KR100700028B1

KR100700028B1 - 다중 계통 키나아제 단백질의 조절 방법

Info

Publication number: KR100700028B1
Application number: KR1020017002385A
Authority: KR
Inventors: 안나 마로니; 케빈 엠. 월튼; 크레이그 에이 디온; 니콜라 네프; 어니스트 주니어 나이트; 마르시 에이. 글릭스만
Original assignee: 세파론, 인코포레이티드
Priority date: 1998-08-26
Filing date: 1999-08-18
Publication date: 2007-03-27
Also published as: ATE293254T1; PL346246A1; EP1105728B1; AU765637B2; JP2002523780A; WO2000013015A8; HUP0103079A3; HK1037722A1; EA006648B1; CN1589788A; CN1206535C; DE69924738D1; NO20010389D0; TR200100589T2; NO20010389L; SK2542001A3; KR20010103573A; HUP0103079A2; ZA200100835B; DE69924738T2

Abstract

본 발명에 따라서 다중 계통 키나아제 단백질을 함유하는 세포를 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 조절하고 세포 생존 또는 세포 사멸을 촉진시키는 화합물과 접촉시키는 단계, 그 화합물이 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 감소시키는지를 확인하는 단계 및 그 화합물이 세포 생존을 촉진시키는지를 확인하는 단계를 포함하는, 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 조절하고 세포 생존 또는 세포 사멸을 촉진시키는 화합물의 확인 방법이 제공된다. 또한, 신경변성 질환 및(또는) 염증의 치료에 유용할 수 있는 화합물의 확인 방법도 제공된다. 또한, 다중 계통 키나아제 단백질 또는 그 단백질을 함유하는 세포를 본 발명의 인데노- 또는 인돌로- 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는 다중 계통 키나아제 단백질 활성의 조절 방법도 제공된다. 또한, 신경변성 질환 및(또는) 염증의 치료 방법도 제공된다.

다중 계통 키나아제, 조절(Modulation).

Description

다중 계통 키나아제 단백질의 조절 방법 {Modulating Multiple Lineage Kinase Proteins}

본 발명은 부분적으로 다중 계통 키나아제 (MLK)족 구성원의 조절 방법, 다중 계통 키나아제 단백질을 조절하고 세포 생존을 촉진시키거나 또는 세포 사멸을 촉진시키는 화합물의 확인 방법, 신경변성 질환 및(또는) 염증의 치료에 유용할 수 있는 화합물의 확인 방법 및 신경변성 질환을 다중 계통 키나아제 단백질을 억제하는 화합물로 치료하는 방법에 관한 것이다.

MLK족은 그 족 구성원의 키나아제 영역의 단백질 서열이 MAPKKKs와 아주 비슷하지만 다른 MAPKKK와 보다는 서로간에 더 큰 유사성을 갖는 단백질 군을 포함한다. MLK족 구성원은 특히 c-Jun N-말단 키나아제 (JNK)의 조절에 관련하고, 다음에는 특히 c-Jun, ATF2 및 ELK-1을 포함한 전사 인자를 조절하는, 아주 복잡한 키나아제 캐스케이드의 일부, 예를 들면 스트레스 시그날링 캐스케이드를 포함한다. JNK는 각각 본원에 전반적으로 참고로 포함된 미국 특허 제5,534,426호, 5,593,884호, 5,605,808호 및 WO 95/03324호에 기재되어 있다.

MLK족은 부분적으로 다음 군을 포함한다: 1) 다중 계통 키나아제 1 (MLK1), 2) 다중 계통 키나아제 2 (MLK2), 3) 다중 계통 키나아제 3 (MLK3), 4) 로이신 지 퍼 함유 키나아제 (LZK), 5) 이중 로이신 지퍼 함유 키나아제 (DLK), 및 6) 다중 계통 키나아제 6 (MLK6). MLK1은 Tyr 및 Ser/Thr에 대해 특이적인 양쪽 키나아제와 유사한 촉매 영역을 갖는다 (Dorow, et al., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 701-710). MLK2도 또한 Tyr 및 Ser/Thr에 대해 특이적인 양쪽 키나아제와 유사한 촉매 영역을 갖는다 (Dorow, et al., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 701-710). MLK2는 MST로서도 알려져 있다 (Katoh, et al., Oncogene, 1995, 10, 1447-1451). MLK3은 그 키나아제 영역 이외에 인접 카르복시 말단 기본 영역 및 프롤린 풍부 영역과 함께 두 로이신 지퍼를 함유하는 단백질을 포함한다 (Ing, et al., Oncogene, 1994, 9, 1745-1750). MLK3은 SPRK로 (Gallo, et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 15092-15100) 또한 PTK1로도 알려져 있다 (Ezoe, et al., Oncogene, 1994, 9, 935-938). LZK는 로이신 지퍼 함유 키나아제이다 (Sakuma, et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 28622-28629). DLK는 키나아제 영역 및 두가지 추정 로이신 지퍼 특색을 갖는다 (Holzman, et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 30808-30817). DLK는 또한 ZPK로 (Reddy, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1994, 202, 613-620) 및 MUK로도 알려져 있다 (Hirai, et al., Oncogene, 1996, 12, 641-650). MLK족 구성원은 또한 예를 들면 문헌 (미국 특허 제5,676,945호, 5,554,523호, WO 93/15201호, 캐나다 특허 제2,148,898호, Diener, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 9687-9692, DeAizpurua, et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 16364-16373, Tung, et al., Oncogene, 1997, 14, 653-659, Sells, et al., Trends in Cell biol., 1997, 7, 161-167, Mata, et al., J. Biol. Chem., 1996, 271, 16888-16896, Hirai, et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 15167-15173, Fan, et al., J. Biol. Chem., 1996, 271, 24788-24793, Blouin et al., DNA and Cell Biol., 1996, 15, 631-642, Pombo, et al., Nature, 1995, 377, 750-754, Kiefer, et al., EMBO J., 1996, 15, 7013-7025, Hu, et al., Genes & Dev., 1996, 10, 2251-2264, Su, et al., EMBO J., 1997, 16, 1279-1290, and Dorow, et al., Eur. J. Biochem., 1995, 234, 492-500)에 기재되어 있다. 최근에, 다른 MLK 관련 키나아제는 EST 데이타베이스에서 확인된다. 이 클론, MLK6의 DNA 서열은 7가지 중복 엔트리에 의해 설명된다. 그의 클론 ID 수는 1007489, 1460085, 510915, 666323, F5555, 482188 및 178522이며, 그 서열 각각은 본원에 전반적으로 참고로 포함된다. 이 단락에 인용된 참고문헌 각각은 본원에 전반적으로 참고로 포함된다.

최근에, ZPK의 안정한 발현은 콜로니 형성 검정에 의해 측정되는 바와 같이 NIH 3T3 섬유아세포의 증식 용량을 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (Bergeron, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1997, 231, 153-155). 그러나, 베르게론 (Bergeron) 등은 ZPK가 ZPK 기질의 활성을 조절하였는지 또는 ZPK가 세포 사멸을 촉진시켰는지를 밝히는 어떠한 데이타도 제공하지 못하였다.

스위스 3T3 세포에서 Myc-MLK2를 코딩하는 제작물의 발현은 주입한지 약 20시간 후에 아포프토시스 (apoptosis)를 유도하는 것으로 밝혀졌다 (Nagata, et al., EMBO J., 1998, 17, 149-158).

출원인은 특히 과증식 상태와 관련된 세포 생장을 억제하고 각종 태(胎)의 배양물, 예를 들면 배근 신경절, 선조체, 우위 경신경절 및 운동뉴런(motoneuron)에서의 사멸을 억제하는 수많은 인돌로 및 인데노 화합물을 개발하였다. 미국 특허 제5,475,110호, 5,591,855호, 5,594,009호, 5,461,146호, 5,621,100호, 5,621,101호, 5,705,511호 및 5,756,494호 각각은 본 출원의 양수인에게 양도되고, 본원에 전반적으로 참고로 포함된다. 미국 특허 제5,705,511호에 인용된 화학식 G의 화합물은 본 출원에서 화학식 I로 불리운다. 출원인은 또한 운동뉴런 아포프토시스가 스트레스-시그날링 캐스케이드를 조절하는 인돌로카르바졸인 K-252a의 유도체에 의해 억제됨을 밝혀냈다 (본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Maroney, et al., J. Neurosci., 1998, 18, 104-111) 참조).

스트레스 시그날링 캐스케이드의 일원을 조절하고 세포 사멸 또는 세포 생존을 촉진시키는 화합물을 스크리닝하는 데 있어서의 부적당한 점으로 인해, 화합물의 새로운 선택적인 스크리닝 방법을 여전히 필요로 하고 있다. 또한, 염증 및 신경변성 질환을 치료하는데 유용할 수 있는 치료 요법에 대한 스크리닝 검정을 여전히 필요로 하고 있다. 본 발명은 이들 목적 및 다른 중요한 목적에 관한 것이다.

발명의 요약

본 발명은 다중 계통 키나아제 단백질을 함유하는 세포를 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 조절하고 세포 생존을 촉진시키는 화합물과 접촉시키는 단계, 그 화합물이 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 감소시키는지를 확인하는 단계 및 그 화합물이 세포 생존을 촉진시키는지를 확인하는 단계를 포함하는, 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 조절하고 세포 생존을 촉진시키는 화합물의 확인 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 다중 계통 키나아제 단백질을 함유하는 세포를 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 조절하고 세포 사멸을 촉진시키는 화합물과 접촉시키는 단계, 그 화합물이 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 감소시키는지를 확인하는 단계 및 그 화합물이 세포 사멸을 촉진시키는지를 확인하는 단계를 포함하는, 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 조절하고 세포 사멸을 촉진시키는 화합물의 확인 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 다중 계통 키나아제 단백질을 함유하는 세포 또는 세포 추출물을 신경변성 질환의 치료에 유용할 수 있는 화합물과 접촉시키는 단계 및 그 화합물이 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 감소시키는지를 확인하는 단계를 포함하는, 신경변성 질환의 치료에 유용할 수 있는 화합물의 확인 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 다중 계통 키나아제 단백질을 함유하는 세포 또는 세포 추출물을 화합물과 접촉시키는 단계 및 그 화합물이 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 감소시키는지를 확인하는 단계를 포함하는, 염증 치료에 유용할 수 있는 화합물의 확인 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 억제하거나 또는 감소시키는 화합물을 신경변성 질환을 가지거나 또는 가진 것으로 의심되는 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 질환을 앓거나 또는 앓는 것으로 의심되는 포유 동물의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 억제하거나 또는 감소시키는 화합물을 염증을 가진 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 염증을 가진 포유 동물의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 다중 계통 키나아제 단백질 또는 그 단백질을 함유하는 세포를 하기 화학식 II의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, 다중 계통 키나아제 단백질 활성의 조절 방법을 제공한다:

상기 식에서,

고리 B 및 고리 F는 독립적으로 각각 그들이 부착된 탄소 원자와 함께

1 내지 3개의 탄소 원자가 질소 원자로 대체될 수 있는 불포화 6원 카르보시클릭 방향족 고리,

불포화 5원 카르보시클릭 방향족 고리, 및

1개의 탄소 원자가 산소, 질소 또는 황 원자로 대체되거나, 2개의 탄소 원자가 황 및 질소 원자, 산소 및 질소 원자, 또는 2개의 질소 원자로 대체되거나, 또는 3개의 탄소 원자가 3개의 질소 원자로 대체된 불포화 5원 카르보시클릭 방향족 고리로 이루어진 군에서 선택되고;

R¹은

H, 탄소 원자수 1 내지 4개의 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬,

-C(=O)R⁹ (여기에서, R⁹는 알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택됨),

-OR¹⁰ (여기에서, R¹⁰은 H 및 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬로 이루어진 군에서 선택됨),

-C(=O)NH₂, -NR¹¹R¹², -(CH₂)_pNR¹¹R ¹², -(CH₂)_pOR¹⁰, -O(CH₂)_pOR¹⁰ 및 -O(CH₂)_pNR¹¹R¹² (여기에서, p는 1 내지 4이고, R¹¹ 및 R¹²는 각각 독립적으로 H 및 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬로 이루어진 군에서 선택되거나, 또는 R¹¹ 및 R¹²는 함께 화학식 -(CH₂)₂-X¹-(CH₂)₂- (여기에서, X¹은 -O-, -S- 및 -CH₂-로 이루어진 군에서 선택됨)의 연결 기를 형성함)로 이루어진 군에서 선택되고;

R²는

H, 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬, -OH, 탄소 원자수 1 내지 4의 알콕시, - OC(=O)R⁹, -OC(=O)NR¹¹R¹², -O(CH₂)_pNR¹¹R ¹², -O(CH₂)_pOR¹⁰, 탄소 원자수 6 내지 10의 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 및 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬로 이루어진 군에서 선택되고;

R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶은 각각 독립적으로

H, 아릴, 헤테로아릴, F, Cl, Br, I, -CN, CF₃, -NO₂, -OH, -OR⁹, -O(CH₂)_pNR¹¹R¹², -OC(=O)R⁹, -OC(=O)NR²R ⁷, -OC(=O)NR¹¹R¹², -O(CH₂)_pOR¹⁰, -CH ₂OR¹⁰, -NR¹¹R¹², -NR¹⁰S(=O)₂R⁹, -NR¹⁰C(=O)R ⁹,

-CH₂OR¹⁴ (여기에서, R¹⁴는 카르복실기의 히드록실기가 제거된 후의 아미노산의 잔기임),

-NR¹⁰C(=O)NR¹¹R¹², -CO₂R², -C(=O)R², -C(=O)NR¹¹R¹², -CH=NOR², -CH=NR⁹, -(CH₂)_pNR¹¹R¹², -(CH₂)_pNHR¹⁴ 또는 -CH=NNR²R^2A (여기에서, R^2A는 R²와 동일함),

-S(O)_yR², -(CH₂)_pS(O)_yR⁹, -CH₂S(O)_yR¹⁴ (여기에서, y는 0, 1 또는 2임),

탄소 원자수 1 내지 8의 알킬, 탄소 원자수 2 내지 8의 알케닐 및 탄소 원자수 2 내지 8의 알키닐

(여기에서, 알킬, 알케닐 또는 알키닐기 각각은 비치환되거나, 또는

알킬, 알케닐 또는 알키닐기 각각은 탄소 원자수 6 내지 10의 아릴, 헤테로아릴, 아릴알콕시, 헤테로시클로알콕시, 히드록시알콕시, 알킬옥시-알콕시, 히드록시알킬티오, 알콕시-알킬티오, F, Cl, Br, I, -CN, -NO₂, -OH, -OR⁹, -X²(CH₂)_pNR¹¹R¹², -X²(CH₂) _pC(=O)NR¹¹R¹², -X²(CH₂)_pOC(=O)NR¹¹R¹², -X²(CH₂)_pCO₂R⁹, -X²(CH₂)_pS(O)_yR⁹, -X²(CH₂) _pNR¹⁰C(=O)NR¹¹R¹², -OC(=O)R⁹, -OCONHR², -O-테트라히드로피라닐, -NR¹¹R¹², -NR¹⁰C(=O)R⁹, -NR¹⁰CO₂R ⁹, -NR¹⁰C(=O)NR¹¹R¹², -NHC(=NH)NH₂, NR¹⁰S(O)₂R⁹, -S(O)_yR⁹, -CO₂R², -C(=O)NR¹¹R¹², -C(=O)R², -CH₂OR¹⁰, -CH=NNR ²R^2A, -CH=NOR², -CH=NR⁹, -CH=NNHCH(N=NH)NH₂, -S(=O)₂NR²R ^2A, -P(=O)(OR¹⁰)₂, -OR¹⁴ 및 탄소 원자수 5 내지 7의 모노사카라이드 (상기에서, 모노사카라이드의 각 히드록실기는 독립적으로 비치환되거나, 또는 H, 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬, 탄소 원자수 2 내지 5의 알킬카르보닐옥시 또는 탄소 원자수 1 내지 4의 알콕시로 대체되고, X²는 O, S 또는 NR¹⁰임)로 이루어진 군에서 선택된 1 내지 3개의 기로 치환됨)로 이루어진 군에서 선택되고;

R⁷ 및 R⁸은 각각 독립적으로 H, 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬, 탄소 원자수 1 내지 4의 알콕시, 탄소 원자수 6 내지 10의 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, -(CH₂)_pOR¹⁰, -(CH₂)_pOC(=O)NR¹¹R¹² 및 -(CH₂)_pNR¹¹R¹²로 이루어진 군에서 선택되거나; 또는

R⁷ 및 R⁸은 함께 화학식 -CH₂-X³-CH₂- (여기에서, X³은 X² 또는 결합임)의 연결 기를 형성하고;

m 및 n은 각각 독립적으로 0, 1 또는 2이고;

Y는 -O-, -S-, -N(R¹⁰)-, -N⁺(O^-)(R¹⁰)-, -N(OR¹⁰)- 및 -CH₂-로 이루어진 군에서 선택되고;

Z는 결합, -O-, -CH=CH-, -S-, -C(=O)-, -CH(OR¹⁰)-, -N(R¹⁰)-, -N(OR¹⁰)-, CH(NR¹¹R¹²), -C(=O)N(R¹⁷)-, -N(R¹⁷)C(=O)-, -N(S(O)_yR⁹)-, -N(S(O)_yNR¹¹R¹²), -N(C(=O)R¹⁷)-, -C(R¹⁵R¹⁶)-, -N⁺(O^-)(R¹⁰)-, -CH(OH)-CH(OH)- 및 -CH(O(C=O)R⁹)CH(OC(=O)R^9A) (여기에서, R^9A는 R⁹와 동일하고, R¹⁵ 및 R¹⁶은 독립적으로 H, -OH, -C(=O)R¹⁰, -O(C=O)R⁹, 히드록시알킬 및 -CO₂R¹⁰으로 이루어진 군에서 선택되고, R¹⁷은 H, 알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택됨)로 이루어진 군에서 선택되고;

A¹과 A²는 H, H; H, -OR²; H, -SR²; H, -N(R²)₂; 및 A¹과 A²가 함께 =O, =S 및 =NR²로 이루어진 군에서 선택된 잔기를 형성하는 기로 이루어진 군에서 선택되고;

B¹과 B²는 H, H; H, -OR²; H, -SR²; H, -N(R²)₂; 및 B¹과 B²가 함께 =O, =S 및 =NR²로 이루어진 군에서 선택된 잔기를 형성하는 기로 이루어진 군에서 선택되고;

단, A¹과 A² 또는 B¹과 B² 쌍 중 하나 이상은 =O를 형성한다.

본 발명은 또한 다중 계통 키나아제 단백질 또는 그 단백질을 함유하는 세포를 하기 화학식 III의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, 다중 계통 키나아제 단백질 활성의 조절 방법을 제공한다.

상기 식에서,

Z₁은 H이고 Z₂는 H이거나, 또는 Z₁ 및 Z₂는 함께 =O를 형성하고;

R₁은 H, Cl, CH₂SO₂C₂H₅, Br, CH₂S(CH ₂)₂NH₂, CH₂S(CH₂)₂N(CH₃) ₂, CH₂S(CH₂)₂NH₂, n-C₄H₉, NHCONHC₆H₅, NHCONHC₂H₅, CH ₂SC₂H₅, CH₂SC₆H₅, N(CH₃) ₂, CH₃, CH₂OCONHC₂H₅, NHCO₂CH₃, CH₂OC₂H₅, CH₂N(CH₃)₂, OH, O-n-프로필, CH=NNH-C(=NH)NH₂, CH=N-N(CH₃)₂, CH₂S(CH₂)₂NH-n-C₄H₉, CH₂OCH₂OCH₂CH₃, CH₂S[3-(1,2,4-트리아진)], CH₂CH₂SCH ₃ 및

로 이루어진 군에서 선택되고;

R₂는 H, Br, Cl, I, CH₂S(CH₂)₂N(CH₃)₂, NHCONHC₂H₅, CH₂SC₂H₅, CH₂OCH₂OCH₂CH₃, CH₂S[3-(1,2,4-트리아진)], CH₂CH₂SCH₃ 및 CH₂OH로 이루어진 군에서 선택되고;

X는 H, CH₂OH, CH₂NH-세린H, CO₂CH₃, CONHC₆H₅, CH₂NHCO₂C₆H₅, CH₂NHCO₂CH₃, CH₂N₃, CONHC₂H₅, CH₂NH-글리신, CON(CH₃) ₂, -CH₂NHCO₂-, CONH₂, CONHC₃H₇, CH ₂NH-세린, CH₂SOCH₃, CH=NOH, CH₂NH-프롤린, CH₂CH₂(2-피리딜), CH=NNHC(=NH)NH₂, CONH(CH₂)₂OH, CH=NNHCONH₂, CH₂OCOCH₃, -CH₂OC(CH₃)₂O-, CH₂SC₆H₅, CH₂SOC₆H₅, CO₂n-헥실, CONHCH₃, CO₂(CH₂)₄CH₃ 및

로 이루어진 군에서 선택되고;

R은 OH 및 OCH₃으로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명은 또한 다중 계통 키나아제 단백질 또는 그 단백질을 함유하는 세포를 하기 화학식 IV의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, 다중 계통 키나아제 단백질 활성의 조절 방법을 제공한다.

상기 식에서,

R₁은 H 또는 Br이고;

R₂는 H이고;

R₃은 H, CH₂CH=CH₂, CH₂CH₂CH₂OH 또는

이고;

R₄는 H, CH₂CH=CH₂ 또는 CH₂CH₂CH₂OH이다.

본 발명의 양태를 예시할 목적으로, 도면에 소정의 특징을 나타내었다. 그러나, 본 발명이 나타낸 바로 그 양태에 제한되는 것이 아니라는 것을 이해하여야 한다.

도 1은 가교 인데노피롤로카르바졸의 일반적인 제조 방법을 나타내는 개략도이다.

도 2는 가교 인데노피롤로카르바졸의 일반적인 제조 방법을 나타내는 개략도이다.

도 3은 수지 결합 인데노피롤로카르바졸의 제조 방법을 나타내는 개략도이다.

도 4는 보호된 가용성 인데노피롤로카르바졸의 제조 방법을 나타내는 개략도이다.

도 5는 중간체 V의 제조 방법을 나타내는 개략도이다.

도 6은 방법 A를 이용한 가교 인데노피롤로카르바졸의 제조 방법을 나타내는 개략도이다.

도 7은 방법 B를 이용한 가교 인데노피롤로카르바졸의 제조 방법을 나타내는 개략도이다.

도 8은 B 고리 치환된 가교 인데노피롤로카르바졸의 제조 방법을 나타내는 개략도이다.

도 9는 가교 인데노피롤로카르바졸의 E 고리의 유도화를 나타내는 개략도이다.

도 10은 NGF의 부재 하에 5일 동안 배양한 후에 남아있는 생존 뉴런 분화된 PC-12 세포의 양을 설명하는 2가지 분리 실험의 그래프를 나타낸다. 결과는 각 군 내의 NGF 대조군의 백분율로서 표시하였다 (NGF 부재하의 벡터 대조군, n=12, 다른 모든 군, n=3). NGF 부재하의 벡터 대조군과 우성 음성 MLK-3 돌연변이체를 발현하는 세포의 안정한 푸울 사이의 차이는 양측 T-시험에 의해 결정되는 바와 같이 통계상 유의적인 것이다 (p<0.05).

도 11A는 방사성 겔 기재 검정을 이용한 바쿨로바이러스 발현된 FLAG-MLK-3 (완전 길이 및 키나아제 영역의 혼합물)에 의한 키나아제-사멸 GST-SEK-1의 인산화 반응을 나타낸다.

도 11B는 바쿨로바이러스 발현된 FLAG-MLK-3 (완전 길이 및 키나아제 영역의 혼합물) 또는 GST-MLK-3 키나아제 영역에 의해 촉매된 키나아제 반응의 결과로서 형성된 ³²P-표지된 인산화 미엘린 염기성 단백질을 나타낸다.

도 12는 포스포-특이적 SEK-1 항체에 의해 검출되는 바와 같이 바쿨로바이러스 발현된 FLAG-MLK-3 (완전 길이 및 키나아제 영역의 혼합물)에 의한 키나아제-사멸 GST-SEK-1의 인산화 반응을 나타내는 면역블롯 분석 결과이다.

도 13은 (o) 멀티스크린 트리클로로아세트산 침전 검정, 또는 (·)포스포셀 룰로오스막 방법을 이용한 세균성 발현된 GST-MLK-3 키나아제 영역에 의한 미엘린 염기성 단백질의 인산화를 나타낸다.

도 14는 MLK-3 바쿨로바이러스 감염된 곤충 세포의 용해질과 함께 배양된 [³H]K252a의 포화 결합 커브를 나타낸다.

도 15A는 0.025% DMSO (대조군) 또는 500 nM K-252a로 처리되고 MLK-3, MLK-2 또는 DLK를 과발현하는 세포로부터의 면역침전/키나아제 반응에서의 ³²P-표지된 c-jun의 양을 나타낸다.

도 15B는 도 15A에 기재된 샘플로부터의 면역침전/키나아제 반응에서 남아있는 활성 백분율을 정량화하는 그래프를 나타낸다. 컬럼은 에러 바아가 평균 범위를 나타내는 이중 샘플의 평균을 나타낸다.

도 15C는 0.025% DMSO (대조군) 또는 500 nM의 화합물 III-3으로 처리되고 나타낸 바와 같이 각종 양의 cDNA로 단독으로 또는 MEKK1과 함께 HA-JNK1을 과발현하는 세포로부터의 면역침전/키나아제 반응에서의 ³²P-표지된 c-jun의 양을 나타낸다 (표 3 참조). 컬럼은 에러 바아가 평균 범위를 나타내는 이중 샘플의 평균을 나타낸다.

도 16은 화합물 III-3이 농도 의존 방식으로 뉴런 생존을 촉진시킴을 나타낸다. 해리된 뉴런(neuron)는 나타낸 영양 인자(trophic factor)의 존재 또는 부재하에 교감신경성 신경절 (SG)(A), 배근 신경절 (DRG)(B), 모양체 신경절 (CG)(C) 및 운동뉴런 (MN)(D)으로부터 배양된다. 세포는 재료 및 방법에 설명된 바와 같이 평판 배양시킨 지 48시간 후에 계수하였다. 데이타는 삼중 또는 사중 확인의 평균 ± SD를 의미한다. 3회 실험 중 하나를 나타낸 것이다.

도 17은 각각의 신경영양 인자 존재하의 (교감 및 감각 뉴런에 대해 20 ng/㎖ NGF, 모양체 뉴런에 대해 10 ng/㎖ CNTF, 운동뉴런에 대해 30 ㎍/㎖ 근육 추출물 (MEX))(A-D) 또는 1 μM의 화합물 III-3 존재하의 (E-H) 배양에서 48시간 후에 (모양체 뉴런의 경우 24시간) E12 DRG (A,E), E9 교감성 (B,F), E8 모양체 (C,G) 및 E5.5 운동뉴런 (D,H)의 배양물의 위상차 현미경 사진을 나타낸다. 바아 = 200 ㎛.

도 18은 시험관내 배근 신경절 체외이식조직의 현미경 사진을 나타낸다. 병아리 DRG (E9)로부터 얻은 체외이식조직을 0.05% BSA를 함유하는 96웰 평판 배지에서 평판배양시켰다. 2시간 부착 기간 후에, 첨가가 이루어졌다: (A) 대조군 DMSO, (B) 20 ng/㎖ NGF, (C) 250 nM 화합물 III-3. 48시간 후에, 배지를 제거하고 체외이식조직을 인산염 완충된 염수 중의 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다.

도 19는 특정 투여량의 화합물 III-3으로 1일 처리한 (E5-9) 후에, E10 상에 생존하는 병아리 요추 운동뉴런의 수를 나타낸다. 제시된 데이타는 5-6 동물/처리 군의 평균 ± S.D.이다. 보고된 실험은 2회 반복하였다. 그 데이타는 하나의 대표적인 실험으로부터 얻은 것이며 요추 컬럼의 한쪽을 나타낸다. *p<0.01, **p<0.001, 본페로니 (Bonferroni) 보정된 화합물 III-3과 대조군 사이의 스튜던트 (Student) t 시험.

도 20은 화합물 III-3 또는 대조군 비히클 (5% 솔루톨 (Solutol) (등록상표))로 1일 처리한 후에 (PN1-5) PN10 또는 PN60에서 생존하는 암컷 쥐 구해면체근 (SNB)의 척수핵 내의 운동뉴런의 수를 나타낸다. PN10 (A,B) 또는 PN60(B) 시에, 쥐를 희생시키고 SNB를 함유하는 척수의 영역을 절개하고 조직학을 위해 처리하였다. 크레실레크-바이올렛 (Cresylecht violet)-염색된 운동뉴런을 이미 설명한 바와 같이 요추 5-천골신경 1 영역의 일련의 절편에서 계수하였다 (Wingfield, et al., Steroids, 1975, 26, 311-327). 실험 데이타는 4-8 동물/처리 군으로부터의 평균 ± S.E.M.이다.

도 21은 화합물 III-3에 의한 처리 후 다 자란 쥐에서의 혀 밑 악소토미 후의 ChAT-면역반응성의 손실을 나타낸다. 혀 밑 신경을 가로 절개하고 (A) 가로 절개 부위를 따라 비히클 용액 (5% 솔루톨 (등록상표))으로 처리하고 (B) 그 부위에 가해진 화합물 III-3 200 ㎍으로 처리한 후의 혀 밑 핵의 현미경사진을 나타낸다. (C) 상기 (A) 및 (B)에 설명된 처리 후의 ChAT-면역반응성 혀 밑 운동뉴런의 수. 결과는 반대측의 비병변 혀 밑 핵 내의 ChAT-면역반응성 운동뉴런의 수를 100%로 정하여 ChAT-면역반응성 운동뉴런의 백분율로서 표시하였다.

도 22는 MLK-3 경로의 억제가 인산화 반응 사건 하단의 차단 및 생체내 효능을 입증함을 나타낸다. 도 22A는 화합물 III-3의 전신 투여 시에 MPTP 병변 후의 흑질 티로신 히드록실라아제 면역반응성 뉴런의 증가를 나타낸다. 도 22B는 MPTP 유도된 인산화 MKK4 농도의 증가를 나타내는 대표적인 면역블롯이다. 도 22C는 화합물 III-3의 존재하의 MPTP 유도된 인산화 MKK4의 감쇠를 나타내는 대표적인 면역블롯 및 ELISA를 나타낸다.

도 23은 저캣 (Jurkat) 세포에서의 IL-2의 유도를 나타낸다. 도 23A는 IL-2 유도의 시간 경과를 나타낸다. 도 23B는 화합물 III-3에 의한 IL-2 유도의 억제를 나타낸다. 도 23C는 화합물 III-3 및 화합물 I-4에 의한 IL-2 유도의 억제를 나타낸다.

위에 또한 설명 전체에 이용된 다음 용어는 달리 나타내지 않으면 다음 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다.

"아포프토시스 (apoptosis)"는 세포 및 그의 핵이 막 결합된 입자로 세분되는 것에 의해 특징지워진 세포 사멸의 특정 형태를 의미한다. 아포프토시스는 예를 들면 아포프토시스 유도 화합물, 예를 들면 에토포시드, 스타우로스포린, 종양 괴사 인자-α, 세라미드 등에 의한 처리에 의해 또는 x-조사와 같은 상태에 의해 개시될 수 있다.

용어 "세포 사멸"은 당 업계의 숙련인에게 널리 공지된 아포프토시스, 괴사 또는 다른 수단에 의한 세포의 사멸을 의미한다. "세포 사멸"은 예를 들면 비처리된 대조군 세포 집락과 비교한 세포 생존율의 감소 또는 세포의 총 수의 감소로서 특징지워질 수 있다. "세포 사멸을 촉진시키는" 화합물에 의해서 대조군 집락에 비교한 세포 생존율의 감소 또는 세포수의 감소가 일어난다. 대조적으로, "세포 생존을 촉진시키는" 화합물은 세포수 또는 세포 생존율의 증가를 일어나게 하거나 또는 세포 사멸 속도를 느리게 하거나 또는 감소시킨다.

용어 "선택적으로 반응하는" 또는 "특이적으로 결합하는"은 MLK 단백질과 물리적으로 또는 화학적으로 직접 상호작용하는 화합물을 설명한다. 대조적으로, "선택적으로 반응하지 않는" 또는 "특이적으로 결합하지 않는" 화합물은 MLK 단백질의 단백질 하단(downstream) 또는 상단(upstream)에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 MLK 단백질의 활성에 영향을 미칠 수는 있지만 MLK 단백질과 물리적으로 또는 화학적으로 직접 상호작용하지는 않는다.

용어 "조절하는"은 특정 단백질 또는 그의 기질의 활성을 증가 또는 감소시키는 것을 의미한다.

본 발명은 부분적으로 MLK 단백질의 활성을 조절하고 세포 생존 또는 세포 사멸을 촉진시키는 화합물의 확인 방법에 관한 것이다. MLK 단백질 활성의 증가를 일으키는 화합물이 세포 사멸을 촉진시키는 반면 MLK 단백질 활성의 감소를 일으키는 화합물은 세포 생존을 촉진시킬 수 있다.

MLK 단백질은 MLK류 단백질에 속하는 것으로 확인되는 임의의 단백질일 수 있다. 바람직하게는, MLK 단백질은 위에 설명된 MLK1, MLK2, MLK3 (SPRK, PTK1), LZK, DLK (ZPK, MUK) 및 MLK6으로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직한 양태에서, 그 방법은 결합 검정, 키나아제 검정 또는 다른 동등한 검정에 의해 확인되는 바와 같이 MLK 단백질과 직접 상호 작용하거나 또는 결합하는 단백질을 확인한다.

MLK 단백질 활성을 조절하고 세포 생존 또는 세포 사멸을 촉진시키는 화합물을 확인하기 위해서는, MLK 단백질을 함유하는 세포(들)을 시험 화합물과 접촉시킨다. 접촉은 당 업계의 숙련인에게 공지된 완충액 또는 배지에서 일어날 수 있다. 또한, 접촉은 생체내에서 일어날 수 있으며, 동물, 예를 들면 생쥐 또는 당 업계의 숙련인에게 공지된 다른 적합한 동물은 시험 화합물 및 제약학상 허용되는 염, 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 투여함으로써 접촉된다. 또한, 세포수 및 시험 화합물의 농도를 변화시킬 수 있다. 시험 화합물이 MLK 단백질의 활성을 증가 또는 감소시키는 지를 확인한다. 또한, 시험 화합물이 세포 생존 또는 세포 사멸을 촉진시키는 지를 확인한다.

시험 화합물과 접촉되는 세포는 임의의 포유 동물 세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 뉴런 세포이다. 바람직하게는, 세포는 신경변성 질병과 관련이 있다. 본 발명의 목적을 위하여, "신경변성 질병," "신경변성 질환," 및 "신경변성 상태"는 상호 교환되며, 뉴런 세포 또는 뉴런계에 관련된 세포와 관련된 임의의 질병 또는 질환을 설명하는데 이용되며, 제한하는 것은 아니지만 그 질병의 예로는 알쯔하이머병, 운동뉴런 질병, 근위축성 측색경화증, 파킨슨씨병, 뇌혈관성 질병, 허혈 상태, AIDS 치매, 헌팅톤씨병, 및 뇌 또는 척수에 대한 진탕증 또는 관통상을 들 수가 있다.

MLK 단백질 활성은 여러 기술에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, MLK 활성은 MLK 단백질의 기질의 활성을 측정함으로써 확인될 수 있다. 그러한 기질은 당 업계의 숙련인에게 잘 알려져 있으며 그들에 의해 쉽게 분별될 수 있다. 바람직하게는, 그 기질은 미토겐 활성화된 단백질 키나아제족 또는 제한하는 것은 아니지만 JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, p38α, p38β, p38γ, p38δ, MEK1, MEK2, MKK3, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1, 및 AEX-3의 포유 동물 상동물로 이루어진 군에서 선택된 단백질을 포함하는 경로 보다 더 하단의 미토겐 활성화된 단백질 키나아제족 기질, 및 미엘린 염기성 단백질 (MBP)와 같은 Ser/Thr 단백질 키나아제의 일반 기질의 구성원이다. 기질의 활성을 측정하는 시약 및 방법도 또한 당 업계의 숙련인에게 공지되어 있다. MLK의 존재는 MLK 단백질 또는 MLK 단백질을 코딩하는 mRNA의 양을 측정함으로써 확인될 수도 있다. 항체 및 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한 시약, 및 노던 및 웨스턴 블롯을 비롯한, DNA 또는 단백질 양의 측정 방법은 당 업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. MLK 단백질 활성은 시험관내 키나아제 검정에 의해 확인될 수도 있다. 시험관내 키나아제 검정은 당 업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 단백질 활성을 측정하는 다른 기술은 당 업계의 숙련인에게 공지되어 있으며 본 발명에 의해 커버될 것이다. 따라서, 당 업계의 숙련인은 시험 화합물이 MLK 단백질 활성을 조절, 즉 증가 또는 감소시키는 지를 확인할 수 있다.

시험 화합물이 세포 생존 또는 세포 사멸을 촉진시키는지 여부는 많은 방법에서 확인될 수 있다. 바람직하게는, 세포 생존 또는 세포 사멸의 촉진은 사멸될 위기에 있는 세포를 사용하고 시험 화합물과 접촉되고 살아있는 세포의 양과 시험 화합물과 접촉되지 않고 살아있는 세포의 양을 비교함으로써 확인된다. 바람직하게는, 세포는 사멸되도록 미리 프로그래밍된 1차 배아 운동뉴런 세포이다. 1차 배아 운동뉴런 세포는 본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Maroney, et al., J. Neurosci., 1998, 18, 104-111)에 기재되어 있다. 1차 배아 운동뉴런 세포는 시험 화합물에 의해 보호되지 않으면 사멸될 것이다. 따라서, 시험 화합물로 처리되지 않은 운동뉴런 세포의 집락 내의 운동뉴런 세포의 수에 비해 시험 화합물로 처리된 운동뉴런 세포의 집락 내의 살아있는 운동뉴런 세포의 더 많은 수는 세포 생존을 촉진시키는 시험 화합물의 지표이다. 대조적으로, 시험 화합물로 처리되지 않은 운동뉴런 세포의 집락 내의 운동뉴런 세포의 수에 비해 시험 화합물로 처리된 운동뉴런 세포의 집락 내의 살아있는 운동뉴런 세포의 더 적은 수는 세포 사멸을 촉진시키는 시험 화합물의 지표이다.

본 발명의 또다른 양태에서, 정상 세포 또는 야생형 세포는 실시예에 하기하는 바와 같이, MLK 단백질을 과발현시킴으로써 사멸될 위기에 있는 세포가 되도록 전환되고 다음에 시험 화합물과 접촉된다. MLK 단백질을 과발현시키는 세포는 시험 화합물에 의해 보호되지 않으면 사멸될 수 있다. MLK 단백질의 과발현은 세포 내측의 특정 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터를 사용하여 이루어질 수 있다. 발현 벡터는 당 업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 또한, 발현 벡터의 제조 방법은 또한 당 업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 임의의 MLK 단백질을 발현하는 발현 벡터는 실시예에 기재된 바와 유사한 방법으로 제조될 수 있다. 시험 화합물로 처리되지 않은 과발현 세포의 집락 내의 살아있는 세포의 수에 비해 시험 화합물로 처리된 과발현 세포의 집락 내의 살아있는 세포의 더 많은 수는 세포 생존을 촉진시키는 시험 화합물의 지표이다. 대조적으로, 시험 화합물로 처리되지 않은 과발현 세포의 집락 내의 살아있는 세포의 수에 비해 시험 화합물로 처리된 과발현 세포의 집락 내의 살아있는 세포의 더 적은 수는 세포 사멸을 촉진시키는 시험 화합물의 지표이다.

본 발명의 또다른 양태에서, 세포 생존의 촉진은 아포프토시스의 감소를 관찰하거나 또는 측정함으로써 확인된다. 세포형질 축화 및 핵 축합은 아포프토시스와 관련이 있다. 따라서, 당 업계의 숙련인은 세포형질 축화 및(또는) 핵 축합을 측정하거나 또는 관찰함으로써 아포프토시스의 감소를 측정할 수 있다. 또한, 당 업계의 숙련인은 통상의 염색 기술을 이용함으로써 아포프토시스를 측정할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 정상의 야생형 뉴런 세포는 세포 사멸을 촉진시키는 화합물을 확인하는데 이용될 수 있다. 정상 뉴런 세포는 시험 화합물에 의해 사멸되도록 유도되지 않으면 생존할 것이다. 시험 화합물로 처리되지 않은 정상 세포의 집락 내의 살아있는 세포의 수에 비해 시험 화합물로 처리된 정상 세포의 집락 내의 살아있는 세포의 더 적은 수는 세포 사멸을 촉진시키는 시험 화합물의 지표이다. 반대로, 시험 화합물로 처리되지 않은 정상 세포의 집락 내의 살아있는 세포의 수에 비해 시험 화합물로 처리된 정상 세포의 집락 내의 살아있는 세포의 더 많거나 또는 동일한 수는 세포 사멸을 촉진시키는 시험 화합물의 지표가 아니다.

본 발명은 또한 부분적으로 MLK 단백질 또는 그 단백질을 함유하는 세포를, 본 출원의 양수인에게 양도되고 본원에 전반적으로 참고로 포함된 미국 특허 제5,705,511호에 기재된 화학식 G의 화합물 (본원에서 화학식 I로 불리움)과 접촉시키는 것을 포함하는, MLK 단백질의 활성의 조절 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 부분적으로 MLK 단백질 또는 그 단백질을 함유하는 세포를, 하기 화학식 III의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, MLK 단백질의 활성의 조절 방법에 관한 것이다:

<화학식 III>

상기 식에서,

로 이루어진 군에서 선택되고;

로 이루어진 군에서 선택되고;

R은 OH 및 OCH₃으로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명의 바람직한 양태에서, Z₁ 및 Z₂는 H이고, X는 CO₂CH₃이고, R₁은 NHCONHC₂H₅이고, R₂는 CH₂CH₂(2-피리딜)이고, R은 OH이다. 본 발명의 다른 바람직한 양태에서, Z₁ 및 Z₂는 H이고, X는 CO₂CH₃이고, R₁ 및 R₂는 CH₂OCH₂OCH₂CH₃이고, R은 OH이거나; 또는 Z₁ 및 Z₂는 H이고, X는 CO₂CH₃이고, R₁ 및 R₂는 CH₂SCH₂CH₃이고, R은 OH이거나; 또는 Z₁, Z₂, R₁ 및 R₂는 H이고, X는 CO₂CH ₃이고, R은 OH이거나; 또는 Z₁, Z₂, R₁ 및 R₂는 H이고, X는 CO₂(CH₂)₄CH ₃이고, R은 OH이거나; 또는 Z₁, Z₂ 및 R₁은 H이고, R₂는 CH₂OH이고, X는 CO₂CH₃이고, R은 OH이거나; 또는 Z ₁ 및 Z₂는 H이고, R₁ 및 R₂는 H₂S[3-(1,2,4-트리아진)]이고, X는 CO₂CH₃이고, R은 OH이거나; 또는 Z₁ 및 Z₂는 H이고, R₁은 Br이고, R₂는 I이고, X는 CO₂CH₃이고, R은 OH이거나; 또는 Z₁ 및 Z₂는 H이고, R₁ 및 R₂는 CH₂CH₂SCH₃이고, X는 CO₂CH₃이고, R은 OH이거나; 또는 Z₁, Z₂, R₁ 및 R₂는 H이고, X는 CO₂CH₃이고, R은 OCH₃이거나; 또는 Z₁ 및 Z₂는 함께 =O를 형성하고, R₁ 및 R₂는 Br이고, X는 CO₂CH₃이고, R은 OH이다.

본 발명은 또한 부분적으로 MLK 단백질 또는 그 단백질을 함유하는 세포를 하기 화학식 II의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, MLK 단백질의 활성의 조절 방법에 관한 것이다:

<화학식 II>

상기 식에서,

a) 1 내지 3개의 탄소 원자가 질소 원자로 대체될 수 있는 불포화 6원 카르보시클릭 방향족 고리,

b) 불포화 5원 카르보시클릭 방향족 고리, 및

c) 1) 1개의 탄소 원자가 산소, 질소 또는 황 원자로 대체되거나, 2) 2개의 탄소 원자가 황 및 질소 원자, 산소 및 질소 원자, 또는 2개의 질소 원자로 대체되거나, 또는 3) 3개의 탄소 원자가 3개의 질소 원자로 대체된 불포화 5원 카르보시클릭 방향족 고리로 이루어진 군에서 선택되고;

R¹은

a) H, 탄소 원자수 1 내지 4개의 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬,

b) -C(=O)R⁹ (여기에서, R⁹는 알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택됨),

c) -OR¹⁰ (여기에서, R¹⁰은 H 및 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬로 이루어진 군에서 선택됨),

d) -C(=O)NH₂, -NR¹¹R¹², -(CH₂)_pNR¹¹R ¹², -(CH₂)_pOR¹⁰, -O(CH₂)_pOR¹⁰ 및 -O(CH₂)_pNR¹¹R¹² (여기에서, p는 1 내지 4이고, 1) R¹¹ 및 R¹²는 각각 독립적으로 H 및 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬로 이루어진 군에서 선택되거나, 또는 2) R¹¹ 및 R¹²는 함께 화학식 -(CH₂)₂-X¹-(CH₂)₂- (여기에서, X¹은 -O-, -S- 및 -CH₂-로 이루어진 군에서 선택됨)의 연결 기를 형성함)로 이루어진 군에서 선택되고;

R²는

R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶은 각각 독립적으로

a) H, 아릴, 헤테로아릴, F, Cl, Br, I, -CN, CF₃, -NO₂, -OH, -OR⁹, -O(CH₂)_pNR¹¹R¹², -OC(=O)R⁹, -OC(=O)NR²R ⁷, -OC(=O)NR¹¹R¹², -O(CH₂)_pOR¹⁰, -CH ₂OR¹⁰, -NR¹¹R¹², -NR¹⁰S(=O)₂R⁹, -NR¹⁰C(=O)R ⁹,

b) -CH₂OR¹⁴ (여기에서, R¹⁴는 카르복실기의 히드록실기가 제거된 후의 아미노산의 잔기임),

c) -NR¹⁰C(=O)NR¹¹R¹², -CO₂R², -C(=O)R², -C(=O)NR¹¹R¹², -CH=NOR², -CH=NR⁹, -(CH₂)_pNR¹¹R¹², -(CH₂)_pNHR¹⁴ 또는 -CH=NNR²R^2A (여기에서, R^2A는 R²와 동일함),

d) -S(O)_yR², -(CH₂)_pS(O)_yR⁹, -CH₂S(O)_yR¹⁴ (여기에서, y는 0, 1 또는 2임),

e) 탄소 원자수 1 내지 8의 알킬, 탄소 원자수 2 내지 8의 알케닐 및 탄소 원자수 2 내지 8의 알키닐

(여기에서, 1) 알킬, 알케닐 또는 알키닐기 각각은 비치환되거나, 또는

2) 알킬, 알케닐 또는 알키닐기 각각은 탄소 원자수 6 내지 10의 아릴, 헤테로아릴, 아릴알콕시, 헤테로시클로알콕시, 히드록시알콕시, 알킬옥시-알콕시, 히드록시알킬티오, 알콕시-알킬티오, F, Cl, Br, I, -CN, -NO₂, -OH, -OR⁹, -X²(CH₂)_pNR¹¹R¹², -X²(CH₂) _pC(=O)NR¹¹R¹², -X²(CH₂)_pOC(=O)NR¹¹R¹², -X²(CH₂)_pCO₂R⁹, -X²(CH₂)_pS(O)_yR⁹, -X²(CH₂) _pNR¹⁰C(=O)NR¹¹R¹², -OC(=O)R⁹, -OCONHR², -O-테트라히드로피라닐, -NR¹¹R¹², -NR¹⁰C(=O)R⁹, -NR¹⁰CO₂R ⁹, -NR¹⁰C(=O)NR¹¹R¹², -NHC(=NH)NH₂, NR¹⁰S(O)₂R⁹, -S(O)_yR⁹, -CO₂R², -C(=O)NR¹¹R¹², -C(=O)R², -CH₂OR¹⁰, -CH=NNR ²R^2A, -CH=NOR², -CH=NR⁹, -CH=NNHCH(N=NH)NH₂, -S(=O)₂NR²R ^2A, -P(=O)(OR¹⁰)₂, -OR¹⁴ 및 탄소 원자수 5 내지 7의 모노사카라이드 (상기에서, 모노사카라이드의 각 히드록실기는 독립적으로 비치환되거나, 또는 H, 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬, 탄소 원자수 2 내지 5의 알킬카르보닐옥시 또는 탄소 원자수 1 내지 4의 알콕시로 대체되고, X²는 O, S 또는 NR¹⁰임)로 이루어진 군에서 선택된 1 내지 3개의 기로 치환됨)로 이루어진 군에서 선택되고;

m 및 n은 각각 독립적으로 0, 1 또는 2이고;

단, A¹과 A² 또는 B¹과 B² 쌍 중 하나 이상은 =O를 형성한다.

본 발명은 또한 부분적으로 MLK 단백질 또는 그 단백질을 함유하는 세포를, 하기 화학식 IV의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, MLK 단백질의 활성의 조절 방법에 관한 것이다:

<화학식 IV>

상기 식에서,

R₁은 H 또는 Br이고;

R₂는 H이고;

R₃은 H, CH₂CH=CH₂, CH₂CH₂CH₂OH 또는

이고;

R₄는 H, CH₂CH=CH₂ 또는 CH₂CH₂CH₂OH이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, R₁, R₂, R₄, Z₁ 및 Z₂는 H이고, R₃은 CH₂CH=CH₂이다. 본 발명의 다른 바람직한 양태에서, R₁은 Br이고, R₂, R₃, R₄, Z₁ 및 Z₂는 H이거나, 또는 R₁, R₂, Z₁ 및 Z₂는 H이고, R₃ 및 R ₄는 CH₂CH=CH₂이거나, 또는 R₁, R₂, R₃, Z₁ 및 Z₂는 H이고, R₄는 CH₂CH=CH₂이거나, 또는 R₁, R₂, Z₁ 및 Z₂는 H이고, R₃ 및 R₄는 CH₂CH₂CH₂OH이거나, 또는 R₁, R₂, R₄, Z₁ 및 Z₂는 H이고, R₃은

이다.

본 발명은 또한 다중 계통 키나아제 단백질을 함유하는 세포 또는 세포 추출물을 신경변성 질환의 치료에 유용할 수 있는 화합물과 접촉시키는 단계 및 그 화합물이 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 감소시키는지를 확인하는 단계를 포함하는, 신경변성 질환의 치료에 유용할 수 있는 화합물의 확인 방법을 제공한다. 세포 및 그로부터의 추출물은 상기한 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 발견되는 화합물 (즉, 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 억제하거나 또는 감소시키는 화합물)은 신경변성 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 그 단백질은 바람직하게는 다중 계통 키나아제 1, 다중 계통 키나아제 2, 다중 계통 키나아제 3, 로이신 지퍼 함유 키나아제, 이중 로이신 지퍼 함유 키나아제 및 다중 계통 키나아제 6으로 이루어진 군에서 선택된다. 그 세포는 시험관내 또는 생체내에서 접촉된다. 바람직하게는, 단백질 활성은 상기 단백질의 기질의 활성 또는 인산화 상태를 측정함으로써 확인된다. 바람직하게는, 그 기질은 JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, p38α, p38β, p38γ, p38δ, MEK1, MEK2, MKK3, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1, 및 AEX-3의 포유 동물 상동물 및 일반 Ser/Thr 기질, 예를 들면 미엘린 염기성 단백질 (MBP)로 이루어진 군에서 선택된다. 단백질 활성은 단백질의 기질의 활성, 단백질의 기질 또는 단백질의 기질을 코딩하는 mRNA의 양을 측정함으로써 확인될 수도 있다. 단백질 활성은 시험관내 키나아제 검정 또는 결합 검정에 의해 확인될 수도 있다. 세포는 바람직하게는 1차 배아 운동뉴런 세포, 다중 계통 키나아제 단백질을 과발현하는 세포 또는 뉴런 세포이지만, 임의의 세포 또는 그로부터의 추출물일 수 있다. 바람직하게는, 다중 계통 키나아제 단백질과 직접 결합하는 화합물은 상기한 바와 같이 확인된다.

본 발명은 또한 다중 계통 키나아제 단백질을 함유하는 세포 또는 세포 추출물을 염증 치료에 유용할 수 있는 화합물과 접촉시키는 단계 및 그 화합물이 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 감소시키는지를 확인하는 단계를 포함하는, 염증 치료에 유용할 수 있는 화합물의 확인 방법을 제공한다. 세포 및 그로부터의 추출물은 상기한 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 발견되는 화합물 (즉, 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 억제하거나 또는 감소시키는 화합물)은 염증을 치료하는데 유용할 수 있다. 그 단백질은 바람직하게는 다중 계통 키나아제 1, 다중 계통 키나아제 2, 다중 계통 키나아제 3, 로이신 지퍼 함유 키나아제, 이중 로이신 지퍼 함유 키나아제 및 다중 계통 키나아제 6으로 이루어진 군에서 선택된다. 그 세포는 시험관내 또는 생체내에서 접촉된다. 바람직하게는, 단백질 활성은 상기 단백질의 기질의 활성 또는 인산화 상태를 측정함으로써 확인된다. 바람직하게는, 그 기질은 JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, p38α, p38β, p38γ, p38δ, MEK1, MEK2, MKK3, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1, 및 AEX-3의 포유 동물 상동물 및 일반 Ser/Thr 기질, 예를 들면 미엘린 염기성 단백질 (MBP)로 이루어진 군에서 선택된다. 단백질 활성은 단백질의 기질의 활성, 단백질의 기질 또는 단백질의 기질을 코딩하는 mRNA의 양을 측정함으로써 확인될 수도 있다. 단백질 활성은 시험관내 키나아제 검정 또는 결합 검정에 의해 확인될 수도 있다.

세포는 바람직하게는 1차 배아 운동뉴런 세포, 다중 계통 키나아제 단백질을 과발현하는 세포 또는 뉴런 세포이지만, 임의의 세포 또는 그로부터의 추출물일 수 있다. 세포는 또한 제한되는 것은 아니지만 염증, 예를 들면 임파세포, 대식세포 및 당 업계의 숙련인에게 공지된 다른 백혈구 세포에 관련된 것을 포함한다. 바람직하게는, 다중 계통 키나아제 단백질과 직접 결합하는 화합물은 상기한 바와 같이 확인된다.

본 발명은 또한 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 억제하거나 또는 감소시키는 화합물을 신경변성 질환을 앓거나 또는 앓는 것으로 의심되는 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 질환을 앓거나 또는 앓는 것으로 의심되는 포유 동물의 치료 방법을 제공한다. 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 억제하 거나 또는 감소시키는 화합물은 제한되는 것은 아니지만 화학식 I, II, III 및 IV의 화합물을 포함한다. 바람직한 화합물은 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 조절하고 세포 생존 또는 세포 사멸을 촉진시키는 화합물을 스크리닝하는 방법에 대해 상기한 것을 포함한다. 바람직한 포유 동물은 인간이다. 개체가 특정 신경변성 질병의 증상을 갖거나, 고 위험 군이거나 또는 신경변성 질병의 가족력을 갖는다면 그 개체는 신경변성 질병을 가진 것으로 의심될 수 있다.

본 발명은 또한 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 억제하거나 또는 감소시키는 화합물을 염증을 가진 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 염증을 가진 포유 동물의 치료 방법을 제공한다. 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 억제하거나 또는 감소시키는 화합물은 제한되는 것은 아니지만 화학식 I, II, III 및 IV의 화합물을 포함한다. 바람직한 화합물은 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 조절하고 세포 생존 또는 세포 사멸을 촉진시키는 화합물을 스크리닝하는 방법에 대해 상기한 것을 포함한다. 바람직한 포유 동물은 인간이다.

화학식 I-IV의 화합물과의 접촉은 당 업계의 숙련인에게 공지된 완충액 또는 배지에서 일어날 수 있다. 또한, 그 접촉은 시험 화합물 및 제약학상 허용되는 염, 담체 또는 희석제를 함유하는 제약 조성물을 적합한 동물 또는 포유동물, 예를 들면 마우스 또는 당 업계의 숙련인에게 공지된 다른 적합한 동물에게 투여함으로써 일어날 수 있다. 또한, 세포의 수 및 화합물의 농도를 변화시킬 수 있다. 시험 화합물과 접촉되는 세포는 임의의 포유동물 세포일 수 있다. 바람직하게는, 그 세포는 뉴런 세포이다. 바람직하게는, 그 세포는 신경변성 질병, 예를 들면 알쯔하이머병, 운동뉴런 질병, 근위축성 측색경화증, 파킨슨씨병, 뇌혈관 질환, 허혈 상태, AIDS 치매, 간질, 헌팅톤씨병, 및 뇌 또는 척수에 대한 진탕증 또는 관통상과 관련된다. 화학식 I의 화합물 및 그의 제조 방법은 본원에 전반적으로 참고로 포함된 미국 특허 제5,705,511호에 기재되어 있다. 화학식 III의 화합물 및 그의 제조 방법은 각각이 본원에 전반적으로 참고로 포함된 미국 특허 제5,741,8098, 5,621,100, 5,621,101, 5,461,146호 및 5,756,494호, 및 WO 97/46567호에 기재되어 있다. 화학식 IV의 화합물 및 그의 제조 방법은 각각이 본원에 전반적으로 참고로 포함된 미국 특허 제5,741,8098, 5,621,100, 5,621,101, 5,461,146호 및 5,756,494호, 및 WO 97/46567호에 기재되어 있다.

화학식 II의 화합물은 치환체 R², R⁷ 및 R⁸이 주위의 탄소 원자에 결합된 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체를 포함한다.

바람직한 가교 인데노피롤로카르바졸은 하기 화학식 II로 표시된다.

<화학식 II>

화학식 II의 화합물의 일부 바람직한 양태에서, R¹은 H이다. 또다른 바람직 한 양태에서, R²는 H, 히드록실, 또는 치환 또는 비치환된 알킬이다.

다른 바람직한 양태에서, R³, R⁴, R⁵ 및R⁶은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 할로겐, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아미노, 또는 치환 또는 비치환된 아릴이다. 또다른 바람직한 양태에서, R⁷ 및R⁸은 독립적으로 H, 또는 치환 또는 비치환된 알킬이다.

일부 바람직한 양태에서, Y는 O이다. 또다른 바람직한 양태에서, Z는 결합, O, S, 또는 치환 또는 비치환된 N이다. 또다른 바람직한 양태에서, m 및 n은 독립적으로 1 또는 2이다. 일부 특히 바람직한 양태에서, Y는 O이고, Z는 결합 또는 O이고, m 및 n은 독립적으로 1 또는 2이다.

또다른 바람직한 양태에서, A¹A² 및 B¹B²는 =O 또는 H,H이다.

일부 특히 바람직한 양태에서, R¹, R⁴, R⁶ 및R⁷은 각각 H이고, Y는 =O이고, n은 1이고, A¹A² 및 B¹B²는 =O 또는 H,H이고, R²는 H, OH 또는 저급 알킬이고, R³은 H 또는 치환된 알킬이고, R⁵ 및R⁸은 각각 H 또는 알콕시, 바람직하게는 메톡시이고, Z는 결합 또는 O이고, m은 1 또는 2이다.

화합물 (II)의 화합물의 일부 특히 바람직한 양태는 하기 표 1에 기재된 화합물 II-1, II-2, II-3, II-4a, II-4b, II-5, II-6, II-7a, II-7b, II-8, II-9, II-10, II-11 및 II-12이다.

화학식 II로 표시되는 화합물은 이후에 화합물 (II)로서 칭해진다.

본원에 사용된 용어 "카르보시클릭"은 고리 부분이 탄소 원자 만으로 이루어진 환식 기를 의미한다. 용어 "헤테로시클로" 및 "헤테로시클릭"은 고리 부분이 1개 이상의 이종 원자, 예를 들면 O, N 또는 S를 포함하는 환식 기를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "알킬"은 탄소 원자수 1 내지 8의 직쇄, 환식, 또는 분지쇄 알킬기, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소아밀, 네오펜틸, 1-에틸프로필, 헥실, 옥틸, 시클로프로필 및 시클로펜틸을 의미한다. 알킬 함유 기, 예를 들면 알콕시, 알콕시카르보닐 및 알킬아미노카르보닐 기의 알킬 잔기는 상기 정의한 알킬과 동일한 의미를 갖는다. 바람직한 저급 알킬기는 탄소 원자수 1 내지 4의 상기 정의한 알킬기이다. 용어 "알케닐"은 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 포함한다. 알케닐 기의 예는 에테닐 및 프로페닐 기를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "알키닐"은 1개 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 포함한다. 알키닐 기의 예는 에티닐 및 프로피닐 기를 포함한다.

아실 함유 기, 예를 들면 아실옥시 기의 아실 잔기는 탄소 원자수 1 내지 6의 직쇄 또는 분지쇄 알카노일기를 포함하며, 그 예로는 포르밀, 아세틸, 프로파노일, 부티릴, 발레릴, 피발로일 또는 헥사노일이 있다.

본원에 사용된 용어 "아릴"은 탄소 원자수 6 내지 12의 기, 예를 들면 페닐, 비페닐 및 나프틸을 의미한다. 바람직한 아릴 기는 비치환 또는 치환된 페닐 및 나프틸기를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "헤테로아릴"은 1개 이상의 고리 탄소 원자가 이종 (즉, 비탄소) 원자, 예를 들면 O, N 또는 S로 대체된 아릴 기를 의미한다. 바람직한 헤테로아릴기는 피리딜, 피리미딜, 피롤릴, 푸릴, 티에닐, 이미다졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 벤조이미다졸릴, 티아졸릴, 피라졸릴 및 벤조티아졸릴기를 포함한다.

용어 "아르알킬" (또는 "아릴알킬")은 아릴기를 갖는 알킬기를 포함하는 탄소 원자수 7 내지 15의 기를 의미한다. 아르알킬기의 예는 벤질, 페네틸, 벤즈히드릴 및 나프틸메틸기를 포함한다.

알킬기 및 치환기, 예를 들면 아르알킬, 알콕시, 아릴알콕시, 히드록시알콕시, 알콕시-알콕시, 히드록시-알킬티오, 알콕시-알킬티오, 알킬카르보닐옥시, 히드록시알킬 및 아실옥시기 내에 함유된 알킬 잔기는 치환 또는 비치환될 수 있다. 치환된 알킬기는 1 내지 3개의 독립적으로 선택된 치환체, 바람직하게는 히드록시, 저급 알콕시, 저급 알콕시-알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시-저급 알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알콕시-저급 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알콕시, 할로겐, 카르복실, 저급 알콕시카르보닐, 니트로, 아미노, 모노- 또는 디-저급 알킬아미노, 디옥솔란, 디옥산, 디티올란, 디티온, 푸란, 락톤 또는 락탐을 갖는다.

치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴 및 치환된 아르알킬기는 각각 바람직하게는 저급 알킬, 히드록시, 저급 알콕시, 카르복시, 저급 알콕시카르보닐, 니트로, 아미노, 모노- 또는 디-저급 알킬아미노 및 할로겐인 1 내지 3개의 독립적으로 선택된 치환체를 갖는다.

질소 원자와 함께 형성된 헤테로시클릭기는 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페리디노, 모르폴리닐, 모르폴리노, 티오모르폴리노, N-메틸피페라지닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 이미다졸, 이미다졸린, 옥사졸린, 옥사졸, 트리아졸, 티아졸린, 티아졸, 피라졸, 피라졸론 및 트리아졸기를 포함한다. 산소 원자와 함께 형성된 헤테로시클릭기는 푸란, 테트라히드로푸란, 피란 및 테트라히드로피란기를 포함한다.

"히드록시알킬"기는 히드록실기가 부착된 알킬기이다. 할로겐은 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "헤테로아릴알킬"은 이종 원자를 함유하는 아릴알킬기를 의미한다. 용어 "옥시"는 산소 원자의 존재를 의미한다. 따라서, "알콕시"기는 산소 원자를 통해 부착된 알킬기이고, "카르보닐옥시"기는 산소 원자를 통해 부착된 카르보닐기이다.

용어 "헤테로시클로알콕시"는 그의 알킬 잔기에 헤테로시클로기가 부착된 알콕시기를 의미하며, 용어 "아릴알콕시"는 그의 알킬 잔기에 아릴기가 부착된 알콕시기를 의미한다. 용어 "알킬카르보닐옥시"는 화학식 -O-C(=O)-알킬의 기를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "알킬옥시-알콕시"는 그의 알킬 잔기에 알킬옥시 치환체가 부착된 알콕시기를 의미한다. 용어 "알콕시-알킬티오"는 그의 알킬 잔기에 알콕시 치환체가 부착된 알킬티오기 (즉, 화학식 -S-알킬의 기)를 의미한다. 용어 "히드록시-알킬티오"는 그의 알킬 잔기에 히드록시 치환체가 부착된 알킬티오기 (즉, 화학식 -S-알킬의 기)를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "모노사카라이드"는 단순 당으로서의 통상적인 의미를 갖는다.

본원에 사용된 용어 "아미노산"은 아미노기 및 카르복실기 둘다를 함유하는 분자를 의미한다. 아미노산의 예는 α-아미노산, 즉 화학식 HOOC-CH(NH₂)-(측쇄)의 카르복실산을 포함한다.

아미노산의 측쇄는 자연 발생 및 비자연 발생 잔기를 포함한다. 비자연 발생 (즉, 비천연) 아미노산 측쇄는 예를 들면 아미노산 유사체에서 자연 발생 아미노산 측쇄 대신에 사용되는 잔기이다 (예를 들면, 본원에 참고로 삽입된 Lehninger, Biochemistry, Second Edition, Worth Publishers, Inc., 1975, pages 73-75 참조).

바람직한 α-아미노산은 D 배위, L 배위를 갖거나 또는 라세미체로서의, 글리신, 알라닌, 프롤린, 글루탐산 및 리신을 포함한다.

또다른 대표적인 α-아미노산의 측쇄는 하기 표 1에 나타내었다.

일부 바람직한 양태에서, 화학식 II의 화합물에 대한 치환기는 그의 카르복실기의 히드록실기가 제거된 후의 아미노산의 잔기, 즉 -C(=O)-CH(NH₂)-(측쇄)의 기를 포함한다.

화학식 II의 화합물 상에 존재하는 관능기는 보호기를 포함할 수 있다. 예를 들면, 화학식 II의 화합물의 아미노산 측쇄 치환체는 보호기, 예를 들면 벤질옥시카르보닐 또는 t-부톡시카르보닐기로 치환될 수 있다. 보호기는 관능기에 선택 적으로 부착되고 그로부터 제거될 수 있는 화학적 관능기, 예를 들면 히드록실기 및 카르복실기로서 알려져 있다. 이 기들은 화합물에 존재하여 그러한 관능기가 화합물이 노출되는 화학 반응 조건에 대해 불활성이 되도록 만든다. 임의의 각종 보호기가 본 발명에 이용될 수 있다. 그러한 보호기 중 하나는 벤질옥시카르보닐 (Cbz;Z) 기이다. 본 발명에 따른 다른 바람직한 보호기는 문헌 (Greene, T.W. and Wuts, P.G.M., "Protective Groups in Organic Synthesis" 2d. Ed., Wiley & Sons, 1991)에 기재되어 있다.

가교 인데노피롤로카르바졸 화합물은 연구 및 치료 분야를 비롯한 여러 환경에서 유용성을 갖는 중요한 기능적 약리학적 활성을 나타내었다. 이들 유도체는 치료제로서 유용하다. 화합물의 활성은 영양 인자 반응 세포의 기능 및(또는) 생존에 대해 양성 효과를 나타낸다. 영양 인자 반응 세포, 예를 들면 신경 계통의 세포의 기능 및(또는) 생존에 대한 효과는 임의의 다음 검정법을 이용하여 입증되었다: (1) 배양된 척수 콜린 아세틸트랜스퍼라아제 ("ChAT") 검정; 또는 (2) 배양된 기저 전뇌 뉴런 ChAT 활성 검정.

본원에 사용된 용어 "효과"는 용어 "기능" 및 "생존"을 변형시키는데 사용될 때 양성 또는 음성 변형 또는 변화를 의미한다. 양성인 효과는 본원에서 "증강" 또는 "증강시키는"으로서 칭해지며, 음성인 효과는 본원에서 "억제" 또는 "억제시키는"으로서 칭해진다.

본원에 사용된 용어 "증강" 또는 "증강시키는"은 용어 "기능" 및 "생존"을 변형시키는데 사용될 때 가교 인데노피롤로카르바졸 화합물의 존재가 화합물 부재하의 세포에 비해 영양 인자 반응 세포의 기능 및(또는) 생존에 대해 양성 효과를 갖는다는 것을 의미한다. 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만 예를 들면 콜린성 뉴런의 생존에 대해서 보면 그러한 화합물로 처리된 집락이 비처리된 집락 보다 비교적 긴 기간의 기능성을 갖는다면, 그 화합물은 그러한 화합물이 존재하지 않는 콜린성 뉴런 집락에 비해 사멸될 위기에 있는 (예를 들면, 손상, 질병 상태, 변성 상태 또는 자연적 진행으로 인해) 콜린성 뉴런 집락의 생존을 증강시키는 것으로 입증될 것이다.

본원에 사용된 용어 "억제하는" 및 "억제"는 지정된 재료 (예를 들면, 효소 활성)의 특정 반응이 가교 인데노피롤로카르바졸 화합물의 존재 하에 비교적 감소되는 것을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "trk"는 trkA, trkB 및 trkC를 포함하는 고친화력 뉴로트로핀 수용체 족, 및 뉴로트로핀이 결합할 수 있는 다른 막 결합된 단백질을 의미한다.

본원에 사용된 VEGFR의 억제는 맥관형성이 역할을 하는 질병, 예를 들면 충실성 종양의 암, 자궁내막증, 당뇨성 망막증, 건선, 혈관아세포종, 및 다른 안구 질병 및 암에서 유용성을 나타낸다.

trk의 억제는 예를 들면 전립선 질병, 예를 들면 전립선암 및 양성 전립선 비대증, 및 염증성 통증의 치료에 유용성을 나타낸다.

혈소판 유도된 성장 인자 수용체 (PDGFR)의 억제는 예를 들면, 각종 형태의 신생물, 류머티스성 관절염, 폐 섬유증, 골수섬유증, 이상 상처 유합, 심장맥관 말단 지점에 의한 질병, 예를 들면 아테롬성 동맥경화증, 레스테노시스, 후-혈관형성술 레스테노시스 등에서 유용성을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "암" 및 "암성"은 포유동물에서 세포의 임의의 악성 증식을 의미한다. 그 예는 전립선, 양성 전립성 비대증, 난소, 유방, 뇌, 폐, 췌장, 결장직장, 위의, 위, 충실성 종양, 머리 및 목, 신경아세포종, 신장 세포암, 임파종, 백혈병, 조혈계의 다른 인지된 악성 종양, 및 다른 인지된 암을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "뉴런," "신경 계통의 세포" 및 "뉴런 세포"는 제한하는 것은 아니지만 단일 또는 다중 전달물질 및(또는) 단일 또는 다중 기능을 갖는 뉴런 유형의 불균질 집락을 포함하며, 이것은 바람직하게는 콜린성 및 감각 뉴런이다. 본원에 사용된 문구 "콜린성 뉴런"는 신경 전달물질이 아세틸콜린인 중추신경계 (CNS) 및 말초신경계 (PNS)의 뉴런을 의미하며, 그 예는 기저 전뇌, 선조체 및 척수 뉴런이다. 본원에 사용된 문구 "감각 뉴런"는 예를 들면, 피부, 근육 및 관절로부터의 환경 신호 (예를 들면, 온도, 운동)에 반응하는 뉴런을 포함하며, 그 예는 배근 신경절로부터의 뉴런이다.

본원에 정의된 용어 "영양 인자 반응 세포"는 영양 인자가 특이적으로 결합하는 수용체를 포함하는 세포이며, 그 예는 뉴런 (예를 들면, 콜린성 및 감각 뉴런) 및 비뉴런 세포 (예를 들면, 단핵세포 및 신생물 세포)를 포함한다.

본원에 기재된 가교 인데노피롤로카르바졸 화합물은 연구 및 치료 환경, 예를 들면 효소 활성의 억제에 유용성을 갖는다. 예를 들면, 연구 환경에서 그 화합물은 세린/트레오닌 또는 티로신 단백질 키나아제 (예를 들면, PKC, trk 티로신 키 나아제)의 억제가 관련 질환 및 질병의 기계학적 면에서 역할을 한다는 것을 더욱 잘 이해하기 위한 검정 및 모델의 개발에 이용될 수 있다. 치료 환경에서, 이들 효소 활성을 억제하는 화합물은 암과 같은 질환에 대해 효소의 유해한 결과를 억제하는데 이용될 수 있다.

하기 실시예에서 입증되는 바와 같이, 가교 인데노피롤로카르바졸 화합물을 이용한 효소 활성의 억제는 예를 들면 다음 검정법을 이용하여 확인될 수 있다:

1. trkA 티로신 키나아제 활성 억제 검정;

2. 완전 세포 제조에서의 NGF-자극된 trk 인산화 반응의 억제;

3. 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR) 키나아제 억제 검정;

4. PKC 활성 억제 검정;

5. PDGFR 억제 검정.

설명된 가교 인데노피롤로카르바졸 화합물은 포유 동물, 예를 들면 인간에서 뉴런 계통의 세포의 기능 및(또는) 생존을 증강시키는데 이용될 수 있다. 이 상황에서, 그 화합물은 개개로 또는 다른 융합된 피롤로카르바졸 및(또는) 인돌로카르바졸과 함께, 또는 지정된 세포의 기능 및(또는) 생존을 성취하는 능력을 갖는 것으로 입증된 다른 유익한 분자와 함께 이용될 수 있다.

각종 신경학적 질환은 사멸되고 있고, 손상되고, 기능적으로 손상되고, 축색돌기 변성되고, 사멸될 위기에 있는 뉴런 세포에 의해 특징지워진다. 이러한 질환은 제한되는 것은 아니지만 알쯔하이머병, 운동뉴런 질환 (예를 들면, 근위축성 측색경화증), 파킨슨씨병, 뇌혈관성 질환 (예를 들면, 졸중, 허혈), 헌팅톤씨병, AIDS 치매, 간질, 다발성 경화증, 당뇨성 신경병을 비롯한 말초 신경병 (예를 들면, 화학요법 관련된 말초 신경병에서 DRG 뉴런에 영향을 미치는 것), 여기성 아미노산에 의해 유도되는 질환, 및 뇌 또는 척수에 대한 진탕증 또는 관통상과 관련된 질환을 포함한다.

ChAT는 신경전달물질 아세틸콜린의 합성을 촉매하며, 그것은 기능적 콜린성 뉴런에 대한 효소적 마커로서 간주된다. 기능적 뉴런은 생존할 수도 있다. 뉴런 생존은 살아있는 뉴런에 의한 염료의 특정 흡수 및 효소적 전환 (예를 들면, 칼세인 AM)의 정량화에 의해 검정된다.

본 발명의 방법에 의해 확인되는 화합물을 비롯한 본원에 기재된 화합물은 그의 변화된 유용성으로 인해 각종 환경에서 유용성을 갖는다. 그 화합물은 뉴런 세포 생존, 기능, 확인의 시험관내 모델의 개발에 또는 본원에 기재된 화합물 또는 본 발명의 방법에 의해 확인되는 화합물의 활성과 유사한 활성을 갖는 다른 합성 화합물을 스크리닝하는데 이용될 수 있다. 본원에 기재된 화합물 및 본 발명의 방법에 의해 확인되는 화합물은 기능적 반응과 관련된 분자 표적을 연구하고, 정의하고 확인하기 위해 연구 환경에 이용될 수 있다. 유도체가 결합하는 표적은, 예를 들면 가교 인데노피롤로카르바졸 화합물 또는 특이 세포 기능 (예를 들면, 유사분열생식)과 관련된 본 발명의 방법에 의해 확인되는 화합물을 방사표지함으로써 특징화를 위해 확인되고, 분리되고 정제될 수 있다.

본원에 기재된 화합물 및 본 발명의 방법에 의해 확인되는 화합물은 영양 반응성 세포, 예를 들면 콜린성 뉴런의 영양 인자 유도된 활성을 증강시키는데 유용할 뿐만 아니라 다른 뉴런 세포 유형, 예를 들면 도파민 작용성 또는 글루타메이트 작용성에 대한 생존 촉진제로서 기능할 수 있다. 성장 인자는 제한하는 것은 아니지만 ras, rac 및 cdc42 (Denhardt, Biochem. J., 1996, 318, 729)를 포함하는 작은 GTP 결합 단백질의 캐스케이드 하단을 시그날링시킴으로써 뉴런의 생존을 조절할 수 있다. 특별하게는, ras의 활성화는 생물학적 성장 및 분화 공정에 관련된, 세포외 수용체 활성화된 키나아제 (ERK)의 인산화 반응 및 활성화를 유도한다. rac/cdc42의 자극은 스트레스, 아포프토시스 및 염증과 관련된 반응인 JNK 및 p38의 활성화의 증가를 유도한다. 성장 인자 반응이 주로 ERK 경로를 통해 이루어지긴 하지만, 이러한 후자의 과정에 영향을 미치는 것은 성장 인자 증강 생존 특성을 모사할 수 있는 뉴런 생존의 또다른 기전을 유도할 수 있다 (Xia et al., Science, 1995, 270, 1326). 그 화합물은 성장 인자 매개된 생존과 관련되지만 그것과 구별되는 기전, 예를 들면 아포프토틱 세포 사멸 과정의 억제에 의한 생존을 유도할 수 있는 JNK 및 p38 경로의 억제에 의해 뉴런 및 비뉴런 세포에 대한 생존 촉진제로서 기능할 수도 있다.

본 발명의 화합물은 감소된 ChAT 활성 또는 척수 운동뉴런에 대한 사멸, 손상과 관련된 질환의 치료에 유용하며, 또한 면역계, 중추 및 말초신경계의 아포프토틱 세포 사멸와 관련된 질병 및 염증 질병에 유용성을 갖는다.

본원에 기재된 화합물은 악성 종양 세포 증식을 포함한 질병 상태, 예를 들면 많은 암의 치료에 유용성을 가질 수도 있다.

본원에 기재된 화합물 및 본 발명의 방법에 의해 확인되는 화합물의 제약학상 허용되는 염은 제약학상 허용되는 산 부가 염, 금속염, 암모늄염, 유기 아민 부가염 및 아미노산 부가염을 포함한다. 산 부가염의 예는 무기 산 부가염, 예를 들면 염산염, 황산염 및 인산염, 및 유기 산 부가염, 예를 들면 아세테이트, 말레에이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 시트레이트 및 락테이트이며, 금속염의 예는 알칼리 금속염, 예를 들면 리튬염, 나트륨염 및 칼륨염, 알칼리 토금속염, 예를 들면 마그네슘염 및 칼슘염, 알루미늄염 및 아연염이며; 암모늄염의 예는 암모늄염 및 테트라메틸암모늄염이며; 유기 아민 부가염의 예는 모르폴린 및 피페리딘과의 염이며; 아미노산 부가염의 예는 글리신, 페닐알라닌, 글루탐산 및 리신과의 염이다.

본 발명의 방법에 의해 확인되는 화합물을 비롯한 본원에 기재된 화합물은 제약학상 허용되는 비독성 부형제 및 담체와 배합되어 제약 조성물로 조제될 수 있다. 그러한 조성물은 비경구 투여에, 특히 액상 용액 또는 현탁액 형태로; 또는 경구 투여에, 특히 정제 또는 캡슐 형태로; 또는 비강내로, 특히 분제, 비점액 또는 에어로졸 형태로; 또는 경피로, 예를 들면 경피 패치를 통해 사용하기 위해 제조될 수 있다.

조성물은 단위 투여 형태로 용이하게 투여될 수 있으며, 예를 들면 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980)에 기재된, 제약업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 비경구 투여용 조제는 통상의 부형제로서 멸균수 또는 식염수, 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 오일 및 식물성, 수소첨가된 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 특히, 생적합성, 생분해성 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체 또는 폴리옥시에 틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체는 활성 화합물의 방출 조절을 위한 유용한 부형제일 수 있다. 이들 활성 화합물에 대한 잠재적으로 유용한 다른 비경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투 펌프, 내이식성 주입 시스템 및 리포좀을 포함한다. 흡입 투여용 조제는 부형제로서 예를 들면 락토오스를 함유하거나, 또는 예를 들면 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트 및 데옥시콜레이트를 함유하는 수용액, 또는 비점액 형태로 투여하기 위한 또는 비강내로 도포되기 위한 겔로서의 오일상 용액일 수 있다. 비경구 투여용 조제는 또한 구강 투여를 위해 글리코콜레이트를, 직장 투여를 위해 살리실레이트를 또는 질내 투여를 위해 시트르산을 포함할 수도 있다. 경피 패치용 조제는 바람직하게는 친지성 에멀젼이다.

본 발명의 화합물은 제약 조성물에 단독 활성 제제로서 이용될 수 있다. 또한, 그 화합물은 다른 활성 성분, 예를 들면 질병 또는 질환에서 뉴런 생존 또는 축색돌기 재생을 용이하게 하는 다른 성장 인자와 함께 이용될 수 있다.

본 발명의 화합물 및 그의 제약학상 허용되는 염은 경구로 또는 비경구로, 예를 들면 연고 또는 주사로서 투여될 수 있다. 치료 조성물 내의 본 발명의 화합물의 농도는 변화될 수 있다. 그 농도는 인자, 예를 들면 투여될 약물의 총 투여량, 이용되는 화합물의 화학적 특성 (예를 들면, 소수성), 투여 경로, 환자의 연령, 체중 및 증상 등에 좌우될 것이다. 본 발명의 화합물은 전형적으로 비경구 투여를 위해 약 0.1 내지 10% w/v 화합물을 함유하는 생리학적 완충 수용액으로 제공된다. 전형적인 투여량 범위는 1일에 약 1 ㎍/체중 ㎏ 내지 약 1 g/체중 ㎏이며; 바람직한 투여량 범위는 1일에 약 0.01 ㎎/체중 ㎏ 내지 100 ㎎/체중 ㎏, 바람직하게는 1일에 1 내지 4회 약 0.1 내지 20 ㎎/체중 ㎏이다. 투여될 약물의 바람직한 투여량은 변수, 예를 들면 질병 또는 질환의 유형 및 진행 정도, 특정 환자의 전체 건강 상태, 선택된 화합물의 상대적인 생물학적 효능, 화합물 부형제의 제형 및 그의 투여 경로에 좌우될 것이다.

시험 화합물 및 본 발명의 방법에 의해 확인되는 화합물을 비롯한 본 발명의 화합물 및 그의 제약학상 허용되는 염은 약리학적 활성 및 투여 목적에 따라서 단독으로 또는 각종 제약 조성물 형태로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 제약 조성물은 활성 성분으로서 유효량의 화합물 또는 그의 제약학상 허용되는 염을 제약학상 허용되는 담체와 균일하게 혼합함으로써 제조될 수 있다. 담체는 투여에 적합한 조성물 형태에 따라서 광범위한 형태를 취할 수 있다. 그러한 제약 조성물은 경구 또는 비경구 투여에 적합한 단위 투여 형태로 제조되는 것이 바람직하다. 비경구 투여 형태는 연고 및 주사를 포함한다.

정제는 부형제, 예를 들면 락토오스, 글루코오스, 수크로오스, 만니톨 및 메틸 셀룰로오스, 붕해제, 예를 들면 전분, 알긴산 나트륨, 칼슘 카르복시메틸 셀룰로오스 및 결정성 셀룰로오스, 윤활제, 예를 들면 스테아르산 마그네슘 및 활석, 결합제, 예를 들면 젤라틴, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스 및 메틸 셀룰로오스, 계면활성제, 예를 들면 수크로오스 지방산 에스테르 및 소르비톨 지방산 에스테르 등을 사용하여 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 각 정제는 활성 성분 15 내지 300 ㎎을 함유하는 것이 바람직하다.

과립은 부형제, 예를 들면 락토오스 및 수크로오스, 붕해제, 예를 들면 전분, 결합제, 예를 들면 젤라틴 등을 사용하여 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 분제는 부형제, 예를 들면 락토오스 및 만니톨 등을 사용하여 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 캡슐은 젤라틴, 물, 수크로오스, 아라비아 고무, 소르비톨, 글리세린, 결정성 셀룰로오스, 스테아르산 마그네슘, 활석 등을 사용하여 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 각 캡슐은 활성 성분 15 내지 300 ㎎을 함유하는 것이 바람직하다.

시럽 조제는 당, 예를 들면 수크로오스, 물, 에탄올 등을 사용하여 통상의 방법으로 제조될 수 있다.

연고는 연고 기재, 예를 들면 바셀린, 액상 파라핀, 라놀린 및 마크로골, 유화제, 예를 들면 소듐 라우릴 락테이트, 염화 벤즈알코늄, 소르비탄 모노지방산 에스테르, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 및 아라비아 고무 등을 사용하여 통상의 방법으로 제조될 수 있다.

주사 조제는 용매, 예를 들면 물, 생리 식염수, 식물유 (예를 들면, 올리브유 및 땅콩유), 에틸 올레에이트 및 프로필렌 글리콜, 가용화제, 예를 들면 벤조산 나트륨, 살리실산 나트륨 및 우레탄, 등장성 제제, 예를 들면 염화 나트륨 및 글루코오스, 보존제, 예를 들면 페놀, 크레졸, p-히드록시벤조산 에스테르 및 클로로부탄올, 항산화제, 예를 들면 아스코르브산 및 피로아황산 나트륨 등을 사용하여 통상의 방법으로 제조될 수 있다.

본 발명은 그것을 명료하게 하기 위한 다음 실시예에 의해 더 예시된다. 이 실시예는 설명의 범위를 제한하는 것으로 의도되거나 또는 해석되어서는 안된다.

실시예 1: 합성 방법 및 실시예의 일반적인 설명

화학식 II의 본 발명의 가교 인데노피롤로카르바졸을 제조하는데 이용되는 일반적인 합성 경로는 도 1 및 2에 나타나 있다. 인데노피롤로카르바졸 (III)/(VIII) 합성에 대한 일반적인 절차는 본원에 전반적으로 참고로 포함된 미국 특허 제5,705,511호에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. R¹이 H일 때, 인데노피롤로카르바졸 (III)/(VIII)의 락탐 질소는 적절한 보호기로 보호되어 화합물 (IV)/(IX)를 형성하게 된다. 보호된 화합물은 무수 유기 용매(들) 중의 적절한 염기로 처리되어 카르바니온으로 생각되는 암적색 용액이 형성된다. 카르바니온과 이관능성 시약 (V)의 반응 결과 (V)의 C=Y 결합에 친전자성 부가가 일어나서 초기 중간체 (VI)/(X)가 형성된다. 중간체(들) (VI)/(X) 및(또는) (VII)/(XI)의 술폰산 또는 루이스산, 예를 들면 보론 트리플루오라이드 에테레이트에 의한 처리 결과 가교 인데노피롤로카르바졸 (I)/(II)가 형성된다.

락탐 질소 보호 방법 (도 3 및 4에 나타냄)은 산 또는 염기 촉매된 과정에 의해 실시될 수 있다. 산 촉매된 반응은 폴리스티렌 기재 링크 산 수지 (XII)와 같은 중합체 지지체에 대한 인데노피롤로카르바졸 (III)/(VIII)의 고정을 가능하게 하는 수지 결합 시약으로 수행되어 화합물 (XIII)이 형성된다 (도 3). 또한, 산 촉매된 반응은 가용성 제제로 수행되어 화합물 (XIV)가 형성된다 (도 4). 실릴 보 호된 화합물 (XV)는 염기 촉매화 하에 생성된다 (도 4).

도 5는 중간체 (V)의 몇가지 제조 방법을 기재한다. 절차 (a)는 각종 아세탈 (XVI)의 (XVII, Z=결합)로의 변형을 기재한다. 예를 들면, 에스테르-아세탈/케탈 (XVI, D=COOR)은 상응하는 알코올로 완전히 환원되고 이어서 알데히드-아세탈/케탈 (XVII, R⁸=H)로 산화 (예를 들면, 스원 (Swern) 또는 데스-마틴 (Dess-Martin) 산화)된다. 또한, 알데히드-아세탈/케탈 (XVI, D=COOR)은 DIBAL로 부분적으로 환원되어 알데히드 (XVII, R⁸=H)가 직접 얻어진다. 마찬가지로, 니트릴-아세탈 (XVI, D=CN)의 DIBAL에 의한 환원은 알데히드 (XVII, R⁸=H)를 형성한다. 케토-아세탈/케탈은 그리냐르 시약을 웨인레브 (Weinreb) 아미드-아세탈/케탈 (XVI, D=CON(OMe)Me)에 첨가함으로써 제조된다.

중간체 (XVII, Z=결합)는 또한 절차 (b)에 개략된 2단계 절차에 의해 얻어질 수도 있다. 유기금속 시약 (XIX)을 아세탈/케탈 (XVIII)에 첨가하여 알켄 (XX)을 형성하며 그것을 가오존분해에 이어서 환원성 가공하여 케토-아세탈/케탈 (XVII)을 얻는다. 2단계 절차에 의한 중간체 (XVII, Z=이종 원자)의 제조는 절차 (c)에 개략되어 있다. 아세탈 (XXII)와 알켄 (XXI)의 커플링에 이어서 형성된 알켄을 가오존분해 (환원성 가공과 함께)하여 케토-아세탈/케탈 (XVII)을 얻는다. 별법으로, 중간체 (XVII, Z=이종 원자)는 절차 (d)에 개략된 2단계 절차에 의해 제조된다. 화합물 (XXIV)와 아세탈/케탈 (XVIII)의 반응 결과 (XXV)가 형성되며, 그것은 절차 (a)에 기재된 방법에 의해 케토-아세탈/케탈 (XVII)로 변형된다. 케토-아세탈/케 탈 (XVII)을 히드록실아민, 히드라진, N-알킬-N-알콕시아민 및 아민과 축합시키면 친전자성 C=N 관능성을 갖는 중간체 (XXVI)이 형성된다.

수지 결합 인데노피롤로카르바졸 (XIII) (도 6, 방법 A)을 염기로서 과량의 그리냐르 시약으로 처리하면 카르바니온의 암적색 용액이 형성된다. 이후의 (V)와의 반응은 C=Y 기에 대한 친전자성 부가로부터 유래된 생성물을 유도한다. 희석 산 (염화 메틸렌 중의 1% TFA)에 의해 생성물(들)을 수성 작업하고 수지로부터 분해시키면 화합물 (XXVII) 및(또는) (XXVIII)의 분리가 일어난다. 술폰산 또는 루이스산, 예를 들면 보론 트리플루오라이드 에테레이트에 의해 중간체들 (XXVII) 및(또는) (XXVIII)을 처리하면 가교 인데노피롤로카르바졸 (II)가 제공된다.

유사한 방법이 가용성 락탐 보호된 중간체, 예를 들면 (XV)의 반응 (도 7, 방법 B)에 이용된다. 그러나, 이 경우에 중간체 (XV)는 그리냐르 시약 대신에 염기로서 피리딘 중의 트리톤 B로 처리된다. 중간체(들) (XXIX) 및(또는) (XXX)은 완전한 락탐 보호기를 가진 채로 분리될 수 있으며, 그것은 크로마토그래피 정제될 수 있다. 방법 A (도 6)에서, 루이스산 (예를 들면, 보론 트리플루오라이드 에테레이트)에 의해 처리하면 가교 인데노피롤로카르바졸 (II) (여기에서, R¹=H임)가 형성된다.

R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶ 기의 도입은 본원에 전반적으로 참고로 포함된 미국 특허 제5,705,511호 및 4,923,986호에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. R³ 치환체는 도 8에 나타낸 바와 같이 가교 인데노피롤로카르바졸의 제조 후에 도입될 수 있다. B 고리의 3 위치는 NBS로 브롬화되어 화합물 (XXXI)이 형성된다. 이어서, 팔라듐-촉매된 스틸 (Stille), 스즈끼 (Suzuki), 헥크 (Heck), 쿠마다 (Kumada) 또는 카스트로-스테펜스 (Castro-Stephens) 반응에 의해 탄소 단편이 도입되어 (XXXII), (XXXIII) 등의 유형의 화합물이 제공된다. 또한, 화합물 (XXXI)은 부흐발드 (Buchwald's) 팔라듐 촉매된 아미노화 화학에 의해 브롬 기가 이종 원자, 예를 들면 아민 기재 기로 대체된 화합물을 제공할 수 있다.

도 9에 나타낸 바와 같이 산화 과정에 의해 산소 결합된 기가 E 고리의 인덴 탄소에서 도입되어 화합물 (XXXIV)가 형성된다. 이 방법에서는 또한 락탐 (A 고리)의 메틸렌 기의 산화가 일어나서 나타낸 바와 같은 이미드 유도체가 제공된다.

실시예 2: 링크 수지 결합 중간체: (XIII-A), (XIII-B) 및 (XIII-C)의 제조 (도 3)

실시예 2-A

오버헤드 기계적 교반기 및 딘-스타크 (Dean-Stark) 트랩이 장치된 3구 둥근 바닥 플라스크를 링크 산 수지 XII (10.00 g, 0.64 mmol/g), 1-메틸-2-피롤리디논 (80 mL), 벤젠 (350 mL), VIII-A (A¹,A²=H₂, B¹,B²=O, R³=R⁴=R⁵=R⁶=H) (3.00 g) 및 p-톨루엔술폰산 (1.00 g)으로 순차적으로 채웠다. 반응 혼합물을 20시간 동안 가온 환류시키고 그후에 여과시켰다. 수지를 THF (5 x 175 mL)로 세척하고 여액을 분리해 두었다. 수지를 DMSO (4 x 100 mL), 2% NaHCO₃ 수용액 (4 x 100 mL), 물 (4 x 100 mL), DMSO (2 x 200 mL), THF (4 x 100 mL) 및 에틸 아세테이트 (4 x 100 mL)로 순차적으로 세척하였다. 수지를 감압 하에 (24시간) 건조시켜 수지 결합 화합 물 VIII-A, (XIII-A) 11.70 (0.47 mmol/g)을 얻었다.

원래 THF 세척액을 증발시키고, 잔류물을 물 (750 mL)로 희석시키고, 형성된 침전물을 여과시키고, 물, 2% NaHCO₃ 수용액 (4 x 100 mL) 및 물 (4 x 100 mL)로 순차적으로 세척하였다. 감압 하에 건조시킨 후에, VIII-A (1.28 g)를 회수하였다.

실시예 2-B

유사한 방법으로, VIII-B (A¹,A²=O, B¹,B²=H₂, R ³=R⁴=R⁵=R⁶=H) (0.5 g)를 링크 산 수지 XII (1.52 g)에 커플링시켜 수지 결합 화합물 VIII-B, (XIII-B) 1.58 g을 얻었다.

실시예 2-C

유사한 방법으로, VIII-C (A¹,A²=H₂, B¹,B²=O, R ³=R⁴=R⁵=H, R⁶=10-OMe) (1.02 g)를 링크 산 수지 XII (3.12 g)에 커플링시켜 회수된 화합물 VIII-C (0.44 g)과 함께 수지 결합 화합물 VIII-C, (XIII-C) 3.70 (0.46 mmol/g)을 얻었다.

실시예 3: 화합물 (II-1), 화합물 (II-2), 화합물 (II-3), 화합물 (II-4a), 화합물 (II-4b), 화합물 (II-6) 및 화합물 (II-8)의 제조 (방법 A, 도 6)

실시예 3-A

THF (24 mL) 중의 (XIII-A) (1.25 g)의 현탁액에 EtMgBr의 1.0 M 용액 (THF 중의 6.25 mL)을 첨가하고 반응물을 HMPA (5.0 mL)를 첨가하기 전에 1시간 동안 교반시켰다. 10분 동안 교반시킨 후에, 디에톡시부티르알데히드 (문헌 (Paquette, et al., J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 9662-71)의 절차에 따라 제조됨) (3.0 g)를 첨가하고 반응물을 20시간 동안 교반시켰다. 반응물을 10% NH₄Cl 수용액 (5 mL)로 급냉시키고 여과시켰다. 수지를 10% NH₄Cl 수용액 (3 x 10 mL), 물 (3 x 10 mL), THF (3 x 10 mL), DMF (3 x 10 mL), 물 (3 x 10 mL), THF (3 x 10 mL) 및 에테르 (3 x 10 mL)로 순차적으로 세척하였다. 수지를 감압 하에 건조시키고, 염화 메틸렌 (15 mL)에 흡수시키고, 트리플루오로아세트산 (0.15 mL)으로 처리하였다. 1시간 동안 교반시킨 후에, 반응물을 여과시키고, 여액을 증발시켰다. 형성된 잔류물을 염화 메틸렌 (20 mL)에 흡수시키고, 피리디늄 토실레이트 (50 ㎎)으로 처리하고 형성 용액을 4시간 동안 교반시켰다. 이때에, 반응물을 NaHCO₃ 포화 수용액 및 염수로 세척하고 MgSO₄ 상에서 건조시켰다.

여과 및 용매 증발 후에, 잔류물을 정제 HPLC (Zorbax RX-8, 4 x 25 ㎝, 60% MeCN/물 w/0.1% 트리플루오로아세트산으로 용출됨)에 의해 정제하였다. 적절한 분별물을 NaHCO₃로 중화시키고, 염화 메틸렌 (3 x 50 mL)으로 추출하고 MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 여과 및 용매 증발 후에, 화합물 (II-1) 70.2 ㎎을 다음 특성을 갖는 백색 분말로서 얻었다.

¹³C NMR (DMSO-d₆) δ171.8, 143.3, 142.4, 141.4, 140.1, 140.0, 136.6, 129.2, 127.9, 127.4, 127.1, 126.8, 124.1 (2C), 122.7, 121.6, 121.5, 118.3, 112.1, 88.1, 79.2, 56.6, 45.6, 33.4, 24.8;

¹H NMR (DMSO-d₆) δ9.21 (d, J=7.5, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.98 (d, J=7.7, 1H), 7.86 (d, J=8.3, 1H), 7.71 (d, J=7.3, 1H), 7.49 (dd, J=7.9,7.4, 1H), 7.41 (dd, J=7.5,7.4, 1H), 7.36-7.27 (m, 2H), 6.86 (d, J=6.0, 1H), 5.63-5.58 (m, 1H), 4.91 (s, 2H), 4.53 (d, J=3.3, 1H), 2.23-2.14 (m, 1H), 1.96-1.92 (m, 1H), 0.96-0.88 (m, 1H), 0.60-0.57 (m, 1H);

MS m/z (M+H): 계산치 379, 실측치 379.

이 반응 생성물 혼합물을 정제 HPLC에 의해 분리하여 다음 특성을 갖는 화합물 (II-2) (0.5 ㎎)을 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆) δ9.17 (d, J=8.1, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.98 (d, J=7.0, 1H), 7.85 (d, J=6.8, 1H), 7.57 (d, J=6.8, 1H), 7.49 (dd, J=7.9,7.4, 1H), 7.44-7.26 (m, 3H), 6.81 (d, J=6.0, 1H), 5.43-5.33 (m, 1H), 4.43 (s, 2H), 2.23-2.14 (m, 1H), 1.96-1.92 (m, 1H), 1.45-1.55 (m, 2H), 0.96-0.88 (m, 1H), 0.60-0.57 (m, 1H), 0.29 (t, J=7.0, 3H);

MS m/z (M+H): 계산치 407, 실측치 407.

실시예 3-B

화합물 (II-1)에 대해 상기한 바와 유사한 방법으로 수지 (XIII-A) (70.3 ㎎)을 1,1-디에톡시-2-펜타논 (문헌 (Sworin, et al., J. Org. Chem., 1988, 53, 4894-6)에 기재된 절차에 따라 제조됨) (0.75 mL)으로 처리하고 정제 TLC (실리카 겔, 50% EtOAc/톨루엔으로 용출됨)에 의해 분리하여 다음 특성을 갖는 화합물 II-3 (3.5 ㎎)을 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆) δ9.42 (d, J=8.2, 1H), 8.58 (s, 1H), 7.95 (d, J=7.4, 1H), 7.79 (d, J=8.3, 1H), 7.71 (d, J=7.1), 7.50-7.20 (m, 4H), 6.81 (d, J=5.9, 1H), 4.90 (s, 2H), 4.46 (s, 1H), 2.35-2.20 (m, 1H), 1.98 (s, 3H), 1.75-1.60 (m, 1H), 1.25-1.00 (m, 1H), 0.35-0.15 (m, 1H);

MS m/z (M+H): 계산치 393, 실측치 393.

실시예 3-C

유사한 방법으로 (XIII-A) (74.3 ㎎)를 1,1-디에톡시-2-헥사논 (문헌 (Brenner, J. Org. Chem., 1961, 26, 22-7)에 기재된 절차에 따라 제조됨) (0.75 mL)로 처리하고 정제 HPLC (Zorbax RX-8, 4 x 25 ㎝, 65% MeCN/물 w/0.1% 트리플루오로아세트산)에 의해 개개로 분리하여 화합물 II-4a (2.10 ㎎) 및 화합물 II-4b (1.06 ㎎)을 얻었다.

화합물 II-4a는 다음 특성을 갖는다:

¹H NMR (DMSO-d₆) δ9.30 (d, J=8.3, 1H), 8.55 (s, 1H), 7.97 (d, J=7.2, 1H), 7.65 (d, J=8.5, 1H), 7.59 (d, J=7.5), 7.48 (dd, J=7.8,7.2, 1H), 7.39-7.15 (m, 3H), 6.31 (dd, J=5.9,5.5, 1H), 5.02 (s, 1H), 4.88 (s, 2H), 0.88 (s, 3H) 다른 지방족 시그날은 용매 하에 피이크를 손실하였다:

MS m/z (M+H): 계산치 407, 실측치 407.

화합물 II-4b는 다음 특성을 갖는다:

¹H NMR (DMSO-d₆) δ9.43 (d, J=8.1, 1H), 8.59 (s, 1H), 7.99 (d, J=7.3, 1H), 7.75-7.65 (m, 2H), 7.49 (dd, J=7.0,6.4, 1H), 7.43 (dd, J=8.2,8.1, 1H), 7.36-7.25 (m, 2H), 6.75 (s, 1H), 4.91 (s, 2H), 4.50 (s, 1H), 1.95 (s, 3H) 다른 지방족 시그날은 용매 하에 피이크를 손실하였다:

MS m/z (M+H): 계산치 407, 실측치 407.

실시예 3-D

유사한 방법으로 (XIII-C) (1.00 g)을 디에톡시부티르알데히드 (3.65 g)으로 처리하고 정제 HPLC (Zorbax RX-8, 2.5 x 25 ㎝, 65% MeCN/물 w/0.1% 트리플루오로아세트산)에 의해 분리하여 다음 특성을 갖는 화합물 II-6 (87.8 ㎎)을 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆) δ9.09 (d, J=8.6, 1H), 8.60 (s, 1H), 7.95 (d, J=7.4, 1H), 7.84 (d, J=8.3, 1H), 7.47 (dd, J=7.2,7.0, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.29 (dd, J=7.0,7.0, 1H), 6.98 (dd, J=8.6,1.9, 1H), 6.83 (d, J=6.0, 1H), 5.65-5.55 (m, 1H), 4.88 (s, 2H), 4.48 (d, J=3.9, 1H), 3.82 (s, 3H), 2.25-2.10 (m, 1H), 2.08-1.85 (m, 1H), 0.96-0.75 (m, 1H), 0.65-0.50 (m, 1H);

MS m/z (M+Na): 계산치 431, 실측치 431.

실시예 3-E

유사한 방법으로 수지 (XIII-B) (153.2 ㎎)를 디에톡시부티르알데히드 (1.5 mL)로 처리하고 정제 HPLC (Zorbax RX-8, 2.5 x 25 ㎝, 65% MeCN/물 w/0.1% 트리플루오로아세트산)에 의해 분리하여 다음 특성을 갖는 화합물 II-8 (3.6 ㎎)을 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆) δ9.09 (d, J=7.9, 1H), 8.81 (s, 1H), 7.81-7.73 (m, 3H), 7.48-7.35 (m, 3H), 7.24 (dd, J=7.6,7.5, 1H), 6.85 (d, J=6.2, 1H), 5.63-5.59 (m, 1H), 4.86 (s, 2H), 4.61 (d, J=3.6, 1H), 3.82 (s, 3H), 2.21-2.13 (m, 1H), 1.96-1.90 (m, 1H), 0.87-0.79 (m, 1H), 0.61-0.56 (m, 1H);

MS m/z (M+H): 계산치 379, 실측치 379.

실시예 4: 화합물 (II-7a) 및 화합물 (II-7b)의 제조 (방법 A, 도 6)

실시예 4-A

(1,1-디에톡시에톡시)아세톤의 제조

THF (150 mL) 중의 NaH (2.68 g, 60%)의 냉각 (0 ℃) 현탁액에 THF (20 mL) 중의 1,1-디에톡시에탄올 (문헌 (Zirkle, et al., J. Org. Chem., 1961, 26, 395-407)에 기재된 절차에 따라 제조됨) (9.00 g)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 염화 메틸렌 (8.0 mL)를 첨가하기 전에 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 밤새 가열 환류시키고, 냉각시키고 셀라이트 마개를 통해 여과시켰다. 용매를 회전 증발시켜 제거하고, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (실리카, 20% 에테르/헥산)에 의해 정제하여 1,1-디에톡시에틸 메탈릴 에테르 (11.5, 90%)를 얻 었다. 이 에테르 (6.00 g)의 EtOAc (80 mL) 중의 냉각 (-30 ℃) 용액의 가오존분해를 출발 물질이 TLC (1시간)에 의해 검출되지 않을 때 까지 수행하였다. 이때에, 반응물을 산소로 정화시키고, Pd(OH)₂ (150 ㎎)로 처리하고 수소 대기 하에 밤새 교반시켰다. 촉매를 여과시켜 제거하고 여액을 회전 증발시켜 농축시켰다. 형성된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (실리카, 20% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 표제 화합물 (4.53 g, 82%)을 얻었다.

실시예 4-B

방법 A (도 6)에 따라서, 수지 (XIII-A) (230.2 ㎎)를 EtMgBr (1.25 mL)에 이어서 (1,1-디에톡시에톡시)아세톤 (실시예 3-A) (1.2 mL)으로 처리하였다. 가공하고 수지로부터 분해시킨 후에, 조 반응 생성물 혼합물 (10.5 ㎎)의 일부를 염화 메틸렌 (20 mL)에 흡수시키고 BF₃ 에테레이트 (20 μL)로 처리하였다. 2.5시간 동안 교반시킨 후에, 그 용액을 MgSO₄ 상에서 건조시키기 전에 NaHCO₃ 포화 수용액 및 염수로 세척하였다. 여과 및 용매 제거 후에, 형성된 잔류물을 정제 HPLC (Zorbax RX-8, 4 x 25 ㎝, 65% MeCN/물 w/0.1% 트리플루오로아세트산)에 의해 정제하여 화합물 II-7a (2.34 ㎎) 및 화합물 II-7b (1.34 ㎎)를 얻었다.

화합물 II-7a는 다음 특성을 갖는다.

¹H NMR (CDCl₃) δ9.35-9.20 (m, 1H), 7.87 (d, J=7.6, 1H), 7.62 (d, J=7.0, 1H), 7.60-7.45 (m, 1H), 7.49 (dd, J=7.7,7.5, 1H), 7.40 (d, J=8.1, 1H), 7.37-7.26 (m, 3H), 6.22 (s, 1H), 5.20-4.85 (m, 1H), 4.47 (s, 1H), 3.67 (d, J=12.7, 1H), 3.52 (d, J=11.8, 1H), 3.40 (d, J=12.7, 1H), 3.38 (d, J=11.8, 1H), 1.91 (s, 3H);

MS m/z (M+H): 계산치 409, 실측치 409.

화합물 II-7b는 다음 특성을 갖는다.

¹H NMR (CDCl₃) δ9.58-9.22 (m, 1H), 7.82 (d, J=7.4, 1H), 7.60-7.40 (m, 3H), 7.37-7.27 (m, 3H), 7.21 (d, J=8.1, 1H), 5.81 (s, 1H), 5.21 (s, 1H), 5.10-4.80 (m, 1H), 4.59 (d, J=13.5, 1H), 4.38 (dd, J=13.5,5.3, 1H), 4.21 (d, J=13.1, 1H), 3.82 (d, J=13.2, 1H), 1.13 (s, 3H);

MS m/z (M+H): 계산치 409, 실측치 409.

실시예 5: 화합물 II-5의 제조 (도 8)

THF (2 mL) 중의 화합물 (II-1) (8.1 ㎎)의 용액에 NBS (4.6 ㎎)를 첨가하고, 반응물을 밤새 교반시켰다. 추가의 NBS (4.5 ㎎)를 첨가하고, 반응물을 2.5시간 동안 교반시켰다. 불용성 재료를 여과시켜 제거하고 여액을 회전 증발시켜 농축시켰다. 형성된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (C-18, 65% MeCN/물 w/0.1% 트리플루오로아세트산)에 의해 정제하였다. 적절한 분별물을 NaHCO₃로 중화시키고, 염화 메틸렌 (3 x 20 mL)으로 추출하고 MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 여과 및 용매 증발 후에, 화합물 (II-5) 5.1 ㎎을 다음 특성을 갖는 백색 분말로서 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆) δ9.22 (d, J=7.4, 1H), 8.67 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.86 (d, J=8.7, 1H), 7.72 (d, J=7.0, 1H), 7.63 (d, J=7.8, 1H), 7.42 (dd, J=7.5,7.3, 1H), 7.35 (dd, J=7.3,7.2, 1H), 6.86 (d, J=6.0, 1H), 5.63-5.58 (m, 1H), 4.94 (s, 2H), 4.54 (d, J=3.1, 1H), 2.30-2.14 (m, 1H), 2.00-1.82 (m, 1H), 0.96-0.88 (m, 1H), 0.62-0.50 (m, 1H);

MS m/z (M+H): 계산치 457/9 (1:1), 실측치 457/9 (1:1).

실시예 6: 중간체 XV의 제조 (도 4)

DMF (25 mL) 중의 화합물 (VIII-A) [A¹,A²=H₂, B¹,B²=O, R³=R⁴=R⁵=R⁶=H] (1.05 g)의 용액에 트리에틸아민 (0.75 mL) 및 t-부틸디메틸실릴 클로라이드 (TBS-Cl) (0.65 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 교반시킨 후에, 반응물을 NaHCO₃ 포화 수용액으로 급냉시키고 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 물 및 염수로 세척하고 MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 여과 및 용매 증발 후에, 형성된 잔류물을 에테르로 연화시켜 화합물 (XV) (848 ㎎)을 얻었다. 세척액을 증발시켜 남겨진 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (실리카, 1% EtOAc/CH₂Cl₂)에 의해 정제하여 다음 특성을 갖는 추가 생성물 (502 ㎎, 총합 수율 94%)을 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆) δ11.94 (s, 1H), 9.32 (d, J=7.6, 1H), 8.03 (d, J=7.7, 1H), 7.64 (d, J=7.2, 1H), 7.58 (d, J=8.1, 1H), 7.44 (dd, J=7.7,7.6, 1H), 7.39 (dd, J=7.7,7.6, 1H), 7.32 (d, J=7.3, 1H), 7.25 (dd, J=7.6,7.3, 1H), 5.00 (s, 2H), 4.14 (s, 2H), 0.99 (s, 9H), 0.46 (s, 6H);

MS m/z (M+H): 계산치 425, 실측치 425.

실시예 7: 방법 B를 통한 화합물 (II-1)의 제조 (도 7)

메탄올 (10 mL) 중의 트리톤 B의 40% 용액을 피리딘 (10 mL)에 용해시켜 피리딘 (0.45 M) 중의 트리톤 B의 용액을 제조하였다. 최종 용적이 ~8 mL가 되도록 용매를 감압 (20 mm Hg) 하에 제거하였다. 잔류물을 피리딘으로 50 mL까지 희석시키고, 여과시키고 질소 하에 저장하였다. 피리딘 (2.0 mL) 중의 XV (20.3 ㎎)의 용액을 아르곤으로 퍼지시키고 트리톤 B (피리딘 중의 0.45 M) 300 μL 및 디에톡시부티르알데히드 (50 μL)로 처리하였다. 2시간 동안 교반시킨 후에, 반응물을 EtOAc로 추출하고, 1N HCl 수용액, 염수로 세척하고 MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 여과 및 용매 증발 후에, 부가물을 CH₂Cl₂ (10 mL)에 흡수시키고 BF₃ 에테레이트 (10 μL)로 처리하였다. 2.0시간 동안 교반시킨 후에, 용액을 MgSO₄ 상에서 건조시키기 전에 NaHCO₃ 포화 수용액 및 염수로 세척하였다. 용매를 회전 증발시켜 제거하여 형성된 잔류물을 정제 HPLC (Zorbax RX-8, 2.5 x 25 ㎝, 65% MeCN/물 w/0.1% 트리플루오로아세트산)에 의해 정제하였다. 적절한 분별물을 NaHCO₃로 중화시키고, 염화 메틸렌 (3 x 20 mL)으로 추출하고 MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 여과 및 용매 증발 후에, 실시예 3-A에 기재된 방법 A에 의해 제조되고 분리된 재료와 동일한 ¹H NMR 및 MS 스펙트럼 및 HPLC 체류 시간을 가진 화합물 (II-1) (11.8 ㎎, 65% 수율)을 얻었다.

실시예 8: 화합물 (II-9)의 제조 (도 8)

1-프로판올 (4.0 mL) 중의 브로모 화합물 II-5 (6.2 ㎎)의 현탁액에 3-아미노페닐붕산 (3.8 ㎎)을 첨가하였다. 0.25시간 동안 교반시킨 후에, Pd(OAc)₂ (2.0 ㎎) Ph₃P (4.8 ㎎), Na₂CO₃ (2.8 ㎎) 및 물 (2.0 mL)을 순차적으로 첨가하였다. 혼합물을 0.75시간 동안 가열 환류시키고, 냉각시키고, CH₂Cl₂로 추출하고, 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 용매를 회전 증발시켜 제거하여 형성된 잔류물을 정제 HPLC (Zorbax RX-8, 2.5 x 25 ㎝, 50% MeCN/물 w/0.1% 트리플루오로아세트산)에 의해 정제하였다. 적절한 분별물을 NaHCO₃로 중화시키고, 염화 메틸렌 (3 x 20 mL)으로 추출하고 MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 여과 및 용매 증발 후에, 다음 특성을 갖는 화합물 II-9 (3.1 ㎎, 49% 수율)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆) δ9.22 (d, J=7.5, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.00-7.25 (m, 8H), 7.12 (dd, J=7.1,7.0, 1H), 6.95-6.80 (m, 3H), 6.53 (d, J=6.0, 1H), 5.63-5.58 (m, 1H), 4.99 (s, 2H), 4.55 (s, 1H), 2.25-2.10 (m, 1H), 1.95-1.90 (m, 1H), 0.98-0.88 (m, 1H), 0.65-0.57 (m, 1H);

MS m/z (M+H): 계산치 470, 실측치 470.

실시예 9: 화합물 (II-10)의 제조 (도 9)

DMSO (1 mL) 중의 화합물 II-1 (5.0 ㎎)의 용액에 NaCN (4.3 ㎎)을 첨가하고, 혼합물을 145 ℃에서 1시간 동안 가온하였다. 혼합물을 냉각시키고, EtOAc 로 추출하고, 물 (3 x 20 mL) 및 염수로 세척하였다. 유기층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과시키고 증발시켜 형성된 잔류물을 정제 HPLC (Zorbax RX-8, 2.5 x 25 ㎝, 55% MeCN/물 w/0.1% 트리플루오로아세트산)에 의해 정제하였다. 적절한 분별물을 NaHCO₃로 중화시키고, 염화 메틸렌 (3 x 20 mL)으로 추출하고 MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 여과 및 용매 증발 후에, 다음 스펙트럼 특성을 갖는 화합물 II-10 (2.7 ㎎, 50% 수율)을 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆) δ11.4 (s, 1H), 8.86 (d, J=7.9, 1H), 8.79 (d, J=7.6, 1H), 7.90 (d, J=8.3, 1H), 7.62-7.55 (m, 2H), 7.49 (dd, J=7.6,7.4, 3H), 7.40 (dd, J=7.4,7.3, 1H), 7.35 (dd, J=7.5,7.4, 1H), 6.86 (d, J=6.0, 1H), 6.03 (s, 1H), 5.40-5.30 (m, 1H), 2.25-2.14 (m, 1H), 2.03-1.90 (m, 1H), 1.10-0.98 (m, 1H), 0.82-0.77 (m, 1H).

실시예 10: 화합물 (II-11)의 제조 (방법 A, 도 6)

방법 A에 따라서, 수지 (XIIIa) (150.2 ㎎)를 EtMgBr (1.0 mL)에 이어서 에틸 2,5-디옥소펜타노에이트 (1.5 mL)와 반응시켰다 (Schmidt, et al., Synthesis, 1993, 809). 작업하고 수지로부터 분해한 후에, 조 반응 생성물 혼합물을 염화 메틸렌 (20 mL)에 흡수시키고 BF₃ 에테레이트 (20 μL)로 처리하였다. 2.5시간 동안 교반시킨 후에, 그 용액을 MgSO₄ 상에서 건조시키기 전에 NaHCO₃ 포화 수용액 및 염수로 세척하였다. 여과 및 용매 제거 후에, 형성된 잔류물을 정제 HPLC (Zorbax RX-8, 4 x 25 ㎝, 55-75% 구배 MeCN/물 w/0.1% 트리플루오로아세트산)에 의해 정제하여 다음 특성을 갖는 화합물 II-11 (6.4 ㎎)을 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆) δ9.36 (d, J=7.7, 1H), 8.68 (s, 1H), 8.00 (d, J=7.7, 1H), 7.83 (d, J=8.3, 1H), 7.58-7.15 (m, 5H), 6.97 (d, J=5.9, 1H), 4.93 (s, 2H), 4.82 (s, 1H), 4.48 (q, J=7.1, 2H), 2.42-1.91 (m, 2H), 1.37 (t, 3H, J=7.1), 1.25-0.63 (m ,2H)

실시예 11: 화합물 (II-12)의 제조

THF (2 mL) 중의 화합물 II-11 (3.4 ㎎)의 용액을 LiBH₄ (THF 중의 1.0 mL)의 2M 용액으로 처리하고 반응물을 1.5시간 동안 교반시켰다. 1N HCl (4 mL)를 첨가하여 반응물을 급냉시켰다. 20분 동안 교반시킨 후에, 10% NaOH (15 mL) 수용액을 첨가하고 혼합물을 염화 메틸렌 (3 x 10 mL)로 추출하였다. MgSO₄ 상에서 건조시킨 후에, 혼합물을 여과시키고 용매 증발시켜 다음 특성을 갖는 화합물 II-12 (0.32 ㎎)을 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆) δ9.35 (d, J=7.7, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.98 (d, J=7.7, 1H), 7.83 (d, J=8.2, 1H), 7.75 (d, J=8.2, 1H), 7.50-7.25 (m, 4H), 6.84 (d, J=7.7, 1H), 6.11 (s, 1H), 4.91 (s, 2H), 4.71 (s, 1H), 4.50-4.40 (m, 1H), 4.30-4.20 (m, 1H), 2.42-1.91 (m, 2H), 1.25-0.63 (m, 2H);

MS m/z (M+H): 계산치 409, 실측치 409.

실시예 12: 척수 ChAT 활성의 증강

ChAt는 기능적 콜린 뉴런에 대한 특정 생화학적 마커이다. 콜린성 뉴런은 해마 형성, 후각 핵, 각간 핵, 피질, 편도 및 시상 일부로의 주요 콜린성 입력을 나타낸다. 척수에서, 운동뉴런은 ChAT를 함유하는 콜린성 뉴런이다 (Phelps, et al., J. Comp. Neurol., 1988, 273, 459-472). ChAT 활성은 콜린성 뉴런의 생존 및(또는) 기능에 대한 뉴로트로핀 (예를 들면, NGF 또는 NT-3)의 효과를 연구하는데 이용되었다. ChAT 검정은 콜린성 뉴런 내의 ChAT 농도 조절의 지표로서 제공된다.

방법: 태의 쥐 척수 세포를 해리하고, 실험을 문헌에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Smith, et al., J. Cell Biology, 1985, 101, 1608-1621; Glicksman, et al., J. Neurochem., 1993, 61, 210-221). 해리된 세포를 표준 트립신 해리 기술 (Smith et al., 상기 참조)에 의해 쥐 (배아 14-15일)로부터 절개된 척수로부터 제조하였다. 세포를 0.05% 소 혈청 알부민 (BSA)로 보충된 무혈청 N2 배지 중의 폴리-1-오르니틴 코팅된 플라스틱 조직 배양 웰 상에서 6 x 10⁵ 세포/㎤로 평판 배양시켰다 (Bottenstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 514-517). 배양물을 5% CO₂/95% 공기의 습윤 대기에서 37 ℃에서 48시간 동안 배양시켰다. ChAT 활성을 문헌 (McManaman, et al., Develop. Biol., 1988, 125, 311-320; Glicksman, et al., J. Neurochem., 상기 참조)에 따른 폰눔 절차 (Fonnum, Neurochem., 1975, 24, 407-409)의 변형법을 이용하여 시험관내에서 2일 후에 측정하였다.

실시예에 기재된 화학식 II의 화합물을 하기 표 2에 나타내었다. R¹, R⁴, R⁶ 및 R⁷에 대한 값은 H이고, Y는 O이고 n은 1이다.

화합물 번호	A₁A₂	B₁B₂	R₂	R₃	R₅	R₈	Z	m
II-1	O	H,H	H	H	H	H	결합	1
II-2	O	H,H	Et	H	H	H	결합	1
II-3	O	H,H	H	H	H	Me	결합	1
II-4a	O	H,H	H	H	H	Me	결합	2
II-4b	O	H,H	H	H	H	Me	결합	2
II-5	O	H,H	H	Br	H	Me	결합	1
II-6	O	H,H	H	H	10-OMe	H	결합	1
II-7a	O	H,H	H	H	H	Me	O	1
II-7b	O	H,H	H	H	H	Me	O	1
II-8	H,H	O	H	H	H	H	결합	1
II-9	O	H,H	H	3'-NH₂-Ph	H	H	결합	1
II-10	O	O	OH	H	H	H	결합	1
II-11	O	H,H	H	H	H	CO₂-Et	결합	1
II-12	O	H,H	H	H	H	CH₂-OH	결합	1

실시예 13: pCDNA3-EE-MLK-3, pcDNA3-EE-MLK-3 (K144R)

MLK3을 문헌 (Lee, et al., Oncogene, 1993, 8, 3403-3410: Ezoc, et al., Oncogene, 1994, 9, 935-938)에 기재된 바와 같이 클로닝하고, 200 ng 폴리아데닐화 흑혈구 mRNA로부터 cDNA를 제조하며, 이러한 반응물의 5%를 주형으로서 사용하여, 공지된 PTKs (PTK1, 5'-CGGATCCACMGIGAYYT-3' (서열 번호 1); PTK2, 5'- GGAATTCCAWAGGACCASACRTC-3' (서열 번호 2); PTK3, 5'-CGGATCCRTICAYMGIGAYYTIGCIGCIMGIAA-3' (서열 번호 3); PTK4, 5'-GGAATTIAYIGGAWAIGWCCAIACRTCISW-3' (서열 번호 4))의 보존된 VIb 및 IX 아영역의 컨센서스 서열로부터 유도된 2개 또는 4개의 고도의 변성 올리고뉴클레오티드 프라이머 혼합물을 사용하여 PTK cDNAs 레퍼토리를 증폭시켰다. Taq DNA 폴리머라아제 (AmpliTaq; Perkin-Elmer/Cetus) 및 자동화 DNA 열 사이클러 (각 주기는 94℃에서 40초, 37℃에서 2분 및 63℃에서 3분으로 이루어짐)를 이용하여 PCR 40 주기를 수행하였다. 8회분 PCR 생성물을 모으고, DNA 폴리머라아제 (Klenow)로 처리하며, BamHI 플러스 EcoR1으로 절단한 다음, 5% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동시켰다. 에티듐 브로마이드 염색 결과, 우세한 200 내지 230bp를 확인하였는데, 이는 절개 및 용출되어 M13mp18 내로 클로닝되었다. 한 실험에서는, PCR 증폭된 cDNA의 일부를 절단하지 않고, 대신 Sma1로 절단된 M13mp18 내로 평활 클로닝시켰다. 연쇄-종결 서열화 방법에 의해 뉴클레오티드 서열을 결정하였다.

PTK1로 확인된 하나의 cDNA를 프로브로서 사용하여 사람 흑색종과 흑혈구 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다. PTK1-3.2로 명명된 클론은 847개 아미노산의 단백질을 코딩하는 2541nt의 완전한 개방 판독 프레임을 포함하고 있다. 이러한 cDNA를 NcoI로 절단하고, DNA 폴리머라아제 (Klenow)로 평활 말단시키며, EcoR1로 다시 절단하고, BamH1로 절단된 벡터 pCDNA3-EE에 연결하며, 평활 말단시킨 다음, EcoR1로 절단하였다. 출발 코돈에 이어서 EE 에피토프를 코딩하는 올리고 MEEEEYMPME (서열 번호 5)을 HindIII/BamH1 부위에 삽입하여 상기 벡터 pCDNA3-EE 를 작제하였다 (Grussenmeyer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 7952-7954). 앞서 공개된 기술 (Chen, et al., Biochemistry, 1994, 17, 657-659)을 이용하는 PCR을 사용하여 돌연변이물 K144R을 만듦으로써 키나아제-사멸 버젼의 MLK3을 만들었다. 제1 돌연변이성 올리고는 5'-GTGGCTGTGCGGGCAGCTCGCCAG-3' (서열 번호 6)이고, 제2 올리고는 5'-GAGACCCTGGATCTCGCGCTT-3' (서열 번호 7)이다. MLK3을 주형으로서 사용하여, 이들 올리고를 PCR에 사용하여 806bp 단편을 생성시키고, 이를 기타 앰플리머로서 T7 프라이머를 이용하고 주형으로서 MLK3을 이용하는 제2의 PCR 반응에 사용하여 1285bp 단편을 생성시켰다. 이 단편을 아가로오스 겔 전기영동시켜 분류하고 분리한 다음, pGEM-5 (Promega) 내로 클로닝한 후 서열화하였다. 이 단편을 HindIII 및 HpaI로 절개한 다음, HindIII 및 HpaI로 절단된 pCDNA3-EE-MLK-3 내로 삽입하였다. 뉴클레오티드 1342에서 추가의 점 돌연변이를 탐지하였다. 이를 교정하기 위하여, Pf1M1 단편 (nt 1093-1418)을 야생형 MLK3으로부터 절개하고, 이를 K144R 돌연변이된 MLK3 중의 동일한 단편을 대체하는데 사용하였다.

실시예 14: pFB-FLAG-MLK-3

MLK3 단백질을 얻기 위하여, cDNA를 바쿨로바이러스성 발현 벡터 pFB-FLAG 내로 클로닝시켰다. MLK3를 Nco1로 분해시킴으로써 PTK1-3.2로부터 절개하고, DNA 폴리머라아제 (Klenow)로 평활 말단시키며, Not1로 다시 절단한 다음, Stu1 및 Not1로 분해된 pFB-FLAG에 연결하였다. pFB-FLAG는 pFB (Life Technologies)로부터 유도된 것이며, BamH1 부위 내의 폴리링커에 가해진, 출발 코돈 MDYKDDDDK (서 열 번호 8)을 갖는 FLAG 에피토프 (참조: Hopp, et al., Biotechnology, 1988, 6, 1205-1210)에 대한 코딩 서열을 갖는다.

실시예 15: pFB-GST-MLK-3 (KD)

MLK3의 키나아제 영역의 바쿨로바이러스성 발현은, EcoR1 및 Xho1을 사용하여 pGEXKG-MLK-3 (KD)로부터 MLK3 단편을 절개하고 이를 EcoR1 및 Xho1로 절단된 pFB 벡터에 연결함으로써 달성하는데, 여기서 글루타티온 S-트랜스퍼라아제 (GST)에 대한 코딩 서열은 상단(upstream)에 클로닝되어 있다. 이는 주형으로서 pGEXKG 벡터를 사용하는 PCR에 의해 이러한 벡터로부터 GST 코딩 서열과 폴리링커를 얻음으로써 달성되었다 (참조: Guan, et al., Anal. Bioch., 1991, 192, 262-267). 이러한 PCR용 5' 올리고는 상기 단편의 5' 말단에 Bg12 제한 부위를 만들었다. 이어서, 이러한 분리된 단편을 Bg12 및 HinD3으로 분해한 다음, 이를 BamH1 및 HinD3으로 분해된 pFB에 연결하였다.

실시예 16: pGEXKG-MLK-3 (KD)

MLK3 키나아제 영역과 루이신 지퍼의 일정 부분(nt 736-1791) 모두를 포함하는 cDNA 단편을, PTK1 cDNA를 사용한 PCR에 의해 얻었다. 이와 같이 분리된 단편을, 상기 PCR 올리고머에 포함되는 부위인 제한 효소 EcoR1 및 Xho1로 분해한 다음, EcoR1 및 Xho1로 분해된 pGEX-KG 내로 클로닝시켰다. 이어서, pGEX-KG 중의 상기 단편을 PCR에 의해 단축시켜 키나아제 영역 (nt 736-1638) 만을 포함하도록 하였다.

실시예 17: pKH3-MLK2, pKH3-MLK2 (KA)

변성 PCR을 이용하여 MLK2를 클로닝하였다 (참조: Dorow, et al., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 701-710; Dorow, et al., Eur. J. Biochem., 1995, 234, 492-500). 상피성 종양 세포주 Colo 16에서 발현된 단백질 키나아제의 촉매적 아영역을 코딩하는 cDNA의 세그먼트를 역전사효소 PCR에 의해 RNA로부터 증폭시켰다. 변성 PCR 프라이머는 표피-성장 인자 수용체 계열 키나아제 촉매 영역의 아영역 VIb 및 VIII 중의 보존된 모티브를 코딩하는 서열을 기준한 것이다. 이 프라이머의 서열은 다음과 같다: 전진 프라이머, 5'-CGGATCCGTG(A)CACC(A)GT(CG)G(A)ACC(T)T-3' (서열 번호 9); 후진 프라이머, 5'-GGAATTCACCA(G)TAA(G)CTCCAG(C)ACATC-3' (서열 번호 10). 몇몇 PCR 생성물을 M13 내로 클로닝하고, T7 슈퍼-염기 서열화 키트 (Bresatec)를 사용하여 서열화하였다. 하나의 216-bp PCR 생성물을 프로브로서 사용하여 사람 결장 λgt11 cDNA 라이브러리 (Clontech, 카탈로그 #HL10346)를 스크리닝하였다. 이 단편을 무작위-프라이밍 표지시키고, 65℃에서 하이브리드화를 수행한 다음, 필터를 65℃ 하의 0.2X NaCl/시트레이트 (150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산 나트륨, pH 7.0) 및 0.5% SDS의 엄격한 조건 하에 세척하였다. 필터를 -70℃ 하에 코닥 XAR-5 필름 상에서 16시간 동안 자동 방사선 사진을 촬영하였다. 4개의 클론을 분리하고, 이중 가장 긴 1.2kb를 사용하여, 동일한 조건을 이용하여 동일한 라이브러리를 재프로빙하였다. 4개 이상의 클론을 선별하였는데, 이중 하나가 MLK2의 1034bp 단편을 나타내었다. 이 클론을 사용하여 사람 뇌 λgt10 라이브러리를 프로빙하였다. 대략 500,000개 클론을 스크리닝하고 하나의 3454bp 클론을 분리하는데, 이는 MLK2의 완전한 코딩 영역을 나타낸다.

BamH1 부위가 MLK2 서열의 중간 부분에 있기 때문에, ATG로부터 폴리A 테일까지의 MLK2를 BamH1 부위와 EcoR1 부위 사이의 벡터 pKH3 내로 2단계로 클로닝시켰다. 상기 벡터 pKH3은, HA 에피토프 태그의 3가지 복사물에 이은 BamH1 부위를 pRK7 폴리링커의 Xba1과 EcoR1 부위 사이에 삽입시킴으로써 작제되었다. 돌연변이된 버젼 (K125A)을 만들기 위해서, MLK2 5'BamH1 단편을 프로메가 피 알터 벡터 내로 클로닝하고 제조업자에 의해 권장된 바와 같이 돌연변이시켰다. 이어서, 상기 단편을 MLK2 pKH3 벡터 내로 다시 클로닝시켰다.

실시예 18: pcDNA3-HA-JNK1

JNK1 cDNA를 문헌 (참조: Coso, et al., Cell, 1995, 81, 1137-1146)에 기재된 바와 같이 얻었다. 이러한 cDNA를 주형으로서 사람 골격근 cDNA (Invitrogen)을 이용한 PCR에 의해 얻고, 이를 pcDNA3-HA (HA 에피토프를 코딩하는 변형된 pcDNA3 발현 플라스미드)의 Bg12/Sal1 부위 내로 클로닝시켰다 (참조: Wilson, et al., Cell, 1984, 37, 767-778). 이어서, 이를 HA 에피토프를 포함한 pcDNA3으로부터 절개한 다음, pGEX-4T3 (Pharmacia)에 연결하였다. 상기 JNK1 cDNA를 Bg12/Sal1 단편으로서 pGEX-4T3 작제물로부터 절개한 다음, pcDNA3의 HinD3/BamH1 부위에 가해진 HA 에피토프를 갖는 벡터인 pcDNA3-HA에 연결하였다.

실시예 19: pFLAG-DLK

DLK를 문헌 (참조: Holzman, et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 30808-30817)에 기재된 바와 같이 FLAG 에피토프가 가해진 발현 벡터 pcDNA3 내로 클로닝시켰다. DLK에 대한 cDNA 단편을 변성 올리고뉴클레오티드-이용한 PCR 클로닝에 의해 분리하였다. 제조업자 (TRIzol Reagent, Life Technologies, Inc.)의 지시에 따라서 시판용 페놀/구아니딘 이소티오시아네이트 시약 방법을 이용하여 배아 13.5일 신장 (32 기관) 및 배아 17.5일 신장 (16 기관)으로부터 전체 RNA를 절개하였다. RNase-유리된 DNase I로 분해한 후, 전체 RNA를 올리고(dT) 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 한가닥 cDNA까지 RNase H-역전사효소 (Superscript, Life Technologies)로 역전사시켰다. 윌크스(Wilks) (참조: Wilks, Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86, 1603-1607)에 의해 본래 고안된 단백질 티로신 키나아제 촉매 아영역 Vib 및 IX에 상응하는 변성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 5' EcoR1 및 HindIII 부위로 각각 변형시켰다 (5'-ATAATTC(GT)GC(TAGC)GCCA(GA)GTC(TAGC)CGGTG-3' (서열 번호 11), 5'-ATAAGCTTCC(TC)(AG)T(GC)AAGTGGA(TC)(GC)GC(AGC)CC(CT)GA-3' (서열 번호 12)). PCR 40주기를 94℃에서 1.5분, 37℃에서 2분 및 63℃에서 3분 동안 수행하였다. 신선한 시약을 가하고, 72℃에서 최종 10분간 연장시키기 전에 40 주기를 추가로 더 완료하였다. 이로써 생성된 200 내지 210bp DNA 증폭 생성물을 겔 분리하고, 준비된 pGEM7zf(+) 플라스미드 (Promega) 내로 서브클로닝시킨 다음, 에스케리챠 콜리 (Escherichia coli)로 변형시켰다. 미니프렙 (miniprep) 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 제조하고, EcoR1 및 HindIII 제한 엔도뉴클레아제로 분해된 일정 부분 (클론을 함유하는 삽입물)을 서열화하였다.

변성 PCR로부터 얻은 195-bp DLK cDNA 단편을 방사성표지시키고 이를 사용하여, 올리고(dT)-프라이밍된 다 자란 마우스 뇌 cDNA 라이브러리인 Uni-ZAP II (Stratagene, La Jolla, CA)의 대략 1 x 10⁶ 재조합체를 스크리닝하였다 (참조: Holzman, et al., Mol Cell Biol, 1990, 10, 5830-5838). 필터를 42℃ 하에 50% 포름아미드, 5 x SSC, 3 x 덴하르트 용액, 0.25% SDS, 1 ㎎/mL 폴리아데닐산 및 200 ㎎/mL 연어 정자 DNA로 이루어진 완충액 중에서 하이브리드화시켰다. 필터를 2 x SSC, 0.2% SDS에서 실온 하에 1회 세척한 다음, 65℃에서 30분 동안 2회 세척하였다. 25개의 독특한 클론을 확인하였는데, 이중 10개 클론을 균질하게 정제하고, 제조업자의 프로토콜에 따라서 생체내 절개한 다음, 제한 지도화하였다. 가장 긴 2개 클론 (5' 말단 만이 상이한 각각 3401 및 3397bp)을 이들의 전체 길이 전반에 걸쳐 양 쇄를 따라 서열화하였다.

완전 길이의 NotI-XhoI DLK cDNA 단편 (3401bp)을 사이토메갈로바이러스 프로모터-이용한 진핵성 발현 벡터 pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) 내로 서브클로닝시켰다 (작제물은 pcDNA3-DLK로 명명되었다). 이어서, NH₄-Met FLAG 에피토프 (DYKDDDDK) (서열 번호 13) 태그된 작제물 (pFLAG-DLK)을 만들었다. PCR을 사용하여, 5' HindIII 부위; 개시 ATG, FLAG 에피토프를 포함한 DLK의 코작 (Kozak) 컨센서스 서열, 및 뉴클레오티드 88에서부터 뉴클레오티드 758에서의 내부 EcoR1 부위까지 연장하는 DLK cDNA 개방 판독 프레임 서열을 코딩하는 cDNA 단편을 증폭시켰다. (등몰 량으로 사용된 HPLC 정제된 합성 올리고뉴클레오티드: FLAG 작제물 센스 프라이머의 경우에는 5'-ATAAAGCTTCCAGAGGCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGC-CTGCCTCCATGAAACCCGAACA-3' (서열 번호 14)이고 안티센스 프라이머의 경우에는 5'-GACAGGGCGGCCGGCTCT-3' (서열 번호 15)이다). 겔 정제된 HindIII 및 EcoR1-분해된 증폭 단편을 HindIII-EcoR1 내로 서브클로닝하여 pcDNA3-DLK 플라스미드를 제조하였다. 작제물을 양 쇄를 따라 서열화하여 Taq 폴리머라아제의 적합도와 판독 프레임의 유지 여부를 확인하였다.

실시예 20: pcDNA3-MLK1

MLK1의 5' 부분을 EST 데이타베이스로부터 얻었다 (수탁 번호 AA160611). 이 클론은 MLK1과 공지되지 않은 실체의 또 다른 cDNA 간의 융합물이다. 이는 앞서 공개된 MLK1의 키나아제 영역 일부 (참조: Dorow, et al., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 701-710)와 함께, 앞서 공개되지 않은 MLK1의 5' 서열을 함유하고 있다. EST 클론으로부터의 MLK1 cDNA 서열은 다음과 같다: GAATTCGGCA CGAGAGGACT CGCAGGTGTC CGGCGACGAG GGCTGGTGGA CCGGGCAGCT GAACCAGCGG GTGGGCATCT TCCCCAGCAA CTACGTGACC CCGCGCAGCG CCTTCTCCAG CCGCTGCCAG CCCGGCGGCG AGGACCCCAG TTGCTACCCG CCCATTCAGT TGTTAGAAAT TGATTTTGCG GAGCTCACCT TGGAAGAGAT TATTGGCATC GGGGGCTTTG GGAAGGTCTA TCGTGCTTTC TGGATAGGGG ATGAGGTTGC TGTGAAAGCA GCTCGCCACG ACCCTGATGA GGACATCAGC CAGACCATAG AGAATGTTCG CCAAGAGGCC AAGCTCTTCG CCATGCTGAA GCACCCCAAC ATCATTGCCC TAAGAGGGGT ATGTCTGAAG GAGCCCAACC TCTGCTTGGT CATGGAGTTT GCTCGTGGAG GACCTTTGAA TAGAGTGTTA TCTGGGAAAA GGATTCCCCC AGACATCCTG GTGAATTGGG CTGTGCAGAT TGCCAGAGGG ATGAACTACT TACATGATGA GGCAATTGTT CCCATCATCC ACCGCGACCT TAAGTCCAGC AAC (서열 번호 16). 이는 다음과 같이 해독된다: NSAREDSQVS GDEGWWTGQL NQRVGIFPSN YVTPRSAFSS RCQPGGEDPS CYPPIQLLEI DFAELTLEEI IGIGGFGKVY RAFWIGDEVA VKAARHDPDE DISQTIENVR QEAKLFAMLK HPNILALRGV CLKEPNLCLV MEFARGGPLN RVLSGKRIPP DILVNWAVQI ARGMNYLHDE AIVPIIHRDL KSSN (서열 번호 17).

MLK1의 3' 부분은 앞서 공개된 바와 같이 변성 PCR에 의해 초기에 클로닝시켰다 (참조: Dorow, et al., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 701-710). MLK1의 3' 부분의 클로닝에 대한 프로토콜은 다음 사항을 제외하고는 MLK2에 대해 기재된 바와 같다: 라이브러리를 1.2kb 클론으로 재스크리닝하여 얻은 4개 클론 중에서, 3개 클론이 MLK1을 나타내었다. 어떠한 클론도 PCR에 의해 얻어지는 완전한 키나아제 영역을 포함하고 있지 않다.

1 ㎖ 등취량의 증폭된 라이브러리 (1 Uni-ZAPXR (Stratagene, 카탈로그 #937204) 중의 정상적인 사람 결장 상피 세포 및 사람 T84 결장 암종 세포주 cDNA)로부터의 파아지를, 20 ㎖ 물에 현탁시킨 다음 스냅 동결시킴으로써 용해시켰다. 이와 같이 용해된 파아지 5 ㎖ 샘플을 각 라이브러리에 대한 두 반응에서 PCR 주형으로서 사용하였다. 이러한 벡터를 나타내는 프라이머를, 상기 클로닝 부위를 플랭킹하는 뉴클레오티드 서열로부터 취하였다. T84 결장 세포주 라이브러리의 경우에는, T3 및 T7 서열화 프라이머 (Promega)를 사용하였다. 각 반응에서, 공지된 서열의 5' 말단으로부터 대략 100 bp인 한 프라이머는 MLK1 유전자의 3'-5' 쇄로부터 유래된 것이다. 제2 프라이머는 2개의 벡터 프라이머 중의 하나이다. PCR 반응물은 1 X PCR 완충액, 2.5 mM 염화 마그네슘, 1U Taq 폴리머라아제 (공급원: Bresatec), 0.2 mM dNTP 및 0.4 mM 각 프라이머를 총 50 ㎖로 함유하였다. 반응 조건은 30주기 동안 95℃에서 60초, 52℃에서 90초, 72℃에서 90초이고 최종 주기 에서는 15분 연장하였다. PCR 생성물을 앞서 기재된 바와 같이 클로닝시킨 다음 서열화하였다. 상기 라이브러리 스크린으로부터 가장 긴 클론과 추가의 MLK1 서열을 포함한 PCR 단편을 함께 연결하여 pUC18 중의 1.08kb MLK1 cDNA를 생성시켰다.

EST 데이타베이스로부터의 MLK1 클론을 벡터 pBluescript (Stratagene)에 제공하였다. 결장성 라이브러리로부터의 MLK1 cDNA은 이를 EcoR1로 분해함으로써 EST 클론에 연결하고, 클레노우로 평활 말단시킨 다음, AflII로 절단하였다. 이와 같이 분리된 단편을 XhoI로 절단된 EST 데이타베이스로부터의 MLK1 cDNA 내로 클로닝하고, 클레노우로 평활 말단시킨 다음, AflII로 절단하였다. 이어서, 이러한 신규 작제물을 Not1 및 Apa1로 분해함으로써 pBluescript로부터 절개한 다음, 역시 Not1 및 Apa1로 절단된 pcDNA3-EE에 연결하였다. 모든 클로닝 연결물의 서열을 확인하였다.

실시예 21: GST-MLK-3_KD의 이. 콜리 발현

pGEXKG-MLK-3 (KD)를 전기천공에 의해 이. 콜리 균주 BL21 내로 형질전환시켰다. 상기 플라스미드를 함유하는 균주를 다음 성분이 풍부한 배지 10 리터 용적으로 15리터 애플리콘 (Applikon) 발효기 내로 접종하였다: 1.95g/L K₂HPO₄, 0.9g/L KH₂PO₄, 0.1g/L 앰피실린, 0.3g/L (NH₄)₂SO₄, 0.92g/L MgSO₄·7H₂O, 42.7 ㎎/L Na 시트레이트, 21.8 ㎎/L FeSO₄·7H₂O, 0.5ml 피치아 미량 금속 (참조: Higgins, et al., Methods Molecular Biology, 1998, 103, 149-177], 20 g/L 카사미노산, 40 g/L 글리세롤, 25.5 ㎎/L CaCl₂. 배양물이 OD₆₀₀=4.4에 도달할 때까지 800rpm/68% 용해 산소/30℃ 하에 세균을 밤새 성장시켰다. 6시간 이하 동안 25℃에서 지속적으로 발효시키면서, 1 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토시드를 첨가함으로써 재조합 단백질 생성을 유도하였다. 이어서, 세균을 원심분리시켜 회수하고, 저장된 세포 페이스트를 정제될 때까지 -20℃에서 동결시켰다.

실시예 22: 세균성 GST-MLK-3_KD의 정제

100 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM 디티오트레이톨 (DTT), pH 7.5 (완충액 A) 중의 세균성 세포 페이스트 100 g을 초음파처리함으로써, 부분적으로 정제된 GST-MLK-3_KD를 제조하였다. 트리톤 X-100을 사용하여 상기 용액을 1%로 만든 다음, 얼음 상에서 1시간 동안 교반시켰다. 20,000 x g로 45분 동안 원심분리시킨 후의 상등 용액을, 완충액 A에서 평형된 10 ㎖ 글루타티온 세파로오스 4B 수지(Pharmacia)와 얼음 상에서 1시간 동안 혼합하였다. 펠릿화 수지를 12.5x 용적의 완충액 A로 2회 세척한 다음, 20 mM 글루타티온, pH 7.5를 함유하는, 20 ㎖ 100 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM DTT(완충액 B)로 용출시켰다. 단백질을 완충액 B에 대해 밤새 투석한 다음, -80℃ 하에 등취량으로 저장하였다.

실시예 23: FLAG-MLK-3 및 GST-MLK-3_KD의 바쿨로바이러스성 발현

매뉴얼 지시에 따라서 BAC-TO-BAC 시스템 (Life Technologies)을 사용하여, FLAG-MLK-3 및 GST-MLK-3_KD을 발현하는 재조합 바쿨로바이러스를 이들 각각의 전이 벡터인 pFB-FLAG-MLK-3 및 pFB-GST-MLK-3_KD로부터 제조하였다. Sf21 세포의 현탁 배양물 (참조: Vaughn, et al., In Vitro, 1977, 13, 213-217)을 27℃/120rpm 하에, 10% 열-불활성화된 태내 소 혈청 (FBS)이 보충된 그레이스 배지 (참조: Hink, Nature, 1970, 226, 466-467)에서 성장시켰다. 재조합 FLAG-MLK-3을 제조하기 위하여, 1.5 x 10⁶ 세포/5% FBS를 함유하는 보충된 그레이스 배지 ㎖의 밀도 하의 Sf21 세포를 감염 중복도(MOI) 3.1로 감염시키고, 감염시킨지 39시간 후에 거두었다. 재조합 GST-MLK-3_KD를 제조하기 위하여, 1.5 x 10⁶ 세포/5% FBS를 함유하는 보충된 그레이스 배지 ㎖의 밀도 하의 Sf21 세포를 MOI 2로 감염시키고, 감염시킨지 41시간 후에 거두었다. 양 경우, 펠릿화 세포를 10 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0.5 mM 페파블록 SC, 5 μM 펩스타틴, 10 ㎍/mL 아프로티닌, 10 ㎍/mL 루이펩틴, pH 7.4로 구성된 완충액에 재현탁시켰다. 147,000 x g로 1시간 동안 원심분리시킨 후의 상등 용액을 3M 트리스 염기로 pH 7.4가 되도록 재조정한 다음, 정제에 앞서 -70℃ 하에 저장하였다.

실시예 24: 바쿨로바이러스성 GST-MLK-3_KD의 정제

부분적으로 정제된 바쿨로바이러스성 GST-MLK-3_KD를 글루타티온 친화 크로마토그래피하여 제조하였다. 10 ㎖의 세포 추출물 (총 단백질 26.6 ㎎)에 대해서는, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4 (완충액 C)에서 평형된 1 ㎖의 글루타티온 세파로오스 4B 수지 (Pharmacia)을 가하고, 단백질이 4℃에서 45분 동안 결합되도록 해준다. 이어서, 수지를 30컬럼 용적의 완충액 C로 컬럼 포맷으로 세척한 다음, 20 mM 글루타티온을 함유하는 5컬럼 용적의 완충액 C로 용출시켰다. 모아진 최종 생성물을 완충액 C에 대해 밤새 투석한 다음, -70℃ 하에 등취량으로 저장하였다.

실시예 25: 바쿨로바이러스성 FLAG-MLK-3의 정제

부분적으로 정제된 바쿨로바이러스성 FLAG-MLK-3를 항체 친화 크로마토그래피하여 제조하였다. 추가의 0.1M NaCl를 갖는 추출물 15 ㎖로부터의 단백질 (총 단백질 19.5 ㎎)을, 반복적으로 부하함으로써(총 3회) 아가로오스 수지 (Sigma)에 커플링된 M2 모노클로날 FLAG 펩티드 항체의 0.25ml 컬럼 상에 결합시켰다. 크로마토그래피에 앞서, 수지를 50 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4(TBS)의 5컬럼 용적 세척물 및 0.1M 글리신, pH 3.5의 3컬럼 용적 세척물에 이어서 TBS를 갖는 또 다른 5컬럼 용적 세척물로 평형화시켰다. 재조합 단백질을 1차적으로, TBS 중의 0.2 mM FLAG 펩티드 (N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C) (서열 번호 18)의 5컬럼 용적으로 용출시켰다. 검정에 앞서, 단백질을 -80℃ 하에 등취량으로 저장하였다.

실시예 26: 우성 음성 돌연변이체: MLK족의 우성 음성 돌연변이체는 신경 성장 인자를 제거한 후의 분화된 PC12 세포의 사멸을 차단한다

쥐 호크롬성세포종 종양으로부터 유래된 PC-21 세포주가, 뉴런 사멸을 유발하는 분자 사건을 검사하기 위한 뉴런 세포 모델로서 광범위하게 사용되어 왔다 (참조: Troy, et al., Adv. Neurology, 1997, 103-111). 신경 성장 인자 (NGF)는 PC-12 세포를 교감 뉴런 표현형으로 분화되도록 유도시켰다 (참조: Greene, Cell Biol., 1978, 78, 747-755). NGF 분화된 PC-12 세포는 생존을 위해 NGF에 의존적이며, NGF를 배지로부터 제거하면 형태학적으로 묘사된 아포프토틱 (apoptotic) 사멸을 진행하게 된다. NGF 제거 후의 PC-12 세포 사멸에 대한 상기 혼합 계통 키나아제족 구성원의 효과를 결정하기 위한 세포 시스템을 개발하였다. 제조업자 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 의해 권장된 바와 같은 Pfx 지질 전이 시스템을 사용하여 MLK3의 우성 음성(DN) 돌연변이체를 코딩하는 cDNA로 PC-12 세포를 형질감염시켰다. G418 설페이트 (Mediatech Inc., Herndon, VA)를 사용하여, DN-MLK-3을 발현하는 형질전환체의 안정한 푸울을 선별하였다. 이들 푸울 중의 대략 30%의 세포는 면역조직화학으로 측정한 결과 DN-MLK-3을 발현하였다. 상기 돌연변이체 키나아제를 안정하게 발현하는 세포 푸울을 폴리오르니틴/라미닌 (인산염 완충 식염수 중의 각각 10㎍/mL) 피복된 조직 배양물 96-웰 포맷 평판 상에 2 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 평판 배양한 다음, 7일 동안 NGF 100 ng/mL로 처리하였다. 이러한 NGF를 함유하는 배지를 제거하고, 세포 단층을 인산염 완충 식염수로 세척하며, 1:1000의 최종 희석율로 중화 NGF 항체 (카탈로그 #N6655; Sigma, St. Louis, MO)를 함유하는 배지로 1 내지 5일 동안 대체하였다. 테트라졸륨 염 (MTS)의 착색된 포르마잔으로의 전환을 이용하는 세포 생존율 검정에 의해 세포 생존율을 정량화하는데, 이는 제조업자 (Promega, Madison, WI)에 의해 권장된 바와 같은 사이토플루오르 (CytoFluor) 2350 (Millipore, Bedford, MA) 상에서 570 nm의 흡광도 하에 판독하였다. DN-MLK-3을 발현하는 안정한 푸울은 NGF 제거로 인해 야기된 세포 사멸로부터 부분적으로 보호되었다 (도 10).

실시예 27: 재조합 MLK 단백질의 효소 활성에 대한 검정

바쿨로바이러스 또는 세균성 발현 시스템에서 발현된 MLK 단백질이 효소 활성을 지니고 있다는 것을 입증하기 위하여, 몇몇 검정 포맷을 이용할 수 있다. 이러한 MLK 단백질은 완전 길이의 작제물이거나 바쿨로바이러스 또는 세균성 발현 시스템에서 발현된 키나아제 영역일 수 있다. 이 검정은 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA), 시간-분석된 형광(TRF) 또는 형광 편광(FP)과 같은 항체-이용된 것일 수 있다. 이러한 항체는 포스포세린, 포스포트레오닌 또는 포스포-특이적 기질에 대한 반응성을 지닌 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 또 다른 한편, 방사성 겔-이용 검정 (도 11 참조), 멀티스크린 트리클로로아세트산(TCA) 침전 검정(도 13), 신틸레이션 근접 검정 (SPA), 플래쉬평판 방법 또는 포스포셀룰로오스 필터 검정 포맷 (도 13)과 같은 비-항체-이용 방법을 사용할 수도 있다. 특정 기질의 직접적인 인산화 반응을 모니터하거나 시그날링 경로에서 하단 키나아제를 이용하는 커플링된 검정 시스템을 모니터하도록 고안될 수 있다. 이러한 기질은 SEK-1과 같은 특이적 기질이거나 미엘린 염기성 단백질(MBP)과 같은 비교적 비-특이적 기질일 수 있다.

실시예 28: 키나아제 검정

(1) 방사성 겔-이용 키나아제 검정

MLK3의 키나아제 활성을, [γ-³²P]-ATP로부터의 ³²P가 MLK의 기질(예를 들면, 키나아제-사멸 SEK-1; 미엘린 염기성 단백질) 내로 혼입되는 것을 모니터하여 검정 하였다. 50㎕ 검정 혼합물은 완충액 A (20 mM MOPS, pH 7.2, 25 mM β-글리세롤 포스페이트, 5 mM EGTA, 1 mM 오르토바나딘산, 1 mM 디티오트레이톨), 15 mM MgCl₂, 100μM ATP, 10μCi[γ-³²P]-ATP 및 0.1㎍ 키나아제-사멸 SEK-1 기질 (Stressgen, Inc.; 결합된 글루타티온 S-트랜스퍼라아제-SEK-1(GST-SEK-1)이 10 mM 글루타티온, pH 8.0을 지닌 글루타티온-아가로오스 비이드로부터 방출됨) 또는 25 ㎍ MBP (Sigma Chemical Co.)를 함유하였다. MLK 단백질 (키나아제 영역, 또는 완전 길이와 키나아제 영역 모두를 함유하는 제제) 또는 대조군 단백질을 가함으로서 반응을 개시하였다. 이 혼합물을 30℃에서 30분 동안 배양하였다. 반응이 끝날 무렵, 2x 환원성 샘플 완충액을 가하였다. 혼합물을 5분 동안 비등시키고, 12% SDS-PAGE 겔 (기질로서 MBP를 사용함) 또는 8% 겔 (기질로서 SEK-1을 사용함) 상에 부하하였다. 전기영동 후, 상기 겔을 건조시켰다. 기질 SEK-1 내로의 인산염 혼입 정량화를 다음 기기 (Molecular Dynamics Phosphorimager; Sunnyvale, CA) 상에서 수행하였다. 기질로서 키나아제-사멸 GST-SEK-1 또는 MBP를 사용하여 바쿨로바이러스-발현된 MLK-3 (FLAG-태그된 완전 길이 또는 GST-태그된 키나아제 영역)의 효소 활성을 나타내도록 고안된 실험의 결과가 도 11A 및 11B에 도시되어 있다.

(2) 웨스턴 블롯 분석

바쿨로바이러스-발현된 MLK-3의 키나아제 활성을 면역블롯 분석에 의해 조사하였다. 20 ㎕ 검정 혼합물은 완충액 A, 15 mM MgCl₂, 100μM ATP 및 0.1㎍ 키나아제-사멸 SEK-1 기질을 함유하였다. 반응을 30℃에서 30분 동안 진행되도록 한 다 음, 10 ㎕ 4x 환원성 샘플 완충액으로 급냉시켰다. 단백질을 8% 트리스-글리신 겔 상에서 분류하고, 임모빌론 (Immobilon) PVDF 막에 전기영동적으로 전이시켰다. 이 막을 포스포-특이적 SEK-1 (Thr223) 항체 (New England Biolabs, Inc.)와 함께 배양한 다음, 홀스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 염소 항-토끼 IgG (Bio-Rad)와 함께 배양하였다. 면역반응성 밴드의 탐지는 향상된 화학발광 (Amersham)을 통하여 수행하였다. FLAG-MLK-3 단백질 (완전 길이와 키나아제 영역 모두를 함유하는 바쿨로바이러스 제제)에 의한 키나아제-사멸 GST-SEK-1의 인산화 반응이 도 12에 도시되어 있다.

(3) 멀티스크린 트리클로로아세트산 (TCA) 침전 검정

문헌 (참조: Pitt, et al., J. Biomol. Screening, 1996, 1, 47-51)에 기재된 바와 같이 멀티포어 멀티스크린 트리클로로아세트산 (TCA) "평판 내 (in-plate)" 검정을 이용하여, 세균적으로 발현된 GST-MLK-3 키나아제 영역의 키나아제 활성을 평가하였다. 검정을 96-웰 멀티스크린 듀라포어 평판 (Millipore)에서 수행하였다. 각각의 50㎕ 검정 혼합물은 20 mM Hepes, pH 7.4, 20 mM MgCl₂, 20 mM MnCl₂, 2 mM DTT, 0.1 mM Na₃VO₄, 1μCi[γ-³²P]-ATP 및 30㎍ MBP 기질을 함유하였다. MLK 단백질을 가함으로써 반응을 개시하고 37℃에서 15분 동안 진행시켰다. 50% TCA 25 ㎕을 이용하여 반응을 중지시켰다. 평판을 4℃에서 30분 동안 평형시킨 다음, 빙냉 25% TCA로 세척하였다. 신틸레이션 칵테일을 상기 평판에 가하고, 왈락 마이크로베타 (Wallac MicroBeta) 1450 PLUS 신틸레이션 계수기를 사용하여 방사능을 결정하였다. 단백질 용량 반응 대 ³²P-표지된 MBP의 형성이 도 13에 도시되어 있다.

(4) 포스포셀룰로오스 필터 검정

키나아제 검정을 20 mM Hepes, pH 7.4, 20 mM MgCl₂, 20 mM MnCl₂, 2 mM DTT, 0.1 mM Na₃VO₄, 1μCi[γ-³²P]-ATP 및 30㎍ MBP를 함유하는 50㎕용 반응 혼합물에서 수행하였다. MLK 단백질을 가함으로써 반응을 개시하고 37℃에서 15분 동안 진행시켰다. 75 mM 인산 75 ㎕을 이용하여 반응을 중지시켰다. 등취량의 급냉된 용액을 포스포셀룰로오스 막(Pierce) 위에 직접적으로 부하하였다. 또 다른 방법으로는, 96-웰 포스포셀룰로오스 멀티스크린 평판 (Millipore)를 사용할 수 있다. 이 막을 75 mM H₃PO₄로 세척하였다. 결합된 ³²P-표지된 인산화 반응 MBP를, 1M 수산화나트륨을 가함으로써 수집용 튜브에서 용출시켰다. 벡크만 신틸레이션 계수기 (Somerset, NJ)에서 세렌코프 (Cerenkov) 계수함으로써 방사능을 결정하였다. 세균적으로 발현된 GST-MLK-3 키나아제 영역의 농도 증가에 따른 인산화 반응 MBP의 형성이 도 13에 도시되어 있다.

실시예 29: 재조합 MLK족에 대한 화합물의 결합을 확인하기 위한 검정

노카르디아 (Nocardia) 종의 인돌로카르바졸 대사물인 K-252a(화합물 III-3; 표 4 참조)는 각종 세린/트레오닌 및 티로신 키나아제와 결합된다 (참조: Angeles, et al., Anal. Biochem, 1996, 236, 49-55; Knight, et al., Anal. Biochem, 1997, 247, 376-381). 삼중 수소화 K252a 리간드를 사용하여, 바쿨로바이러스 감염된 세포의 조 (crude) 제제로부터의 사람 재조합 완전 길이 MLK-3에 대한 결합을 평가하였다. [³H]K-252a는 NEN 리서치 생성물(Billerica, MA)과의 접촉을 통하여 3 및 9위치에서 삼중 수소로 특이적으로 표지시키는데, 이는 40 Ci/mmol의 비활성을 지니고 있다. 96-웰 평판 중의 1 ㎖에서 결합 반응을 수행하였다. 반응 혼합물은 50 mM MOPS 완충액, pH 7, 150 mM NaCl, 5 mM MnCl₂, 1 ㎎/mL BSA, 1% DMSO 및 0.25 nM [³H]K-252a를 함유하였다. 이 샘플을 조악한 바쿨로바이러스 유래된 MLK-3 5 ㎍/㎖의 농도로 3회 수행하였다. 비-특이적 결합은 표지되지 않은 1.2 μM K252a의 존재하에서의 결합으로서 정의하고 총 결합으로부터 공제하여 특이적 결합을 얻었다. 이러한 희석율에서는, 총 계수의 12 내지 15%가 단백질에 비-특이적으로 결합되고 이들 계수의 75 내지 85%가 MLK-3에 특이적으로 결합되었다(도 14). 모든 실험을 4℃에서 2시간 동안 수행하였다. 브랜들 수거기를 사용하여 GF/C 왓트만 필터 상에서 [³H]K-252a/MLK-3 복합체를 수집하고, 찬 MOPS/NaCl 완충액으로 세척한 다음, 왈락 마이크로베타 계수기 상에서 계수하였다. 포화 결합 실험을 수행하여 K252a에 대한 K_d를 얻었다. 이들 실험들 중의 한 실험으로부터의 결과에 대한 예가 제시되어 있다 (도 14). 0.89 nM (신뢰도 한계치: 0.2 내지 1.5 nM)의 K_d가 얻어졌다.

실시예 30: 완전한 세포(intact cell) 검정

(A) Cos7 과발현 시스템

재료

K-252a 및 이 화합물의 유도체는 다음 회사 (Kyowa-Hakko Kogyo Co. Ltd; Tokyo, Japan; Kaneko et al., 1997)에 의해 제공되었다. 화합물을 세포 배양물 등급의 디메틸 술폭시드 (DMSO)에 용해시키고 암실에서 4℃ 하에 저장하였다. 화합물의 모든 희석물을, 1% 소 혈청 알부민을 함유하는 둘벡코 변형된 이글스 배지(DMEM)에서 만들었다. 혈구응집소(HA) 항체는 BAbCO (Richmond, CA)로부터 구입하였다. AP-1(c-jun) 기질은 프로메가 (Madison, WI)로부터 구입하였다. [γ-³²P]ATP (6000Ci/mmol)은 아머샴 (Arlington Heights, IL)으로부터 구입하였다.

Cos7 세포 배양

그린 몽키 신장 Cos 7 세포를 ATCC (Rockville, Maryland; CRL 1651)로부터 얻고, 이를 10% CO₂, 90% 공기 대기 하 37℃에서 10% 소 혈청, 2 mM 글루타민, 1 mM 피루베이트, 50 U/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에 유지시켰다. 0.25% 트립신을 가함으로써 계대접종을 위해 Cos7 세포를 분리시켰다.

(1) Cos7 세포에서의 MLK족 구성원 및 JNK1의 과발현

Cos7 세포를 80% 컨플루언시로 평판 배양하고, 공급자 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)에 의해 권장된 바와 같이 리포펙타민을 사용하여 cDNA 작제물 각각 2㎍으로 형질감염시켰다. 사람 MLK-3, MLK-2 또는 마우스 DLK, 또는 앞서 기재된 바와 같은 부분적 사람 MLK-1의 완전 길이의 cDNA, 및 완전 길이의 혈구응집소 A-태그된 사람 JNK1 (이는 Silvio Gutkind; NIH, Bethesda, MD에 의해 제공됨)을 pcDNA3 벡터 (Invitrogen, San Diego, CA) 내로 서브클로닝시켰다. 형질감염시킨지 48시간 후, 0.025% DMSO 또는 상기한 화합물 500 nM로 2시간 동안 처리한 다음, 0.4ml 트리톤 완충액 (1% 트리톤 X-100, 50 mM 염화나트륨, 10 mM 트리스 (pH 7.6), 0.1% 소 혈청 알부민, 30 μM 나트륨 피로포스페이트, 50 mM 플루오르화 나트륨, 20 ㎍/mL 아프로티닌, 1 mM 페닐메틸술포닐플루오라이드, 1 mM 나트륨 바나데이트)에서 용해시켰다. 이러한 용해물로부터의 JNK 활성을 다음에 기재된 바와 같은 면역침전/키나아제 검정법으로 검정하였다.

(2) 완전 세포로부터의 면역침전 및 키나아제 검정

마이크로 BCA 키트 (Pierce; Rockford, IL)를 사용하여 Cos7 세포로부터의 용해물을 대상으로 하여 단백질 농도를 측정하고, 등량의 단백질을 4℃에서 1시간 동안 HA 항체로 면역침전시켰다. 면역침전체를 마이크로퓨즈 원심분리기에서 20초 동안 원심분리시킴으로써 펠릿화하고, 트리톤 완충액에 재현탁시키며, 2회 더 원심분리시킴으로써 세척한 다음, 키나아제 완충액 (20 mM Hepes, pH 7.4, 20 mM MgCl₂, 2 mM 디티오트레이톨, 0.1 mM 나트륨 바나데이트)에서 최종 세척하였다. 이러한 면역침전체를, 1μM ATP 및 5μCi[γ-³²P]ATP 및 기질 (1 ㎍/AP-1 샘플)을 함유하는 키나아제 완충액에서 재현탁시킨 다음, 30℃에서 15분 동안 배양하였다. 환원성 샘플 완충액 (Laemmli, Nature 1970; 227; 680-685)을 첨가함으로써 키나아제 반응을 중지시켰다. 샘플을 5분 동안 80℃로 가열하고 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에 부하하였다. 단백질을 전기영동하여 분류시켰다. 이 겔을 건조시키고, AP-1 기질 중의 방사능의 정량화를 다음 기기 (Molecular Dynamics Phosphorimager; Sunnyvale, CA) 상에서 수행하였다. MLK-3, MLK-2 및 DLK를 HA-JNK1과 함께 공동-발현시키고 K-252a의 존재 또는 부재하에서 배양시킨 실험으로부터의 결과가 도 15A 및 15B에 도시되어 있다. 이와는 달리, 보다 선택적인 키나아제 억제제인, 화합물 III-3으로 명명된 모 K-252a 화합물의 유도체 (표 4 참조)는 JNK의 또 다른 MAPKKK 상단(upstream)인 MEKK1에 의해 활성화된 JNK 경로를 방해하지 않았다 (도 15C).

(B) MLK 활성화된 JNK에 대한 완전-세포 리포터 검정

MLK족을 항시적으로(constitutive) 발현하는 클론을 유도하는 시도가 성공적이지 못하였는데, 이는 MLK의 과발현이 세포 생존에 영향을 미칠 수 있다는 것을 제시해준다 (참조: Bergeron et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, 231, 153-155; Nagata, et al., EMBO J., 1998, 17, 149-158). 따라서, MLK 유도된 생화학적 사건을 추적하기 위한 완전 세포 검정을 개발하는데 있어서, 관심있는 키나아제의 유전공학적으로 처리된 유도성 발현 시스템을 함유하는 세포주가 요구될 수 있다. 예를 들면, PC-12 세포주는 테트라사이클린-조절된 트랜스액티베이터 (transactivator)로 형질감염시켰다. 세포를 유도성 프로모터 tetO에 의해 구동된 관심있는 유전자로 추가로 형질감염시킨 경우에는, 이러한 유전자의 발현이 배지 중의 테트라사이클린에 의해 엄격하게 조절된다 (참조: Shockett, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6522).

MLK의 활성화를 정량화하기 위하여, 앞서 기재된 바와 같은 다중 검정 포맷으로 MEK-4, JNK 또는 c-jun과 같은 하단 기질의 인산화 반응을 측정할 수 있다. 완전 세포에서의 MLK 활성화를 정량화하기 위한 또 다른 접근법은 다음 공급원 (PathDetect (등록상표) 시스템; Stratagene, LaJolla, CA)으로부터 시판중인 c-jun 루시퍼라아제 리포터 시스템과 같은 리포터 효소 활성을 이용하는 것이다. 이러한 시스템에서는, 테트라사이클린-유도성 세포주를 두 플라스미드로 형질감염시켰다. 한 플라스미드는 cJun NH₂-말단 트랜스액티베이팅 영역과 효모 GAL4 DNA 결합 영역과의 융합물 (cJun-DBD 융합 단백질)을 항시적으로(constitutively) 발현하였다. 다른 플라스미드는 GAL4 결합 부위의 5개 직렬 반복체에 의해 구동된 개똥벌레 루시퍼라아제에 대한 코딩 서열을 수반하였다. MLK의 활성화시, JNK의 하단 기질인 cJun-DBD 융합 단백질은 인산화 반응되고, GAL4 결합 부위에 결합한 다음, 루시퍼라아제 유전자 전사를 유도한다. 루시퍼라아제는 이의 기질 (Promega, Madison, WI)을 가하고 화학발광을 측정함으로써 세포 용해물에서 용이하게 검정하였다.

실시예 31: MLK족 구성원의 억제와 운동뉴런 및 피질 생존과의 관련성

운동뉴런이 풍부하게 된 쥐 척수 배양물의 생존

배아 연령(E) 14.5 내지 15의 스프라그-돌리 쥐 태아 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA)로부터 척수를 절개하였다. 단지 척수의 복측 부분으로부터의 세포를 해리시키고, 앞서 기재된 바와 같이 (참조: Henderson, et al., 1993] 6.5% 단계 메트리즈아미드 구배 상에서 원심분리시킴으로써 운동뉴런을 풍부하게 하며, 낮은 친화성 뉴로트로핀 수용체 항체 (IgG-192; Boehringer-Mannheim)로 염색함으로써 순도에 대해 분석하였다 (데이타는 제시되지 않음). 세포를 화학적으로 규정된 무혈청 N2 배지에서 6 x 10⁴ 세포/㎠의 밀도로, 폴리-1-오르니틴 및 라미닌 (각각 5 ㎍/mL)로 미리 피복시킨 96-웰 평판 상에 시딩하였다 (Bottenstein, et al., 1979, 상기 참조). 부착을 생존 효과와 분리하기 위하여, 1 내지 3시간의 초기 부착 기간 이후에 화합물을 배양물에 가하였다. 형광측정 생존율 검정에서 칼세인 AM (Molecular Probes, Eugene, OR)을 사용함으로써 4일 후에 뉴런 생존을 평가하였다 (참조: Bozyczko-Coyne, et al., 1993, 상기 참조). 현미경을 이용한 뉴런 계수치를 상대적 형광치로 직접적으로 교정하였다. 간략하게 언급하면, 배지를 DPBS(둘벡코 인산염 완충 식염수)에서 일련으로 희석시킨 다음, 6μM 칼세인 AM 원료의 최종 농도를 각 96-웰에 가하였다. 평판을 37℃에서 30분 동안 배양한 다음, DPBS 중의 일련의 희석 세척물과 배양하였다. 여기 파장 485 nm 및 방사 파장 538 nm 하에 밀리포어 (Cytofluor 2350)로부터의 평판-판독 형광측정기를 사용하여 형광성 시그날을 판독하였다. 각 평판의 경우, 칼세인 AM은 수용하지만 세포는 전혀 함유하고 있지 않는 웰로부터 유도된 평균 배경을 모든 값으로부터 공제하였다. 이들 실험에서 일정 범위의 세포 밀도에 대한 농도와 배양 시간을 알아보기 위하여, 상기 형광 시그날의 선형성을 확인하였다. 250 nM의 시험 화합물의 존재하에서 운동뉴런의 대조군 이상의 생존율(%)의 예가 표 3에 제시되어 있다.

피질 뉴런의 생존

뇌 피질을 배아 18일 쥐 태아로부터 절개하고 효소적으로 분해하여 단일 세포 현탁액을 얻었다. 세포를, B27 보충물을 함유하는 무혈청 신경 기초 배지에서 폴리-오르니틴/라미닌 피복된 96 웰 조직 배양 평판 상으로 1.56 x 10⁵/㎠의 밀도로 시딩하였다. 평판을 PBS 중의 폴리-오르니틴/라미닌 (각각 8 ㎍/mL)의 용액으로 37℃ 하에 2시간 이상 동안 피복하였다. 시험관내에서 5 내지 7일째, 시험 화합물의 존재 또는 부재하에서 피질 뉴런을 Ab25-35 (20 μM)에 노출시켰다. Ab25-35 (Sigma, St. Louis, MO) 원료 용액 (1 mM)을 탈이온-증류된 멸균 H₂O에서 준비하였다. 혈장 막 원형 보존/세포 생존율의 지표로서 락테이트 데히드로게나아제 (LDH) 방출을 이용하여 펩티드 첨가한 지 48시간 후에 상대적 뉴런 생존율을 결정하였다. 제조업자의 지시에 따라서 세포독성 탐지용 키트 (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 LDH를 측정하였다. Ab25-35 단독으로 처리된 배양물과 비교하여 방출된 LDH의 억제율(%)로서 데이타를 나타내었다.

화학식	피질 뉴런	운동뉴런		Cos-7 세포	Cos-7 세포	Cos-7 세포	Cos-7 세포
화학식	250 nM에서 대조군 생존%	250 nM에서 대조군 생존%	500 nM에서 JNK 억제%	500 nM에서 DLK JNK 억제%	500 nM에서 MLK-3 JNK 억제%	500 nM에서 MLK-2 JNK 억제%	500 nM에서 MLK-1 JNK 억제%
III¹	46, 56	300%	65%	63, 73	99, 98	89, 67	97, 96
III²	47, 80	315%	88%	36, 22, 42	94, 94	69, 44	92, 64
I³	22, 54	177%	88%	20, 25	94, 93	0	79, 29
I⁴	29, 39	165%	97%	58, 13, 52, 8	84, 92, 90	0	63, 38
¹Z₁, Z₂, R₁및 R₂가 H이고, X가 CO₂CH₃이고, R이 OH인 화학식 III의 화합물. ²Z₁과 Z₂가 H이고, X가 CO₂CH₃이고, R₁과 R₂가 CH₂SCH₂CH₃이고, R이 OH인 화학식 III의 화합물. ³ A₁, A₂, R₁, R₃, R₅ 및 R₆이 H이고, B₁과 B₂가 함께 O를 나타내고, R₂가 CH₂CH₂OAc이고, R₄가 CH₂CH₂(2-피리딜)이고, X가 CH₂인 화학식 I의 화합물. ⁴ A₁, A₂, R₁, R₃, R₅ 및 R₆이 H이고, B₁과 B₂가 함께 O를 나타내고, R₂가 H이고, R₄가 CH₂CH₂(2-피리미디닐)이고, X가 CH₂인 화학식 I의 화합물.

실시예 32: 인돌로카르바졸 또는 융합된 피롤로카르바졸의 부재 또는 존재하에서 운동뉴런 배양물로부터의 내인성 JNK 활성의 면역침전

정제된 운동뉴런을 16 mm 직경 웰에 6 x 10⁴ 세포/㎠의 밀도로 평판 배양하였다. 처리 전에, 세포를 2시간 동안 부착시켜 두었다. 세포를 N2 규정된 배지에서 2시간 동안 0.0125% DMSO 또는 500 nM 화합물로 처리하였다. 이어서, 세포를 빙냉 인산염 완충 식염수로 세정한 다음, 실시예 30에서 기재된 바와 같이 0.4ml 트리톤 완충액에서 용해시켰다. 운동뉴런 배양물로부터의 용해물을 대상으로, 세포 수를 기준하여 표준을 맞추고 JNK1 항체 (카탈로그 #sc-474)(구입처: Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA)로 면역침전시켰다. 이러한 면역침전체로부터의 JNK 활성을 상기 언급된 바와 같이 ³²P-ATP 및 c-jun 기질의 존재하에서 검정하였다. 4가지 시험 화합물의 억제 활성 프로필을 DLK, MLK-1, MLK-2 또는 MLK-3을 과발현하는 Cos7 세포 및 운동뉴런에서 비교하였다 (표 3).

실시예 33: Cos7 세포에서의 MLK3-유도된 JNK 활성의 억제와 1차 배아 배양물에서의 콜린아세틸 트랜스퍼라아제 활성 간의 상관관계

이들 키나아제에 의해 조절된 JNK 경로의 억제가 신경영양성 화합물과 상관있는지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 HA-JNK 및 MLK3을 과발현하는 Cos7 세포에서 JNK 활성에 대한 화합물의 효과를 평가하였다. 48시간 동안 형질감염시킨 후, 세포를 2시간 동안 500 nM의 화합물과 함께 배양한 다음, 세포성 용해시켰다. 용해물을 면역침전시키고, 키나아제 활성을 상기 언급된 바와 같이 측정하였다. 그 결과가 대조군이 DMSO의 존재하에서의 JNK 활성인 대조군 샘플의 억제율(%)로서 보고된다. 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 척수 및/또는 기저 전뇌 ChAT 활성에 있어서 활성을 나타내는 대부분의 화합물이 MLK-3의 JNK 활성화의 강력한 억제제이다.

MLK3을 과발현하는 Cos 7 세포에서의 JNK 활성에 대한 인돌로- 및 인데노- 카르바졸의 효과

	콜린아세틸트랜스퍼라아제 활성		JNK 활성의 % 억제 (평균)
화합물	척수	기저 전뇌	Cos 7 세포 내의 MLK3
III-1¹	+	+	84
III-2²	+	+	96
III-3³	+	+	94
I-1⁴	+	+	93
I-2⁵	+	+	85
I-3⁶	+	+	93.5
I-4⁷	-	+	95
I-5⁸	-	+	97
I-6⁹	-	+	58
I-7¹⁰	-	+	85.5
III-4¹¹	-	+	66
III-5¹²	-	+	96
III-7¹³	-	+	54
I-8¹⁴	+	-	89
III-8¹⁵	+	-	94
III-9¹⁶	+	+	98.5
III-10¹⁷	+	-	78
I-9¹⁸	+	-	88
I-10¹⁹	+	-	94
III-11²⁰	-	-	92.5
I-11²¹	-	+	33
I-12²²	-	-	11
I-13²³	-	-	1
¹ Z₁과 Z₂가 H이고, X가 CO₂CH₃이고, R₁이 NHCONHC₂H₅이고, R₂가 CH₂CH₂(2-피리딜)이고, R이 OH인 화학식 III의 화합물. ² Z₁과 Z₂가 H이고, X가 CO₂CH₃이고, R₁ 및 R₂가 CH₂OCH₂OCH₂CH₃이고, R이 OH인 화학식 III의 화합물. ³ Z₁과 Z₂가 H이고, X가 CO₂CH₃이고, R₁ 및 R₂가 CH₂SCH₂CH₃이고, R이 OH인 화학식 III의 화합물. ⁴A₁, A₂, R₁, R₃ 및 R₄가 H이고, B₁과 B₂가 함께 O를 나타내고, R₂가 CH₂CH₂OH이고, R₅와 R₆이 OCH₃이고, X가 CH₂인 화학식 I의 화합물.

⁵ A₁, A₂, R₁, R₃, R₅ 및 R₆이 H이고, B₁과 B₂가 함께 O를 나타내고, R₂가 CH₂CH₂OAc이고, R₄가 Br이고, X가 CH₂인 화학식 I의 화합물. ⁶ A₁, A₂, R₁, R₃, R₅ 및 R₆이 H이고, B₁과 B₂가 함께 O를 나타내고, R₂가 CH₂CH₂OAc이고, R₄가 CH₂CH₂(2-피리딜)이고, X가 CH₂인 화학식 I의 화합물. ⁷ A₁, A₂, R₁, R₃, R₄, R₅ 및 R₆이 H이고, B₁과 B₂가 함께 O를 나타내고, R₂가 CH₂CH₂OH이고, X가 CH₂인 화학식 I의 화합물. ⁸ A₁, A₂, R₁, R₃, R₄, R₅ 및 R₆이 H이고, B₁과 B₂가 함께 O를 나타내고, R₂가 CH₂CH₂CH₂OH이고, X가 CH₂인 화학식 I의 화합물. ⁹ A₁, A₂, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆이 H이고, B₁과 B₂가 함께 O를 나타내고, X가 S인 화학식 I의 화합물. ¹⁰ A₁, A₂, R₁, R₃, R₄, R₅ 및 R₆이 H이고, B₁과 B₂가 함께 O를 나타내고, R₂가 CH₂CH₂CH₂NHCO(4- (OH)Ph)이고, X가 CH₂인 화학식 I의 화합물. ¹¹ Z₁, Z₂, R₁ 및 R₂가 H이고, X가 CO₂(CH₂)₄CH₃이고, R이 OH인 화학식 III의 화합물. ¹² Z₁, Z₂ 및 R₁이 H이고, R₂가 CH₂OH이고, X가 CO₂CH₃이고, R이 OH인 화학식 III의 화합물.. ¹³ Z₁과 Z₂가 함께 =O를 형성하고, R₁과 R₂가 Br이고, X가 CO₂CH₃이고, R이 OH인 화학식 III의 화합물. ¹⁴ A₁, A₂, R₁, R₃, R₅ 및 R₆이 H이고, B₁과 B₂가 함께 O를 나타내고, R₂가 H이고, R₄가 CH₂CH₂(2- 피리미디닐)이고, X가 CH₂인 화학식 I의 화합물. ¹⁵ Z₁과 Z₂가 H이고, R₁이 Br이고, R₂가 I이고, X가 CO₂CH₃이고, R이 OH인 화학식 III의 화합물. ¹⁶ Z₁, Z₂, R₁ 및 R₂가 H이고, X가 CO₂CH₃이고, R이 OH인 화학식 III의 화합물. ¹⁷ Z₁과 Z₂가 H이고, R₁ 및 R₂가 CH₂CH₂SCH₃이고, X가 CO₂CH₃이고, R이 OH인 화학식 III의 화합물. ¹⁸ A₁, A₂, R₁, R₂, R₃, R₅ 및 R₆이 H이고, B₁과 B₂가 함께 O를 나타내고, R₄가 CH₂CH₂(2- 피리다지닐)이고, X가 CH₂인 화학식 I의 화합물. ¹⁹ A₁, A₂, R₁, R₃, R₅ 및 R₆이 H이고, B₁ 및 B₂가 함께 O를 나타내고, R₂가 H이고, R₄가 CH₂CH₂(2- 피리딜)이고, X가 CH₂인 화학식 I의 화합물. ²⁰ Z₁, Z₂, R₁ 및 R₂가 H이고, X가 CO₂CH₃이고, R이 OCH₃인 화학식 III의 화합물. ²¹ A₁, A₂, R₁, R₃, R₄, R₅ 및 R₆이 H이고, B₁과 B₂가 함께 O를 나타내고, R₂가 (CH₂)₃-NH-C(=O)- 3,5-디히드록시페닐이고, X가 CH₂인 화학식 I의 화합물. ²² A₁, A₂, R₁, R₃, R₄, R₅ 및 R₆이 H이고, B₁과 B₂가 함께 O를 나타내고, R₂가 벤조일이고, X가 CH₂인 화학식 I의 화합물. ²³ A₁, A₂, R₁, R₂, R₃, R₅ 및 R₆이 H이고, B₁과 B₂가 함께 O를 나타내고, R₄가 CH=CH-C≡N이고, X가 CH₂인 화학식 I의 화합물.

실시예 34: MLK 활성화에 대한 겔 이동 검정

MLK의 활성화는 c-jun 전사를 유도시켜, 결과적으로 c-Jun 단백질을 증가시 킬 수 있다. c-Jun 단백질의 증가량은 겔 이동 검정으로 확인된 표준 검정법으로 측정할 수 있다 (본원에 전반적으로 참고로 포함되어 있는 문헌 (Garner, et al., Nucleic Acids Res., 1981, 9, 3047-3060)을 참조할 수 있다). c-Jun DNA-결합 부위를 코딩하는, 방사성 표지된 두가닥 DNA 올리고머를 핵상 세포 추출물과 함께 배양한 다음, 아크릴아미드 겔 전기영동시키고 보다 느린 이동도로 이동된 방사성 표지된 DNA를 정량화하였다. 이는 c-Jun 단백질과 결합되는 DNA 부분을 나타내는데, 이는 상기 추출물 중의 c-Jun 단백질의 양과 정비례하였다.

MLK의 활성화는 또한, c-Jun 인산화 반응을 유도할 수 있다. 이는, 예를 들면, 웨스턴 블롯 또는 ELISA와 같은 탐지 시스템에서 상기 단백질의 인산화 반응 형태를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 탐지할 수 있다.

실시예 35: 병아리 배아 뉴런의 생존

재료

라이보비츠 (Leibovitz)의 L15 배지, 글루코오스, 중탄산 나트륨, 트립신 및 항생물질을 지브코 (Gibco)로부터 구입하였다. 근육 추출물을 본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Henderson, et al., Nature, 1983, 302, 609-611)에 기재된 바와 같이 제조하였다. 기타 모든 시약은 달리 언급되지 않는 한, 시그마(Sigma)로부터 구입한 것이다.

세포 배양물

본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Weng, et al., NeuroReport, 1996, 7, 1077-1081)에 기재된 바와 같이 변형된, 본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Bloch-Gallego, et al., Development, 1991, 111, 221-232)에 제시된 절차에 따라서 면역학적 방법으로 운동뉴런 (배아 5.5일)를 분리하였다. 정제된 운동뉴런을 폴리-DL-오르니틴 및 라미닌 (1 ㎍/mL, Upstate Biotech)로 예비피복된 35 mm 조직 배양 디쉬 (Nunc) 상으로 시딩하였다. 이러한 배지는 중탄산 나트륨 (22.5 mM), 글루코오스 (20 mM), 프로게스테론 (2 x 10^-8M), 아셀렌산 나트륨 (3 x 10^-8M), 콘알부민 (0.1 ㎎/mL), 인슐린 (5 ㎍/mL), 페니실린-스트렙토마이신, 및 10% 열-불활성화 말 혈청을 갖는 L15이다. 근육 추출물을 30 ㎍/mL로 보충하였다. 화합물 III-3을 DMSO 중의 4 mM 원료 용액으로서 제조하고, 4℃ 하에 빛으로부터 보호하여 저장하였다. 처리된 배양물 및 대조군 배양물 중의 DMSO의 최종 농도는 0.125%이다.

척추방 교감신경성 신경절 (SG; 배아 12일(E12)), 배근 신경절 (DRG;E9) 및 모양체 신경절 (CG;E8)를 본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Lindsay, et al., Dev. Biol., 1985, 112, 319-328)에 기재된 바와 같이 지시된 배아일에서 병아리 배아로부터 절개하였다. 트립신 처리 및 해리한 후, 신경 세포 현탁액을, 10% 말 혈청이 보충된 햄 (Ham)의 F14 배지에서 폴리오르니틴-라미닌-피복된 배양 디쉬 상으로 평판 배양하였다. 평판 배양 직후, 생존 인자를 다음 농도로 가하였다: 신경 성장 인자 (NGF), 20 ng/mL; 모양체 신경영양 인자 (CNTF), 10 ng/mL. 배양물을 흡습한 환경 하 37℃ 및 5% CO₂에서 유지시켰다.

세포 계수

뉴런을 격자가 있는 35 mm 배양 디쉬 (Nunc)에 평판 배양하였다. 표면의 약 10%를 함께 포함하는 각 디쉬의 선별된 영역을 대상으로, 평판 배양 직후 및 평판 배양한 지 48시간 후에 상 투명 세포의 존재에 대해 스캐닝하여 생존율(%)을 평가하였다. 세포 생존율은 트립판 블루로 중요한 기관을 염색함으로써 (제시되지 않음) 확인하였다.

완전한(intact) DRG

신경절을, 0.05% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 무혈청 배지 (본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Bottenstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 514-517) 참조)에서 폴리-1-오르니틴 및 라미닌(각각 5㎍/인산염 완충 식염수 ml)으로 미리 피복된 96 웰 평판에 놓아두고, 흡습된 환경하 37℃ 및 5% CO₂ 하에 48시간 동안 유지시켰다. 평판 배양한 지 2시간 후, 처리된 신경절에 250 nM 화합물 III-3 또는 20 ng/mL NGF를 제공하였다.

화합물 III-3은 농도-의존적 방식으로 병아리 배아 말초 뉴런의 생존을 지지해준다

E9 배근 신경절 감각 뉴런 (DRG)와 E12 교감신경성 신경절 뉴런 (SG)의 해리된 배양물로부터 NGF를 제거하면, 이들은 48시간 이내에 PCD를 진행하게 된다. 이는 NGF 제거시 상기 배지에 화합물 III-3을 첨가함으로써 방지된다. 1 μM에서는, 화합물 III-3이 SG 뉴런의 94%를 유지시키고 DRG 뉴런의 8-90%가 48시간 후에서 살아 있다 (NGF-처리된 대조군: SG 65%, DRG 66%). 유사하게, 화합물 III-3은 24시간 후의 CNTF-의존성 모양체 신경절(CG) 뉴런의 생존율을 76%로 촉진시켰다 (CNTF-처리된 대조군 67%). 10% 혈청의 존재하에서는, 화합물 III-3의 생존 효과가 농도-의존적인데, 3가지 뉴런 집락 모두에 대해 1μM 근처에서 안정 상태에 도달하였다 (도 16A-C). 생존한 뉴런은 대조군 배양물과 비교해서 보다 두껍고 곡선 형태를 이룬 신경돌기를 지니는 광범위한 신경돌기 성장을 나타내었다 (도 17E-H). 4일 후, 생존 촉진 활성이 여전히 본래대로 유지되었다; DRG:화합물 III-3 52%, 성장 인자-처리된 대조군 41%; SG:화합물 III-3 83%, NGF-처리된 대조군 55%; CG:화합물 III-3 58%, CNTF-처리된 대조군 50%. 최적 조건하에서, 상기 배양물은 1주 이상 동안 화합물 III-3으로 유지될 수 있었다 (제시되지는 않음).

화합물 III-3은 농도-의존적 방식으로 병아리 배아 운동뉴런의 생존을 지지해준다

배양된 병아리 운동뉴런은 근육 추출물의 존재하에서 생존할 수 있고 진행 과정을 연장할 수 있는 반면, 이들의 부재하에서는 신속하게 사멸된다. 본 발명자들의 실험에서는, 48시간 후에, 운동뉴런의 65%가 근육 추출물의 존재하에서 생존하였으나, 처리되지 않은 대조군은 14%가 생존하였다. 무혈청 조건하에서는, 화합물 III-3의 생존 효과가 300 nM에서 최대이고, 근육 추출물에 의해 유도된 것 보다 다소 높다(79%). 이러한 시스템에서 화합물 III-3의 생존 효과의 농도-의존성은 말초 뉴런에서와 상이한데, 이는 300 nM 이상의 화합물 III-3 농도가 점차적으로 감소 효과를 나타내기 때문이다 (도 16A). 이는 화합물 III-3 활성의 몇몇 국면에 대한 운동뉴런의 특정한 민감도를 지시해줄 수 있다. 형태학적으로, 화합물 III-3으로 보호된 운동뉴런은 상 투명 세포체를 나타내었으며, 긴 신경돌기를 확장시킬 수 있는데, 이는 근육 추출물에 의해 유도된 것 보다 약간 더 두껍게 나타났다(도 17). 배양물에서 4일 후, 근육 추출물을 이용한 경우에는 운동뉴런의 42%가 살아있는 것과 비교해서, 화합물 III-3을 이용한 경우에는 56%가 살아 있었다. 300 nM에서는, 화합물 III-3-처리된 뉴런이 시험관내에서 1주 이상 동안 생존하였다(제시되지는 않음).

화합물 III-3은 완전한(intact) 배근 신경절로부터 신경돌기 성장을 촉진시킨다

상기 실험 결과는 화합물 III-3이 말초 및 중추 신경계로부터 배아 뉴런의 생존을 촉진시킬 뿐만 아니라 강한 신경돌기 성장을 가져온다는 것을 입증해준다. 많은 이들 확장물은 성장 인자의 존재하에서 유도된 것 보다 더 두껍게 보여진다 (도 17A-D를 도 17E-H와 비교한다). 이러한 효과는 또한, 250 nM 화합물 III-3의 존재하에서 배양된 완전한 배아 배근 신경절로부터 유도된 신경돌기 성장에서 관찰되었다 (도 18C). 신경돌기는 NGF(도 18B)와 화합물 III-3 모두에 반응하여 성장하는데; NGF에 의해 유도된 것은, 두껍고 가능하게는 섬유속 모양을 나타내는 화합물 III-3의 존재하에서의 성장 보다도 더 미세하고 보다 분지화되었다.

실시예 36: 생체내 처리

병아리 배아에서 발생적으로 조절된 운동뉴런 사멸

본 실시예는 본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Glicksman, et al., J. Neurobiol., 1998, 35, 361-370]에 상세히 기재되어 있다. E6에서, 계란 (Spafas, Preston, CT) 껍질에 창을 만들고, 비히클 (5% Solutol (등록상표) HS 15, 폴리에틸렌 글리콜 660 히드록시스테레이트; BASF Aktiengesellschaft, Ludwigshafen, Germany (인산염 완충 식염수, pH 7.2 중)) 또는 이러한 비히클 중의 특정 용량의 화합물 III-3을, 본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Oppenheim, et al., Science, 1991, 251, 1616-1617)에 기재된 바와 같이 E6에서부터 E9까지 1일 1회 맥관화 융모요막 상으로 직접 적용하였다. 배아를 E10에 희생시키고 이들의 척수를 제거한 다음, 카노이(Carnoy) 용액 (10% 빙초산, 60% 무수 에탄올, 30% 클로로포름)에 고정시키며, 일련의 파라핀 절편에 대해 처리한 후, 티오닌으로 염색하였다. 요추 세그먼트 1-8의 매 20번째 절편을 선행 기술분야에서 언급된 기준에 따라서 계수하였다 (참조: Clarke, et al., Methods In Cell Biology:Cell Death, 1995, Schwart & Osborne, Eds., Academic Press, New York, pp.277-321; 이는 본원에 전반적으로 참고로 포함되어 있다).

신생아 쥐에서 발생적으로 조절된 운동뉴런 사멸

미숙한 임신한 스프라그-돌리 쥐를 할란 라보라토리즈 (Harlan Laboratories; Indianapolis, IN)로부터 얻었다. 암컷 쥐 새끼를 태어난 날(P1)부터 시작하여 5일(P5) 동안 지속적으로, 5% 솔루톨 (Solutol)(등록상표) HS 15 또는 비히클 중의 화합물 III-3로 표적 회음 근육 전반에 걸쳐 매일 피하(SC) 손상시켰다. P10 또는 P60에서, 새끼를 참수시키고, 혈액을 헤파린 처리된 모세관에 모으며, 구해면체근의 성적 이성 척수 핵(SNB)을 함유하는 척수의 영역과 구해면체근(BC) 및 거근 아니(LA) 근육을 함유하는 회음 영역을, 식염수/포르말린을 상기 동물에게 관류시킨 후에 절개하였다. SNB를 함유하는 척수의 영역을 후-고정시키고, 파라플라스트에 봉매시키며, 10 ㎛으로 나누어 절단하고 크레실레크 바이올렛 (Cresylecht violet)으로 염색하였다 (본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Nordeen, et al., Science, 1985, 229, 671-673) 참조). 운동뉴런을 앞서 기재된 바와 같이 (Nordeen, et al., 상기 참조) 요추 5에서부터 척수의 천골 1 영역까지의 일련의 절편에서 X500으로 계수하였다. 처리 군에 대해 몰이해한 관찰자에 의해 코딩된 절편 상에서 현미경 목록을 만들었다. 운동뉴런 계수치를 세포 크기와 절편 두께에 대해 교정하고 (본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Konisgsmark, Contemporary Research Methods in Neuroanatomy, Nauta & Ebbesson, Eds., 1970, Springer-Verlag, New York, pp. 315-340) 참조) 통계학적 분석을 원-웨이 분산 분석 (ANOVA)으로 수행하였다. 회음 근조직을 후-고정시키고, 참수하며, 파라플라스트에 봉매한 다음, 10 ㎛로 나누어 절단하고 밀리간 (Milligan) 트리크롬으로 염색하였다. 명시야 현미기술 (250X)을 이용하여, 정상적인 암컷과 화합물 III-3-처리된 암컷 (405 동물/군)에서의 BC 및 LA 근육을, 이들의 위치와 가로무늬 섬유의 존재 여부 모두에 의해 양성적으로 확인하였다. 투시 현미경 (62.5)을 사용하여 대체 절편으로부터 근육 조직의 윤곽을 추적하고, 디지타이징 패드 및 컴퓨터-이용 형태 시스템 (Sigmascan, Jundel Scientific)을 사용하여 단면적을 측정하였다. 총 단면적을 취하고 이를 절편 두께에 곱함으로써 근육 용적을 산정하고, 샘플링된 구조의 %에 대해 교정하였다.

수집된 혈액을 실온에서 5분 동안 원심분리시킨 다음, 혈장을 꺼내어 -20℃ 하에 동결시켰다. 본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Wingfield, et al, Steroids, 1975, 26, 311-327)에 제시된 절차를 수행하여 방사성면역검정시킴으로써 혈청 테스토스테론 수준 (6-7마리 동물/군)을 측정하였다.

다 자란 쥐에서 악소토미(axtomy)-유도된 운동뉴런 분화

네움부톨 마취 하에 다 자란 암컷 스프라그-돌리 쥐 (120 내지 180g)의 목에서 좌측 혀 밑 신경을 절개하고, 화합물 III-3 또는 이의 비히클 (5% Solutol (등록상표) HS 15) 50 ㎕를 겔폼 (등록상표) (Gelfoam; AJ Buck, Owings Mills, MD) 조각에 적용한 다음, 상기와 같이 절개된 신경의 근접 말단 주변에 랩을 씌운다. 7일 후, 상기 동물을 마취시키고, 이에 소렌손 완충액, 0.07M 인산염, pH 7.2 중의 4% 파라포름알데히드를 관류시켰다. 뇌 간을 꺼내고, 40 ㎛ 두께의 일련의 관상 절편을 저온조에서 절단하였다 (본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Chiu, et al., NeuroReport, 1994, 5, 693-696) 참조). 매 5번째 절편을 대상으로 하여, 케미콘 (Chemicon)으로부터 얻은 항-ChAT 모노클로날 항체의 1:350 희석물을 사용하여 앞서 기재된 바와 같이 (본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Chiu, et al., J. Comp. Neurol., 1993, 328, 351-363) 참조) ChAT 면역조직화학에 대해 처리하였다. 배경 위에 분명하게 염색된 세포를 염색된 절편에서 계수하는데; 목록화된 세포의 수는 혀 밑 핵의 악소토마이즈 측면 상에서의 ChAT-면역반응성 세포 수 대 대조군 (손상되지 않음) 측면 상의 면역반응성 세포 수의 비로서 표시된다.

화합물 III-3은 쥐 배아 운동뉴런이 시험관내에서 아포프토틱 사멸되지 못하도록 보호해주었고, 시그날링 경로를 억제시켜 이들 세포에서 JNK1을 활성화시켰다 (본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Maroney, et al., J. Neurosci., 1998, 18, 104-111) 참조). 생체내에서의 잠재적 활성을 결정하기 위하여, 화합물 III-3을 발생적으로 조절된 프로그램된 운동뉴런 사멸의 두 모델과 다 자란 쥐 운동뉴런에서의 악소토미-유도된 탈분화 모델에서 평가하였다. 병아리에서는, 대략 50%의 척수 운동뉴런이 E5 내지 10 동안에 PCD를 진행하였다 (본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Hamburger, et al., J. Neurosci., 1982, 1, 38-55; Purves, et al., Body and Brain: A Trophic Theory of Neural Connections, 1988, Harvard University Press, Cambridge, MA) 참조). 이러한 기간 동안 화합물 III-3을 융모요막에 적용한 결과, 운동뉴런 사멸이 용량-의존적 방식으로 방지되었다 (도 19). 정상적으로 사멸하는 운동뉴런의 40%가 시험된 가장 높은 두 용량 (2.3 및 7 ㎍/일)에서 보호된 반면, 운동뉴런의 25%가 보다 낮은 용량 (1.2 및 1.8 ㎍/일)에서 보호되었다 (도 19).

암컷 쥐의 초기 분만 전후 동안 (생후(PN) 4일이 될때까지의 말기 배아 단계), SNB 중의 운동뉴런의 50% 이상이 PCD를 통하여 제거되었다 (본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Breedlove, J. Neurobiol., 1986, 17, 157-176) 참조). 숫컷에서는, 이 핵 중의 운동뉴런이 가로무늬 음경근 관련된 I 융합 반사를 자극하여 활성화시켰다. 안드로겐 스테로이드의 고환성 분비는 숫컷에서 SNB 운동뉴런 사멸을 저하시키며, 이러한 뉴런에 의해 자극되어 활성화된 BC 및 LA 근육의 수축을 상당 부분 방지시킨다. 테스토스테론을 암컷 새끼에게 투여하면, 완전하게 남성화된 수 많은 SNB 운동뉴런이 생성되고 (Nordeen, et al. 상기 참조), BC 및 LA 근육 수축을 방지하였다 (본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Waiman, et al., Endocrinology, 1941, 29, 955-978) 참조). 화합물 III-3을 암컷 쥐(PN 1-5)에게 매일 피하 투여하면, 운동뉴런 사멸이 상당히 약화되었다 (도 20A). 화합물 III-3에 의한 SNB 운동뉴런 사멸의 방지는 두 용량(0.5 및 1 ㎎/kg/일)에서 일어났다. 0.5 및 1 ㎎/kg/일의 최대 유효 용량에서 화합물 III-3을 투여한 결과, 운동뉴런 생존율이 70% 증가하였는데, 이는 테스토스테론의 효과와 동등한 것이다 (도 20A). 화합물 III-3은 처리된 암컷의 혈장 테스토스테론 수준을 변화시키지 않았다. 1-㎎/kg/일 군에서 혈장 테스토스테론 수준을 방사성면역 측정한 결과, 비히클 대조군 군과 비교할 때 어떠한 상당한 차이도 나타내지 않았다 (각각 0.016±0.008 ng/mL 및 0.029±0.015 ng/mL 평균의 표준 오차(S.E.M.)).

화합물 III-3 처리가 운동뉴런 생존을 장기간 지속시키는데 유효한 지를 결정하기 위하여, 암컷을 동일한 기간 PN(1-5) 동안 화합물 III-3 (0.5 및 1 ㎎/kg/일)으로 처리하였다. 비히클 및 양 처리 군의 동물 절반을 PN10에 희생시켰다. 이어서, 나머지 동물들은 PN60에 희생시킬 때까지 추가의 화합물 III-3 처리없이 유지시켰다. 앞서 관찰된 바와 같이 (도 20A), 화합물 III-3 처리시키면, 운동뉴런 생존율이 70% 증강되었다 (도 20B). 더욱이, 이들 보호된 운동뉴런의 100%는 화합물 III-3으로 마지막 처리한 지 55일 후에 형태학적으로 동일할 수 있다 (도 20B). 신생아 기간 동안 운동뉴런 사멸의 화합물 III-3 억제로 인해, 운동뉴런 생존율이 성인 수준으로 되었다.

근위축성 측색 경화증과 같은 성인 질환에서의 운동뉴런 상실의 황폐화 효과와 명백한 증명에도 불구하고, 대부분의 운동뉴런 손상 동물 모델에서의 다 자란 운동뉴런은 사멸되지 않으려고 하였다. 그러나, 축색돌기 손상은, 병이 든 변성 운동뉴런에서의 사멸 이전의 변성 변화를 모사할 수 있는 다 자란 운동뉴런에서 형태학적 변화 (Oppenheim, et al., 상기 참조) 뿐만 아니라 생화학적 변화 (본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Oppenheim, et al., 상기 참조; Rende, et al., J. Comp. Neurol., 1992, 319, 285-298; Chiu, et al., J. Comp. Neurol., 1993, 328, 351-363)를 가져다 준다. 이러한 유형의 변화의 한 예가 혀를 자극하여 활성화시키는 혀 밑 신경의 악소토미로부터 발생된다. 다 자란 쥐 중의 상기 신경을 일측성 절개하면, 7일 후 동측 핵에서의 ChAT-면역반응성 혀 밑 운동뉴런의 95%가 상실되었다 (본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Chiu, et al., NeuroReport, 1994, 5, 693-696) 참조). ChAT 면역반응성 상실은 영구적이지 않다. 악소토미한 지 4주 후, 운동뉴런의 100%가 대조군 수준의 ChAT 면역반응성으로 복구되었다 (본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Borke, et al., J. Neurocytol., 1993, 22, 141-153). 반대측성의 혀 밑 운동뉴런에서의 ChAT 면역반응성은 전혀 영향을 받지 않았다 (Chiu, et al., 상기 참조) (도 21 및 표 5).

겔폼 (등록상표)에서 혀 밑 신경의 인접 말단에 적용한 경우, 화합물 III-3은 악소토미한 지 7일 후에 평가된 동측 혀 밑 운동뉴런에서의 ChAT 면역반응성 저하를 용량-의존적으로 약화시켰다. 최대 유효 용량 (50 ㎍)에서는, 악소토미화되고 처리되지 않은 대조군과 비교해서 ChAT-면역반응성 운동뉴런이 40% 더 증가하였다 (도 21B 및 표 5). 보다 낮은 용량과 높은 용량 간에는 벨-모양의 용량 의존성이 나타났는데, 이로써 처리되지 않은 대조군 보다 높은 생존율을 나타내 주었지만, 이는 50 ㎍에서 달성된 것보다는 덜하다. SNB 모델의 경우에 밝혀진 바와 같이, 시험된 어떠한 용량에서도 이들 동물에서 어떠한 연합된 중량 손실, 사망률 또는 총 조직 손상도 나타나지 않았다.

생체내에서 운동뉴런 변성의 3가지 별개의 모델에서는, 화합물 III-3이 다음에 대해 신경보호 활성을 나타냈다: 배아에서 요추 척수 운동뉴런의 발생적으로 조절된 PCD (도 19), 생후 SNB 운동뉴런의 안드로겐-민감성 사멸 (도 20), 및 다 자란 혀 밑 운동뉴런에서 작용성 마커인 ChAT의 악소토미-유도된 상실 (도 21 및 표 5). 화합물 III-3은 피하 주사에 의해 말초적으로 투여되거나, 신경의 절단 말단에 국부적으로 적용되거나 또는 병아리 배아 융모요막 상에 직접적으로 오버레이되는 경우에 유효하다. 모 분자 K-252a와는 반대로, 화합물 III-3은 운동뉴런 풍부한 배양물에서의 생존을 매개하는데 있어서 대략 5배 더 강력하고 (데이타는 제시되지 않음) trkA 티로신 키나아제 및 몇몇 세린 트레오닌 키나아제에 대한 억제 활성을 나타내지 않았다 (본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Maroney, et al., 상기 참조; Kaneko, et al., J. Med. Chem., 1997, 40, 1863-1869).

악소토미화 혀 밑 운동뉴런에서의 콜린 아세틸트랜스퍼라아제 면역반응성에 대한 화합물 III-3의 효과

		ChAT-양성 운동뉴런
처리	n	실험/대조군	%	평균/군
비히클	2	20/544	3.68	4.01
		19/437	4.35
3.6 ㎍ III-3	2	55/420	13.10	12.84*
		72/572	12.59
25 ㎍ III-3	2	95/597	15.91	19.01*
		142/642	22.12
50 ㎍ III-3	2	188/484	38.84	41.34*
		278/637	43.85
100 ㎍ III-3	4	465/920	50.54	32.61*
		235/784	29.98
		178/770	23.12
		182/679	26.80
200 ㎍ III-3	2	99/461	21.48	24.96*
		159/559	28.44
허위 조작됨	2	350/335	104.48	101.24
		292/298	98.00
* p<0.05, 대조군 비히클 처리된 동물과 비교하여 통계학적으로 유의적임.

화합물 III-3을 절개 직후 혀 밑 신경의 인접 말단에 겔 발포체로 가하였다. 7일 후, 동물을 희생시키고, 혀 밑 핵을 통하여 일련으로 나누어 절개한 다음, 매 5번째 절편을 항-ChAT 항체로 면역염색시켰다. 상기 핵의 동측 (실험) 및 반대측성 (대조군) 측면에서 ChAT-양성 뉴런을 계수하였다.

MLK-3 경로의 억제제는 생체내 효능을 나타내고 MPTP 모델에서 MKL-3의 인산화 반응 사건 하단을 차단한다

MPTP를, 흑질에서 선조체 도파민 작용성 터미날 및 세포체의 손실을 가져다주는 용량 (40 ㎎/kg)으로 투여하였다. 티로신 히드록실라제를 상기 흑질 중의 도파민 작용성 신경 터미날에 대한 마커로서 사용하였다. 화합물 III-3을 전신 투여하면, MPTP 병변 후 흑질 티로신 히드록실라제 면역반응성 뉴런의 손실이 약화되었다 (도 22a; Saporito et al., 1999). 화합물 III-3은 MLK-3의 공지된 억제제이기 때문에, MLK-3의 하단 기질의 활성화는 MPTP-처리된 마우스에서 측정하였다. 면역블롯 (도 22b) 또는 ELISA (도 22c)에 의해 일인산화 형태의 MKK4를 인식하는 포스포-MKK4 특이적 항체 (New England Biolabs, Beverly, MA)를 사용하여 인산화 MKK4의 수준을 측정하였다. MPTP 투여는 흑질에서의 인산화 반응 MKK4의 수준을 대조군 수준에 비해 5배 정도까지 상승시켰다 (도 22b). MPTP를 투여한 지 4시간 후에 피이크 상승이 일어났으며, 이는 MPP⁺의 피이크 CNS 수준과 부합된다. MPTP-매개된 MKK4 인산화 반응은 1-데프레닐로의 예비처리에 의해 약화되는데, 이는 이들 인산화 반응 사건이 MPP⁺에 의해 매개된다는 것을 나타낸다 (도 22c). 더욱이, MKK4 인산화 반응은 MPTP-유도된 흑선조체 도파민 작용성 손실에 대한 보호를 가져다 주는 용량 (1 ㎎/kg)에서 화합물 III-3-예비처리에 의해 부분적으로 억제된다 (도 22c). 이들 데이타는 MPTP(MPP⁺)가 MLK3의 하단 기질인 MKK4를 활성화시킨다는 것을 입증해준다. 더욱이, 이들 데이타는 MLK3의 공지된 억제제가 생체내에서 상기 키나아제 경로의 활성화를 억제한다는 것을 입증해준다.

실시예 37: 염증

THP-1 세포에서 LPS에 의한 IL-1 및 TNF-α의 유도 및 이러한 유도에 대한 인돌로카르바졸 및 피롤로카르바졸의 효과

면역계의 세포를 선택하는데, 이는 많은 키나아제가 수 많은 면역학적 기능 (예를 들면, 사이토킨 합성 유도 및 사이토킨의 생물학적 반응 유도)의 조절과 연관이 있기 때문이다. 최근의 보고서 (본원에 전반적으로 참고로 포함된 문헌 (Hambleton, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2774-2778) 참조)는 단핵세포 유래된 세포주를 LPS로 처리하면 JNK 활성이 신속하게 활성화된다고 제시하였다. 단핵세포가 리포폴리사카라이드(LPS)와 같은 세균성 내독소와 접촉되면, 이들은 염증성 사이토킨인 IL-1과 TNF-α를 생성시켰다. 이들 두 사이토킨의 생성 억제가 면역계의 특정한 염증 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 이들 사이토킨은 시판용 ELISA 키트에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 본 발명자들은 (1) 인돌로카르바졸 및 융합된 피롤로카르바졸이 본 발명자들의 단핵세포주 THP-1에서 IL-1 및 TNF-α의 합성을 억제시킬 수 있는지를 결정하고, (2) JNK가 THP-1 세포에서 LPS에 의해 활성화되는지를 결정하며, (3) LPS에 의한 JNK의 활성화가 인돌로카르바졸 및 융합된 피롤로카르바졸에 의해 억제될 수 있는지를 결정하기 위한 실험을 고안하였다.

실험 과정

THP-1 세포를 10% 태내 소 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 성장시켰다. LPS (이. 콜리 혈청형 0111.B4, TCA 추출됨)을 시그마로부터 구입하고 PBS에 용해시켰다. IL-1 및 TNF-α를 검정하기 위한 ELISA 키트는 다음 구입처 (Boehringer-Mannheim)으로부터 구입하고 제조업자에 의해 지시된 바와 같이 THP-1 배지 상에서 검정을 수행하였다. 각 검정을 이용하여 지시에 따른 표준 곡선을 얻었다.

4 x 10⁵ 세포/mL로 THP-1 세포 1 또는 2ml를 갖는 12웰 배양 평판에서 실험을 수행하였다. 상기 배지 및 그 후 사이토킨 검정을 위해 각종 시간에 수집된 배지에 LPS를 가함으로써 IL-1 및 TNF-α를 유도시켰다. 세포를 원심분리시켜 제거 하고, 상등액을 검정할 때까지 -70℃ 하에 동결시켰다. 비용을 최소화하기 위하여, 실험을 이중 배양물에서 수행하고, 이중 상등액을 원심분리시킨 후에 모았다. 이와 같이 모은 각 상등액을 2회 검정하였다. 100% DMSO 중의 인돌로카르바졸 및 융합된 피롤로카르바졸의 원료 용액을, 10% 태내 소 혈청을 함유하는 배지 또는 0.5 ㎎/mL BSA를 함유하는 배지에서 목적하는 농도가 되도록 희석시켰다. 달리 언급되지 않으면, LPS를 가하기 1시간 전에 THP-1 세포에 화합물을 가하였다.

JNK 단백질을 용해된 THP-1 세포의 추출물로부터 면역침전시킨 후에 JNK 활성에 대한 검정을 수행하였다. 펠릿화 THP-1 세포를 500 ㎕의 프락 (Frac) 완충액 (10 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 30 μM 피로인산 나트륨, 1 ㎎/mL BSA, 1% 트리톤-X-100)에서 15분 동안 얼음 상에서 용해시켰다. 이 추출물을 14K로 10분 동안 원심분리시키고 JNK 항체(Santa Cruz) 5 ㎕를 상기 상등액에 가하였다. 추출물을 4℃에서 60분 동안 회전시키고, 세척된 단백질 A 세파로오스 (프락 중의 20%w/v) 75 ㎕를 가하며, 추출물을 30분 더 회전시켜 항체 복합체가 단백질 A 세파로오스에 결합되도록 하였다. 이러한 단백질 A 세파로오스를 프락 완충액으로 2회 세척하고, 20 mM Hepes, pH 7.6, 20 mM MgCl₂, 2 mM DTT로 1회 세척한 다음, 키나아제 완충액 (20 mM Hepes, 20 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 1 ㎍ 재조합 c-jun 및 2μM ATP-γ-³²P, 2μCi) 30 ㎕에서 30℃ 하에 15분 동안 배양하였다. 4X SDS 겔 부하 완충액 10 ㎕를 가함으로써 반응을 종결짓고, 이를 80℃에서 3시간 동안 가열하고, 단백질을 10% SDS 겔 상에서 분석하였다. 상기 겔을 건조시키고, 포스포-영상화기 평판에 노출시킨 다음, 방사성 밴드를 포스포-영상화기 상에서 분석하였다.

초기 실험 결과는 2 ㎍/㎖의 LPS를 IL-1의 최대 수율을 제공해준다는 것을 지시하며, 이러한 농도의 LPS가 그 후 모든 실험에서 사용하였다. 상기 사이토킨의 최대 수율을 위해 LPS를 가한 후의 최소 시간은, LPS를 가한 후에 각종 시간에서 검정용 배지의 등취량을 취함으로써 결정하였다. 첫번째 실험은 LPS를 가한 지 5시간 이내에 IL-1 및 TNF-α가 최대 수율로 획득되었다는 것을 나타내었다. 가장 이른 수집 시간이 첫 번째 실험에서 2.4시간이기 때문에, 두 번째 실험은 LPS를 가한 지 15분 후에 출발하여 수집한 배지를 사용하여 수행하였다. TNF-α만이 검정되는 이러한 실험의 결과는 LPS를 가한 지 3시간 후에 최대 수율로 획득되었다는 것을 나타내었다. LPS를 가한 지 90분 후까지는 배지에서 상당한 어떠한 TNF-α도 발견되지 않았다.

최대 수율의 신속한 획득은 상기 2가지 사이토킨의 합성이 극히 엄격하게 조절된다는 것을 지시해준다 (신속한 합성 및 신속한 하향 조절). LPS를 가하기 전에, 세포 배양물을 RNA 합성 억제제인 악티노마이신 D 또는 단백질 합성 억제제인 사이클로헥스이미드로 30분 동안 처리하였다. LPS를 가한 지 3시간 후에 배지를 수집하고 TNF-α를 검정하였다. 신규한 RNA와 신규한 단백질 합성 모두가 TNF-α유도에 필요하기 때문에, 어느 한 억제제로 처리된 세포의 배지에서는 TNF-α가 전혀 발견되지 않았다. 그 다음 실험을 수행하여, 화합물 III-3이 IL-1 및 TNF-α의 유도를 억제하는지를 결정하였다. 화합물 III-3은 각각 IC₅₀값 267 nM 및 139 nM으 로 IL-1 및 TNF-α 모두의 유도를 억제하였다. 10% 태내 소 혈청을 함유하는 배지 중의 세포를 사용하여 이들 실험 결과를 얻었다. 화합물의 신경영양 활성을 알아보기 위하여 척수 조직 및 기저 전뇌 조직을 이용한 검정을 무혈청 배지 (500㎍/mL BSA)에서 수행하기 때문에, 무혈청 배지에서 IL-1 및 TNF-α의 억제에 대한 IC₅₀값을 결정하는 것이 관심있는 일이다. THP-1 세포를 무혈청 배지(500㎍/mL BSA)에서 화합물 III-3로 처리한 경우, IC₅₀값은 269 nM에서 23 nM으로 10배 감소된다. 달리 언급되지 않는 한, 그 후 수행된 모든 실험은 무혈청 배지에서 수행한 것이다. 화합물 III-3에 의한 THP-1 세포에서의 IL-1 및 TNF-α의 유도 억제는, 화합물 III-3이 상기 사이토킨의 정상적인 양 이상을 생성시킴으로써 야기된 병리학적 상태를 치료하는데 있어서 치료 요법으로서 유용할 수도 있다는 것을 제시해준다. 패혈성 쇽이 이러한 상태이다. 패혈성 쇽은 순환시 그람 음성 세균의 성장에 의해 유발되며, 이로 인해 다량의 내독소 LPS가 방출된다. 이때, 이러한 LPS는 1차적으로 단핵세포와 대식세포를 자극하여 다량의 IL-1 및 TNF-α를 생성시킨 다음, 대량의 조직 손상 및 많은 경우에는 사망을 유발시켰다.

몇몇 화합물을 대상으로 하여, TNF-α를 억제하는 이들의 능력에 대해 시험하고, JNK를 억제하는 능력과 비교하였다. 그 결과가 표 6에 제시되어 있다.

	THP-1 세포		Cos 7 세포 내의 과발현된 MLK3
화합물	TNF-α IC50 nM	JNK % 억제 500 nM	JNK % 억제 500 nM
III-1	49.5	93.5	83.8
III-3	29	93	94
I-2	>5000	78.5	85
I-3	366	80.5	93.7
I-4	75.5	79.5	95
I-5	514	89	97.2
I-6	817.5	77.5	57.8
I-7	1009	74	85.5
III-4	462.5	81	66
III-5	4	84.5	96
III-7	590.5	11.5	54
III-8	11.5	51	94
III-10	4298	48	78
I-10	4500	62	94
III-11	686	51	92.5

저캣 (Jurkat) 세포에서 IL-2의 유도에 대한 화합물 III-3의 효과

화합물 III-3이 저캣 세포에서 IL-2의 유도를 억제하는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다.

실험 절차

저캣 세포를 10% 태내 소 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 성장시켰다. TNF-α는 프로메가로부터 구입한 것이고 안티 CD3 및 안티 CD28 항체는 파미겐 (Pharmigen)으로부터 구입한 것이다. 저캣 실험을 96 웰 평판에서 200 ㎕로 수행하였다. 다음 구입처 (Boehringer-Mannheim)으로부터 구입한 ELISA 키트로 IL-2를 측정하였다. 저캣 세포를 가하기 이전에, CD3 및 CD28에 대한 항체가 상기 96 웰 평판의 플라스틱에 결합되도록 하였다 (PBS 중에서 18시간). 세포를 항체 피복된 평판에 가하기 1시간 전에 화합물로 처리하였다. CD3 및 CD28에 대한 항체를 사용하여 T 세포 수용체를 활성화시키고 IL-2를 유도하였다. IL-2는 유도가 개시된지 6시간 후와 24시간 후 사이에 저캣 세포로부터 방출되었다 (도 23A). 어떠한 IL-2도 항시적으로(constitutively) 만들어지지 않았다 (도 23A CNT). 그 다음, IL-2 유도에 대한 화합물 III-3의 효과 (유도에 앞서 화합물 III-3으로 1시간 동안 처리함)를 평가하였다 (도 23B). 500 nM의 화합물 III-3 농도가 IL-2 유도를 80% 이상 억제하였다 (도 23B). 화합물 III-3 및 화합물 1-4를 사용하여 보다 광범위한 용량 반응 실험을 수행하는데, 화합물 III-3의 경우에는 IC₅₀값 139 nM이 생성되었고 화합물 1-4의 경우에는 IC₅₀값 207 nM이 생성되었다 (도 23C).

본 특허 명세서에 언급된 각각의 특허, 출원 및 발행된 공보는 본원에 전반적으로 참고로 포함되어 있다.

당 업계의 숙련인에 의해 인지되는 바와 같이, 본 발명의 요지를 벗어나지 않고서도 수 많은 변화 및 변형이 본 발명의 바람직한 양태에 대해 이루어질 수 있다. 이러한 변화는 본 발명의 범주 내에 속하였다.

<110> Maroney, Anna Walton, Kevin Knight, Ernest Glicksman, Marcie Dionne, Craig Neff, Nicola <120> Methods For Modulating Multiple Lineage Kinase Proteins And Screening Compounds Which Modulate Multiple Lineage Kinase Proteins <130> CEPH0431 <140> <141> <160> 18 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Novel Sequence <400> 1 Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Ala Cys Met Gly Ile Gly Ala Tyr Tyr 1 5 10 15 Thr <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Novel Sequence <400> 2 Gly Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys Ala Trp Ala Gly Gly Ala Cys Cys 1 5 10 15 Ala Ser Ala Cys Arg Thr Cys 20 <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Novel Sequence <400> 3 Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Arg Thr Ile Cys Ala Tyr Met Gly Ile 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Tyr Thr Ile Gly Cys Ile Gly Cys Ile Met Gly Ile Ala 20 25 30 Ala <210> 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Artificial Sequence: Novel Sequence <400> 18 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

Claims

(a) 다중 계통 키나아제 단백질(multiple lineage kinase protein)을 함유하는 인간을 제외한 동물의 세포를, 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 조절(modulation)하고 세포 생존 또는 세포 사멸을 촉진시키는 화합물과 접촉시키는 단계,

(b) 상기 화합물이 상기 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 증가시키는지 감소시키는지를 확인하는 단계 및

(c) 상기 화합물이 세포 생존 또는 세포 사멸을 촉진시키는지를 확인하는 단계

를 포함하는, 인간을 제외한 동물에서의 다중 계통 키나아제 단백질의 활성을 조절하고 세포 생존 또는 세포 사멸을 촉진시키는 화합물의 확인 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질이 다중 계통 키나아제 1, 다중 계통 키나아제 2, 다중 계통 키나아제 3, 로이신 지퍼 함유 키나아제, 이중 로이신 지퍼 함유 키나아제 및 다중 계통 키나아제 6으로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
제2항에 있어서, 상기 세포가 시험관내에서 접촉되는 방법.
제2항에 있어서, 상기 세포가 생체내에서 접촉되는 방법.
제2항에 있어서, 상기 단백질 활성이 상기 단백질의 기질의 활성 또는 인산 화 상태를 측정함으로써 확인되는 방법.
제5항에 있어서, 상기 기질이 JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, p38α, p38β, p38γ, p38δ, MEK1, MEK2, MKK3, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1, 및 AEX-3의 포유 동물 상동물로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
제2항에 있어서, 상기 단백질 활성이 상기 단백질의 기질의 활성, 상기 단백질의 기질의 양, 또는 상기 단백질의 상기 기질을 코딩하는 mRNA의 양을 측정함으로써 확인되는 방법.
제2항에 있어서, 상기 단백질 활성이 시험관내 키나아제 검정 또는 결합 검정에 의해 확인되는 방법.
제2항에 있어서, 상기 세포 생존의 촉진이, 사멸될 위기에 있는 세포를 사용하여 상기 화합물과 접촉된 살아있는 세포의 양을 상기 화합물과 접촉되지 않은 살아있는 세포의 양과 비교함으로써 확인되는 방법.
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제2항에 있어서, 상기 세포 생존의 촉진이 아포프토시스의 감소를 관찰함으로써 확인되는 방법.
제2항에 있어서, 상기 세포가 뉴런 세포(neuronal cell)인 방법.
제2항에 있어서, 상기 세포가 1차 배아 운동뉴런 세포(motoneuron cell), 뉴런 세포(neuronal cell), 또는 상기 다중 계통 키나아제 단백질을 과발현하는 세포인 방법.
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제1항에 있어서, 상기 세포 사멸의 촉진이, 사멸될 위기에 있는 세포를 사용하여 상기 화합물과 접촉된 살아있는 세포의 양을 상기 화합물과 접촉되지 않은 살아있는 세포의 양과 비교함으로써 확인되는 방법.
제9항 또는 23항에 있어서, 상기 세포가 1차 배아 운동뉴런 세포인 방법.
제9항 또는 23항에 있어서, 상기 세포가 상기 다중 계통 키나아제 단백질을 과발현하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 세포 사멸의 촉진이 아포프토시스의 증가를 관찰함으로써 확인되는 방법.
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제2항에 있어서, 상기 세포가 임파세포, 대식세포 또는 단핵세포인 방법.