanto, con el ioduro de propidio y emiten

fluorescencia que se pued e visualizar, y, consecuentemente, medir y cuantificar la

25

muerte celular. Los cultivos organotípicos de hipocampo y corteza entorrinal se trataron

a 2 concentraciones diferentes del inhibidor Rottlerin: 2,5 y 7,5 ~lM (Figura 18).

Como se muestra en la Figura 18, una concentración de 7,5 J.!M de Rottlerin

protege de la muerte ce lular inducida por el péptido (J-42)AI3 tanto en cultivos

organotípicos de hipocampo como en corteza entorrinal. Estos resultados confirman, de

30

manera más fisiológica la implicación de las nuevas PKCs en la señalización inducida

por el péptido ( 1-42)A~ que conduce a la muerte neuronal.

Estos resultados describen por primera vez cómo el péptido (1-42)A~ transduce la señales de muerte celular a través de la ruta PI3Kinasa/PDK l/nuevas PKCs/Rac l/muerte neuronal, esta caracterización ha permitido proponer a PDK 1, a las nuevas PKcs y a Rael como dianas terapéuticas para frenar el proceso de mue rte

neuronal dirigido por el péptido (1-42)AP (Figura 19).

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Uso de un inhibidor de POK 1 para producir un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada a la formación de depósitos ami lo ideos, en donde dicho inhibidor de PDKI es celecoxib o un derivado de ceJecoxib mostrado en la Tabla I (Grupo XI).

2. 2.

   Uso según la reivindicación 1, en el que dicha enfermedad asociada a la formación de depósitos amiloideos es la enfennedad de Alzheimer, la demencia asociada a los cuerpos de Lewy, al sÚldrome de Down, al complejo de la demencia de Guam asociada al parkinsonisl1lo, a la hemorragia cerebral hereditaria del tipo holandés con amiloidosis, angiopatía p-amiloide y hemorragia cerebral tal como hemorragia cerebral debida a angiopatía amiloide cerebral solitaria osteomielitis, tuberculosis, fiebre mediterránea familiar, hemorragia cerebral hereditaria, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, espondilitis anquilosante, infecciones por priones, enfermedad de Creutzfeldt·Jacob, diabetes tipo n, enfermedad de Castleman, amiloidosis asociada al mieloma múltiple, enfermedad de Parkinson, parkinsonismo panencefalítico esclerosante subagudo, parkinsonismo posencefalítico, encefalitis pllgilística, complejo parkinsonismo· demencia de Guam, enfermedad de Pic~ atrofia sistémica múltiple (ASM), parálisis supranllclear progresiva (PSP) y degeneración corticobasal (DCB), síndrome de Down, enfermedad de cuerpos de Lewy, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, Kuru, e nfermedad de Gersmann·Straüssler·Scheinker, amiloidosis cardiaca senil, polineuropatia familiar amiloidótica, o amiloidosis asociada a tumores endocrinos como el carcinoma medular del tiroides.

3. 3.

   Uso según la reivindicación 2, en el que dicha enfermedad asociada a la fonnación de depósitos amiloideos es la enfermedad de Alzheimer.

4. 4.

   Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho medicamento

   reduce la muerte neuronal inducida por el péptido (l-42)AI3 en el sistema nervioso

   central (SNC).

5. 5.

   Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho inhibidor

   de PDKI se usa combinado con otro fármaco útil para e l tratam iento de la

   enfermedad de Alzheimer.

6. 6.

   Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho inhibidor

   de PDK 1 está pre sente en un ve hí cul o de admini stración de fárma cos

   famlacéuticamente aceptable.

7. 7.

   Uso seglll1 una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el inhibidor de

   P D K 1 e s 2-amino-N-( 4-(5-(2-fenantrenil)-3-(trilluorometil)-1 Hpirazol-l

   il)fenil)acetamida (OSU-03012).

8. 8.

   Un método para la identificación de un compuesto capaz de inhibir la muerte

   celular inducida por depósitos amiloideos para el tratamiento de enfermedades

   asociadas a la fonnación de depósitos amiloideos, que comprende:

   a) poner en contacto una célula con una proteína amiloidea;

   b) poner las células resultantes de a) con un compuesto candidato~ y

   e) detemúnar en dicha célula los ni veles de activación de PDKl,

   en donde si los niveles de activación de PDKl en la célula después de haber sido

   tratada con un compuesto candidato son menores que antes del tratamiento, el

   compuesto candidato es capaz de inhibir la muerte celular neuronal inducida por

   proteínas amiloidcas y útil para el tratamiento de enfermedades asociadas a la

   fonllación de depósitos amiloideos.

   30

9. 9.

   Método según la reivindicación 8, en el que dichas enfe rmedades son enfennedades asociadas a la formación de depósitos ami lo ideos del péptido beta amiloide y la proteína amiloidea es un péptido beta amiloide.

10. 10.

    Método según la reivindicación 9, en el que el péptido beta amiloide es el péptido (1-42)Ap.

11. 11.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que, adicionalmente, se detenninan los niveles de muerte celular o viabilidad del cultivo.