ES2241316T3

ES2241316T3 - Modulacion de proteinas quinasa de linaje multiple.

Info

Publication number: ES2241316T3
Application number: ES99943759T
Authority: ES
Inventors: Anna Maroney; Kevin M. Walton; Craig A. Dionne; Nicola Neff; Ernest Knight, Jr.; Marcie A. Glicksman
Original assignee: Cephalon LLC
Current assignee: Cephalon LLC
Priority date: 1998-08-26
Filing date: 1999-08-18
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2019-08-18
Also published as: AU765637B2; DK1105728T3; KR100700028B1; CZ2001701A3; AU5679399A; PT1105728E; BR9913190A; EA200100278A1; WO2000013015A1; CA2339539A1; DE69924738D1; HUP0103079A3; EA200500934A1; JP2002523780A; DE69924738T2; EP1105728B1; HUP0103079A2; TR200400635T2; PL346246A1; UA74772C2

Abstract

Un procedimiento para identificar un compuesto que modula la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple y promueve la supervivencia celular o muerte celular, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto in vitro dicha célula que contiene dicha proteína de quinasa de linaje múltiple con dicho compuesto; (b) determinar si dicho compuesto incrementa o disminuye la actividad de dicha proteína de quinasa de linaje múltiple ; y (c) determinar si dicho compuesto promueve la supervivencia celular o muerte celular.

Description

Modulación de proteínas quinasa de linaje múltiple.

La presente invención se refiere, en parte, a procedimientos para modular miembros de la familia de las quinasas de linaje múltiple (MLK), procedimientos para identificar compuestos que modulan una proteína de quinasas de linaje múltiple y promover la supervivencia celular o promover la muerte celular, procedimientos para identificar compuestos que pueden ser útiles en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos y/o inflamación, y procedimientos de tratamiento de trastornos neurodegenerativos con compuestos que inhiben una proteína de quinasa de linaje
múltiple.

Antecedentes de la invención

La familia de las MLK comprende un grupo de proteínas en las que la secuencia de proteínas de los dominios quinasa de los miembros de la familia se parecen estrechamente a las MAPKKK pero tienen mayor similitud entre sí que otras MAPKKK. Los miembros de la familia de MLK comprenden una parte de las cascadas de las quinasas muy complejas tales como, por ejemplo, la cascada de señalización de estrés, que implica modulación de, entre otros, la quinasa N-terminal c-Jun (JNK), que a su vez modula, entre otros, factores de transcripción que incluyen c-Jun, ATF2, y ELK - 1. JNK se describe en las patentes de Estados Unidos números 5.534.426, 5.593.884, 5.605.808, y en el documento WO 95/03324, cada una de las cuales se incorpora en esta memoria descriptiva por referencia en su totalidad.

La familia MLK incluye, en parte, los grupos siguientes: 1) la quinasa 1 de linaje múltiple (MLK1); 2) la quinasa 2 de linaje múltiple (MLK2); 3) la quinasa 3 de linaje múltiple (MLK3); 4) la quinasa que lleva cremallera de leucina (LZK); 5) la quinasa que lleva cremallera de leucina dual (DLK); y 6) la quinasa 6 de linaje múltiple (MLK6). La MLK1 tiene un dominio catalítico similar a ambas quinasas específico para Tyr y Ser/Thr. Dorow, y col., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 701 - 710. La MLK2 también tiene un dominio catalítico similar a ambas quinasas específico para Tyr o Ser/Thr. Dorow, y col., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 701 - 710. La MLK2 también se conoce como MST. Katoh, y col., Oncogene, 1995, 10, 1447 - 1451. La MLK3 comprende una proteína que, además del dominio quinasa, contiene dos cremalleras de leucina con una región básica carboxi - terminal adyacente, y una región rica en prolina. Ing, y col., Oncogene, 1994, 10, 1745 - 1750. La MLK3 también se conoce como SPKR (Gallo y col., J. Biol. Chem, 1994, 269, 15092 - 15100, y PTK1 (Ezoe, y col., Oncogene, 1994, 9, 935 - 938). LZK es una quinasa que lleva cremallera de leucina. Sakuma, y col., J. Biol. Chem, 1997, 272, 28622 - 28629. DLK tiene un dominio quinasa y dos motivos de cremallera de cremallera de leucina supuestos. Holzman, y col., J. Biol. Chem, 1994, 269, 30808 - 30817. DLK también se conoce como ZPK (Reddy, y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1994, 202, 613 - 620) y MUK (Hirai, y col., Oncogene, 1996, 12, 641 - 650). Los miembros de la familia MLK también se describen en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 5.676.945, 5.554.523, documento WO 93/15201, patente canadiense 2.148.898, Diener, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 9687 - 9692, DeAizpurua, y col., J. Biol. Chem, 1997, 272, 16364 - 16373, Tung, y col., Oncogene, 1997, 14, 653 - 659, Sells, y col., Trends in Cell Bioq., 1997, 7, 161 - 167, Mata, y col., J. Biol. Chem, 1996, 271, 16888 - 16896, Hirai, y col., J. Biol. Chem, 1997, 272, 15617 - 15173, Fan, y col., J. Biol. Chem, 1996, 271, 24788 - 24793, Blouin, y col., DNA and Cell Biol., 1996, 15, 631 - 642, Pombo, y col., Nature, 1995, 377, 750 - 754, Kiefer y col., EMBO J., 1996, 15, 7013 - 7025, Hu, y col., Genes & Dev., 1996, 10, 2251 - 2264, Su y col., EMBO J., 1997, 16, 1279 - 1290, y Dorow, y col., Eur. J. Brochem., 1995, 234, 492 - 500. Recientemente, se identificó otra quinasa relacionada con MLK en la base de datos de EST. La secuencia de ADN de este clon, MLK6, se describe mediante siete entradas de superposición. Sus números de identificación de clon son: 1007489, 1460085, 510915, 666323, F5555, 482188 y 178522, las secuencias de cada una de los cuales se incorporan en esta memoria descriptiva como referencias en su totalidad. Cada una de las referencias citadas en el párrafo presente se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad.

Recientemente, la expresión estable de ZPK de ha mostrado que reduce la capacidad proliferativa de fibroblastos NIH 3T3 se mide mediante un ensayo de formación de colonias. Bergeron, y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1997, 231, 153 - 155. Sin embargo, Bergeron, y col., no proporcionaron ningún dato que mostrara que ZPK modulaba la actividad de un sustrato de ZPK o si ZPK promovía la muerte celular.

La expresión de una construcción que codifica Myc - MLK2 en células Swiss 3T3 se ha mostrado que conduce a apoptosis aproximadamente 20 horas después de inyección. Nagata y col., EMBO J., 1998, 17, 149 - 158.

Los solicitantes han desarrollado numerosos compuestos indolo e indeno que, entre otros, inhiben el crecimiento celular asociado a estados hiperproliferativos e inhiben la muerte en una variedad de cultivos embriónicos, tal como ganglios de la raíz dorsal, ganglios cervicales superiores, estriados y neuronas motoras. Las patentes de Estados Unidos números 5.475.110, 5.591.855, 5.594.009, 5.461.146, 5.621.100, 5.621.101, 5.705.511, y 5.756.494, cada una de las cuales es de cesión común con la solicitud presente solicitud, y cada una de las cuales se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia. Los compuestos descritos en la patente de Estados Unidos Nº 5.705.511 que tienen la fórmula G se refieren en la presente solicitud por tener la fórmula I. Los solicitantes también muestran que la apoptosis de las neuronas motoras se inhibe por un derivado de K - 252a, un indolocarbazol que también modula la cascada de señalización de estrés. Maroney, y col., J. Neurosci., 1998, 18, 104 - 111, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad.

Debido a la lo inadecuado de los compuestos de selección que modulan miembros de la cascada de señalización de estrés y promueven la muerte celular o supervivencia celular, continúa siendo una necesidad procedimientos selectivos, nuevos y compuestos de selección. Además, continúa siendo una necesidad de ensayos de selección para compuestos terapéuticos que pueden ser útiles en el tratamiento de inflamación y trastornos degenerativos. La presente invención se refiere a éstos, así como a otros, fines importantes.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona procedimientos para identificar compuestos que modulan la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple y promueve la supervivencia celular que comprende las etapas de poner en contacto la célula que contiene la proteína de quinasa de linaje múltiple con el compuesto, determinando si el compuesto disminuye la actividad de la proteína de quinasa de linaje múltiple, y determinando si el compuesto promueve supervivencia celular.

La presente invención también proporciona procedimientos para identificar compuestos que modulan la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple y promueve la muerte celular comprendiendo las etapas de poner en contacto la proteína de quinasa de linaje múltiple con el compuesto, determinando si el compuesto incrementa la actividad de la proteína de quinasa de linaje múltiple, y determinando si el compuesto promueve la muerte celular.

La presente invención también proporciona procedimientos para identificar compuestos que pueden ser útiles en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos que comprenden poner en contacto una célula o extracto de células que contiene una proteína de quinasa de linaje múltiple con el compuesto y determinando si el compuesto disminuye la actividad de la proteína de quinasa de linaje múltiple.

La presente invención también proporciona procedimientos para identificar compuestos que pueden ser útiles en el tratamiento de inflamación que comprende poner en contacto una célula o extracto de células que contiene una proteína de quinasa de linaje múltiple con el compuesto y determinando si el compuesto disminuye la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple.

La presente invención también proporciona procedimientos para tratar un mamífero que tiene o es sospechoso de tener un trastorno degenerativo que comprende la administración a dicho mamífero de un compuesto que inhibe o reduce la actividad de la proteína de quinasa de linaje múltiple.

La presente invención también proporciona procedimientos para tratar un mamífero que tiene inflamación que comprende la administración a dicho mamífero de un compuesto que inhibe o reduce la actividad de la proteína de quinasa de linaje múltiple.

La presente invención también proporciona procedimientos para modular la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple que comprende poner en contacto la proteína de una célula que contiene la proteína con un compuesto que tiene la fórmula II:

1

en la que:

el anillo B y el anillo F, independientemente, y cada uno junto con los átomos de carbono a los que están unido, se seleccionan entre el grupo constituido por:

un anillo aromático carbocíclico de 6 miembros en el que entre 1 y 3 átomos de carbono se pueden reemplazar por átomos de nitrógeno;

un anillo aromático carbocíclico de 5 miembros no saturado; y

un anillo aromático carbocíclico de 5 miembros no saturado en el que bien un átomo de carbono se reemplaza con un átomo de oxígeno, nitrógeno, o azufre;

un átomo de carbono se reemplaza con un átomo de oxígeno, nitrógeno, o azufre;

dos átomos de carbono se reemplazan con un átomo de azufre y uno de nitrógeno, un átomo de oxígeno y un átomo de nitrógeno, dos átomos de nitrógeno; o tres átomos de carbono se reemplazan con tres átomos de nitrógeno;

R^{1} se selecciona entre el grupo constituido por:

H, alquilo sustituido o no sustituido que tiene entre 1 y 4 átomos de carbonos, arilo sustituido o no sustituido, arilalquilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, o heteroarilalquilo sustituido o no sustituido;

-C(=O)R^{9}, en el que R^{9} se selecciona entre el grupo constituido por alquilo, arilo y heteroarilo;

-OR^{10}, donde R^{10} se selecciona entre el grupo constituido por H y alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono;

-C(=O)NH_{2}, -NR^{11}R^{12}, -(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, -(CH_{2})_{p}OR^{10}, -O(CH_{2})_{p}OR^{10} y -O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, en los que p está entre 1 y 4; y en los que bien o

R^{11} y R^{12} se seleccionan cada uno de ellos independientemente entre el grupo constituido por H y alquilo que tienen entre 1 y 4 átomos de carbono; o

R^{11} y R^{12} juntos forman un grupo de unión de fórmula -(CH_{2})_{2}-X^{1}-(CH_{2})_{2}-, en el que X^{1} se selecciona entre el grupo constituido por -O-, -S-, y -CH_{2}-;

R^{2} se selecciona entre el grupo constituido H, alquilo que tiene entre y 4 átomos de carbono, -OH, alcoxi que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, -OC(=O)R^{9}, -OC(=O)NR^{11}R^{12}, -O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, -O(CH_{2})_{p}OR^{10}, arilalquilo sustituido o no sustituido que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono, y heteroarilalquilo sustituido o no sustituido;

R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se seleccionan cada uno de ellos independientemente entre el grupo constituido por:

H, arilo, heteroarilo, F, Cl, Br, I, -CN, CF_{3}, -NO_{2}, -OH, -OR^{9}, -O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, -OC(=O)R^{9}, -OC(=O)NR^{2}R^{7}, -OC(=O)NR^{11}R^{12}, -O(CH_{2})_{p}OR^{10}, -CH_{2}OR^{10}, -NR^{11}R^{12}, -NR^{10}S(=O)_{2}R^{9}, -NR^{10}C(=O)R^{9};

-CH_{2}OR^{14}, en el que R^{14} es el residuo de un aminoácido después de que se retire el grupo hidroxilo del grupo carboxilo;

-NR^{10}C(=O)NR^{11}R^{12}, -CO_{2}R^{2}, -C(=O)R^{2}, -C(=O)NR^{11}R^{12}, -CH=NOR^{2}, -CH=NR^{9}, -(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, -(CH_{2})_{p}NH
R^{14}, o -CH=NNR^{2}R^{2A} en los que R^{2A} es el mismo que R^{2};

-S(O)_{y}R^{2}-(CH_{2})_{p}S(O)_{y}R^{9}, -CH_{2}S(O)_{y}R^{14} en el que y es 0, 1 ó 2; alquilo que tiene entre 1 y 8 átomos de carbono, alquenilo que tiene entre 2 y 8 átomos de carbono, y alquinilo que tiene entre 2 y 8 átomos de carbono, en los que

cada grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo está no sustituido; o

cada grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo está sustituido con 1 a 3 grupos seleccionados entre el grupo constituido por arilo que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono, heteroarilo, arilalcoxi, heterocicloalcoxi, hidroxialcoxi, alquiloxi- alcoxi, hidroxialquiltio, alcoxi-alquiltio, F, Cl, Br, I, -CN, -NO_{2}, -OH, -OR^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}C(=O)NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}OC(=O)NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}CO_{2}R^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p}S(O)_{y}R^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p}NR^{10}C(=O)NR^{11}R^{12}, -OC(=O)R^{9}, -OCONHR^{2}, -O-tetrahidropiranilo, -NR^{11}R^{12}, -NR^{10}C(=O)R^{9}, -NR^{10}CO_{2}R^{9}, -NR^{10}C(O)NR^{11}R^{12}, -NHC(=NH)
NH_{2}, NR^{10}S(O_{2})R^{9}, -S(O)_{y}R^{9}, -CO_{2}R^{2}, -C(=O)NR^{11}R^{12}, -C(=O)R^{2}, -CH_{2}OR^{10}, -CH=NNR^{2}R^{2A}, -CH=NOR^{2}, -CH=N
R^{9}, -CH=NNHCH(N=NH)NH_{2}, -S(=O)_{2}NR^{2}R^{2A}, -P(=O)(OR^{10})_{2}, -OR^{14}, y un monosacárido que tiene entre 5 y 7 átomos de carbono en el que cada grupo hidroxilo del monosacárido está bien independientemente no sustituido o reemplazado con H, alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, alquilcarboniloxi que tiene entre 2 y 5 átomos de carbono, o alcoxi que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono;

X^{2} es O, S, o NR^{10};

R^{7} y R^{8} están cada uno de ellos independientemente seleccionados entre el grupo constituido por H, alquilo, que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, alcoxi que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, arilalquilo sustituido o no sustituido que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono, heteroarilalquilo sustituido o no sustituido, -(CH_{2})_{p}OR^{10}, -(CH_{2})_{p}
OC(=O)NR^{11}R^{12}, y -(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}; o R^{7} y R^{8} juntos forman un grupo de unión de fórmula -CH_{2}-X^{3}-CH_{2}-, en el que X^{3} es X^{2} o un enlace;

m y n son cada uno de ellos independientemente 0, 1, ó 2;

Y se selecciona entre el grupo constituido por -O-, -S-, -N(OR^{10})-, -N^{+}(O^{-})(R^{10})-, -N(OR^{10})-, y -CH_{2}-;

Z se selecciona entre el grupo constituido por un enlace, -O-, -CH=CH-, -S-, -C(=O)-, -CH(OR^{10})-, -N(R^{10})-,
-N(OR^{10})-, CH(NR^{11}R^{12})-, -C(=O)N(R^{17})-, -N(R^{17})C)=O)-, -N(S(O)_{y}R^{9})-, -N(SO)_{y}NR^{11}R^{12})-, -N(C(=O)R^{17})-, -C(R^{15}
R^{16})-, N^{+}(O^{-})R^{10})-, -CH(OH)-CH(OH)-, y -CH(O(C=O)R^{9})CH(OC(=O)R^{9A})-, en los que R^{9A} es el mismo que R^{9},

R^{15} y R^{16} están independientemente seleccionados entre el grupo constituido por H, -OH, -C(=O)R^{10}, -O(C=O)R^{9}, hidroxialquilo, y -CO_{2}R^{10},

R^{17} se selecciona entre el grupo constituido por H, alquilo, arilo, y heteroarilo;

A^{1} y A^{2} se seleccionan entre el grupo constituido por H, H; H, OR^{2}; H, -SR^{2}; H, -N(R^{2})_{2}; y un grupo en el que A^{1} y A^{2} juntos forman un resto seleccionado entre el grupo constituido por =O, =S, y =NR^{2};

B^{1} y B^{2} se seleccionan entre el grupo constituido por H, H; H, OR^{2}; H, -SR^{2}; H, -N(R^{2})_{2}; y un grupo en el que B^{1} y B^{2} juntos forman un resto seleccionado entre el grupo constituido por =O, =S, y =NR^{2};

con la condición de que al menos uno de los pares A^{1} y A^{2}, o B^{1} y B^{2}, forman =O.

La presente invención también proporciona procedimientos para modular la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple que comprende poner en contacto la proteína o célula que contiene la proteína con un compuesto que tiene la fórmula III:

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2

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en la que

Z_{1} es H y Z_{2} es H o Z_{1} y Z_{2} juntos forman =O;

R_{1} se selecciona entre el grupo constituido por H, Cl, CH_{2}SO_{2}C_{2}H_{5}, Br, CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH_{2}, CH_{2}S(CH_{2})_{2}N(CH_{3})_{2}, CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH_{2}, n-C_{4}H_{9}, NHCONHC_{6}H_{5}, NHCONHC_{2}H_{5}, CH_{2}SC_{2}H_{5}, CH_{2}SC_{6}H_{5}, N(CH_{3})_{2}, CH_{3}, CH_{2}OCONH
C_{2}H_{5}, NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}OC_{2}H_{5}, CH_{2}N(CH_{3})_{2}, OH, O-n-propilo; CH=NNH-C(=NH)NH_{2}, CH=N-N(CH_{3})_{2}, CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH-n-C_{4}H_{9}, CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}, CH_{2}S[3-(1,2,4-triazina)], CH_{2}CH_{2}SCH_{3};

3

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R_{2} se selecciona entre el grupo constituido por H, Br, Cl, I, CH_{2}S(CH_{2})_{2}N(CH_{3})_{2}, NHCONHC_{2}H_{5}, CH_{2}SC_{2}H_{5}, CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}, CH_{2}S[3-(1,2,4- triazina)], CH_{2}CH_{2}SCH_{3}; y CH_{2}OH;

X se selecciona entre el grupo constituido por H, CH_{2}OH, CH_{2}NH-SerinaH, CO_{2}CH_{3}, CONC_{6}H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}C_{6}
H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}N_{3}, CONHC_{2}H_{5}, CH_{2}NH-glicina, CON(CH_{3})_{2}, -CH_{2}NHCO_{2}-, CONH_{2}, CONHCH_{3}H_{7}, CH_{2}
NH-serina, CH_{2}SOCH_{3}, CH=NOH, CH_{2}NH-prolina, CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), CH=NNH-C(=NH)NH_{2}, CONH(CH_{2})_{2}OH, CH=NNHCONH_{2}, CH_{2}OCOCH_{3}, -CH_{2}OC(CH_{3})_{2}O-, CH_{2}SC_{6}H_{5}, CH_{2}SOC_{6}H_{5}, CO_{2}n-hexilo, -CONHCH_{3}, y CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3}; o uno de las siguientes fórmulas

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4

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y R se selecciona entre el grupo constituido por OH, y OCH_{3}.

La presente invención también proporciona procedimientos de modulación de la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple que comprende poner en contacto la proteína o una célula que contiene la proteína con un compuesto que tiene la fórmula IV:

5

en la que

Z_{1} es H y Z_{2} es H o Z_{1} y Z_{2} juntos forman =O;

R_{1} es H o Br;

R_{2} es H;

R_{3} es H, CH_{2}CH=CH_{2}, CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH, o

y

R_{4} es H, CH_{2}CH=CH_{2} o CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH

Breve descripción de los dibujos

Para los propósitos de ilustrar las realizaciones de la presente invención, en los dibujos se muestran ciertas características. Sin embargo, se debe entender que esta invención no se limita a las realizaciones precisas mostradas.

La figura 1 es un dibujo esquemático que muestra una preparación general de indenopirrolocarabazoles unidos por puentes.

La figura 2 es un dibujo esquemático que muestra una preparación general de indenopirrolocarabazoles unidos por puentes.

La figura 3 es un dibujo esquemático que muestra una preparación general de indenopirrolocarabazoles unidos a resina.

La figura 4 es un dibujo esquemático que muestra la preparación de indenopirrolocarabazoles, protegidos, solubles.

La figura 5 es un dibujo esquemático que muestra la preparación de intermedio V.

La figura 6 es un dibujo esquemático que muestra la preparación general de indenopirrolocarabazoles unidos por puentes usando el procedimiento A.

La figura 7 es un dibujo esquemático que muestra la preparación general de indenopirrolocarabazoles unidos por puentes usando el procedimiento B.

La figura 8 es un dibujo esquemático que muestra la preparación de indenopirrolocarabazoles unidos por puentes sustituidos en el anillo B.

La figura 9 es un dibujo esquemático que muestra la derivatización del anillo E de indenopirrolocarabazoles unidos por puentes.

La figura 10 muestra un gráfico de dos experimentos separados que muestran la cantidad de células PC - 12 neuronalmente diferenciadas viables que permanecen después de 5 días de cultivo en ausencia de NGF. Las células se expresan como porcentaje de control NGF en cada grupo (control de vector en ausencia de NGF, n = 12; los otros grupos, n = 3). La diferencia entre control de vector y conjuntos estables de células que expresan un mutante MLK - 3 negativo dominante en ausencia de NGF es estadísticamente significativa como se determina por una prueba T de dos lados (p < 0,05).

La figura 11A muestra la fosforilación de GST - SEK muestras por quinasas por FLAG - MLK - 3 expresada por baculovirus (mezcla de dominio de longitud completa y quinasa) usando un ensayo basado en gel radiactivo.

La figura 11B muestra el producto proteico de mielina fosforilada marcado por ^{32}P formado como resultado de una reacción quinasa catalizada por FLAG - MLK - 3 expresada por baculovirus (mezcla de dominio de longitud completa y quinasa) o dominio GST - MLK - 3.

La figura 12 es un ensayo de inmunotransferencia que muestra la fosforilación de GSt - SEK - 1 muestra por quinasa mediante FLAG - MLK - 3 expresada por baculovirus (mezcla de dominio de longitud completa y quinasa) como se detecta por un anticuerpo SEK - 1 fosfo específico.

La figura 13 muestra la fosforilación de proteína básica de mielina mediante dominio quinasa GST - MLK - 3 bacterianamente expresado que usa (\circ) el ensayo de precipitación de ácido tricloroacético de multiselección, o el (\bullet) procedimiento de membrana de fosfocelulosa.

La figura 14 muestra una curva de unión por saturación de [^{3}H]K252a incubada con lisado de células de insecto infectadas con baculovirus MLK - 3.

La figura 15A muestra la cantidad de c-jun marcado con ^{32}P en una reacción de inmunoprecipitación/quinasa a partir de las células que sobreexpresan MLK - 3, MLK - 2 p DLK y tratada con bien DMSO al 0,25% (control) o K - 252a 500 nM.

La figura 15B muestra un gráfico que cuantifica el porcentaje de actividad que permanece en las reacciones de inmunopercipitado/quinasa a partir de muestras descritas en la figura 15A. Las columnas representan la media de muestras duplicadas en las que la barra de error indica el intervalo de la media.

La figura 15C muestra la cantidad de c-jun marcado con ^{32}P en una reacción de inmunoprecipitación/quinasa a partir de las células que sobreexpresan HA - JNK1 sola o con MEKK1 a diversas cantidades de ADNc como se indica y se trata bien con DMSO al 0,25% (control) o 500 nM de compuesto III-3 (véase la tabla 3). Las columnas representan la media de muestras duplicadas donde la barra de error indica el intervalo de la media.

La figura 16 muestra que el compuesto III-3-promueve la supervivencia neuronal de una manera dependiente de la concentración. Las neuronas disociadas se cultivaron a partir de ganglios simpáticos (SG) (A), ganglios de la raíz dorsal (DGR) (B), ganglios filiares (CG) (C), y neuronas motoras (MN) (D), en presencia o ausencia de los factores tróficos indicados. Las células se contaron 48 horas después de sembrar como se describe en materiales y procedimientos. Los datos representan medias \pm DT de las determinaciones por triplicado o cuadriplicado. Se muestra uno de tres experimentos.

La figura 17 muestra microfotografías de contraste de fase de cultivos E12 DGR (A, E), E9 simpático (B, F), E8 ciliar (C, G) y E.5 neuronas motoras (D, H) después de 48 h en cultivo (24 horas para neuronas filiares) en presencia del factor neurotrófico respectivo (20 ng/ml de NGF para neuronas simpáticas y sensoriales 10 ng/ml de CTNF para neuronas filiares, 30 \mug/ml de extracto muscular (MEX) para motoneuronas ( A - D) o en presencia de compuesto III -
3 1 \muM (E - H). Bar = 200 \mum.

La figura 18 muestra una microfotografía de explantes de ganglios de la raíz dorsal in vitro. Los explantes de DRG de pollitos (E9) se sembraron en medio de placas de 96 pocillos que contienen BSA al 0,5%. Después de 2 h de período de unión, se realizaron adiciones: (A) DMSO control; (B) 20 ng/ml de NGF; (C) compuesto III - 3 250 nM. Cuarenta y ocho horas más tarde, el medio se retiró y se fijaron los explantes con paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato.

La figura 19 muestra el número de neuronas motoras lumbares de pollito que sobrevive en E10 después de tratamiento diario (E5-9) con dosis específicas del compuesto III - 3.Los datos presentados son la media \pm DT de 5 -
6 animales/grupo de tratamiento. El experimento reseñado se repitió dos veces. Los datos son de un experimento representativo y representan un lado de la columna lumbar. * p < 0,01, ** p < 0,001, prueba de t de Student entre compuesto III - 3 y grupos control con corrección de Bonferroni.

La figura 20 muestra el número de neuronas motoras en el núcleo espinal de ratas hembras del bulbo cavernoso (SNB) que sobrevive en PN10 o PN60 después de tratamiento diario (PN1 - 5) compuesto III - 3, o vehículo control (Solutol™ al 5%). En PN10 (A,B) o ON 60 (B), se sacrificaron las ratas y al región y la región de la médula espinal que contiene el SNB se diseccionó y se procesó para histología; las neuronas motoras teñidas con violeta Cresilech se contaron después en secciones en serie de la región 5-sacra 1 lumbar de la médula espinal como se ha descrito previamente (Wingfield, y col., Steroids, 1975, 26, 311 - 327). Los datos experimentales son la media \pm ETM de 4 - 8 animales/grupo de tratamiento.

La figura 21 muestra pérdida de inmunorreactividad ChAT después de axotomía hipoglosal en la rata adulta después de tratamiento con el compuesto III - 3. Las microfotografías del núcleo hipoglosal después de transección del nervio hipoglosal y tratamiento con (A) solución de vehículo junto (Solutol (CM) al 5%) y (B) 200 \mug del compuesto III -
3 aplicado al sitio de la transacción. (C) Número de ChAT - neuronas motoras hipoglosales inmunorreactivoas después de los tratamientos descritos en (A) y (B) anteriores. Los resultados se expresan como el porcentaje de ChAT -
neuronas motoras hipoglosales inmunorreactivoas con 100% definido como el número de ChAT - neuronas motoras hipoglosales inmunorreactivoas en el núcleo hipoglosal contralateral, no lesionado.

La figura 22 muestra la inhibición de la ruta MLk - 3 demuestra in vivo eficacia y bloqueo de casos de fosforilación hacia abajo. La figura 22A muestra el incremento de neuronas inmunorreactivas de tirosina hidrolasa de la sustancia negra después de la lesión de MPTP tras la administración sistémica del compuesto III - 3. La figura 22B es una inmunotransferencia representativa que muestra el incremento inducido por MPTP en los niveles de MKK4 fosforilada. la figura 22C muestra una inmunotransferencia representativa y ELISA que muestra atenuación de MKK4 fosforilada inducida por MPTP en presencia del compuesto III - 3.

La figura 23 muestra la inducción de IL - 2 en células Jurkat. La figura 23A muestra el curso del tiempo de la inducción de IL - 2. La figura 23b muestra la inhibición de la inducción de IL - 2 por el compuesto III - 3. La figura 23c muestra la inhibición de la inducción de IL - 2 por el compuesto III - 3 y compuesto I - 4.

Descripción detallada de la invención

Como se ha empleado anteriormente y a los largo de la descripción, los siguientes términos, salvo que se indique otra cosa, se entenderá que tienen los significados siguientes.

"Apoptosis" se refiere a una forma morfológica específica de al muerte celular caracterizada por la fragmentación de células y sus núcleos en partículas unidas a membrana. La apoptosis se puede desencadenar mediante, por ejemplo, tratamiento con compuestos que inducen apoptosis tal como etopósido, estaurosporina, factor á de necrosis tumoral, ceramida, y similares, o por condiciones tales como irradiación por rayos X.

El término "muerte celular" se refiere a la muerte de células por apoptosis, necrosis, u otros medios ampliamente conocidos en la técnica. "Muerte celular" se caracteriza, por ejemplo, como un descenso en el número de células totales o un descenso en la viabilidad celular comparada con poblaciones de células controles no tratados. Los compuestos que "promueven la muerte celular" dan como resultado un descenso en número de células o un descenso en la viabilidad celular comparado con las poblaciones control. Por el contrario, los compuestos que "promueven al supervivencia celular" dan como resultado un incremento en los números de células o viabilidad celular, o que ralentiza o reduce la velocidad de muerte celular.

Los términos "reacciona selectivamente" o "se une específicamente" describe compuestos que física o químicamente interactúa directamente con una proteína MLK. Por el contrario, los compuestos que "no reaccionan selectivamente" o se "unen selectivamente" pueden afectar a las proteínas cadena abajo o cadena arriba de la proteína MLK, y de este modo afectan a la actividad d3e proteínas MLK, pero no interactúan física o químicamente directamente con una proteína MLK.

El término "modula" se refiere a incremento o descenso de una actividad de una proteína particular de sustrato de la misma.

La presente invención se refiere, en parte, a procedimientos para identificar los compuestos que modulan la actividad de una proteína MLK y promueve bien la supervivencia celular o muerte celular. Losa compuestos que dan como resultado un incremento de la actividad de al proteína MLK pueden promover la muerte celular, mientras que los compuestos que dan como resultado un descenso de la actividad de la proteína MLk pueden promover la supervivencia celular.

La proteína MLK puede ser cualquier proteína que identificada por pertenecer a la clase de MLK de proteínas. Preferiblemente, la proteína MLK se selecciona entre el grupo constituido por MLK1, MLK2, MLK3, (SPRK, PTK1), LZK, DLK (ZPOK, MUK), y MLK6 que se han descrito anteriormente. En las reacciones preferidas de la invención, los procedimientos identifican compuestos que interactúan directamente o se unen con la proteína MLK como se determina en los ensayos de unión, ensayos de quinasa. u otros ensayos equivalentes.

Con el fin de identificar compuestos que modulan la actividad de la proteína MLK y promover la supervivencia celular o muerte celular, o célula o células que contienen la proteína MLK se pone en contacto con el compuesto de ensayo. El contacto puede tener lugar en tampones o medios bien conocidos por los experto en la técnica. Además, se pueden usar números variables de células y concentraciones de compuestos de ensayo. Se determina si el compuesto de ensayo incrementa o disminuye la actividad de la proteína MLK. Además, también se determina si el compuesto de ensayo promueve la supervivencia celular o muerte celular.

Las células que están en contacto con los compuestos de ensayo pueden ser cualquier célula de mamífero. Preferiblemente, la célula es una célula neuronal. Preferiblemente, la célula está implicada en una enfermedad neurodegenerativa. Para propósitos de la presente invención, una "enfermedad neurodegenerativa", un "trastorno neurodegenerativo" son intercambiables y se usan para describir cualquier enfermedad o trastorno que implica células neuronales o células implicadas en el sistema neuronal, incluyendo, pero sin limitación a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de neuronas motoras, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, enfermedad cerebrovascular, demencia por SIDA, enfermedad de Huntington, y lesiones por conmoción o penetrantes del cerebro o médula espinal.

La actividad de la proteína MLK se puede determinar mediante numerosas técnicas. Por ejemplo, la actividad de MLK se puede determinar midiendo la actividad de un sustrato de la proteína MLK. Tales sustratos se conocen bien y fácilmente discernibles por los expertos en la técnica. Preferiblemente, el sustrato es un miembro de la familia de la proteína quinasa activada por mitógeno de la familia o de la familia de la proteína quinasa activada por mitógeno o sustratos adicionales hacia debajo de la ruta que incluye, pero no se limita a, una proteína seleccionada entre el grupo constituido por JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, p38\alpha, p38\beta, p38\gamma, p38\delta, MEK1, MEK2, MKK3, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1, y el homólogo de mamífero de AEX-3, y también sustratos generales de proteína quinasas de Ser/Thr tal como la proteína básica de mielina (MBP). Los reactivos y procedimientos para medir la actividad de los sustratos los conocen bien los expertos en al técnica. La presencia d MLK también se puede determinar midiendo la cantidad de la proteína MLK o ARNm que codifica la proteína MLK. Los expertos en al técnica conocen bien los reactivos, incluyendo anticuerpos y sondas de oligionucleótidos, así como procedimientos de medición de la cantidad de ADN o proteína, incluyendo transferencias de Northern y Western. La actividad de la proteína MLK también se puede determinar mediante un ensayo de quinasa in vitro. Los ensayos de quinasa in vitro los conocen bien los expertos en al técnica. Otras técnicas para medir la actividad de la proteína los conocen bien los expertos en al técnica y se pretende que estén abarcadas por la presente invención. De este modo, los expertos en la técnica pueden determinar si el compuesto de ensayo modula, es decir, incrementa o disminuye, la actividad de la actividad de la proteína.

Si el compuesto promueve o no la supervivencia celular o muerte celular se puede determinar de numerosas maneras. Preferiblemente, la promoción de la supervivencia celular o muerte celular se determina usando células con riesgo de teñirse y comparando la cantidad de células que se pusieron en contacto con el compuesto de ensayo y permanecen vivas con la cantidad de células que no se pusieron en contacto con el compuesto de ensayo y permanecen vivas. Preferiblemente, las células son neuronas motoras embriónicas primarias que están programadas para morir. Las v se describen en el documento de Maroney, y col., J. Neurosci., 1998, 18, 104 - 111, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad. Las neuronas motoras embriónicas primarias morirán salvo que sean rescatadas por el compuesto de ensayo. De este modo, numerosas neuronas motoras vivas en la población de neuronas motoras tratadas con el compuesto de ensayo comparado con el número de neuronas motoras en al población de neuronas motoras que no se tratan con el compuesto de ensayo es indicativo de un compuesto de ensayo que promueve la supervivencia celular. Por el contrario, un número menor de neuronas motoras en al población de neuronas motoras tratadas con el compuesto de ensayo comparado con el número de neuronas motoras en al población de neuronas motoras que no se trataron con el compuesto de ensayo es indicativo de un compuesto de ensayo que promueve la muerte celular.

En otra realización de al invención, las células normales, o células de tipo salvaje se convierten en células en riesgo de sobreexpresar la proteína MLK, como se describe más adelante en los ejemplos, y después puestas en contacto con el compuesto de ensayo. Las células que sobreexpresan proteínas MLK pueden morir salvo que sean rescatadas por el compuesto de ensayo. La sobreexpresión de proteínas MLK se puede lograr usando vectores capaces de expresar la proteína particular en el interior de la célula. Los vectores de expresión los conocen bien los expertos en la técnica. Además, los expertos en al técnica conocen bien los vectores de expresión. Los vectores de expresión que expresan cualquiera de las proteínas MLK se pueden preparar de una manera similar a los descritos en los ejemplos. Un gran número de células vivas en al población de células sobreexpresadas que no se trataron con el compuesto de ensayo es indicativo de un compuesto de ensayo que promueve la supervivencia celular. Por el contrario, un número menor de células vivas en la población de células sobreexpresadas tratadas con el compuesto de ensayo comparado con el número de células vivas en al población de células sobreexpresadas que no se trataron con el compuesto de ensayo es indicativo de un compuesto de ensayo que promueve muerte celular.

En otra realización de la invención, la promoción de supervivencia celular se determina observando o midiendo un descenso de apoptosis. La contracción citoplásmica y condensación nuclear están asociadas a apoptosis. De este modo, los expertos en al técnica pueden medir un descenso en apoptosis midiendo u observando una contracción citoplásmica y/o condensación nuclear. Además, los expertos en la técnica pueden medir apoptosis empleando técnicas de tinción convencionales.

En otra realización de la invención, células normales, de tipo salvaje se pueden usar para identificar compuestos que promueven muerte celular. Las células neuronales normales sobrevivirán salvo que estén inducidas a morir por el compuesto de ensayo. Un menor número de células vivas en la población de células normales tratadas con el compuesto de ensayo comparado con el número de células vivas en la población de células normales que no se trataron con el compuesto de ensayo es indicativo de un compuesto de ensayo que promueve muerte celular. Por el contrario, un número mayor o igual de células vivas en la población de células normales tratadas con el compuesto de ensayo comparado con el número de células vivas en al población de células vivas que no se trataron con el compuesto de ensayo no es indicativo de un compuesto de ensayo que promueve muerte celular.

La presente invención también se dirige, en parte a procedimientos para modular la actividad de una proteína MLK que comprende poner en contacto la proteína o una célula que contiene la proteína con un compuesto que tiene la fórmula G (fórmula I indicada en esta memoria descriptiva) expuesta en la patente de estados unidos Nº 5.705.511, que es de cesión común con la solicitud presente y se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad.

\newpage

La presente invención también se refiere, en parte, a procedimientos para modular la actividad de una proteína MLK que comprende poner en contacto la proteína o una célula que contiene la proteína con un compuesto que tiene la fórmula III a continuación:

6

Z_{1} es H y Z_{2} es H o Z_{1} y Z_{2} juntos forman =O;

R_{1} se selecciona entre el grupo constituido por H, Cl, CH_{2}SO_{2}C_{2}H_{5}, Br, CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH_{2}, CH_{2}S(CH_{2})_{2}N(CH_{3})_{2}, CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH_{2}, -n-C_{4}H_{9}, NHCONHC_{6}H_{5}, NHCONHC_{2}H_{5}, CH_{2}SC_{2}H_{5}, CH_{2}SC_{6}H_{5}, N(CH_{3})_{2}, CH_{3}, CH_{2}OCONHC_{2}
H_{5}, NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}OC_{2}H_{5}, CH_{2}N(CH_{3})_{2}, OH, O n-propilo, CH=N-N(CH_{3})_{2}, CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH-n-C_{4}H_{9}, CH_{2}OCH_{2}O
CH_{2}CH_{3}, CH_{2}S[3-(1,2,4-triazina)], CH_{2}CH_{2}SCH_{3},

7

X se selecciona entre el grupo constituido por H, CH_{2}OH, CH_{2}NH-SerinaH, CO_{2}CH_{3}, CONC_{6}H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}C_{6}
H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}N_{3}, CONHC_{2}H_{5}, CH_{2}NH-glicina, CON(CH_{3})_{2}, -CH_{2}NHCO_{2}-, CONH_{2}, CONHCH_{3}H_{7}, CH_{2}
NH-serina, CH_{2}SOCH_{3}, CH=NOH, CH_{2}NH-prolina, CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), CH=NNHC(=NH)NH_{2}, CONH(CH_{2})_{2}OH, CH=NNHCONH_{2}, CH_{2}OCOCH_{3}, -CH_{2}OC(CH_{3})_{2}O-, CH_{2}SC_{6}H_{5}, CH_{2}SOC_{6}H_{5}, CO_{2}n-hexilo, -CONHCH_{3}, y CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3}; o uno de las siguientes fórmulas

8

y

R se selecciona entre el grupo constituida por OH, y OCH_{3}.

En realizaciones preferidas de la invención, Z_{1} y Z_{2} son H, X es CO_{2}CH_{3}, R_{1} es NHCONHC_{2}H_{5}, R_{2} es CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), y R es OH. En otras realizaciones preferidas de la invención, Z_{1} y Z_{2} son H, X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} y R_{2} son CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}, y R es OH; o Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H, X es CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3}, y R es OH; o Z_{1}, Z_{2}, y R_{1}, son H, R_{2} es CH_{2}OH, X es CO_{2}CH_{3}, y R es OH; o Z_{1}, y Z_{2} son H, R_{1} y R_{2} son H_{2}S[3-(1,2,4-triazina)], X es CO_{2}CH_{3}, y R es OH; o Z_{1} y Z_{2} son H, R_{1} es Br, R_{2}, es I, X, es CO_{2}CH_{3}; y R es OH; o Z_{1} y Z_{2} son H, R_{1} y R_{2} son CH_{2}CH_{2}SCH_{3}; X es CH_{2}CH_{3}, y R es OH; o Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H, X es CO_{2}CH_{3}, y R es CH_{3}; o Z_{1} y Z_{2} juntos forman =O, R_{1} y R_{2} son Br, X es CO_{2}CH_{3}, y R es OH.

La presente invención también se dirige, en parte a procedimientos para modular la actividad de una proteína MLK que comprende poner en contacto la proteína o una célula que contiene la proteína con un compuesto que tiene la fórmula II a continuación:

9

en al que el anillo B y anillo F, independientemente, y cada uno juntos forman con los átomos de carbono a los que están unidos, se seleccionan entre el grupo constituido por:

a): un anillo aromático carbocíclico no saturado de 6 miembros en el que 1 a 3 átomos de carbono se pueden reemplazar con átomos de nitrógeno;

b): un anillo aromático carbocíclico no saturado en el que bien

1): un átomo de carbono se reemplaza con un átomo de oxígeno, nitrógeno, o azufre;

2): dos átomos de carbono se reemplazan con un átomo de azufre y un átomo de nitrógeno, o dos átomos de nitrógeno; o

3): tres átomos de carbono se reemplazan con tres átomos de nitrógeno;

R^{1} se seleccionan entre el grupo constituido por:

a): H, alquilo sustituido o no sustituido que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, arilo sustituido o no sustituido, arilalquilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, o heteroarilalquilo sustituido o no sustituido;

b): -C(=O)R^{9}, donde R^{9} se selecciona entre el grupo constituido por alquilo, arilo y heteroarilo;

c): -OR^{10}, donde R^{10} se selecciona entre el grupo constituido por H, alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono;

d): -C(=O)NH_{2}, -NR^{11}R^{12}, -(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, -(CH_{2})_{p}OR^{10}, -O(CH_{2})_{p}OR^{10} y -O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, en los que p está entre 1 y 4; y en los que bien

1): R^{11} y R^{12} se seleccionan cada uno de ellos independientemente entre el grupo constituido por H y alquilo que tienen entre 1 y 4 átomos de carbono; o

2): R^{11} y R^{12} juntos forman un grupo de unión de fórmula -(CH_{2})_{2}-X^{1}-(CH_{2})_{2}-, en el que X^{1} se selecciona entre el grupo constituido por -O-, -S-, y -CH_{2}-;

R^{2} se selecciona entre el grupo constituido H, alquilo que tiene entre y 4 átomos de carbono, -OH, alcoxi que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, -OC(=O)R^{9}, -OC(=O)R^{11}R^{12}, -OC(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, -O(CH_{2})_{p}OR^{10}, arilalquilo sustituido o no sustituido que tiene entre 6 y 100 átomos de carbono, y heteroarilalquilo sustituido o no sustituido;

a) H, arilo, heteroarilo, F, Cl, Br, I, -CN, CF_{3}, -NO_{2}, -OH, -OR^{9}, -O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, -OC(=O)R^{9}, -OC(=O)NR^{2}R^{7}, -OC(=O)NR^{11}R^{12}, -O(CH_{2})_{p}OR^{10}, -CH_{2}OR^{10}, -NR^{11}R^{12}, -NR^{10}S(=O)_{2}R^{9}, -NR^{10}C(=O)R^{9};

b) -CH_{2}OR^{14}, en el que R^{14} es el residuo de un aminoácido después de que se retire el grupo hidroxilo del grupo carboxilo;

c) -NR^{10}C(=O)NR^{11}R^{12}, -CO_{2}R^{2}, -C(=O)R^{2}, -C(=O)NR^{11}R^{12}, -CH=NOR^{2}, -CH=NR^{9}, -(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, -(CH_{2})_{p}
NHR^{14}, o -CH=NNR^{2}R^{2A} en los que R^{2A} es el mismo que R^{2};

d) -S(O)_{y}R^{2}-(CH_{2})_{p}S(O)_{y}R^{9}, -CH_{2}S(O)_{y}R^{14} en el que Y es 0, 1 ó 2;

e) alquilo que tiene entre 1 y 8 átomos de carbono, alquenilo que tiene entre 2 y 8 átomos de carbono, y alquinilo que tiene entre 2 y 8 átomos de carbono, en los que

1): cada grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo está no sustituido; o

2): cada grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo está sustituido con 1 a 3 grupos seleccionados entre el grupo constituido por arilo que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono, heteroarilo, arilalcoxi, heterocicloalcoxi, hidroxialcoxi, alcoxi-alcoxi, hidroxialquiltio, alcoxi-alquiltio, F, Cl, Br, I, -CN, -NO_{2}, -OH, -OR^{9}, -X^{2} (CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}C(=O)NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}OC(=O)NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}CO_{2}R^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p}S(O)_{y} R^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p}NR^{10}C(=O)NR^{11}R^{12}, -OC(=O)R^{9}, -OCONHR^{2}, -O-tetrahidropiranilo, -NR^{11}R^{12}, -NR^{10}C(=O)R^{9}, -NR^{10}CO_{2}R^{9}, -NR^{10}C(O)NR^{11}R^{12}, -NHC(=NH)NH_{2}, NR^{10}S(O_{2})R^{9}, -S(O)_{y}R^{9}, -CO_{2}R^{2}, -C(=O)NR^{11}R^{12}, -C(=O)R^{2}, -CH_{2}OR^{10}, -CH=NNR^{2}R^{2A}, -CH=NOR^{2}, -CH=NR^{9}, -CH=NNHCH(N=NH)NH_{2}, -S(=O)_{2}NR^{2} R^{2A}, -P(=O)(OR^{10})_{2}, -OR^{14}, y un monosacárido que tiene entre 5 y 7 átomos de carbono en el que cada grupo hidroxilo del monosacárido está bien independientemente no sustituido o reemplazado con H, alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, alquilcarboniloxi que tiene entre 2 y 5 átomos de carbono, o alcoxi que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono;

X^{2} es O, S, o NR^{10};

m y n son cada uno de ellos independientemente 0, 1, ó 2;

Z se selecciona entre el grupo constituido por un enlace, -O-, -CH=CH-, -S-, -C(=O)-, -CH(OR^{10})-, -N(R^{10})-,
-N(OR^{10})-, CH(NR^{11}R^{12})-, -C(=O)N(R^{17})-, -N(R^{17})C(=O)-, -N(S(O)_{y}R^{9})-, -N(SO)_{y}NR^{11}R^{12})-, -N(C(=O)R^{17})-, -C(R^{15}
R^{16})-, -N^{+}(O^{-})R^{10})-, -CH(OH)-CH(OH)-, y -CH(O(C=O)R^{9})CH(OC(=O)R^{9A})-, en los que R^{9A} es el mismo que R^{9},

B^{1} y B^{2} se seleccionan entre el grupo constituido por H, H; OR^{2}; H, -SR^{2}; H, -N(R^{2})_{2}; y un grupo en el que B^{1} y B^{2} juntos forman un resto seleccionado entre el grupo constituido por =O, =S, y =NR^{2};

La presente invención también proporciona procedimientos para modular la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple que comprende poner en contacto la proteína o célula que contiene la proteína con un compuesto que tiene la fórmula IV a continuación:

\vskip1.000000\baselineskip

10

en la que

Z_{1} es H y Z_{2} es H o Z_{1} y Z_{2} juntos forman =O;

R_{1} es H o Br;

R_{2} es H;

R_{3} es H, CH_{2}CH=CH_{2}, CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH, o

11

y

R_{4} es H, CH_{2}CH=CH_{2} o CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH.

En realizaciones preferidas de la invención

R_{1}, R_{2}, R_{4}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} es CH_{2}CH=CH_{2}. En otras realizaciones preferidas de la invención, R_{1} es Br y R_{2}, R_{3}, R_{4}, Z_{1}, y Z_{2} son H; o R_{1}, R_{2}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} y R_{4} son CH_{2}CH=CH_{2}; o R_{1}, R_{2}, R_{3}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{4} es CH_{2}CH=CH_{2}; o R_{1}, R_{2}, Z_{1}, y Z_{2} son H; y R_{3} y R_{4} son CH_{2}CHCH_{2}OH; o R_{1}, R_{2}, R_{4}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} es

12

La presente invención también proporciona procedimientos para identificar compuestos que pueden ser útiles en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos que comprenden poner en contacto una célula o extracto que contiene una proteína de quinasa de linaje múltiple con el compuesto y determinar si el compuesto disminuye la actividad de la proteína de quinasa de linaje múltiple. Las células, y extractos de las mismas incluyen, las descritas anteriormente. Los compuestos que se encuentran mediante los procedimientos presentes (es decir, los compuestos que inhiben o reducen la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple) puede ser útil para tratar enfermedades neurodegenerativas. La proteína se selecciona preferiblemente entre el grupo constituido por la quinasa 1 de múltiple linaje, la quinasa 2 de múltiple linaje, la quinasa 3 de múltiple linaje, la quinasa que lleva cremallera de leucina, quinasa que lleva cremallera de leucina dual, y la quinasa 6 de múltiple linaje. La célula se pone en contacto in vitro. Preferiblemente, la actividad de la proteína se determina midiendo la actividad o estado de fosforilación de un sustrato de dicha proteína. Preferiblemente, el sustrato se selecciona entre el grupo constituido por JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, p38\alpha, p38\beta, p38\gamma, p38\delta, MEK1, MEK2, MKK3, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1, y el homólogo de mamífero de AEX-3, y así como los sustratos generales de Ser/Thr tal como la proteína básica de mielina (MBP). La actividad de la proteína también se puede determinar midiendo la actividad de un sustrato de la proteína, cantidad de un sustrato de la proteína, o ARNm que codifica el sustrato de al proteína. La actividad de la proteína también se puede determinar mediante un ensayo de quinasa in vitro o ensayo de unión. Las células preferiblemente son neuronas motoras embriónicas primarias, células que sobreexpresan una proteína de quinasa de linaje múltiple, o una célula neuronal, pero puede ser cualquier célula o extracto de ellas. Preferiblemente, se identifican los compuestos que se unen directamente a la proteína de quinasa de linaje múltiple, como se ha descrito anteriormente.

La presente invención también proporciona procedimientos para identificar compuestos que pueden ser útiles en el tratamiento de inflamación que comprende poner en contacto una célula o extracto que contiene una proteína de quinasa de linaje múltiple con el compuesto y determinar si el compuesto disminuye la actividad de la proteína de quinasa de linaje múltiple. Las células, y extractos de las mismas, incluyen las descritas anteriormente. Los compuestos que se encuentran en los procedimientos presentes, (es decir, los compuestos que inhiben o reducen la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple) pueden ser útiles para tratar inflamación. La proteína se selecciona preferiblemente entre el grupo constituido por la quinasa 1 de múltiple linaje, la quinasa 2 de múltiple linaje, la quinasa 3 de múltiple linaje, la quinasa que lleva cremallera de leucina, quinasa que lleva cremallera de leucina dual, y la quinasa 6 de múltiple linaje. La célula se pone en contacto in vitro. Preferiblemente, la actividad de la proteína se determina midiendo la actividad o estado de fosforilación de un sustrato de dicha proteína. Preferiblemente, el sustrato se selecciona entre el grupo constituido por JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, p38\alpha, p38\beta, p38\gamma, p38\delta, MEK1, MEK2, MKK3, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1, y el homólogo de mamífero de AEX-3, y así como los sustratos generales de Ser/Thr tal como la proteína básica de mielina (MBP). La actividad de la proteína también se puede determinar midiendo la actividad de un sustrato de la proteína, cantidad de un sustrato de la proteína, o ARNm que codifica el sustrato de al proteína. La actividad de la proteína también se puede determinar mediante un ensayo de quinasa in vitro o ensayo de unión.

Las células son preferiblemente neuronas motoras embriónicas primarias, células que sobreexpresan una proteína de quinasa de linaje múltiple, o una célula neuronal, pero puede ser cualquier célula o extracto de ellas. Las células también incluyen, pero no se limitan a, las implicadas en inflamación tales como, por ejemplo, linfocitos, macrófagos y otros leucocitos bien conocidos por los expertos en la técnica. Preferiblemente, se identifican los compuestos que se unen directamente a la proteína de quinasa de linaje múltiple.

La presente invención también proporciona procedimientos para tratar un mamífero que tiene o sospechoso de tener un trastorno neurodegenerativo que comprende la administración al mamífero de un compuesto que inhibe o reduce la actividad de la proteína de quinasa de linaje múltiple. Un compuesto que inhibe o reduce la actividad de la proteína de quinasa de linaje múltiple incluye, pero no se limita a, compuestos que tienen la fórmula I, II, III, y IV. Los compuestos preferidos incluyen los descritos anteriormente con respecto al procedimiento para seleccionar compuestos que modulan la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple y bien promueven supervivencia celular o muerte celular. Un mamífero preferido es un ser humano. Un individuo puede ser sospechoso de tener una enfermedad neurodegenerativa.

La presente invención también proporciona procedimientos para tratar un mamífero que tiene inflamación que comprende la administración a dicho mamífero de un compuesto que inhibe o reduce la actividad de la proteína de quinasa de linaje múltiple. Un compuesto que inhibe o reduce la actividad de la proteína de quinasa de linaje múltiple incluye, pero no se limita a, compuestos que tienen la fórmula I, II, III, y IV. Los compuestos preferidos incluyen los descritos anteriormente con respecto al procedimiento para seleccionar compuestos que modulan la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple y bien promueven supervivencia celular o muerte celular. Un mamífero preferido es un ser humano.

La puesta en contacto con compuestos que tienen las fórmula I - IV puede tener lugar en tampones o medios, que sin bien conocidos por los expertos en la técnica. Como alternativa, la puesta en contacto puede tener lugar mediante la administración de una composición farmacéutica que contiene el compuesto de ensayo y una sal, vehículo, o diluyente farmacéuticamente aceptable a un animal o mamífero, tal como, por ejemplo, un ratón u otro animal adecuado conocido por los expertos en la técnica. Además, se pueden usar números variables de células y concentraciones de los compuestos. Las células que se ponen en contacto con los compuestos de ensayo puede ser cualquier célula de mamífero. Preferiblemente, la célula es una neurona. Preferiblemente, la célula está implicada en una enfermedad neurodegenerativa, tal como, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de neuronas motoras, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, enfermedad cerebrovascular, afecciones isquémicas, demencia por SIDA, epilepsia, enfermedad de Huntington, y lesiones por conmoción o penetrantes al cerebro o médula espinal. Los compuestos que tienen la fórmula I, y procedimientos para prepararlos, se describen en al patente de Estados Unidos Nº 5.705.511, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad. Los compuestos que tienen la fórmula III, y procedimientos de prepararlos, se describen en las patentes de estados nidos números 5.741.808, 5.621.100, 5.621.101, 5.461.146, y 5.756.494, y en el documento WO 97/46567, cada uno de los cuales se incorpora en esta memoria descriptiva por referencia en su totalidad. Los compuestos que tienen la fórmula IV, y procedimientos para prepararlos, se describen en las patentes 5.741.808, 5.621.100, 5.621.101, 5.461.146, y 5.756.494, y en el documento WO 97/46567, cada uno de los cuales se incorpora en esta memoria descriptiva por referencia en su totalidad.

Los compuestos que tienen la fórmula II incluyen diastereoisómeros y enantiómeros alrededor de los átomos de carbono a los que los sustituyentes R^{2}, R^{7}, y R^{8} están unidos.

Los indenopirrolocarbazoles unidos por puentes se representan por la fórmula II:

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En algunas realizaciones preferidas de los compuestos de fórmula II, R^{1} es H. En realizaciones adicionales preferidas, R^{2} es H, hidroxilo, o alquilo sustituido o no sustituido.

En otras realizaciones preferidas R^{3}, R^{4}, R^{5}, y R^{6} son independientemente H, alquilo sustituido o no sustituido, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, amino sustituido o no sustituido, o arilo sustituido o no sustituido. En realizaciones preferidas, R^{7} y R^{8} son independientemente H, o alquilo sustituido o no sustituido.

En algunas realizaciones preferidos, Y es O. En realizaciones preferidas Z es un enlace, O, S, o N sustituido o no sustituido. Todavía en otras realizaciones preferidas, m y n son independientemente 1 ó 2. En algunas realizaciones especialmente preferidas, Y es O, Z es un enlace u O, y m y n son independientemente 1 ó 2.

En realizaciones preferidas adicionalmente, A^{1}A^{2} y B^{1}B^{2} son =O o H,H.

En algunas realizaciones especialmente preferidas, R^{1}, R^{4}, R^{6}, y R^{7} son cada uno H, Y es =O, n es 1, A^{1}A^{2} y B^{1}B^{2} son =O o H,H, R^{2} es H, OH es alquilo inferior, R^{3} es H o alquilo sustituido, R^{5}, y R^{8} son cada uno H o alcoxi, siendo preferido metoxi, Z es un enlace u O, y m es 1 ó 2.

Algunas realizaciones especialmente preferidas de los compuestos de fórmula II son los compuestos II - 1, II - 2, II -
3, II - 4a, II - b, II - 5, II - 6, II - 7a, II - 7b, II - 8, II - 9, II - 10, II - 11, y II - 12 expuestos en al tabla I, más adelante.

Los compuestos representados por la fórmula II se denominan de aquí en adelante compuesto (II).

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término"carbocíclico" se refiere a grupos carbocíclicos en los que la porción anillo se compone solamente de átomos de carbono. Los términos "heterociclo" y "heterocíclico" se refieren a grupos cíclicos en los que al porción anillo incluye al menos un heteroátomo tal como O, N, o S.

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "alquilo" significa un grupo alquilo de cadena lineal, cíclico, o ramificado que tiene entre 1 y 8 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isoamilo, neopentilo, 1-etilpropilo, hexilo, octilo, ciclopropilo, y ciclopropilo. El resto alquilo de grupos que contienen alquilo, tales como grupos alcoxi, alcoxicarbonilo,, y alquilaminocarbonilo, tiene el mismo significado que alquilo definido anteriormente. Grupos alquilo inferior, que se prefieren, son grupos son grupos alquilo como se han definido anteriormente que contienen entre 1 y 4 átomos de carbono. El término "alquenilo" pretende incluir cadenas hidrocarbonadas de cadena lineal o ramificada que tienen al menos un doble enlace carbono - carbono. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen cadenas hidocarbonadas de cadena lineal o ramificada que tienen al menos un doble enlace carbono carbono. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen grupos etinilo y
propinilo.

El resto acilo de grupos que contienen acilo tales como grupos aciloxi pretende incluir un grupo alcanoílo de cadena lineal o ramificado que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, tales como formilo, acetilo, propanoílo, butirilo, valerilo, pivaloílo o hexanoílo.

Como se usa en esta memoria descriptiva el término "arilo" significa un grupo que tiene entre 6 y 12 átomos de carbono tal como fenilo, bifenilo y naftilo. Los grupos arilo preferidos incluyen grupos fenilo y naftilo no sustituidos o sustituidos. El término "heteroarilo" como se usa en esat memoria descriptiva significa un grupo arilo en el que uno o más átomos de carbono en el anillo se reemplaza por átomo hetero (es decir, no carbono) tal como O, N o S. Los grupos heteroarilo preferidos incluyen grupos piridilo, pirimidinilo, pirrolilo, furilo, tienilo, imidazolilo, triazolilo, tetrazolilo, quinolilo, isoquinolilo, benzoimidazolilo, tiazolilo, pirazolilo, y benzotiazolilo.

El término "aralquilo" (o "arlalquilo") propone significar un grupo que tiene entre 7 y 10 átomos de carbono, cocnstituido por un grupo alquilo que lleva un grupo arilo. Los ejemplos de grupos aralquilo incluyen grupos bencilo, fenetilo, bencidrilo y naftilmetilo.

Los grupos y restos alquilo contenidos en os grupos sustituidos tales como grupos aralquilo, alcoxi, arilalcoxi, hidroxialcoxi, alcoxi - alcoxi, hidroxi - alquiltio, alcoxi - alquiltio, alquilcarboniloxi, hidroxialquilo, y aciloxi pueden ser sustituidos o no sustituidos. Un grupo alquilo sustituido tiene entre 1 y 3 sustituyentes seleccionados independientemente, preferiblemente hidroxi, alcoxi inferior, alcoxi inferior - alcoxi, arilalcoxi inferior sustituido o no sustituido alcoxi, heteroarilalcoxi inferior sustituido o no sustituido alcoxi, arilalcoxi sustituido o no sustituido, heterocicloalcoxi sustituido o no sustituido, halógeno, carboxilo, alcooxicarbonilo inferior, nitro, amino, mono - o di alquilamino inferior, dioxolano, dioxano, ditiolano, furano, lactona, o lactama.

Grupos arilo sustituido, heteroarilo sustituido y aralquilo sustituido cada uno tiene entre 1 y 3 sustituyentes seleccionados independientemente que son preferiblemente alquilo inferior, hidroxi, alcoxi inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, nitro, amino, mono- o di-alquilamino inferior, y halógeno.

Los grupos heterocíclicos formados con un átomo de nitrógeno incluyen grupos pirrolidinilo, piperidinilo, piperidino, morfolinilo, morfolino, tiomorfolino, N-metilpiperazinilo, indolilo, isoindolilo, imidazol, imidazolina, oxazolina, oxazol, triazol, tiazolina, tiazol, pirazol, pirazolona, y triazol. Los grupos heterocíclicos formados con un átomo de oxígeno incluye grupos furano, tetrahidrofurano, pirano, y tetrahidrofurano.

Los grupos "hidroxialquilo" son grupos alquilo que tienen un grupo hidroxilo añadidos a ellos. Los halógenos incluyen flúor, cloro, bromo y yodo.

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "heteroarilalquilo" significa un grupo arilalquilo que contiene un heteroátomo. El término "oxi" significa la presencia de un átomo de oxígeno. De este modo, grupos "alcoxi" son grupos alquilo que se unen a través de un átomo de oxígeno y grupos "carboniloxi" son grupos carbonilo que están unidos a través de un átomo de oxígeno.

El término "heterocicloalcoxi" significa un grupo alcoxi que tiene un grupo heterocilo unido al resto alquilo del mismo, y el término "arilalcoxi" significa un grupo alcoxi que tiene un grupo arilo unido al resto alquilo del mismo. El término "alquilcarboniloxi" significa un grupo de fórmula -O-C=O)-alquilo.

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "alquiloxi-alcoxi" significa un grupo alcoxi que contiene un sustituyente alquiloxi unido a su resto alquilo. El término "alcoxi-alquiltio" significa un grupo alquiltio (es decir, un grupo de fórmula -S-alquilo) que contiene un sustituyente alcoxi unido a su resto alquilo. El término "hidroxi-alquiltio" significa un grupo alquiltio (es decir, un grupo de fórmula -S-alquilo) que contiene un sustituyente hidroxi unido a su resto alquilo.

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "monosacárido" tiene sus significados de costumbre como un azúcar simple.

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "aminoácido" significa una molécula que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo. Las realizaciones de aminoácidos incluyen \alpha-aminoácidos; es decir, ácidos carboxílicos de fórmula general HOOC-CH(NH_{2})-(cadena lateral).

Las cadenas laterales de aminoácidos incluyen restos de origen natural y no natural. Las cadenas de aminoácidos de origen no natural (es decir no naturales9 son restos que se usan en lugar de cadenas de aminoácidos de origen natural en, por ejemplo, análogos de aminoácidos. Véase, por ejemplo, Lehninger, Biochemistry, edición segunda, Worth Publishers, Inc, páginas 73 - 75, incorporada en esta memoria descriptiva.

Los \alpha-aminoácidos preferidos incluyen glicina, alanina, prolina, ácido glutámico, y lisina, que tiene la configuración D, la configuración L, o como un racemato.

Las cadenas laterales de \alpha-aminoácidos representativos adicionales se muestran más adelante en al tabla 1.

TABLA 1

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En algunas realizaciones preferidas, los grupos sustituyentes para los compuestos de fórmula II incluyen el residuo de un aminoácido después de retirar el resto hidroxilo del grupo carboxilo del mismo, es decir, grupos de fórmula -C(=O)-CH(NH_{2})-(cadena lateral).

Los grupos funcionales presentes en los compuestos de fórmula II pueden contener grupos protectores. Por ejemplo, los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos de los compuestos de fórmula II se pueden sustituir con grupos protectores tales como grupos benciloxicarbonilo o t-butoxicarbonilo. Los grupos protectores se conocen per se como grupos funcionales químicos que se pueden añadir selectivamente a y retiras de las funcionalidades, tales como grupos hidroxilo y grupos carboxilo. Estos grupos se presentan en un compuesto químico para hacer tal funcionalidad inerte condiciones de reacción química a la que se exponen el compuesto. Se puede emplear cualquier diversidad de grupos protectores con al presente invención. Uno de tales grupos protectores es el grupo benciloxicarbonilo (Cbz; Z). Otros grupos protectores preferidos según la invención se pueden encontrar en Greene, T. W. y Wuts, P. G. M., "Protective Groups in Organic Synthesis" 2º edición. Ed., Wiley y Sons, 1991.

Los compuestos de indenopirrolocarbazol unidos por puentes han evidenciado actividades farmacológicas funcionales importantes que encuentran utilidad en una diversidad de situaciones, incluyendo tanto arenas de investigación como terapéuticas. Estos derivados son útiles como agentes terapéuticos. Las actividades de los compuestos muestran efectos positivos en la función y/o supervivencia de células sensibles al factor trófico. El efecto sobre la función y/o supervivencia de las células sensibles al factor trófico, por ejemplo, células de un linaje neuronal, se ha demostrado usando cualquiera de los siguientes ensayos: (1) ensayo de colina acetiltransferasa de médula espinal cultivada ("ChAT"); o (2) ensayo de actividad de ChAT de neuronas del cerebro anterior basal cultivadas.

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "efecto" cuando se usa para modificar los términos "función" y "supervivencia" significa una alteración o cambio positivo o negativo. Un efecto que es positivo puede denominarse aquí "potenciación" o "potenciando" y un efecto que es negativo se puede denominar en esta memoria descriptiva "inhibición" o "inhibiendo".

Como se usa en esta memoria descriptiva, los términos "potenciar" o "potenciando" cuando se usan para modificar los términos "función" o "supervivencia" significa que la presencia de un compuesto de indenopirrolocarbazol unido por puentes tiene un efecto positivo sobre la función y/o supervivencia de una célula sensible al factor trófico comparado con una célula en ausencia del compuesto. Por ejemplo, y no a modo de limitación, con respecto a la supervivencia de, por ejemplo, una neurona colinérgica, el compuesto evidenciaría la potenciación de supervivencia de una población neuronal colinérgica con riesgo de morir (debido a, por ejemplo, lesión, una afección patológica, una afección degenerativa o progresión natural) cuando se compara con una población neuronal colinérgica no presentada con tal com-
puesto, s la población tratada tiene un período comparativamente mayor de funcionalidad que la población no tratada.

Como se usa en esta memoria descriptiva, "inhibir" o "inhibiendo" significan que una respuesta específica de un material deseado (por ejemplo, actividad enzimática) está comparativamente disminuida en presencia de un compuesto indenopirrolocarbazol unido por puentes.

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "trk" se refiere a la familia de receptores de neurotrofina de alta afinidad actualmente comprendiendo taka, trkB, y trkC, y otras proteínas asociadas a membrana q las que se puede unir una neurotrofina.

Como se usa en esta memoria descriptiva, inhibición de VEGFR implica utilidad en, por ejemplo, enfermedades en las que la angiogénesis juega papeles importantes, tales como cáncer de tumores sólidos, endometriosis, retinopatía diabética, psoriasis, hemangioblastoma, así como otras enfermedades oculares y cánceres.

La inhibición de trk implica utilidad en, por ejemplo, enfermedades de al próstata tales como cáncer de próstata e hiperplasia de próstata benigna, y tratamiento de dolor inflamatorio.

La inhibición del factor del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) implica utilidad en, por ejemplo, diversas formas de neoplasia, artritis reumatodide, fibrosis pulmonar, mielofibrosis, curación de heridas anormales, enfermedades con puntos finales cardiovasculares, tales como aterosclerosis, reestenosis, reestenosis post-angioplastia, etc.

Como se usa en esta memoria descriptiva, los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a cualquier proliferación maligna de células en un animal. Los ejemplos incluyen próstata, hiperplasia de próstata benigna, ovarios, mama, pulmón, pancreático, colorrectal, gástrico, estómago, tumores sólidos, cabeza y cuello, neuroblastoma, carcinoma de células renales, leucemia, otras malignidades reconocidas de los sistemas hematopoyéticos, y otros cánceres reconocidos.

Como se usa en esta memoria descriptiva los términos "neurona," "célula de linaje neuronal" y "célula neuronal" incluyen, pero no se limitan a, una población heterogénea de tipos neuronales que tienen transmisores singulares o múltiples y/o funciones singulares o múltiples; preferiblemente, éstos son colinérgicos u neuronas sensoriales. Como se usa en esta memoria descriptiva, la frase "neurona colinérgica" significa neuronas del Sistema Nervioso Central (SNC) y sistema nervioso periférico (SNP) cuyo transmisor es acetilcolina; los ejemplos son neuronas del cerebro anterior basal, estriadas y de la médula espinal. Como se usa en esta memoria descriptiva, la frase "neurona sensorial" incluye neuronas sensibles a señales ambientales (por ejemplo, temperatura, movimiento) de, por ejemplo, piel, músculo y articulaciones; un ejemplo es una neurona de los ganglios de la raíz dorsal.

Una "célula sensible al factor trófico", como se define en esta memoria descriptiva, es una célula que incluye un receptor al que se puede unir específicamente un factor trófico; los ejemplos incluyen neuronas (por ejemplo, neuronas colinérgicas y sensoriales) y células no neuronales (por ejemplo, monocitos y células neoplásicas).

Los compuestos de indenopirrolocarbazol descritos en esta memoria descriptiva encuentran utilidad tanto en situaciones de investigación como terapéuticas, por ejemplo, inhibición de actividad enzimática. Por ejemplo, en un entorno de investigación, los compuestos se pueden usar en el desarrollo de ensayos y modelos para una potenciación adicional del entendimiento de los papeles que inhiben serina/proteína o tirosina proteína quinasa (por ejemplo, PKC, trk tirosina quinasa) juegan en los aspectos mecanísticos de los trastornos y enfermedades asociados. En una situación terapéutica, los compuestos que inhiben estas actividades enzimáticas se pueden usar para inhibir las consecuencias perjudiciales de están enzimas con respecto a trastornos tales como cáncer.

Como los ejemplos más adelante demuestran, se puede determinar la inhibición de actividad enzimática usando los compuestos de indenopirrolocarbazol unidos por puentes usando, por ejemplo, los siguientes ensayos:

1.: ensayo de inhibición de actividad de trk tirosina quinasa;

2.: inhibición de fosforilación de trk estimulada por NGF en una preparación de células enteras;

3.: ensayo de inhibición de quinasa de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR);

4.: ensayo de inhibición de actividad de PKC;

5.: ensayo de inhibición de PDGFR.

Los compuestos de indenopirrolocarbazol unidos por puentes descritos se pueden usar para potenciar la función y/o supervivencia de células de linaje neuronal en un mamífero, por ejemplo, un ser humano, En estos contextos, los compuestos se pueden utilizar individualmente o con otros pirrolocarbazoles y/o indolocarbazoles condensados, o en combinación con otras moléculas beneficiosas que también evidencian la capacidad de afectar la función y/o supervivencia de una célula diseñada.

Se caracterizan una diversidad de trastornos neurológicos mediante células neuronales que mueren, lesionadas, comprometidas funcionalmente, que padecen degeneración axonal, en riesgo de morir, etc. Estos trastornos incluyen, pero no se limitan a. enfermedad de Alzheimer; trastornos de neuronas motoras (por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica); enfermedad de parkinson; trastornos cerebrovasculares (por ejemplo, accidente cerebrovascular, isquemia); enfermedad de Huntington; demencia por SIDA; epilepsia; esclerosis múltiple; neuropatía periféricas (por ejemplo, las que afectan a neuronas DGR en neuropatía periférica asociada a quimioterapia) incluyendo neuropatía diabética; trastornos inducidos por aminoácidos excitativos; y trastornos asociados con lesiones por conmoción o penetrantes del cerebro o médula espinal.

ChAT cataliza la síntesis de la acetilcolina neurotransmisora, y se considera un marcador enzimático para una neurona colinérgica funcional. Una neurona funcional también es capaz de sobrevivir. La supervivencia de neuronas se ensaya mediante cuantificación de la captación y conversión enzimática específica de un tinte (por ejemplo, calceína AM) por neuronas vivas.

Debido a sus utilidades variadas, los compuestos descritos en esta memoria descriptiva que incluyen los compuestos identificados mediante los procedimientos descritos en esta memoria descriptiva , encuentran utilidad en una diversidad de situaciones. Los compuestos se pueden usar en el desarrollo de de modelos in vitro de supervivencia de células neuronales, función, identificación, o para la selección de otros compuestos sintéticos que tienen actividades similares a las de los compuestos descritos en esta memoria descriptiva, o compuestos identificados por los procedimientos descritos en esta memoria descriptiva. Los compuestos descritos en esta memoria descriptiva, así como los identificados usando los procedimientos descritos en esta memoria descriptiva, se pueden utilizar en un entorno de investigación para investigar, definir y determinar dianas moleculares asociadas a respuestas funcionales. Por ejemplo, marcando radiactivamente un compuesto de indenopirrolocarbazol unidos por puentes, o un compuesto identificado por los procedimientos descritos en esta memoria descriptiva, asociados a uan función específica celular (por ejemplo, mitogénesis), la entidad diana a la que se une el derivado se puede identificar, aislar, y purificar para caracterización.

Los compuestos, descritos en esta memoria descriptiva así como los identificados usando los procedimientos descritos en esta memoria descriptiva, son útiles, entre otros, no solamente para potenciar las actividades inducidas por factor trófico o células sensibles al factor trófico, por ejemplo, neuronas colinérgicas, pero también pueden funcionar como agentes promotores de supervivencia de neuronas mediante cascadas de señalización hacia abajo de las proteínas de unión a GTP pequeñas, pero sin limitación a, ras, rac y cdc 42 (Denhardt, Biochem., 1996, 318, 729). Específicamente, activación de ras conduce a fosforilación activación de quinasa activada por receptor extracelular (ERK), que se ha unido a crecimiento biológico y procedimientos de diferenciación. La estimulación de rac/cdc42 conduce a un incremento en al activación de JNK y p38, respuestas que están asociadas a estrés, apoptosis, e inflamación. Aunque las respuestas del factor de crecimiento son principalmente mediante la ruta ERK, que afectan a estos últimos procesos pueden conducir a mecanismos alternativos de supervivencia neuronal que pueden imitar la potenciación del factor de crecimiento que potencia las propiedades de supervivencia (Xia y col., Science, 1995, 270, 1326). Los compuestos también pueden funcionar como agentes de promoción de supervivencia para células neuronales y no neuronales mediante mecanismos relacionados a, pero también distintos de supervivencia mediada por el factor de crecimiento, por ejemplo, inhibición de las rutas de JNK y p38 que pueden conducir a supervivencia mediante la inhibición de procesos de muerte celular apoptópica.

Los presentes compuestos son útiles en el tratamiento de trastornos asociados a un descenso de actividad de ChAT o la muerte, lesión de las neuronas motoras de al médula espinal, y también tienen utilidad en, por ejemplo, enfermedades asociadas a muerte celular apoptópica del sistema nervioso periférico y central, sistema inmune y enfermedades inflamatorias.

Los compuestos descritos en esta memoria descriptiva pueden encontrar utilidad en el tratamiento de estados patológicos que implican proliferación celular maligna, tal como muchos cánceres.

Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en esta memoria descriptiva, así como los compuestos identificados por los procedimientos presentes, incluyen las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables, sales metálicas, sales amónicas, sales de adición de aminas orgánicas, y sales de adición de aminoácidos. Los ejemplos de sales de adición de ácido son sales de adición de ácidos inorgánicos tales como clorhidrato, sulfato y fosfato, y sales de adición de ácidos orgánicos tales como acetato, meleato, fumarato, tartrato, citrato y lactato; los ejemplos se sales metálicas de las sales metálicas son sales de metales alcalinas tales como sal de litio, sal de sodio y sal de potasio, sales de metales alcalinos tales como sal de magnesio y sal de calcio, sal de aluminio, y sal de cinc; los ejemplos de las sales de amonio son sales de amonio y sal de tetrametilamonio; los ejemplos de las sales de adición de aminas orgánicas son sales con morfolina y piperidina; y los ejemplos de las sales de adición de aminoácidos son sales con glicina, fenilalanina, ácido glutámico y lisina.

Los compuestos proporcionados en esta memoria descriptiva, incluyen los identificados por los procedimientos presentes, se pueden formular en composiciones farmacéuticas mediante mezcla con excipientes y vehículos no tóxicos farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones se pueden preparar para uso en administración parenteral, particularmente en la forma de soluciones o suspensiones líquidas; o administración oral en forma de comprimidos o cápsulas, o por vía intranasal, particularmente en forma de polvos, gotas nasales, o aerosoles; o por vía dérmica, mediante, por ejemplo, parches transdérmicos.

La composición se puede administrar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se puede preparar mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica, por ejemplo, como se describe en Remington's Pharmacéutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PZ, 1980). Las formulaciones para administración parenteral pueden contener como excipientes comunes agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites y naftalenos hidrogenados, vegetales de origen vegetal y similares. En particular, polímero de lactida biocompatible, biodegradable, copolímero de lactida/glicolida, o copolímeros de polioxietileno polioxipropileno pueden que excipientes útiles para controlar la liberación de los compuestos activos. Otros sistemas de distribución parenteral potencialmente útiles APRA estos compuestos activos incluyen partículas de copolímero de etileno - acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables, y liposomas. La formulaciones para administración por inhalación contienen como excipientes, por ejemplo, lactosa, o pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo, polioxietileno-9-lauril éter, glicocolato y desoxicolato, o soluciones oleosas para administración en forma de gotas nasales, o como un gel a aplicar por vía intranasal. Las formulaciones para administración parenteral también pueden incluir glicocolato para administración bucal, un salicilato para administración rectal, o ácido cítrico para administración vaginal. Las formulaciones para parches transdérmicos son preferiblemente emulsiones lipófilas.

Los compuestos de esta invención se pueden emplear como el agente activo solo en una composición farmacéutica. Como alternativa, se pueden usar en combinación con otros ingredientes activos, por ejemplo, otros factores de crecimiento que facilitan la supervivencia neuronal o regeneración axonal en enfermedades o trastornos.

Los compuestos de la invención y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se pueden administrar por vía oral o no oral, por ejemplo, como una pomada o una inyección. Las concentraciones de los compuestos de esta invención en una composición terapéutica pueden variar. La concentración dependerá de factores tales como la dosificación total del fármaco a administrar, las características químicas (por ejemplo, hidrofobicidad) del compuesto empleado, la vía de administración, la edad, peso corporal y síntomas de un paciente, etc. Los compuestos de esta invención típicamente se proporcionan en una solución acuosa de tampón fisiológico que contiene aproximadamente 0,1 a 10% p/v del compuesto para administración parenteral. Los intervalos de dosis típicos están entre aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal al día; un intervalo de dosis preferido está entre aproximadamente 0,01 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal al día, y preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg una vez a cuatro veces al día. Una dosificación preferida de fármaco a administrar probablemente depende de variables tales como el tipo y grado de progresión de la enfermedad o trastorno, el estado de salud global y el paciente particular, la eficacia biológica relativa del compuesto seleccionado, y formulación del excipiente del compuesto, y su vía de administración.

Los compuestos de la invención que incluyen el compuesto de ensayo y compuestos identificados mediante los procedimientos se la presente invención, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se pueden administrar solos, o en forma de diversas composiciones farmacéuticas, según la actividad farmacológica y el propósito de administración. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la presente invención se pueden preparar mezclando uniformemente una cantidad eficaz de un compuesto do una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como ingrediente activo, con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo puede tomar un amplio intervalo de formas según las formas de composición adecuadas para administración. Se desea que tales composiciones farmacéuticas se preparen en forma de dosificación unitaria adecuadas para administración oral y no oral. Las formas para administración no oral incluyen pomada e inyección.

Los comprimidos se pueden preparar usando excipientes tales como lactosa, glucosa, sacarosa, manitol y metilcelulosa, agentes disgregantes tales como almidón, alginato de sodio, carboximetilcelulosa de calcio y celulosa cristalina, lubricantes tales como estearato de magnesio y talco, aglutinantes tales como gelatina, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, hidroxipropilcelulosa y metilcelulosa, tensioactivos tales éster de ácido graso de sacarosa y éster de ácido graso de sorbitol, y similares de una manera convencional. Se prefiere que cada comprimido contenga 15 - 300 mg de ingrediente activo.

Se pueden preparar gránulos que usan excipientes tales como lactosa y sacarosa, agentes disgregantes tales como almidón, aglutinantes tales como gelatina, y similares de una manera convencional. Se pueden preparar polvos usando excipientes tales como lactosa y manitol, y similares de una manera convencional. Se pueden preparar cápsulas usando gelatina, agua, sacarosa, goma arábiga, sorbitol, glicerina, celulosa cristalina, estearato de magnesio, talco, y similares de una manera convencional. Se prefiere que cada cápsula contenga 15 - 300 mg del ingrediente activo.

Se pueden preparar preparaciones de jarabe usando azúcares tales como sacarosa, agua, etanol, y similares de una manera convencional.

Se puede preparar una pomada usando bases de pomadas tales como vaselina, parafina líquida, lanolina y macrogol, emulsionantes tales como lauril sulfato sódico , cloruro de benzalconio, éster de ácidos grasos de mono sorbitán, carboximetilcelulosa de sodio y goma arábiga, y similares de una manera convencional.

La preparaciones inyectables se pueden preparar usando disolventes tales como agua, solución salina fisiológica, aceites vegetales (por ejemplo, aceite de oliva y aceite de cacahuete), oleato de etilo y propilenglicol, agentes solubilizante tales como benzoato sódico, salicilato de sodio, y uretano, agentes isotónicos tales como cloruro sódico y glucosa, conservantes tales como fenol, cresol, éster de ácido p-hidroxibenzoico y clorobutanol, antioxidantes tales como ácido ascórbico y pirosulfito de sodio y similares de una manera convencional.

La invención además se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos que pretenden ilustrar la invención. Estos ejemplos no pretenden, no se construyen como limitantes del alcance de la descripción.

Ejemplos Ejemplo 1 Descripción general del procedimiento de síntesis y ejemplos

La vía de síntesis general empleada para preparar los indenopirrolocarbazoles unidos por puentes de esta invención que tienen la fórmula II se muestra en la figuras 1 y 2. Los procedimientos generales para la síntesis de los indenopirrolocarbazoles (II) (VIII) se pueden realizar como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.705.511, cuya descripcón se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad. Cuando R^{1} es H, el nitrógeno de lactama de los indenopirrolocarbazoles (II)/(VIII) se protege con un grupo protector que conduce a (IV)/(IX). Los compuestos protegidos se tratan con una base apropiada en un(os) disolvente(s) orgánico(s) anhidro(s), que da como resultado la generación de una solución de color rojo oscuro que se cree que es el carabanion. La reacción de carbanion con un reactivo bi-funcional (V) da como resultado una adición electrófila al enlace (=Y de (V) que conduce al intermedio inicial (VI)/(X). El tratamiento del (de los) intermedio(s) (VI)/(X) y/o (VII)/(XI) con un ácido sulfónico o ácido de lewis, por ejemplo eterato trifluoruro de boro, proporciona los indenopirrolocarbazoles (I)/(II).

La estrategia de protección del nitrógeno de lactama (mostrado en las figuras 3 y 4) se puede llevar a cabo bien mediante un procedimiento catalizado por ácido o por base. La reacción catalizada por ácido se puede llevar a cabo con un reactivo de unión a resina que permite la inmovilización del indenopirrolocarbazol (III)/(VIII) a un soporte polimérico, tal como una resina de ácido Rink, basado en poliestireno (XII) (figura 3), proporcionando (XIII). Como alternativa, la reacción catalizada por ácido se puede llevar acabo con un reactivo soluble para proporcionar un compuesto (XIV) (figura 4). El compuesto sililo - protegido (XV) se produce en condiciones básicas (figura 4).

La figura 5 describe varios procedimientos para preparar en intermedio (V). El procedimiento (a) describe las transformaciones de diversos acetales (XVI) a (XVII, Z = enlace). Por ejemplo, éster - acetal/cetal (XVI, D = COOR) se reduce completamente en el correspondiente alcohol y posteriormente se oxida (por ejemplo, oxidación de Swern o de Dess - Martin) en el aldehído - acetal/cetal (XVII, R^{8} = H). Como alternativa, éster - cetal/cetal se reduce parcialmente con DIBAL para producir aldehído (XVII, R^{8} = H) directamente. De manera similar, la reducción de nitrilo - acetal (XVI, D = CN) con DIBAL proporciona aldehído (XVII, R^{8} = H). Ceto - acetales/cetal se preparan mediante la adición de reactivos de Grignard a amida - acetal/cetal (XVI, D = CON(OMe)Me).

El intermedio (XVII, Z = enlace) también se puede obtener mediante un procedimiento en dos etapas esquematizado en el procedimiento (b). La adición de un reactivo organometálico (XIX) a acetal/cetal (XVIII) proporciona el alqueno (XX) que tras ozonolisis seguida de un tratamiento reductor produce el ceto - cetal (XVII). La preparación del intermedio (XVII, Z = heteroátomo) mediante un procedimiento de dos etapas se esquematiza en el procedimiento (c). El acoplamiento del acetal (XXII) con el alqueno (XXI) seguido de ozonolisis (con un procesamiento reductor) del alqueno resultante proporciona el ceto - acetal/cetal (XVII). Como alternativa, el intermedio (XVII, Z = heteroátomo) se prepara mediante un procedimiento de dos etapas esquematizado en el procedimiento (d). La reacción del compuesto (XXIV) con el acetal(cetal (XVIII) proporciona(XXV) que se transforma en el ceto - acetal/cetal (XVII) mediante los procedimientos descritos en el procedimiento (a). la condensación del ceto - acetal/cetal (XVII) con hidroxialminas, hidracinas, N-alquil, -N-alcoxiaminas, y aminas proporciona el intermedio (XXVI) que lleva una funcionalidad electrófila C=N.

El indenopirrolocarbazol unido a resina (XIII) (figura 6, procedimiento A) se trata con un exceso de un reactivo de Grignard en forma de una base, que da como resultado la generación de una solución rojo oscuro del carbanion. La reacción posterior con (V) conduce a productos derivados de adición electrófila al grupo C=Y. El procesamiento acuoso y escisión del (de los) producto(s) con ácido diluido (TFA al 1% en cloruro de metileno) de la resina da como resultado aislamiento de (de los) compuesto(s) (XXVII) y/o (XXVIII). El tratamiento de (de los) intermedio(s)
(XXVII) y/o (XXVIII) con bien un ácido sulfónico o un ácido de Lewis, por ejemplo trifluriuroeterato de boro, proporciona el indenopirrolocarbazol unido por puentes (II).

Se emplea una estrategia similar para la reacción del intermedio soluble protegido por lactama, por ejemplo, (XV) (figura 7, procedimiento B). Sin embargo, en este caso el intermedio (XV) se trata conn Tritón B en piridina como una base en lugar del reactivo de Grignard. El (los) intermedio(s) (XXXIX) y/o (XXX) se pueden aislar con el grupo protector de lactama intacto, que es capaz de purificación cromatográfica. Como en el procedimiento A, (figura 6), el tratamiento con un ácido de Lewis (tal como trifluoruro eterato de boro) proporciona los indenopirrolocarbazoles unidos por puentes (II), donde R^{1} = H.

La introducción de grupos R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se puede llevar a cabo como se describe en las patentes de Estados Unidos números 5.701.511 y 4.923.986, cuyas descripciones se incorporan en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad. un sustituyente R^{3} se puede introducir de otra manera después de la construcción de los indenopirrolocarbazoles unidos por puentes, como se muestra en al figura 8. La posición 3 del anillo B se broma con NBS proporcionando el compuesto (XXXI). Un fragmento carbonado se introduce posteriormente empleando reacciones de Stille, Suzuki, Heck, Kumada o Castro - Stephens catalizado por paladio para proporcionar los compuestos de tipo (XXXII), (XXXIII), etc. además, el compuesto (XXXI) puede proporcionar acceso a los compuestos en los que el grupo bromo se desplaza con un heteroátomo, por ejemplo, un grupo basado en amina mediante la utilización de la química de aminación de Buchwald catalizada por paladio.

Mediante un procedimiento oxidante, un grupo ligado a oxígeno se puede introducir en el cabono de indeno del anillo E, como se muestra en la figura 9, compuesto (XXXIV). Como se muestra esta química también da como resultado la oxidación del grupo metileno de lactama (anillo A) proporcionando un derivado imida.

Ejemplo 2 Preparación de intermedios unidos a resina Rink: (XIII - A), (XIII - B) y (XIII - C), (figura 3)

Ejemplo 2 - A

Se cargó secuencialmente un matraz de fondo redondo de tres cuellos equipado con un agitador mecánico en la parte superior y una trampa de Dean Stark con resina de ácido Rink XII (10,00 g, 0,64 mmoles/g), 1-metil-2-pirrolidinona (80 ml), benceno (350 ml), VIII - A (A^{1}, A^{2} = H_{2}, B^{1}, B^{2} = O, R^{3} = R^{4} = R^{5} = R^{6} = H)) (3,00 g) y ácido p-toluenosulfónico (1,00 g). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 20 horas, y después se filtró. Se lavó la resina con THF (5 x 175 ml) y el filtrado se reservó. Después la resina se lavó secuencialmente con DMSO (4 x 100 ml), NaHCO_{3} acuoso al 2% (4 x 100 ml), agua (4 x 100 ml), DMSO (2 x 200 ml), THF (4 x 100 ml) y acetato de etilo (4 x 100 ml). La resina se secó a vacío (24 horas) para producir 11,70 (0,47 mmoles/g) de VII - A unido a resina, (XIII -
A).

Los lavados de THF originales se evaporaron y el residuo se diluyó con agua (750 ml), y el precipitado resultante se filtró y se lavó posteriormente con agua, NaHCO_{3} acuoso al 2% (4 x 100 ml), y agua (4 x 100 ml). Después de secar a vacío, se recuperó VII - A (1,28 g).

Ejemplo 2 - B

De una manera similar, VIII - B (A^{1}, A^{2} = O, B^{1}, B^{2} = H_{2}, R^{3} = R^{4} = R^{5}= R^{6} = H), (0,5 g) se acopló a resina de ácido Rink XII (1,52 g) para producir 1,58 g de VIII - B unido a resina, (XIII - B).

Ejemplo 2 - C

De una manera similar, VIII - C (A^{1}, A^{2} = O, B^{1}, B^{2} = H_{2}, R^{3} = R^{4} = R^{5}= R^{6} = 10-OMe), (1,02 g) se acopló a resina de ácido Rink XII (3,12 g) para producir 3,70 (0,46 mmoles/g) de compuesto VIII - C unido a resina, (XIII - C) junto con el compuesto recuperado VIII - C (0,44 g).

Ejemplo 3 Preparación del compuesto (II - 1), compuesto (II - 2), compuesto (II - 3), compuesto (II - 4a), compuesto (II - 4b), compuesto (II - 6) y compuesto (II - 8) (procedimiento A, figura 6)

A una suspensión de (XIII - A), (1,25 g) en THF (24 ml) se añadió solución 1 M de EtMgBr (6,25 m en THF) y la reacción se agitó durante 1 hora antes de la adición de HMPA (5,0 ml). Después de agitar durante 10 minutos, se añadió dietoxibutiraldehído (3,0 g) (que se preparó según el procedimiento de la bibliografía de Paquette, y col., J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 9662 - 71), y la reacción se agitó durante 20 horas. La reacción se inactivó con NH_{4}Cl acuoso al 10% (5 ml) y se filtró. La resina se lavó sucesivamente con NH_{4}Cl acuoso al 10% (3 x 10 ml), agua (3 x 10 ml), THF (3 x 10 ml), DMF (3 x 10 ml), agua (3 x 10 ml), THF (3 x 10 ml), y éter (3 x 10 ml). La resina se secó a vacío, se recogió en cloruro de metileno (15 ml), y se trató con ácido fluoroacético (0,15 ml). Después de agitar durante 1 hora, la reacción se filtró, y el filtrado se evaporó. El residuo resultante se recogió en cloruro de metileno (20 ml) y se trató con tosilato de piridinio (50 mg), y la solución resultante se agitó durante 4 horas. En este momento la reacción se lavó con NHCO_{3} saturado y salmuera, y se secó sobre MgSO_{4}.

Después de filtración y evaporación del disolvente, el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (Zorbax RX-8, 4 x 25 cm, eluido con MeCN al 60%/agua p/ ácido trifluoroacético al 0,1%). Las fracciones apropiadas se neutralizaron con NHCO_{3} y se extrajo en cloruro de metileno (3 x 50 ml) y se secaron sobre MgSO_{4}. Después de filtración y evaporación de disolvente , se obtuvieron 70,2 mg del compuesto II - 1 en forma de un polvo blanco que tenía las siguientes características: ^{13}C RMN (DMSO-d_{6}) \delta 171,8, 143,3, 142,4, 141,4, 140,1, 140,0, 136,6, 129,2, 127,9, 127,4, 127,1, 126,8, 124,1, (2C), 122,7, 121,6, 121,5, 118,3, 112,1, 88,1, 79,2, 56,6, 45,6, 33,4, 24,8;

^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 9,21 (d, J = 7,5, 1H), 8,62 (s, 1H), 7,98 (d, J = 7,7, 1H), 7,86 (d, J = 8,3, 1H), 7,71 (d, J = 7,3, 1H), 7,49 (d, J = 7,9, 7,4, 1H), 7,41 (d, J = 7,5, 7,4, 1H), 7,36 - 7,27 (m, 2H), 6,86 (d, J = 6,0, 1H), 5,63 - 5,58 (m, 1H), 4,91 (s, 2H), 4,53 (d, J = 3,3, 1H), 2,23 - 2,14 (m, 1H), 1,96 - 1,92 (m, 1H), 0,96 - 0,88 (m, 1H), 0,60 - 0,57 (m, 1H); EM m/z (M + H) calculado 379, observado 379.

También aislado mediante HPLD preparativa de esta mezcla de producto de reacción fue el compuesto II - 2 (0,5 mg) que tenía las siguientes características: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 9,17 (d, J = 8,1, 1H), 8,62 (s, 1H), 7,98 (d, J = 7,0, 1H), 7,85 (d, J = 6,8, 1H), 7,57 (d, J = 6,8, 1H), 7,49 (d, J = 7,9, 7,4, 1H), 7,44 - 7,26 (m, 3H), 6,81 (d, J = 6,0, 1H), 5,43 - 5,33 (m, 1H), 4,43 (s, 2H), 2,23 - 2,14 (m, 1H), 1,96 - 1,92 (m, 1H), 1,45 - 1,55 (m, 2H), 0,96 - 0,88 (m, 1H), 0,60 - 0,57 (m, 1H), 0,29 (t, J = 7,3, 3H); EM m/z (M + H) calculado 407, observado 407.

Ejemplo 3 - B

De una manera similar, como se ha descrito anteriormente para el compuesto II - 1, la resina (XIII - A) (70,3 mg) se trató con 1,1-dietoxi-2-pentanona (0,75 ml) (que se preparó según el procedimiento de bibliografía de Sworin, y col., J. Org. Chem., 1988, 53, 4894 - 6), para producir el compuesto II - 3 (3,5 mg) que se aisló mediante HPLC preparativa (gel de sílice, eluido con EtOAc al 50%/tolueno) y tenía las siguientes propiedades: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 9,42 (d, J = 8,2, 1H), 8,58 (s, 1H), 7,95 (d, J = 7,4, 1H), 7,79 (d, J = 8,3, 1H), 7,71 (d, J = 7,1), 7,50 - 7,20 (m, 4H), 6,81 (d, J = 5,9, 7,4, 1H), 4,90 (s, 2H), 4,46 (s, 1H), 2,35 - 2,20 (m, 1H), 1,98 (s, 3H), 1,75 - 1,60 (m, 1H), 1,25 - 1,00 (m, 1H), 0,35 - 0,15 (m, 1H); EM m/z (M + H) calculado 393, observado 393.

Ejemplo 3 - C

De una manera similar, (XIII - A) (74,3 mg) se trató con 1,1-dietoxi-2-hexanona (que se preparó según el procedimiento de bibliografía de Brenner, J. Org. Chem., 1961, 26, 22 - 7) (0,75 ml), para producir el compuesto II - 4a (2,10 mg) y compuesto II - 4b (1,06 mg) que se aislaron individualmente mediante HPLC preparativa (Zorbax RS-8, 4 x 25 cm, MeCN al 60%/agua p/ ácido trifluoroacético al 0,1%). El compuesto II - 4a tenía las siguientes propiedades: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 9,30 (d, J = 8,3, 1H), 8,55 (s, 1H), 7,97 (d, J = 7,2, 1H), 7,65 (d, J = 8,5, 1H), 7,59 (d, J = 7,5), 7,48 (dd, J = 7,8, 7,2, 1H), 7,39 - 7,15 (m, 3H), 6,31 (dd, J = 5,9, 5,5, 1H), 5,02 (s, 1H), 4,88 (s, 2H), 0,88 (s, 3H) otras señales alifáticas perdidas en picos de disolvente; EM m/z (M + H) calculado 407, observado 407. El compuesto II - 4b tenía las siguientes propiedades: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 9,43 (d, J = 8,1, 1H), 8,59 (s, 1H), 7,99 (d, J = 7,3, 1H), 7,75 - 7,65 (m, 2H), 7,49 (dd, J = 7,0, 6,4, 1H), 7,43 (dd, J = 8,2, 8,1, 1H), 7,36 - 7,25 (m, 2H), 6,75 (s, 1H), 4,91 (s, 2H), 4,50 (s, 1H), 1,95 (s, 3H) otras señales alifáticas perdidas en picos de disolvente; EM m/z (M + H) calculado 407, observado 407.

Ejemplo 3 - D

De una manera similar, (XIII - C) (1,00 mg) se trató con dietoxibutiraldehído (3,65 g) para producir el compuesto II - 6 (87,8 mg) que se aisló mediante HPLC preparativa (Zorbax RS-8, 4 x 25 cm, MeCN al 60%/agua p/ ácido trifluoroacético al 0,1%) y tenía las siguientes propiedades: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 9,09 (d, J = 8,6, 1H), 8,60 (s, 1H), 7,95 (d, J = 7,4, 1H), 7,84 (d, J = 8,3, 1H), 7,47 (d, J = 7,2, 7,0, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,29 (dd, J = 7,0, 7,0, 1H), 6,98 (dd, J = 8,6, 1,9, 1H), 6,83 (d, J = 6,0, 1H), 5,65 - 5,55 (m, 1H), 4,88 (s, 2H), 4,48 (d, J = 3,9, 1H), 3,82 (s, 3H), 2,25 - 2,10 (m, 1H), 2,08 - 1,85 (m, 1H), 0,96 - 0,75 (m, 1H), 0,65 - 0,50 (m, 1H); EM m/z (M + Na) calculado 431, observado 431.

Ejemplo 3 - E

De una manera similar, la ersina (XIII - B) (153,2 mg) se trató con dietoxibutiraldehído (1,5 g) para producir el compuesto II - 8 (3,6 mg) que se aisló mediante HPLC preparativa (Zorbax RS-8, 4 x 25 cm, MeCN al 60%/agua p/ ácido trifluoroacético al 0,1%) y tenía las siguientes propiedades: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 9,09 (d, J = 7,9, 1H), 8,81 (s, 1H), 7,81 - 7,73 (m, 3H), 7,48 - 7,35 (m, 3H), 7,24 (dd, J = 7,6,7,5 1H), 6,85 (d, J = 6,2, 1H), 5,65 - 5,59 (m, 1H), 4,86 (s, 2H), 4,61 (d, J = 3,6, 1H), 3,82 (s, 3H), 2,21 - 2,13 (m, 1H), 1,96 - 1,90 (m, 1H), 0,89 - 0,79 (m, 1H), 0,61 - 0,56 (m, 1H); EM m/z (M + H) calculado 379, observado 379.

Ejemplo 4 Preparación del compuesto II - 7a y el compuesto II - 7b (procedimiento A, figura 6)

Ejemplo 4 - A

Preparación de (1,1-dietoxietoxi)acetona

A una suspensión fría (0ºC) de NaH (2,68 g, 60%) en THF (150 ml) se añadió a una solución de 1,1-dietoxietanol (que se preparó según el procedimiento de bibliografía de Zirkle, y col., J. Org. Chem., 1961, 26, 395 - 407) (9,00 g) en >THF (20 ml), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora antes de añadir cloruro de metalilo (8,0 ml). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante toda una noche, se enfrió y se filtró a través de un obturador de celita. Se retiró el disolvente mediante un rotavapor, y el residuo de purificó mediante cromatografía en columna (sílice, éter al 20%/hexano) para proporcionar 1,1-dieoxietil metalil éter (11,5, 90%). la ozonolisis de una solución enfriada (-30ºC) de este éter (6,00 g) en EtOAc (80 ml) se llevó a cabo hasta que no era detectable material de partida mediante TLC (1 hora). En este momento, la reacción se purgó con oxígeno, se trató con Pd((OH)_{2} (150 mg) y se agitó en una atmósfera de hidrógeno durante toda una noche. El catalizador se retiró por filtración, y el filtrado se concentró mediante un rotavapor. El residuo resultante se purificó mediante cromatografía en columna (sílice, EtOAc al 20%/hexano) para producir el compuesto del título (4,53 g, 82%).

Ejemplo 4 - B

Según el procedimiento A (figura 6), la resina (XIII - A) (230,2 mg) se trató con EtMgBr (1,25 ml) seguido de (1,1-dietoxietoxi)acetona (ejemplo 3 - A) (1,2 ml). Después de tratamiento y escisión de la resina, una mezcla del producto de reacción bruto (10,5 mg) se recogió en cloruro de metileno (20 ml) y se trató con BF_{3}eterato (20 \mul). Después de agitación durante 2,5 horas, la solución se lavó con NaHCO_{3} saturado acuoso y salmuera antes de secar sobre MgSO_{4}. Después de la filtración y retirada del disolvente, el residuo resultante se purificó mediante HPLC preparativa (Zorbax RS-8, 4 x 25 cm, MeCN al 60%/agua p/ ácido trifluoroacético al 0,1%) para proporcionar el compuesto II - 7a (2,34 mg) y el compuesto II - 7b (1,34 mg). El compuesto (II - 7a) tenía las siguientes propiedades: ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 9,35 -
9,20 (m, 1H), 7,87 (d, J = 7,6, 1H), 7,62 (d, J = 7,0, 1H), 7,60 - 7,45 (m, 1H), 7,49 (dd, J = 7,7, 7,5, 1H), 7,40 (d, J = 8,1, 1H), 7,37 - 7,26 (m, 3H), 6,22 (s, 1H), 5,20 - 4,85 (m, 1H), 4,47 (s, 1H), 3,67 (d, J = 12,7, 1H), 3,52 (d, J = 11,8, 1H), 3,40 (d, J = 12,7, 1H), 3,38 (d, J = 11,8, 1H), 1,91 (s, 3H); EM m/z (M + H) calculado 409, observado 409. El compuesto II - 7b tenía las siguientes propiedades: ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 9,58 - 9,22 (m, 1H), 7,82 (d, J = 7,4, 1H), 7,60 -
7,40 (m, 3H), 7,37 - 7,27 (m, 3H), 7,21 (d, J = 8,1, 1H), 5,81 (s, 1H), 5,21 (s, 1H), 5,10 - 4,80 (m, 1H), 4,59 (d, J = 13,5, 1H), 4,38 (d, J = 13,5, 5,3, 1H), 4,21 (d, J = 13,1, 1H), 3,82 (d, J = 13,2, 1H), 1,13 (s, 3H); EM m/z (M + H) calculado 409, observado 409.

Ejemplo 5 Preparación del compuesto II - 5 (figura 8)

A una solución del compuesto II - 1 (8,1 mg) en THF (2 ml) se añadió NBS (4,6 mg), y la reacción se agitó durante toda una noche. Se añadió NBS adicional (4,5 mg), y la reacción se agitó durante 2,5 horas. El material ion soluble se retiró por filtración y se concentro mediante un rotavapor. El residuo resultante se purificó mediante cromatografía en columna (C-18,MeCN al 60%/agua p/ ácido trifluoroacético al 0,1%): Las fracciones apropiadas se neutralizaron con NaHCO_{3} y se extrajeron en cloruro de metileno (3 x 20 ml) y se secaron sobre MgSO_{4}. Después de filstración y evaporación del disolvente, se obtuvo el compuesto II - 5 (5,1 mg) en forma de un polvo blanco que tenía las siguientes características: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 9,22 (d, J = 7,4, 1H), 8,67 (s, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,86 (d, J = 8,7, 1H), 7,72 (d, J = 7,0, 1H), 7,63 (d, J = 7,8, 1H), 7,42 (dd, J = 7,5, 7,3, 1H),7,35 (dd, J = 7,3,7,2, 1H), 6,86 (d, J = 6,0, 1H), 5,63 - 5,58 (m, 1H), 4,94 (s, 2H), 4,54 (d, J = 3,1, 1H), 2,30 - 2,14 (m, 1H), 2,00 - 1,82 (m, 1H), 0,96 - 0,88 (m, 1H), 0,62 - 0,50 (m, 1H); EM m/z (M + H) calculado 457/9 (1:1), observado 457/9 (1:1).

Ejemplo 6 Preparación del intermedio XV (figura 4)

A una solución de VIII - 4 [A^{1}, A^{2} = H_{2}, B^{1}, B^{2} = O, R^{3} = R^{4} = R^{5}= R^{6} = H)] (1,05 g) en DMF (25 ml) se añadió trietilamina(0,75 ml) y cloruro de t-butildimetilsililo (TBs-Cl) (0,65 g). Después de agitar durante 3 horas, la reacción se inactivó con NaHCO_{3} acuoso saturado y se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera y se secó sobre MgSO_{4}. Después de filtración y evaporación del disolvente, el residuo se trituró con éter para proporcionar el compuesto XV (848 mg). Los lavados se evaporaron para producir un residuo que se purificó mediante cromatografía en columna (sílice, EtOAc al 1%/CH_{2}Cl_{2}) y proporcionó un producto adicional (502 mg, rendimiento combinado de 94%) que tenía las siguientes propiedades espectrales: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 11,94 (s, 1H), 9,32 (d, J = 7,6, 1H), 8,03 (d, J = 7,7, 1H), 7,64 (d, J = 7,2, 1H), 7,58 (d, J = 8,1, 1H), 7,44 (dd, J = 7,7, 7,6, 1H), 7,39 (dd, J = 7,7, 7,6, 1H), 7,32 (d, J = 7,3, 1H), 7,25 (d, J = 7,6, 7,3, 1H), 5,00 (s, 2H), 4,14 (s, 2H), 0,99 (s, 9H), 0,46 (s, 6H); EM m/z (M + H) calculado 425, observado 425.

Ejemplo 7 Preparación del compuesto II - 1 mediante el procedimiento B (figura 7)

Una solución de Tritón B es piridina (0,45 M) se preparó disolviendo una solución de Tritón B al 40% en metanol (10 ml) en piridina (10 ml). El disolvente se retiró a presión reducida (10 mm de Hg (2,6664 kPa)) hasta un volumen final de aproximadamente 8 ml. El residuo se diluyó con piridina hasta 50 ml, se filtró y se almacenó en nitrógeno. Una solución de XV (20,3 mg) en piridina (2,0 ml) se purgó con argón y se trató con 300 \mul de Tritón B ((0,45 M es piridina) y dietoxibititaldehído (50 \mul). Después de agitar durante 2 horas, la reacción se extrajo en EtOAc, se lavó con HCl acuoso 1 N, salmuera y se secó sobre MgSO_{4}. Después de filtración y evaporación del disolvente, el aducto se recogió en CH_{2}Cl_{2}(10 ml) y se trató con BF_{3} etearato (10 \mul) Después de agitar durante 2 horas, la solución se lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado y salmuera antes de secar sobre MgSO_{4}. La retirada del disolvente mediante un rotavapor proporcionó un residuo que se purificó mediante HGPLC preparativa (Zorbax RX-8, 2,5 x 25 cm, C-18, MeCN al 60%/agua p/ ácido trifluoroacético al 0,1%). Las fracciones apropiadas se neutralizaron con NaHCO_{3} y se extrajeron en cloruro de metileno (3 x 20 ml) y se secaron sobre MgSO_{4}. Después de la filtración y evaporación del disolvente, se obtuvo II - 1 (11,8 mg, 65% de rendimiento) cuyos espectros de ^{1}H RMN y EM y tiempo de retención de HPLC eran idénticos al material preparado y aislado mediante en procedimiento A, descrito en el ejemplo 3 -
A.

Ejemplo 8 Preparación del compuesto II - 9 (figura 8)

A una suspensión del compuesto bromo II - 5 (6,2 mg g) en 1-propanol (4,0 ml) se añadió ácido 3-aminofenilbórico (3,8 mg). Después de agitación durante 0,25 horas, Pd(OAc)_{2} (2,0 mg) Ph_{3}P (4,8 mg), NaCO_{3} (2,8 mg), y agua (2,0 ml) se añadieron secuencialmente. La mezcla se calentó a reflujo durante 0,75 horas, se enfrió, se extrajo en CH_{2}Cl_{2}, y se lavó con agua y salmuera. La fase orgánica se secó MgSO_{4}, y el disolvente se retiró mediante un rotavapor para proporcionar un residuo que se purificó mediante HGPLC preparativa (Zorbax RX-8, 2,5 x 25 cm, C-18, MeCN al 60%/agua p/ ácido trifluoroacético al 0,1%). Las fracciones apropiadas se neutralizaron con NaHCO_{3} y se extrajeron en cloruro de metileno (3 x 20 ml) y se secaron sobre MgSO_{4}. Después de la filtración y evaporación del disolvente, se obtuvo el compuesto II - 9 (3,1 mg, 49% de rendimiento) y tenía las siguientes propiedades espectrales: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 9,22 (d, J = 7,5, 1H), 8,66 (s, 1H), 8,00 - 7,25 (m, 8H), 7,12 (dd, J = 7,1, 7,0, 1H), 6,95 - 6,80 (m, 3H), 6,53 (d, J = 6,0, 1H), 5,63 - 5,58 (m, 1H), 4,99 (s, 2H), 4,55 (s, 1H), 2,25 - 2,10 (m, 1H), 1,95 - 1,90 (m, 1H), 1,95 - 1,90 (m, 1H), 0,98 - 0,88 (m, 1H), 0,65 - 0,57 (m, 1H); EM m/z (M + H) calculado 470, observado
470.

Ejemplo 9 Preparación del compuesto II - 10 (figura 9)

A una solución del compuesto II - 1 (5,0 mg g) en DMSO (1 ml) se añadió NaCN (4,3 mg) y la mezcla se calentó hasta 145ºC durante 1 hora. La mezcla se enfrió, se extrajo en EtOAc, y se lavó con agua (3 x 20 ml) y salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó para proporcionar un residuo que se purificó mediante HGPLC preparativa (Zorbax RX-8, 2,5 x 25 cm, MeCN al 55%/agua p/ ácido trifluoroacético al 0,1%). Las fracciones apropiadas se neutralizaron con NaHCO_{3} y se extrajeron en cloruro de metileno (3 x 20 ml) y se secaron sobre MgSO_{4}. Después de la filtración y evaporación del disolvente, se obtuvo el compuesto II - 10 (2,7 mg, 50% de rendimiento) y tenía las siguientes propiedades espectrales: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 11,4 (s, 1H), 8,86 (d, J = 7,9, 1H), 8,79 (d, J = 7,6, 1H), 7,90 (d, J = 8,3, 1H), 7,62 - 7,55 (m, 2H), 7,49 (d, J = 7,6, 7,4, 3H), 7,40 (dd, J = 7,4, 7,3, 1H), 7,35 (dd, J = 7,5, 7,4, 1H), 6,86 (d, J = 6,0, 1H), 6,0 (s, 1H), 5,40 - 5,30 (m, 1H), 2,25 - 2,14 (m, 1H), 2,03 - 1,90 (m, 1H), 1,10 - 0,98 (m, 1H), 0,82 - 0,77 (m, 1H).

Ejemplo 10 Preparación del compuesto II - 11 (procedimiento A, figura 6)

Según el procedimiento A, se hizo reaccionar la resina (XIIIa) (150,2 mg) con EtMgBr (1,0 ml) seguido de 2,5-dioxopentanoato de etilo (Schmidt, y col., Synthesis, 1993, 809) (1,5 ml). Después de reprocesamiento y escisión de la resina, el producto de reacción bruto se recogió en cloruro de metileno (20 ml) y se trató con Br_{3} eterato (20 \mul). Después de agitar durante 2,5 horas, la solución se lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado y salmuera antes de secar sobre MgSO_{4}. Después de filtración y retirada de disolvente, el residuo resultante se purificó mediante HGPLC preparativa (Zorbax RX-8, 2,5 x 25 cm, MeCN al 55% - 75%/agua p/ ácido trifluoroacético al 0,1%) para producir el compuesto II - 11 (6,4 mg) que tenía las siguientes propiedades: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 9,36 (d, J = 7,7, 1H), 8,68 (s, 1H), 8,00 (d, J = 7,7, 1H), 7,83 (d, J = 8,3, 1H), 7,58 - 7,15 (m, 5H), 6,97 (d, J = 5,9, 3H), 4,93 (s, 2H), 4,82 (s, 1H), 4,48 (c, J = 7,1, 2H), 2,42 - 1,91 (m, 2H), 1,37 (t, 3H, J = 7,1), 1,25 - 0,63 (m, 2H).

Ejemplo 11 Preparación del compuesto II - 12

A una solución del compuesto II - 11 (3,4 mg g) en THF (2 ml) se trató con una solución 2 M de LiBH_{4} (1,0 ml, en THF) y al reacción se agitó durante 1,5 horas. La reacción se inactivó mediante la adición de HCl acuoso 1 N (4 ml). Después de agitar durante 20 minutos, se añadió NaOH acuoso al 10% (15 ml) y al mezcla se extrajo en cloruro de metileno (3 x 10 ml). Después de secar sobre MgSO_{4}, la mezcla se filtró y se evaporó el disolvente para producir el compuesto II - 12 (0,32 mg) que tenía las siguientes propiedades: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 9,35 (d, J = 7,7, 1H), 8,62 (s, 1H), 7,98 (d, J = 7,7, 1H), 7,83 (d, J = 8,2, 1H), 7,75 (d, J = 8,2, 1H), 7,50 - 7,25 (m, 4H), 6,84 (dd, J = 7,7, 1H), 6,11 (s, 1H), 4,91 (s, 2H), 4,71 (s, 1H), 4,50 - 4,40 (m, 1H), 4,30 - 4,20 (m, 1H), 2,42 - 1,91 (m, 2H), 1,25 - 0,63 (m, 2H); EM m/z (M + H) calculado 409, observado 409.

Ejemplo 12 Potenciación de la actividad ChAT de la médula espinal

ChAT es un marcador bioquímico específico para las neuronas colinérgicas funcionales. Las neuronas colinérgicas representan una información colinérgica importante en la formación del hipocampo, núcleo olfativo, núcleo interpendular, córtex, amígdala, y partes del tálamo. En la médula espinal, las neuronas motoras son neuronas colinérgicas que contienen ChAT (Phelps, y col., J. Comp. Neurol., 1988, 273, 459 - 472). La actividad ChAT se ha usado para estudiar so efectos de las neurotrofinas (por ejemplo, NGF o NT - 3) en al supervivencia y/o función de neuronas colinérgicas. El ensayo ChAT también sirve como una indicación de la regulación de los niveles de ChAT en las neuronas colinérgicas.

Procedimientos: Células de la espina dorsal de rata fetal se disociaron, y se realizaron experimentos como se describe en (Smith, y col., J. Cell Biology, 1985, 101, 1608 - 621; Glicksman, y col., J. Neurochem., 1993, 61, 210 -
221). Se prepararon células disociadas a partir de médulas espinales diseccionadas ratas (día embriónico 14 - 14) mediante técnicas de disociación de tripsina convencionales (Smith y col., anteriormente). Se sembraron células a 6 x 10^{5}células/cm^{2} en pocillos de cultivo de tejidos de plástico recubiertos con poli-l-ornitina en medio N2 sin suero suplementado con albúmina sérica bovina al 0,05% (BSA) (Bottenstein, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 514 - 517). Los cultivos se incubaron a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5%/aire al 95% durante 48 horas. La actividad ChAT se midió después de 2 días in vitro usando una modificación del procedimiento de Fonnum (Fonnum, Neurochem, 1975, 24, 407 - 409) según McManaman, y col. y Glicksman, y col. McManaman, y col., Develop. Biol., 1988, 125, 311 - 320; Glicksman, y col., J. Neurochem., anteriormente).

Los compuestos que tienen la fórmula II descritos en los ejemplos se enumeran en la tabla 2. Los valores para R^{1}, R^{4}, R^{6}, y R^{7} son H; Y es O; y n es 1.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

15

Ejemplo 13 ADNpC3-EE-MLK3, ADNpc3-EE-MLK3(K144R)

Se clonó MLK3 como se describe en (Lee, y col., Oncogene, 1993, 8, 3403 - 3410; Ezoe, y col., Oncogene, 1994, 9, 935 - 938). Se preparó ADNc a partir de 200 ng de ARNm de melanocitos poliadenilado y 5% de la reacción se usó como molde para amplificar un repertorio de ADNc de PTK usando mezclas de bien dos o cuatro cebadores de ligonucleótidos altamente degenerados derivados de las secuencias de consenso de los subdominios VIb y IX conservados de las PKT conocidas:

PKT1, 5'-CGGATCCACMGIGAYYT-3' (SEC ID Nº 1);

PTK2, 5'-GGAATTCCAWAGGACCASACRTC-3' (SEC ID Nº 2);

PTK3, 5'-CGGATCCRTICAYMGIGAYYTIGCIGCIMGIAA-3' (SEC ID Nº 3);

PTK4, 5'-GGAATTIAYIGGAWAIGWCCAIACRTCISW-3' (SEC ID Nº 4).

Se llevaron a cabo cuarenta ciclos de PCR usando la Taq ADN polimerasa (AmpliTaq; Perkin - Elmer/cetros) y un ciclador térmico de ADN automático; cada ciclo consistía en 40 s a 94ºC, 2 minutos a 37ºC y 3 minutos a 63ºC. Los productos de ocho PCR se reunieron, se trataron con ADN polimerasa (Klenow), se escindieron con BamH1 plus y se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 5%. La tinción como bromuro de etidio identificó una banda predominante de 200 - 230 pares de bases que se escindió, se eluyó y se clonó en M13mp13. En un experimento, parte del ADNc amplificado por PCR no se escindió, pero en su lugar se clonó romo en M13mp18 escindido con Sma1. La secuencia de nucleótidos se determinó mediante el procedimiento de secuenciación de terminación de cadena.

Un ADNc, identificado como PTK1, se usó como una sonda para seleccionar genotecas de ADNc de melanocitos y melanoma humano. Un clon, designado PTK1-3,2, incluía la fase abierta de lectura de 2541 nucleótidos, que codifica una proteían de 847 aminoácidos. Este ADNc se cortó con Nco1, se hizo romo con ADN polimerassa (Klenow), se cortó otra vez con EcoR1 y se ligó en el vector ADNpC3-EE cortado con BamH1, se hizo romo y después se cortó con EcoR1. El vector ADNpC3-EE se construyó insertando en el sitio HindIII/BamH1 un oligo que codifica un codón de partida seguido de un epítope EE, MEEEEYMPME (SEC ID Nº 5) (Grussenmeyer, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 7952 - 7954). La vesión destruida por quinasa de MLK3 se preparó realizando la mutación K144R usando PCR que emplea una técnica publicada previamente (Chen, y col., Biotechniques, 1994, 17, 657 - 659). El primer oligo mutagénico era 5'-GTGGCTGTGCGGGCAGCTCGCCAG-3' (SEC ID Nº 6) y el segundo oligo era 5'-GAGACCCTGGATCTCGCGCTT-3' (SEC ID Nº 7). Usando MLK3 como molde, estos oligos se usaron en PCR para generar un fragmento de 806 pares de bases y se empleó en una segunda reacción de PCR usando un cebador de T7 como el otro amplímero y MLK3 como molde para generar un fragmento de 1285 pares de bases. El fragmento se separó mediante electroforesis en gel de agarosa, se aisló, se clonó en pGEM-5 (Promega) y se secuenció). El fragmento se escindió con HindIII y HpaI, y se insertó en ADNpCA3-EE-MLK3 se cortó con HindIII y HpaI. Se detectó uan mutación puntual adicional en el nucleótido 1342. Para corregir esto, un fragmento Pf1M1 (nucleótido 1093 - 1418) se escindió a partir de la MLK3 de tipo salvaje y se usó para reemplazar el fragmento idéntico en MLK3 mutada K144R.

Ejemplo 14 pFB-FLAG-MLK3

Para obtener la proteína MLK3, el ADNc se clonó en el vector de expresión de baculovirus pFB-FLAG. MLK3 se escindió a partir de PKT1-3.2 mediante digestión con Nco1, se hizo romo con la ADN polimerasa (Klenow), se cortó otra vez con Not1 y se ligó en pFB-FLAG digerido con Stu1 y Not1. pFB-FLAG se derivó a partir de pFB (Life Technologfies) y tiene la secuencia codificadora para el epítope FLAG JHopp, y col., Biotechnology, 1988, 6, 1205 - 1210) con un codón de partida, MDYKDDDDK (SEC ID Nº 8), se añadió al poliengarce en el sitio BamH1.

Ejemplo 15 pFB-GST-MLK3 (KD)

Se logró la expresión baculoviral del dominio quinasa de MLK3 mediante escisión del fragmento MLK3 a partir del pGEXKG-MLK(KD) usando EcoR1 y Xho1 y ligando en un vector pFB cortado con EcoR1 y Xho1 en el que la secuencia codificadora para glutatión S-transferasa (GST) se había clonado cadena arriba. Esto se logró obteniendo la seceuncia codificadora de GST y el poliengarce del vector pGEXKG mediante PCR usando el ector como molde (Guan, y col., anal. bioch, 1991, 192, 262 - 267). El 5' oligo para PCR creó un sitio de restricción Bgl2 en el extremo 5' del fragmento. Este fragmento aislado después se digirió con Bgl2 y HinD3 y se ligó en pFB digerido con BamH1 y HinD3.

Ejemplo 16 pGEXXG-MLK3 (KD)

Un fragmento de ADNc que incluía tanto el dominio quinasa de MLK3 como una porción de la cremallera de leucina (nucleótidos 736 - 1791) se obtuvo mediante PCR usando el ADNc de PTK1. El fragmento aislado se digirió con las enzimas de restricción EcoR1 y Xho1, sitios que se incluyeron en los oligos de PCR, y se clonaron en pGEX-KG digerido con EcoR1 y Xho1. Este fragmento en pGEX-Kg se acortó después mediante PCR para incluir solamente el dominio quinasa (nucleótidos 736 - 1638).

Ejemplo 17 pKH3-MLK2, pKH3-MLK2 (KA)

MLK2 se clonó usando PCR degenerada (Dorow, y col., Eur. J. Biochem., 1993, 13, 701 - 710; Dorow, y col., Eur. J. Biochem., 1995, 234, 492 - 500). Los segmentos de los ADNc que codifican subdominios catalíticos de las proteínas quinasas expresadas en la línea celular de tumor epitelial Colo 16 se amplificaron a partir de ARN mediante PCR de transcriptasa inversa. Los cebadores de PCR degenerada se basaron en secuencias que codifican motivos conservados en subdominios Vib y VIII de los dominios catalíticos de la familia quinasa de receptores del factor de crecimiento epidérmico. Las secuencias de los cebadores eran como sigue: cebador delantero, 5'-CGGATCCGTG(A)GT(CG)G(A)ACC(T)T-3' (SEC ID Nº 9), cebador inverso, 5'-GGAATTCACCA(G)TAA(G)CTCCAG(C)ACATC-3' (SEC ID Nº 10). Se clonaron productos de PCR en M13 y se secuenciaron usando un kit de secuenciación de T7 Super - - Base (Bresatec). Se usó un producto de PCR de 216 pares de bases como sonda para seleccionar una genoteca de ADNc \lambdagt11 de colon humano (Clontech, nº de catálogo 10346)). El fragmento se marcó por cebado aleatorio, la hibridación se realizó a 65ºC y se lavaron los filtros para una rigurosidad de NaCl 0,2X/citrato (cloriro sódico 150 mM, citrato sódico 15 mM, pH 7,0) y SDS al 0,5% a 65ºC. Los filtros se autorradiografiaron durante 16 horas a -70ºC sobre película Kodak XAR - 5. Se aislaron cuatro clones y el más largo, 1,2 kb, se usó para volver a sondar la misma genoteca usando las mismas condiciones. Se seleccionaron cuatro clones más y uno de estos clones representó un fragmento se 1034 pares de bases de MLK2. Este clon se usó para sondar una genoteca \lambdagt11 de cerebro humano. Aproximadamente 500.000 clones se seleccionaron y se aisló un clon de 3454 pares de bases, que representa la región codificadora entera de MLK2.

MLK2 se clono, a partir de ATG a la cola poliA, en el vector pKH3 entre los sitios BamH1 y EcoR1 en dos etapas ya que existe un sitio BamH1 en la mitad de al secuencia MLK2. El vector pKH3 se construyó insertando tres copias de la diana del epítope HA seguido de un sitio BamH1 entre los sitios Xba1 y EcoR1 del poliengarce pRK7. Para realizar la versión mutagenizada, K125A, el fragmento BamH1 de MLK2 5' se clonó en el vector Promega p Alter y se mutó como se recomienda por el fabricante. Después el fragmento se clonó otra vez en el vector pkH3 de MLK2.

Ejemplo 18 ADNpc3-HA-JNK1

El ADNc de JNK1 se obtuvo como se ha desrito en (Coso, y col., Cell, 1995, 81, 1137 - 1146). Al ADNc se obtuvo mediante PCR usando como molde ADNc de músculo esquelético humano (Invitrogen) y se clonó en ls sitios Bgl2 / Sal1 de ADNpc3-HA, un plásmido de expresión de ADNpc3 modificado que codifica el epítope HA (Wilson y col., Cell, 1984, 37, 767 - 778). Después éste se escindió a partir de ADNpc3, incluyendo el epítope HA, y se ligó en pGEX-4T3 (Pharmacia). El ADNc de JNK1 se escindió a partir de la construcción pGEX-4T3 como un fragmento Bgl1 / Sal1 y se ligó ADNpc3-HA, un vector con el epítope HA añadido en el sitio Hind3/BamH1 de ADNpc3.

Ejemplo 19 p-FLAG - DLK

DLK se clonó e el vector de expresión ADNpc3 con el epítope FLAG añadió como se describe en (Holtzman, y col., J, Biol. Chem., 1994, 269, 30808 - 30817). Un fragmento de ADNc para DLK se aisló mediante clonación por PCR degenerada basada en oligonucleótido. Se extrajo e ARN total a partir de riñones de 13,5 días embriónicos (32 órganos) y riñones de 17,5 días embriónicos (16 órganos) usando un procedimiento reactivo de fenol/guanidina isotiocianato preparado comercialmente según las instrucciones del fabricante (TRIzol Reagent, Life Technologies, Inc. Después de la digestión con ADNasa I sin ARNasa, el ERN total se transcrivió inversamente con ARNasa H - tranbscriptasa inversa (Superscript, Life Technologies, Inc.) a partir de un cebador de oligonucleótido sintético oligo (dT) a un ADNc de cadena sencilla. Los cebadores de oligonucleótidos degenerados correspondientes a los subdominios catalíticos de proteína tirosina quinasa Vib y IX descrito originalmente por Wilks (Wilks, Proc. Natl Acad Sci USA., 1989, 86, 1603 -
1607) se modificaron a sitios 5' Eco e HindIII, respectivamente (5'-ATAATTC(GT)GC(TAGC)GCCA(GA)GTC(TAGC)CGGTG-3') (SEC ID Nº 11), (5'-ATAAGCTTCC(TC)(AG)T(GC)AAGTGGA(TC)(GC)GC(AGC)CC(CT)GA-3') (SEC ID Nº 12). Se llevaron a cabo cuarenta ciclos de PCR durante 1,5 minutos a 94ºC, 2 minutos a 37ºC, y 3 minutos a 63ºC. Se añadieron reactivos recién preparados y se completaron 40 ciclos adicionales antes de una extensión de 10 minutos a 72ºC. El producto de amplificación de ADN de 200 - 210 pares de bases resultante se aisló mediante gel, se subclonó en un plásmido pGEM7zf(+) preparado (Promega), y se transformó en Escherichia coli. Se preparó ADN de plásmido miniprep a partir de bacterias transformadas y una porción digerida con endonucleasas de restricción EcoRI e HindIII; se secuenciaron los clones que contenían inserciones.

El fragmento de ADNc de 195 pares de bases DLK obtenido mediante PCR degenerada se marcó radiactivamente y se usó para seleccionar aproximadamente 1 x 10^{6} recombinantes de un Uni-ZAP II (Stratagene, La Jolla, CA), genoteca de ADNc de cerebro de ratón adulto cebado con oligo (DT) (Holzman, y col., Mol Cell Biol, 1990, 10, 5830 -
5838). Los filtros se hibidaron en un tampón constituido por formamida al 50%, 5 x SSC, solución de Denhardt 3 x, SDS al 0,25%, 1 mg/ml de ácido poliadenílico, y 200 mg/ml de ADN de esperma de salmón a 42ºC. Los filtros se lavaron una vez a temperatura ambiente en SSC 2 x, SDS al 0,2% y dos veces durante 30 minutos a 65ºC. Se identificaron veinticinco únicos clones; 10 clones se purificaron hasta homogeneidad, se escindieron in vivo según el protocolo del fabricante y se mapearon por restricción. Los dos clones más largos (3401 y 3397 pares de bases, respectivamente, difiriendo solamente en sus extremos 5') se secuenciaron junto con ambas hebras sobre su longitud completa.

El fragmento de ADNc de DLK NotI - XhoI de longitud completa (3401 pases de bases) se subclonó en el vector de expresión ADNpc3 eucariótico basado en promotor de citomegalovirus (Invitrogen, San Digo, CA) (construcciones designada ADNpc3-DLK). A continuación, se preparó una construcción dirigida (pFLAG-DLK) de epítope de NH4-Met FLAG (DYKDDDDK) (SEC ID Nº 13). Se usó PCR para amplificar fragmentos de ADNc que codificaba un sitio 5' HindIII, secuencia de consenso de Kozak de DLK que incluye el inicio ATG, el epítope FLAG, y la secuencia del marco abierto de lectura de ADNc de DLK que se extiende entre el nucleótido 88 y un sitio EcoRI interno en el nucleótido 758. (Oligonucleótidos sintéticos purificados por HPLC usados en catidades equimoleculares:

5'-ATAAAGCTTCCAGAGGCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGCCTGCCTCCATGAAACCCG
AACA-3' (Sec ID Nº 14)

para el cebador de polaridad positiva de la construcción FLAG y 5'-GACAGGGCGGCCGGCTCT-3' (SEC ID Nº 15) para el cebador de sentido opuesto). Fragmentos amplificados digeridos por HindIII y EcoRI purificados sobre gel se subclonaron en el HindIII - EcoRI para preparar plásmido ADNpc3 - DLK. Las construcciones se secuenciaron junto a ambas hebras para asegurar la fidelidad de la Taq polimerasa y mantener el marco de lectura.

Ejemplo 20 ADNpc3 - MLK1

La porción 5' de MLK1 se obtuvo a partir de la base de datos de EST nº de acceso AA160611). Este clon era una fusión entre MLK1 y otro ADNc de identidad desconocida. Contenía la secuencia en 5' no publicada previamente de MLK1 junto con una parte del dominio previamente publicado de MLK1 (Dorow, y col., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 701 - 710). La secuencia de ADNc de MLK1 del clon de EST es como sigue:

16

Esto se traduce en:

17

La porción en 3' de MLK1 se clonó inicialmente mediante PCR degenerada como se ha publicado previamente (Dorow, y col., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 701 - 710). El protocolo para clonar la porción en 3' de MLK1 era como se describió anteriormente para MLK2 con las siguientes excepciones. De los cuatro clones obtenidos a partir de la reselección de la genoteca con el clon de 1,2 kb, tres de los cuatro clones representaban MLK1. Ninguno de los clones incluían el dominio quinasa entero, que se obtuvo mediante PCR.

Alícuotas de 1 ml de fago de genotecas ampliadas (ADNc de línea celular de carcinoma de colon T84 humano y epitelio de colon humano normal en 1 Uni-ZAPXR (Stratagene, no de catálogo 937204) se lisaron mediante suspensión en 20 ml de agua y se congelaron instantáneamente. Una muestra de 5 ml de del fago lisado se usó como molde de PCR en dos reacciones para cada genoteca. Los cebadores que representan los vectores se recogieron a partir de las secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de clonación. En el caso de la genoteca de la línea celular de colon T84, se usaron los cebadores de secuenciación de T3 y T7 (Promega). En cada reacción, un cebador era la hebra 3' - 5' del gen MLK1, 100 pares de bases aproximadamente del extremo 5' de la secuencia conocida. El segundo cebador era uno de los dos bebedores de vectores. Las reacciones de PCR contenían tampón PCR 1 x, cloruro de magnesio 2,5 mM, Taq polimerasa 1 U (todos de Bresatec), dNTP 0,2 M y 0,4 mM de cada cebador en un total de 50 ml. Las condiciones de reacción eran 60 segundos a 95ºC, 90 segundos a 52ºC, 90 segundos a 72ºC durante 30 ciclos con un tiempo de extensión de 15 minutos en el final del ciclo. Los productos de PCR se clonaron y se secuenciaron como se ha descrito anteriormente. El clon más largo, de al selección de la genoteca y un fragmento de PCR que incluía al secuencia adicional de MLK1 se ligaron juntos para crear un ADNc de MLK1 de 1,08 kb en pUC18.

El clon de MLK1 de la base de adtos de EST se proporcionó en el vector Bluescript (Stratagene). El ADNc de MLK1 se la genoteca de colon se ligó en el clon de EST mediante digestión del anterior con EcoRI, se hizo romo con Klenow, después se cortó con AfIII. Este fragmento aislado se clonó en en ADNc de MLK1 de la base de datos de EST cortado con XhoI, hecha roma con Klenow, y se cortó con AfIII. Esta nueva construcción después se escindió a partir de pBluescript mediante digestión con Not1 y Apa1 y se ligó en ADNpc3 - EE también cortado con Not1 y Apa 1. Todas las uniones de clonación se secuenciaron verificadas.

Ejemplo 21 Expresión de E. coli de GST - MLK3_{KD}

pEGEXGK-MLK3 (KD) se transformó en la cepa de E. coli BL21 mediante electroporación. Las bacterias que contenían el plásmido se inocularon en un fermentador Applikon de 15 litros en 10 litros de volumen del siguiente medio enriquecido: 1,95 g/l de K_{2}HPO_{4}, 0,9 g/ de KH_{2}PO_{4}, 0,1 g/l de ampicilina, 0,3 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,92 g/l de MgSO_{4} \cdot 7 H_{2}O , 42,7 mg/l de citrato sódico, 21,8 mg/l de de FeSO_{4} \cdot 7 H_{2}O, 0,5 ml de metales en pequeñas cantidades Pichia (Higgins, y col., Methods Molecular Biology, 1998, 103, 149 - 177), 20 g/l de casa aminoácidos, 40 g/l de glicerol, 25,5 mg/l de CaCl_{2}. Se hicieron crecer las bacterias durante toda una noche a 800 rpm/ 68% de oxígeno disuelto 68%/ 30ºC hasta que el cultivo alcanzó una DO600 = 4,4. La producción de proteína recombinante se indujo mediante la adición de isopropil-\beta-D-tiogalactósido 1 mM, con fermentación continuada a 25ºC durante hasta 6 horas. Después se recuperaron las bacterias por centrifugación y el sedimento celular se almacenó congelado a -20ºC hasta purificación.

Ejemplo 22 Purificación de GST - MLK3_{KD} bacteriano

GST - MLK3_{KD} parcialmente purificado se preparó mediante sonicación de 100 gramos de sedimento celular bacteriano en Tris - HCl 100 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, ditiotreitol (DTT) 5 mM, pH 7,5 (tampón A). Se hizo la solución al 1% con Tritón X - 100, después se agitó sobre hielo durante 1 hora. La solución de sobrenadante después de centrifugación durante 45 minutos a 20.000 x g se mezcló durante 1 hora sobre hielo con 10 ml de resina glutatión Sefarosa 4B (Pharmacia) equilibrada en tampón A. La resina sedimentada se lavó con dos veces con 12,5 volúmenes de tampón A, después se eluyó con 200 ml de Tris - HCl 100 mM, NaCl 150 mM, DTT 5 mM (tampón B), que contenía glutation 20 mM, pH 7,5. La proteína se dializó durante toda una noche frente a tampón B y se almacenó en alícuotas a -80ºC.

Ejemplo 23 Expresión baculoviral de FLAG - MLK3 y GST - MLK3_{KD}

Baculovirus recombinantes que expresan FLAG - MLK3 y GST - MLK3_{KD} se produjeron a partir de sus respectivos vectores de transferencia, pFB-FLAG-MLK3 y pFB-GST- MLK3_{KD} usando el sistema BAC-TO-BAC (Life Technologies) según el manual de instrucciones. Los cultivos en suspensión de las células Sf21 (Vaughn, y col., In Vitro, 1977, 13, 213 - 217) se desarrollaron a 27ºC/120 rpm en medio de Grace suplementado (Link, Nature, 1970 , 226, 466 - 467) con suero fetal bovino (FBS) al 10% inactivado por calor. Para producir FLAG-MLK3 recombinante, células Sf21 a una densidad de 1,5 x 10^{6} células/ml en medio de Grace suplementado que contenía FBS al 5% se infectaron con una multiplicidad de infección (MOI) de 3,1 y se recogió a las 39 horas después de infección. Para producir GST - MLK3_{KD}, células Sf21 a una densidad de 1,5 x 10^{6} células/ml en medio de Grace suplementado que contenía FBS al 5% se infectaron con una MOI de 2 y se recogió a las 41 horas después de la invención. En ambos casos, las células sedimentadas se volvieron a suspender en tampón constituido por HEPES 10 mM, NaCl 50 mM, SC Pefabloc 0,5 mM, pepstatina 5 \muM, 10 \mug/ml de aprotinina, 10 \mug/ml de leupeptina, pH 7,4. La solución de sobrenadante después de centrifugación durante 1 hora a 147.000 x g se reajustó hasta pH 7,4 con base Tris 3 M y después se almacenó a -70ºC antes de la purificación.

Ejemplo 24 Purificación de GST - MLK3_{KD} baculoviral

GST - MLK3_{KD} baculoviral parcialmente purificado se preparó mediante cromatografía de afinidad sobre glutatión. Para 10 ml de extracto celular (26,6 mg de proteína total), se añadió 1 ml de resina de glutatión Sefarosa 4B (Pharmacia) equilibrada en HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 (tampón C) y la proteína se dejó que se uniera durante 45 minutos a 4ºC. la resina se lavó después en formato de columna con 30 volúmenes de columna, después de eluyó con 5 volúmenes de columna de tampón C que contenía glutatión 20 mM. El producto final reunido se dializó durante toda una noche contra tampón C y se almacenó en alícuotas a -70ºC.

Ejemplo 25 Purificación de FLAG - MLK3_{KD} baculoviral

FLAG - MLK3_{KD}baculoviral parcialmente purificado se preparó mediante cromatografía de afinidad de anticuerpo. Proteína de 15 ml de extracto (19,5 mg, de proteína total) con NaCl 0,1 M adicional en 0,25 ml de columna de anticuerpo de péptido FLAG monoclonal M2 acoplado a resina de agarosa (Sigma) mediante carga repetida (un total de tres veces). La resina se había equilibrado con un lavado de 5 volúmenes de columna de Tris - HCl 50 mM, 150 mM, pH 7,4 (TBS), un lavado de 3 volúmenes de columna de glicina 0,1 M, pH 3,5, seguido de otro lavado de 5 volúmenes de columna con TBS, antes de cromatografía. La proteína recombinante se eluyó principalmente mediante 5 volúmenes de columna de péptido FLAG 0,2 mM (N - Asp - Tyr - Lys - Asp - Asp - Asp - Asp - Lys - C) (SEC ID Nº 18) en TBS. La proteína se almacenó en alícuotas a -80ºC antes del ensayo.

Ejemplo 26 Mutante negativo dominante: un mutante negativo dominante de la familia MLK bloquea la muerte en células PC12 diferenciadas después de la retirada del factor de crecimiento nervioso

La línea celular PC - 12 derivada de un tumor de feocromocitoma de rata se ha usado extensivamente como un modelo de células neuronales para examinar los casos moleculares que conducen a muerte neuronal (para revisión, véase, Troy, y col., Adv. Neurology, 1997, 103 - 111). El factor de crecimiento nervioso (NGF) induce células PC - 12 para diferenciar se en fenotipo neuronal simpático (Greene, Cell Biol, 1978, 78, 747 - 755). Las células PC - 12 diferenciadas de NGF son dependientes de NGF para supervivencia y experimentan una muerte apotópica descrita morfológicamente tras la retirada de NGF del medio de cultivo. Se desarrolló un sistema celular para determinar el efecto de miembros de la familia de la quinasa de linaje mixta sobre muerte de células PC - 12 después de la retirada de NGF. Células PC - 12 se transfectaron con ADNc que codifica un mutante dominante negativo (DN) de MLK - 3 que usa sistema de transferencia de lípido Pfx como recomienda el fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Un conjunto estable de transfectante que expresa DN-MLK-3 se seleccionó usando G418 sulfato (Mediatech Inc, Rendón, VA). Aproximadamente 30% de células en estos conjuntos expresa MLK3 DN como se determina mediante inmunoquímica. Los conjuntos de células que expresan establemente la quinasa mutante se sembraron en placas de formato de 96 pocillos de cultivo de tejido recubiertas con poliornitina/laminina (10 \mug/ml de cada uno en solución salina tamponada con fosfato) a una densidad de 2 x 10^{4} células /pocillo y se trataron 100 ng/ml de NGF durante 7 días. Se retiró el medio que contenía el NGF, la monocapa de células se lavó con solución salina tamponada con fosfato que contenía anticuerpo de NGF neutralizante (nº de catálogo N6655; Sigma, San Luis, mO) a uan dilución final de 1:1000 se reemplazó durante 1 - 5 días. La viabilidad celular se cuantificó mediante un ensayo de viabilidad celular usando la conversión de la sal tetrazolio, MTS, a un formazán coloreado que se leyó a uan absorbancia de 570 m sobre un CytoFluor 2350 (JMillipore, Bedford, MA) según recomienda el fabricante (Promega, Madion, WIU). Los conjuntos estables que expresan DN - MLK3 se rescataron parcialmente a partir de la muerte celular producida por la retirada de NGF (figura 10).

Ejemplo 27 Ensayo para evaluar la actividad enzimática de proteína MLK recombinante

Con el fin de demostrar que la proteína MLK expresada en el sistema de expresión bien de baculovirus o bacteriano es enzimáticamente activo, se pueden usar varios formatos de ensayo. La proteína MLK puede ser una construcción de longitud completa o un dominio quinasa expresado en un sistema de expresión bien de baculovirus o bacteriano, El ensayo puede ser baasdo en anticuerpos tal como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), fluorescencia en tiempo resuelto (TRF), o polarización de fluorescencia (FP). El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal con reactividad hacia fosfoserina, fosfotreonina, o sustrato específico d fosfo. Como alternativa, un procedimiento no basado en anticuerpo se puede usar como un ensayo basado en gel radiactiv0o (véase la figura 11), ensayo de precipitación de ácido tricloroacético (TCA) de selección múltiple (figura 13, ensayo de proximidad se centelleo, procedimiento de placa rápida, o ensayo de filtro de fosfocelulosa (figura 13). El ensayo se puede diseñar para controlar la fosforilación de un sustrato acoplado a un sistema de ensayo acoplado utilizando las quinasas cadena abajo en una ruta de señalización, El sustrato puede ser un sustrato específico tal como SEK - 1 un sustrato relativamente no específico tal como proteína básica de mielina (MBP).

Ejemplo 28 Ensayos de quinasas (1) Ensayo de quinasa basado ángel radiactivo

La actividad quinasa de MLK - 3 se ensayó controlando la incorporación de ^{32}P de [\gamma-^{32}P]-ATP en una sustancia de MÑLK (por ejemplo, SEK - 1 muertas por quinasa; proteína básica de mielina). Los 50 \mul de mezcla de ensayo contenía tampón A (MOPS 20 mM, pH 7,2 \beta-glicerol fosfato 25 mM, EGTA 5 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, ditiotreitol 1 mM), MgCl_{2} 15 mM, ATP 100 \muM, 10 \muCi de [\gamma-^{32}P]-ATP, y 0,1 \mug de sustrato de SEK-1 muertas por quinasa (Stressgen, Ing; S- transferasa - SEK-1 glutatión unido (GST-SEK-1) se liberó de perlas de glutatión - agarosa con glutatión 10 mM, pH 8,0) o 25 \mug de MBP (Sigma Chemical Co.). La reacción se inició mediante la adición de proteína MLK (dominio quinasa o preparación que contiene dominio tanto de longitud completa como quinasa) o proteína control. La mezcla se incubó durante 30 minutos a 30ºC. La final de la reacción se añadió tampón demuestra reductor 2 x. La mezcla de sometió a ebullición durante 5 minutos, se cargó en bien gel SDS al 12% - PAGE (usando MBP como sustrato) o gel al 8% (SEK-1 como sustrato). Después de electroforesis, se secó el gel. La cuantificación de incorporación de fosfato en sustrato, SEK-1, se realizó sobre un Molecular Dynamics Phosphorimager (Sunnyvale, CA). Los resultados de lso experimentos designados APRA mostrar las actividades emzimáticas de MLK-3 expresada en baculovirus (dominio de longitud completa marcado con FLAG o quinasa marcado con GST) usando GST - SEK1 muerta por quinasa o MBp como sustrato se muestran en las figuras 11A y 11B.

(2) Análisis de transferencia de Western

La actividad quinasa se MLK-3 expresada en baculovirus se examinó mediante ensayo de inmunotransferencia. Los 20 \mul de mezcla de ensayo contenía tampón A, MgCl_{2} 15 mM, ATP 100 \muM, y 0,1 \mug de sustrato de SEK-1 muerta por quinasa. la reacción se dejó que procediera durante 30 minutos a 30ºC, después se inactivó con 10 \mul de tampón de muestra reductor 4 x. La proteínas se separaron sobre un gel Tris al 8% - glicina y se transfirió electroforéticamente a membrana Immobilon PVDF. La membrana se incubó con anticuerpo SEK-1 (Thr 233) específico de fosfo (New England Biolabs, Inc) seguido de IgG anticonejo marcada con peroxidasa de rábano picante (Bio - Rad). La detección de las bandas inmunorreactivas se realizó mediante quimioluminiscencia potenciada (Amersham). La fosfolilación de GTS - SEK-1 muerta por quinasa mediante proteína FLAG - MLK3 (la preparación de baculovirus contenía dominio de longitud completa y quinasa) se ilustra en al figura 12.

(3) Ensayo de precipitación con ácido tricloroacético (TCA) Multiscreen

La actividad quinasa de dominio GST - MLK-3 quinasa expresado bacteriológicamente se determinó usando el ensayo "en placa" de ácido tricloroacético Multiscreen de Millipore como describe Pitt, y col., J. Biomol. Screening, 1996, 1, 47 - 51). Los ensayos se realizaron en placas de 96 pocillos Multiscreen Durapore (Millipore). Cada 50 \mul de mezcla de ensayo contenía Hepes 20 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 20 mM, MnCl_{2} 20 mM, DTT 2 mM, Na_{3}VO_{4} 0,1 mM, 1 \muCi de [\gamma-^{32}P] ATP, y 30 \mug de sustrato de sustrato de MBP. La reacción se inició añadiendo proteína MLK y se dejó proceder durante 15 minutos a 37ºC. La reacción se detuvo con 25 \mul de TCA al 50%. Las placas se dejaron equilibrar durante 30 minutos a 4ºC, después se lavaron con TCA al 25% enfriado con hielo. Se añadió cóctel de centelleo a las placas, y se determinó al radiactividad usando contador de centelleo Wallac MicroBeta 1450 PLUS. La respuesta de dosis de proteína frente a la formación de MBP marcada con ^{32}P se muestra en al figura 13.

(4) Ensayo de filtro de fosfocelulosa

El ensayo de quinasa se realizó en 50 \mul de mezcla de reacción que contenía Hepes 20 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 20 mM, MnCl_{2} 20 mM, DTT 2 mM, Na_{3}VO_{4} 0,1 mM, 1 \muCi de [\gamma-^{32}P] ATP, y 30 \mug de sustrato de sustrato de MBP. La reacción se inició añadiendo proteína MLK y se dejó que procediera durante 15 minutos a 37ºC. La reacción se detuvo con 75 \mul de ácido fosfórico 75 mM. Una alícuota de solución inactivada se cargó directamente sobre la membrana se fosfocelulosa (Pierce). Como alternativa, se puede usar la placa multiscreen de fosfoceliulosa de 96 pocillos (Millipore). Las membranas se lavaron con H_{3}PO_{4} 75 mM. La MBP fosforilada marcada con ^{32}P unida se eluyó con tubos de recogida añadiendo hidróxido sódico 1 M. la radiactividad se determinó mediante un recuento de Cerenkov en un contador de centelleo Beckman (Somerset, NJ). la formación de MBP fosforilada con una concentración creciente de dominio quinasa GST - MLK-3 expresada bacteriológicamente se muestra en al figura 13.

Ejemplo 29 Ensayo para determinar la unión de compuestos a la familia MLK recombinante

K-252a (compuesto III - 3; véase la tabla 4), un metabolito de indazol de especie Nocardia, se une a una diversidad de serina/treonina y tirosina quinasas (Ángeles y col., anal. Biochem., 1996, 236, 49 - 55; Knight, y col., Anal. Biochem., 1997, 247, 376 - 381). Un ligando K-252a tritiado se usó para determinar la unión a MLK-3 de longitud completa recombinante humana a partir de una preparación bruta de células por baculovirus. [^{3}H]K-252a se marcó específicamente con tritio en las posiciones 3 y 9 mediante contrato con productos de investigación NEN (Billerica, MA) y tenía una actividad específica de 40 Ci/moles. Las reacciones de unión se realizaron en 1 ml en una placa se 96 pocillos. La mezcla de reacción contenía tampón MOPS 50 mM, pH 7, NaCl 150 mM, MnCl_{2} 5 mM, BSA 1 mg/ml, DMSO al 1% y [^{3}H]K252a. Las muestras se llevaron a cabo por triplicado con una concentración de 5 \mug/ml de MLK-3 derivada con baculovirus bruta. La unión no específica se definió como unión en presencia e K252a 1,2 \muM y se sustrajo de la unión total para proporcionar la unión específica. A esta dilución 12 - 15% de los conteos totales estaban unidas no específicamente a proteína y 75 - 85% de estos conteos estaban específicamente unidas a MLK (figura 14). Todos los experimentos se realizaron durante dos horas a 4ºC. Los complejos [^{3}H]K252a/MLK-3 se recogieron sobre filtros Watman GF/C usando un recogedor Brandel, se lavaron con tampón MOPS/NaCl frío y se contaron sobre un contador Micro Beta de Wallac. Un experimento de unión de saturación se realizó para obtener una K_{d} para K252a. Se muestra un ejemplo de los resultados de uno de estos experimentos (figura 14). Se obtuvo una K_{d} de 0,89 nM (límites de confianza: 0,2 a 1,5 nM).

Ejemplo 30 Ensayo de células intactas (A) Sistema de sobreexpresión Cos 7 Materiales

K-252a y derivados de este compuesto se proporcionaron mediante Kyowa - Hakko. Kogyo Co. Ltd. (Tokio, Japón) (Kaneko y col., 1997). Los compuestos se disolvieron en dimetil sulfóxido de calidad de cultivo celular (DMSO) y se almacenaron en oscuridad a 4ºC. Todas las diluciones de compuestos se realizaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía albúmina sérica bovina al 1%. El anticuerpo de hematglutinina (HA) se compró en BabCO (Richmond, CA). Sustrato AP-1 (c-jun) se compró en Amersham (Arlington Heights,
IL).

Cultivo de células Cos 7

Células Cos 7 de riñón de mono verde se obtuvieron de ATCC, Rockville, Maryland (CLR 1651) y se mantuvieron en DMEM que contenía suero bovino al 10%, glutamina 2 mM, piruvato 1 mM, penicilina 50 U/ml/estreptomicina a 37ºC en CO_{2} al 10%, atmósfera de aire al 90%. las células Cos 7 se separaron para subcultivo añadiendo tripsina al 0,25%.

(1) La sobreexpersión de miembros de la familia MLk y JKN 1 en células Cos 7

Se sembraron células Cos 7 a 80% de confluencia y se transfectaron con 2 \mug cada una de las construcciones de ADNc usando lipofectamina como recomienda el proveedor (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Un ADNc de longitud completa de MLK-3, MLK-2 humanas, o DLK de ratón o una MLK-1 humana parcial como se ha descrito anteriormente, y JNK1 humana marcada con Hemaglutinina A, proporcionada amablemente por J. Silvio Gutkind (NIH, Bethesda, MD), se subclonaron en el vector ADNpc3 (Invitrogen, San Diego, CA). Después de 48 horas de transfección, las células se trataron con DMSO al 0,025% o 500 nM de los compuestos indicados durante 72 horas seguido de lisis en 0,4 l de tampón Ttritón (Tritón X-100 al 1%, cloruro sódico 50 mM, Tris 10 mM (pH 7,6), albúmina sérica bovina al 0,1%, pirofosfato sódico 30 \muM, fluoruro sódico 50 mM, 20 \mug/ml de aprotinina, fenilmetilsulfnilfluoruro 1 mM, vanadato sódico 1 mM). La actividad de JNk del lisado se ensayó mediante ensayo de inmunoprecipitación /quinasa como se describe mas adelante.

(2) Ensayo de imunoprecipitación y quinasa de células enteras

Lisado de células Cos 7 se midió para concentración de proteína usando el kit Micro BCA de Pierce (Rockford, IL) y cantidades iguales de proteína se inmunoprecipitaron con el anticuerpo HA durante 1 hora a 4ºC. Los inmunoprecipitados se sedimentaron mediante centrifugación en una microcentrífuga durante 20 segundos, se volvió a suspender en tampón Tritón, se lavó mediante centrifugación 2 veces más, seguido de un lavado final en tampón quinasa (Hepes 20 mM pH 7,4, MgCl_{2} 20 mM, ditiotreitol 2 mM, vanadato sódico 0,1 mM). El inmunoprecipitado se volvió a suspender en tampón quinasa que contenía ATP 1 \muM y 5 \muCi [\gamma-^{32}P]ATP y sustrato (1 \mug/muestra de AP - 1) y se incubó durante 15 minutos a 30ºC. la reacción de quinasa se detuvo mediante adición de tampón de muestra reductor (Laemmli, Nature 1970: 227; 680 - 685). Las muestras se calentaron hasta 80ºC durante 5 minutos y se cargaron en geles de SDS al 10% - poliacrilamida. Las proteínas se separaron mediante electroforesis. El gel se secó y la cuantificación de radiactividad en el sustrato AP - 1 se realizó en un Molecular Dynamics Phosphoroimager (Sunnyvale, Ca). Los resultados de los experimentos en los que MLK-3, MLk-2 y DLK se co - expresan con HA - JNK1 y se incubaron en ausencia de K-252a se muestran en las figuras 15A y 15B. Por el contrario, un derivado del compuesto parentela K-252a llamado compuesto III - 3 (véase la tabla 4), que era un inhibidor más selectivo de quinasa, no interfirió con la ruta JNK activada pot otra MAPKKK cadena arriba de NK, MEKK1 (figura 15C).

(B) Ensayo indicador de células completas para JKK activada por MLK

Intentos en clones de derivación expresando constitutivamente la familia MLK no han tenido éxito, sugiriendo que la sobreexpresión de la MLK puede afectar a la supervivencia celular (Berrgeron y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, 231, 153 - 155; Nagata y col., EMBO., 1998, 17, 149 - 158). Por lo tanto, en el desarrollo de un ensayo de células enteras para rastreo de casos bioquímicos inducidos por MLK, se puede requerir una línea celular que contenía un sistema de expresión inducible modificado por ingeniería genérica de la quinasa de interés. Por ejemplo, una línea celular PC - 12 transfectada con un transactivador controlado por tetraciclina. Cuando las células se transfectaron adicionalmente con un gen de interés conducido por el promotor inducible tertO, la expresión de ese gen está estrechamente controlada por tetraciclina en el medio (Shockett, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6522).

Para cuantificar la activación de MLK, se puede medir la fosforilación de sustratos cadena abajo tales omo MEK4, JNK o c-jun en formatos de ensayo múltiple como se ha descrito anteriormente. Otros planteamiento para cuantificar la activación de MLK en células enteras es usar una actividad enzimátira reportera tal como el sistema reportero de luciferasa c - jun comercialmente disponible a través del sistema PathDetect™ (Stratagene, Lajolla, CA). (En este sistema, la línea celular inducible por tetraciclina se transecta con dos plásmidos. Un plásmido expresa constitutivamente uan fusión del dominio transactivador NH2 terminal de jun con el dominio de unión de ADN GAL4 de levadura (proteína de fusión jun - DBD). El otro plásmido lleva las secuencias codifcadoras para la luciferasa de luciérnaga conducida por cinco repeticiones en tándem del sitio de unión de GAL4. Tras activación de MLK, el sustrato cadena debajo de JNK, proteína de fusión jun - DBD, se fosforila, se une a los sitios de unión de GAL, e induce la transcripción del gen de luciferasa. La luciferasa se ensaya fácilmente en lisadis celulares mediante la adición de su sustrato (Promega, Madison, WI) y la medición de quimioluminiscencia.

Ejemplo 31 Asociación de inhibición de los miembros de la familia MLK con neuronas motoras y supervivencia cortical Supervivencia de cultivos de médula espinal enriquecidos por neuronas motoras

Se diseccionaron médulas espinales de fetos de ratas Sprague - Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) de edad embriónica (E) 14,5 - 15. Se disociaron células solamente de la parte ventral de la médula espinal, y se enriquecieron adicionalmente APRA evaluar las neuronas motoras mediante centrifugación en una etapa de gradiente de metrizamida al 6,5%, como se ha descrito anteriormente (Henderson, y col., 1993), y se analizaron para evaluar la pureza mediante la tinción con anticuerpo receptor de neurotrofina de baja afinidad (IgG - 192, Boehringer -
Mannheim) (datos no mostrados. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos previamente revestidas con poli-l-ornitina y laminina (5 \mug/ml cada uno) a una densidad de 6 x 10^{4} células/cm^{2} en medio N2 exento de suero químicamente definido (Bottenstein, y col., 1979, anteriormente). Con el fin de separar la unión de efectos de supervivencia, la adición de los compuestos a los cultivos se realizó después de un período de unión inicial de 1 - 3 horas. La supervivencia neuronal se determinó después de 4 días usando calceína AM (Molecular Probes, Eugene, OR) en un ensayo de viabilidad fluorométrica (Bozyczko - Coiné, y col., 1993, anteriormente). Los conteos microscópicos se neuronas se correlacionaban directamente con los valores de fluorescencia relativa. En resumen, medios de cultivo se diluyó en serie en DPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbeccos) y después se añadió una concentración final de solución madre de calceína AM 6 \muM a cada uno de los 96 pocillos. las placas se incubaron durante 30 minutos a 37ºC, seguido de lavados de dilución en serie en DBPS. La señal fluorescente se leyó usando un fluorímetro de lectura placas de Millipore (Cytofluor 2350) a exciutación = 485 nm y emisión = 538 nm. Para cada placa, el fondo medio derivado de pocillos que recibían calceína AM, pero no conteniendo células, se restó de todos los valores. la linealidad de la señal de fluorescencia se verificó para la concentración y tiempo de incubación para el intervalo de densidades celulares en estos experimentos. Un ejemplo de porcentaje de supervivencia por encima del control de neuronas motoras en presencia de compuestos de ensayo a 250 nM se muestra en la tabla
3.

Supervivencia de neuronas corticales

Se diseccionaron cortezas cerebrales de fetos de ratas de 18 días embriónicas y se digirieron enzimáticamente para obtener una suspensión de células individuales. Las células se sembraron a una densidad de 1,56 x 10^{5}/cm^{2} en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos recubiertos con poli-ornitina/laminina en medio basal neural exento de suero que contenía suplementos B27 Las placas se recubrieron con una solución de poli-ornitina/laminina (8 \mug/ml cada uno) preparadas en PBS durante al menos 2 horas a 37ºC. Los días 5 - 7 in vitro, las neuronas corticales se expusieron a Ac25 -
35 (20 \muM) bien en presencia o en ausencia de compuestos de ensayo. Soluciones madre de Ab25 - 35 (Sigma, San Luis, MO) (1 mM) se prepararon en H_{2}O destilada estéril desionizada. La supervivencia neuronal relativa se determinó a las 48 horas después de la adición de péptidos usando la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) como indicador de la integridad de membrana plasmática/viabilidad celular. LDH se midió usando el kit de detección de citotoxicidad (Boehringer - Mannheim, Indianápolis, IN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos se expresan como porcentaje de inhibición de LDH liberada con relación a cultivos tratados con Ab25 - 35
solo.

TABLA 3

18

^{1} \begin{minipage}[t]{150mm} El compuesto tiene la fórmula III en la que Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; y R es OH. \end{minipage}

^{2} \begin{minipage}[t]{150mm} El compuesto tiene la fórmula III en la que Z_{1}, Z_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; R_{1}, y R_{2} son CH_{2}CH_{2}CH_{3}; y R es OH. \end{minipage}

^{3} \begin{minipage}[t]{150mm} El compuesto tiene la fórmula I en la que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5}, y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es CH_{2}CH_{2}OAc; R_{4} es CH_{2}CH_{2}(2\text{-}piridilo); y X es CH_{2}. \end{minipage}

^{4} \begin{minipage}[t]{150mm} El compuesto tiene la fórmula I en la que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5}, y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es H; R_{4} es CH_{2}CH_{2}(2\text{-}piridilo); y X es CH_{2}. \end{minipage}

Ejemplo 32 Inmunopreparación de la actividad de JUK endógena de los cultivos de neuronas motoras en ausencia o presencia de indolocarbazoles o pirroilocarbazoles condensados

Las neuronas motoras se siembran a una densidad de 6 x 104 células/cm2 en pocillos de 16 mm de diámetro. Se deja que las células se adhieran durante 2 horas antes del tratamiento. La células se trataron con bien DMSO al 0,0125% o compuesto 500 nM durante 2 horas en medio definido N2. Después las células se enjuagan con solución salina tamponada con fosfato enfriado con hielo seguido de lisis en 0,4 ml de tampón Tritón como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 30. El lisado de los cultivos de las neuronas motoras se normalizó hasta un número de células y se inmunoprecipitó con anticuerpo JNK1 /nº de catálogo sc-474) comprado en Santa Cruz Biotechnology (santa Cruz, CA). La actividad de JNK del inmunoprecipitado se ensayó en presencia de ^{32}P-ATP y sustrato c-jun como se ha descrito anteriormente. El perfil de la actividad inhibidora de los 4 compuestos de ensayo se comparó en las neuronas motoras y en células Cos 7 que sobreexpresan bien DLK, MLK-1, MLK-2 o MLK-3 (tabla 3).

Ejemplo 33 Correlación entre inhibicón de actividad de JNK inducida por MLK-3 en células Cos 7y actividad de la colinaacetiltransferasa en cultivos embriónicos primarios

Para determinar si al inhibición de la ruta de JNK regulada por estas quinasas está correlacionada con compuestos neurotróficos, los inventores evaluaron el efecto de los compuestos sobre la actividad de JNK en células Cos 7 que sobreexpresan HA-JNK y MLK3. Después de un período de transfección de 48 horas, las células se incubaron con los compuestos a 500 nM durante 2 horas seguido de lisis celular. El lisado se inmunoprecipitó y la actividad quinasa se midió como se ha descrito previamente. Los resultados se reseñaron como porcentaje de inhibición de muestra control en la que el control es actividad de JNK en presencia de DMSO. Como se puede observar en la tabla 4, la mayoría de los compuestos que eran activos en la actividad de ChAT de la médula espinal y/o del cerebro delantero basal eran potentes inhibidores de la activación por MLK-3 de JNK.

TABLA 4 Efecto de indolo- e indeno- carbazoles en la actividad de JNK en células Cos 7 que sobreexpresan MLK3

19

^{1} El compuesto que tiene la fórmula III en la que Z_{1} y Z_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} es NHCONHC_{2}H_{5}; R_{2} es CH_{2}CH_{2}(2-piridilo); y R es OH.

^{2} El compuesto que tiene la fórmula III en la que Z_{1} y Z_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} y R_{2} son CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}; y R es OH.

^{3} El compuesto que tiene la fórmula III en la que Z_{1} y Z_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} y R_{2} son CH_{2}SCH_{2}CH_{2}; y R es OH.

^{4} El compuesto que tiene la fórmula I en la que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, y R_{4} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es CH_{2}CH_{2}OH; R_{5} y R_{6} son OCH_{3}; y X es CH_{2}.

^{5} El compuesto que tiene la fórmula I en la que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5}, y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es CH_{2}CH_{2}OAc; R_{4} es Br; y X es CH_{2}.

^{6} El compuesto que tiene la fórmula I en la que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5}, y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es CH_{2}CH_{2}OAc; R_{4} es CH_{2}CH_{2}(2- piridilo); y X es CH_{2}.

^{7} El compuesto que tiene la fórmula I en la que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es CH_{2}CH_{2}OH; y X es CH_{2}.

^{8} El compuesto que tiene la fórmula I en la que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH; y X es CH_{2}.

^{9} El compuesto que tiene la fórmula I en la que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; y X es S.

^{10} El compuesto que tiene la fórmula I en la que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es CH_{2}CH_{2}CH_{2}NHCO(4-(OH)Ph); y X es CH_{2}.

^{11} El compuesto que tiene la fórmula III en la que Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3}; y R es OH.

^{12} El compuesto que tiene la fórmula III en la que Z_{1}, Z_{2}, y R_{1}, son H; R_{2} es CH_{2}OH; X es CO_{2}CH_{3}; y R es OH.

^{13} El compuesto que tiene la fórmula III en la que Z_{1} y Z_{2} juntos forman =O; R_{1} y R_{2} son Br; X es CO_{2}CH_{3}; y R es OH.

^{14} El compuesto que tiene la fórmula I en la que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5}, y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es H; R_{4} es CH_{2}CH_{2}(2- pirimidilo); y X es CH_{2}.

^{15} El compuesto que tiene la fórmula III en la que Z_{1}, y Z_{2} son H; R_{1} es Br; R_{2} es I; X es CO_{2}CH_{3}; y R es OH.

^{16} El compuesto que tiene la fórmula III en la que Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; y R es OH.

^{17} El compuesto que tiene la fórmula III en la que Z_{1}, y Z_{2} son H; R_{1} y R_{2} son CH_{2}CH_{2}SCH_{3}; X es CO_{2}CH_{3}; y R es OH.

^{18} El compuesto que tiene la fórmula I en la que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{4} es CH_{2}CH_{2}(2-piridazinilo); y X es CH_{2}.

^{19} El compuesto que tiene la fórmula I en la que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5}, y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es H; R_{4} es CH_{2}CH_{2}(2-piridilo); y X es CH_{2}.

^{20} El compuesto que tiene la fórmula III en la que Z_{1}, Z_{2}, R_{1} y R_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; y R es OCH_{3}.

^{21} El compuesto que tiene la fórmula I en la que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es (CH_{2})_{3}-NH-C(=O)-3,5-dihidroxifenilo; y X es CH_{2}.

^{22} El compuesto que tiene la fórmula I en la que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es benzoílo; y X es CH_{2}.

^{23} El compuesto que tiene la fórmula I en la que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5}, y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{4} es CH=CH-C\equivN; y X es CH_{2}.

Ejemplo 34 Ensayo de desplazamiento en gel para activación de MLK

La activación de MLK puede conducir a la inducción de la transcripción de c-jun, dando como resultado un incremento de la proteína c-Jun. La cantidad aumentada de proteína c-Jun se puede medir mediante un ensayo convencional, identificado como un ensayo de desplazamiento en gel. Garner, y col., Nucleic Acids Res., 1981, 9, 3047 - 3060, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad. Los oligómeros de ADN de doble cadena marcados radiactivamente, que codifican un sitio de unión a ADN de c-Jun, se incuban con in extracto celular nuclear seguido de electroforesis en gel de archilamida y cuantificación del ADN marcado radiactivamente desplazado a una movilidad más lenta. Esto representa la parte de ADN que está unida a la proteína c-Jun y es directamente proporcional a la cantidad de proteína c-Jun en el extracto.

La activación de las MLK también pueden inducir la fosforilación c-Jun. Estos se puede detectar usando anticuerpos que específicamente reconocen la forma fosforilada de la proteína en sistemas de detección tales. como por ejemplo, transferencias de Western o ELISA.

Ejemplo 35 Supervivencia de neuronas embriónicas de pollo Materiales

Medio L15 de Leibovitz, glucosa, bicarbonato sódico, tripsina y antibióticos eran de Gibco. Se preparó extracto muscular como se ha descrito en (Henderson, y col., Nature, 1983, 302, 609 - 611, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad. Todos los otros reactivos eran de Sigma, salvo que se indique de otra manera.

Cultivo celular

Se aislaron neuronas motoras (embriónicas de 5,5 días) con un procedimiento inmunológico según el procedimiento expuesto en Bloch - Gallego, y col., Development, 1991, 111, 221 - 232, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad, con modificaciones como se describe en Weng, y col., NeuroReport, 1996, 7, 1077 - 1081, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad. Se sembraron neuronas motoras en placas de cultivo de tejido de 35 mm (Nunc) pre - recubiertas con poli-DL-ornitina y laminina (1 \mug/ml), Upstate Biotech). El medio de cultivo era L15 con bicarbonato sódico (22,5 mM), glucosa (20 mM), progesterona (2 x 10^{-8}M), selenito sódico (3 x 10^{-8}M), con albúmina (0,1 mg/ml), insulina (5 \mug/ml), penicilina - estreptomicina, y suero de caballo al 10% inactivado por calor. El extracto muscular se suplementó a 30 \mug/ml. El compuesto III - 3 se preparó como una solución madre 4 mM en DMSO y se almacenó protegido de la luz a 4ºC. La concentración final de DMSO en cultivos tratados y control era 0,125%.

Los ganglios simpáticos paravertebrales (SG; día embrional 12 (E12)), ganglios de la raíz dorsal (DRG; E9), y ganglios filiares (CG; E8) se diseccionaron de embriones de pollo en el día nembriónico indicado como se describe en Lindsay, y col., Dev. Biol., 1985, 112, 319 - 328, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad. Después de tripsinación y disociación, las suspensiones de células nerviosas se sembraron en placas de cultivo recubiertas con poliornitina - laminina en medio de cultivo F14 de Ham, suplementado con suero de caballo al 10%. Inmediatamente después de sembrar, los factores de supervivencia se añadieron a las concentraciones siguientes: factor de crecimiento nervioso (NGF), 20 ng/ml; factor neurotrofico ciliar (CNTF), 10 ng/ml. Los cultivos se mantuvieron a 37ºC y CO_{2} al 5% en un ambiente humidificado.

Recuento celular

Las neuronas se sembraron en placas de cultivo de 35 mm con cuadrículas (Nunc). Áreas seleccionadas de cada placa que comprenden juntas aproximadamente el 10% de la superficie se barrieron para evaluar la presencia de células brillantes de fase inmediatamente después de la siembra y otra vez después de 48 horas para determinar los porcentajes de supervivencia. La supervivencia celular se confirmó mediante tinción vital con azul de triptófano (no mostrado).

DGR intacto

Los ganglios se colocaron en placas de 96 pocillos recubiertas previamente con poli-l-ornitina y laminina (5 \mug de cada uno/ml de solución salina tamponada con fosfato) en medio N2 exento de suero (Bottenstein, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 514 - 517, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad) que contiene albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5% y se mantuvieron durante 48 horas a 37ºC y CO_{2} al 5% en un ambiente humidificado. Los ganglios tratados recibieron bien compuesto III - 3 250 nM o 20 ng/ml de NGF 2 horas después de la siembra.

El compuesto III - 3 soporta la supervivencia de neuronas periféricas embriónicas de pollo de una manera dependiente de la concentración

Retirada de NGF de cultivos disociados de neuronas sensibles de ganglios de la raíz dorsal E9 (DGR) y neuronas de los ganglios simpáticos (SG) E12 les produce que se sometan a PCD en 48 horas. Estos se evitaron mediante la adición del compuesto III - 3 al medio de cultivo en el tiempo de la retirada de NGF. AT 1 \muM, compuesto III - 3 mantenido al 94% de neuronas del SG y 890% de neuronas de DGR vivas después de 48 horas (control tratado con NGF: SG 65%, DRG 66%). De manera similar el compuesto III - 3 promovía la supervivencia de 76% de neuronas de ganglios ciliares (CG) dependientes de CNTF después de 24 horas (67% de control tratado cor CNTF). En presencia de suero al 10%, los efectos de supervivencia del compuesto III - 3 eran dependientes de concentración, con una meseta alcanzada aproximadamente a 1 \mu para las tres poblaciones de neuronas (fig. 16 A - C). Las neuronas supervivientes mostraron crecimiento hacia el exterior de neuritas extenso con neuritas más gruesas y más curvadas como se compara con los cultivos control. (Fig. 17 E - H). Después de cuatro días, la actividad promotora de supervivencia estaba todavía intacta: DGR: 52% de compuesto III - 3 41% de control tratado con factor de crecimiento; SG: 83% de compuesto III - 3, 55% de control tratado con NGF; CG: 58% de compuesto III - 3, 50% de control tratado con CNTF). En condiciones óptimas, los cultivos se pueden mantener con compuesto III - 3 durante una semana y más tiempo (no mostrado).

El compuesto III - 3 soporta la supervivencia de neuronas motoras embriónicas de pollo de una manera dependiente de concentración

Neuronas motoras de pollo cultivadas pueden supervivir extender los procesamientos en presencia de extracto muscular, mientras que mueren rápidamente en su ausencia. En los experimentos de los inventores, después de 48 horas, el 65% de las neuronas motoras sobrevivió en presencia de extracto muscular, en contraposición al 14% de controles no tratados. En condiciones sin suero, el, efecto de supervivencia del compuesto III - 3 era máximo a 300 nM, y era algo mayor (79%) que la inducida por extracto muscular. La dependencia de la concentración del efecto de supervivencia del compuesto III - 3 en este sistema es diferente que en las neuronas periféricas, ya que concentraciones del compuesto III - 3 superiores 300 mostraron un efecto progresivamente reducido (fig. 16A). Esto pudiera indicar una sensibilidad particular de neuronas motoras a algún aspecto de la actividad del compuesto III - 3. Morfológicamente, las neuronas motoras rescatadas con el compuesto III - 3 mostraron cuerpos celulares de brillo de fase y eran capaces de extenderse a neuritas largas, que parecía ligeramente más gruesas que las inducidas por extracto muscular (Figura 17). Después de cuatro días en cultivo, el 56% de las neuronas motoras estaban vivas con el compuesto III - 3, comparado con el 42% con extracto muscular. A 300 nM, las neuronas tratadas con el compuesto III - 3 sobrevivieron in vitro durante al menos una semana (no mostrado).

El compuesto III - 3 promueve el crecimiento hacia fuera de neuritas desde los ganglios de la raíz dorsal intacta

Los resultados de los experimentos anteriores demuestran que el compuesto III - 3 no solamente promueve la supervivencia de de neuronas embriónicas de lso sistemas nerviosos periféricos y central, pero también da como resultado un crecimiento hacia el exterior de neuritas robusto. Muchas de estas extensiones parecen ser más gruesas que las generadas en presencia de factores de crecimiento (comparar la figura 17 A - D con la fig 17 E - H). Este efecto también se observó en el crecimiento hacia el exterior neurítico generado de ganglios de raíces dorsales embriónicos cultivados en presencia de 250 nm de compuesto III - 3 (figura 18 C). Las neuritas se desarrollaron en respuesta tanto a NGF (fig. 18B) como al compuesto III - 3; las generadas por NGF eran mucho más finas y más ramificadas que las desarrolladas en presencia del compuesto III - 3 que parecían gruesas y posiblemente fasciculadas.

Ejemplo 36 Tratamiento in vivo Muerte de neuronas motoras desarrolladamente regulada en el embrión de pollo

El ejemplo presente se describe en detalle en Glicksman, y col., J. Neurobiol., 1998, 35, 361 - 370, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad. En E6, se realizó una ventana en la cáscara de los huevos de pollo (Spafas, Preston, CT) y se aplicó bien vehículo (Solutol™ HS 15al 5%, polietilenglicol 660 hidroxiestearato; BASF Aktiengesellschaft, Ludwigshafen, Alemania (en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2)) o la dosis especificad del compuesto III - 3 en el vehículo directamente en el interior de la membrana corioalntoica vascularizada una vez al día de E6 a E9 como se describe en Oppenheim, y col., Science, 1991, 251, 1616 - 1617, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad). Se sacrificaron los embriones en E10 y se retiraron sus médulas espinales, se fijaron en solución de Carnoy (ácido acético glacial al 10%, etanol absoluto al 60%, cloroformo al 30%), se procesaron para obtener secciones en parafina en serie, y se tiñeron con tionina. Cada sección 20ª de los segmentos 1 - 8 se contaron según los criterios previamente descritos (Clarke, y col., Methods In Cell Biology: Cell Death 1995, Schwart y Osborne, Eds., Academia Press, Nueva York, pp. 277 - 321, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad.

Muerte de neuronas motoras desarrolladamente regulada en la rata neonatal

Ratas Sprague - Dawley preñadas sin un tiempo de embarazo determinado se obtuvieron de Laboratorios Harlan (Indianápolis, IN). Crías de rata hembras se inyectaron diariamente, por vía subcutánea (SC), sobre los músculos perineales diana, con el compuesto III - 3 en Solutol™ HS 15 al 5% o vehículo junto comenzando el día del nacimiento (P1) y continuando durante 5 días (P5). En P10 o P60, las crías se decapitaron, se recogió sangre en tubos capilares heparinizados, y la región de la médula espinal que contenía núcleo espinal sexualmente dimórficos del bulvo cavernoso (SNB) y el área perineal que contenía el bulbo cavernoso (BC) y músculos del levator ani (LA) se diseccionaron después de la perfusión de los animales con solución salina/formalina. La región de la médula espinal que contien el SNF se fijó posteriormente, se embebió en Paraplast, se seccionaron a 10 \mum, y se tiñeron con violeta Ceresylech (Noordeen, y col., Science, 1995, 229, 671 - 673, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad). Las neuronas motoras se contaron a x 500 en secciones en serie desde la región lumbar 5 a la sacra 1 de la médula espinal como se ha descrito previamente (Nordeen, y col., anteriormente). La enumeración microscópica se realizó en secciones codificadas por un observador ciego para los grupos de tratamiento. Los recuentos de neuronas motoras se corrigieron para el tamaño de células y espesor de la sección (Konisgsmark, Contemporary Research Methods in Neuroanatomy, Nauta y Ebbessson, Eds., 1970, Springer - Verlag, Nueva York, pp. 315 - 340, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad) y análisis estadístico era por análisis de varianza de una vía (ANOVA). la musculatura perineal se fijó posteriormente, se descalcificó, se embebió en Paraplast, se seccionó a 10 \mum y se tiñó con Tricromo de Milligan. Usando microscopía de campo brillante (x 250), músculos BC y LA en hembras normales y tratadas con el compuesto III - 3 (450 animales por grupo) se identificaron positivamente por tanto su localización como en presencia de fibras estriadas. La estructura del tejido muscular se trazó a partir de las secciones alternativas que usan un microscopio de proyección (62,5), y el área de sección transversal se midió usando una almohadilla de digilitación y un sistema morfométrico basado en ordenador (Sigmascan, Jandel Scientific). Se calculó el volumen muscular tomando el total de área de sección transversal y multiplicándolo por el espesor de la sección, y se corrigió para el porcentaje de la estructura muestreada.

La sangre recogida se centrifugó durante 5 minutos a temperatura ambiente; después, se retiró el plasma y se congeló a -20ºC. Los niveles de testosterona en suero (6 - 7 animales/grupo) se midieron mediante radioinmunoensayo siguiendo los procedimientos expuestos en Wingfield, y col., Steroids, 1975, 26, 311 - 327, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad.

Diferenciación de las neuronas motoras inducida por axotomía en la rata adulta

El nervio hipoglosal izquierdo se transfectó en el cuello de ratas adultas hembras Sprague - Dawley (120 - 180 g) bajo anestesia de Neumbutol, y 50 \mul del compuesto III - 3 o su vehículo (Solutol™ HS 15 al 5%) se aplicaron a una pieza de Gelfoam™ (AJ Buck, Owings Mills, MD), después se envolvieron alrededor del extremo proximal del nervio transfectado. Después de 7 días, lso animales se anestesiaron y se prefundieron con paraformaldehído al 4% en tampón Sorenson, fosfato 0,07 M, pH 7,2. El tronco cerebral se retiró y se cortaron secciones coronales en serie de 40 \mum en un criostato (Chiu, y col., NeuroReport, 1994, 5, 693 - 696, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad). Cada quinta sección se procesó para evaluar la inmunohistoquímica de ChAT como se ha descrito previamente (Chiu, y col., J. Com. Nerol., 1993, 328, 351 - 363, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad) usando una dilución 1:350 de un anticuerpo monoclonal anti - ChAT obtenido de Chemicon. Las células que se tiñeron claramente en los antecedentes anteriores se contaron en las secciones teñidas; el número de células enumeradas se expersó como la relación del número de células ChAT - inmunorreactivas en el lado axomotizado del núcleo hipoglosal frente al número de células inmunorreactivas en el lado control (no lesionado).

El compuesto III - 3 rescató neuronas motoras de embrión de rata de la muerte apoptópica in vitro e inhibió una ruta de señalización que da como resultado la activación de JNK1 en esta células (Maroney, y col., J. Neurosci., 1998, 18, 104 - 111, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad). Para determinar la actividad potencial in vivo, el compuesto III - 3 se ensayó en dos modelos de muerte de neuronas motoras programadas desarrolladamente regulada y en un modelo de diferenciación inducido por axotomía en neuronas motoras adultas. En pollo, aproximadamente el 50% de las neuronas motoras de la médula espinal padecen PCD durante E5 - 10 (Hamburger, y col., J. Neurosci., 1982, 1, 38 - 55; Purves, y col., Body and Brain: A Trphic Theory of Naural Connections, 1988, Harvard University Press, Cambridge, MA, los cuales se incorporan en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad). La aplicación del compuesto III - 3 a la membrana corialantoica durante este período evitaban la muerte de las neuronas motoras de una menra dependiente de la dosis (fig. 19). El cuarenta por ciento de las neuronas motoras que morirían normalmente se rescataron a las dosis más altas ensayadas (2,3 y 7 \mug/día), mientras que el 25% de las neuronas motoras se rescataron a dosis más bajas (1,2 y 1,8 \mug/día) (fig. 19).

Durante la vida perinatal temprana de las ratas hembras (el estado embriónico tardío hasta el día postnatal (PN) a), más del 50% de las neuronas motoras en el SNB se eliminan mediante PCD (Beedlove, J. Neurobiol., 1986, 17, 157 - 176, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad). En machos, las neuronas motoras en este núcleo inervan los músculos del pene estriados implicaban los reflejos copuladores I. La secreción testicular de esteroides androgénicos reduce la muerte de neuronas motoras de SNB en machos previene mucha de la atrofia de los músculos BD y LA inervados por las neuronas. La administración de testosterona a crías hembras dan como resultado un número completamente masculino de neuronas motoras de SNB (noorden, y col., anteriormente) y prevenía la atrofia muscular de BC y LA (Waiman, y col., Endocrinology, 1941, 29, 955 - 978) que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad). La administración SC diaria del compuesto III - 3 (PN 1 - 5) a ratas hembra atenuaba significativamente la muerte de neuronas motoras (Fig. 20 A). El rescate de muerte de las neuronas motoras de SNB por el compuesto III - 3 se produjo a dos dosis (0,5 y 1 mg/kg al día). A las dosis más máximas eficaces de 0,5 y 1 mg/kg al día, la administración del compuesto III - 3 dio como resultado un 70% de aumento de la supervivencia de las neuronas motoras que igualó el efecto de la testosterona (fig. 20 A). El compuesto III - 3 no alteró los niveles de testosterona en plasma de hembras tratadas. Las mediciones radio inmunes de testosterona en plasma en el grupo de 1 mg/kg al día dio como resultado ninguna diferencia significativa cuando se compara con el grupo control de vehículo (0,016 \pm 0,008 ng/ml) y 0,029 \pm 0,015 ng/ml de error estándar de la media (E. T. M.), respectivamente).

Para determinar si el tratamiento con el compuesto III - 3 era eficaz en el mantenimiento a largo plazo de la supervivencia de neuronas motoras, se trataron las hembras con el compuesto III - 3 (0,5 y 1 mg/kg al día) durante el mismo período de tiempo PN (1 - 5). La mitad de los animales en el grupo del vehículo y ambos grupos de tratamiento se sacrificaron el PN 10. Los animales restantes se mantuvieron después sin tratamiento adicional del compuesto III -
3 hasta sacrificio en PN60. Como se ha observado previamente (figura 20 B). Además, el 100% de estas neuronas motoras rescatadas eran identificables morfológicamente 55 días después del último tratamiento con el compuesto III - 3 (figura 20 B). La inhibición por el compuesto III - 3 de la muerte de las neuronas motoras durante el período neonatal permitió la supervivencia de las neuronas motoras en la edad adulta.

A pesar de la clara demostración y efectos asoladores de la pérdida de neuronas motoras en enfermedad de seres humanos adultos tales como neuronas motoras de adultos con esclerosis lateral amiotrófica en al mayoría de los modelos animales de lesión de neuronas motoras son resistentes a muerte. Sin embargo, la lesión axonal no da como resultado cambios morfológicos (Oppenheim, y col., anteriormente) como bioquímicos (Oppenheim, y col., anteriormente; Rende, y col., J. Com. Neurol., 1992, 319, 285 - 298, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad; (Chiu, y col., J. Com. Neurol., 1993, 328, 351 - 363, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad) en neuronas motoras adultas que pueden imitar cambio degenerativo que precede a la muerte en neuronas motoras enfermas y degenerativas. un ejemplo de este tipo de cambio se produce de la axotomía del nervio hipoglosal que inerva la lengua. La sección transversal de este nervio en la rata adulta dio como resultado la pérdida de 95% de las neuronas motoras hipoglosales ChAT - inmunorreactivas en el núcleo ipsilateral después de 7 días (Chiu, y col., NeuroReport, 1994, 5, 693 - 696, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad). La pérdida de inmunorreactividad ChAT no era permanente. Cuatro semanas después de axotomía, el 100% de las neuronas motoras había recuperado los niveles de control de la inmunorreactividad ChAT (Borke, y col., J. Neurocytol., 1993, 22, 141 - 153, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad). La inmunorreactividad ChAT en las neuronas motoras hipoglosales contralaterales no estaba afectada (Chiu y col., anteriormente) (figura 21 y tabla 5).

Cuando se aplicó en Gelfoam™ al extremo proximal del nervio hipoglosal, atenuó dependientemente de la dosis del compuesto III - 3 el descenso en al inmuunorreactividad ChAT en las neuronas motoras hipoglosales ipsilaterales valoradas 7 días después de la axotomía. La dosis máxima eficaz (50 \mug) dio como resultado 40% más de neuronas motoras ChAT - inmunorreactivas comnparado con las axotomizadas, control no tratado (figura 21 B y tabla 5). había una dependencia de la dosis en forma de campana con tanto las dosis bajas como las altas que dan como resultado una supervivencia mayor que el control no tratado, pero menos que la lograda a 50 \mug. Como era verdad con el modelo de SNB, no estaba asociada a la pérdida de peso, mortalidad, o enorme daño tisular en estos animales a cualquiera de las dosis ensayadas.

En tres modelos separados de degeneración de neuronas motoras in vivo, actividad neuroprotectora demostrada por el compuesto III - 3: PCD regulada desarrolladamente de neuronas motoras de la médula espinal lumbar en embriones (figura 19), muerte sensible a andrógenos de neuronas motoras de SNB (figura 20), y pérdida inducida por axotomía de un marcador funcional, ChAT, en neuronal motoras hipoglosales adultas (figura 21 y tabla 5). El compuesto III - 3 era eficaz cuando se administraba periféricamente mediante inyección SC, aplicado localmente al extremo de corte de un nervio, o superpuesto en una membrana corioalantoica de embrión de pollo. En contraposición a la molécula precursora K - 252a, el compuesto III - 3 era aproximadamente cinco veces más potente en la mediación de la supervivencia en los cultivos enriquecidos de neuronas motoras (datos no mostrados) y no mostraron actividad inhibidora frente a la tirosina quinasa taka y varias serina treonina quinasas (Maroney y col., anteriormente; Kaneko, y col., J. Med. Chem. 1997, 40, 1863 - 1869, que se incorpora en esta memoria descriptiva por referencia en su
totalidad).

TABLA 5 Efecto del compuesto III - 3 sobre la ainmunidad de colina acetiltransferasa en neuronas motoras hipoglosales axotomizadas

21

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}[t]{145mm} El compuesto III - 3 o vehículo se
añadieron en espuma de gel al extremo  proximal del nervio
hipoglosal inmediatamente después de su transfección.  Después de 7
días, se sacrificaron los animales se seccionaron en serie a través 
del núcleo hipoglosal, y cada quinta sección se inmunotiñó con
anticuerpos anti - ChAT. Los recuentos de las neuronas ChAT
positivas se realizaron en los lados  ipsilaterales (experimental) y
contralaterales (control) del núcleo.\end{minipage} \cr  * p
< 0,05, comparado estadísticamente con los animales tratados con 
vehículo
control\cr}

Un inhibidor de la ruta de MLK - 3 demuestra la eficacia in vivo y bloquea los casos de fosforilación hacia debajo de MLK - 3 en el modelo de MTPP

Se administró a una dosis (40 mg/kg) que produce pérdida de terminales dopaminérgicos estriados en cuerpos de las células en la sustancia negra. La tirosina hidroxilasa se usó como un marcador para terminales del nervio dopaminérgico en la sustancia negra. El compuesto III - 3 administrado sistemáticamente atenuaba la pérdida de las neuronas tirosina hidrolasa inmunorreactivas de la sustancia negra después de la lesión de MPTP (figura 22 a; Saporito y col., 1999). Ya que el compuesto III - 3 es un inhibidor conocido de MLK3, la activación del sustrato hacia abajo e MLK3 se midió en ratones tratados con MPTP. Los niveles de MKK4 fosforilada se midió usando anticuerpo anticuerpo específico fosfo - MKK4 (New England Biolabs, Beverly, MA) que reconoce la forma monofosfosforilada de MKK4 bien mediante inmunotransferencia (figura 22b) 9 ELISA (figura 22c c). La administración de MPTP elevó los niveles de MKKK4 en la sustancia negra hasta 5 veces más sobre los niveles control (figura 22 b). Las elevaciones máximas se produjeron 4 horas después de al administración de MPTP y coincidía con los niveles del SNC máximos de MPP^{+} La fosforilación de MKK4 mediada por MPTP se atenuó mediante tratamiento previo con l-deprenil, indicando que estos casos de fosforilación estaban mediados por MPP^{+} (fig. 22 c). Además, la fosforilación de MKK4 estaba parcialmente inhibida con el tratamiento previo del compuesto III - 3 a una dosis (1 mg/kg) que produce protección contra la pérdida dopaminérgica nigroestriada inducida por MPTP (figura 22 c). Estos datos demuestran que MPTP (MPP^{+}) activa MKK4, un sustrato hacia abajo de MLK3. Además, estos datos demuestran que un inhibidor conocido de MLK3, inhibe la activación de esta ruta de quinasa in vivo.

Ejemplo 37 Inflamación La inducción de IL-1 y TNF-\alpha por células THP y el efecto de indolocarbazoles y pirrolocarbazoles sobre su inducción

Se eligieron células del sistema inmune ya que muchas quinasas están implicadas en la regulación de numerosas funciones inmunológica, por ejemplo, la inducción de la síntesis de citocinas y la inducción de una respuesta biológica de citosina. Una reciente reseña (Hambleton, y col., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 1996, 93, 2774 - 2778, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad) mostraba que el tratamientote líneas celulares derivadas de monocitos con LPS producía una rápida activación de actividad de JNK. Cuando los monocitos se ponen en contacto con endotoxinas tales como lipopolisacáridos (LPS) producen que las citocinas inflamatorias, IL-1 y TNF-\alpha. La inhibición de la producción de estas dos citocinas puede ser un tratamiento útil de ciertos trastornos inflamatorios del sistema inmune. Estas citocinas se pueden medir fácilmente mediante kits ELISA comerciales. Los inventores diseñaron experimentos para determinar (1) si los indolo - y pirrolocarbazoles pueden inhibir la síntesis de IL-1 y TNF-\alpha en una línea celular de monocitos de los inventores THP-1, (2) si JNK esta activada por LPS en células THP-1, y (3) si la activación de JNK por LPS se puede inhibir por indolo - y pirrolocondensados.

Procedimientos experimentales

Se desarrollaron células THP-1 en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10%. LPS (E. coli serotipo 0111.B14, extraído con TCA) se compro en Sigma y se disolvió en PBS. Se compraron kits ELISA para ensayar IL-1 y TNF-\alpha se compraron en Boerhinger - Mannheim y se realizaron ensayos sobre medio de cultivo THP-1 como indica el fabricante. Se obtuvieron curvas patrones según las indicaciones con cada ensayo.

Se realizaron experimentos en placas de cultivo de 12 pocillos con bien 1 ó 2 ml de células THP-1 a 4 x 10^{4} células /ml. Se indujeron IL-1 y TNF-\alpha mediante la adición de LPS al medio de cultivo y se recogió el medio a diversos tiempos posteriormente para ensayo de citosina. Se retiraron células mediante centrifugación y se congelaron los sobrenadantes a -70ºC hasta ensayo. Para minimizar los costes de los experimentos se realizaron cultivos por duplicado y los sobrenadantes duplicados se reunieron después de la centrifugación. Cada sobrenadante reunido se ensayó por duplicado. Soluciones madre de indolo- y pirrolocarbazoles condensados en DMSO al 100% se diluyeron hasta las concentraciones deseadas en bien medio que contenía suero bovino fetal al 10% o medio que contenía 0,5 mg/ml de BSA. Salvo que se indique otra cosa, los compuestos se añadieron a las células THP-1 1 hora antes de la adición de LPS.

Se realizaron ensayos para evaluar la actividad de JNK después de inmunoprecipitar la proteína de JNK de un extracto de células THP-1 lisadas. Las células THP-1 lisadas sobre hielo durante 15 minutos en 500 \mul de tampón Frac (Tris - HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, pirofosfato de sodio 30 \muM, 1 mg/ml de BSA, Tritón - X - 100 al 1%). El extracto se centrifugó durante 10 minutos a 14 K y se añadieron 5 \mul de anticuerpo JNK (Santa Cruz) al sobrenadante. El extracto se centrifugó durante 60 minutos a 4ºC, se añadieron 75\mul de proteína A Sefarosa lavada (20% p/v en Frac) y el extracto se centrifugó otros 30 minutos para unir e complejo anticuerpo a la proteína A Sefarosa. La proteína A Sefarosa se lavó dos veces con tampón Frac, una vez con Hepes 20 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 20 mM, DTT 2 mM, después se incubó durante 15 minutos a 30ºC en 30 \mul de tampón quinasa (Hepes 20 mM, MgCl_{2} 20 mM, DTT 2 mM, 1 pH 7,6, g de c-jun recombinante, y ATP-\gamma-^{32}P, 2 pH 7,6, Ci. La reacción se terminó mediante la adición de 10 pH 7,6,l de tampón de carga gel SDS 4 X, se calentó durante 3 minutos a 80ºC, y las proteínas se analizaron sobre un gel de SADS al 10%. El gel se secó, se unió a un placa Phosphorimager, y las bandas radiactivas se analizaron sobre una Phosphorimager.

Los resultados de los experimentos iniciales indicaban que a 2 pH 7,6 g/ml proporcionaron el máximo rendimiento de IL-1 y esta concentración de LPS se usó en todos los experimentos posteriormente. El tiempo mínimo después de la adición de LPS para un rendimiento máximo de las citocinas se determinó tomando alícuotas de medio para ensayo a diversos tiempos después de la adición de LPS. El primer experimento indicó que tanto IL-1 como TNF-\alpha alcanzaban el máximo rendimiento en menos de 5 horas después de al adición de LPS. Ya que el tiempo de recolección más temprano era 2,4 horas en el primer experimento, un segundo experimento se realizó con recogidas de medio partiendo de 15 minutos después de la adición de LPS. El resultado de este experimento donde solamente TNF-\alpha se ensayó mostró que alcanzaba un máximo rendimiento a las 3 horas después de la adición de LPS. No se encontró TNF-\alpha significativo en el medio hasta 90 minutos después de la adición de LPS.

Las rápida consecución de rendimiento máximo indicó una regulación estrecha de al síntesis de las 2 citocinas y una rápida regulación hacia abajo. Los cultivos de las células se trataron durante 30 minutos antes de la adición de LPS con bien Actinomicina D, un inhibidor de la síntesis de ARN, o cicloheximida, un inhibidor de la síntesis de proteína. Se recogió medio 3 horas después de la adición de LPS y se ensayó TNF-\alpha. Tanto la síntesis de ARN como de nueva proteína se requieren para la inducción de TNF-\alpha. ya que se encontró TNF-\alpha en el medio de células tratadas con cualquier inhibidor. Los siguientes experimentos se realizaron para determinar si el compuesto III - 3 inhibiría la inducción de IL-1 y TNF-\alpha. El compuesto III - 3 inhibía la inducción de tanto IL-1 como TNF-\alpha con valores de CI_{50} de 267 nM y 139 nM respectivamente. Los resultados de estos experimentos se obtuvieron con células en medio que contenía suero bovino fetal al 10%. ya que los ensayos con tejido de médula espinal y tejido de cerebro delantero basal para evaluar la actividad neurotrófica de los compuestos se realizan en medio sin suero (500 \mug/ml) era de interés para determinar los valores de CI_{50} para la inhibición de la IL-1 y TNF-\alpha en medio sin suero. Cuando las células THP-1 se trataron con el compuesto III - 3 en medio sin suero (500 \mug/ml) los valores de CI_{50} se redujeron 10 veces más de 269 nM a 233 nM. Salvo que se establezca otra cosa todos los experimentos realizados de aquí en adelante se realizaron en medio sin suero. La inhibición del compuesto III - 3 de la inducción de IL-1 y TNF-\alpha en células THP-1 sugiere que el compuesto III - 3 podría ser útil como agente terapéutico en el tratamiento de afecciones patológicas producidas por la producción de cantidades normales anteriores de estas citocinas. El choque séptico es una de tales afecciones. El choque séptico se produce por el crecimiento de bacterias gram negativas en la circulación que a su vez libera grandes cantidades de la endotoxina LPS. Después la LPS estimula principalmente los monociitos y macrófagos para producir grandes cantidades de IL-1 y TNF-\alpha que después produce daño tisular masivo y en muchos casos la muerte.

Se ensayaron varios compuestos para evaluar su capacidad de inhibir el TNF-\alpha y se comparó con la capacidad de inhibir JNK. Los resultados se muestran en la tabla 6.

TABLA 6

23

24

Efecto del compuesto III - 3 sobre la inducción de IL - 2 en células Jurkat

Los experimentos se llevaron a cabo para determinar si el compuesto III - 3 inhibía la inducción de IL - 2 en células Jurkat.

Procedimientos experimentales

Se desarrollaron células Jurkat en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10%. El TNF-\alpha era de Promega y anticuerpos anti CD3 y anti CD28 eran de Pharmigen. Los experimentos de Jurkat se hicieron en 200 \mul en una placa de 96 pocillos. La IL - 2 se midió con un kit ELISA comprado de Boehringer Mannheim. Los anticuerpos para CD3 y CD28 se dejó que se unieran al plástico de la placa de 96 pocillos (18 horas en POBS) antes de la adición de las células Jurkat. Las células retrataron con compuestos 1 hora antes de añadir a la placa recubierta con anticuerpo. Los anticuerpos CD3 y CD28 se usaron para activar el receptor de las células T e inducir IL - 2. La IL - 2 se liberó de las células Jurkat entre 6 y 24 horas después del inicio de la inducción (figura 23 A). No se preparó ninguna IL -
2 (figura 23 A CNT). El efecto del compuesto III - 3 (1 hora de tratamiento con el compuesto III - 3 antes de la inducción) en la inducción de IL - 2 se ensayó a continuación. (figura 23 B). Una concentración del compuesto III - 3 de 500 nM inhibía la inducción de IL - 2 más de un 80% (figura 23 B). Se realizó un experimento de dosis respuesta más extenso con el compuesto III - 3 y con el compuesto I - 4 que produjo unos valores de CI_{50} de 139 nM para el compuesto III - 3 y 207 nM para el compuesto I - 4 (figura 23 C).

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<110> Maroney, Anna

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Walton, Kevin

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Knight, Ernest

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Glicksman, Marcie

\hskip1cm

Dionea, Craig

\hskip1cm

Neff, Nicola

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<120> Procedimientos para modular proteínas de quinasa de linaje múltiple y compuestos de selección que modulan proteínas de quinasa de linaje múltiple

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<130> CEPH0431

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<140>

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<141>

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<160> 18

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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<400> 1

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\sa{Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Ala Cys Met Gly Ile Gly Ala Tyr Tyr}

\sac{Thr}

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<210> 2

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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<400> 2

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\sa{Gly Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys Ala Trp Ala Gly Gly Ala Cys Cys}

\sac{Ala Ser Ala Cys Arg Thr Cys}

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<210> 3

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<211> 33

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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\sa{Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Arg Thr Ile Cys Ala Tyr Met Gly Ile}

\sac{Gly Ala Tyr Tyr Thr Ile Gly Cys Ile Gly Cys Ile Met Gly Ile Ala}

\sac{Ala}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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<400> 4

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\sa{Gly Gly Ala Ala Thr Thr Ile Ala Tyr Ile Gly Gly Ala Trp Ala Ile}

\sac{Gly Trp Cys Cys Ala Ile Ala Cys Arg Thr Cys Ile Ser Trp}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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<400> 5

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\sa{Met Glu Glu Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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<400> 6

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtggctgtgc gggcagctcg ccag

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

gagaccctgg atctcgcgct t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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<400> 8

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\sa{Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

cggatccgtg acaccagtcg gaacctt

\hfill

27

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggaattcacc agtaagctcc agcacatc

\hfill

28

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<210> 11

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

ataattcgtg ctagcgccag agtctagccg gtg

\hfill

33

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 39

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

attaagcttcc tcagtgcaag tggatcgcgc agcccctga

\hfill

39

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<210> 13

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<211> 8

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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<400> 13

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\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}

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<210> 14

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<211> 69

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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<400> 14

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\hskip-.1em\dddseqskip

ataaagcttc cagaggccat ggactacaag gacgacgatg acaaggcctg cctccatgaa

\hfill

60

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\hskip-.1em\dddseqskip

acccgaaca

\hfill

69

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<210> 15

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

gacagggcgg ccggctct

\hfill

18

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<210> 16

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<211> 583

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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<400> 16

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25

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<210> 17

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<211> 194

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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<400> 17

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26

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<210> 18

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

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<400> 18

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\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}

Claims

1. Un procedimiento para identificar un compuesto que modula la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple y promueve la supervivencia celular o muerte celular, que comprende las etapas de:

(a): poner en contacto in vitro dicha célula que contiene dicha proteína de quinasa de linaje múltiple con dicho compuesto;

(b): determinar si dicho compuesto incrementa o disminuye la actividad de dicha proteína de quinasa de linaje múltiple ; y

(c): determinar si dicho compuesto promueve la supervivencia celular o muerte celular.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 para identificar un compuesto que promueve la supervivencia celular que comprende la etapa de determinar si dicho compuesto disminuye la actividad de dicha proteína de quinasa de linaje múltiple.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 para identificar un compuesto que promueve la muerte celular que comprende la etapa de determinar si dicho compuesto incrementa la actividad de dicha proteína de quinasa de linaje múltiple.

4. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho compuesto puede ser útil en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo o inflamación.

5. El procedimiento de la reivindicación 2 o reivindicación 4 en el que dicha proteína se selecciona entre el grupo constituido por quinasa 1 de linaje múltiple, quinasa 2 de linaje múltiple, quinasa 3 de linaje múltiple, quinasa que leva cremallera de leucina, quinasa que lleva cremallera de leucina dual, y quinasa 6 de linaje múltiple.

6. El procedimiento de la reivindicación 3 en el que dicha proteína se selecciona entre el grupo constituido por quinasa 1 de linaje múltiple, quinasa 2 de linaje múltiple, quinasa 3 de linaje múltiple, quinasa que leva cremallera de leucina, quinasa que lleva cremallera de leucina dual, y quinasa 6 de linaje múltiple.

7. El procedimiento de la reivindicación 5 o reivindicación 6 en el que dicha actividad de proteína se determina por un ensayo de quinasa in vitro o ensayo de unión.

8. El procedimiento de la reivindicación 5 o reivindicación 6 en el que dicha célula es una célula neuronal.

9. El procedimiento de la reivindicación 5 en el que dicha actividad de proteína se determina midiendo la actividad o estado de fosforilación de un sustrato de dicha proteína.

10. El procedimiento de la reivindicación 6 en el que dicha actividad de proteína se determina midiendo la actividad o estado de fosforilación de un sustrato de dicha proteína.

11. El procedimiento de las reivindicaciones 9 ó 10 en el que dicho sustrato se selecciona entre el grupo constituido por JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, p38\alpha, p38\beta, p38\gamma, p38\delta, MEK1, MEK2, MKK3, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1, y el homólogo de mamífero de AEX-3.

12. El procedimiento de la reivindicación 5 en el que dicha actividad de proteína se determina midiendo la actividad de un sustrato de dicha proteína, cantidad de un sustrato de dicha proteína, o ARNm que codifica dicho sustrato de dicha proteína.

13. El procedimiento de la reivindicación 6 en el que dicha actividad de proteína se determina midiendo la actividad de un sustrato de dicha proteína, cantidad de dicha proteína, o ARNm que codifica dicha proteína.

14. El procedimiento de la reivindicación 5 o reivindicación 6 en el que dicha promoción de supervivencia celular se determina usando células en riesgo de morir y comparando la cantidad de células vivas que estaban en contacto con dicho compuesto con la cantidad de células vivas que no estaban en contacto con dicho compuesto.

15. El procedimiento de la reivindicación 5 o reivindicación 14 en el que dichas células son células de neuronas motoras embriónicas primarias.

16. El procedimiento de la reivindicación 5 o reivindicación 14 en el que dichas células sobreexpresan dicha proteína de quinasa de linaje múltiple.

17. El procedimiento de la reivindicación 5 en el que dicha promoción de supervivencia celular se determina observando una disminución de apoptosis.

18. El procedimiento de la reivindicación 6 en el que dicha promoción de supervivencia celular se determina observando un incremento de apoptosis.

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6 en el que dicha célula está implicada en una enfermedad neurodegenerativa.

20. El procedimiento de la reivindicación 2 en el que dicha célula está implicada en inflamación.

21. El uso de un compuesto que tiene la fórmula:

27

que inhibe una proteína de quinasa de linaje múltiple en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo o inflamación,

en al que el anillo B y el anillo F, independientemente, del otro junto con el los átomos de carbono a los que están unidos, forman o bien

un anillo aromático carbocíclico de 6 miembros no saturado en el que entre uno y tres de (de los) átomo(s) de carbono se reemplaza por átomo(s) de nitrógeno; o

un anillo aromático carbocíclico de 5 miembros no saturado en el que bien un átomo de carbono se reemplaza con un átomo de oxígeno, nitrógeno, o azufre.

o

dos átomos de carbono se reemplazan con un átomo de azufre y uno de nitrógeno, o un átomo de oxígeno y un átomo de nitrógeno.

A^{1} y A^{2} juntos representan O, y B^{1} y B^{2} juntos representan O;

R^{1} es H, alquilo de 1 - 4 átomos de carbono (Inclusive), arilo, arilalquilo, heteroarilo, y heteroarilalquilo; COR^{9}, en el que R^{9} es alquilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive), o arilo, preferiblemente fenilo o o naftilo; -OR^{10}, donde R^{10} es H o alquilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); -CONH_{2}, -NR^{7}R^{8}, -(CH_{2})_{n}NR^{7}R^{8},en los que n es un número entero de 1 - 4 (inclusive) o -(CH_{2})_{n}NR^{7}R^{8}, y bien

R^{7} y R^{8} o independientemente son H o alquilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); o

R^{7} y R^{8} se combinan juntos para formar un grupo de unión de la fórmula general -(CH_{2})_{2}-X^{1}-(CH_{2})_{2}-, el que X^{1} es O, S, y CH_{2};

R^{2} es H, -SO_{2}R^{9}; -CO_{2}R^{9}, -COR^{9}, alquilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusivo), preferiblemente un alquilo de 1 -
4 átomos de carbono (inclusive), alquenilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), preferiblemente un alquenilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive), o alquinilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), preferiblemente un alquinilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); o un monosacárido de 5 - 7 átomos de carbono (inclusive) donde cada grupo hidroxilo del monosacárido independientemente está o bien no sustituido o se reemplaza por H, alquilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive), alquilcarboniloxi de 2 - 5 átomos de carbono (inclusive) o alcoxi de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); y o bien

cada alquilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), alquenilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), o alquinilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive) está no sustituido; o

cada alquilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), alquenilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), o alquinilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive) independientemente está sustituido con 1 - 3 arilo de 6 - 10 átomos de carbono (inclusive), preferiblemente fenilo o naftilo; heteroarilo, F, Cl, Br, I, -CN, NO_{2}, -OR^{9}, -O(CH_{2})_{p}NR^{7}R^{8}, -OCOR^{9},
-OCONHR^{9}, O-tetrahidropiranilo, NH_{2}, -NR^{7}R^{8}, -NR^{10}COR^{9}, -NR^{10}CO_{2}R^{9}, -NR^{10}CONR^{7}R^{8}, -NHC(=NH)NH_{2},
-NR^{10}SO_{2}R^{9}, -S(O)_{y}R^{11}, en el que R^{11} es H o alquilo de 1 - 4 átomos de carbono, arilo de 6 - 10 átomos de carbono, preferiblemente fenilo o naftilo, o heteroarilo e y es 1 ó 2; -SR^{11}, -CO_{2}R^{9}, -CONR^{7}R^{8}, -CHO, COR^{9}, -CH_{2}OR^{7}, -CH= NHR^{11}R^{12}, -CH=NOR^{11}, -CH=NR^{9}, -CH=NNHCHCH(N=NH)NH_{2}, -SO_{2}NR^{12}R^{13}, -PO(OR^{11})_{2}, u OR^{14} en el que R^{14} es el residuo de un aminoácido después de que el grupo hidroxilo del grupo carboxilo es retirado;

y bien

R^{12} y R^{13} independientemente son H, alquilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive), arilo de 6 - 10 átomos de carbono, preferiblemente fenilo o naftilo, o heteroarilo; o

R^{12} y R^{13} se combinan juntos para formar un grupo de unión, preferiblemente -(CH_{2})_{2}-X^{1}-(CH_{2})_{2},

cada R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} es independientemente H, arilo, preferiblemente un arilo de 6 - 10 átomos de carbono (inclusive), más preferiblemente fenilo o naftilo; heteroarilo; F, Cl, Br, I, -CN, CF_{3}, -NO_{2}, -OH, -OR^{9}, -O(CH_{2})_{n}NR^{7}R^{8},
-OCOR^{9}, -OCONHR^{9}, NH_{2}, -CH_{2}OH, -CH_{2}OR^{14}, -NR^{7}R^{8}, -NR^{10}COR^{9}, -NR^{10}CONR^{7}R^{8}, -SR^{11}, -S(O)_{y}R^{11} en el que y es 1 ó 2; -CO_{2}R^{9}, -COR^{9}, -CONR^{7}R^{8}, -CHO, -CH=NOR^{11}, -CH=NR^{9}, -CH=NNR^{11}R^{12}, -(CH_{2})_{n}SR^{9}, en el que n es un número entero de 1 - 4 (inclusive), -(CH_{2})_{n}S(O)_{y}R^{9}, -CH_{2}SR^{15} en el que R^{15} es alquilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); -CH_{2}S(S(O)_{y}R^{14}, -(CH^{2})_{n}NR^{7}R^{8}, -(CH_{2})_{n}NHR^{14}, alquilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), preferiblemente alquilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); alquenilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), preferiblemente alquenilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); alquinilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), preferiblemente alquinilo de 1 - 4 átomos de carbono (inclusive); y o bien cada alquilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), alquenilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive) o alquinilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive) esta no sustituido; o

cada alquilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive), alquenilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive) o alquinilo de 1 - 8 átomos de carbono (inclusive) está sustituido como se describe en (d) (2) de la reivindicación 58;

X es o bien alquileno no sustituido de 1 - 3 átomos de carbono (inclusive); o

X es alquileno de 1 - 3 átomos de carbono (inclusive) sustituido con un grupo R^{2}, preferiblemente OR^{10}, -R^{10}, R^{15}, en el que R^{15} es un alquilo de 1 - 4 (inclusive); fenilo, naftilo, arilalquilo de 7 - 14 átomos de carbono (inclusive), preferiblemente bencilo; o

X es -CH=CH-, -CH(OH)-CH(OH)-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)_{2}, -CR^{10})_{2}-, -C(=O)-, -C(=NOR^{11})-, -C(OR^{11})(R^{11})-, -C(=O)CHR^{15})-, -CHR^{15})C(=O)-, -C(=NOR^{11})CHR^{15})-, -CHR^{15})C(=NOR^{11})-, -CH_{2}Z-, -Z-CH_{2}-, -CH_{2}ZCH_{2}-,

en los que Z es, C(OR^{11})(R^{11}), O, S, C(=O), C(=NOR^{11}), o NR^{11};

A^{1} y A^{2} juntos son cada uno independientemente H, H; H, -OR^{11}; H, -NR^{11}R^{12}; o juntos representan =S o =NR^{11}; B^{1} y B^{2} juntos representan O; cada uno de R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, y X son como se definen en (c), (d), (e), y (f) de la reivindicación 58;

o

A^{1} y A^{2} juntos representan O, y B^{1} y B^{2} juntos son cada uno de ellos independientemente H, H; -OR^{11}; H, -SR^{11}, H, -NR^{11}R^{12}, o juntos representan =S o =NR^{11}; y cada uno de R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, y X son como se definen en (c), (d), (e), y (f) de la reivindicación 58.

22. El uso de la reivindicación 21 en el que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3} y R_{4} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH; R_{5} y R_{6} son OCH_{3}; y X es CH_{2}.

23. El uso de la reivindicación 21 en el que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5} y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es CH_{2}CH_{2}OAc; R_{4} es Br; y X es CH_{2}.

24. El uso de la reivindicación 21 en el que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5} y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es CH_{2}CH_{2}OAc; R_{4} es CH_{2}CH_{2}(2-Pir); y X es CH_{2}.

25. El uso de la reivindicación 21 en el que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5} y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es H; R_{4} es R_{2} es CH_{2}CH_{2}(2-Pirimidinilo); y X es CH_{2}.

26. El uso de la reivindicación 21 en el que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5} y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es H; R_{4} es CH_{2}CH_{2}(2-Pir); y X es CH_{2}.

\newpage

27. El uso de la reivindicación 21 en el que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{5} y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es H; R_{4} es CH_{2}CH_{2}(2-Piridazinilo); y X es CH_{2}.

28. El uso de la reivindicación 21 en el que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es CH_{2}CH_{2}OH; y X es CH_{2}.

29. El uso de la reivindicación 21 en el que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH; y X es CH_{2}.

30. El uso de la reivindicación 21 en el que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; y X es S.

31. El uso de la reivindicación 21 en el que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es CH_{2}CH_{2}CH_{2}NHCO(4-(OH)Ph); y X es CH_{2}.

32. El uso de la reivindicación 21 en el que A_{1}, A_{2}, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} son H; B_{1} y B_{2} juntos representan O; R_{2} es CH_{2}CH_{2}OH; y X es CH_{2}.

33. El uso de un compuesto que tiene la fórmula:

\vskip1.000000\baselineskip

28

que inhibe una proteína de quinasa de linaje múltiple en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo o inflamación.

en la que:

(a) un anillo aromático carbocíclico de 6 miembros en el que entre 1 y 3 átomos de carbono se pueden reemplazar por átomos de nitrógeno;

(b) un anillo aromático carbocíclico de 5 miembros no saturado; y

(c) un anillo aromático carbocíclico de 5 miembros no saturado en el que o bien

(1): un átomo de carbono se reemplaza con un átomo de oxígeno, nitrógeno, o azufre;

(2): dos átomos de carbono se reemplazan con un átomo de azufre y uno de nitrógeno, un átomo de oxígeno y un átomo de nitrógeno, o dos átomos de nitrógeno; o

(3): tres átomos de carbono se reemplazan con tres átomos de nitrógeno;

R^{1} se selecciona entre el grupo constituido por:

(a) H, alquilo sustituido o no sustituido que tiene entre 1 y 4 átomos de carbonos, arilo sustituido o no sustituido, arilalquilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, o heteroarilalquilo sustituido o no sustituido;

(b) -C(=O)R^{9}, en el que R^{9} se selecciona entre el grupo constituido por alquilo, arilo y heteroarilo;

(c) -OR^{10}, donde R^{10} se selecciona entre el grupo constituido por H y alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono;

(d) -C(=O)NH_{2}, -NR^{11}R^{12}, -(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, -(CH_{2})_{p}OR^{10}, -O(CH_{2})_{p}OR^{10} y -O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, en los que p está entre 1 y 4; y en los que o bien

(1): R^{11} y R^{12} se seleccionan cada uno de ellos independientemente entre el grupo constituido por H y alquilo que tienen entre 1 y 4 átomos de carbono; o

(2): R^{11} y R^{12} juntos forman un grupo de unión de fórmula -(CH_{2})_{2}-X^{1}- (CH_{2})_{2}-, en el que X^{1} se selecciona entre el grupo constituido por -O-, -S-, y -CH_{2}-;

R^{2} se selecciona entre el grupo constituido H, alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, -OH, alcoxi que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, -OC(=O)R^{9}, -OC(=O)NR^{11}R^{12}, -O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, -O(CH_{2})_{p}OR^{10}, arilalquilo sustituido o no sustituido que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono, y heteroarilalquilo sustituido o no sustituido;

(a) H, arilo, heteroarilo, F, Cl, Br, I, -CN, CF_{3}, -NO_{2}, -OH, -OR^{9}, -O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, -OC(=O)R^{9}, -OC(=O)NR^{2}R^{7}, -OC(=O)NR^{11}R^{12}, -O(CH_{2})_{p}OR^{10}, -CH_{2}OR^{10}, -NR^{11}R^{12}, -NR^{10}S(=O)_{2}R^{9}, -NR^{10}C(=O)R^{9};

(b) -CH_{2}OR^{14}, en el que R^{14} es el residuo de un aminoácido después de que se retire el grupo hidroxilo del grupo carboxilo;

(c) -NR^{10}C(=O)NR^{11}R^{12}, -CO_{2}R^{2}, -C(=O)R^{2}, -C(=O)NR^{11}R^{12}, -CH=NOR^{2}, -CH=NR^{9}, -(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, -(CH_{2})_{p}
NHR^{14}, o -CH=NNR^{2}R^{2A} en los que R^{2A} es el mismo que R^{2};

(d) -S(O)_{y}R^{2}-(CH_{2})_{p}S(O)_{y}R^{9}, -CH_{2}S(O)_{y}R^{14} en el que y es 0, 1 ó 2;

(e) alquilo que tiene entre 1 y 8 átomos de carbono, alquenilo que tiene entre 2 y 8 átomos de carbono, y alquinilo que tiene entre 2 y 8 átomos de carbono, en los que

(1): cada grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo está no sustituido; o

(2): cada grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo está sustituido con 1 a 3 grupos seleccionados entre el grupo constituido por arilo que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono, heteroarilo, arilalcoxi, heterocicloalcoxi, hidroxialcoxi, alquiloxi-alcoxi, hidroxialquiltio, alcoxi-alquiltio, F, Cl, Br, I, -CN, -NO_{2}, -OH, -OR^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p} NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}C(=O)NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}OC(=O)NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}CO_{2}R^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p}S(O)_{y}R^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p}NR^{10}C(=O)NR^{11}R^{12}, -OC(=O)R^{9}, -OCONHR^{2}, -O-tetrahidropiranilo, -NR^{11}R^{12}, -NR^{10}C(=O)R^{9}, -N R^{10}CO_{2}R^{9}, -NR^{10}C(O)NR^{11}R^{12}, -NHC(=NH)NH_{2}, NR^{10}S(O_{2})R^{9}, -S(O)_{y}R^{9}, -CO_{2}R^{2}, -C(=O)NR^{11}R^{12}, -C (=O)R^{2}, -CH_{2}OR^{10}, -CH=NNR^{2}R^{2A}, -CH=NOR^{2}, -CH=NR^{9}, -CH=NNHCH(N=NH)NH_{2}, -S(=O)_{2}NR^{2}R^{2A}, -P(=O)(OR^{10})_{2}, -OR^{14}, y un monosacárido que tiene entre 5 y 7 átomos de carbono en el que cada grupo hidroxilo del monosacárido está independientemente o bien no sustituido o está reempalzado con H, alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, alquilcarboniloxi que tiene entre 2 y 5 átomos de carbono, o alcoxi que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono;

X^{2} es O, S, o NR^{10};

m y n son cada uno de ellos independientemente 0, 1, ó 2;

Z se selecciona entre el grupo constituido por un enlace, -O-, -CH=CH-, -S-, -C(=O)-, -CH(OR^{10})-, -N(R^{10})-,
-N(OR^{10})-, CH(NR^{11}R^{12})-, -C(=O)N(R^{17})-, -N(R^{17})C)=O)-, -N(S(O)_{y}R^{9})-, -N(SO)_{y}NR^{11}R^{12})-, -N(C(=O)R^{17})-, -C(R^{15}
R^{16})-, -N^{+}(O^{-})R^{10})-, -CH(OH)-CH(OH)-, y -CH(O(C=O)R^{9})CH(OC(=O)R^{9A})-, en los que R^{9A} es el mismo que R^{9},

R^{15} y R^{16} están independientemente seleccionados entre entre el grupo constituido por H, -OH, -C(=O)R^{10}, -O(C=O)R^{9}, hidroxialquilo, y -CO_{2}R^{10},

34. El uso de un compuesto que tiene la fórmula:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

en la que

Z_{1} es H y Z_{2} es H o Z_{1} y Z_{2} juntos forman =O;

R_{1} es H o Br;

R_{2} es H;

R_{3} es H, CH_{2}CH=CH_{2}, CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH, o

30

y

R_{4} es H, CH_{2}CH=CH_{2} o CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH.

35. El uso de la reivindicación 34 en el que R_{1}, R_{2}, R_{4}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} es CH_{2}CH=CH_{2}.

36. El uso de la reivindicación 34 en el que R_{1} es Br y R_{2}, R_{3}, R_{4}, Z_{1}, y Z_{2} son H.

37. El uso de la reivindicación 34 en el que R_{1}, R_{2}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} y R_{4} son CH_{2}CH=CH_{2}.

38. El uso de la reivindicación 34 en el que R_{1}, R_{2}, R_{3}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{4} es CH_{2}CH=CH_{2}.

39. El uso de la reivindicación 34 en el que R_{1}, R_{2}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} y R_{4} CH_{2}CH=CH_{2}; o R_{1}, R_{2}, R_{4}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} es

31

40. El uso de un compuesto que tiene la fórmula:

32

en la que

Z_{1} es H y Z_{2} es H o Z_{1} y Z_{2} juntos forman =O;

R_{1} se selecciona entre el grupo constituido por H, Cl, CH_{2}SO_{2}C_{2}H_{5}, Br, CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH_{2}, CH_{2}S(CH_{2})_{2}N(CH_{3})_{2}, CH_{2}S(CH_{2})_{2}NH_{2}, n-C_{4}H_{9}, NHCONHC_{6}H_{5}, NHCONHC_{2}H_{5}, CH_{2}SC_{2}H_{5}, CH_{2}SC_{6}H_{5}, N(CH_{3})_{2}, CH_{3}, CH_{2}OCONHC_{2}
H_{5}, NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}OC_{2}H_{5}, CH_{2}N(CH_{3})_{2}, OH, O-n-propilo; CH=NNH-C(=NH)NH_{2}, CH=N-N(CH_{3})_{2}, CH_{2}S(CH_{2})_{2}
NH-n-C_{4}H_{9}, CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}, CH_{2}S[3-(1,2,4-triazina)], CH_{2}CH_{2}SCH_{3};

y

33

34

35

36

X se selecciona entre el grupo constituido por H, CH_{2}OH, CH_{2}NH-SerinaH, CO_{2}CH_{3}, CONC_{6}H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}
C_{6}H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}N_{3}, CONHC_{2}H_{5}, CH_{2}NH-glicina, CON(CH_{3})_{2}, -CH_{2}NHCO_{2}-, CONH_{2}, CONHCH_{3}H_{7}, CH_{2}NH-serina, CH_{2}SOCH_{3}, CH=NOH, CH_{2}NH-prolina, CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), CH=NNH-C(=NH)NH_{2}, CONH(CH_{2})_{2}
OH, CH=NNHCONH_{2}, CH_{2}OCOCH_{3}, -CH_{2}OC(CH_{3})_{2}O-, CH_{2}SC_{6}H_{5}, CH_{2}SOC_{6}H_{5}, CO_{2}n-hexilo, -CONHCH_{3}, y CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3};

37

y

R se selecciona entre el grupo constituido por OH, y OCH_{3}.

41. El uso de la reivindicación 40 en el que Z_{1} y Z_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} es NHCONHC_{2}H_{5}; R_{2} es CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), y R es OH.

42. El uso de la reivindicación 40 en el que Z_{1} y Z_{2} son H, X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} y R_{2} son CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}CH_{3}, y R es OH.

43. El uso de la reivindicación 40 en el que Z_{1} y Z_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} y R_{2} son CH_{2}CH_{2}SCH_{3}; y R es OH.

44. El uso de la reivindicación 40 en el que Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}, y R es OH.

45. El uso de la reivindicación 40 en el que Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3}; y R es OH.

46. El uso de la reivindicación 40 en el que Z_{1}, Z_{2}, y R_{1} son H; R_{2} es CH_{2}OH; X es CO_{2}CH_{3}; y R es OH.

47. El uso de la reivindicación 40 en el que Z_{1} y Z_{2}, son H; y R_{1} y R_{2} son H_{2}S( 3-(1,2,4-triazina)); X es CO_{2}CH_{3}; y R es OH.

48. El uso de la reivindicación 40 en el que Z_{1} y Z_{2}, son H; R_{1} es Br; R_{2} es I; X es CO_{2}CH_{3}, y R es OH.

49. El uso de la reivindicación 40 en el que Z_{1} y Z_{2} son H; R_{1} y R_{2} son CH_{2}CH_{2}SCH_{3}; X es CO_{2}CH_{3}, y R es OH.

50. El uso de la reivindicación 40 en el que Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; y R es OCH_{3}.

51. El uso de la reivindicación 40 en el que Z_{1} y Z_{2} juntos forman =O; R_{1} y R_{2} son Br; X es CO_{2}CH_{3}; y R es OH.

52. Un procedimiento de modulación de la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple que comprende poner en contacto dicha proteína o célula que contiene dicha proteína con un compuesto que tiene la fórmula

38

en la que

Z_{1} es H y Z_{2} es H o Z_{1} y Z_{2} juntos forman =O;

R_{1} es H o Br;

R_{2} es H;

R_{3} es H, CH_{2}CH=CH_{2}, CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH, o

39

y

R_{4} es H, CH_{2}CH=CH_{2} o CH_{2}CH_{2}CH_{2}OH.

53. El procedimiento de la reivindicación 52 en el que R_{1}, R_{2}, R_{4}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} es CH_{2}CH=CH_{2}.

54. El procedimiento de la reivindicación 52 en el que R_{1} es Br y R_{2}, R_{3}, R_{4}, Z_{1}, y Z_{2} son H.

55. El procedimiento de la reivindicación 52 en el que R_{1}, R_{2}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} y R_{4} son CH_{2}CH=CH_{2}.

56. El procedimiento de la reivindicación 52 en el que R_{1}, R_{2}, R_{3}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{4} es CH_{2}CH=CH_{2}.

57. El procedimiento de la reivindicación 52 en el que R_{1}, R_{2}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} y R_{4} son CH_{2}CH=CH_{2}; o R_{1}, R_{2}, R_{4}, Z_{1}, y Z_{2} son H y R_{3} es

40

58. Un procedimiento de modulación de la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple que comprende poner en contacto dicha proteína o célula que contiene dicha proteína con un compuesto que tiene la fórmula

41

\vskip1.000000\baselineskip

en la que:

(b) un anillo aromático carbocíclico de 5 miembros no saturado; y

(2): dos átomos de carbono se reemplazan con un átomo de azufre y un átomo de nitrógeno, un átomo de oxígeno y un átomo de nitrógeno, o dos átomos de nitrógeno; o

(3): tres átomos de carbono se reemplazan con tres átomos de nitrógeno;

R^{1} se selecciona entre el grupo constituido por:

(c) -OR^{10}, en el que R^{10} se selecciona entre el grupo constituido por H y alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono;

(d) -C(=O)NH_{2}, -NR^{11}R^{12}, -(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, -(CH_{2})_{p}OR^{10}, -O(CH_{2})_{p}OR^{10} y -O(CH_{2})_{p}NR^{11}R^{12}, en los que p es entre 1 y 4 átomos de carbono; y en los que bien

(e) alquilo que tiene entre 1 y 8 átomos de carbono, alquenilo que tiene entre 2 y 8 átomos de carbono, y alquinilo que tiene entre 2 y 8 átomos de carbono,en los que

(1): cada grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo está no sustituido; o

(2): cada grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo está sustituido con 1 a 3 grupos seleccionados entre el grupo constituido por arilo que tiene entre 6 y 10 átomos de carbono, heteroarilo, arilalcoxi, heterocicloalcoxi, hidroxialcoxi, alquiloxi-alcoxi, hidroxialquiltio, alcoxi-alquiltio, F, Cl, Br, I, -CN, -NO_{2}, -OH, -OR^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p} NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}C(=O)NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}OC(=O)NR^{11}R^{12}, -X^{2}(CH_{2})_{p}CO_{2}R^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p}S(O)_{y}R^{9}, -X^{2}(CH_{2})_{p}NR^{10}C(=O)NR^{11}R^{12}, -OC(=O)R^{9}, -OCONHR^{2}, -O-tetrahidropiranilo, -NR^{11}R^{12}, -NR^{10}C(=O)R^{9}, -N R^{10}CO_{2}R^{9}, -NR^{10}C(O)NR^{11}R^{12}, -NHC(=NH)NH_{2}, NR^{10}S(O_{2})R^{9}, -S(O)_{y}R^{9}, -CO_{2}R^{2}, -C(=O)NR^{11}R^{12}, -C (=O)R^{2}, -CH_{2}OR^{10}, -CH=NNR^{2}R^{2A}, -CH=NOR^{2}, -CH=NR^{9}, -CH=NNHCH(N=NH)NH_{2}, -S(=O)_{2}NR^{2}R^{2A}, -P(=O)(OR^{10})_{2}, -OR^{14}, y un monosacárido que tiene entre 5 y 7 átomos de carbono en el que cada grupo hidroxilo del monosacárido está bien independientemente no sustituido o está reempalzado con H, alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, alquilcarboniloxi que tiene entre 2 y 5 átomos de carbono, o alcoxi que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono;

X^{2} es O, S, o NR^{10};

m y n son cada uno de ellos independientemente 0, 1, ó 2;

59. Un procedimiento de modulación de la actividad de una proteína de quinasa de linaje múltiple que comprende poner en contacto dicha proteína o célula que contiene dicha proteína con un compuesto que tiene la fórmula

42

en la que

Z_{1} es H y Z_{2} es H o Z_{1} y Z_{2} juntos forman =O;

y

43

44

45

46

X se seleccioan entre el grupo constituido por H, CH_{2}OH, CH_{2}NH-SerinaH, CO_{2}CH_{3}, CONC_{6}H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}
C_{6}H_{5}, CH_{2}NHCO_{2}CH_{3}, CH_{2}N_{3}, CONHC_{2}H_{5}, CH_{2}NH-glicina, CON(CH_{3})_{2}, -CH_{2}NHCO_{2}-, CONH_{2}, CONHCH_{3}H_{7}, CH_{2}NH-serina, CH_{2}SOCH_{3}, CH=NOH, CH_{2}NH-prolina, CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), CH=NNH-C(=NH)NH_{2}, CONH(CH_{2})_{2}
OH, CH=NNHCONH_{2}, CH_{2}OCOCH_{3}, -CH_{2}OC(CH_{3})_{2}O-, CH_{2}SC_{6}H_{5}, CH_{2}SOC_{6}H_{5}, CO_{2}n-hexilo, -CONHCH_{3}, y CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3};

47

y

R se selecciona entre el grupo constituido por OH, y OCH_{3}.

60. El procedimiento de la reivindicación 59 en el que Z_{1} y Z_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} es NHCONHC_{2}H_{5}; R_{2} es CH_{2}CH_{2}(2-piridilo), y R es OH.

61. El procedimiento de la reivindicación 59 en el que Z_{1} y Z_{2} son H, X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} y R_{2} son CH_{2}OCH_{2}OCH_{2}
CH_{3}, y R es OH.

62. El procedimiento de la reivindicación 59 en el que Z_{1} y Z_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; R_{1} y R_{2} son CH_{2}CH_{2}SCH_{3}; y R es OH.

63. El procedimiento de la reivindicación 59 en el que Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}, y R es OH.

64. El procedimiento de la reivindicación 59 en el que Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es CO_{2}(CH_{2})_{4}CH_{3}; y R es OH.

65. El procedimiento de la reivindicación 59 en el que Z_{1}, Z_{2}, y R_{1} son H; R_{2} es CH_{2}OH; X es CO_{2}CH_{3}; y R es OH.

66. El procedimiento de la reivindicación 59 en el que Z_{1} y Z_{2}, son H; y R_{1} y R_{2} son H_{2}S( 3-(1,2,4-triazina)); X es CO_{2}CH_{3}; y R es OH.

67. El procedimiento de la reivindicación 59 en el que Z_{1} y Z_{2}, son H; R_{1} es Br; R_{2} es I; X es CO_{2}CH_{3}, y R es OH.

68. El procedimiento de la reivindicación 59 en el que Z_{1} y Z_{2} son H; R_{1} y R_{2} son CH_{2}CH_{2}SCH_{3}; X es CO_{2}CH_{3}, y R es OH.

69. El procedimiento de la reivindicación 59 en el que Z_{1}, Z_{2}, R_{1}, y R_{2} son H; X es CO_{2}CH_{3}; y R es OCH_{3}.

70. El procedimiento de la reivindicación 59 en el que Z_{1} y Z_{2} juntos forman =O; R_{1} y R_{2} son Br; X es CO_{2}CH_{3}; y R es OH.