ES2385157B1 - Compuestos para el tratamiento de alzheimer. - Google Patents

Abstract

Compuestos para el tratamiento de Alzheimer.#Los compuestos inhibidores de PKCs pueden ser utilizados para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos, entre las que se encuentra la enfermedad de Alzheimer. Los niveles de activación de dichas PKCs en una célula tratada con una proteína amiloidea pueden ser utilizados para identificar compuestos capaces de inhibir la muerte celular inducida por depósitos amiloideos potencialmente útiles en el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos.

Description

COMPUESTOS PARA EL TRATAMIENTO DE ALZHEIMER

CAMPO DE LA INVENCiÓN

La invención se encuadra dentro del campo de las enfermedades ocasionadas por la acumulación de depósitos amiloideos, más concretamente, en el campo de la identificación de nuevas dianas terapéuticas y el desarrollo de nuevas terapias para estas enfermedades .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La amiloidosis es un término genérico, utilizado para hacer referencia a un grupo de enfermedades de etiología diversa y pronóstico y tratamiento variables, con una característica común: todas ellas están causadas por el depósito extracelular de un material, denominado material amiloidc, de naturaleza proteica, insoluble y resistente a la protcolisis. Uno de los múltiples péptidos que aparecen en los acúmulos o depósitos amiloideos es el péptido beta-amiloide (~-amiloide. AB o A~) que proviene de la proteína precursora amiloidea (APP, del inglés "Amyloid Precursor Protein").

Estudios in vill'o indican que el procesamiento por la vía no amiloidogénica de la APP (sAPPa) puede actuar como señal autocrina para estimular la proliferación y adhesión celular y apoyar el crecimiento nervioso en células pe 12. Sin embargo, si la APP se procesa por la vía amiloidogénica, se genera un péptido de 39-43 aminoácidos, concretamente el péptido beta-amiloide (péptido ~-amiloide o péptido A~) al que se le ha señalado como el factor neurotóxico primario en la patogenia de procesos neurodegenerativos, e.g., Alzheimer. Dicho péptido, in vitro, es tóxico para células endote\iales, células musculares lisas, astrocitos, neuronas y oligodendrocitos. Los mecanismos por los que el péptido A~ ejerce su acción citotóxica no están definidos aunque todo apunta a que los procesos oxidativos pueden estar implicados en la generación de esta toxicidad induciendo la muerte celular.

Se ha relacionado la presencia de depósitos de péptido A~ en el cerebro con numerosas enfermedades, tales como la enfermedad de Alzheimer (EA), pérdida de memoria, síntomas de défic it de atención asociados con la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Alzheimer de tipo cuerpos de Lewy difusos, deterioro cognitivo leve, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis de tipo holandés, angiopatía ~-amjloide y hemorragia cerebral tal como hemorragia cerebral debida a angiopatía amiloide cerebral solitaria, infecciones por priones, diabetes tipo 11, demencias degenerativas, incluyendo demencias de origen degenerativo y vascular mixto, demencia frontotemporal, demencia presenil, demencia senil, demencia asociada con el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA), trastornos parkinsonianos tales como la enfermedad de Parkinson (EP), parkinsonismo pancnccfalítico esclcrosantc subagudo, parkinsonismo posencefalítico, encefalitis pugilística, complejo parkinsonismodemencia de Guam, la enfennedad de Piek, atrofia sistémica múltiple (ASM), parálisis supmnuclcar progresiva (PSP), degeneración corticobasal (DCB), síndrome de Down, la enfermedad de cuerpos de Lewy, la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple y enfermedades neurotraumáticas tales como accidente cerebrovascular agudo, epilepsia, trastornos del estado de ánimo tales como depresión, esquizofrenia y trastornos bipolares, isquemia, lesión cerebral, especialmente lesión cerebral traumática, inflamación y enfennedades inflamatorias crónicas.

En la actualidad, los esfuerzos se centran en descubrir las posibles cascadas de señalización que podrían estar mediadas por el péptido A~. Hay varias vías de señalización que podrían estar implicadas en el daño celular y que parecerían activarse por el péptido A~. Por ejemplo, parece claro que los efectos del péptido A~ están asociados con estrés oxidativo, disfunción mitocondrial, alteración de la homeostasis del ci+,generación de NO, activación de la microglía y otras. Sin embargo, aún existe controversia en la explicación de la relación causal o la secuencia exacta de estos eventos.

En cultivos neuronales primarios, los oligómeros de péptido A~ y los ligandos difusibles derivados del péptido AP (ADDL, del inglés "Ap-derived diffusible ligands") pueden unirse con avidez a receptores de membrana o regiones específicas de membrana plasmática neuronales e inducir muerte celular rápida a través de la ruta apoptótica mitocondrial. Por el contrario, las fibri llas de péptido A~ parecen inducir una fonna más crónica de distrofia neurítica y muerte neuronal. Se han asociado los rápidos efectos tóxicos del péptido A~ con un efecto pro-oxidante del péptido y pueden mediarse en parte a través de RAGE (del inglés "Receptor for Advaneed Glyeation End products" o receptor para productos finales de glicosilación avanzada). El péptido A~ también puede inducir apoptosis a través de la activación de caspasas y calpaína. Otro

mecanismo de toxicidad puede implicar la activac ión aberrante de la re-entrada del ciclo

celular en neuronas, que se ha obsclVado en cultivos ne uronales tratados con péptido AP

y en la EA. Se conoce poco sob re los fa ctores qu e reg ulan la generac ión de agregados

de péptido Ap tóxicos en el cerebro envejecido, aunque estudios recientes sugieren

5

posib les pape les para la se ña lizació n del factor I de crecimiento similar a la

insulina/insulina (J GF-I) y la horn costasis del calc io. Otra clase de rutas de señali zación

acti vadas por el péptido Ap está implicada en la respuesta inflamatoria de la microglía.

Los depósitos amiloid eos están estrechamente asoci ados con acti vación de la microglí a

en la EA yen ratones transgénicos para APP [para una revisión veáse Yankner B.A. &

lO

Lu T. 2009. Journal of Bio logica l Chemistry 284 (8): 4755-4 759].

En W009/087568A se describen composiciones que compre nden compuestos,

tales como quercetina, kaemfenol y bipigenina, que reduce n la mu erte neuronal causada

por la ex posición al pépt ido Ap.

En US5948800A se describe el uso de drogas para prevenir o tratar la EA;

15

dichas drogas contienen el compuesto activo 2-fe ni l-l ,2-benzisoselenazo l-3(2H)-ona,

cuyo efecto se basa en la reducción de la toxicidad neuronal causada por el péptido Ap.

En US2002 1 02259 se describe un método para inhibir los efectos del péptido Ap

en el cerebro de un anima l que comprend e la adm ini stración de un compuesto qu e

modu la de manera efecti va la acti vidad de CD45.

20

Por tanto, debido a la participación del pépt ido AP en múltiples enfermedades,

ex iste una necesidad de identificar nuevas dianas así como compuestos que actúen sobre

di chas di anas para desa rroll ar agentes terapéuticos que redu zcan de manera efi caz la

muerte celular provocada por la deposición del péptido Ap.

25 COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Ahora, los inventores han observado usando modelos celulares y organotípicos de la enfennedad de Alzheirner (EA) que el péptido (1-42)AP provoca la muerte celular. Los in ventores han observado que sorprendentemente, dicho péptido (1-42)AP transduce la señales de muerte celular a través de la ruta PI3Ki nasa/PDKl/nuevas

30 PKCs/Rac l/muerte neuronaL Los inventores han propuesto a POK 1, a las nuevas PKCs ya Racl como dianas terapéuticas para frenar el proceso de muerte celular y neuronal dirigido por el péptido ( 1-42)A~.

Los inventores también han observado cómo la activación de la GTPasa Racl por el péptido (1-42)AP se ve inhibida al prc-tratar las células con inhibidorcs de PKCs nuevas (Figura 5 y 6), lo que pone de manifiesto que las PKCs forma parte de la cascada de señalización que desencadena el péptido (1-42)A~ y que conduce a la activación de Rae l.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con el uso de un inhibidor de una PKC, como agente neuroprotector, para producir un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas a la fonnación de depósitos amiloideos.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de un compuesto capaz de inhibir la muerte celular inducida por depósitos amiloideos para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos ami lo ideos que comprende:

a) poner en contacto una célula con una proteína ami loidea;

b) poner las células resultantes de a) en contacto con un compuesto candidato; y

c) detenninar en dicha célula los niveles de activación de PKC,

en donde si los niveles de activación de PKC en la célula después de haber sido tratada con un compuesto candidato son menores que antes del tratamiento, el compuesto candidato es capaz de inhibir la muerte neuronal inducida por proteínas amiloideas y útil para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloidcos.

BREVE DESCRlPCION DE LAS FIGURAS

La Figura l es un diagrama de barras que muestra la toxicidad cel ular causada por el péptido (1-42)AP en células SN474 l determinada por un ensayo de toxicidad celular mediante MTT (3-4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium); la gráfica muestra la toxicidad celular inducida por concentraciones crecientes del péptido tras 24 horas de tratamiento. En la figura se representan las medias de 3 experimentos independientes y las barras de error se han calculado mediante la desviación estándar de los valores.

La Figura 2 muestra la apoptosis inducida por el péptido (I-42)A~ en células SN474 1. Mediante tinción con ioduro de propidio y anexina Vy posterior análisis por citometría de flujo, se puede corroborar que las células SN4741 son sensibles al pépt ido (1-42)A~. que produce un incremento de las células apoptóticas que son positivas para la tindón con Ancxina V. En los paneles superiores se observa un dot plot de las células control (izquierda) y tratadas con el péptido (1-42)AP (derecha). El eje de abscisas corresponde a las células marcadas con joduro de propidio y el eje de ordenadas corresponde a las células marcadas con Anexina V. En los paneles inferiores, se muestran las curvas de la Anexina V, separándose las poblaciones Ancxina V negativas O viables (P2) y Anexina V positivas o apoptóticas (P3). Los valores corresponden a la cantidad de eventos registrados en cada una de estas poblaciones, representados como porcentaje del total. Se muestra un resultado representativo de tres experimentos independientes.

La Figura 3 muestra los resultados de la curva dosis-respuesta de activación de Racl por el péptido (l-42)AP en células SN4741 (A) y en cultivos primarios de neuronas (B); la dosis mínima de péptido (1-42)AP a la que se encuentra un efecto sobre la activación de Rac l es 1,25 J.lM. La figura que se muestra es representativa de 3 experimentos independientes.

La Figura 4 muestra la cinética de activación de RacJ por el péptido (J-42)AP en 2 líneas celulares neuronales, las células SN474 1 (A) e IMR32 (B); en ambos casos la mayor activación de Rael se produce tras 30 minutos de exposición al péptido (142)Ap. La figura muestra resultados representativos de 3 experimentos independientes.

La Figura 5 muestra la implicación de PKC en la activación de Racl por el péptido (I-42)AP; las células SN474 1 fueron pretratadas con GF (un inhibidor fannacológico de las PKCs) 1 ~LM Y posterionnente tratadas con péptido (1-42)AI3 1,25

J.l.M. Se realizaron ensayos de precipitación por afinidad para estudiar la activación de Rac 1, seguidos de Western blot anti-Rac 1. El resultado mostrado es representativo de tres experimentos independientes.

La Figura 6 muestra la implicación de PKC en la activación de Rac 1 por el péptido (1-42)AI3; los cultivos primarios de neuronas fueron pretratadas con GF I09203X (a partir de ahora lo denominaremos GF) 1 ~lM Y posterionnente tratadas con péptido Ap 1.25 J.l.M. Se realizaron ensayos de precipitación por afinidad para estudiar la activación de RacJ , seguidos de Western blot anti-RacJ. El resultado mostrado es representativo de tres experimentos independientes.

La Figura 7 muestra la implicación de PKC en la activación de Rael; las células SN4741 (A) y los cultivos primarios de neuronas (B) fueron prctratadas 1 hora con GF 1 ~lM. Y posteriormente tratadas con PMA 1 ~LM durante 15 minutos, para inducir la activación de las PKCs. Posteriormente se estudió la activación de Rae 1 mediante ensayos de precipitación por afinidad. El resultado mostrado es representativo de tres experimentos independientes.

La Figura 8 muestra la implicación de PI3K en la activación de Racl por el péptido (1-42)AP; las células neuronales fueron pretratadas con Ly 294002 (un inhibidor farmacológico de PI3K, denominado a partir de ahora " Ly") 20 ~lM, Y posteriormente tratadas con 1,25 ~LM de péptido (l-42)A~. Se realizaron ensayos de precipitación por afinidad para estudiar la activación de Rac 1, seguidos de Western blot anti-Racl en células SN474 I (panel izquierdo) y en cultivos primarios de neuronas (panel derecho). La figura muestra un resultado representativo de tres experimentos independientes.

La Figura 9 muestra a PDKI como el vínculo entre PI3K y PKC; al inhibir la kinasa PDK I con su inhibidor farmacológico OSU 03012 (denominado a partir de ahora OSU), tanto la activación de Rac 1 como la fosforilación de PKD mediada por el péptido (1-42)AP se ve inhibida -este efecto se puede observar tanto en células SN474 I (panel izquierdo) como en cultivos primarios de neuronas (panel derecho).

La Figura 10 esquematiza la cascada de señalización que emplea el péptido ( 142)AP para mediar en la activación de la GTPasa Rac 1 en neuronas.

La Figura 1I es un diagrama de barras que muestra la implicación de la vía PI3K1PDKl/AKT en la toxicidad celular inducida por el péptido (1-42)AP; las células SN4741 se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 105 células por pocillo; al día siguiente se sometieron a ayuno de suero durante 24 horas antes de añadir los diferentes pre-tratamientos de I hora con los inhibidores de P13K, AKT Y PDKI; posteriormente se trataron con péptido (1-42)AP 1,25 ).lM durante 24 horas y la toxicidad se analizó mediante ensayos de MTT. Los valores se calcularon como porcentajes sobre el control sin tratar. En la figura se representan las medias de 5 experimentos independientes y las barras de error se han calculado mediante la desviación estándar de los valores.

La Figura 12 es un diagrama de barras que muestra la inhibición de las PKCs en la toxicidad neuronal inducida por el péptido (1-42)AP; las células SN4741 se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 105 células por pocillo; al día siguiente se sometieron a ayuno de suero durante 24 horas antes de añadir los diferentes prctratamientos de 1 hora con distintas concentraciones O dosis de GF, un inhibidor de las PKCs; posteriormente se trataron con péptido (1-42)A¡3 1 ,25 ~durante 24 horas, y la toxicidad se analizó mediante ensayos de MTT. Los valores se calcularon como porcentajes sobre el control sin tratar. En la gráfica se representan las medias de 5 experimentos independientes y las barras de error se han calculado mediante la desviación estándar de los valores.

La Figura J 3 es un diagrama de barras que muestra la implicación de la inhibición de Racl en la toxicidad neuronal mediada por el péptido (l-42)Aj3; las células SN4741 se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 105 células por pocillo; al día siguiente se sometieron a ayuno de suero durante 24 horas antes de añadir los diferentes pretratamientos de 1 hora con distintas dosis de 6-mercaptopurina (6-MP), que inhibe la activación de la GTPasa Racl; posteriormente se trataron con péptido (142)Aj3 1,25 JlM durante 24 horas, y la toxicidad se analizó mediante ensayos de MTT. Los valores se calcularon como porcentajes sobre el control sin tratar. En la gráfica se representan las medias de 5 experimentos independientes y las barras de error se han calculado mediante la desviación estándar de los valores.

La Figura 14 es un diagrama de barras que muestra el efecto de los inhibidores de PKC, POK l y Racl en la apoptosis neuronal inducida por el péptido (1-42)Aj3 (A); las células SN474 1 fueron pretratadas con GF 1 J.!M, OSU I JlM y 6-MP 5 J.!M, y su efecto sobre la apoptosis inducida por el péptido (l-42)Aj3 se estudió mediante tinción con ioduro de propidio y Anexina V y aná lisis por citometría de flujo. La gráfica presenta la apoptosis y la viabilidad celular como porcentaje; se muestran los valores medios y las desviaciones estándar de 3 experimentos independientes presentadas como barras de elTor. También se muestra la implicación de las PKCs clásicas en la toxicidad inducida por el péptido (1-42)AP (B). Las células SN474 1 se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 105 células por pocillo; al día siguiente se sometieron a ayuno de suero durante 24 horas antes de añadir los diferentes pretratamientos de 1 hora con distintas dosis de 06 6967 (en adelante 06) un inhibidor de las PKCs clásicas; posteriormente se trataron con péptido (1-42)Aj3 1,25 J.!M durante 24 horas, y la toxicidad se analizó mediante ensayos de MTT. l<>s valores se calcularon como porcentajes sobre el control sin tratar. En la gráfica se representan las medias de 5 experimentos independientes y las barras de error se han calculado mediante la desviación estándar de los valores.

La Figura 15 es un diagrama de barras que muestra la implicación de las PKCs nuevas o y e en la toxicidad inducida por el péptido (1-42)AP; las células SN474 1 se sembraron en placas de 96 pocillos a mzón de lOS células por pocillo, al día siguiente se sometieron a ayuno de suero durante 24 horas antes de añadir los diferentes pretratamientos de 1 hora con distintas dosis de Rottlerin, un inhibidor selectivo de las PKCs nuevas o y 9; posteriormente se trataron con péptido (l-42)AP 1 ,25 ~lM durante 24 horas, y la toxicidad se analizó mediante ensayos de MTT. Los valores se calcularon como porcentajes sobre el control sin tratar. En la figura se representan las medias de 5 experimentos independientes y las barras de error se han calculado mediante la desviación estándar de los valores.

La Figura 16 es un diagrama de barras que muestra la implicación de las PKCs nuevas en la apoptosis inducida por el péptido (l-42)A~; las células SN474 l fueron pretratadas con Rottlerin 7,5 ).lM y su efecto sobre la apoptosis inducida por el péptido A~ se estudió mediante tinción con ioduro de propidio y Anexina V y análisis por citometría de flujo. La gráfica presenta la apoptosis y la viabilidad celular como porcentaje; se muestran los valores medios y las barras de error se han calculado mediante la desviación estándar de los valores de 3 experimentos independientes.

La Figura 17 muestra la impli cación de las nuevas PKCs en la activación de Racl inducida por el pé ptido (1-42)A~ en células SN4741 ; las célu las fu eron pretratadas con Rottlerin 15 ~LM Y su efecto sobre la activación de Rac l inducida por el péptido (1-42)A~ 1,25 ).lM se estudió mediante ensayos de precipitación por afinidad. Las bandas inmunorreactivas fueron visualizadas utilizando un anticuerpo anti-Racl. Los resultados que se muestran son representativos de 3 experimentos independientes.

La Figura 18 muestra la implicación de las isofonnas nuevas 8 y ede PKC en la toxicidad celular inducida por el péptido ( J -42)A~ en cultivos organotípicos de cerebro. Los cultivos organotípicos de hipocampo (A) y de corteza entorrinal (B) se trataron con péptido (1-42)A~ 100 nM. En el panel inferior se observa la fluorescencia emitida por unión del ioduro de propidio al ADN en las células que han perdido la integridad de la membrana plasmática en el proceso de muerte celular. C-control sin tratar; 0tratamiento con péptido (1-42)AP 100 nM; E-Rottlerin 2,5 fLM; F-Rottlerin 7,5 ¡tM. ECx, corteza cerebral cntorrinal; CA 1 Y CA2-3, regiones hipocampalcs CA 1, CA2 y CA3; DG, giro dentado.

La Figura 19 muestra la caracterización de la ruta de señalización que emplea el 5 péptido (l-42)A~ para inducir muerte neuronal.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN Usos terapéuticos Los autores de la presente invención, usando líneas celulares de origen neuronal,

10 tales como las células SN4741 (Figura 2), y cultivos organotípicos de cerebro (Figura 18), han observado que el péptido (l-42)AP induce muerte celular. Los inventores han observado que, sorprendentemente, dicho péptido (1-42)AP transduce las señales de muerte celular a través de la ruta PI3K1PDK llnucvas PKCslRacllmucrtc neuronal y han propuesto a dichas PI3A, POKI, nuevas PKCs, y Racl como potenciales d ianas

15 terapéuticas para frenar el proceso de muerte neuronal dirigido por el péptido (l-42)A~. Asimismo, los inventores han comprobado que la inhibición de PKC en neuronas tanto en líneas celulares como en cultivos primarios bloqueaba la activación de Rac 1 mediada por el péptido (1-42)AP (Figuras 5 y 6), lo que apunta a que las PKCs, y especialmente las PKCs nuevas, están implicadas en la ruta de señalización que conduce a la

20 activación de Rac I y potencialmente actúa como vínculo entre PDK I Y Rac I en esta vía (Figuras 16 y 17). Como puede observarse en la figura 16, el pre-tratamiento de las células SN474 I con el inhibidor Rottlerin, tuvo un efecto protector total frente a la apoptosis inducida por el péptido (l-42)A~, y la viabilidad de las células SN474 I fue completa. La apoptosis inducida por A~ fue de un 43,52% y mediante el pretratamiento

25 con 7,5¡.IM Rottlerin, esta apoptosis se redujo hasta alcanzar los niveles basales de las células sin tratamiento (15,15%). Por otro lado, como se puede observar en la Figura 14A, el tratamiento con el péptido ( 1-42)A~ a una concentración de 1,25 ~lM durante 24 horas produjo, un incremento de la apoptosis en las células SN4741 alcanzándose un 37,88%; sin

30 embargo, cua ndo las células se pre-trataron con los inhibidores farmacológicos de PDK 1, PKC y Rac 1 correspondientes, se consiguió proteger al 100% de las células del daño inducido por el péptido (1-42)A j3, ya que la viabilidad alcanzó unos valores

similares a aquellos de las células control (sin tratar). Estos resultados indican que la

toxicidad inducida por el péptido (1-42)AP en las células SN474 l se puede bloquear in

vitro bloqueando las actividades de PDK I, PKCs y Rael.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con el uso de un inhibidor de

5

una PKC para producir un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas

a la formación de depósitos am iloidcos. En una realización particular, dicho inhibidor

de una PKC actúa como agente neuroprotector para el tratamiento de enfermedades

asociadas a la formación de depósitos amiloideos de péptido Ap.

En el contexto de la presente invención se entiende por "inhibidor de una PKC"

1 O

a un compuesto que disminuye la actividad de una o varias PKCs en contacto con dicha

proteína, así como cualquier sustancia o compuesto que sea capaz de impedir o bloquear

la transcripción y la traducción del gen que codifica una PKC (es decir, impedir o

bloquear la expresión de dicho gen), o que sea capaz de imped ir que la prote ína

codificada por dicho gen realice su func ión (actividad).

15

En la presente invención, se entiende por " PKC" (o "Proteína kinasa C"), o, en

p lural, PKCs, a los miembros de una familia de enz imas que están involucradas en

controlar la función de otras proteínas a través de la fosforilación de grupos hidroxilo

de residuos de aminoácidos de serina y treonina en dichas proteínas . Las PKCs están

divididas en tres grupos en base a la estructura y a los requerimientos de co-factores.

20

(Jaken, S. 1996. Curro Opino Cell Bio!. 8: 168):

las isoformas clásicas (o convencionales) de PKC (cPKC) requieren

diacilglicerol (DAG), Ca2+ y fosfatidilserina (PS) para una óptima actividad

e incluye PKC-a (PRKCA), PKC-pl (PRKCBI), PKC-pll y PKC-y

(pRKCG);

25

las formas nuevas de PKCs (nPKC) incluyen las isoformas PKC-o

(PRKCD), PKC-¡; (PRKCE), PKC-~ (PRKCH) y PKC-9 (PRKCQ); estas

PKCs nuevas requieren DAG y PS pero no Ca2+; y

las formas PKCs atipieas, que incluyen PKC-, (PRKCI), PKC-¡; (PRKCZ),

PK-N l (PKN 1) Y PK-N2 (PKN2), se unen a PS pero son insensibles a Ca' · y

30

DAG.

A pesar de que las distintas isoformas poseen diferentes requerimientos de

cofactores, ex isten pocas diferencias en la especificidad in vitro del sustrato.

La estructura de las PKCs consiste en un dominio regulador y un dominio catalítico. La región catalítica está altamente conservada ente las diferentes iso formas. Los diferentes requerimientos de segundos mensajeros de las diferentes iso formas son resultado de la región reguladora, que es similar entre los miembros de una clase. La región reguladora del término amino de las PKCs contiene diferentes regiones compartidas. El dominio el, presente en todas las iso formas de PKC tiene un sitio de unión para DAG así como análogos no fisiológicos llamados ésteres de forbe l. El dominio e2 actúa como un sensor de Ca2 + y está presente en las PKCs clásicas y en las PKCs nuevas pero solo es funcional en las clásicas. La región de pseudosustrato, que está presente en las tres clases de PKCs es una secuencia pequeña de aminoácidos que mimetiza el sustrato y se une a la cavidad de unión al sustrato en el dominio catalítico mantenie ndo la enzima inactiva. Cuando ci+ y OAG están presentes en concentraciones suficientes, se unen a CI y C2 respectivamente y la PKC es reclutada a la membrana. Esta interacción da como resultado que el dominio pseudosustrato se separa del sitio catalítico activándose asi la enzima. Para que estas interacciones ocurran, las proteínas PKCs debe presentar una estructura tridimensional adecuada.

La región catalítica o núcleo catalítico de las PKCs parece que está localizado en una estructura bilobal con una lámina beta que comprende el extremo N-terminal y una hélice alfa que forma el lóbulo C-terminal. Tanto el sitio de unión a ATP como el de unión a sustrato parece que están localizados en una hendidura formada por ambos lóbulos.

Adicionalmente las PKCs nuevas y las PKCs clásicas presentan tres regiones de fosforilación: el motivo de activación, el dominio "turn" y el dominio hidrofóbico. Las PKC pueden autofosforilarse.

Entre los sustratos de las PKCs se encuentran PKO, las proteínas MARCKS, MAP kinasa, inhibidor del factor de transcripción IKB, receptor de Vitamina 03 OVOR, Rafkinasa, calpaina, y EGFR (epidennal growth factor receptor).

En una realización particular, los inhibidores de PKC son inhibidores de PKCs clásicas. En humanos, las PKCs clásicas comprenden la PKC-a (PRKCA NM_002737.2), PKC-~I (PRKCBI, isoforma I NM_212535.2), PKC-~II (isoforma 2 NM_002738.6) y PKC-y (PRKCG NM_002739.3).

En otra realización particular y preferida, los inhibidores de PKC son inhibidorcs de PKCs nuevas. En humanos, las nuevas PKCs comprenden las PKC-o (PRKCO ¡soforma I NM_006254.3 (SEQ ID NO: 1), ¡soforma 2 NM_212539.1 (SEQ ID NO :2)), PKC-c (pRKCE NM 005400.2 (SEQ ID NO :3)), PKC-~ (PRKCH

5 NM_006255.3 (SEQ ID NO:4)) y PKC-9 (pRKCQ NM_006257.2 (SEQ ID NO:5)).

El término «PKC" tal y como se usa en la presente invención no se refiere únicamente al gen y las proteína humanas sino también a los ortólogos de otras especies como el ratón, de rata etc. Asimismo, el ténnino "PKC", tal y como se usa en la presente invención incluye todas las formas e isoforrnas de PKCs.

10 A modo ilustrativo, no limitativo, entre los agentes inhibido res de la expresión de PKC adecuados para su uso en la presente invención se incl uyen, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido específicos para el gen que codifica una PKC, microARNs específicos, ARNs catalíticos o ribozimas específicos, ARNs de interferencia (ARNips) específicos, ARN con actividad "decoy", es decir, con capacidad para unirse

15 específicamente a un factor (proteico generalmente) importante para la expresión del gen, de manera que la expresión del gen de interés, en este caso PKC sea inhibida, etc. Asimismo, ejemplos ilustrativos, no limitativos, de agentes inhibidores de PKC capaces de impedir que la proteína PKC realice su función incluyen, péptidos inhibidores de PKC, anticuerpos dirigidos específicamente contra epítopos de PKC esenciales para

20 desempeñar su función, como los dominios CI (unión a DAG) y C2 (unión a Ca2+). las regiones de unión a ATP, el sitio de unión al sustrato, las regiones de fosforilación, etc. Se conocen numerosos compuestos químicos (moléculas pequeñas) que reducen la actividad de PKC cuando se ponen en contacto con dicha proteína ["small molecule inhibitors of PKC], por ejemplo, bisindolilmaleimida, chcleritrina) y sus sales,

25 Floridzin, Rottlerin, GF109203X, Go 6976, CGP 41251, etc., los cuales pueden ser utilizados en la presente invención. Adicionalmente, otros compuestos con capacidad de inhibición de la expresión de PKC que pueden ser utilizados en la puesta en práctica de la presente invención incluyen aptámeros y espiegélmeros, es decir, ácidos nucleicos O

o L de cadena sencilla O doble que se unen específicamente a la proteína diana (PKC en

30 este caso), dando como resultado una modificación de la actividad biológica de ésta. Los aptámeros y espiegélrneros tienen una longitud de entre 15 y 80 nucleótidos y, preferiblemente, de entre 20 y 50 nucleótidos. Los compuestos que provocan la reducción de los niveles de ARNm pueden ser identificados usando ensayos estándar para determinar los niveles de expresión de ARNm tales como transcripción rcvcrsareacción en cadena de la polirncrasa (RT-PCR), análisis de protección de ARN, Northem blot, hibridación in situ, microarrays, etc.

Los compuestos que provocan la reducción d.e los niveles proteicos de PKC pueden ser identificados usando ensayos estándar para la determinación de niveles de expresión proteica tales como Western-blot o Western transfer, EUSA ("enzyrne-linked irnmunosorbent assay"), RJA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo de enzima competitivo), DAS-ELISA ("double antibody sandwich EUSA"), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el uso de biochips de proteínas o microarrays que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en la precipitación coloidal en formatos tales como los "dipsticks".

La determinación de la capacidad inhibidora en la actividad kinasa del inhibidor de una PKC puede ser medida usando diferentes ensayos que miden la actividad kinasa de las PKCs. Existen múltiples métodos que pueden ser usados para determinar la activación de kinasas, particularmente de PKCs, conocidos por el experto en la materia. A modo ilustrativo, se puede utilizar la habilidad de la kinasa para fosforilar su sustrato natural [e.g., proteínas conocidas por ser activadas por PKCs incluyen las proteínas MARCKS, MAP kinasa, la PKO, inhibidor del factor de transcripción IKB, receptor de Vitamina 03 o VDR, Raf kinasa, calpaína y EGFR]. También se pueden utilizar métodos basados en la medición de la activación de dichas proteínas conocidas por ser activadas por PKCs. La habilidad de de la kinasa para fosforilar su sustrato puede ser detectada por cualquier método apropiado, por ejemplo, mediante una unión radio/química/fotoquímica de un fosfato y la detección posterior de su incorporación en el sustrato.

Otros ensayos de activación de PKCs están diseñados para identificar la cantidad de PKC activa. Un ejemplo de ensayo de la activación de PKCs es La medición usando el método de "Pull-down", o el basado en la técnica de ELlSA, en donde se mide la activación de las PKCs por medio de luminiscencia. Las técnicas basadas en ELlSA consisten en la incubación de la prueba con una placa que presenta un dominio de fosforilación de una proteína efectora de PKCs. La forma activa de PKCs se unirá a dicho dominio y posteriormente pude ser detectada usando un anticuerpo específico para PKCs.

Alternativamente, se pueden usar bioscnsores basados en la transmisión de energía de resonancia (FRET -del inglés " Forster resonance energy transfer) para medir la activación de PKC en tiempo real. (Jin Zhang & Allen M. D. ; 2007. Molecular bioSystems, vol. 3, nll , pp.759-765).

Otros ensayos para medir la modulación de las kinasas son conocidas por el experto en la materia tales como los descritos en Julianne 1. Sando (Protein Kinase e Protocols. 2003 Humana Prcss) y W012004/0358 I l.

El ténnino "enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos" (o "enfermedades asociadas con amiloidosis" O "enfermedades amiloideas") se refiere a, e incluye, pero no se limita a, enfermedades asociadas con amiloidosis sistémica, local, crónica y senil. Las amiloidosis se caracterizan por los "depósitos amiloidcos" que están constituidos de fibrillas proteicas, conocidas como fibrillas de péptido amiloide, en la región extrace\ular. La enfermedad de Alzheimer (EA) es uno de los ejemplos de amiloidosis más conocidos. Las fibri llas de amiloide tienen una serie de características en común aunque estén formadas por distintas proteínas; todas presentan una morfología alargada, se tiñen con Rojo Congo y presentan un patrón de difracción de rayos X caractelÍstico, llamado patrón "cross-beta". Las fibrillas se forman por la unión cooperativa de moléculas con una cinética de formación característica que incluye una fase inicial más lenta de nucleación y una fase posterior más rápida de elongación O crecimiento.

Se pueden encontrar diferentes tipos de depósitos amiloideos; así, se pueden encontrar:

depósitos de fibri llas de amiloidc que se asocian a la demencia en la EA, a la demencia asociada a los cuerpos de Lewy, al síndrome de Down, al complejo de la demencia de Guam asociada al parkinsonismo, a la hemorragia cerebral hereditaria del tipo holandés con amiloidosis, y a otros procesos similares (en donde el amiloide específico se refiere a la proteína precursora del amiloide O APP);

amiloidosis asociada a la inflamación crónica, por ejemplo, osteomielitis, tuberculosis, fiebre mediterránea familiar, hemorragia cerebral hereditaria, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, espondilitis anquilosante, enfermedad de Castleman, y similares (en donde el amiloide específico se refiere al amiloide del tipo AA o proteína amiloidc A (proteína AA), con una estructura no inmunoglobulinica compuesta por 76 aminoácidos con peso molecular de 8.500 daltons; la proteína AA deriva de un precursor de síntesis hepática denominado "precursor sérico de la proteína amiloide A" (SAP), que circula en plasma unido a la lipoproteína HDL3);

amiloidosis asociada al micloma múltiple, por ejemplo, a discrasias de la células B, y similares, (en donde el amiloide específico se refiere al am iloide del tipo AL, formado por cadenas ligeras de inmunoglobulinas con predominio de las Lambda (A) sobre las Kappa (K), en una proporción 2: 1, con tendencia a fonnar estructuras fibrilares que adoptan una distribución beta plegada);

amiloidosis asociada a la diabetes tipo 2 (en donde el amiloide específico es la amilina del islote pancreático);

amiloidosis asociada a las enfermedades priónicas, por ejemplo, la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, el Kuru, la enfermedad de Gersmann-Straüssler-Scheinker, el "scrapie" animal, y similares (en donde el amiloide específico se refiere al amiloide PrP O proteína prión);

amiloidosis asociada a la hemodiálisis crónica, amiloidosis asociada a la hemodiálisis a largo plazo, al síndrome del túnel carpal, ya otros procesos similares, (en donde el amiloide específico se refiere a la ss2-microglobulina);

amiloidosis cardiaca senil, polincuropatía familiar amiloidótica, y a procesos similares (en donde el amiloide específico se refiere a la transtirretina o prealbúmina); y

amiloidosis asociada a tumores endocrinos como el carcinoma medular del tiroides y a otros procesos similares (en donde el amiloide específico es una variante de la procalcitonina).

El término "formación y/o acumulación u organización molecular del amiloide", en forma de dímeros, oligómeros, protofibrillas, fibrillas, filamentos, ovillos o placas se refiere a, e incluye, pero no se limita, al depósito de varias proteínas insolubles, fibrilares, placas amiloideas de la proteína, proteínas amiloideas, depósitos de amjioide formados por la agregación de "proteínas amiloideas". Por "proteínas amiloideas" se entiende cualquier proteína O péptido insoluble, fibrilar, que resulte en la formación y/o acumulación u organización molecular del amiloide, de placas ami lo ideas o depósitos de amiloide que incluye, sin estar limitado, las proteínas o fragmentos de: APP, amiloide del tipo AA, amiloide PrP, amiloide del tipo AL, ss2-microglobulina, transtirrctina o prcalbúmina, o una variante de la proca1citonina. El término "depósito de amilo ide" se refiere al depósito (acúmulo) extracelular de depósitos formados por la agregación de proteínas amiloideas seguida de la combinación posterior de agregados

5 y/o de proteínas amiloideas, formación de depósitos amiloides y similares.

El término "enfermedades asociadas al depósito amiloidco" se refiere a, e incluye, pero no se limita, enfermedad de Alzheimer, la demencia asociada a los cuerpos de Lewy, síndrome de Down, complejo de la demencia de Guam asociada al parkinsonismo, hemorragia cerebral hereditaria del tipo holandés con amiloidosis,

10 amiloidosis asociada a la inflamación crónica, por ejemplo, osteomielitis, tuberculosis, la fiebre mediterránea familiar, hemorragia cerebral hereditaria, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, espondilitis anquilosante, enfermedad de Castleman, amiloidosis asociada al mieloma múltiple, por ejemplo, a di scrasias de células B y similares, amiloidosis asociada a la diabetes tipo 2, amiloidosis asociada a las enfermedades

15 priónicas, por ejemplo, la enfennedad de Creutzfeldt-Jacob, el Kuru, la enfermedad de Gersmann-Straüssler-Scheinker, el "scrapie" animal, y similares, amiloidosis asociada a hemodiálisis crónica, amiloidosis asociada a la hemodiálisis a largo plazo, síndrome del túnel carpal, amiloidosis cardiaca senil, polineuropatía familiar amiloidótica, amiloidosis asociada a tumores endocrinos como el carcinoma medular del tiroides, etc.

20 En una realización particular, los depósitos amiloideos son depósitos extracelulares de péptido beta amiloide; en una realización concreta, el péptido que fonna los depósitos amiloideos es el péptido (1-42)A~.

La "proteína precursora amiloide" o "APP" es una glicoproteína transmembrana que es sustrato de la familia de proteasas denominadas presilinas. Dependiendo de las 25 proteasas que participen en el procesamiento de la APP se van a generar productos de

reacción con diferente actividad a nivel de la fisiología neuronal.

Por "oéptido beta amiloide" o "péptido AB" se entiende un péptido de 39 a 43 aminoácidos derivado de la APP (APP: SEQ ID NO: 6 NM-000484.3 variante 1, NM_201413.2 variante 2, NM_201414.2 variante 3, NM_OOI 136129.2 variante 5,

30 NM_001l36I30.2 variante 6). En condiciones fisiológicas, este péptido se genera a partir de la APP por medio del procesamiento de la APP por la vía amiloidogénica.

El "pértido 0-42)beta amiloide" o "péptido (l-42)AB" se refiere a un péptido AP compuesto por los primeros 42 aminoácidos resultantes del procesamiento de la APP por la vía amiloidogénica. [Zain Sb et a l., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA. 1988 february; 85(3):929-933].

En una realización particular, las enfermedades asociadas a depósitos ami lo ideos del péptido AP incluyen, pero no se limitan a, EA, pérdida de memoria, síntomas de déficit de atención asociados con la EA, EA de tipo cuerpos de Lewy difusos, deterioro cognitivo leve, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis de tipo holandés, angiopatía p-amiloidc y hemorragia cerebral tal como hemorragia cerebral debida a angiopatía amiloide cerebral solitaria, infecciones por priones, diabetes tipo 11, demencias degenerativas, incluyendo demencias de origen degenerativo y vascular mixto, demencia frontotemporal, demencia presenil, demencia senil, demencia asociada con SIDA, trastornos parkinsonianos tales como la e nfermedad de Parkinson (EP), parkinsonismo panencefalítico esclerosante subagudo, parkinsonismo posencefalítico, encefalitis pugilística, complejo parkinsonismo-demencia de Guam, la enfermedad de Pick, atrofia sistémica múltiple (AS M), parálisis supranuclear progresiva (PSP) y degeneración corticobasal (OC8), síndrome de Oown, la enfermedad de cuerpos de Lewy, la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple y enfermedades neurotraumáticas tales corno accidente cerebrovascular agudo, epilepsia, trastornos del estado de ánimo tales como depresión, esquizofrenia y trastornos bipolares, isquemia, lesión cerebral, especialmente lesión cerebral traumática, inflamación y enfennedades inflamatorias crónicas.

En realizaciones preferidas, dicha enfermedad asociada a depósitos ami lo ideos se selecciona entre la EA, EP, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, accidente cerebrovascular agudo e isquemia.

El término "tratar" o "tratamiento" designa tanto tratamiento terapéutico como profiláctico o medidas preventivas, en el que el objeto es prevenir o frenar (reducir) un cambio fisiológico indeseado o trastorno, tal como la muerte celular asociada a la formación de depósitos amiloideos y más en concreto a la muerte neuronal inducida por el péptido (1-42)A~ en el sistema nervioso central (SNC). Para el fin de esta invención, resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, sin limitación, alivio de síntomas, reducción de la extensió n de la enfermedad, estado patológico estabilizado

,.

(concretamente no empeorado), retardo o freno de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado patológico y remisión (tanto parcial como total), tanto detectable como no detectable. "Tratamiento" puede significar también prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento.

5 Aquellos sujetos que necesitan de tratamiento incluyen aquellos sujetos que sufren ya la afección O trastorno, así como aquellos con tendencia a sufrir la afección O trastorno O aquellos en los que ha de prevenirse la afección o trastorno.

Como "método de tratamiento" se entiende la administración a un individuo en necesidad de dicho tratamiento, de una composición fannacéutica que comprende un 10 inhibidor de una PKC según la invención.

Por "muerte celular inducida por el péptido AS" se entiende la respuesta en forma de muerte de celular por parte de las células que han sido expuestas al péptido Ap. En una realización particular, la muerte celular inducida por el péptido Ap es a través de la ruta PI3KJPKD l/nuevas PKCs/Rac l/muerte celular. En una realización

15 preferida, la muerte celular es muerte neuronal y está inducida por el péptido Ap a través de la ruta PI3KJPKD l/nuevas PKCs/Racl/muerte neuronal.

En una realización particular, dicho inhibidor de una PKC actúa como un agente neuroprotector en el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos asociados al péptido Ap.

20 El término "neuroprotector", tal como aquí se uti liza, se refiere a la atenuación de los efectos de la degeneración o muerte neuronal mediante cualquier mecanismo conocido o por conocer, por ejemplo, necrosis, apoptosis, autofagia, daño oxidativo, deposición de subproductos, pérdida de la arquitectura celular, etc., o a la desaparición de los efectos de la degeneración o muerte neuronal mediante cualquier mecanismo

25 conocido O por conocer, por ejemplo, necrosis, apoptosis, autofagia, daño oxidativo, deposición de subproductos, pérdida de la arqu itectura celular, etc., o a la disminución O desaparición de sus efectos secundarios.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un inhibidor de una PKC para producir un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas a la 30 formación de depósitos ami lo ideos del péptido beta amiloide, especialmente el péptido (1-42)AP, en donde el medicamento reduce la muerte neuronal inducida por el péptido (l-42)AP en el SNC. En una realización particular, el péptido (1-42)AP transduce la

señales de muerte celular a través de la ruta PI3Kinasa/PKD l/nuevas

PKCs/Rac l/muerte neurona l. La Tabla 1 recoge ejemplos ilustrativos, no limitativos, de inhibido res de PKC que pueden ser usados en la presente invención.

Tabla 1 Inhibidores de PKC

Tipo de inhibidor

1

Oligonuclcótido antiscntido específico para la secuencia del gen que codifica una PKC.

11

Enzima de ADN específica para la secuencia de una PKC

111

Ribozima específica para el gen que codifica una PKC

IV

M icroRNA específico para el gen que codifica una PKC

V

ARN de interferencia específico para la secuencia del gen que codifica una PKC, e.g., ARN ip para PKCo [Esper R.M and Loeb JA. 2009. The Joumal ofBiologieal Chemistry, 284, 2625 1-26260 . N .lrie et al. , Bioehem Biophys. Res. Comm., Vo. 298,738 (2002)]

VI

Péptido con capacidad para unirse específicamente a una PKC e inhibir su actividad, c.g.: -el péptido inhibidor de la PKC Beta 11 : Ser-Lcu-Asn-Pro-Glu-Trp Asn-Glu-Thr (SEQ ID NO:7); y -los péptidos inhibidores de l a PK C delta identificados e US6855693 y W02009/111169

VII

Anticuerpo con capacidad para unirse específicamente a una PKC e inhibir su actividad kinasa, e.g., los anticuerpos anti-PKC delta "ab4 143", "ab574 19" [Abcam Inc. Cambridge Massachusetts, EEUU], el anticuerpo GTX93022 [Geztex, San Antonio, Texas, EEUU] así como los descritos por Babinska y col. [A. Babinska, et al. 1996 Am J Physiol Heart Cire Physiol 27 1:H2 134H2144]

VIII

Bisindolilmaleimida

IX X Xl

Wilkinson SE, el aL 1993 Biochem. 1. 294 PI 2):335-7.) Cheleritrina (1 ,2-dimetoxi-12-metil-[ 1,3 ]benzodioxo lo[ 5,6-c ]fenantridin12-io) y sus sales, c.g., cheleritrina cloruro de fónnula H H 0'1 H H Floridzin (1-[2,4-dihidroxi-6-[ (2S ,3R,4S,5S,6R )-3,4,5-trihidroxi6-(hidroxirnctil)oxan-2-il]oxifcnil]-3-(4-hidroxifcnil)propanI-olla) de fónnula Rotterin (mallotoxina o 1-[6-[ (3-acetill-2,4,ú-trihidroxi-5-metilfenil) metil]5,7 -dihidroxi-z,z-dirnctil-2H-l-bcnzopiran-8-il]-3-fcni 1-2-propcn-l-ona) de fórmula

H

X II

GFIOn03X (3-[ 1-[3-(dimetilamino )propiljindo l-3-ilj-4-( 1 H-indol-3il)pirrol-2,5-diona hidrocloruro, de fórmula

XIII

Gb 6976 (12-(2-eianoetil)-6,7, 12, I 3-tetrahidro-1 3-met il-5-oxo-5 Hindolo[2,3-ajpirrolo[3,4-e jearbazol) de fórmula H O N N, CH3

XIV

cap 41251 (4 '-N-bcnzoil staurosporina) de fórmula

~/o H'~, N

N H

1. Oligonuclcótidos antisentido

En una reali zación particular, se utiliza un o ligonuclcótido an liscntido específico

para inhibir la expresión del gen que codifica una PKC, por ejemplo, inhibiendo la

5

transcripción y/o traducción del ácido nuclcico que codifica una PKC (cuya actividad se

desea inhibir). Los oligonucl eótidos antisentido se pueden unir a su diana potencial

mediante comp lcmcntaricdad de bases convenc iona l, 0, por ejemplo, en el caso de

unirse a ADN bicatenario, a través de interacciones específicas en el surco mayor de la

doble héli ce.

ID

Para su empleo en la presente in vención, una construcción que comprende un

ol igonuclcótido antisentido se puede distribuir, por ejemplo, como un plásmido de

expresión que, cuando se transcribe en la célula, produce ARN que es complementario a

al menos una parte única del ARNm celular que codifica una PKC. Alternativamente, la

construcción antisentido es una sonda de oligonucleótidos que se genera ex vivo y que,

15

cuando se introduce en la célu la, produce inhibición de la expresión génica hibridando

con el ARNm y/o secuencias genómicas del ácido nucleico diana. Tales sondas de

oligonucleótidos son preferiblemente oli gonuclcótidos modificados, que son resistentes

a las nucleasas endógenas, por ejemplo, exonucleasas y/o endonucleasas, y que son por

lo tanto estables in vivo. Moléculas de ácidos nucleicos ilustrativas para su uso como

20

oligonucleótidos ant isentido incluyen análogos de ADN de fosforamidato, fosfotionato

y metilfosfonato (véanse, por ejemplo, US5176996, US5 264564 y US5256775).

Adicionalmente, para una revisión de las aproximaciones generales para construir

oligómeros útiles en terapia antisentido véanse, por ejemplo, Van der Krol et al., BioTeehniques 6: 958-976, 1988; Y Stein et al., Caneer Res 48: 2659-2668, 1988.

Respecto al oligonuclcótido antiscntido, son preferidas las regiones de oligodesoxirribonucleótidos derivadas del sitio de inicio de la traducción, por ejemplo, entre -10 y + 1 O del gen diana. Las aproximaciones antisentido implican el diseño de oligonuclcótidos (bien AON o bien ARN) complementarios al ARNm que codifica el polipéptido diana. Los oligonucleótidos antisentido se unirán a los transcritos de ARNm y evitarán la traducción.

También se podrían usar oligonuclcótidos complementarios bien a las regiones 5' Ó 3' no traducidas, no codificantes, de un gen en una aproximación antisentido para inhibir la traducción de ese ARNm. Los oligonucleótidos complementarios a la región 5' no traducida del ARNm deberían incluir el complemento del codón de iniciación AUG. Los oligonuclcótidos complementarios a las regiones codificantes del ARNrn son inhibidores de la traducción menos eficaces pero también se podrían usar según la invención. Si están diseñados para hibridar con la región 5', 3' o codificante del ARNm, los ácidos nuc1cicos antiscntido deberían tencr al menos 6 nucleótidos de longitud y tener preferiblemente menos de alrededor de 100 Y más preferiblemente menos de alrededor de 50, 25, 17 ó 10 nueleótidos de longitud.

Preferentemente, se deben realizar estudios in vitra para cuantificar la capacidad de los oligonucleótidos antisentido de inhibir la expresión génica. Ventajosamente, dichos estudios utilizarán controles que distingan entre inhibición génica antisentido y efectos biológicos no específicos de los oligonucleótidos. También se prefiere que esos estudios comparen los niveles del ARN o proteína diana con los de un control interno de ARN o proteína. Los resultados obtenidos usando los oligonucleótidos antisentido se pueden comparar con los obtenidos usando un oligonuclcótido controL Se prefiere que el oligonuclcótido control sea aproximadamente de la misma longitud que el oligonucleótido a ensayar y que la secuencia del oligonucleótido difiera de la secuencia antisentido no más dc lo que sea necesario para prevenir la hibridación cspecífica a la secuencia diana.

Los oligonucleótidos antisentido pueden ser de AON o ARN o mezclas quiméricas o derivados o versiones modi ficadas de los mismos, de cadena sencilla o de cadena doble. El oligonuclcótido se puede modificar en la base, en el azúcar O en el esqueleto de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, su capacidad de hibridación ctc. El oligonuclcótido puede incluir otros grupos unidos, tales como péptidos (por ejemplo, para dirigirlos a receptores de células huésped) o agentes para facilitar el transporte a través de la membrana celular (Letsinger et al., Proc. Nat!.

5 Acad. Sci. U.$.A. 86: 6553-6556, 1989; Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648652, 1987; W088/0981 O) o la barrcra hcmatoencefálica (W089/l O 134), agentes intercalantes (Zon, Pharm. Res. 1988.5: 539-549). Para este fin. el oligonucleótido puede estar conjugado a otra molécula, por ejemplo, un péptido, un agente transportador, un agente de corte desencadenado por hibridación, ctc.

10 En algunos casos, puede ser dificil alcanzar las concentraciones intracelulares del oligonuclcótido antisentido suficientes para suprimir la traducción de los ARNm endógenos. Por tanto, una aproximación preferida usa una construcción de AON recombinante en la que se coloca el oligonucleótido antisentido bajo el control de un promotor fuerte de poi III o poI 11.

15 Alternativamente, se puede reducir la expresión del gen diana dirigiendo secuencias de desoxirribonucleótidos complementarias a la región reguladora del gen (es decir, el promotor y/o potenciado res) para formar estructuras de triple hélice que previenen la transcripción del gen en las células diana en el cuerpo (Helene et al Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84,1991).

20 En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos antisentido son morfolinos antisentido. En una realización particular, el oligonucleótido antisentido específico tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 1 (J). En otra realización particular, dicho oligonuclcótido antisentido es específico para la secuencia del gen que codifica una

25 PKC nueva, especialmente humana, seleccionadas entre PKC-o isoformas 1 y 2, PKC-E, PKC-~ y PKC-9.

JI. Enzimas de ADN En otra realización particular, se utiliza una enzima de ADN específica para

30 inhibir la expresión del gen que codifica una PKC. Las enzimas de ADN incorporan algunas de las características mecanísti cas ta nto de las tecnologías de los oligonuclcótidos antisent ido como de las tecnologías de los ribozimas. Las enzimas de ADN se diseñan de modo que reconozcan una secuencia diana del ácido nucleico particular (en este caso, la secuencia que codifica a una PKC), parecido al oligonuclcótido antisentido; sin embargo, de forma similar a la ribozima, son catalíticas y cortan específicamente el ácido nucleico diana.

111. Rioozimas

En otra realización particular, se utiliza una ribozima específica diseñada para cortar de fonna catalítica transcritos de un ARNm diana para prevenir la traducción de un ARNm que codifica una PKC cuya actividad se desea inhibir. Las ribozimas son moléculas enzimáticas de ARN capaces de catalizar el corte específico de ARN [para una revisión véase Rossi, 1994. Current Biology 4: 469-471]. La secuencia de las moléculas de ribozima preferiblemente incluye una o más secuencias complementarias al ARNm diana, y la bien conocida secuencia responsable del corte del ARNm °una secuencia funcionalmente equivalente [véase, por ejemplo, US5093246].

Las ribozimas usadas en la presente invención incluyen las ribozimas de cabeza de martillo, las ARN endorribonueleasas, ele. [Zaug el al., 1984. Seienee 224:574-578].

Las ribozimas pueden estar compuestas de oligonucleótidos modificados (por ejemplo, para mejorar la estabilidad, direccionamiento, etc.) y se deberían distribuir a células que expresan el gen diana in vivo. Un método preferido de distribución implica usar una construcción de AON que "codifica" la ribozima bajo el control de un promotor constitutivo fuerte de poi 111 ó poi 11, de modo que las células transfectadas producirán cantidades suficientes de la ribozima para destruir los mensajeros diana endógenos e inhibir la traducción. Puesto que las ribozimas, contrariamente a otras moléculas antisentido, son catalíticas, se requiere una concentración intracelular menor para su eficacia.

En una realización particular, dicha ribozima es específica para el gen que codifica una PKC nueva, especialmente humana, seleccionada entre PKC-o isofonnas I y 2, PKC-B, PKC-~ y PKC-e.

IV. MieroARNs

En otra realización particular, se utiliza un microARN específico para la secuencia que codifica una PKC. Como es conocido, un microARN (miARN O miRNA por sus siglas en inglés) es un ARN monocatenario, de una longitud de entre 21 y 25 nuclcótidos, y que tiene la capacidad de regular la expresión de otros genes mediante diversos procesos, utilizando para ello la ruta de ribointerfcrencia. En una realización particular, el microARN se selecciona del g rupo formado por los microARNs

5 específicos mostrados en la Tabla 1 (IV). En otra realización particular, dicho microARN es específico para el gen que codifica una PKC nueva, especialmente humana, seleccionada entre PKC-o isofonnas I y 2, PKC-E, PKC-T) y PKC-9.

V.ARNi

10 En otra realización particular, se utiliza un ARN de interferencia (ARNi), tal como un ARN de interferencia pequeño (ARNip) específico para la secuencia que codifica una PKC cuya actividad se desea inhibir.

Los ARN de interferencia pequeños o ARNip (siRNA en su denominación en inglés) son agentes capaces de inhibir la ex presión de un gen diana mediante 15 interferencia del ARN. Un ARNip se puede sintetizar químicamente, o, alternativamente, se puede obtener mediante transcripción in vitro o bien se puede sintetizar in vivo en la célula diana. Típicamente, los ARNip consisten en una cadena doble de ARN de entre 15 y 40 nucleótidos de longitud, que puede contener una región protuberante 3' y/o 5' de 1 a 6 nucleótidos. La longitud de la región protuberante es

20 independiente de la longitud total de la molécula de ARNip. Los ARNip actúan mediante la degradación o el silenciamiento post-transcripcional del mensajero diana. Los ARNip pueden ser los llamados shRNA (short hairpin RNA), caracterizados porque las cadenas antipara lelas que fonnan el ARNip están conectadas por una región bucle u horquilla. Los shRNAs pueden estar codificados por plásmidos o virus,

25 particularmente retrovirus, y estar bajo el control de promotores tales como el promotor U6 de la ARN polimerasa 111 . En una realización particular, los ARNip que pueden ser utilizados en la presente invención son sustancialmente homólogos al ARNm del gen que codifica una PKC O a la secuencia genómica que codifica dicha proteína. Por "sustancialmente

30 homólogos" se entiende que tienen una secuencia que es suficientemente complementaria o si milar al ARNm diana, de forma que el ARNip sea capaz de provocar la degradación de éste por interferencia de ARN. Los ARNip adecuados para

provocar dicha interferencia incluyen ARNip fonnados por ARN, así como ARNip que

contienen distintas modificaciones químicas tales como:

ARNip en los que los enlaces entre los nucleótidos son distintos a los

que aparecen en la naturaleza, tales como enlaces fosforotioato;

5

conjugados de la cadena de ARN con un reactivo funcional , tal como

un fluoróforo ;

modificaciones de los extremos de las cadenas de ARN, en particular

el extremo 3' mediante la modificación con distintos grupos

funcionales del hidroxilo en posición 2';

lO

nucleótidos con azúcares modificados tales como restos O-alquilados

en posición 2' tales como 2'-O-rnctilribosa O 2'-O-fluorosibosa;

nucleótidos con bases modificadas tales como bases halogenadas (por

ejemplo 5-bromouracilo y 5-iodouracilo), bases alquiladas (por

ejemplo 7-metil guanosina).

15

Los ARNip y ARNsh que pueden ser utilizados en la presente invención se

pueden obtener usando una serie de técnicas conocidas para el experto en la materia. La

región de la secuencia de nucleótidos que codifica una PKC que se toma como base

para diseñar los ARN ip no es limitante y puede contener una región de la secu encia

codificante (entre el codón de iniciación y el codón de tenninación) o, alternativamente,

20

puede contener secuencias de la región no traducida 5' o 3', preferentemente de entre 25

y 50 nucleótidos de longitud y en cualquier posición en posición sentido 3' con respecto

al codón de iniciación. Una fonna de diseñar un ARNip implica la identificación de los

motivos AA(N19)TT, en donde N puede ser cualquier nucleótido en la secuencia que

codifica una PKC, y la selección de aquellos que presenten un alto contenido en G/C. Si

25

no se encuentra dicho motivo, es posible identificar el motivo NA(N21), en donde N

puede ser cualquier nucleótido.

En una realización particular, el inhibidor de una PKC es un ARNi específico

para una PKC, tal como los ARNip específicos para PKC6 descritos por Esper & Loeb

O por Iri e y col. [Esper R.M & Loeb JA. 2009. The Journa! of Biologica! Chemistry,

30

284:26251-26260; Irie N. el al., Biochcm Biophys. Res. Comm., Vol. 298:738 (2002)] .

2.

En otra realización particular, dicho ARNi es específico para la secuencia del gen que codifica una PKC nueva, especialmente humana, seleccionadas entre PKC-o ¡soformas l y 2, PKC-f., PKC-~ y PKC-9.

V1. Pértidos inhibido res

En otra realización particular, se utiliza un péptido inhibidor de alguna de las PKCs descritas anteriormente para impedir que dicha proteína ejerza alguna de sus funciones, en particular, una actividad relacionada con su capacidad de fosfofilar a otras proteínas.

El término "péptido inhibidor", tal como aquí se utiliza, hace referencia a aquellos péptidos que son capaces de unirse a una PKC de manera específica e inhibir una o más de las funciones de dicha PKC, preferiblemente relacionada(s) con la fosforilación de otras proteínas. "Péptido inhibidor" es también todo aquel péptido capaz de unirse a una PKC de manera específica y bloquear los sitios de fosforilación de PKC, los sitios CI y C2 de unión a Ca2 + y DAG, los sitios de unión de PKC con otras proteínas así como el dominio catalítico. Los péptidos pueden ser preparados usando cualquiera de los métodos que son conocidos para el experto en la materia. Una vez identificados péptidos con capacidad de unión a PKC, se seleccionarán aquellos capaces de inhibir la actividad de esta proteína usando un ensayo de identificación de agentes inhibidores de PKC. Estos ensayos han sido descritos anteriormente. Ejemplos ilustrativos de dichos péptidos se describen en la Tabla l (VI), entre los que se encuentran el péptido cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 7 así como los péptidos inhibidores de la PKC delta identificados en US6855693 y W02009/ 111169.

En una realización particular, dicho péptido inhibidor de una PKC es un péptido específico para una PKC nueva, especialmente humana, seleccionada entre PKC-o ¡so formas l y 2, PKC-E, PKC-~ y PKC-9.

VII. Anticuemos inhibidores

En otra realización particular, se utiliza un anticuerpo inhibidor de una PKC para impedir que dicha proteína ejerza alguna de sus funciones, en particular, una actividad relacionada con su capacidad de fosforilación a otras proteínas.

Por "anticuerpo inhibidor" se entiende en el contexto de la presente invención todo aquel anticuerpo que es capaz de unirse a una PKC de manera específica e inhibir una o más de las funciones de dicha PKC, preferiblemente rclacionada(s) con la fosforilación de otras proteínas. "Anticuerpo inhibidor" es también todo aquel anticuerpo que es capaz de unirse a una PKC de manera específica y bloquear los sitios

de fosforilación de PKC, los sitios el y e2 de unión a Ca2 + y DAG, los sitios de unión

de PKC con otras proteínas así como el dominio catalítico. Los anticuerpos pueden ser obtenidos usando cualquiera de los métodos que son conocidos para el experto en la materia. Una vez identificados anticuerpos con capacidad de u nión a PKC, se seleccionarán aquellos capaces de inhibir la actividad de esta proteína usando un ensayo de identificación de agentes inhibidores de PKC [véase, por ejemplo, Metz; S. et al. 2008. J.BioI.Chem. 283:5985-5995].

En una realización particular, dicho anticuerpo inhibidor de una PKC es un anticuerpo con capacidad para unirse a PKC e inhibir específicamente la actividad kinasa de dicha enzima (PKC); ejemplos ilustrativos de dichos anticuerpos se describen en las referencias citadas en la Tabla 1 (VII), cuyos contenidos se incorporan a la presente descripción por referencia, entre los que se encuentran los anticuerpos anti-PKC delta "ab4143", "ab574 19" [Abcam Inc. Cambridge Massachusetts, EEUU], el anticuerpo GTX93022 [Geztex, San Antonio, Texas, EEUU] así como los descritos por Babinska y col. [A. Babinska, el al. 1996 Am J Physiol Hcart Circ PhysioI271:H2134-H2144]

En una realización particular, dicho anticuerpo inhibidor de una PKC es un anticuerpo específico para una PKC nueva, especialmente humana, seleccionada entre PKC-o isoformas I y 2, PKC-E, PKC-~ y PKC-e.

VIII-XIV. Compuestos químicos

En otra realización particular, se utiliza un compuesto químico que disminuye la actividad de PKC cuando se pone en contacto con dicha proteína. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichos compuestos químicos incluyen los compuestos mencionados en la Tabla I (Vlll-XlV) O análogos dc los mismos.

En una realización particular, dichos compuestos son inhibidores específicos de PKCs nuevas, preferentemente, PKCs nuevas humanas (PKC-o, PKC-e PKC-ll y PKCe).

En otra realización particular, dichos compuestos inhibido res de PKC se seleccionan del grupo formado por bisindolilmalcimida, un inhibidor competitivo con ATP con un leso de 10 nM para PKCs (leSO para PKCf. de 24 nM); 1,2-dimetoxi-12metil-[1,3]benzodioxolo[5,6-c]fenantridi-12-nio (Cheleritrina) y sus sales, c.g., cheleritrina cloruro (PKC, ICSO ~ 0,66 .uM); 1-[2,4-dihidroxi-6-[(2S,3R,4S,5S,6R)3,4,5-trih idrox i-6-(h idro x imel iI)oxan-2 -i1 ]ox ifen i1] -3 -(4-hidro x ifen i1)pro pan-1-0na (Flo ridzin); 1-[6-[ (3-acet ill-2, 4, 6-lrihidro x i-5-mel il fe ni I)met iI]-5,7 -d ihid ro x i-Z,zdimetil-2H-l-benzopiran-8-il]-3-fcnil-2-propcn-I-ona (Rottlerin), un inhibidor específico para PKC dclta con una potencia de 5-10 veces mayor que para PKC alfa o PKC beta y unas 13-33 veces mayor para PKC epsilon [Gschwendt M, et al. 1994. Biochem Biophys Res Commun. 199(1):93-8. Ni H, et al 2003 Br J Hacmatol. 121 (6):849-56]; 3-[ 1-[3-(dimelilamino )propil]indol-3-il]-4-( 1 H-indol-3-il)pirrol-2,5diona hidrocloruro (GFI09203X) cuyos valores de [C50 difieren entre las distintas isoformas, siendo menores para PKC alfa que para PKC delta [Toullec, D., et al 1991. J. Biol. Chem. 266: 15771); 12-(2-cianoetil)-6,7, 12, I3-tetrahidro-I3-melil-5-oxo-5Hindolo[2,3-a]pirrolo[3,4-c]carbazol (Gii 6976), específico para las isoformas PKC ti (IC50~2,3 nM) y PKC pi (IC50~6,2 nM); 4'-N-benzoil-slaurosporina (CGP 41251), un potente inhibidor reversible de PKC, y combinaciones de los mismos.

En una realización particular y preferida, dicho compuesto inhibidor de una PKC se se lecciona entre 1-[6-[(3-acetill-2,4,6-trihidroxi-5-metilfenil) metil]-5,7dihidroxi-z,z-dimetil-2H-I-benzopiran-8-il]-3-fenil-2-propen-I-ona) (Rottlerin) y (3-[ 1[3-( dimetilamino )propil]indo 1-3-il]-4-( 1 H-indo 1-3-il)pirrol-2,5-diona hidrocLoruro (GFI09203X) y combinaciones de los mismos.

Composiciones farmacéuticas de la invención

El experto en la materia entiende que los inhibidores de PKC pueden ser utilizados para preparar un medicamento que será administrado de manera adecuada al sujeto en necesidad de tratamiento.

En una realización particular, dicho medicamento reduce la muerte neuronal inducida por el péptido (1-42)AP en el SNC; en una realización concreta, dicho medicamento se administra a un sujeto que padece la enfermedad de Alzheimer (EA).

5

En otra realización particular, el inhibidor de una PKC se selecciona entre los inhibidorcs específicos para PKCs nuevas, preferentemente humanas (PKC-o, PKC-E PKC-~ y PKC-9). En una realización particular, dicho inhibidor de una PKC se selecciona entre cualquiera de los inhibidores contenidos en la Tabla 1. En otra realización particular, dicho inhibidor de una PKC se selecciona del grupo formado por:

lO

un ARN de interferencia especifico para la secuencia de un gen que codifica una PKC, C.g., un ARNip para PKCú [Espcr R.M and Locb JA. 2009. The Journal of Biologieal Chemistry, 284, 26251-26260. N. Irie et al., Bioehem Biophys. Res. Comrn., Vol. 298,738 (2002)];

15

un péptido con capacidad pam unirse específicamente a PKC e inhibir su actividad, c.g., el péptido inhibidor de la PKC Beta n cuya secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 7, o los péptidos inhibidores de la PKC delta ident ificados en US6855693 y W02009/l 111 69;

20

un anticuerpo con capacidad para unirse específicamente a PKC e inhibir su actividad kinasa, e.g., los anticue rpos anti-PKC delta "ab4143", "ab574 19" [Abcam Inc. Cambridge Massachusetts, EEUU], el anticuerpo GTX93022 [Geztex, San Antonio, Texas, EEUU] así como los descritos por Babinska y col. [A . Babinska, et al. 1996 Am J Physiol Heart Cire Physiol271 :H2134-H2 144];

25 30

un compuesto químico seleccionado del grupo fonnado por bisindoli lmaleimida, 1 ,2-dimetoxi-12-metil-[ 1 ,3 ]benzodioxo lo[5,6e ]fenantridi-12-nio (Cheleritrina) y sus sales, e.g., cheleritrina cloruro; 1-[2, 4-d ihi drox i-6-[ (2S, 3 R,4 S,5 S,6 R )-3,4,5-t rih idrox i-6-(h idro x imetil)oxan-2-il]oxifenil]-3-( 4-hidroxifenil)propan-I-ona (Floridzin); 1[6-[ (3-acct ill-2,4,6-trihidroxi-5-mctilfenil)met il]-5, 7 -dihidroxi-z,zdimet il-2H-I-benzopiran-8-il]-3-fenil-2-propen-I-ona (Rottlerin); 3-[ 1[3-( dirnetil.amino )propil] indo1-3-il]-4-( 1 H-indo 1-3-i l)pirrol-2,5-diona hidrocloruro (GF 1 09203X); 12-(2-eianoetil)-6, 7, 12, 1 3-tetrahidro-1 3

metil-5-oxo-5H-indolo[2,3-a]pirrolo[3,4-c ]carbazol (Go 6976); 4' -Nbcnzoil-staurosporina (CGP 41251), y combinaciones de los mismos. En una realización particular y preferida, dicho compuesto inhibidor de una PKC se selecciona entre Rottlerin, GF 1 09203X y combinaciones de los mismos.

Para su administración a un sujeto, los inhibidores de PKC se formularán junto con un vehículo farmacéuticamcntc aceptable para su administración según la vía de administración elegida.

Como un experto en la materia entiende, en los casos en los que los inhibido res de PKC sean ácidos nucleicos, estos pueden estar incluidos en vectores. Los medios para la distribución de genes a una célula o tejido in vivo O ex vivo incluyen (pero no están limitados a) inyección directa de AON desnudo, métodos balísticos, transferencia mediada por liposomas, transferencia mediada por receptores (complejo ligando-AON), clectroporación, y precipitación con fosfato cálcico. Ver la patente de EE.UU. Nos. 4970154, WO 96/40958, patente de EE.UU. No. 5679559, patente de EE.UU. No. 5676954, Y patente de EE.UU. No. 5593875. También incluyen el uso de vectores virales tales como un retro virus, adenovirus, virus adenoasociado, poxvirus, lentivirus, virus del papiloma o el herpes simplex virus, uso de un conjugado ADN-proteína y el liSO de un liposoma. El uso de los vectores se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. No. 5672344, patente de EE.UU. No. 5399346, patente de EE.UU. No. 5631236, Y patente de EE.UU. No. 5635399.

Cuando se administran solos, los inhibidores de PKC pueden administrarse en combinación con vehículos fannacéuticamente aceptables y en las dosificaciones aquí descritas. Dichos inhibidores de PKC también pueden usarse en combinación con uno o más compuestos adicionales eficaces contra la patología específica fijada como objetivo para el tratamiento. Los agentes terapéuticos y/o los compuestos adicionales diferentes pueden administrarse simultáneamente con, poste riormente a, O antes de la administración del compuesto descrito en la Tabla 1.

En una realización particular, un inhibidor de una PKC contenido en la Tabla J se usa combinado con otro fármaco útil para el tratamiento de una enfennedad asociada a la formación de depósitos amiloideos, particularmente enfermedades asociadas a depósitos de un péptido beta amiloide. En una realización particular, el péptido beta amiloide es el péptido (l-42)A~. En una realización particular, el otro fármaco se selecciona entre un inhibidor de Rae 1 o un inhibidor de PDK 1.

En una realización particular, dicho medicamento comprende uno O más de los inhibidores de PKC mostrados en la Tabla l. En este sentido, se podrían combinar dichos inhibido res en proporciones iguales o distintas, y podrían formar parte de la misma formulación O podrían formularse en formulaciones diferentes para su administración secuencial o simultánea.

Las composiciones farmacéuticas conteniendo uno o más inhibido res de PKC pueden presentarse en cualquier forma farmacéutica de administración que se considere adecuada para la vía de administración elegida, por ejemplo, por vía sistémica, oral, parenteral o tópica, para lo cual incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la forma de administración deseada.

La cantidad efectiva de inhibidor de una PKC puede variar dentro de un amplio intervalo y, en general, variará en función de circunstancias particulares de aplicación, la duración de la exposición y consideraciones de este tipo.

Las formas de dosificación sólidas para administración oral pueden incluir cáps ul as convencionales, cáps ul as de lib eración sos tenida, comprimidos convencionales, comprimidos de liberación sostenida, comprimidos masticables, comprimidos sublinguales, comprimidos efervescentes, píldoras, suspensiones, polvos, gránulos y geles. En dichas formas de dosificación sólidas, los compuestos activos pueden mezclarse con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Dichas formas de dosificación también pueden comprender, como en la práctica normal, sustancias adicionales distintas de diluyentes inertes, por ejemplo, agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. En el caso de cápsulas, comprimidos, comprimidos efervescentes y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponantes. Los co mprimidos y píldoras pueden prepararse con recubrimientos entéricos.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elix ires farmacéuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes habitualmente usados en la técnica, tales como agua. Dichas composiciones también pueden comprender adyuvantes, tales como agentes

humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, y agentes edulcorantes, aromatizantcs y pcrfumantcs. Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables y estériles pueden formularse de acuerdo con la técnica conocida usando

5 agentes dispersantes adecuados, agentes humectantes y/o agentes de suspensión. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden usarse están agua, solución de Ringer, y solución isotónica de cloruro sódico. Los aceites estériles también se usan convencionalmente como disolventes o medios de suspensión.

Para su administración tópica, los inhibidorcs de PKC pueden formularse en

10 forma de cremas, geles, lociones, líquidos, pomadas, soluciones de pulverización, dispersiones, barras sólidas, emulsiones, microemulsiones y similares, que pueden formularse de acuerdo con los métodos convencionales que usan excipientes adecuados, tales como, por ejemplo, emulsionantes, tensioactivos, agentes espesantes, , colorantes y combinaciones de dos o más de los mismos.

15 Adicionalmente, los inhibido res de PKC pueden administrarse por vía transdénnica en forma de parches transdérmicos o dispositivos de iontoforesis. En una realización, el inhibidor de una PKC se administra en forma de un parche transdérrnico, por ejemplo, en forma de parche transdérmico de liberación sostenida. Se describen parches transdérmicos adecuados con más deta lle en, por ejemplo, US5262l65,

20 US5948433, US60 1 0715 Y US6071531. Las composiciones conteniendo los inhibidores de PKC pueden incluir adicionalmente excipientes convencionales, es decir, vehiculos farmacéuticamente aceptables adecuados para la aplicación parenteral que no reaccionan de fonna nociva con los compuestos activos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados

25 incluyen, por ejemplo, agua, soluciones salinas, alcohol, aceites vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, tensioactivos, ácido silícico, parafina viscosa, aceite perfumante, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ác idos g rasos pe troetrales, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

30 Se conocen diversos sistemas de suministro de fármacos y pueden usarse para administrar los compuestos o composiciones de la invención, incluyendo, por ejemplo, encapsulación en liposomas, microburbujas, emulsiones, micropartículas, microcápsulas y similares. La dosificación necesaria puede administrarse en forma de una única unidad

o en una fonna de liberación sostenida.

Las formas de liberación sostenida adecuadas así como los materiales y métodos para su preparación se describen en, por ejemplo, "Modified-Relcase Drug DeLivery Teehnology", Rathbone, M. J. Hadgraft, J. and Roberts, M. S. (eds.), Maree! Dekker, Inc., New York (2002); "Handbook of Phannaccutical Controlled Rclcasc Technology", Wise, D. L. (ed.), Mareel Dekker, Inc. New York, (2000); En una realización de la invención, la fonna administrable por vía oral de los inhibidores de PKC está en una forma de liberación sostenida que comprende adicionalmente al menos un recubrimiento o matriz. El recubrimiento o matriz de liberación sostenida incluye, pero sin limitación, polímeros naturales, semisintéticos o sintéticos insolubles en agua, modificados, ceras, grasas, alcoholes grasos, ácidos grasos, plastificantes naturales semisintéticos O sintéticos, O una combinación de dos o más de los mismos.

Los recubrimientos entéricos pueden aplicarse usando procesos convencionales conocidos por los especialistas en la técnica, como se describe en, por ejemplo, Johnson, J. L., "Pharmaceutical tablet coating", Coatings Technology Handbook (Segunda Edición), Satas, D. and Tracton, A. A. (eds), Maree! Dekker, Inc. New York, (2001); Carstensen, T., UCoating Tablets in Advanced Pharmaceutical Solids", Swarbriek, 1. (ed.), Mareel Dekker, Ine. New York (2001), 455-468;

Aunque las necesidades individuales pueden variar, la determinación de los intervalos óptimos para cantidades eficaces de los inhibidores de PKC pertenece a la experiencia habitual de los especialistas en la técnica. En general, la dosificación necesaria para proporcionar una cantidad eficaz de dichos inhibidores de PKC, que pueda ajustarse por un especialista en la técnica, variará dependiendo de la edad, salud, estado fisico, sexo, dicta, peso, grado de la alteración del receptor, frecuencia de tratamiento y la naturaleza y alcance de la alteración o enfermedad, afección médica del paciente, la vía de administración, consideraciones farmacológicas tales corno la actividad, eficacia, perfil farmacocinético y de toxicología del compuesto particular lisa do, si se usa un sistema de suministro del fármaco, y si el compuesto se administra como parte de una combinación de fármacos.

La cantidad de inhibidor de una PKC que será eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección, y puede determinarse por técnicas clínicas convencionales, incluyendo la referencia a Goodman and Gilman, supra; Thc Physician's Dcsk Reference, Medical Economics Company, Inc., Oradcll, N.J., 1995; Y Drug Facts and Comparisons, Inc., Sto Louis, MO, 1993. La dosis exacta a usar en la formulación también dependerá de la vía de administración, y la gravedad de la enfermedad o trastorno, y debe decidirse a criterio del médico y de las circunstancias del paciente.

Métodos de screening de la invención

Los inventores han observado que en células de origen neuronal yen cultivos organotipicos (Figura 1, 2 Y 18) la adición del péptido (1-42)AP reproduce las características patológicas de una enfermedad asociada a depósitos amiloidcos tal como la EA. En consecuencia, aquellos agentes que provoquen una mejora de los estadios patológicos observados en un cultivo celular O en un cultivo organotípico podrían ser potencialmente útiles en el tratamiento enfermedades asociada a depósitos amiloidcos en general, y, en particular, en el tratamiento de la EA.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de un compuesto capaz de inhibir la muerte celular inducida por depósitos amiloideos para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos que comprende:

a) poner en contacto una célula con una proteína amiloidea;

b) poner las células resultantes de a) en contacto con un compuesto candidato;

y

c) determinar en dicha célula los niveles de activación de PKC, en donde si los niveles de activación de PKC en la célula después de haber sido tratada con un compuesto candidato son menores que antes del tratamiento, el compuesto candidato es capaz de inhibir la muerte celular neuronal inducida por proteínas amiloideas y útil para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos ami loidcos.

Los términos "enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos", y "proteína amiloidea" han sido descritos anteriormente en el apartado de composiciones de la invención.

El experto en la materia entiende que para determinar si una proteína es una proteína ami lo idea, dicha proteína o péptido debe aparecer en los depósitos amiloidcos de enfermedades asociadas con los depósitos amiloideos arriba citadas teniendo por tanto una morfología alargada, se tiñen con Rojo Congo, que presenten un patrón de difracción de rayos X característico, llamado patrón "cross-beta". Inouye H. et al Biophys J. 199364(2):502-519.

En una realización particular, la proteína amiloidea es un péptido beta amiloide; en consecuencia, el método seria un método para la identificación de compuestos capaces de inhibir la muerte celular inducida por un péptido beta amiloidc para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos de un péptido beta amiloide que comprende:

a) poner en contacto una célula con un péptido beta amiloide;

b) poner las células resultantes de a) en contacto con un compuesto cand idato;

y

c) detenninar en dicha célula los niveles de activación de una PKC, en donde si los niveles de activación de dicha PKC en la célula después de haber sido tratada con un compuesto candidato son menores que antes del tratamiento, el compuesto candidato es capaz de inhibir la muerte celular neuronal inducida por un péptido beta amiloide y úti l para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos del péptido beta amiloide. En una realización particular, el péptido es el péptido (1-42)A~.

Los ténninos "péptido beta amiloide ", "muerte celular inducida por un péptido beta amiloide" y y "enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos asociadas a péptido AW' han sido definidos con anterioridad.

Así, en una primera etapa [etapa a)], el método de rastrCQ de agentes terapéuticos de la invención comprende poner en contacto una célula con una proteína amiloidea. En una realización particular en una primera etapa [etapa a)], el método de rastreo de agentes terapéuticos de la invención comprende poner en contacto una célula con un péptido A~, tal como el péptido (1-42)A~.

En la presente invención, se entiende por célula a una célula aislada en cultivo así como a una pluralidad de células tanto asiladas (cultivo celular) como formando

3.

parte de un cultivo organotipico. Así, en la presente invención, el término "cultivo" incluye todas las posibilidades antcrionncntc citadas.

Ejemplos de células que pueden ser usadas en la presente invención son tanto cultivos primarios obtenidos de diversos tejidos como la piel, la sangre, corazón, cerebro etc como células inmortalizadas o de cultivos primarios provenientes de ostcoblastos, mioblastos, ncuroblastos, fibriblastos, glioblastos, células madre, hepatocitos, condrocitos, células de musculo liso y estriado, células de tejido conectivo, células gliales, epiteliales, endoteliales, neuronas, ctc. En una realización particular, las células usadas son células de origen neuronal, tanto de cultivos primarios de neuronas como de cultivos inmortalizados de origen neuronal como las células SN474l, lMR32, N-TERA, PCI2, GNll, C1300.

En otra realización particular, las células forman parte de una estructura tridimensional denominada cultivo organotípico. En la presente invención, por "cultivo organotípico" se entiende un cultivo tridimensional de tejido que mantiene en gran parte la estructura, conexiones celulares y fisiología similares a las presentes en el órgano del que ha sido extraído en este caso cerebro (Gahwiler, 1981 1. Neurosci. Meth. 4, 329-42; Gahwiler 1984 Neuroscience. II :751-60; Gahwiler 1988 Trends Neurosc. 11 :484-9; Stoppini et al. 1991 J. Neuroscience Methods 37: 173-82).

Los cultivos organotípicos pueden ser extraídos de cualquier órgano en donde se pretenda estudiar la influencia de la muerte celular inducida por una proteína amiloidea como el péptido (l-42)A~, como, por ejemplo el cerebro, el corazón, los riñones, etc. En una realización particular, el cultivo organotipico es de origen cerebral. El cultivo organotípico puede contener diversas zonas del cerebro y será realizado seleccionando las zonas según los intereses particulares de cada ensayo.

Métodos para generar cu ltivos organotípicos son conocidos por el experto en la materia (Gahwiler, 1981 J. Neurosci. Meth. 4, 329-42; Gahwiler 1984 Neuroscience.

11 :75 1-60; Gahwiler 1988 Trends Neurosc. 11 :484-9; Stoppini et al. 1991 J. Neuroscience Methods 37: 173-82). El animal no-humano al que se le disecciona el cerebro u otro órgano, puede ser cualquier animal, preferentemente, un vertebrado, tal como un mamífero, por ejemplo, un roedor, preferiblemente, un ratón O una rata. Dicho animal no-humano puede ser un animal con un fondo genético modificado genéticamente, es decir, cuyo material genético ha sido manipulado y diseñado o alterado deliberadamente con el fin de otorgarle alguna característica de interés, o puede ser un animal no modificado genéticamente. Dichos animales no humanos genéticamente modificados pueden ser animales transgénicos, es decir, animales que presentan, insertada en su genoma, la secuencia de un gen de interés, C.g., EYFP (Winter SM et al., 2007 Respir Physiol Neurobiol. 159: 108-14) o genes-GFP para la expresión de la proteína fluorescente GFP bajo el control del promotor de nestina (Friling et al., 2009 Proc Natl Acad Sci U S A 106(18):7613-8). También puede ser un animal que presenta bloqueada la expresión de un gen específico (c.g., ratones knockout). Los métodos para la generación de animales de este tipo son bien conocidos por un experto en la materia.

Un ejemplo de cultivo organotípico cerebral sería el cultivo organotípico mostrado en la Figura 18 y descrito en los ejemplos de la presente invención.

Los cultivos usados en el método de la invención, son mantenidos en condiciones que permitan la supervivencia celular. Dichas condiciones adecuadas para la supervivencia de dicho cultivo incluyen las condiciones que garantizan que el cultivo no se necrose y se mantenga vivo. Dichas condiciones incluyen el mantenimiento de los cultivos en condiciones de humedad, temperatura y concentraciones de gases (habitualmente, 37°C, 5% C02 y 95% Oú adecuadas, condiciones que pueden ser conseguidas manteniendo los cultivos en incubado res especialmente diseñados para dicho fin. El estado de la técnica incluye numerosos ejemplos de incubado res adecuados para mantener vivo un cultivo organotípico. Las condiciones de cultivo varían ampliamente para cada tipo de cultivo organotípico.

Además de la temperatura y la mezcla de gases, el factor más comúnmente variado en los sistemas de cultivo es el medio de crecimiento. Las recetas para los medios de crecimiento pueden variar en pH, concentración de glucosa, factores de crecimiento y la presencia de otros componentes nutritivos. Se conocen diversas recetas de medios utilizados para el mantenimiento de cultivos organotípicos (Vergni et al., 2009 PLoS ONE4(4):e5278, Chechneva et aL, 2006 Neurobiol of Dis. 23(2):247-59).

Además, es necesario mantener los cultivos bajo condiciones de esterilidad usando métodos apropiados, por ejemplo, esterilización, etc., así como llevando a cabo el manejo del cultivo en condiciones de esterilidad. El objetivo de todo ello es evitar la contaminación microbiana (e.g., bacterias, levaduras, mico plasmas, cte.) que competirían con las células de la porción de cerebro por los nutrientes y/o podrían infectar y eliminar dichas células. En una realización particular, toda manipulación se lleva a cabo, típicamente, en una campana de flujo laminar para evitar la entrada de microorganismos contaminantes. También pueden añadirse antibióticos al medio de cultivo.

Asimismo, para la correcta supervivencia del cultivo puede ser necesario, en ocasiones, realizar cambios del medio de cultivo de manera regular; así, en una realización particular, se realizan cambios del medio de cultivo cada 3 Ó 4 días.

La expresión "poner en contacto", tal como aquí se usa, se refiere al proceso por el cual una proteína amiloidea como por ejemplo el péptido A~ entra en contacto con una célula O cultivo organotípico, e incluye cualquier posible fonna "in vio'o" de poner en contacto una proteína amiloidea de manera extracelular así como cualquier método que permita la introducción de una proteína amiloidea a las células aisladas O que fonnan parte de un cultivo organotípico.

Las proteínas ami lo ideas pueden ser obtenidas de manera comercial o ser producidas usando síntesis química o biológica.

El péptido A~, en especial el péptido (l-42)A~ puede ser obtenido de manera comercial O ser producido usando síntesis química O biológica tal y como se describe en el ejemplo 1 en el apartado "Preparación del péptido p-Amiloide (AP)" de la presente invención. Aunque trabajar con proteínas amiloides siempre implica problemas en la preparación de muestras (baja solubilidad, difici l reproducibilidad, etc.), el péptido ~(l42) es especialmente dificil de manipular, ya que presenta una insolubilidad muy elevada, lo que dificulta también su purificación. En condiciones cromatográficas estándar dicha proteína eluye dando lugar a picos extremadamente anchos, con poca resolución (Zagorski et al (1999) Methods Enzymol 309, 189-2359), por lo que requiere el uso de sistemas cromatográficos no habituales en la química de péptidos, como mezclas de cluyentes de ACN/isopropanol y condiciones básicas (Snyder S:W: et al Biophys J 1994, 67, 1216-1228, http://www.WesternAnalytical.com/vydac/bamyloid. Naslund J et al J. Neuroehem. 1996,67,294-301).

Las concentraciones del péptido Ap, especialmente del péptido (1-42)AP usados en el método de la invención, en el caso de que se util icen cultivos celulares varían de entre 0,001 ~M Y 40 ~M, 0,05 ~M Y 30 ~M, preferiblemente entre O,15 ~M Y lO ~M,

0,3 Y 5 ¡.tM. 0,1 ¡.tM Y 2 ,uM. En una realización preferida, el cultivo es un cultivo celular y la concentración del péptido AI3 es de entre 0,5 ¡.tM Y 3 ¡.tM Ypreferiblemente de 1,25 ,uM. En otra realización particular, el cultivo es un cultivo organotípico y la concentración del péptido AI3 es de entre 10 nM Y 1 ,uM, preferentemente 100 nM.

5 En una segunda etapa [etapa b)], el método de rastreo de agentes terapéuticos de la invención comprende poner las células resultantes de a) con un compuesto candidato.

Los compuestos utilizados en el método de rastreo pueden ser compuestos químicos tanto orgánicos como inorgánicos. Entre los compuestos orgánicos, dicho compuesto puede ser un polímero biológico tal como un ácido nucleico o una proteína.

10 En una realización particular, el compuesto a ensayar no se encuentra aislado sino que se encuentra formando parte de una mezcla más O menos compleja, bien derivada de una fuente natural o bien formando parte de una biblioteca de compuestos. Ejemplos de bibliotecas de compuestos que pueden ser ensayadas según el método de la presente invención incluyen, sin limitación, bibliotecas de péptidos formadas tanto por

15 péptidos como por análogos peptídicos que comprenden D-aminoácidos o péptidos que comprenden enlaces no peptídicos, bibliotecas de ácidos nucleicos formadas por ácidos nucleicos con enlaces no fosfodiéster del tipo de fosforotioato o ácidos nucleicos peptídicos, bibliotecas de anticuerpos, de carbohidratos, de compuestos de bajo peso molecular, preferiblemente moléculas orgánicas, de peptidomiméticos, y similares. En

20 el caso de que se use una biblioteca de compuestos orgánicos de bajo peso molecular, la biblioteca puede haber sido preseleccionada para contener compuestos que puedan acceder al interior celular con mayor facilidad. Asi, los compuestos se pueden seleccionar en base a determinados parámetros tales como tamaño, lipofilicidad, hidrofilicidad, capacidad de formar puentes de hidrógeno. En caso de que el compuesto

25 candidato se encuentre formando parte de una mezcla de mayor O menor complej idad, la invención comprende adicionalmente una O varias etapas de fraccionamiento de dicha mezcla y la repetición del método de la invención un número variable de veces hasta que el compuesto de la mezcla responsable de la separación de los elementos que forman el primer complejo de la invención se encuentre aislado. Métodos para el

30 fraccionamiento de compuestos presentes en una mezcla incluyen cromatografia (en capa fina, de gases o de exclusión molec ular en gel, de afinidad), cristalización, destilac ión, filtración, precipitación, sublimación, ex tracción, evaporación, centrifugación, cspcctrornctria de masas, adsorción y similares.

Alternativamente, los compuestos a ensayar pueden estar fonnando parte de un extracto obtenido de una fuente natural. La fuente natural puede ser animal o vegetal y 5 estar obtenida de cualquier entorno, incluyendo, sin limitación, extractos de organ ismos

terrestres, aéreos, marinos y similares.

Un experto en la materia entiende que para la rea lización de un ensayo "in vifro" , se pueden utilizar péptidos aislados de lisados de fracciones o de células enteras derivados sin limitación de célul as primari as, transformadas, líneas celulares,

10 recombinantes, bacterias etc.

La incubación con el agente a ensayar se realiza a diferentes concentraciones y tiempos de incubación. Por otro lado, el uso de reacciones control negativas (sin agente) y positivas es recomendable.

En una realización particular de la invención, el agente a ensayar se trata de un

15 péptido. Para la introducción del péptido en las células del cultivo de la invención se pueden usar diversos procedimientos bien descritos en el estado de la técnica. También se puede introducir el fragmento de ADN que codifica dicho péptido. Métodos de clonaje y propagación de dicho fragmento de ADN son bien conocidos en el estado de la técnica. Los medios para la distrib ución de genes a una célula o tejido in vivo

20 incluyen (pero no están limitados a) inyección directa de ADN desnudo, métodos balísticos, transferencia mediada por liposomas, transferencia mediada por receptores (complejo ligando-ADN), electroporación, y precipitación con fosfato cálcico (véase, por ejemplo, US 4970154, WO 96/40958, US 5679559, US 5676954 y US 5593875). También se incluye el uso de vectores virales tales como un retrovirus, adenovirus,

25 virus adenoasociado, poxvirus, lentivirus, virus del papiloma O el herpes simplex virus, uso de un conjugado ADN-protcína y el uso de un liposoma. En una tercera etapa [etapa c)], el método de rastreo de agentes terapéuticos de la invención comprende detenninar en dicha célula los niveles de activación de PKC. Los distintos tipos de PKCs han sido descritos anteriormente. En una realización 30 particular, las PKCs son PKCs nuevas. Existen múltiples métodos que pueden ser usados para determinar la activación de kinasas, particulannente de PKCs, conocidos por el experto en la materia.

Por ejemplo, se puede utilizar la habilidad de la kinasa para fosfofilar su sustrato natural (i.c proteínas conocidas por ser activadas por PKCs son las proteínas MARCKS, MAP kinasa, la PKD, inhibidor del factor de transcripción IKB, receptor de Vitamina

5 D3 o VDR, Raf kinasa, calpaina, y el EGFR (epidermal growth factor receptor). También se pueden utilizar métodos basados en la medición de la activación de dichas proteínas conocidas por ser activadas por PKCs. La habilidad de de la kinasa para fosfofilar su sustrato puede ser detectada usando, por ejemplo una unión radio/química/fotoquímica de un fosfato y la detección posterior de su incorporación en

10 el sustrato. Otros ensayos de activación de PKCs están diseñados para identificar la cantidad de PKC activa. Un ejemplo de ensayo de la activación de PKCs es la medición usando el método de Pull-down, o el basado en la técnica de EUSA, en donde se mide la activación de las PKCs por medio de Luminiscencia. Las técnicas basadas en ELlSA consisten en la incubación de la prueba con una placa que presenta un dominio de

15 fosforilación de una proteína efectora de PKCs. La forma activa de PKCs se unirá a dicho dominio y posteriormente pude ser detectada usando un anticuerpo específico para PKCs.

Alternativamente, se pueden usar biosensores que como los biosensores basados en FRET para medir la activación de PKCs en tiempo real. (Jin Zhang; Allen M. D.;

20 2007 Molecular bioSystcms, vol. 3, nOII, pp. 759-765.) Otros ensayos para medir la modulación de las kinasas son conocidas por el experto en la materia tales como los descritos en Julianne J. San do (Protein Kinase C Protocols. 2003 Humana Prcss) y W012004/0358 I l. En una realización particular, el tercer paso del método de la invención

25 comprende de manera adicional, la medición de los niveles de muerte celular o la viabilidad del cultivo. Métodos para medir los niveles de muerte celular o viabilidad de un cultivo o célula son conocidos por el experto en la materia.

Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de tales métodos incluyen la inspección visual bajo microscopio usando criterios morfológicos tales como la conservación de la 30 estructura, el uso de colorantes vitales, la cuantificación de la expresión de marcadores

de viabilidad celular, la determinación de la muerte celular por apoptosis, etc.

La muerte celular puede ser dctcnninada usando métodos bien descritos en el estado de la técnica tales como la incorporación de ioduro de propidio o el marcaje con anexina V. La cuantificación de las células que se están degenerando se puede realizar midiendo la incorporación de dichas sustancias a la célula tal y como se describe en el

5 apartado de métodos en los ejemplos de la presente invención. Otro método que puede ser utilizado es la medida de la actividad mitocondria como el ensayo de la reducción de MTT tal y como se describe en la invención en el apartado ensayo de la reducción de MTT.

La cuantificación de los niveles de expresión de los marcadores de viabilidad

10 celular, se puede realizar usando diferentes métodos bien conocidos en el estado de la técnica. El término "expresión", tal como aquí se utiliza, se refiere a un proceso mediante el cual se produce una proteína a partir del AON. Este proceso implica la transcripción del gen a un ARN mensajero (ARNm) y la traducción de este ARNm a proteína. Los términos proteína O polipéptido son ut ilizados en la presente invención de

15 manera equivalente. En el contexto de la invención "cambios en los niveles de expresión" de los marcadores de viabilidad celular se refiere a cualquier cambio en la producción del ARNm, de la proteína o de ambos, que produce niveles relativos alterados del ARNm, proteína O ambos, en una muestra con respecto a otras moléculas en la misma muestra. Se apreciará que los niveles de expresión de un marcador de

20 viabilidad celular se puede determinar mediante la determinación de los niveles de ARNm en una muestra o mediante la determinación de los niveles del polipéptido correspondiente. De forma alternativa, los marcadores de viabilidad polipeptídicos pueden ser variantes resultantes de modificaciones postraduccionales, incluyendo fragmentos de los mismos.

25 Los niveles de expresión de los marcadores de viabilidad celular se pueden evaluar mediante cualquiera de una amplia variedad de métodos bien conocidos para detectar la expresión de una molécula transcrita (ARNm) o su proteína correspondiente. Métodos para determinar la molécula transcrita O la proteína son ampliamente conocidos por un experto en la materia, tales como PCR cuantitativa O usando

30 anticuerpos con capacidad de unirse a las proteínas que codifican dichos genes y posterior cuantificación de los complejos fonnados usando por ejemplo técnicas como el Western-blot o transferencia Western, ELlSA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), RJA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELlSA (ELlSA sandwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empico de biochips

o microarrays de proteínas etc. , Aunque prácticamente cualquier marcador de viabilidad celular puede ser utilizado, en una realización particular, se determinan los niveles de fosfatidil serina en la cara externa de la me mbrana plasmática. En condiciones fisiológicas el fosfolípido fosfatidilserina se encuentra en la cara interna de la membrana plasmática, cuando comienza el proceso de apoptosis este fosfolípido se posiciona en la cara externa de la membrana plasmática y puede ser detectado con la proteína anexina-V. Esta proteína se une específicamente a la fosfatidilserina y como está etiquetada con un fluorocromo, el complejo fosfatidil serina-AnexinaV se puede detectar por citometría de flujo.

En otra realización particular de la invención, la viabilidad celular se puede determinar usando colorantes vitales bien conocidos por un experto en la materia, e.g., el crisol violeta. Para su detección. se pueden utilizar diversas técnicas de inmunoensayo y microscopía descritas anterionnente.

El experto en la materia entiende que dichos métodos para determinar la viabilidad celular del cultivo bajo estudio se pueden uti lizar independientemente entre sí

o en combinación.

En general, se considerará que un compuesto es potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos como por ejemplo enfermedades asociadas a depósitos de A~, cuando los niveles de activación de PKC o PKCs en la célula después de haber sido tratada con un compuesto candidato son menores que antes del tratamiento.

Se considera que los niveles de activación de PKC y/o de muerte celular en la célula O cultivo después de haber sido tratada con un compuesto candidato son menores que antes del tratamiento cuando se produce una activación menor de 2, 5, 10, 15,20, 30, 40,50, 100 veces y/o una disminución de los niveles de muerte celular en la célula O cu ltivo tratada con el compuesto candidato en referencia a la célula O cultivo antes de el tratamiento del compuesto candidato.

Un experto en la materia entiende que si el método de medición de la actividad de PKC requiere la lisis de la célula (ej extracción de proteínas, ARN etc), entonces

sería necesario el uso de una segunda célula o cultivo que no ha sido tratada con el

compuesto a estudio en donde será medida la acti vación de PKC (cultivo control nait).

Así, se considerará que un compuesto es potencialm ente útil para el tratamiento de

enfermedades asociadas a la forma ción de depósitos amiloideos, en parti cular de

5

enferm edades asociadas a péptidos beta amiloides, más especialmente el péptido (1 -

42)A~ cuando los ni veles de activación de PKC y/o los niveles de muerte celular en la

célula o cultivo después de haber sido tratada con un compuesto candidato son menores

que antes del tratamiento, el compuesto candidato es capaz de inhibir la muerte celular

inducida por el depósitos amilo idco, en part icular la muerte celular inducida por

lO

péptidos beta ami loides, más especialmente por el péptido ( 1-42)A~.

Se considera que los niveles de acti vación de PKC y/o de muerte celular en la célula O

cultivo después de haber sido tratada con un compuesto candidato son menores que

antes del tratamiento cuando se produce una activación menor de 2, 5, 10, 15 , 20, 30,

40, 50, 100 veces y/o una disminución de los niveles de muerte ce lular en la célula O

15

cultivo tratada con el compuesto candid ato en referencia a la célula O cultivo control

naif (es decir que no ha sido tratado con el compuesto potencialmente úti l pa ra el

tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos pero sí

con una proteína amiloidea como por ejemplo el péptido (1-42)A~).

Adicionalmente, si se desea, en una realización particular, el método de rastreo

20

de compuestos potencialmente útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento de

enfe rmedades asociadas a la form ación de depósitos ami loideos de la invenció n

comprende una etapa adi cional [etapa e)] en la que se analiza la activación de PKC,

especialmente de PKCs nuevas, en un cultivo celu lar u organotípico control. Diversos

tipos de cultivos control (celular u organotípico) pueden ser uti lizados: a) cultivo

25

control naif-naif, es decir que no ha sido tratado con el compuesto potencialmente útil

para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos am il oideos

ni con una proteína amiloidea como el péptido (1-42)A~, b) cultivo control naif, no ha

sido tratado con el compuesto pero si con proteína ami loidea como el péptido (1-42)A~,

c) un cultivo positivo-naif, es decir, que ha sido tratado con un compuesto bien descrito

30

conocido por activar PKC pero no con una proteína amiloidea como el péptido (1

42)A~, d) un cultivo positivo, es decir, que ha sido tratado con un compuesto bien

descrito conocido por activar PKC y con una proteína amiloidea como el péptido ( 1

42)A~, e) un control negativo naif, es decir, que ha sido tratado con un compuesto bien descrito conocido por inhibir PKC pero no con una proteína amiloidca como el péptido (l-42)AP, f) un control negativo es decir, que ha sido tratado con un compuesto bien descrito conocido por inhibir PKC pero no con una proteína amiloid.ea como el péptido (1-42)Ap.

Compuestos que inhiben a PKC son conocidos por el experto en la material. Otros ejemplos de inhibidores específicos de PKCs aparecen descritos en la Tabla l.

EJEMPLO I

1. Materia les v Métodos

1.1 Cultivos celulares

Se utilizaron células SN4741, que provienen de la Sustancia Nigra de ratón [Son

J. H. el al.; 1999 J Neurosci 19(1):10-20; Son J.H. el al. 2005. J Neurochem 94(4): 1040-53]. Se cultivaron en DMEM (medio Eagle modificado de Oulbecco) modificado con L-glutamina 4 mM, 3,7g!L de bicarbonato de sodio y 4,5g!L de glucosa sin piruvato de sodio (Cambrex) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibco) y una mezcla de antibióticos constituida por 10.000 ulml de penicilina y 10 mg/ml de estreptomicina (Gibco) a 37°C y 5% de C02.

Se utilizó también la línea derivada de neuroblastoma IMR32, disponible, por ejemplo, en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo (ATCC) con el número de acceso CC1127. Estas células se cultivaron en MEM modificado por Earl (Gibco), suplementado con 10% de FBS, y una mezcla de antibióticos constituida por 10.000 U/mi de penicilina y 10 mg/ml de estreptomicina (Gibco) a 37°C y 5% C02.

Las dos líneas celulares utilizadas crecían en monocapa y para su expansión se lavaron 2 veces con OPBS (solución sal ina tamponada con fosfato de Oulbecco -del inglés "Oulbecco's Phosphate Buffered Saline") sin ci+ y sin Mg2 + (G ibco) precalentado a 37°C. Se cubrieron con Tripsina-EOTA (ácido eti1endiaminotetracético) IX y se dejó actuar durante unos minutos. Para parar la reacción se añadió el medio de crecimiento completo.

También se utilizaron cultivos primarios de células neuronales obtenidas de cerebros de embriones de rata en la segunda semana de gestación. Se sembraron 1 x l 05 células por pocillo, en medio neurobasal (Gibco) suplementado con 10% de FBS y 1% de gentamicina. Previamente las placas de 6 pocillos se trataron con fibronectina para facilitar la adhesión de las células neuronales. Al cabo de 24 horas se cambió el medio a uno sin suero para evitar que creciesen y proliferasen otros tipos celulares que no fuesen neuronas propiamente dichas y se le añadió el factor B27 el cual favorece la diferenciación y crecimiento de dendritas y axones. Finalmente, las células se mantuvieron en cultivo 8 días a 37°C en atmósfera de CO2 al 5% antes de ser utilizadas para los experimentos.

1.2 Cultivos organotípicos

Se prepararon a partir de cortes coronales de 400 J.l.ffi de grosor del hipocampo y corteza cntorrinal de ratas Spraguc-Dawlcy de 2-3 días de edad [Cavalicrc F. el al.; 2005. Neuroscience;136(3):615-23]. Los cortes se adhirieron a membranas Millicell CM (Millipore, Schwalbach, Alemania) y se mantuvieron en medio de cultivo HME al 75% (Cell Concept, Berlin, Alemania), L-glutamina (8iochrom, Serlin, Alemania) 2 mM, 25% de suero de caballo (Gibco) y 25 mg/mI de gentamicina durante 3 días a 37°C. Posterionnente, los cultivos se cambiaron a medio neurobasal suplementado con 827 al 0,5% (ambos de Gibco). Los ensayos de toxicidad se llevaron a cabo en cultivos de 7 días que se incubaron con oligómeros del péptido (l-42)A~ durante 72 horas en presencia o ausencia de Rottlerin [3 '-[(8-cinamoil-5,7-dihidroxi-2,2-dimetil-2H-Ibenzopiran-6-il)metil]-2 ',4' ,6'-trihidroxi-5 ' -metilacetofenona]. La muerte celular se evaluó mediante incubación con ioduro de propidio (lO JlM) durante 2 horas a 37°C. Finalmente, los cultivos se examinaron mediante fluorescencia (luz de excitación a 510560 nm; emisión a 610 nm) empleando un filtro de rodamina en un microscopio invertido (Cell Observer, Zeiss). Las imágenes se adquirieron con una cámara CCD (ORCA; Hamamatsu, Barcelona) y se analizaron con sofware Axovision (Zeiss).

1.3 Transfección de SN4741 por electroporación

Para c<>nseguir la mayor eficiencia de transfección por este método, se necesita que las células se encuentren en fase de crecimiento exponencial y que el pase no sea muy reciente. Las células se tripsinizaron, se contaron, se lavaron con PBS (solución salina tamponada por fosfatos) y se centrifugaron. Se resuspendieron a razón de 5xl06 en 200 JlL del medio de crecimiento completo enfriado previamente en hielo y se

pusieron en la cubeta de electroporación también enfriada previamente en hielo. Se añadieron a cada cubeta 10 Ilg del ADN a transfcctar, y se colocaron las cubetas en el hielo. Las células se sometieron a un único pulso eléctrico de 260 V Y 950 JlF (Electroporator BIORAD) y las cubetas se volvieron a colocar en el hielo. Realizando 5 todo el procedimiento en frío, se consigue que los poros en las membranas celulares permanezcan abiertos y que penetre así el AON con mayor facilidad. Posteriormente, las células transfectadas se colocaron en placas de 100 mm en las que había 10 mi de medio de crecimiento completo precalcntado a 37°C. Las células permanecieron sin cambiar el medio durante 24 horas, tras las cuales fueron lisadas con buffer de Laemli

10 2X si lo que se desea es ver la expresión de las proteínas sobreexpresadas, o fueron sometidas a ayuno de suero, si lo que se desea es realizar algún experimento que así lo reqUI era.

lA Ensayos de activación de las GTPasas de la superfamilia Ras

15 Los experimentos de precipitación por afinidad de Ras, Rho, Rac l y Cdc42, se llevaron a cabo utilizando proteínas de fusión GST (glutatión-S-transferasa) que tiene el dominio de unión específico para cada una de ellas (RBD); así se utilizó GST -RBD de Rafpara Ras, GST-RSO de Rhotekin para RhoA, GST-RBO de PAKI para Rae l y GST-RBD de WASP para Cdc42. La determinación del estado de activación de estas

20 GTPasas se llevó a cabo de la siguiente manera: las células transfectadas o no fueron estimuladas o no como se indica en el capítulo de resultados. Tras la estimulación, las células se lavaron con PBS y se lisaron como ya se había descrito anterionnente [Maillet, Robert et a l. 2003 Nat Cell Biol. Jul;5(7):633-639]. los lisados se centrifugaron a 4°C durante 15 min a 14.500 rpm y se incubaron durante I hora a 4°C

25 con 50 ~g de proteína de fusión previamente acoplada a bolas de glutatión sefarosa. Las proteínas precipitadas fueron disociadas de las bolas utilizando un buffer de carga 2X SDS-PAGE y fueron analizadas por inmunoblot. Las bandas inmunoreactivas fueron visualizadas con ECL (General Electric Healthcare).

30 1.5 Preparación del péptido (1-42lAB

La preparación del péptido se realizó de acuerdo con el protocolo descrito por Klein y col. [Klein W.L. et al.; 2001 Srain Res 24(4):219-24] para formar ADOls (del

inglés "Ap-Derived Diffusible Ligando"). El péptido (1-42)AP (Bachem) se retiró del congelador y se puso en hielo para preparar el stock. Se colocó en hielo HFIP (l,I,I,3,3,3,-hexatluoro-2-propanol) (Sigma) y se dejó enfriar. Se añadió HFIP al vial que contenía 1 mg del péptido (I-42)AP para obtener una concentración de 1 mM. Se 5 incubó a temperatura ambiente hasta su completa disolución manteniendo el vial cerrado, ya que el HFIP es altamente volátil. Cuando el péptido se había solubilizado por completo. se puso en hielo durante 15 minutos. Una vez transcurrido ese tiempo, se hicieron alícuotas de la solución y se dejaron los tubos sin cerrar en una campana de extracción toda la noche para permitir la evaporación del HFIP. Se secaron los tubos en 10 el Speedvac durante lO minutos para eliminar los restos de HFIP por completo. El stock se guardó a -800C. Se hizo un stock de péptido ( 1-42)A~ a 5 mM en dimetilsulfóxido (DMSO) 100% asegurando la completa resuspensión del péptido (este stock se debía preparar cada vez que se necesitase, ya que no se podía guardar el péptido en DMSO porque se formarían protofibrillas). Se diluyó esta mezcla en medio Ham's FI 2 sin rojo

15 fenol (PromoCell), la concentración máxima en esta disolución fue de 100 ,uM. Esta solución se incubó a 5°C durante 24 horas, posteriormente se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 minutos en frío, y se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo. Este sobrenadante era la preparación de ADDLs, que se iba a utilizar para los experimentos.

20 1.6 Ensayos para la determinación de la toxicidad y muerte celular por el pépfido (1 421AB

1.6. 1 Ensayo de la reducción del MTT [bromuro de 3-(4,S-dimetiltiazol-2-il)-2,Sdifeni ltetrazolio] La muerte neuronal fue cuantitativamente evaluada mediante el ensayo del MTT

25 [Mosmann T. el al.; 1983 J Immunol MClhods 65(1-2):55-63]. Para ello, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 104 células por pocillo. Al día siguiente se lavaron y se cambiaron de medio para mantenerlas 24 horas en medio sin FBS. Transcurrido ese tiempo, se sometió a las células a los diferentes tratamientos con los inhibidores y el péptido (1-42)A~, Y se mantuvo el tratamiento durante 24 horas. Para

30 realizar el ensayo, se utilizó el kit de MTT de Pro mega (CellTiter 96 Non-Radioactive cell proliferation assay kit) según las recomendaciones del fabricante: La medida espectrofotométrica se realizó en un lector de microplacas. En cada ensayo se realizaron todas las condiciones por triplicado; además, cada estudio se repitió un mínimo de 3 veces. Los valores obtenidos se transformaron en porcentajes dando el valor 100% de viabilidad a la absorbancia neta de las células control. El resto de valores correspondientes a los distintos tratamientos, se presentan como porcentajes sobre el

control.

1.6.2 Ensayos de apoptosis mediante doble marcaje con ioduro de propidio y anexina V para citometria de flujo

Para realizar los ensayos con anexina V se utilizó un kit de SO (FITC Anncxin V Apoptosis detection kit) en el que la anexina V estaba combinada con el fluorocromo FITC. Para estos experimentos se cultivaron las células SN4741 en placas de 100 mm de diámetro a una densidad de 3x I 06 células por placa. Al día siguiente, se sometieron a ayuno de FBS durante 24 horas, y una vez transcurrido este tiempo, se realizaron los distintos tratamientos con los inhibidores, con el péptido (1-42)A~ o con el vehículo, y se incubaron las células durante 24 horas. Al finalizar la incubación, las células se lavaron 2 veces con PBS, se tripsinizaron, y se recogieron en tubos de 15 mL. Las células se centrifugaron y se lavaron 2 veces con PBS frío para retirar los restos de tripsina, que puede interferir con la marcación con anexina V, se contabilizaron y se resuspendieron en la solución de anexina Va razón de Ixl06 células/mL. De esta solución, se cogieron 100 J.1L Yse pasaron a un tubo de citometría tapado con papel aluminio para proteger las células de la luz, y se añadieron 5 ~LL de anexina V y 5 J.1L de ioduro de propidio, se agitó suavemente y se dejó incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos protegido de la luz. La adquisición de los datos en el citó metro debe realizarse dentro de la hora posterior a la realización del marcaje.

La citometría de flujo permitió diferenciar y cuantificar las distintas poblaciones formadas por células vivas (AnV-/PI-), células apoptóticas tempranas (AnV+/PI-) y células apoptóticas avanzadas O necróticas (AnV+/PI+).

2. Resultados

El péptido {l-42)AP es uno de los actores principales que intervienen en el proceso de muerte neuronal en los cerebros de los pacientes con la enfermedad de Alzheimer. Del mismo modo, un gran número de líneas celulares de origen neuronal, también son sensibles al tratamiento con este péptido [Loo D.T. et al. 1993 Proc Natl Aead Sei U S A 90(17) :795 1-5; Allen 1. W. et al.; 1999. Neuropharmacology 38(8):1243-52: Xu J. S. et al.; 2001. J Neurosei 21(1):RC I18; Lee J. T. et al. 2004. J Cell Biol 164( 1): 123-31) Y la mayor o menor sensibilidad a la toxieidad del péptido (1

5 42)A~ es dependiente del tipo celular [Gschwend M. H. et al.; 1995 J Neurochem 65(1):292-300; Simakova S. B. el al.; 2007. J Neurosci 27(50):13719-29]. Lo primero que se estudió fue si la línea neuronal SN4741, proveniente de la Sustancia Nigra de ratón, era sensible a la toxicidad inducida por el tratamiento con el péptido (1-42)Ap.

El proceso de muerte en las células SN4741 fue cuantitativamente evaluado

10 mediante el ensayo del MTT, una medida de la actividad mitocondrial [Mosmann T. et al.; 1983 J Immunol Melhods 65(1-2):55-63]. El MTT es una sal de tetrazolio hidrosoluble que se reduce a formazán al ser metabolizado por las deshidrogenasas mitocondrialcs de las células viables. El form azán solubilizado se puede medir espectrofotométricamente a una longitud de o nda de 570 nm, correlacionando la

15 absorbancia obtenida con la viabilidad celular.

El péptido (1-42)A~ se preparó para formar ADDLs según el procedimiento descrito en el apartado de Materiales y Métodos. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 104 células por pocillo. Al día siguiente se lavaron y se cambiaron de medio para mantenerlas 24 horas en medio sin FBS. Transcurrido ese

20 tiempo, se sometió a las células a concentraciones crecientes del péptido (1-42)AP como se indica en la Figura I y se mantuvo el tratamiento durante 24 horas. Para realizar el ensayo, se utilizó el kit de MTT de Promega (CellTiter 96 Non-Radioactive cell proliferation assay kit) según las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se retiró el medio y se añadieron I00 ~LL de medio fresco sin FBS y 15 ~L de la solución de

25 MTT Y se incubaron las células durante 5 horas a 37°C en atmósfera de CO2 al 5% para permitir que las células viables realizasen la reacción metabólica descrita. Posterionnente, se añadieron 100 IJ.L de la solución de solubilización que lleva DMSO y se dejó toda la noche a 3 re para disolver los cristales de form azán formados. La determinación espectro fotométrica se realizó en un lector de micro placas y los valores

30 obtenidos se transformaron en porcentajes dando el valor del 100% de viabilidad al control.

Como puede verse en la Figura 1, las células SN474 1 son sensibles a la toxicidad inducida por el péptido (1-42)Ap. La viabilidad celular, medida como actividad mitocondrial, disminuye como consecuencia de la exposición al péptido (142)AP durante 24 horas, y la toxicidad aumenta de manera dependiente de la dosis, a concentraciones mayores de péptido, se produce una mayor muerte celular.

La determinación de la toxicidad celular mediante colorimetría permite detectar porcentaje de células viables, sin embargo, no permite discriminar si las células muertas mueren por necrosis o por apoptosis. Por lo tanto, para discriminar entre apoptosis y necrosis, se utilizó la tinción con Ancxina V combinada con ¡oduro de propidio y posterior análisis por citometría de flujo, ya que esta técnica permite la detección de la apoptosis mediante la pérdida de asimetría de la membrana en las células apoplóticas.

Las células viables mantienen una asimetría entre la cara externa e interna de la membrana plasmática, de modo que la fosfatidilserina se observa sólo en la cara interna. Esta asimetría de membrana se mantiene por la acción de los enzimas denominados tlipasas. La fosfatidilserina tiene la habilidad de translocar a la cara externa de la membrana plasmática en determinadas condiciones, como sucede al inicio de la apoptosis, sirviendo como diana de reconocimiento específica para los macrófagos que deben fagocitar a las células en degeneración. De este modo, la detección de la fosfatidilserina en la cara externa de la membrana puede servir como indicador de apoptosis.

Para realizar los ensayos con Anexina Y, se utilizó un kit de BD (FlTC Annexin V Apoptosis detection kit) en el que la Anexina Y estaba combinada con el fluorocromo FITC (isotiocianato de fluoresceína). Para estos experimentos se cultivaron las células SN474 1 en placas de lOO mm de diámetro a una densidad de 3xl06 células por placa. Al día siguiente, se sometieron a ayuno durante 24 horas, y una vez transcurrido este tiempo, se les trató con el péptido (1-42)AP o el vehículo, y se incubaron las células durante 24 horas. Al finalizar la incubación, las células se lavaron 2 veces con PBS, se tripsinizaron, y se recogieron en tubos de J 5 mL. Las células se centrifugaron y se lavaron 2 veces con PBS frío para retirar los restos de tripsina, que puede interferir con la marcación con Anexina Y, se contabilizaron y se resuspendieron en la solución de Anexina Y a razón de Ix I 06 células/mL. De esta solución, se cogieron I 00 ~L Y se añadieron 5 ).lL de Anexina Y y 5 ).LL de ioduro de propidio, y se dejó a temperatura ambiente durante 15 minutos protegido de la luz. La adquisición de los datos en el dtómetro se realizó dentro de la hora posterior a la realización del marcaje.

El péptido (1-42)AP induce la apoptosis en las células SN4741 (Figura 2). En los paneles superiores se observan dot plots de las células control (izquierda) y las células tratadas con el péptido (1-42)AP (derecha). El eje de abscisas corresponde a las células marcadas con ioduro de propidio yel eje de ordenadas, las marcadas con Ancxina V. Al utilizar a la vez los fluorocromos FITC (AnexinaV-FITC) (AnV/FITC) y el ioduro de propidio (PI) se pueden diferenciar y cuantificar las distintas poblaciones formadas por células vivas (AnV-/PI-) en el cuadrante Q3, células apoptóticas tempranas (AnV+/PI-) en el cuadrante Q4 y células apoptóticas avanzadas o necróticas (AnV+/PI+) en el cuadrante Q2 (Figura 2).

Además, se puede observar que la población celular en las condiciones control (panel superior izquierdo) se encuentra predominantemente en el cuadrante Q3, que corresponde a la población viable, mientras que el tratamiento con el péptido (1-42)AP (panel superior derecho), induce la apoptosis temprana y tardía detectada como un aumento de las células Anexina V positivas en los cuadrantes Q2 y Q4. En los paneles inferiores de la Figura 2, se muestran las curvas de la Anexina V, separando las poblaciones Anexina V negativas O viables (P2) y Anexina V positivas O apoptóticas (P3). Los valores corresponden a la cantidad de eventos registrados en cada una de estas poblaciones, representados como porcentaje del total. Se puede observar que el tratamiento de las células SN474 1 con el péptido (1-42)AP produce un incremento de la apoptosis de más de un 30%.

Una vez comprobado que las células SN474l eran sensibles a la toxicidad celular inducida por péptido (1-42)A~, se concluyó que, por lo tanto, esta línea celular era un buen modelo neuronal por su procedencia de la sustancia negra para el estudio de las vías de señalización que conducen a la muerte celular mediada por el péptido (1

42)A~.

Para poder estudiar con más detalle el efecto que el péptido (J-42)A~ ejercía sobre la activación de Rae 1, se determinó tanto la cinética de activación como las concentraciones necesarias para activar a Rac l. Para ello, se trataron las células con concentraciones crecientes del péptido ( 1-42)A~ tal como se indica en la Figura 3. La Figura 3A muestra la curva dosis-respuesta realizada en las células SN4741, en la cual, se puede observar que la activación de Racl es dependiente de la concentración del péptido (l-42)Ap. La concentración mínima del péptido que produce la máxima activac ión de Rael es 1,25 ~LM. Este resultado se confirmó en cultivos primarios de neuronas, en Los que también se pudo observar que la dosis mínima de péptido (1-42)A~ para inducir la máxima activación de Rae 1 es I ,25 ~(Figura 3B).

Por otra parte la activación de Rae 1 mediada por el péptido (1-42)AP se inició a los 15 minutos de exposic ión al péptido, y alcanzó su máxima activación a los 30 minutos para posterionnente ir disminuyendo hasta retomar a los niveles basales a los 60 minutos (Figura 4A). Estos resultados se confinnaron utilizando otro modelo celular como es la línea de neuroblastoma lMR32 y en la que se obtuvieron resultados similares, el péptido (l-42)A~ activaba Racl siendo la máxima activación al cabo de 30 minutos de tratamiento (Figura 4B).

Estos resultados mostraban por primera vez que el tratamiento con el péptido (1 42)AP sobre las monocapas de líneas celulares neuronales y cultivos primarios de neuronas inducía la activación de Rae 1, Y ésta era dependiente tanto del tiempo como de la concentración de péptido. En base a esto, se abordó el estudio de la caracterización de las cascadas de señalización que utiliza el péptido (I-42)A~ para activar a Racl y que probablemente están relacionadas con la muerte celular.

Para caracterizar la potencial vía de señalización que conduce a la activación de Rac l, se empezó por estudiar una de las grandes familias de serintreonin qui.nasas implicadas en la señalización intracelular temprana como son las PKCs, para lo cual se utilizó un inhibidor farmacológico, concretamente GFI09203X (GF) [3-[1-[3(dimetilamino )propil]-I H-indo 1-3-il]-4-(lH-indol-3-il)-IH-pirrolil-2,5 -diona)].

Las células SN4741 fueron pre-tratadas durante l hora con GF l ~M, posteriormente se realizó el tratamiento con el péptido (1-42)AP durante 30 minutos. Transcurrido el tiempo de tratamiento, las células se lavaron 3 veces con PBS frío y se lisaron con el tampón de lisis para rea lizar una precipitación por afinidad con el dominio RBD del efector PAK. Las muestras fueron separadas mediante SDS-PAGE y transferidas a membranas de nitrocelulosa. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando el anticuerpo anti-Rac l. La Figura S muestra que, el tratamiento en las células SN474l con el GF, bloqueaba la activación de Racl, lo que sugería que la

activación de la GTPasa Rae 1 por parte del péptido (1-42)A~ requería la activación de la familia PKC. Al igual que ocurría en las células SN4741, el pretratamicnto de las monocapas de cultivos primarios con el inhibidor GF, bloqueaba la activación de la GTPasa Racl

5 mediada por el péptido (1 -42)A~ (Figura 6). Estos resultados sugieren que la familia PKC podría estar implicada en las vías de señalización que el péptido (l-42)AP induce y que conllevan la activación de la GTPasa Rae l.

Para comprobar si se pueden activar las PKCs con ésteres de forbol y ver si Rae 1 se activa, las células SN4741 se mantuvieron en ayuno de suero durante 24 horas, 10 y tras el tratamiento con GF durante 1 hora, las células se trataron con Forbol-12miristato 13-acetato (PMA -del inglés «Phorbol 12-myristate l3-acetate") ] ¡.tM durante 15 minutos. Como se puede observar en la Figura 7, el PMA media en la activación de Rac l y al pre-tratar las células SN4741 con el GF, y estimular después con PMA, la activación de Racl no se indujo (Figura 7A) [lo que corroboraba los

15 resultados de que la familia de las PKCs podría estar implicada en la vía de señalización iniciada por el péptido (1-42)AP Y que conduce a la activación de Rac J]. Se realizó la misma aproximación experimental en neuronas primarias de rata y los resultados obtenidos mostraron que la activación de Rac l era dependiente de la actividad de las PKCs, ya que utilizando GF se bloqueaba la activación de esta GTPasa (Figura 78).

20 Por otro lado, para estudiar la posible implicación de PI3K en la muerte celular causada por el péptido (1-42)A~, las células SN474 l se pre-trataron durante l hora con 2-morfolin-4-il-8-fenilcromen-4-ona (Ly 294002 o, en ocasiones, "Ly" en esta descripción) 20 ¡.tM, un inhibidor de la PI3K, y posteriormente se realizó el tratamiento de 30 minutos con el péptido ( 1-42)A~ (1 ,25 ~LM). Transcurrido este tiempo, se

25 colocaron las placas sobre hielo, se lavaron las células 3 veces con PBS frío y se lisaron con el tampón de lisis para realizar una precipitación por afinidad con el dominio efector de PAK (Ras binding domain de PAK (RBD) . Las muestras fueron separadas mediante SDS-PAGE y transferidas a membranas de nitrocelulosa y las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando el anticuerpo anti-Rac l.

30 Los resultados obtenidos muestran que el pretratamiento de las monocapas con Ly bloqueaba la activación de Racl mediada por el péptido (1-42)A~ (Figura 8 panel izquierdo).

Al igual que ocurría en la línea celular SN4741, también en los cultivos

primarios de neuronas se producía una inhibición de la activación de la GTPasa Rae 1

mediada por el péptido (1-42)AP tras el pretratamicnto de las células con Ly (Figura 8,

panel derecho). Estos resultados mostraban que la PI3K se encontraba dentro de la vía

5

de señalización que utiliza el péptido (1-42)AP para activar la GTPasa Rae l.

Para establecer cuál era el orden jerárquico entre estas dos kinasas, PI3K y PKC,

se analizó el estado de fosforilación de PKD. PKD es una serin treonin kinasa sustrato

de la familia de las PKCs, y por lo tanto, se fosforila cuando estas kinasas se activan. En

la Figura 8 tercer panel se puede observar que el tratamiento con el péptido (J -42)AP de

lO

las células SN4741 , como en las neuronas primarias, produce una fosforilación de PKD

y que esta fosfori lación se ve inhibida cuando las monocapas celu lares son pretratadas

con el inhibidor de PI3K y posteriormente expuestas al péptido (1-42)Ap. Este resultado

significaba, por una parte, que tanto la PBKinasa como las PKCs se encontraban en la

misma ruta de señalización que conducía a la activación de Rac I y, por otra parte, que

15

la PJ3K se encontraba por encima de PKC en la vía de señalización.

Para explicar la conexión entre PI3K y PKC se estudió una de las moléculas que

potencialmente tienen capacidad para unir a estas dos kinasas: otra proteína con

actividad enzimática, la kinasa dependiente de fosfoinositoles, PDK I . PDKI es sustrato

de PI3K y que a su vez, es activadora de las PKCs.

20

Para verificar la hipótesis de que ambas kinasas PI3K y PKC se encontraban

conectadas mediante PDKI , se procedió a utilizar OS U-03012 (OSU) un inhibidor

fannacológico de esta última kinasa . Para ello, las células SN4741 se mantuvieron en

ayuno de suero durante 24 horas, al cabo de las cuales se realizó un pretratamiento con

OSU lO fLM , posteriormente se trataron con el péptido (1-42)AP (1,25 fLM) durante 30

25

minutos y se realizaron ensayos de precipitación por afinidad para comprobar el estado

de activac ión de la GTPasa Rac!. Como se puede observar en la Figura 9 (panel

izquierdo), el inhibidor de PDKI bloqueaba la activación de Racl mediada por el

péptido (J-42)AP, lo que apuntaba a que PDKI estaba implicada en la ruta de

señalización que conducía a la act ivación de Rac I y potencialmente actuaba como

30

vínculo entre PI3K y PKC en esta vía. Estos ensayos se realizaron también en cu ltivos

primarios de neuronas procedentes de cerebros de embriones de rata. Los resultados

obtenidos con estos cultivos primarios (Figura 9 -panel derecho), son consistentes con

5.

los obtenidos para las células SN4741: la activación de la GTPasa Rael por el péptido (l-42)AP, se ve inhibida al prctratar las células con OS U; por tanto, se puede concluir que PDKI forma parte de la cascada de señalización que desencadena el péptido (142)AP Y que conduce a la activación de Racl , y que su función en esta vía sería la de ejercer de puente entre P13K y PKC. Ya que el pretratamiento de las monocapas celulares con OSU y posterior tratamiento con el péptido (1-42)AP, el inhibidor de PDKI bloquea la fosforilación de PKD, se pone una vez más de manifiesto que las PKCs están por debajo de la ruta de señalización gobernada por PI3KJPDK 1.

Con estos resultados se propone, tal y como muestra la Figura 10, una novedosa cascada de señalización que descifraría cómo el péptido (I-42)A~ media en la activación de Racl yen esta ruta se verían implicadas las kinasas Pl3Kinasa, POK 1 y la fami lia de proteína kinasa C.

Para tratar de establecer si esta vía de señalización intervenía en la muerte celular causada por el péptido ( 1-42)A~, se decidió estudiar la implicación de PI3K, Akt y PDKI en este proceso de muerte celular. Para ello, las células SN474 l se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 105 células por pocillo y al día siguiente se les sometió a ayuno de suero permaneciendo así 24 horas antes de añadir los diferentes tratamientos. En todos los casos, los pre-tratamientos con los diferentes inhibidores se mantuvieron durante las 24 horas de tratamiento posterior con el péptido ( 1-42)A~.

Como puede observarse en la Figura 11, los inhibidores Ly y Aktll, produjeron un descenso de la viabilidad pe,. se ya que son por sí mismos tóxicos para las células. Esto se podría deber a que la vía PI3K1AKT es una de las principales vías de regulación de la supervivencia en muchos tipos celulares, entre e llos en las neuronas, si se tratan las células con inhibidores farmacológicos de PI3K y AKT, el bloqueo de la actividad basal de estas kinasas puede ser suficiente para que las células entren en un proceso de muerte. Por el contrario, la inhibición de la actividad de PDK 1 no modificó la viabilidad celular por lo que PDKI parece tener un espectro de acción más reducido que PI3K y/o Akt sobre la supervivencia celular ya que bloqueando su actividad basal no se manifestó toxicidad. Se observó que el inhibidor de PDKI (OSU) prevenía el efecto tóxico inducido por el péptido (J-42)A~, pasando de ser la viabilidad celular de un 50,28% en las células tratadas con el péptido ( 1-42)A~ (1 ,25 ~LM), a un 78,83% en las células p rctmtadas con OSU (1 ¡.tM). p<O,OOI.

De estos resultados se deduce que PDKI estaría relacionada con vías implicadas en la muerte celular y PDK 1 podría ser una diana con potencial terapéutico ya que bloqueando su actividad se prevenía la muerte neuronal inducida por el péptido (1

42)A~.

5 Por otro lado, se estudió cuál era el potencial grado de implicación de las PKCs en este proceso de muerte celular regulado por la acumulación del péptido ( 1-42)A~. Para ello, las células se pretrataron con el inhibidor GF durante 1 hora, y posterionnente se realizó el tratamiento con el péptido (1-42)AP (1 ,25 ~lM) durante 24 horas. Como se muestra en la Figura 12, el prctratamicnto de las células SN4741 con GF, fue capaz de

10 proteger de la toxicidad causada por el péptido (1 -42)A~. La viabilidad celular en las células tratadas con el péptido (1-42)A~ (1,25 ¡.1M) fue del 50,28%, Y esta viabilidad aumentó mediante el pretratamiento con GF hasta alcanzar un 77,96% en las células pro-tratadas con G F (5 ¡tM).

Estos datos sugerirían, al igual que para PK01, que las PKCs estarían

15 interviniendo de manera activa en la cascada de señalización que desembocaba en la muerte celular mediada por el péptido (J -42)AP, por lo que se observó, por primera vez, que bloqueando su actividad mediante el uso de inhibidores fannacológicos especí ficos, se podía revertir el fenotipo de muerte.

También se determinó el papel de Rac 1 en este proceso de muerte ce lular

20 mediado por el péptido ( 1-42)A~. Las monocapas se pretrataron con 6-mercaptopurina (6-MP) durante l hora y posterionnente durante 24 horas de tratamiento con el péptido (1-42)A~. En la Figura 13, se puede observar que, de la misma manera que ocurría cuando se inhibían POK l y PKCs, la inhibición de Rac l en estas condiciones hizo que las células SN474 1 resistieran a la acción tóxica del péptido (1-42)A~. La viabilidad

25 aumentó desde un 50,28% en las células tratadas con el péptido (1-42)A~, hasta un 75,5 1% al pre-tratar las monocapas con 6-MP (5 ~lM). Estos resultados indican que la GTPasa Racl podría ser, al igual que POKI y la familia de las PKCs, una potencial diana terapéutica que retrasara o bloqueara los efectos de la acumulación del péptido ( 142)A~.

30 Para verificar estos resultados se procedió a cuantificar la apoptosis mediante tincíón combinada con ioduro de propidio y Anexina V y se analizaron las muestras por citometria de flujo, ya que ésta es una metodología más específica y precisa para cuantificar apoptosis.

Como se puede observar en la Figura 14A, el tratamiento con el péptido (142)A~ a una concentración de 1 ,25 ~M durante 24 horas produjo un incremento de la apoptosis en las células SN4741 que alcanzó así un 37,88%. Cuando las células se prctrataron con los inhibidores farmacológicos de POK 1, PKC, y Rae 1, se consiguió proteger al 100% a las células del daño inducido por el péptido (l-42)AP. ya que la viabilidad alcanzó unos valores similares a aquellos de las células control sin tratar. Estos resultados indican que la toxicidad inducida por el péptido (J -42)AP en las células SN4741 , se puede bloquear in vill'o bloqueando las actividades de PDKI, PKCs y Rac l.

Este resultado, es muy importante ya que demuestra que la cascada de señalización descrita en estos experimentos interviene en la toxicidad celular inducida por el péptido (l-42)AP y que las moléculas implicadas en esta vía, son potenciales dianas terapéuticas que pueden proteger a las monocapas de la muerte celular inducida por el péplido (1-42)Ap.

El hecho de que GF fuera capaz tanto de inhibir la activación de Rac I como de proteger a las células de la toxicidad inducida por el péptido (1-42)AP, llevó a los inventores a descartar las PKCs atípicas como las posibles implicadas en esta cascada de señalización, ya que este inhibidor es especifico de las PKCs clásicas y nuevas [Toullee D. el al. 1991 J Biol Chem 266(24): 15771-81 : Martiny-Baron G. el al. 1993 J Biol Chem 268(13):9194-7; Jaeobson P. el al. 1995 J Pharmaeol Exp Ther 275(2):9951002; Coultrap S. el al. 1999 J Pharmaeol Exp Ther 290(1): 76-82].

Por lo tanto, estos resultados indican que las PKCs implicadas pudieran ser las clásicas o las nuevas y se planteó realizar los ensayos de toxicidad por MTT con distintos inhibidores más específicos para las distintas isoformas. Para ello, se utilizó Gó 6967, un inhibidor de las PKCs clásicas, principalmente a y p; y el inhibidor Rottlerin, que inicialmente se describió como un inhibidor selectivo de la PKC nueva o [Gschwendt, M. et al. 1994 J Neurochem 65(1):292-300], sin embargo, posteriormente se vio que también tenía efecto sobre PKC e[Villalba M. et al. 1999 J Immunol 163( 11 ):5813-9; Cordey and Pike 2006 J Neuroehem 96( 1 ):204-17].

El pretratamiento de las células SN474 I con concentraciones crecientes de 06 6967, produjo un aumento en la viabilidad celular del 13% (Figura 14 B). La viabilidad aumentó de un 50,28% en las células tratadas con el péptido (l-42)A~ hasta un 63,07% en las células prc-tratadas con Gü 6967 (4,5 nM), sin embargo, este aumento no fue significativo según el análisis estadístico por T de Student.

A continuación, se procedió a tratar las monocapas celulares con diferentes

5 concentraciones de Rottlerin y a determinar su efecto sobre la viabilidad celular mediante ensayos de MTT. Como puede observarse en la Figura 15, con una concentración de 1,5 J.!M de Rottlerin, no se apreciaba ningún efecto ni positivo, protección, ni negativo, toxicidad. En el otro extremo a una concentración de 30 J.lM de Rottlcrin, esta concentración per se resultaba tóxica para las células SN4741 . A

10 concentraciones que van desde 7,5 a 15 ~LM se observó un efecto protector absoluto, llegando a ser la viabilidad celular la misma que las monocapas control, no tratadas. A esas concentraciones, la viabilidad pasó de un 50,28% en las células tratadas con el péptido (1-42)AP y a un 90-95% en las células tratadas con Rottlerin.

Para verificar estos resultados se procedió a cuantificar la apoptosis mediante

15 tinción combinada con ioduro de propidio y Anexina V y se analizaron las muestras por citometría de flujo, ya que ésta es una metodología más específica y precisa para cuantificar apoptosis. Las células SN474 1 se pre-trataron con Rottlerin 7,5 ~M durante l hora, y posteriormente se indujo la apoptosis tratando con el péptido (1-42)A~ (1 ,25 JlM) durante 24 horas. Una vez transcurrido este tiempo, se realizó la tinción mediante

20 ioduro de propidio y Anexina V y la apoptosis se analizó por citometría de flujo. Como puede observarse en la Figura 16, el pre-tratamiento de las células SN4741 con el inhibidor Rottlerin, tuvo un efecto protector total frente a la apoptosis inducida por el péptido (l-42)AP, y la viabilidad de las células SN474 1 fue completa. La apoptosis inducida por el péptido (1-42)AP fue de un 43,52% y mediante el pretratamiento con

25 Rottlerin 7,5 JlM , esta apoptosis se redujo hasta alcanzar los niveles basales de las células sin tratamiento (15,15%). Estos resultados confirman la implicación de las PKCs en la cascada de señalización que conduce a la muerte celular inducida por el péptido (1-42)Ap. Una vez demostrada esta implicación, estos resultados muestran por primera vez que estas

30 moléculas pueden ser potenciales dianas terapéuticas que sirvan para frenar O bloquear la muerte celular inducida por el péptido (1-42)Ap.

Para consolidar este resultado y ver si Rottlerin tenia también efecto sobre la activación de Rae 1 mediada por el péptido (1-42)AP, se procedió a realizar ensayos de precipitación por afinidad. Para ello, se prc-trataron las células SN4741 con Rottlcrin 15 ~Mdurante 1 hora, y posteriormente se añadió péptido ( 1 -42)A~ ( 1.25 ~M) durante 30

5 minutos. Transcurrido ese tiempo, se procedió a realizar los ensayos de precipitación por afinidad con las proteínas de fusión que llevan el dominio CRIB de la proteína efectora Pak. La Figura 17 muestra que el pretratamiento de las células SN4741 con Rottlerin bloqueaba la activación de la GTPasa Rae 1 mediada por el péptido (1-42)AP sugiriendo la implicación de las nuevas PKCs, en la activación de la GTPasa Rac l

10 inducida por el péptido (1-42)A~, e implicando a Rac l en la cascada de muerte celular regulada por dicho péptido (1-42)A~.

Con objeto de determinar si estos resultados podían reproducirse en condiciones más fisiológicas, se procedió a estudiar los efectos de la inhibición de las nuevas PKCs en cultivos organotípicos de hipocampo y corteza entorrinal. Ambas estructuras

15 cerebrales son vulnerables en los estadíos iniciales de la enfermedad de Alzheimer. Los cultivos organotípicos procedían de ratas de 4 días, se extrajo el cerebro y se realizaron cortes del tejido cerebral que pennanecieron 7 días in vitro. Transcurrido ese período de tiempo, se añadió el péptido (1 -42)A~ a una concentración de 100 nM Y se mantuvo con este tratamiento durante 72 horas. Los cortes de cerebro se tiñeron con ioduro de

20 propidio, que no es permeable para las membranas de células vivas y solamente puede penetrar al interior de las células cuando la membrana celular pierde su integridad en el proceso de muerte celular. El ioduro de propidio que penetra en las células se intercala en el ADN emitiendo fluorescencia roja con un máximo a 6 10 nm cuando son excitadas a una longitud de onda de 540 nm. Los núcleos de las células que han perdido la

25 integridad de su membrana, se tiñen, por tanto, con el ioduro de propidio y emiten fluorescencia que se puede visualizar, y, consecuentemente, medir y cuantificar la muerte celular. Los cultivos organotípicos de hipocampo y corteza entorrinal se trataron a 2 concentraciones diferentes del inhibidor Rottlerin: 2,5 y 7,5 ~lM (Figura 18).

Como se muestra en la Figura 18, una concentración de 7,5 11M de Rottlerin 30 protege de la muerte celular inducida por el péptido ( 1-42)A~ tanto en cultivos organotípicos de hipocampo como en corteza entorrinal. Estos resultados confirman, de

manera más fisiológica la implicación de las nuevas PKCs en la señalización inducida por el péptido (1-42)AP que conduce a la muerte neuronal.

Estos resultados describen por primera vez cómo el péptido (1-42)AP transduce la señales de muerte ce lular a través de la ruta PI3Kinasa/PDK l/nuevas PKCs/Rac l/muerte neuronal, esta caracterización ha permitido proponer a PDKI, a las nuevas PKcs y a Rael como dianas terapéuticas para frenar el proceso de muerte neuronal dirigido por el péptido (1-42)AP (Figura 19).

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Uso de rottlerin para producir un medicamento para el tratamiento de una

   enfennedad asociada a la formación de depósitos ami loideos.

2. 2.

   Uso según la reivi ndicación 1, en el que dicha enfermedad asociada a la fOffi13ción

   de depósitos amiloideos es la enfermedad de Alzheimer, la demencia asociada a

   los cuerpos de Lewy, al síndrome de Down, al complejo de la demencia de Guam

   asociada al parkinsonismo, a la hemorragia cerebral hereditaria del tipo ho landés

   con amiloidosis, angiopatía p-amilo ide y hemorragia cerebral tal como

   hemorragia cerebral debida a angiopatía ami loide cerebral so litaria osteomielitis,

   tuberculosis, fiebre mediterránea familiar, hemorragia cerebral hereditaria, artritis

   reumatoide, enfermedad de Crohn, espondilitis anquilosante, infecciones por

   priones, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, diabetes tipo 11, enfermedad de

   Castleman, amiloidosis asociada al mieloma múltiple, enfermedad de Parkinson,

   parkinsonismo panencefalítico esclerosante subagudo, parkinsonismo

   posencefalítico, encefalitis pllgilística, complejo parkinsonismo-demencia de

   Gllam, enfermedad de Pick, atrofia sistémica múltiple (AS M), parálisis

   supranuc1ear progresiva (PSP) y degeneración corticobasal (DCB), síndrome de

   Down, enfermedad de cuerpos de Lewy, enfermedad de Huntington, esclerosis

   lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, Kuru, enfermedad de Gersl11ann

   Straüssler-Scheinker, amiloidosis cardiaca senil, polineuropatía familiar

   amiloidótica, o amiloidosis asociada a tumores endocrinos como el carcinoma

   medular del tiroides.

3. 3.

   Uso según la reivindicación 2, en el que dicha enfermedad asociada a la formación

   de depósitos ami loideos es la enfermedad de Alzheimer.

4. 4.

   Uso según cualquiera de las rei vindicaciones l a 3, en el que el medicamento

   30

   reduce la muerte neuronal inducida por el péptido {l-42)A~ en el sistema nervioso

   central (SNC).

5. 5.

   Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que rottlerin se usa combinado con otro fármaco útil para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

6. 6.

   Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que rottlerin está presente en un vehículo de administración de un fármaco farmacéuticamente aceptable.

7. 7.

   Un método para la identificación de compuestos capaces de inhibir la muerte celular inducida por depósitos ami lo ideos para el tratamiento de enfermedades asociadas a la formación de depósitos amiloideos que comprende:

   a) poner en contacto una célula con una proteína amiloidea; b) poner las células resultantes de a) con un compuesto candidato; y e) determinar en dicha célula los niveles los niveles de activación de una

   PKC nueva,

   en donde si los niveles de activación de dicha PKC nueva en la célula después de haber sido tratada con un compuesto candidato son menores que antes del tratamiento, el compuesto candidato es capaz de inhibir la muerte celular neuronal inducida por proteínas ami lo ideas y útil para el tratamiento de enfennedades asociadas a la formación de depósitos ami lo ideos.

8. 8.

   Método según la reivindicación 7, en el que dichas enfermedades son enfennedades asociadas a la fonnación de depósitos amiloideos del péptido beta amiloide y la proteína amiloidea es un péptido beta amiloide.

9. 9.

   Método según la reivindicación 8, en el que el péptido beta amiloide es el péptido ( 1-42)Ap.

10. 10.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que, adicionalmente, se determinan los niveles de muerte celular o viab ilidad del cultivo.