CZ2001701A3 - Způsob identifikace sloučeniny, která pozměňuje aktivitu kinasových proteinů s násobnou vazbou - Google Patents

Description

'Způsoby pozměňování kinasových proteinů s násobnou vazbou

Oblast techniky

Tento vynález se částečně zaměřuje na způsoby pozměňování členů skupiny kinas s násobnou vazbou (MLK), způsobů identifikace sloučenin, které pozměňují kinasový protein s násobnou vazbou a buď podporují přežívání buňky nebo podporují zánik buňky, způsobů identifikace sloučenin, které mohou být použitelné při léčení neurodegenerativních poruch a/nebo zánětu a způsobů léčení neurodegenerativních poruch sloučeninami, které inhibují kinasový protein s násobnou vazbou.

Dosavadní stav techniky

Skupina kinasových proteinů s násobnou vazbou (MLK) zahrnuje proteiny, ve které jsou proteinové sekvence kinasových domén velice podobné sekvencím MAPKKK, avšak mezi sebou navzájem jsou podobnější než vůči kterémukoliv členu skupiny MKPKKK. Členové skupiny MLK zahrnují část velice složitých kinasových kaskád, jako je například kaskáda signalizující stres zahrnující mimo jiné pozměnění c-Jun N-terminální kinasy (JNK), která dále pozměňuje mimo jiné transkripční faktory včetně c-Jun, ATF2 a ELK-1. JNK se popisuje v US patentech 5 534 426, 5 593 884, 5 605 808 a v publikaci WO 95/03324 a tyto materiály se zde zahrnují v plném znění formou odkazu.

Skupina MLK zahrnuje částečně následující skupiny:

1) kinasa s násobnou vazbou 1 (MLK1), 2) kinasa s násobnou vazbou 2 (MLK2), 3) kinasa s násobnou vazbou 3 (MLK3), 4) kinasa nesoucí leucinovy zipper (LZK), 5) kinasa nesoucí • · • ·· • ·

Obrázek k anotaci

dvojitý leucinový zipper (DLK) a 6) kinasa s násobnou vazbou 6 (MLK6). MLK1 má katalytickou doménu podobnou oběma kinasam specifickým pro Tyr a Ser/Thr, Dorrow a kol., Eur. J. Biochem., 213. 701-710 (1993). MLK2 má rovněž katalytickou doménu podobnou oběma kinasam specifickým pro Tyr nebo Ser/Thr, Dorrow a kol., Eur. J. Biochem., 213, 701-710 (1993) . MLK2 se též udává jako MST, Katoh a kol., Oncogene, 10, 1447-1451 (1995). MLK3 obsahuje protein, který navíc ke kinasové doméně obsahuje dva leucinové zippery s přiléhající bazickou oblastí karboxylového konce a oblastí bohatou na prolin, Ing a kol., Oncogene, 1745-1750 (1994). MLK3 se též uvádí jako SPRK [Gallo a kol., J. Biol. Chem., 269, 15092-15100 (1994)] a PTK1 [Ezoe a kol., Oncogene, 9, 935-938 (1994)]. LZK je kinasa nesoucí leucinový zipper, [Sakuma a kol., J. Biol. Chem., 272. 28622-28629 (1997)]. DLK má kinasovou doménu a dva předpokládané motivy leucinového zipperu, Holzman a kol., J. Biol. Chem., 269, 30808-30817 (1994). DLK se též nazývá ZPK [Reddy a kol., Biochem. Biophys. Res. Comm., 202, 613-620 (1994)] a MUK [Hirai a kol., Oncogene, 12, 641-650 (1996)]. Členové skupiny se též napříkald popisují v US patentech 5 676 945, 5 554 523, WO 93/15201, kanadském patentu 2 148 898, v publikacích Diener a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 94. 9687-9692 (1997), DeAizpurua a kol., J. Biol. Chem., 272, 16364-16373 (1997), Tung a kol., Oncogene, 14, 653-659 (1997), Sells a kol., Trends in Cell Biol., 7, 161-167 (1997), Mata a kol., J. Biol. Chem., 271. 16888-16896 (1996), Hirai a kol., J. Biol. Chem., £72, 15167-15173 (1997), Fan a kol.,

J. Biol. Chem., 271. 24788-24793 (1996), Blouin a kol., DNA and Cell Biol., 1$, 631-642 (1996), Pombo a kol., Nátuře, 377. 750-754 (1995), Kiefer a kol., EMBO J., 1£, 7013-7025 (1996), Hu a kol., Genes & Dev., lfi, 2251-2264 (1996), Su a kol., EMBO J., 16, 1279-1290 (1997) a Dorow a kol., Eur.

·· · ·♦ · · * · «··

J. Biochem., 234, 492-500 (1995). Nedávno byla identifikována kinasa příbuzná MLK v databázi EST. Sekvence deoxyribonukleové kyseliny v tomto klonu, MLK6, se popisuje sedmi záznamy. Jejich identifikační čísla klonů jsou 1007489, 1460085, 510915, 666323, F5555, 482188 a 178522 a všechny jejich sekvence se zde zahrnují v plném znění formou odkazu. Každá z citací v předchozím odstavci se zde zahrnuje v plném rozsahu formou odkazu.

Nedávno se ukázalo, že stabilní exprese ZPK snižuje proliferační kapacitu fibroblastu NIH 3T3 měřenou zkouškou tvorby kolonií, Bergeron a kol., Biochem. Biophys. Res. Comm., 231, 153-155 (1997). Avšak Bergeronovi se nepodařilo poskytnout žádné údaje ukazující, že ZPK pozměňuje aktivitu substrátu ZPK nebo zda ZPK podporuje zánik buněk.

Exprese složky kódující Myc-MLK2 v buňkách Swiss 3T3 způsobuje apoptosu zhruba 20 h po injekci, Nagata a kol., EMBO J., 17, 149-158 (1998).

Předkladatelé vyvinuli řadu indolových a indenových sloučenin, které mimo jiné inhibují růst buněk spojený s hyperproliferačními stavy a inhibují zánik řady embryonálních kultur, jako je kultura ganglionů dorsálních kořenů, corpus striatum, horních krčních ganglionů a motoneuronů, US patenty Č. 5 475 110, 5 591 855, 5 594 009, 5 461 146, 5 621 100, 5 621 101, 5 705 511 a 5 756 494, které byly všechny uděleny původci tohoto vynálezu, a které se zde v plném znění zahrnují formou odkazu. Sloučeniny popisované v US patentu 5 705 511 obecného vzorce G se v této patentové přihlášce popisují jako sloučeniny obecného vzorce I. Předkladatelé též prokázali, že derivát K-252a, indolokarbazol, který též pozměňuje kaskádu signalizující stres, inhibuje apoptosu ne4 * V · · 4 4*444

V 4 9 9 9 9 9 9 9 94 • 4 4 4 · 4 · 4 4 4 «4 ·»· 4444 444

4 44 44 44444 uronů, publikace Maroney a kol., J. Neurosci., 18, 104-111 (1998), která se zde zahrnuje v plném znění formou odkazu.

Vzhledem k nedostatečnému vyhledávání sloučenin, které pozměňují látky kaskády signalizující stres a podporují buď zánik nebo přežívání buněk, je nadále potřeba nových selektivních způsobů vyhledávání látek. Navíc je nadále potřeba screeningových zkoušek pro léčiva použitelná při léčení zánětu a neurodegenerativních poruch. Tento vynález se zaměřuje na tyto i další důležité cíle.

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje způsoby identifikace sloučenin, které pozměňují kinasový protein s násobnými vazbami a podporují přežívání buněk, zahrnující kroky k zajištění styku buněk obsahujících kinasový protein s násobnými vazbami se sloučeninou, stanovení, zda sloučenina snižuje aktivitu kinasového proteinu s násobnými vazbami a stanovení, zda tato sloučenina podporuje přežívání buněk.

Tento vynález též poskytuje způsoby identifikace sloučenin pozměňujících aktivitu kinasového proteinu s násobnými vazbami a podporujících zánik buněk, které zahrnují kroky zajištění styku buněk obsahujících kinasový protein s násobnými vazbami se sloučeninou, určení zda tato sloučenina zvyšuje aktivitu kinasového proteinu s násobnými vazbami a stanovení, zda tato sloučenina podporuje zánik buněk.

Tento vynález též poskytuje způsob identifikace sloučenin, které mohou být použitelné při léčení neurodegenerativních poruch, zahrnující zajištění styku buňky nebo buněčného extraktu obsahujícího kinasový protein s násobnými vaz5 • · · · · · · φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφ bami se sloučeninou a stanovení, zda tato sloučenina snižuje aktivitu kinasového proteinu s násobnými vazbami.

Tento vynález též poskytuje způsoby identifikace sloučenin, které mohou být použitelné při léčení zánětu, zahrnující zajištění styku buňky nebo buněčného extraktu obsahujícího kinasový protein s násobnými vazbami se sloučeninou a stanovení, zda tato sloučenina snižuje aktivitu kinasového proteinu s násobnými vazbami.

Tento vynález též poskytuje způsoby léčení savce, s neurodegenerativní poruchou nebo s podezřením na tuto poruchu, které zahrnují podávání tomuto savci sloučeniny, která inhibuje nebo snižuje aktivitu kinasového proteinu s násobnou vazbou.

Tento vynález též poskytuje způsob léčení savce, který má zánět, zahrnující podávání tomuto savci sloučeniny, která inhibuje nebo snižuje aktivitu kinasového proteinu s násobnou vazbou.

Tento vynález též poskytuje způsob pozměňování aktivity kinasového proteinu s násobnou vazbou, který zahrnuje zajištění styku proteinu nebo buňky obsahující tento protein se sloučeninou obecného vzorce II

Rí

(II) ve kterém kruh B a kruh F se nezávisle na sobě, každý spolu s atomy uhlíku, ke kterému se připojuje, volí z následujících případů nenasycený šestičlenný karbocyklický aromatický kruh, ve kterém se mohou 1 až 3 atomy uhlíku nahradit atomy dusíku, nenasycený pětičlenný karbocyklický aromatický kruh a nenasycený pětičlenný karbocyklický aromatický kruh, ve kterém se jeden atom uhlíku nahradí atomem kyslíku, atomem dusíku nebo atomem síry, dva atomy uhlíku nahradí atomem síry a atomem dusíku, atomem kyslíku a atomem dusíku nebo dvěma atomy dusíku nebo se tři atomy uhlíku nahradí třemi atomy dusíku,

R¹ se volí z následujících případů:

» v 4 · » w ·«* » · 9 9 9 ··· · 9 atom vodíku, substituovaná nebo nesubstituovaná alkylová skupina mající 1 až 4 atomy uhlíku, substituovaná nebo nesubstituovaná arylová skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná arylalkylová skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná heteroarylová skupina nebo substituovaná či nesubstituovaná heteroarylalkylová skupina, skupina -C(=O)R⁹, ve které se R⁹ volí z případů alkylová skupina, arylová skupina a heteroarylová skupina, skupina -0R^xo, ve které R^xo se volí z případů atom vodíku a alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku, skupina -C(=O)NH , -NR^XXR^X2, - (CH ) NR^1XR^X2, - (CH ) 0R^xo, 2 2 p 2 p

-O(CH) 0R^xo a -O(CH ) NR^XXR^X2, ve které p je od 1 do 4 a ve které bud'

R^xx a R¹² se zvolí nezávisle na sobě z případů atom vodíku a alkylová skupina mající 1 až 4 atomy uhlíku nebo

R^xx a R^X2 spolu vytvářejí spojovací skupinu obecného vzorce -(CH^)^-X¹-(CHa), ve kterém se X¹ volí z případů -0-, -S- a -CH2-,

R² se volí z případů atom vodíku, alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku, hydroxylová skupina, alkoxyskupina o 1 až 4 atomech uhlíku, skupina -OC{=O)R⁹, -0C(=O)NR^XXR¹², -0(CH ) NR^X1R¹², -O(CH ) 0R^xo, sub2 2 p stituovaná či nesubstituovaná arylalkylová skupina o 6 až 10 atomech uhlíku a substituovaná či nesubstituovaná heteroarylalkylová skupina,

R³, R⁴, R^s a R^s se navzájem nezávisle volí z následujících případů:

atom vodíku, arylová skupina, heteroarylová skupina, atom fluoru, atom chloru, atom bromu, atom jodu, kyanoskupina, skupina CF₃, nitroskupina, hydroxylová skupina, skupina OR⁹, • · ··«**«· *· · ·· »· ·· ΦΦ·

-0(CH ) NR^XXR¹², -0C(=0)R⁹, -OC(=0)NR²R⁷, -OC (=0) NR^XXR^X2 , -O(CH ) OR^XO, -CH OR^XO, -NR^XXR^X2, -NR^xoS(=0) R⁹, p 2 Z

-NR^XOC(=0)R⁹, skupina -CH^OR¹⁴, ve které R^X4 je zbytek aminokyseliny po odstranění hydroxylové skupiny z karboxylové skupiny, skupina -NR^XOC(=O)NR^XXR^X2, -CO^R², -C(=0)R², -C(=0)NR^XXR^X=, -CH=N0R², -CH=NR⁹, -(CH ) NR^XXR¹², p

- (CH₂) ^NHR³·⁴ nebo -CH=NNR²R^2A, ve které R^2A má stejný význam jako R², skupina -S(0) R²-(CH ) S(0) R⁹, -CH S(0) R^X4, ve které y je 0, 1 nebo 2, alkylová skupina mající od 1 do 8 atomů uhlíku, alkenylová skupina mající od 2 do 8 atomů uhlíku a alkinylová skupina mající od 2 do 8 atomů uhlíku, kde každá alkylová, alkenylová nebo alkinylová skupina je nesubstituovaná nebo každá alkylová, alkenylová nebo alkinylová skupina je substituovaná 1 až 3 skupinami zvolenými z případů: arylová skupina o 6 až 10 atomech uhlíku, heteroarylová skupina, arylalkoxyskupina, heterocykloalkoxyskupina, hydroxyalkoxyskupina, alkoxy-alkoxyskupina, hydroxyalkylthioskupina, alkoxy-alkylthioskupina, atom fluoru, atom chloru, atom bromu, atom jodu, kyanoskupina, nitroskupina, hydroxylová skupina, skupina -0R⁹, -X²(CH ) NR^R¹², -X² (CH ) C(=0)NR^T1R¹², jp 2 F>

-X²(CH ) OC(=0)NR^XXR^X2, -X²(CH ) CO R⁹, -X²(CH ) S(0) R⁹, p 2 p 2 2 p X

-X²(CH ) NR^XOC(0)NR^XXR^X2, -0C(=0)R⁹, -0C0NHR², -0-tetra2 p hydropyranylová skupina, skupina -NR^XXR^X2, -NR^xoC(=0)R⁹, -NR^xoC02R⁹, -NR^xoC(=0)NR^xxR^x2, -NHC(=NH)NH2, NR^xoS(0)_R⁹, -S(O)^R⁹, -C02R², -C(=O)NR^XXR^X2, -C(=O)R², -CH20R^xo, -CH= =NNR²R^2a, -CH=N0R², -CH=NR⁹, -CH=NNHCH(N=NH)NH2, -S(=O)2NR²r^2A, -P(=0)(0R^xo)2, -OR¹⁴ a monosacharidová skupina mající 5 až 7 atomů uhlíku, ve které je každá hydroxylová skupina monosacharidu nezávisle buď nesubstituovaná nebo nahraze9

	* í	♦ · ··«	* · ·· • · *
	·· <	··	··

ná atomem vodíku, alkylovou skupinou o 1 až 4 atomech uhlíku, alkylkarbonyloxyskupinou o 2 až 5 atomech uhlíku nebo alkoxyskupinou o 1 až 4 atomech uhlíku,

X= je atom kyslíku, atom síry nebo skupina NR^XO,

R⁷ a R⁸ se nezávisle na sobě volí z případů atom vodíku, alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku, alkoxyskupina o 1 až 4 atomech uhlíku, substituovaná či nesubstituovaná arylalkylová skupina o 6 až 10 atomech uhlíku, substituovaná či nesubstituovaná heteroarylalkylová skupina, skupina - (CH ) 0R^xo, -(-CH ) OC(=0)flR^^-R¹² a - nebo R⁷ a R® spolu vytvářejí spojovací skupinu obecného vzorce -CH2-X³-CH2-, ve které X³ je X² nebo vazba, man jsou nezávisle na sobě 0, 1 nebo 2,

Y se volí z případů -0-, -S-, ~N(R^XO)-, -N*(0“)(R^xo)-,

-N(0R^xo)- a -CH₂-,

Z se volí z případů vazba, -0-, -CH=CH-, -S-, -C(=0)~,

-CH(0R^xo)-, -N(R^XO)-, -N(0R^xo)-, CH(NR^X1R¹²)-, -C(=0)N(R^X7)-, -N(R^X7)C(=0)-N(S(O} R⁹)-, y

-N(S(0)^NR^XXR^X2)-, -N (C (-0) R^x7)-C (R^XSR^X6) - , -N⁺(0“)R^xo)-, -CH(OH)-CH(OH) - a -CH(O(C=O)R^S)CH(OC(=0)R^9A)-, kde R^9A má stejný význam jako R⁹,

R^xs a R^xe se navzájem nezávisle volí z případů atom vodíku, hydroxylová skupina, skupina -C(=0)R^xo, -O(C=O)R⁹, hydroxyalkylová skupina a skupina -CO_aR^xo,

R^X7 se volí z případů atom vodíku, alkylová skupina, • · · ·«··· · · ♦ · · · · · * · a * ·* * *· ·* a* ·«* arylová skupina a heteroarylová skupina,

A^x a A² se volí z případů 2 atomy vodíku, atom vodíku a skupina OR², atom vodíku a skupina -SR², atom vodíku a skupina -N(R²)₂ a skupina, ve které A¹ a A² spolu vytvářejí zbytek zvolený z případů =0, =S a =NR²,

B¹ a B² se volí z případů 2 atomy vodíku, atom vodíku a skupina -OR², atom vodíku a skupina -SR², atom vodíku a skupina -N(R²)₂ a skupina, ve které B¹ a B² vytvářejí zbytek zvolený z případů =0, =S a =NR², s podmínkou, že alespoň jeden z párů A¹ a A² nebo B¹ a B² tvoří =0.

Tento vynález též poskytuje způsoby pozměňování aktivity kinasového proteinu s násobnou vazbou zahrnující zajištění styku proteinu nebo buňky obsahující tento protein se sloučeninou obecného vzorce III

(III)

- - - T w WV · • 4 * ♦ 4 4·· 44 •44 444444« ·· ♦ 4« 4« 44444 ve kterém

Ζ_χ je atom vodíku a Z₌ je atom vodíku nebo Ζ_χ a Z₂ spolu vytvářejí =0,

R¹ se volí z případů atom vodíku, atom chloru, CH₂SO_;2C H , atom bromu, CH S(CH ) NH , CH S(CH ) N(CH ) ,

3 2 222 2 2232

CHS(CH ) NH , n-C H , NHCONHC H , NHCONHC H , CH₂SC₂H_s, CH₂SC_sH₅, N(CH₃)₂, ch₃, ch₂oconhc₂h_b, NHCO CH , CH OC H , CH N(CH ) , OH, O-n-propylová

3 2 2 5 2 32

Skupina, CH=NNH-C(=NH)NH₂, CH=N-N(CH₃)₂, CH^S(CHJ_eNH-n-C H , CH OCH OCH CH , CH S[3-(1,2,4-triazin)],

CH CH SCH ,

23

- 12 • * · 4 « ·*· * « · • ·· · · · · • · · · · · · • 4 ·· ·· ···

R₂ se zvolí z případů atom vodíku, atom bromu, atom chloru, atom jodu, skupina CH₂S(CH₂)₂N(CH₃)₂, NHCONHC H , CH SC H , CH OCH OCH CH , CH S[325 225' 2 2 2 3* 2

-(1,2,4-triazin)], CH CH SCH a CH OH,

2 32

X se zvolí z případu atom vodíku, skupina CH^OH,

CH N-serin, CO CH , CONHC H , CH NHCO C H ,

CH NHCO CH , CH N , CONHC H , CH NH-glycin,

2 3 2 3 2 52

CON(CH ) , -CH NHCO -, CONH , CONHC H , CH NH-serin,

2 2 2 3*72

CH₂SOCH₃, CH=NOH, CH₂NH-prolin, CH₂CH₂(2-pyridyl), • · * ♦ · ··* · » • ·· ♦ · ·· ··· · · • · t *·····* • I * · · · · Η · < Φ

CH=NNHC(=NH)NH₂, CONHÍCHJ_zOH, CH=NNHCOCH₂,

CH OCOCH , -CH OCÍCH ) 0-, CH SC Η , CH SOC Η ,

COjh-hexylová) skupina, CONHCH₃ a CO₂(CH₌)₄CH₃ nebo ze skupin následujících vzorců

a

R se zvolí z případů hydroxylová skupina a skupina OCH₃.

Tento vynález též poskytuje způsob pozměňování aktivity kinasového proteinu s násobnou vazbou stykem tohoto proteinu nebo buňky obsahující tento protein se sloučeninou obecného vzorce IV

(IV)

I

ve kterém je atom vodíku a Z je atom vodíku nebo Z a Z ^J 2 1 2 společně vytvářejí skupinu =0,

je atom vodíku nebo atom bromu,

je atom vodíku,

R je atom vodíku, skupina CH CH=CH , CH CH CH OH nebo z”\

CH CH CH -N .0 a

2 2 χ__f

R je atom vodíku, skupina CH CH=CH nebo CH CH CH OH.

Přehled obrázku na výkresech

Pro znázornění ztělesnění podle tohoto vynálezu se předkládají výkresy. Je však třeba si uvědomit, že tento vynález se neomezuje na tato přesná znázorněná ztělesnění.

Obr. 1 je schematický výkres znázorňující obecnou přípravu indenopyrrolokarbazolů s můstky.

Obr. 2 je schematický výkres znázorňující obecnou přípravu indenopyrrolokarbazolů s můstky.

Obr. 3 je schematický výkres znázorňující obecnou přípravu indenopyrrolokarbazolů vázaných na pryskyřici.

Obr. 4 je schematický výkres znázorňující přípravu chráněných rozpustných indenopyrrolokarbazolů.

Obr. 5 je schematický výkres znázorňující přípravu meziproduktu V.

Obr. 6 je schematický výkres znázorňující přípravu indenopyrrolokarbazolů s můstky s použitím způsobu A.

Obr. 7 je schematický výkres znázorňující přípravu indenopyrrolokarbazolů s můstky s použitím způsobu B.

Obr. 8 je schematický výkres znázorňující přípravu indenopyrrolokarbazolů s můstky se substituovaným kruhem B.

Obr. 9 je schematický výkres znázorňující přípravu indenopyrrolokarbazolů s můstky se substituovaným kruhem E.

Obr. 10 ukazuje graf pro dva oddělené pokusy znázorňující množství živých neuronálně diferencovaných PC-12 buněk zbývajících po 5 dnech pěstování bez NGF. Výsledky se vyjadřují jako procento kontroly NGF pro každou skupinu (kontrola vektoru v přítomnosti NGF, n=12, všechny ostatní skupiny, n=3). Rozdíl mezi kontrolou vektoru a stabilními soubory buněk exprimujících dominantní negativní mutant MLK-3 v nepřítomnosti NGF je statisticky významný, jak ukazuje oboustranný t-test (p<0,05).

Obr. 11A ukazuje fosforylaci kinase-dead” GST-SEK-1 FLAG-MLK-3 exprimovanou bakulovirem (směs celé délky a kinasové domény) s použitím radioaktivní gelové zkoušky.

Obr. 11B ukazuje fosforylovaný myelinový bázický proteinový produkt značený radionuklidem fosforu ³²P vytvořený kinasovou reakcí katalyzovanou FLAG-MLK-3 exprimovaným bakulovirem (směs celé délky a kinasové domény) nebo kinasovou doménou GST-MLK-3.

-» · · « · *· * · · · · ··· ·*

-·*ΐ · · » » ·» *· ι ·« *· ·«·

Obr. 12 je imunoblotová analýza ukazující fosforylaci kinase-dead GST-SEK-1 uskutečněnou FLAG-MLK-3 exprimovanou bakulovirem (směs celkové délky a kinasové domény) detekovanou fosfospecifickou protilátkou SEK-1.

Obr. 13 ukazuje fosforylaci myelinového bazického proteinu bakteriálně exprimovanou kinasovou doménou GST-MLK-3 s použitím (o) multiscreeningové srážecí analýzy s kyselinou trichloroctovou nebo (·) metody fosfocelulosové membrány.

Obr. 14 ukazuje saturační vazebnou křivku [³H]K252a inkubovaného s lysatem MLK-3 hmyzích buněk infikovaných bakulovirem.

Obr. 15A ukazuje množství c-jun značeného ³²P v imunoprecipitační/kinasové reakci z buněk nadměrnou expresí MLK-3, MLK-2 nebo DLK zpracovaných buď 0,025% roztokem dimethylsulfoxidu (kontrola) nebo 500 nM roztokem K-252a.

Obr. 15B ukazuje graf vyjadřující kvantitativně zbývající procento aktivity v reakcích imunoprecipitát/kinasa ze vzorků popsaných na Obr. 15A. Sloupce představují průměr z dvojic vzorků, kde úsečka pro chybu ukazuje rozmezí střední hodnoty.

Obr. 15C ukazuje množství c-jun značeného ³²P v imunoprecipitační/kinasové reakci z buněk s nadměrnou expresí HA-JNK1 samotných nebo s MEKK1 při různých množstvích cDNA zpracovaných buď 0,025% roztokem dimethylsulfoxidu (kontrola) nebo 500 nM roztokem sloučeniny III-3 (viz tabulka 3). Sloupce představují průměr z dvojic vzorků a úsečka pro chy17 » » v · ···* *4 4 4 · · 4 · 44* • fr 4 ·· 44 44* 4* * 4 4 4444 *4* ·· 9 44 *4 44444 bu ukazuje rozmezí střední hodnoty.

Obr. 16 ukazuje, že sloučenina III-3 podporuje přežívání neuronů způsobem závislým na koncentraci. Disociované neurony se pěstují z ganglií sympatiku (SG) (A), ganglií dorsálních kořenů (DRG) (B) , ciliámích ganglií (CG) (C) a motoneuronů (MN) (D) za přítomnosti nebo v nepřítomnosti popisovaných trofických faktorů. Buňky se počítají 48 h po nanesení na desky, jak se popisuje v oddílu materiály a způsoby provedení. Údaje představují střední hodnotu ±standardní odchylku ze tří nebo čtyř stanovení. Je znázorněn jeden ze tří pokusů.

Obr. 17 ukazuje mikrofotografie z fázového kontrastu kultur E12 DRG (A, E), E9 sympatických (B, F), E8 ciliárních (C, G) a E5.5 motorických neuronů (D, H) po 48 h pěstování (24 h pro ciliární neurony) za přítomnosti příslušného neurotropního faktoru (20 ng/ml NGF pro sympatické a sensorické neurony, 10 ng/ml CNTF pro ciliární neurony, 30 gg/ml svalového extraktu (MEX) pro motoneurony (A-D) nebo za přítomnosti 1 μΜ koncentrace sloučeniny III-3 (E-H). Úsečka = 200 μτη.

Obr. 18 ukazuje mikrofotografii ganglií dorsálních kořenů in vitro. Vzorky odebrané z kuřecího DRG (E9) se nanášejí na 96-jamkové desky do média obsahujícího 0,05 % bovinního serumalbuminu. Po době připojení 2 h se přidává: (A) kontrolní dimethylsulfoxid, (B) 20 ng/ml NGF, (C) 250 nM roztok sloučeniny III-3. Po 48 h se medium odstraní a vzorky se fixují 4% paraformaldehydem ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem.

Obr. 19 ukazuje počet kuřecích lumbálních motorických

- w · www *«·

J to · * · »«to to to

- 18 -· · » *···Ι*·ϊ neuronů přežívajících na E10 po denním zpracování (E5-9) popsanými dávkami sloučeniny III-3. Výsledky udávají střední hodnotu ±směrodatnou odchylku pro 5 až 6 zvířat na léčenou skupinu. Tento experiment se opakuje dvakrát. Údaje pocházejí z jednoho representativního pokusu a představují jednu stranu lumbálního provazce. *p<0,01, **p<0,001, Studentův t-test mezi sloučeninou III-3 a kontrolními skupinami s Bonferroniho korekcí.

Obr. 20 ukazuje počet motorických neuronů ve spinálním nucleus bulbocavernosus krysí samice (SNB) přežívajícího v PN10 nebo PN60 po denním zpracování (PNI-5) sloučeninou III-3 nebo kontrolním vehikulem (5% Solutol™). Krysy z PN10 (A, B) nebo PN60 (B) byly utraceny a oblast míchy obsahující SNB byla vyjmuta a zpracována pro histologii. Motorické neurony obarvené Cresylechtovou violetí se počítají v sériových řezech lumbální 5-sakrální oblasti 1 míchy, jak popisuje Wingfield a kol., Steroids, 26, 311-327 (1975). Údaje představují střední hodnoty + standardní odchylku střední hodnoty od 4 až 8 zvířat na léčenou skupinu.

Obr. 21 ukazuje ztrátu imunoreaktivity ChAT po hypoglosální axotomii u dospělých krys po léčení sloučeninou III-3. Mikrofotografie hypoglosálního jádra po přenesení hypoglosálního nervu a zpracování (A) roztokem vehikula (5% Solutol™) a (B) 200 gg sloučeniny III-3 nanesené na místo přenesení (C). Počet ChAT-imunoreaktivních hypoglosálních motorických neuronů po způsobech léčení popsaných výše v (A) a (B). Výsledky se vyjadřují jako procento ChAT-imunoreaktivních motorických neuronů, kde 100 & se definuje jako počet ChAT-imunoreaktivních motorických neuronů v kontralaterálním nepoškozeném hypoglosálním jádru.

• ♦ ·· i ......

- 19 -··· · · * · · · *4 * 4* 44 44 ♦

4Φ·

Obr. 22 ukazující inhibici MLK-3 prokazuje účinnost in vivo a blokování dějů fosforylace ve vzestupném směru, Obr. 22A ukazuje vzrůst tyrosinhydroxylasa-imunoreaktivních neuronů substantia nigra po poškození MPTP při systémovém podávání sloučeniny III-3. Obr. 22B je representativní pro výsledky imunoblotové analýzy a ukazuje vzrůst hladin fosforylovaného MKK4 indukovaného MPTP. Obr. 22C znázorňuje representativní výsledky imunoblotové analýzy a analýzy ELISA a ukazuje zeslabení fosforylovaného MKK4 indukovaného MPTP za přítomnosti sloučeniny III-3.

Obr. 23 ukazuje indukci interleukinu IL-2 v Jurkatových buňkách. Obr. 23A ukazuje časový průběh indukce IL-2. Obr. 32B ukazuje inhibici indukce IL-2 sloučeninou III-3. Obr. 23C ukazuje inhibici indukci IL-2 sloučeninou III-3 a sloučeninou 1-4.

Následuje podrobný popis vynálezu.

Následující termíny používané výše a v celém popisu, pokud se neuvádí jinak, mají následující významy.

Apoptosa se týká specifické morfologické formy smrti (zániku) buňky charakterizované fragmentací buněk a jejich jader na částice vázané na membránu. Apoptosa se může spouštět například léčením sloučeninami indukujícími apoptosu, jako je etoposid, staurosporin, faktor nekrosy tumoru a, ceramid a podobně, nebo vystavením určitým podmínkám, jako je například ozáření rtg zářením.

Pojem zánik buňky se týká zániku buněk apoptosou, nekrotickými či jinými prostředky, které jsou v široké míře známy tomu, kdo má zkušenost v oboru. Zánik buňky lze na* * * «9 ··· · · *

-♦*» · · · « · ♦ t ·· 9 99 9« 99 99 9 příklad charakterizovat jako pokles celkového počtu buněk nebo pokles životaschopnosti buňky ve srovnání s neléčenou kontrolní populací buněk. Sloučeniny, které podporují zánik buněk, způsobují pokles počtu buněk nebo pokles životaschopnosti buňky ve srovnání s kontrolními populacemi. Naproti tomu sloučeniny, které podporují přežívání buněk, způsobují vzrůst počtu buněk nebo životaschopnosti buněk nebo zpomalují či snižují rychlost zániku buněk.

Pojmy reaguje selektivně nebo selektivně se váže se týkají sloučenin, které fyzikálně či chemicky interagují přímo s proteinem MLK. Naproti tomu sloučeniny, které selektivně nereagují nebo selektivně se neváží mohou ovlivňovat proteiny v sestupném či vzestupném směru od proteinu MLK a tak mohou ovlivňovat aktivitu proteinů MLK, avšak fyzikálně ani chemicky přímo nereagují s proteinem MLK.

Pojem pozměňuje se týká zvyšování či snižování aktivity konkrétního proteinu nebo jeho substrátu.

Tento vynález se částečně zaměřuje na způsoby identifikace sloučenin, které pozměňují aktivitu proteinu MLK a podporují bud' přežívání buněk nebo zánik buněk. Sloučeniny, které způsobují zvýšenou aktivitu proteinu MLK, mohou podporovat zánik buněk, zatímco sloučeniny, které způsobují sníženou aktivitu proteinu MLK, mohou podporovat přežívání buněk.

Protein MLK může být kterýkoliv protein, jehož identifikace ukazuje, že patří do skupiny proteinů MLK. Přednostně se protein MLK volí ze skupiny zahrnující MLK-1, MLK2, MLK3 (SPRK, PTK1), LZK, DLK (ZPK, MUK) a MLK6, která se popisuje výše. V preferovaných ztělesněních tohoto vyná·« 9 » · * · · 4«« í 4 ’ 2 1 · 4 φ Φ · v «4 ·· · «6 ·· lezu se používají způsoby identifikující sloučeniny, které přímo interagují nebo se váží s proteinem MLK, jak se stanoví ve vazebných rozborech, kinasových rozborech a dalších ekvivalentních rozborech.

Pro identifikaci sloučenin, které pozměňují aktivitu proteinu MLK a podporují přežívání buněk nebo zánik buněk, se buňka nebo buňky obsahující protein MLK přivede do styku se zkoušenou látkou. Tento styk se může uskutečnit v pufrech nebo médiích dobře známých tomu, kdo má zkušenost v oboru. Alternativně může kontakt nastat in vivo, kdy zvíře, jako je například myš nebo jiné vhodné zvíře známé tomu, kdo má zkušenost v oboru, přijde do styku podáním farmaceutického prostředku obsahujícího zkoušenou látku a farmaceuticky přijatelnou sůl, nosič nebo zředbvací prostředek. Navíc lze použít různé počty buněk a koncentrace zkoušených látek. Stanoví se, zda zkoušená látka zvyšuje či snižuje aktivitu proteinu MLK. Navíc se též stanoví, zda tato zkoušená látka podporuje přežívání buněk nebo zánik buněk.

Buňky, které se uvádějí do styku se zkoušenými látkami, mohou být jakékoliv savčí buňky. Přednostně je touto buňkou neuronová buňka. Přednostně se tato buňka účastní neurodegenerativního onemocnění. Pro účely tohoto vynálezu se zde střídavě používají pojmy neurodegenerativní onemocnění, neurodegenerativní porucha a neurodegenerativní stav pro popis jakéhokoliv onemocnění či poruchy ovlivňující neuronové buňky nebo buňky neuronového systému včetně, avšak bez omezení, Alzheimerovy choroby, onemocnění motorických neuronů, amyotropní laterální sklerosy, Parkinsonovy choroby, cerebrovaskulární choroby, ischemických stavů, demence při AIDS, epilepsie, Huntingtonovy choroby a otřesů a poškození pronikajících do mozku či míchy.

· · · · «*· k · « » ·····♦·* 4

-22-*»· · · · · ·· · «· · · ♦ · · · · · · ·

Aktivitu proteinu MLK lze stanovit řadou způsobů. Například lze aktivitu MLK stanovit měřením aktivity substrátu proteinu MLK. Takové substráty jsou dobře známé a snadno rozlišitelné pro toho, kdo má zkušenost v oboru. Přednostně patří takový substrát do skupiny proteinkinasy aktivované mitogenem nebo dalších substrátů v sestupném směru, které zahrnují, avšak bez omezení, protein zvolený ze skupiny JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, p38a, p38S, p38gama, p38ó, MEK1, MEK2, MJJ3, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1 a savčí homolog AEX-3 a též obecné substráty Ser/Thr proteinkinas, jako je myelinový bázický protein (MBP). Činidla a způsoby pro měření aktivity substrátu jsou rovněž známé pro toho, kdo má zkušenost v oboru. Přítomnost MLK lze též stanovit měřením množství proteinu MLK nebo mRNA kódující protein MLK. Činidla včetně protilátek a oligonukleotidových sond, stejně tak jako způsoby měření množství DNA nebo proteinu včetně Northernova a Westernová blotování jsou dobře známy tomu, kdo má zkušenost v oboru. Aktivitu proteinu MLK lze též stanovit kinasovou zkouškou in vitro. Kinasové zkoušky in vitro jsou dobře známy tomu, kdo má zkušenost v oboru. Další způsoby měření aktivity proteinu jsou známy tomu, kdo má zkušenost v oboru a uvažují se tak, aby se pokrývaly tímto vynálezem. Proto ten, kdo má zkušenost v oboru, může určit, zda zkoušená látka pozměňuje, to jest zvyšuje či snižuje aktivitu proteinu MLK.

Skutečnost, zda zkoušená látka podporuje přežívání buněk nebo zánik buněk, lze zjistit řadou způsobů. Přednostně se přežívání buněk či zánik buněk určuje použitím buněk s rizikem zániku a srovnáním množství buněk, které přišly do styku se zkoušenou látkou a zůstávají živé s množstvím buněk, které nepřišly do styku se zkoušenou látkou a zůstávají živé. Přednostně jsou těmito buňkami embryonální motoneuronové buňky, které jsou předem naprogramované pro zánik. Primární embryonální motoneuronové buňky popisuje Maroney a kol., J. Neurosci., 18. 104-111 (1998) a tato práce se zde jako celek zahrnuje formou odkazu. Primární embryonální motoneuronové buňky zahynou, pokud se nezachrání působením zkoušené látky. Proto zvýšený počet živých motoneuronových buněk v populaci motoneuronových buněk ošetřené zkoušenou látkou ve srovnání s počtem motoneuronových buněk v populaci motoneuronových buněk, které nebyly ošetřené zkoušenou látkou, ukazuje na zkoušenou látku podporující přežívání buněk. Oproti tomu nižší počet žijících motoneuronových buněk v populaci motoneuronových buněk ošetřených zkušební látkou ve srovnání s počtem živých motoneuronových buněk v populaci motoneuronových buněk, které nebyly ošetřené zkoušenou látkou, ukazuje na zkoušenou látku, která podporuje zánik buněk.

V dalším ztělesnění tohoto vynálezu se normální buňky nebo buňky divokého typu převedou na buňky s rizikem zániku nadměrnou expresí proteinu MLK, jak se popisuje níže v příkladech, a poté se přivedou do styku se zkoušenou látkou. Nadměrné exprimování proteinů MLK může způsobit zánik buněk, pokud je nezachrání zkoušená látka. Nadměrná exprese proteinů MLK se může uskutečnit použitím vektorů schopných exprimovat konkrétní protein uvnitř buňky. Vektory exprese jsou dobře známy tomu, kdo má zkušenost v oboru. Navíc jsou způsoby přípravy vektorů exprese rovněž známy tomu, kdo má zkušenost v oboru. Vektory exprese, které exprimují kterýkoliv z proteinů MLK, lze připravit způsobem podobným způsobům popsaným v příkladech. Vyšší počet žijících buněk v populaci buněk s nadměrnou expresí ošetřených zkoušenou látkou ve srovnání s počtem žijících buněk v populaci buněk s nadměr nou expresí, které nebyly zpracované zkoušenou látkou, ukazuje na to, že tato zkoušená látka podporuje přežívání buněk. Naopak nižší počet žijících buněk v populaci buněk s nadměrnou expresí ošetřených zkoušenou látkou ve srovnání s počtem žijících buněk v populaci buněk s nadměrnou expresí, které nebyly ošetřeny zkoušenou látkou, ukazuje na to, že tato zkoušená látka podporuje zánik buněk.

V dalším ztělesnění tohoto vynálezu se podpora přežívání buněk stanoví pozorováním Či měřením snížení apopsosy. Apoptosa souvisí s cytoplasmatickým smršťováním a jadernou kondenzací. Proto ten, kdo má zkušenost v oboru, může měřit pokles apoptosy měřením či pozorováním poklesu cytoplasmatického smršťování a/nebo nukleární kondenzace. Navíc ten, kdo má zkušenost v oboru, může měřit apoptosu použitím konvenčních způsobů barvení.

V dalších ztělesněních tohoto vynálezu lze použít normální přirozené neuronové buňky pro identifikaci sloučenin podporujících zánik buněk. Nižší počet žijících buněk v populaci normálních buněk ošetřených zkoušenou látkou ve srovnání s počtem žijících buněk v populaci normálních buněk, které nebyly ošetřené zkoušenou látkou, ukazuje na zkoušenou látku, která podporuje zánik buněk. Oproti tomu vyšší či stejný počet žijících buněk v populaci normálních buněk ošetřených zkoušenou látkou ve srovnání s počtem žijících buněk v populaci normálních buněk, které nebyly ošetřené zkoušenou látkou, ukazuje na zkoušenou látku, která podporuje zánik buněk.

Tento vynález se též částečně zaměřuje na způsoby pozměňování aktivity proteinu MLK zahrnující styk proteinu nebo buňky obsahující tento protein se sloučeninou obecného

í · ·’	4 ·	Ϊ · ’í
·· ·	·· ♦·	·· ·♦

vzorce G (označenou zde vzorcem I) popsanou v US patentu č. 5 705 511 uděleném původci tohoto vynálezu, který se zde v celém znění zahrnuje formou odkazu.

Tento vynález se též částečně zaměřuje na způsob pozměňování aktivity proteinu MLK založený na styku tohoto proteinu nebo buňky obsahující tento protein se sloučeninou obecného vzorce III

(III) ve kterém

Z^ je atom vodíku a Z₂ je atom vodíku nebo Ζ_χ a Z₌ spolu vytvářejí =0,

R¹ se volí z případů atom vodíku, atom chloru,

CH SO C H , atom bromu, CH S(CH ) NH ,

CH₂S(CH₂)₂N(CH₃)₃, CH₂S(CH₂)₂NH₂, n-C₄H₉,

NHCONHC H , NHCONHC H , CH SC H , CH SC Η , N(CH ) ,

CH , CH OCONHC H , NHCO CH , CH 0C H , CH N(CH ) , * 2 25 2 3' 2 25' 2 3 2* * * · ♦ · *·· · » » * · · ···*·«* » *·* »·»»·»»

- «· · ·· ·· ·· ···

OH, O-(n-propylová) skupina, CH=NNH-C(=NH)NH__;,

CH=N-N(CH ) , CH S(CH ) NH-(n-C H ), CH OCH OCH CH ,

3'2' 2 2 2 ' 4 θ' ^ř 2 2 2 3 ¹

CH_aS[3-(1,2,4-tria2Ín)], CH_aCH_aSCH₃,

Γ~\

CH=N—N NCHj

CH2CH2CH2— O se zvolí z případů atom vodíku, atom bromu, atom chloru, atom jodu, skupina CH₂S(CH^)_N(CH₃)_z, ϊ ϊ · · ··· ί i ’ί *·* · · · 0 0* * ·* ·· ·· ·♦·

NHCONHC Η , CH SC Η , CH OCH OCH CH , CH S[3-

S ' 2 3 5 2 2 2 32

-(1,2,4-triazin)], CH CH SCH a CH OH,

X se zvolí z případu atom vodíku, skupina CH^OH,

CH N-serin, CO CH , CONHC Η , CH NHCO CΗ ,

CH NHCO CH , CH N , CONHC H , CH NH-glycin,

2 3 ' 23' 2S' 2 Ji

CON(CH ) , -CH NHCO CONH _t CONHC H , CH NH-serin,

2 2 2 2 3 *72

CH₂SOCH₃, CH=NOH, CH₂NH-Prolin, CH₂CH₂(2-pyridyl), CH=NNHC(=NH)NH₂, CONH(CH₂)₂OH, CH=NNHCONH₂, CH OCOCH , -CH OC(CH ) 0-, CH SC Η , CH SOC Η , C0₂(n-hexylová) skupina, CONHCH₃ a C0₂(CH₂)₄CH₃ nebo ze skupin následujících vzorců “4H con^o ^CffeSO-<Q ^H \ / N—' a

R se zvolí s případů karboxylová skupina a skupina

OCH .

V preferovaných ztělesněních tohto vynálezu jsou Ζ_χ a Z₂ atomy vodíku, X je skupina CO₂CH₃, R^ je skupina NHC0NHC₂H_s, R₂ je CH₂CH₂(2-pyridylová) skupina a R je hydro• · · ·

99 999 xylová skupina. V dalších preferovaných ztělesněních tohoto vynálezu jsou Ζ_χ a Z₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂CH₃, R_x a R^ jsou skupiny CH₂OCH₂OCH₃CH₃ a R je hydroxylová skupina nebo a Z₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂CH₃, R_x a R_a jsou skupiny CH₃SCH₃CH₃ a R je hydroxylová skupina,nebo Ζ_χ, Z₂, R_x a R₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina, nebo Z , Z₂, R_x a R₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO₃(CH₃)₄CH₃ a R je hydroxylová skupina nebo Ζ_χ, Z₂ a R_x jsou atomy vodíku, R_a je skupina CH^OH, X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina nebo Ζ_χ a Z₂ a R_x jsou atomy vodíku, R₌ je skupina CH₂OH, X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina nebo Ζ_χ a Z₌ jsou atomy vodíku, R_x a R₌ jsou skupiny H₃S[3-(1,2,4-triazin)], X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina nebo Ζ_χ a Z₂ jsou atomy vodíku, R_x je atom bromu, R₂ je atom jodu, X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina nebo Ζ_χ a Z₂ jsou atomy vodíku, R_x a R₂ jsou skupiny CH₃CH₃SCH₃, X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina nebo Z , Z₂, R a R₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO CH a R je skupina OCH nebo Ζ_χ a Z₂ spolu vytvářejí skupinu =0, R_x a R₃ jsou atomy bromu, X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina.

Tento vynález se též částečně zaměřuje na způsoby pozměňování aktivity proteinu MLK založené na styku tohoto proteinu nebo buňky obsahující tento protein se sloučeninou obecného vzorce II ♦

· · 9 ·· ·· »· •»

9· ·» ·

(II) ve kterém ' ^r kruh B a kruh F se nezávisle na sobě, každý spolu s atomy uhlíku, ke kterému se připojuje, volí z následujících případů

a) nenasycený šestičlenný karbocyklický aromatický kruh, ve kterém se mohou 1 až 3 atomy uhlíku nahradit atomy dusíku,

b) nenasycený pětičlenný karbocyklický aromatický kruh a

c) nenasycený pětičlenný karbocyklický aromatický kruh, ve kterém se

1) jeden atom uhlíku nahradí atomem kyslíku, atomem dusíku nebo atomem síry,

2) dva atomy uhlíku nahradí atomem síry a atomem dusíku, atomem kyslíku a atomem dusíku nebo dvěma atomy dusíku

3) nebo se tři atomy uhlíku nahradí třemi atomy dusíku, ϊ ΐ »’ · · ··· iii • · * *4 44 4*4 * * · » 444* 4·· “ * 9 ·· *· ·· ···

R^x se volí z následujících případů:

a) atom vodíku, substituovaná nebo nesubstituovaná alkylová skupina mající 1 až 4 atomy uhlíku, substituovaná nebo nesubstituovaná arylová skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná arylalkylová skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná heteroarylová skupina nebo substituovaná či nesubstituovaná heteroarylalkylová skupina,

b) skupina -C(=O)R®, ve které se R® volí z případů alkylová skupina, arylová skupina a heteroarylová skupina,

c) skupina -OR^xo, ve které R^xo se volí z případů atom vodíku a alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku,

d) skupina -C(=O}NH , -NR^XXR^X2, - (CH ) NR^xxR^x2, - (CH ) OR^xo,

2 p 2 £>

-O(CH ) OR^xo a -O(CH ) NR^XXR^X2, ve které p je od 1 do 4 a ve 2 p 2 p které buď

1) R^xx a R^x2 se zvolí nezávisle na sobě z případů atom vodíku a alkylová skupina mající 1 až 4 atomy uhlíku nebo

2) R^xx a R^x2 spolu vytvářejí spojovací skupinu obecného vzorce -(CH2)2-X^x-(CH^)=-, ve kterém se X^x volí z případů. -0-, -S- a -CH₂-,

R² se volí z případů atom vodíku, alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku, hydroxylová skupina, alkoxyskupina o 1 až 4 atomech uhlíku, skupina -OC(=O)R®, -OC(=O)NR^XXR^X2, -O(CH ) NR^XXR^X2, -O(CH ) OR¹⁰, substituovaná či nesubstituovaná arylalkylová skupina o 6 až 10 atomech uhlíku a substituovaná či nesubstituovaná heteroarylalkylová skupina,

R³, R⁴, R⁼ a R⁶ se navzájem nezávisle volí z následujících případů:

· « · ·Μ • · · • 9 * 9 9 · 9 9 t 9 “ ·♦ 9 ·· ♦· ·· ·♦·

a) atom vodíku, arylová skupina, heteroarylová skupina, atom fluoru, atom chloru, atom bromu, atom jodu, kyanoskupina, skupina CF₃, nitroskupina, hydroxylová skupina, skupina OR⁹, -O(CH ) NR^XXR^X2, -OC(=O)R⁹, -OC(=O)NR²R\

I?

-OC{=O)NR^1:LR¹², -O(CH ) 0R^xo, -CH 0R^xo, -NR^XXR¹², jp 2

-NR^xoS{=0)₂R⁹, -NR^loC(=0)R⁹,

b) skupina -CH₂OR^X4, ve které R^X4 je zbytek aminokyseliny po odstranění hydroxylové skupiny z karboxylové skupiny,

c) skupina -NR^XOC(=0)NR^XXR^X2, -CO₌R², -C(=O)R², -C(=0)NR^XXR^X2, -CH=N0R², -CH=NR⁹, -(CH ) NR^XXR^X2,

-(CH_£)^NHR^X4 nebo -CH=NNR²R^2A, ve které R^2A má stejný význam jako R²,

d) skupina -S(0) R²-(CH ) S(0) R⁹, -CH S(0) R^X4, ve které y je 0, 1 nebo 2,

e) alkylová skupina mající od 1 do 8 atomů uhlíku, alkenylová skupina mající od 2 do 8 atomů uhlíku a alkinylová skupina mající od 2 do 8 atomů uhlíku, kde

1) každá alkylová, alkenylová nebo alkinylová skupina je nesubstituovaná nebo

2) každá alkylová, alkenylová nebo alkinylová skupina je substituovaná 1 až 3 skupinami zvolenými z případů: arylová skupina o 6 až 10 atomech uhlíku, heteroarylová skupina, arylalkoxyskupina, heterocykloalkoxyskupina, hydroxyalkoxyskupina, alkoxy-alkoxyskupina, hydroxyalkylthioskupina, alkoxy-alkylthioskupina, atom fluoru, atom chloru, atom bromu, atom jodu, kyanoskupina, nitroskupina, hydroxylová skupina, skupina -0R⁹, -X²(CH ) NR^XXR^X2, -X²(CH ) C(=O)NR^XXR^X2,

2

-X²(CH ) OC(-O)NR^XXR¹², -X²(CH ) CO R⁹, -X²(CH ) S (O) R⁹, e> 2 £> 2 2 X

-X²(CH ) NR^1OC(0)NR^XXR¹², -OC(=O)R⁹, -0C0NHR², -0-tetrahydropyranylová skupina, skupina -NR^XXR¹², -NR^XOC(=0)R⁹, -NR^xoC02R⁹, -NR^xoC(=0)NR^xxR^X2, -NHC(=NH)NH2, NR^xoS (0) ₂r⁹, -S(0) R⁹, -CO R², -C(=0)NR^XXR^X2, -C(=0)R², -CH 0R^xo, y 2 2

-CH=NNR²R^2a, -CH=N0R², -CH=NR⁹, -CH=NNHCH(N=NH)NH₂, » ·♦·♦ ·· ♦· ·♦ ·· ♦ ΦΦΦΦ φφφ • ♦·· φ φ φφ φ φ φ ΦΦΦΦ φφφ φφ ·Φ ·· ··♦

-S(=0)₌NR²R^2A, -Ρ(=0)(0R^lo)_a, -0R^X4 a monosacharidová skupina mající 5 až 7 atomů uhlíku, ve které je každá hydroxylová skupina monosacharidu nezávisle bud' nesubstituovaná nebo nahrazená atomem vodíku, alkylovou skupinou o 1 až 4 atomech uhlíku, alkylkarbonyloxyskupinou o 2 až 5 atomech uhlíku nebo alkoxyskupinou o 1 až 4 atomech uhlíku,

X² je atom kyslíku, atom síry nebo skupina NR^XO,

R^v a R® se nezávisle na sobě volí z případů atom vodíku, alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku, alkoxyskupina o 1 až 4 atomech uhlíku, substituovaná či nesubstituovaná arylalkylová skupina o 6 až 10 atomech uhlíku, substituovaná Či nesubstituovaná heteroarylalkylová skupina, skupina - (CHJp0R^xo, - (-CH^OC^OlNR^R¹² a - (CHa)^NR^XXR^X2 nebo R^-7 a R® spolu vytvářejí spojovací skupinu obecného vzorce -CHa-X³-CHa-, ve které X³ je X² nebo vazba, man jsou nezávisle na sobě 0, 1 nebo 2,

Y se volí z případů -0-, -S-, -N(R^XO)-, -N*(0)(R^xo)-,

-N(0R^xO)- a -CH₂-, z se volí z případů vazba, -0-, -CH=CH-, -S-, -C(=0)-,

-CH(OR^xo)~, -N(R^XO)-, -N(0R^xO)-, CH(NR^XXR^X2) - , -C(=0)N(R¹⁷)-, -N(R^{1 7}) C (=0)-, -N(S(O)_yR⁹)-, -N(S(O) NR^XXR^X2)-N(C(=O)R^XV)-C (R^X5R^xe) - , -N*(0-)R¹⁰)-CH(OH)-CH(OH)- a -CH(0(C=0)R⁹)CH(OC(=0)R^9A)-, kde R^9A má stejný význam jako R⁹,

R^xs a R^x® se navzájem nezávisle volí z případů atom vodíku,

				··
♦	•	•	• 9	•	*
	•	•	··	•	•
*	•	•	• i	♦	4
	·		·«	• ·	♦ ·

hydroxylová skupina, skupina -C(=0)R^xo, -O(C=O)R®, hydroxyalkylová skupina a skupina -CO_aR^xo,

R^X7 se volí z případů atom vodíku, alkylová skupina, arylová skupina a heteroarylová skupina,

A¹ a A² se volí z případů 2 atomy vodíku, atom vodíku a skupina OR², atom vodíku a skupina -SR², atom vodíku a skupina -N(R²)_a a skupina, ve které A¹ a A² spolu vytvářejí zbytek zvolený z případů =0, =S a =NR²,

B¹ a B ² se volí z případů 2 atomy vodíku, atom vodíku a skupina -OR², atom vodíku a skupina -SR², atom vodíku a skupina -N(R²)_a a skupina, ve které B^x a B² vytvářejí zbytek zvolený z případů =0, =S a =NR², s podmínkou, že alespoň jeden z párů A^x a A² nebo B^x a B² tvoří =0.

Tento vynález se též částečně zaměřuje na způsob pozměňování aktivity proteinu MLK založený na styku tohoto proteinu nebo buňky obsahující tento protein se sloučeninou obecného vzorce IV

(IV) ve kterém

Z X	je atom vodíku a Z2 je atom vodíku nebo Ζχ a Z2 společně vytvářejí skupinu =0,
R	je atom vodíku nebo atom bromu,
R	je atom vodíku,
R 3	je atom vodíku, skupina CH2CH=CH2, CH2CH2CH2OH nebo /~\ CH CH CH -Ň ,0 a 2 2 2 \_/
R 4	je atom vodíku, skupina CH2CH=CH2 nebo CH2CH2CH=OH. V preferovaných ztělesněních tohoto vynálezu Rx, R2,

R , a Z₂ jsou atomy vodíku a R₃ je skupina CH_aCH=CH₂.

V dalších preferovaných ztělesněních tohoto vynálezu R_± je atom bromu a R₂, R₃, R₄, Ζ_χ a Z₂ jsou atomy vodíku nebo R_x,

• * • 4	4 4	ϊ « ··« i i í • · · ·«· · ·
35 - · 44	4 •	4 4 4·	4 4 · · 44 ··	4 444

R_a, Ζ_χ a Z₂ jsou atomy vodíku a R₃ a R₄ jsou skupiny CH₂CH=CH₂ nebo R , R_z, R₃, Z^ a Z₂ jsou atomy vodíku a je skupina CH CH=CH nebo R , R , Z a Z jsou atomy vodíku a R a R jsou skupiny CH CH CH OH nebo R , R , R , Z a Z

4 ^{J r J} 2 2 2 X 2 4 1 2 jsou atomy vodíku a R₃ je skupina

Tento vynález též poskytuje způsoby identifikace sloučenin, které lze použít při léčení neurodegenerativních poruch, zahrnující styk buňky nebo buněčného extraktu obsahujícího protein kinasy s násobnou vazbou se sloučeninou a stanovení, zda tato sloučenina snižuje aktivitu proteinu kinasy s násobnou vazbou. Buňky a jejich extrakty zahrnují ty, které se popisují výše. Sloučeniny nalézané těmito způsoby (to jest ty sloučeniny, které inhibují či snižují aktivitu proteinu kinasy s násobnou vazbou) lze použít pro léčení neurodegenerativních poruch. Protein se přednostně volí ze skupiny zahrnující kinasu s násobnou vazbou 1, kinasu s násobnou vazbou 2, kinasu s násobnou vazbou 3, kinasu nesoucí leucinový zipper, kinasu nesoucí dvojitý leucinový zipper a kinasu s násobnou vazbou 6. Buňka přichází do kontaktu in vitro nebo in vivo. Přednostně se aktivita proteinu určuje měřením aktivity nebo stavu fosforylace substrátu tohoto proteinu. Přednostně se substrát volí ze skupiny zahrnující JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, ρ38α, ρ38β, p38gama, ρ38δ, MEK1, MEK2, MKK3, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun,

- 36 » ·· • · ··> · J ♦ · · · · ! ! • ♦ · · · · ·· ♦· ·* *··

ATF2, ELK1 a savčí homolog AEX-3, stejně tak jako obecné substráty Ser/Thr, jako je například myelinový bázícký protein (MBP). Aktivitu proteinu lze též určit měřením aktivity substrátu proteinu, množství substrátu proteinu nebo mRNA kódující substrát proteinu. Aktivitu proteinu lze též určit kinasovou zkouškou in vitro nebo vazebnou zkouškou. Buňky jsou převážně primárními buňkami embryonálních motoneuronů, buňky které nadměrně exprimují protein kinasy s násobnou vazbou nebo motoneuronové buňky, avšak mohou to být jakékoliv buňky nebo jejich extrakty. Přednostně se sloučeniny, které se přímo váží na protein kinasy s násobnou vazbou, určí, jak se popisuje výše.

Tento vynález též poskytuje způsoby identifikace sloučenin, které lze použít při léčení zánětu, zahrnující styk buňky nebo buněčného extraktu obsahujícího protein kinasy s násobnou vazbou se sloučeninou a stanovení, zda tato sloučenina snižuje aktivitu proteinu kinasy s násobnou vazbou. Buňky a jejich extrakty zahrnují ty, které se popisují výše. Sloučeniny, které lze nalézt těmito způsoby (například sloučeniny, které inhibují či snižují aktivitu protein kinasy s násobnou vazbou) mohou být použitelné pro léčení zánětu. Protein se přednostně volí ze skupiny zahrnující kinasu s násobnou vazbou 1, kinasu s násobnou vazbou 2, kinasu s násobnou vazbou 3, kinasu nesoucí leucinový zipper, kinasu nesoucí dvojitý leucinový zipper a kinasu s násobnou vazbou

6. Buňka přichází do styku in vitro nebo in vivo. Přednostně se aktivita proteinu stanovuje měřením aktivity stavu fosforylace substrátu tohoto proteinu. Přednostně se tento substrát volí ze skupiny zahrnující JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, p38a, p38E, p38gama, ρ38δ, MEK1, MEK2, MKK3, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1 a savčí homolog AEX-3, stejně tak jako obecné substráty Ser/Thr, jako je například myelinový bázický protein (MBP). Aktivitu proteinu lze též stanovit měřením aktivity substrátu proteinu, množství substrátu proteinu nebo mRNA kódující substrát proteinu. Aktivitu proteinu lze též určit kinasovou zkouškou in vitro nebo vazebnou zkouškou.

Buňky jsou přednostně embryonální motoneuronové buňky, buňky které nadměrně exprimují protein kinasy s násobnou vazbou nebo neuronové buňky, avšak mohou to být jakékoliv buňky či jejich extrakty. Buňky též zahrnují, avšak bez omezení, ty typy buněk, které se účastní zánětu, jako jsou například lymfocyty, makrofágy a další bílé krvinky dobře známé tomu, kdo má zkušenost v oboru. Přednostně se identifikují sloučeniny, které se váží přímo na kinasový protein s násobnou vazbou.

Tento vynález též poskytuje způsoby léčení savce, který má neurodegenerativní poruchu nebo u kterého je podezření na tuto poruchu, zahrnující podávání tomuto savci sloučeniny, která inhibuje Či snižuje aktivitu kinasového proteinu s násobnou vazbou. Sloučenina, která inhibuje či snižuje aktivitu kinasového proteinu s následnou vazbou zahrnuje, avšak bez omezení, sloučeniny obecných vzorců I, II, III a IV. Preferované sloučeniny zahrnují ty, které se popisují výše vzhledem ke způsobu screeningu sloučenin pozměňujících aktivitu kinasového proteinu s násobnou vazbou a podporujících bud' přežívání buněk nebo zánik buněk. Preferovaným savcem je člověk. U jednotlivce může být podezření z neurodegenerativního onemocnění, pokud má symptomy konkrétního neurodegenerativního onemocnění, pokud je členem skupiny s vysokým rizikem, nebo pokud má rodinnou anamnézu neurodegenerativního onemocnění.

• 9

38· • 9 • •9

9 9 ·· ··

Tento vynález též poskytuje způsoby léčení savce majícího zánět zahrnující podávání tomuto savci sloučeniny, která inhibuje či snižuje aktivitu kinasového proteinu s násobnou vazbou. Sloučenina, která inhibuje či snižuje aktivitu kinasového proteinu s násobnou vazbou, zahrnuje, avšak bez omezení, sloučeniny obecných vzorců I, II, III a IV. Preferované sloučeniny zahrnují ty, které se popisují výše, vzhledem ke způsobu screeningu sloučenin pozměňujících aktivitu kinasového proteinu s násobnou vazbou a podporujících buď přežívání buněk nebo zánik buněk. Preferovaným savcem je člověk.

Styk sloučenin obecných vzorců I až IV se může uskutečňovat v pufrech či médiích dobře známých tomu, kdo má zkušenost v oboru. Alternativně lze kontakt uskutečnit podáním farmaceutického prostředku obsahujícího zkoušenou látku a farmaceuticky přijatelnou sůl, nosič nebo zřeďovací prostředek vhodnému živočichu či savci, jako je například myš nebo jiné vhodné zvíře známé tomu, kdo má zkušenost v oboru. Navíc lze použít různá množství buněk a koncentrací sloučenin. Buňky, které se mohou uvádět do kontaktu se zkoušenými látkami, mohou být jakékoliv savčí buňky. Přednostně je touto buňkou buňka neuronu. Přednostně se buňka účastní neurodegenerativního onemocnění, jako je například Alzheimerova choroba, onemocnění motorických neuronů, amyotropní laterální sklerosa, Parkinsonova choroba, cerebrovaskulární onemocnění, ischemické stavy, demence při AIDS, epilepsie, Huntingtonova choroba a otřesy či poranění pronikající do mozku či míchy. Sloučeniny obecného vzorce I a způsoby jejich přípravy se popisují v US patentu 5 705 511, jehož plné znění se zde zahrnuje formou odkazu. Sloučeniny obecného vzorce III a způsoby jejich přípravy se popisují v US patentech 5 741 8098, 5 621 100, 5 621 101, 5 461 146 a 5 756 494 • ·

3?

a v publikaci WO 97/46567 a jejich 2nění se zde zahrnuje v plném rozsahu formou odkazu. Sloučeniny obecného vzorce IV a způsoby jejich přípravy se popisují v US patentech

741 8098, 5 621 100, 5 621 101, 5 461 146 a 5 756 494 a v publikaci WO 97/46567, jejichž znění se zde zahrnuje v plném rozsahu formou odkazu.

Sloučeniny obecného vzorce II zahrnují diastereomery a enantiomery vzhledem k atomům uhlíku, ke kterým se připojují substituenty R², R^v a R⁸.

Preferované indenopyrrolokarbazoly s můstky znázorňuje obecný vzorec II

(II)

V některých preferovaných ztělesněních sloučenin • * 0

obecného vzorce II je R¹ atom vodíku. V dalších preferovaných ztělesněních je R² atom vodíku, hydroxylová skupina nebo substituovaná či nesubstituovaná alkylová skupina.

V dalších preferovaných ztělesněních jsou R³, R⁴, R⁵ a R⁶ nezávisle na sobě atom vodíku, substituovaná či nesubstituovaná alkylová skupina, atom halogenu, substituovaná či nesubstituovaná alkoxyskupina, substituovaná či nesubstituovaná aminoskupina nebo substituovaná či nesubstituovaná arylová skupina. V dalších preferovaných ztělesněních jsou R^v a R^s nezávisle na sobě atom vodíku nebo substituovaná či nesubstituovaná alkylová skupina.

V některých preferovaných ztělesněních je Y atom kyslíku. V dalších preferovaných ztělesněních je Z vazba, atom kyslíku, atom síry nebo substituovaný či nesubstituovaný atom dusíku. Ještě v dalších preferovaných ztělesněních jsou man nezávisle na sobě 1 nebo 2. V některých zvláště preferovaných ztělesněních je Y atom kyslíku, Z je vazba nebo atom kyslíku a m a n jsou nezávisle na sobě 1 nebo 2.

v dalších preferovaných ztělesněních jsou A^XA² a B^XB² =0 nebo dvojice atomů vodíku.

V některých zvláště preferovaných ztělesněních jsou R¹, R⁴, R⁶ a R² vesměs atomy vodíku, Y je =0, n je 1, A^XA² a B^XB² jsou =0 nebo dvojice atomů vodíku, R² je atom vodíku, hydroxylová skupina nebo nižší alkylová skupina, R³ je atom vodíku nebo substituovaná alkylová skupina, R^s a R⁸ jsou atomy vodíku nebo alkoxyskupiny s preferovanou methoxyskupinou, Z je vazba nebo atom kyslíku a m je 1 nebo 2.

Některá zvláště preferovaná ztělesnění sloučenin

* 4	4	• · ··*	4 · ·
4«	«	44 · *	*4 44

obecného vzorce II představují sloučeniny II-l, II-2, II-3, II-4a, II-4b, II-5, II-6, II-7a, II-7b, II-8, II-9, 11-10, 11-11 a 11-12 ukázané v tabulce 1 níže.

Sloučeniny obecného vzorce II se zde uvádějí jako sloučenina II.

Pojem karbocyklická, jak se zde používá, se týká cyklických skupin, ve kterých se kruhová část skládá pouze z atomů uhlíku. Pojmy heterocyklo a heterocyklická se týkají cyklických skupin, ve kterých kruhová část obsahuje alespoň jeden heteroatom, jako je atom kyslíku, dusíku nebo síry.

Pojem alkylová skupina, jak se zde používá, znamená přímou, cyklickou Či rozvětvenou alkylovou skupinu o 1 a 8 atomech uhlíku, jako je methylová skupina, ethylová skupina, propylová skupina, isopropylová skupina, butylová skupina, isobutylová skupina, sek.butylová skupina, terč.butylová skupina, pentylová skupina isoamylová skupina, neopentylová skupina, 1-ethylpropylová skupina, hexylová skupina, oktylová skupina, cyklopropylová skupina a cyklopentylová skupina. Alkylový zbytek skupin obsahujících alkylové skupiny, jako je alkoxyskupina, alkoxykarbonylová skupina a a1kýlaminokarbonylová skupina, má stejný význam jako alkylová skupina definovaná výše. Nižší alkylové skupiny, které se preferují, jsou alkylové skupiny, jak se definují výše, které obsahují 1 až 4 atomy uhlíku. Pojem alkenylová skupina zahrnuje přímé či rozvětvené uhlovodíkové řetězce mající alespoň jednu dvojnou vazbu mezi atomy uhlíku. Příklady alkenylových skupin zahrnují ethenylové a propenylové skupiny. Pojem alkinylová skupina, jak se zde užívá, zahrnuje přímé či rozvětvené uhlovodíkové řetězce mající alespoň jednu trojnou

* · *·· · « ’· • · · · · · « ·* ·♦ ·» ··♦ vazbu mezi atomy uhlíku. Příklady alkinylových skupin zahrnují ethinylové skupiny a propinylové skupiny.

Acylový zbytek skupin obsahujících acylové skupiny, jako jsou acyloxyskupiny zahrnuje přímou či rozvětvenou alkanoylovou skupinu o 1 až 6 atomech uhlíku, jako je formylová skupina, acetylová skupina, propanoylová skupina, butyrypiVaivyluvá Skupiiici nebo hexanoylová skupina.

Pojem arylová skupina, jak se zde používá, znamená skupinu o 6 až 12 atomech uhlíku, jako je fenylová skupina, bifenylová skupina a naftylová skupina. Preferované arylové skupiny zahrnují nesubstituované či substituované fenylové a naftylové skupiny. Pojem heteroarylová skupina, jak se zde používá, označuje arylovou skupinu, ve které je alespoň jeden atom uhlíku nahrazen heteroatomem (to jest jiným než uhlíkovým atomem), jako je kyslík, dusík nebo síra. Preferované heteroarylové skupiny zahrnují pyridylovou skupinu, pyrimidylovou skupinu, pyrrolylovou skupinu, furylovou skupinu, thienylovou skupinu, imidazolylovou skupinu, triazolylovou skupinu, tetrazolylovou skupinu, chinolylovou skupinu, isochinolylovou skupinu, benzimidazolylovou skupinu, thiazolylovou skupinu, pyrazolylovou skupinu a benzothiazolylovou skupinu.

Pojem aralkylová skupina (nebo ary1alkylová skupina) označuje skupinu mající 7 až 15 uhlíků tvořenou alkylovou skupinou, ke které je připojená arylová skupina. Příklady aralkylových skupin zahrnují benzylovou skupinu, fenethylovou skupinu, benzhydrylovou skupinu a naftylmethylovou skupinu.

• ··♦ · · · · v • · « ·· ··

Alkylové skupiny a alkylové zbytky, které jsou součástí substituentů, jako je aralkylová skupina, alkoxyskupina, arylalkoxyskupina, hydroxyalkoxyskupina, alkoxy-alkoxyskupina, hydroxy-alkylthioskupina, alkoxy-alkylthioskupina, alkylkarbonyloxyskupina, hydroxyalkýlová skupina a acyloxyskupina, mohou být substituované nebo nesubstituované. Substituovaná alkylová skupina má 1 až 3 nezávisle zvolené sub4 4— * % « m 4“ w f fr wX ln* f 1 r nlří, rf^v r vmi w r ií X í ·\ I f/rI^í r iJ L-J_ UUC.1ÍL· jf f XX jí UIJ. ΟΛγ -L. vy V V> VX OniX^/XllU / 11X Zj o-L. U-LA-VAJ QA.U pinu, nižší alkoxy-alkoxyskupinu, substituovanou nebo nesubstituovanou arylalkoxy-(nižší alkoxyskupinu), substituovanou či nesubstituovanou heteroarylalkoxy-(nižší alkoxyskupinu), substituovanou či nesubstituovanou arylalkoxyskupinu, substituovanou či nesubstituovanou heterocykloalkoxyskupinu, atom halogenu, karboxylovou skupinu, nižší alkoxykarbonylovou skupinu, nitroskupinu, aminoskupinu, mono- nebo di-(nižší alkyl)aminoskupinu, dioxolanovou skupinu, dioxanovou skupinu, dithiolanovou skupinu, dithionovou skupinu, furanovou skupinu, laktonovou skupinu nebo laktamovou skupinu.

Substituované arylové, substituované heteroarylové a substituované aralkylové skupiny mají vesměs 1 až 3 nezávisle zvolené substituenty, kterými jsou přednostně nižší alkylová skupina, hydroxylová skupina, nižší alkoxyskupina, karboxylové skupina, nižší alkoxykarbonylová skupina, nitroskupina, aminoskupina, mono- nebo di-(nižší alkyl)aminoskupina a atom halogenu.

Heterocyklické skupiny obsahující atom dusíku zahrnují pyrrolidinylovou skupinu, piperidinylovou skupinu, piperidinovou skupinu, morfolinylovou skupinu, morfolinoskupinu, thiomorfolinoskupinu, N-methylpiperazinylovou skupinu, indolylovou skupinu, isoindolylovou skupinu, imidazolovou skupinu, imidazolinovou skupinu, oxazolinovou skupinu, oxazolovou

44*., ·· ··· skupinu, triazolovou skupinu, thiazolinovou skupinu, thiazolovou skupinu, pyrazolovou skupinu, pyrazolonovou skupinu a triazolovou skupinu. Heterocyklické skupiny s atomem kyslíku zahrnují furanovou skupinu, tetrahydrofuranovou skupinu, pyranovou skupinu a tetrahydropyranovou skupinu.

Hydroxyalkýlové skupiny jsou alkylové skupiny, ke

Vt“ TWt Τ>ΖΛ-ΐ ii -i o r/A vrwi rl r«lri τ tu

- * ·— 'w-J ·.·.·. Μ X- J-V v V* .

LJ —t 1 χχτλ*·»* r nu fluor, chlor, brom a jod.

Pojem heteroarylalkylová skupina, jak se zde používá, znamená arylalkylovou skupinu, která obsahuje heteroatom. Pojem oxy označuje přítomnost atomu kyslíku. Alkoxyskupiny jsou tedy alkylové skupiny, které se připojují prostřednictvím atomu kyslíku a karbony1oxyskupiny jsou karbonylové skupiny, které se připojují prostřednictvím atomu kyslíku.

Pojem heterocykloalkoxyskupina znamená alkoxyskupinu, která má heterocyklickou skupinu připojenou k alkylovému zbytku a pojem arylalkoxyskupina znamená alkoxyskupinu, která má k alkylovému zbytku připojenou arylovou skupinu. Pojem alkylkarbony1oxyskupina znamená skupinu obecného vzorce -0-C(=0)-(alkylová skupina).

Pojem alkyloxy-alkoxyskupina, jak se zde užívá, označuje alkoxyskupinu, která obsahuje alkyloxysubstituent připojený k alkylovému zbytku. Pojem alkoxy-alkylthioskupina znamená alkylthioskupinu (to jest skupinu vzorce -S-alkylová skupina), která obsahuje alkoxysubstituent připojený k alkylovému zbytku. Pojem hydroxy-alkylthioskupina znamená alkylthioskupinu (to jest skupinu vzorce -S-alkyl), která obsahuje hydroxysubstituent připojený

♦ · ·	• ♦ ··		• «
45’.-»· :	·· ·*	*·	··♦

k alkylovému zbytku.

Pojem monosacharid, jak se zde používá, má obvyklý význam jednoduchého cukru.

Pojem aminokyselina, jak se zde používá, označuje molekulu obsahující aminoskupinu a karboxylovou skupinu. *7 Ί^- Ί rsnn Xn í «-*trr r vr v a a Ί r *r ir br·· -4 í ai -r <ra « ν» η 1 — · *- λ 1 * > A** — —- £* uut.j.coiickLj. _i_ _uix í*cu.LLimj± kí.^-anuiiuPky j o karboxylové kyseliny obecného vzorce HOOC-CH(NH₌)-(postranní řetězec).

Postranní řetězce aminokyselin zahrnují přirozené a nepřirozené zbytky. Nepřirozené postranní řetězce aminokyselin jsou zbytky použité místo přirozených aminokyselinových postranních řetězců, například analogy aminokyselin, viz například Lehninger, Biochemistry, 2. vydání, Worth Publishers, lne., 1975, s. 73-75, které se zde zahrnuje formou odkazu.

Preferované a-aminokyseliny zahrnují glycin, alanin, prolin, kyselinu glutamovou a lysin v konfiguraci D, v konfiguraci L nebo ve formě racemické směsi.

Postranní řetězce dalších zástupců a-aminokyselin ukazuje níže tabulka 1.

· ···

Tabulka 1

CHjHO-CH_r

CJij-CH,HOC^CH,

HO

HS-CH₂HO₂C-CH(NH₂)-CH,-S-S-CH₂CHj-CHjCH₃’S-CH₂-CH₂CH₃-CH₂-S-CH₂-CH₂ho-ch₂-ch₂CH_rCH(OH)HO₂C-CH₂-NHC(=O)-CH₂o-

HO₂C-CHj-CH₂NHjC(=O)-CH_rCH_r (CH₃)₂-CH(CH₃)₂-CH-CH₂ch₃-ch₂-ch₂H₂N-CH₂-CH₂'CH₂H₂N-C(=NH)-NH-CH₂-CH₂-CH₂H₂N-C(=O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂CH₃-CH₂-CH(CH₃)ch₃-ch₂-ch₃-ch₂H₂N-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂47\, • 4 «·» ·* • · · · ♦ · ·· » ♦ · 4 44 ·· ·· ··

V některých preferovaných ztělesněních zahrnují sloučeniny obecného vzorce II zbytek některé aminokyseliny po odstranění hydroxylového zbytku její karboxylové skupiny, to jest skupinu obecného vzorce -C{=0)-CH{NH_a)-(postranní řetězec) .

Funkční skupiny přítomné na sloučeninách obecného substituenty postranního řetězce aminokyselin ve sloučeni nách obecného vzorce II substituovat chránícími skupinami, jako je benzyloxykarbonylová skupina nebo terč.butoxykarbonylová skupina. Chránící skupiny jsou jako takové známy jako chemické funkční skupiny, které lze selektivně připojit k funkčním skupinám a odstranit z těchto skupin, jako jsou hydroxylové skupiny a karboxylové skupiny. Tyto skupiny jsou přítomné v chemické sloučenině, aby zajistily inertní chová ní funkční skupiny za reakčních podmínek, kterým je slouče nina vystavena. V tomto vynálezu lze použít kteroukoliv chránící skupinu. Jedna z těchto chránících skupin je benzyloxykarbonylová skupina (Cbz, Z). Další preferované chrá nící skupiny podle tohoto vynálezu lze nalézt v Greene,

T. W. a Wuts, P. G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vydání, Wiley & Sons, 1991.

Indenopyrrolokarbazolové sloučeniny s můstky vykazují důležité funkční farmakologické působení, které nalézá použití v řadě případů včetně výzkumu a terapie. Tyto deriváty jsou použitelné jako terapeutické prostředky. Působení těchto sloučenin vykazuje pozitivní účinky na funkci a/nebo přežívání buněk citlivých na trofické faktory. Účinek na funkci a/nebo přežívání buněk citlivých na trofické faktory, například buněk neuronální linie, lze prokázat kteroukoliv z následujících analýz: (1) stanovení cholinacetyltransfera48 * * · ·»··» « • ·· · · · · * » ··· · · · « · <* · ·· ·· ·· sy (ChAT) v kultuře míchy nebo (2) stanovení ChAT v kultuře basalního neuronu předního mozku.

Pojem účinek*¹, jak se zde používá pro modifikaci termínů funkce a přežívání, znamená pozitivní či negativní pozměnění či změnu. Účinek, který je pozitivní, se zde může uvádět jako zlepšení nebo zlepšující a účinek, který je negativní, se zde může uvádět jako inhibice či inhibuj ícíTermíny zlepšení či zlepšující, jak se zde užívají pro modifikaci termínů funkce či přežívání, znamenají, že přítomnost indenopyrrolokarbazolové sloučeniny s můstkem má pozitivní účinek na funkci a/nebo přežívání buněk citlivých na některý trofický faktor ve srovnání s buňkou v nepřítomnosti této sloučeniny. Jako příklad a nikoliv ve smyslu omezení vzhledem k přežívání například cholinergního neuronu by sloučenina zlepšovala přežívání cholinergní neuronové populace, která je vystavená riziku zániku (například následkem poranění, chorobného stavu, degenerativního stavu nebo přirozeného postupu) ve srovnání s cholinergní neuronovou populací bez přítomnosti této sloučeniny, jestliže léčená populace má ve srovnání delší dobu zachování funkce než neléčená populace.

Pojmy inhibovat a inhibice znamenají, že specifická odpověď určeného materiálu (například enzymatická aktivita) je ve srovnání snížená za přítomnosti indenopyrrolokarbazolové sloučeniny s můstkem.

Pojem trk, jak se zde používá, se vztahuje ke skupině neurotrofinových receptorů s vysokou aktivitou, které v současné době zahrnují trkA, trkB a trkC a další proteiny

I · ·«» · ·* • · · · · * * ·· • · · · · *· • · ·· · 9·· · vztahující se k membráně, ke kterým se váže neurotrofin.

Inhibice VEGFR, jak se zde používá, zahrnuje využití například při onemocnění, při kterých hraje důležitou úlohu angiogenese, jako je rakovina ve formě solidních tumorů, endometriosa, diabetická retinopatie, psoriasa, hemangioblastom a stejně tak další oční choroby a karcinomy.

Inhibice trk zahrnuje použití například při onemocněních prostaty, jako je karcinom prostaty a benigní hyperplasie prostaty, a léčení bolesti při zánětu.

Inhibice receptoru růstového faktoru odvozeného od destiček (PDGFR) zahrnuje použití například při různých formách neoplasie, revmatické arthritidy, plicní fibrosy, myelofibrosy, nenormálního hojení ran, onemocnění s kardiovaskulárními následky, jako je atherosklerosa, restenosa, restenosa po angioplastice atd.

Pojmy rakovina a rakovinový, jak se zde používají, se týkají jakékoliv maligní proliferace buněk u savce. Příklady zahrnují rakovinu prostaty, benigní hyperplasii prostaty, rakovinu vaječníků, prsu, mozku, plic, slinivky, tlustého střeva a rekta, žaludku, solidní tumory, tumory v oblasti hlavy a krku, neuroblastom, renální buněčný karcinom, lymfom, leukémii, další uznávané maligní procesy krvetvorného systému a další uznávané typy rakoviny.

Pojem neuron nebo buňka neuronové linie, jak se zde používá, a neuronová buňka zahrnuje, avšak bez omezení, heterogenní populaci neuronových typů majících singulární či násobné transmitery a/nebo singulární či násobné funkce. Přednostně jsou to cholinergní a sensorické neurony. Po • ·«*

50*·· jem cholinergní neuron, jak se zde používá, znamená neuron centrální nervové soustavy (CNS) a periferní nervové soustavy (PNS), jejichž neurotransmiterem je acetylcholin. Příkladem jsou neurony předního mozku, corpus striatum a míchy. Pojem sensorický neuron, jak se zde používá, zahrnuje neurony reagující na podněty prostředí (například teplota, pohyb) například z kůže, svalů a kloubů. Příkladem je neuron ganglionu dorsálních kořenů.

Buňka reagující na trofický faktor, jak se zde definuje, je buňka, která zahrnuje receptor, ke kterému se specificky váže určitý trofický faktor. Příklady zahrnují neurony (například cholinergní a sensorické neurony) a jiné než neuronové buňky (například monocyty a neoplastické buňky) .

Indenopyrrolokarbazolové sloučeniny s můstky, které se zde popisují, nalézají použití ve výzkumu a v terapii, například pro inhibici enzymatické aktivity. Například v oblasti výzkumu lze tyto sloučeniny použít v rozborech a modelech pro další zlepšení pochopení úloh, které hrají serinové/threoninové nebo tyrosinové proteinkinasy (například PKC, trk tyrosinová kinasa) při mechanistických aspektech souvisejících poruch a chorob. Při terapeutickém použití lze užít sloučeniny, které inhibují tyto enzymatické aktivity, pro potlačení škodlivých následků těchto enzymů vzhledem k poruchám, jako je karcinom.

Jak ukazují příklady popsané níže, lze inhibici enzymatické aktivity s použitím indenopyrrolokarbazolových sloučenin s můstky určit například následujícími rozbory:

1. stanovení inhibice aktivity tyrosinové kinasy trkA,

• ♦	·· · a	*
	• · · · ·	9
9 ·		•
99	•9 ·	99 »

2. inhibice fosforylace trk stimulované NGF v celobuněčném preparátu,

3. stanovení inhibice kinasy receptoru vaskulárního endotheliálního růstového faktoru (VEGFR),

4. stanovení inhibice aktivity PKC,

5. stanovení inhibice PDGFR.

Popisované indenopyrrolokarbazolové sloučeniny s můstky lze použít pro zlepšení funkce a/nebo přežívání buněk neuronové linie u některého savce, například u člověka. V těchto souvislostech lze tyto sloučeniny použít jednotlivě nebo s jinými kondenzovanými pyrrolokarbazoly a/nebo indolokarbazoly nebo v kombinaci s jinými prospěšnými molekulami, které též vykazují schopnost ovlivňovat funkci a/nebo přežívání určených buněk.

Řada neurologických poruch je charakteristická neuronovými buňkami, které jsou ve stavu zániku, poškozené, funkčně ohrožené, podrobené axonální degeneraci, ohrožené zánikem atd. Tyto poruchy zahrnují bez omezení Alzheimerovu chorobu, poruchy motorických neuronů (například amyotropní laterální sklerosu), Parkinsonovu chorobu, cerebrovaskulární poruchy (například mrtvici, ischemii), Huntingtonovu chorobu, demenci při AIDS, epilepsii, roztroušenou sklerosu, periferní neuropathie (například ty, které ovlivňují neurony DRG při periferní neuropathii související s chemoterapií) včetně diabetické neuropathie, poruch indukovaných excitujícími aminokyselinami a poruch souvisejících s otřesem nebo poškozením pronikajícím do mozku či míchy.

ChAT katalyzuje syntézu neurotransmiteru acetylcholinu a považuje se za enzymatický markér pro funkční cholinergní neuron. Funkční neuron je též schopný přežívání. Pře-

« • · · · • · · · ·♦ ««

žívání neuronu se určí kvantitativním stanovením specifického vychytávání a enzymatické přeměny barviva (například kalceinu ΆΜ) živými neurony.

Díky rozmanité použitelnosti nacházejí sloučeniny, které se zde popisují, včetně sloučenin identifikovaných způsoby, které se zde rovněž popisují, použití v řadě situací. Tyto sloučeniny lze použít při rozvoji modelů in vitro přežívání, funkce a identifikace neuronových buněk nebo pro screening dalších syntetických sloučenin, které vykazují aktivity podobné aktivitám sloučenin, které se zde popisují, nebo sloučenin, které se identifikují způsoby, které se zde rovněž popisují. Sloučeniny, které se zde popisují, stejně tak jako ty, které se identifikují způsoby, které se zde popisují, se mohou používat ve výzkumu pro vyšetřování, definování a stanovení molekulových cílů spojených s funkční odpovědí. Například značením indenopyrrolokarbazolové sloučeniny s můstky nebo sloučeniny identifikované způsoby, které se zde popisují, souvisejících se specifickou buněčnou funkcí (například mitogenesí), radioaktivními nuklidy lze identifikovat, izolovat a purifikovat pro charakterizaci cílovou složku, se kterou se daný derivát váže.

Sloučeniny, které se zde popisují, stejně tak jako ty, které se identifikují způsoby, které se zde rovněž popisují, jsou mimo jiné použitelné nejen pro zlepšování aktivit indukovaných trofickými faktory nebo buněk odpovídajících na trofické faktory, například cholinergních neuronů, avšak mohou též působit jako prostředky pro podporu přežívání jiných neuronových buněčných typů, například dopaminergních nebo glutamatergních. Růstové faktory mohou regulovat přežívání neuronů signalizací kaskád sestupně od malých proteinů, které váží GTP, včetně avšak bez omezení ras, rac a cdc42 [Den53 ^J • « 4 4·»· 4*· • 4 44 4 · » · · 4· • · 4 4 · · ·· · · ·· · ··« 4 hardt, Biochem. J., 318, 729 (1996)]. Konkrétně vede aktivace ras k fosforylaci a aktivaci extracelulární kinasy aktivované receptorem (ERK), která souvisí s procesy biologického růstu a diferenciace. Stimulace ras/cdc42 vede ke vzrůstu aktivace JNK a p38, odpovědím, které se spojují se stresem, apoptosou a zánětem. I když odpovědi růstového faktoru probíhají především cestou ERK, ovlivnění těchto procesů může vést k alternativním mechanismům neuronového přežívání, které mohou napodobovat vlastnosti zvyšování přežívání růstovými faktory [Xia a kol., Science, 270, 1326 (1995)]. Tyto sloučeniny mohou též působit jako prostředky pro podporu přežívání neuronových a jiných buněk mechanismy, které souvisejí s přežíváním zprostředkovaným růstovými faktory, avšak odlišují se od tohoto způsobu, například inhibicí cest JNK a p38, která může vést k přežívání inhibicí procesů apoptického zániku buňky.

Sloučeniny, které se zde popisují, jsou použitelné při léčení poruch spojených se sníženou aktivitou ChAT nebo se zánikem či poškozením motoneuronů míchy a jsou též použitelné například při chorobách spojených s apoptickým zánikem buněk centrálního a periferního nervového systému, imunitního systému a při zánětlivých chorobách.

Sloučeniny, které se zde popisují, se též mohou používat při léčení chorobných stavů včetně proliferace maligních buněk, jako je tomu při mnoha typech rakovinových onemocněních .

Farmaceuticky přijatelné soli sloučenin, které se zde popisují, stejně tak jako sloučenin identifikovaných popisovanými způsoby, zahrnují farmaceuticky přijatelné kyselé adiční soli, kovové soli, amonné soli, adiční soli organic♦ · V 9 9*9 99

S4 -9 9 9 9 9 9 999 * 9* · 99 ·· 9 kých aminů a adiční soli aminokyselin. Příklady kyselých edičních solí jsou adiční soli s anorganickými kyselinami, jako je hydrochlorid, síran a fosfát a adiční soli s organickými kyselinami, jako je acetat, maleat, fumarat, tartarat, citrát a laktat. Příklady kovových solí jsou soli alkalických kovů, jako je lithná sůl, sodná sůl a draselná sůl, soli kovů alkalických zemin, jako je horečnatá sůl a vápenatá sůl, hliníkové soli a zinečnaté soli. Příklady amonných solí jsou amonná sůl a tetramethylamonná sůl. Příklady adičních solí s organickými aminy jsou soli s morfolinem a piperidinem. Příklady adičních solí s aminokyselinami jsou soli s glycinem, fenylalaninem, kyselinou glutamovou a lysinem.

Sloučeniny, které se zde poskytují, včetně těch, které se identifikují způsoby, které se zde popisují, se mohou formulovat do farmaceutických prostředků smísením s farmaceuticky přijatelnými netoxickými pomocnými látkami a nosiči. Tyto prostředky lze připravovat pro použití parenterálním podáváním, zejména ve formě kapalných prostředků či suspenzí nebo perorálním podáváním, zejména ve formě tablet Či tobolek, nebo intranasálně, zejména ve formě prášků, nosních kapek či aerosolů, nebo dermálně například použitím transdermálních náplastí.

Prostředek lze vhodně podávat ve formě dávkových jednotek a může se připravovat jedním ze způsobů dobře známých v oboru farmacie, například jak se popisuje v Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980). Formulace pro parenterální podávání může obsahovat jako běžné pomocné látky sterilní vodu nebo fyziologický roztok, polyalkylenglykoly, jako je polyethylenglykol, oleje rostlinného původu, hydrogenované naftaleny a podobně. Jako pomocné látky pro kontrolu uvolňování aktivních složek mohou být • · · 4 ·44 · 4* •4 44 4 4 · * ** •4 444·*·* *· ««44 44··· zvláště užitečné biokompatibilní, biodegradovatelné laktidové polymery, kopolymer laktid/glykolid nebo polyoxyethylen-polyoxypropylenové polymery. Další potenciálně použitelné systémy pro parenterální podávání těchto účinných látek zahrnují ethylen-vinylacetatové kopolymerní částice, osmotická čerpadla, implatovatelné infusní systémy a liposomy. Přípravky pro inhalační podávání obsahují jako pomocné látky například laktosu nebo mohou být ve formě vodných roztoků obsahujících například polyoxyethylen-9-laurylether, glykocholat a deoxycholat nebo olejové roztoky pro podávání ve formě nosních kapek nebo mohou být ve formě intranasálně podávaného gelu. Formulace pro parenterální podávání může též obsahovat glykocholat pro bukální podávání, salicylat pro rektální podávání nebo kyselinou citrónovou pro vaginální podávání. Přípravky pro transdermální náplasti jsou přednostně ve formě lipofilních emulzí.

Prostředky podle tohoto vynálezu lze použít jako jedinou účinnou látku ve farmaceutickém přípravku. Alternativně je lze použít v kombinaci s jinými účinnými složkami, například s dalšími růstovými faktory, které umožňují přežívání neuronů nebo regeneraci axonů při chorobách a poruchách.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu a jejich farmaceuticky přijatelné soli lze podávat perorálně nebo jinak, například ve formě masti či injekce. Koncentrace sloučenin podle tohoto vynálezu v terapeutickém přípravku se v širokém rozmezí mění. Koncentrace bude záviset na faktorech, jako jsou celková dávka léku, který se má podávat, chemické charakteristiky (například hydrofobnost) použitých sloučenin, cesta podávání, stáří, tělesná hmotnost a symptomy pacienta atd. Sloučeniny podle tohoto vynálezu se poskytují ve vodném » t * * · ·»» · 4· • I «·«·**·»·

Rfi 1 · · · · · · · ·· * ·· ·φ *|··· fyziologickém pufru obsahujícím zhruba 0,1 až 10 hmotnostních % sloučeniny pro parenterální podávání. Obvyklá dávková rozmezí jsou od zhruba 1 jíg/kg do zhruba 1 g/kg tělesné hmotnosti denně. Preferované dávkové rozmezí je od zhruba 0,01 mg/kg do 100 mg/kg tělesné hmotnosti denně, nejlépe zhruba 0,1 až 20 mg/kg jednou až čtyřikrát denně. Preferované dávkování podávaného léku závisí na proměnných, jako je typ a rozsah postupu onemocnění či poruchy, celkový zdravotní stav konkrétního pacienta, relativní biologická účinnost zvolené sloučeniny a formulace pomocné látky sloučeniny a její cesta podávání.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu včetně testovaných sloučenin a sloučenin identifikovaných způsoby podle tohoto vynálezu a jejich farmaceuticky přijatelné soli se mohou podávat samotné nebo ve formě různých farmaceutických přípravků v závislosti na farmakologických účincích a účelu podávání. Farmaceutické prostředky podle tohoto vynálezu lze připravit jednotným smísením účinného množství sloučeniny nebo její farmaceuticky přijatelné soli jako účinné složky s farmaceuticky přijatelným nosičem. Tento nosič může být v širokém rozmezí forem v závislosti na formách přípravku vhodného pro podávání. Požaduje se, aby tyto farmaceutické přípravky byly v jednotkových dávkových formách vhodných pro perorální nebo jiné podávání. Formy pro jiné než perorální podávání zahrnují masti a injekce.

Tablety lze připravovat s použitím pomocných látek, jako je laktosa, glukosa, sacharosa, mannitol a methylcelulosa, rozvolňovadel, jako je škrob, alginat sodný, vápenatá sůl karboxymethylcelulosy a krystalická celulosa, maziv, jako je stearat hořečnatý a mastek, pojiv, jako je želatina, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, hydroxypropylcelulosa

* V Φ ·· W · · · ♦· 9 9« * * l ·· ·«· ·· * »·*··»* ·· ·· 99999 a methylcelulosa, povrchově aktivních látek, jako jsou estery mastné kyseliny se sacharosou a sorbitolem a podobně, konvenčním způsobem. Preferuje se, aby každá tableta obsahovala 15 až 300 mg účinné složky.

Granule lze připravovat s použitím pomocných látek, jako je laktosa a sacharosa, rozvolňovadel, jako je škrob, pojiv, jako je želatina a podobně, konvenčním způsobem. Prášky lze připravovat s použitím pomocných látek, jako je laktosa a mannitol a podobně, konvenčním způsobem. Tobolky lze připravovat s použitím želatiny, vody, sacharosy, arabské klovatiny, sorbitolu, glycerolu, krystalické celulosy, stearatu hořečnatého, mastku a podobně, konvenčním způsobem. Preferuje, aby každá tobolka obsahovala 15 až 300 mg účinné složky.

Sirupy lze připravovat s použitím cukru, jako je sacharosa, vody, ethanolu a podobně, konvenčním způsobem.

Masti lze připravovat s použitím masúovych základů, jako je vaselina, kapalný parafin, lanolin a makrogol, emulgátorů, jako je lauryllaktat sodný, benzalkoniumchlorid, sorbitanový monoester mastné kyseliny, sodná sůl karboxymethylcelulosy a arabská klovatina a podobně, konvenčním způsobem.

Přípravky pro injekce se připravují s použitím rozpouštědel, jako je voda, fyziologický roztok, rostlinné oleje (například olivový olej a slunečnicový olej), ethyloleat a propylenglykol, solubilizačních prostředků, jako je benzoat sodný, salicylat sodný a urethan, prostředků pro úpravu osmotického tlaku, jako je chlorid sodný a glukosa, konzervačních prostředků, jako je fenol, kresol, ester kyseliny

- 58 -»·♦ ···· · * p-hydroxybenzoové a chlorbutanol, antioxidačních prostředků, jako je kyselina askorbová a pyrosulfit sodný a podobně, konvenčním způsobem.

Příklady provedení vynálezu

Tento vynález se dále znázorňuje pomocí následujících příkladů, které jej mají objasnit. Tyto příklady se nezamýšlejí a také se nekonstruují tak, aby vytvářely omezení obsahu tohoto popisu.

Příklad 1

Obecný popis syntetických způsobů a příkladů

Obecný způsob přípravy používaný pro získávání indenopyrrolokarbazolů s můstky podle tohoto vynálezu obecných vzorců II ukazují obrázky 1 a 2. Obecné způsoby přípravy indenopyrrolokarbazolů II/VIII se mohou provádět, jak se popisuje v US patentu č. 5 705 511, jehož popis se zde zahrnuje v plném znění formou odkazu. Jestliže R¹ je atom vodíku, chrání se laktamový dusík indenopyrrolokarbazolů III/VIII příslušnou chránící skupinou s obdržením IV/IX. Chráněné sloučeniny se zpracují příslušnou bází v bezvodém organickém rozpouštědle (rozpouštědlech), což vede k obdržení tmavě červeného roztoku, který se považuje za karbanion. Reakce karbanionu s bifunkčním činidlem V vede k elektrofilní adici vazby C=Y V, která vede k počátečnímu meziproduktu VI/X. Zpracování meziproduktu (meziproduktů) VI/X a/nebo VII/XI buď některou sulfonovou kyselinou nebo některou Lewisovou kyselinou, například etheratem fluoridu boritého, poskytuje indenopyrrolokarbazoly I/II s můstky.

φ · Φφφφ· φ φ Φ* » · · · ·Μ

Φ Φ · « ΦΦ • ·· Φ·♦ ·

Ml

Způsob ochrany laktamového dusíku (ukázaný na obr. 3 a 4) se může provádět buď kyselou nebo bázickou katalýzou. Reakce katalyzovaná kyselinou se může provádět s činidlem vázaným na pryskyřici umožňujícím immobilizaci indenopyrrolokarbazolu III/VIII na polymerním nosiči, jako je Rinkova kyselá pryskyřice na bázi polystyrenu XII (obr. 3) s obdržením XIII. Alternativně lze reakci katalyzovanou kyselinou provést s rozpustným činidlem s obdržením sloučeniny XIV (obr. 4). Sloučenina chráněná silylem (XV) se obdrží katalýzou v bazickém prostředí (obr. 4).

Obr. 5 popisuje několik způsobů přípravy meziproduktu V. Způsob (a) popisuje transformace různých acetalů XVI na XVII, Z = vazba. Například ester-acetal/ketal XVI, D = COOR, se úplně redukuje na odpovídající alkohol a následně oxiduje (například Swernova či Dessova-Martinova oxidace) na aldehyd-acetal/ketal (XVII, R^s = H). Alternativně se ester-acetal/ketal XVI, D = COOR, částečně redukuje DIBALem s přímým obdržením aldehydu XVII, R® = H. Podobně redukce nitril-acetalu XVI, D = CN, DIBALem poskytuje aldehyd XVII, R® = H. Keto-acetal/ketal se připraví přídavkem Grignardova činidla k Weinrebovu amid-acetalu/ketalu XVI, D = CON(OMe)Me.

Meziprodukt XVII, Z = vazba, se může též obdržet dvoustupňovým způsobem (b). Přídavek organometalického prostředku XIX k acetalu/ketalu XVIII poskytuje alken XX, který ozonolýzou s následným redukčním zpracováním poskytuje ketoacetal/ketal XVII. Příprava meziproduktu XVII, Z = heteroatom, dvoustupňovým způsobem se popisuje ve způsobu (c) . Spojení acetalu XXII s alkenem XXI s následnou ozonolýzou (s redukčním zpracováním) výsledného alkenu poskytuje ketoacetal/ketal XVII. Alternativně se připraví meziprodukt • ” » · v · · · «* * · φ φ φφ · ·· • · φ · 4 40 44

Λ Φ φ * 4 4 · ΦΦ 4

ΦΦ Φ ΦΦ ·9 «·444

XVII, Z = heteroatom, dvoustupňovým způsobem (d). Reakce sloučeniny XXIV s acetalem/ketalem XVIII poskytuje sloučeninu XXV, která se transformuje na ketoacetal/ketal způsoby popsanými jako způsob (a). Kondenzace ketoacetalu/ketalu XVII s hydroxylaminy, hydraziny, N-alkyl-N-alkoxyaminy a aminy poskytuje meziprodukt XXVI s elektrofilní funkční skupinou C=N.

Indenopyrrolokarbazol XIII (obr. 6, způsob A) vázaný na pryskyřici se zpracuje přebytkem Grignarova činidla jako bází s obdržením tmavě červeného roztoku karbanionu. Následná reakce s V vede k produktům odvozeným od elektrofilní adice na skupinu C=Y. Zpracování ve vodném prostředí a odštěpení produktu (produktů) zředěnou kyselinou (1% kyselina trifluoroctová v methylenchloridu) od pryskyřice vede k izolaci sloučeniny (sloučenin) XXVII a/nebo XXVIII. Zpracování meziproduktu (meziproduktů) XXVII a/nebo XXVIII buď některou sulfonovou kyselinou nebo některou Lewisovou kyselinou, například etheratem fluoridu boritého, poskytuje indenopyrrolokarbazoly s můstky II.

Podobný přístup se používá pro reakci rozpustného meziproduktu chráněného laktamem, například XV (obr. 7, způsob

B), Avšak v tomto případě se meziprodukt XV zpracuje Tritonem B v pyridinu jako bázi místo použití Grignardova činidla. Meziprodukt (meziprodukty) XXIX a/nebo XXX lze izolovat s neporušenou chránící laktamovou skupinou, která se může podrobit chromatografické purifikaci. Podobně jako ve způsobu A (obr. 6) poskytuje zpracování některou Lewisovou kyselinou (například etheratem fluoridu boritého) indenopyrrolokarbazoly s můstky II, kde R^x = H.

Zavedení skupin R³, R⁴, R⁵ a R⁶ lze provést, jak se j·· · · · * » « aa *a popisuje v US patentech č. 5 705 511 a 4 923 986, jejichž plné znění se zde zahrnuje formou odkazu. Substituent R³ se může jinak zavádět po vytvoření indenopyrrolokarbazolů s můstky, jak ukazuje obr. 8. Poloha 3 kruhu B se brómuje pomocí NBS s obdržením sloučeniny XXXI. Uhlíkatý fragment se následně zavede použitím reakce Stilleho, Suzukiho, Hecka, Kumady nebo Castra-Stephense katalyzované palladiem s obdržením sloučenin typu XXXII, XXXIII atd. Navíc může sloučenina XXXI poskytnout přístup ke sloučeninám, ve kterých je skupina bromu vytěsněna heteroatomem, například skupinou na bázi aminu použitím Buchwaldovy aminace katalyzované palladiem.

Oxidačním způsobem lze zavést skupinu připojenou prostřednitvím kyslíku na indenový uhlík kruhu E, jak ukazuje obr. 9, sloučenina XXXIV. Tento způsob též vede k oxidaci methylenové skupiny laktamu (kruh A) s obdržením ukázaného imidového derivátu.

Příklad 2

Příprava meziproduktů vázaných na Rinkovu pryskyřici XIII-A, XIII-B a XIII-C, obr. 3

Příklad 2-A

Tříhrdla baňka s kulatým dnem opatřená Deanovým-Stárkovým lapačem se postupně naplní Rinkovou kyselou pryskyřicí XII (10,00 g, 0,64 mmol/g), 1-methyl-2-pyrrolidinonem (80 ml), bezenem (350 ml), sloučeninou VIII-A (A¹, A² = H₂, D¹, B² = 0, R³ = R⁴ = R⁵ = R^s = H) (3,00 g) a kyselinou p-toluensulfonovou (1,00 g). Reakční směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 20 h a poté se zfiltruje. Prysky£9 1 · · ··«··*« ·· · φφ «φ Μ ··· řiče se promyje tetrahydrofuranem (5 x 175 ml) a filtrát se odloží stranou. Pryskyřice se poté postupně promyje dimethylsulfoxidem (4 x 100 ml), 2% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (4 x 100 ml), vodou (4 x 100 ml), dimethylsulfoxidem (2 x 200 ml), tetrahydrofuranem (4 x 100 ml) a ethylacetatem (4 x 100 ml). Po vysušení pryskyřice ve vakuu se obdrží sloučenina VIII-A (1,28 g).

Původní terahydrofuranové promývací podíly se odpaří, zbytek se zředí vodou (750 ml) a výsledná sraženina se zfiltruje a postupně promyje vodou, 2¾ hydrogenuhličitaném sodným 4 x 100 ml) a vodou (4 x 100 ml). Po vysušení ve vakuu se obdrží VIII-A (1,28 g) .

Příklad 2-B

Podobným způsobem se sloučenina VIII-B (A^x, A² = O, B^x, B² = H₂, R³ = R^ů = R^s = R^e = H) (0,5 g) naváže na Rinkovu kyselou pryskyřici XII (1,52 g) s obdržením 1,58 g sloučeniny VIII-B navázané na pryskyřici, XIII-B.

Příklad 2-C

Podobným způsobem se sloučenina VIII-C (A^x, A² = H₌, B^x, B² = O, R³ = R^4, = R⁵ = H, R^G = 10-OMe) (1,02 g) naváže na Rinkovu kyselou pryskyřici XII (13,12 g) s obdržením 3,70 g (0,46 mmol/g) sloučeniny VIII-C navázané na pryskyřici, XIII-C, spolu se získanou sloučeninou VII-C (0,44 g) .

Příklad 3

Příprava sloučeniny II-l, sloučeniny II-2, sloučeniny II-3, sloučeniny II-4a, sloučeniny II-4b, sloučeniny II-6 a slou63 ³

Ceniny II-8 (způsob A, obr. 6)

Příklad 3-A

K suspenzi sloučeniny XIII-A (1,25 g) v tetrahydrofuranu (24 ml) se přidá 1,0 M roztok ethylmagnesiumbromidu (6.25 ml v tetrahydrofuranu) a reakční směs se míchá po dobu 1 h před přídavkem HMPA (5,0 ml). Po míchání po dobu 10 min se přidá diethoxybutyraldehyd (3,0 g) [který se připraví podle způsobu popsaného v literatuře, Paquette a kol., J.

Am. Chem. Soc., 119, 9662-71 (1997)] a reakční směs se míchá po dobu 20 h. Reakce se ukončí přídavkem 10% vodného roztoku chloridu amonného (5 ml) a směs se zfiltruje. Pryskyřice se postupně promyje 10% vodným roztokem hydroxidu amonného (3 x 10 ml), vodou (3 x 10 ml), tetrahydrofuranem (3 x 10 ml), dimethylformamidem (3 x 10 ml), vodou (3 x 10 ml), tetrahydrofuranem (3 x 10 ml) a etherem (3 x 10 ml). Pryskyřice se suší ve vakuu, vyjme methylenchloridem (15 ml) a zpracuje kyselinou trifluoroctovou (0,15 ml). Po míchání po dobu 1 h se reakční směs zfiltruje a filtrát se odpaří. Výsledný zbytek se vyjme methylenchloridem (20 ml) a zpracuje pyridiniumtosylatem (50 mg) a výsledný roztok se míchá po dobu 4 h. Poté se reakční směs promyje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a roztokem chloridu sodného a vysuší síranem hořečnatým.

Po filtraci a odpaření rozpouštědla se zbytek purifikuje preparativní vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií (Zorbax RX-8, 4 x 25 cm, eluce 60% směsí acetonitril/voda s 0,1 % kyseliny trifluoroctové). Příslušné frakce se neutralizují hydrogenuhličitanem sodným a extrahují do methylenchloridu (3 x 50 ml) a poté se vysuší síranem hořečnatým. Po zfiltrování a odpaření rozpouštědla se obdrží 70,2 mg slou- 64

W* · · · V · V · W • · · · to ··· · · • · · · · toto to · · to · ··· ······« v* · ·· ·· toto ··· ceniny II-l ve formě bílého prášku, který vykazuje následující vlastnosti.

Nukleární magnetická

143.3,

127.4,

142,4,

127,1,

141,4,

126,8,

118,3,

171.8,

127.9,

121,5,

NMR (DMSO-d₆) (d, J = 7,7, 1H) , 7,49 7,36-7,27

1H) ,

1H) ,

1H) .

112,1, δ 9,21

1H) , (dd, J = (m, 2H), (s, 2H),

4,91

1,96-1,92 (m,

88,1, 79,2, (d, J =

7,86 (d, J

7,9, 7,4,

6,86 (d, .

4,53 (d,

1H), 0,96 resonance ^iaC NMR (DMSO-d ) δ

140,1, 140,0, 136,6, 129,2,

124,1 (2C), 122,7, 121,6,

24,8, ^XH

7,98 = 7,3,

1H) , (m, (m,

56,6, 45,6, 33,4,

7,5, 1H) , 8,62 (s, 1H), = 8,3, 1H), 7,71 (d, J

1H), (dd, J = 7,5, 7,4, =6,0, 1H), 5,63-5,58 = 3,3, 1H), 2,23-2,14

Hmotnostní spektrometrie m/z (M+H) vypočteno 379, naměřeno 379.

Preparativní vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií této směsi reakčních produktů se též oddělí sloučenina II-2 (0,5 mg), která vykazuje následující vlastnosti.

Nukleární magnetická resonance ^XH NMR (DMSO-d_e) δ

9,17 (d, J = 8,1, 1H), 8,62 (s, 1H), 7,98 (d, J = 7,0, 1H),

7,85 (d, J = 6,8, 1H), 7,57 (d, J = 6,8, 1H), 7,49 (dd, J =

7,9, 7,4,	1H), 7,44-7,26	(m, 3H), 6,81 (d, J = 6,0,	1H) ,
5,43-5,33	(m,	1H)	, 4,43	(s, 2H), 2,23-2,14	(m,	1H) ,
1,96-1,92	(m,	1H)	, 1,45-	1,55 (m, 2H), 0,96	-0,88	(m,	1H) ,
0,60-0,57	(m,	1H)	, 0,29	(t, J = 7,0, 3H).

Hmotnostní spektrometrie m/z (M+H) vypočteno 407, naměřeno 407.

•	«	•	•	•	···	* ·
J	•	•	•	•	• ·	• *
·	•		«·	«·	«·

Příklad 3-B

Podobným způsobem, jak se popisuje výše pro sloučeninu II-l, se pryskyřice XIII-A (70,3 mg) zpracuje

1,l-diethoxy-2-pentanonem (0,75 ml) [který se připraví podle způsobu popsaného v literatuře Sworinem a kol., J. Org. Chem., 53, 4894-4896 (1988)] s obdržením sloučeniny II-3 (3,5 mg), která se oddělí preparativní chromatografií na tenké vrstvě (silikagel, eluce 50% směsí ethylacetat/toluen) a vykazuje následující vlastnosti.

	Nukleá	rní	magnetická	resonance XH NMR (DMSO-d^)	δ
9,42	(d, J =	8,2,	1H), 8,58	(S, 1H), 7,95	(d, J = 7,4,	1H) ,
7,79	(d, J =	8,3,	1H), 7,71	(d, J = 7,1),	7,50-7,20 (m,
4H) ,	6,81 (d,	J =	5,9, 1H),	4,90 (s, 2H),	4,46 (S, 1H),
2,35-	-2,20 (m,	1H)	, 1,98 (s,	3H), 1,75-1,60	(m, 1H),
1,25-	-1,00 (m,	1H)	, 0,35-0,15	(m, 1H) .

Hmotnostní spektrometrie m/z (M+H) vypočteno 393, naměřeno 393.

Příklad 3-C

Podobným způsobem se sloučenina XIII-A (74,3 mg) zpracuje 1,l-diethoxy-2-hexanonem [který se připraví podle způsobu popsaného v literatuře Brennerem, J. Org. Chem.,

26. 22-27 (1961)] (0,75 ml) s obdržením sloučeniny II-4a (2,10 mg) a sloučeniny II4b (1,06 mg), které se individuálně oddělují preparativní vysokovýkonnou kapalinovou chromatograf ií (Zorbax RX-8, 4 x 25 cm, 65% směs acetonitril/voda s 0,1 % kyseliny trifluoroctové). Sloučenina II-4a má následující vlastnosti.

•	•	•	v	v •	V • 44	9 4	* •	* v
4	•	•	•	4	• ·	k	4
-	•	44	• 4	4 4	44

Nukleární magnetická resonance ^XH NMR (DMSO-d_e) δ 9,30 (d, J = 8,3, 1H), 8,55 (s, 1H), 7,97 (d, J = 7,2, 1H),

7,65 (d, J = 8,5, 1H), 7,59 (d, J = 7,5), 7,48 (dd, J = 7,8, 7,2, 1H), 7,39-7,15 (m, 3H), 6,31 (dd, J = 5,9, 5,5, 1H), 5,02 (s, 1H), 4,88 (s, 2H), 0,88 (s, 3H) ostatní alifatické signály se ztrácejí pod píky rozpouštědla.

Hmotnostní spektrometrie m/z (M+H) (M+H) vypočteno 407, naměřeno 407.

Sloučenina II-4b má následující vlastnosti.

^XH NMR (DMSO-d₆) δ 9,43 (d, J = 8,1, 1H), 8,59 (s,

1H), 7,99 (d, J = 7,3, 1H), 7,75-7,65 (m, 2H), 7,49 (dd, J = 7,0, 6,4, 1H), 7,43 (dd, J = 8,2, 8,1, 1H), 7,36-7,25 (m, 2H), 6,75 (s, 1H), 4,91 (s, 2H), 4,50 (s, 1H), 1,95 (s, 3H) ostatní alifatické signály se ztrácejí pod píky rozpouštědla.

Hmotnostní spektrometrie m/z (M+H) naměřeno 407, vypočteno 407.

Příklad 3-D

Podobným způsobem se sloučenina XIII-C (1,00 g) zpracuje diethoxybutyraldehydem (3,65 g) s obdržením sloučeniny II-6 (87,8 mg), která se oddělí preparativní vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií (Zorbax RX-8, 2,5 x 25 cm, 65% směs acetonitril/voda s 0,1 % kyseliny trifluoroctové) a vykazuje následující vlastnosti.

Nukleární magnetická resonance ^XH NMR (DMSO-d_g) Ó 9,09 (d,J = 8,6, 1H), 8,60 (s, 1H), 7,95 (d, J = 7,4, 1H), • · · · · ··· · » · • · · · «· · ··· ·· · ·· · ·· ···

7,84	(d, J = 8,3, 1H),	7,47	(dd, J = 7,2,	7,0, 1H),	7,35 (S,
1H) ,	7,29 (dd, J = 7,0,	- 7,0,	1H), 6,98 (d	d, J = 8,6,	1.9,
1H) ,	6,83 (d, J = 6,0,	1H) ,	5,65-5,55 (m,	1H), 4,88	(s,
2H) ,	4,48 {d, J = 3,9,	1H) ,	3,82 (s, 3H),	2,25-2,10	(m,
1H) ,	2,08-1,85 (m, 1H),	, 0,96	-0,75 (m, 1H)	, 0,65-0,50	(m,
1H) .

Hmotnostní spektrometrie m/z (M+Na) vypočteno 431, naměřeno 431.

Příklad 3-E

Podobným způsobem se pryskyřice XIII-B (153,2 mg) zpracuje diethoxybutyraldehydem (1,5 ml) s obdržením sloučeniny II-8 (3,6 mg), která se izoluje preparativní vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií (Zorbax RX-8, 2,5 x 25 cm, 65% směs acetonitril/voda s 0,1 % kyseliny trifluoroctové) a vykazuje následující vlastnosti.

Nukleární magnetická resonance ’Ή NMR (DMSO-d_e) δ 9,09 (d, J = 7,9, 1H), 8,81 (s, 1H), 7,81-7,73 (m, 3H), 7,48-7,35 (m, 3H), 7,24 (dd, J = 7,6, 7,5, 1H), 6,85 (d, J = 6,2, 1H), 5,63-5,59 (m, 1H), 4,86 {s, 2H), 4,61 (d, J = 3,6, 1H), 3,82 (s, 3H), 2,21-2,13 (m, 1H) , 1,96-1,90 (m, 1H), 0,87-0,79 (m, 1H) , 0,61-0,56 (m, 1H) .

Hmotnostní spektrometrie m/z (M+H) vypočteno 379, naměřeno 379.

Příklad 4

Příprava sloučeniny II-7a a sloučeniny II-7b (způsob A, obr.

6)

	• » · • · ··»	•	•	* ·
• · i		• *	•	•
·♦ ·		*·	♦ ·	• *

Příklad 4-A

Příprava (1,1-diethoxyethoxy)acetonu

Ke chladné (0 °C) suspenzi hydridu sodného (2,68 g, 60%) v tetrahydrofuranu (150 ml) se přidá roztok 1,1-diethoxyethanolu [který se připraví podle způsobu popsaného v literatuře Zirklem a kol., J. Org. Chem., 26, 395-407 (1961)] (9,00 g) v tetrahydrofuranu (20 ml) a reakční směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 1 h před přídavkem methylallychloridu (8,0 ml). Reakční směs se vaří pod zpětným chladičem přes noc, vychladí a zfiltruje celitem. Rozpouštědlo se odpaří na rotační odparce a zbytek se purifikuje sloupcovou chromatografií (silikagel, eluce 20% směsí ether/hexan) s obdržením 1,1-diethoxyethyl-methylallyletheru (11,5 g, 90 %). Ozonolýza vychlazeného (-30 °C) roztoku tohoto etheru (6,00 g) v ethylacetatu (80 ml) se provádí tak dlouho, až chromatografie na tenké vrstvě nedetekuje žádnou výchozí látku (1 h). Poté se reakční směs promývá proudem kyslíku, zpracuje hydroxidem palladnatým (150 mg) a míchá přes noc pod atmosférou vodíku. Katalyzátor se odfiltruje a filtrát se odpaří na rotační odparce. Výsledný zbytek se purifikuje sloupcovou chromatografií (silikagel, 20% směsí ethylacetat/hexan) s obdržením sloučeniny podle nadpisu (4,53 g, 82 %).

Příklad 4-B

Podle způsobu A (obr. 6) se pryskyřice XIII-A (230,2 mg) zpracuje ethylmagnesiumbromidem (1,25 ml) a poté

1,1-(diethoxyethoxy)acetonem (příklad 3-A) (1,2 ml). Po zpracování a odštěpení od pryskyřice se podíl surové směsi • · · ····*·* - ·· · ·· ♦· ·♦· reakčního produktu (10,5 mg) vyjme methylenchloridem (20 ml) a zpracuje etheratem fluoridu boritého (20 μΐ). Po míchání po dobu 2,5 h se roztok promyje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným roztokem chloridu sodného a vysuší se síranem horečnatým. Po filtraci a odstranění rozpouštědla se výsledný zbytek purifikuje preparativní vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií (Zorbax RX-8, 4 x 25 cm, 65% směs acetonitril/voda s 0,1 % kyseliny trifluoroctové) s obdržením sloučeniny II-7a (2,34 mg) a sloučeniny II-7b (1,34 mg). Sloučenina II-7a má následující vlastnosti.

Nukleární magnetická resonance ^XH NMR (CDC1₃) δ 9,35-9,20 (m, 1H), 7,87 (d, J = 7,6, 1H), 7,62 (d, J = 7,0,

1H), 7,60-7,45 (m, 1H), 7,49 (dd, J = 7,7, 7,5, 1H), 7,40 (d, J = 8,1, 1H), 7,37-7,26 (m, 3H), 6,22 (s, 1H), 5,20-4,85 (m, 1H), 4,47 (s, 1H), 3,67 (d, J = 12,7, 1H),

3,52 (d, J = 11,8, 1H), 3,40 (d, J = 12,7, 1H), 3,38 (d,

J = 11,8, 1H), 1,91 (s, 3H).

Hmotnostní spektrometrie m/z (M+H) vypočteno 409, naměřeno 409.

Sloučenina II-7b má následující vlastnosti.

Nukleární magnetická resonance ^XH NMR (CDCl_a) δ

9,58-9,22 (m, 1H), 7,82 (d, J = 7,4, 1H), 7,60-7,40 (m, 3H), 7,37-7,27 (m, 3H), 7,21 (d, J = 8,1, 1H), 5,81 (S, 1H), 5,21 (s, 1H), 5,10-4,80 (m, 1H), 4,59 (d, J = 13,5, 1H), 4,38 (dd, J = 13,5, 5,3, 1H), 4,21 (d, J = 13,1, 1H) ,

3,82 (d, J = 13,1, 1H), 1,13 (s, 3H).

Hmotnostní spektrometrie m/z (M+H) vypočteno 409, na70

4 4	•	• v		* 9
4 4 ··	• •	« · • t	• ·	• 4 <·	«4

měřeno 409.

Příklad 5

Příprava sloučeniny II-5 (obr. 8)

K roztoku sloučeniny II-l (8,1 mg) v tetrahydrofuranu (2 ml) se přidá NBS (4,6 mg) a reakční směs se míchá přes noc. Přidá se další NBS (4,5 mg) a reakční směs se míchá po dobu 2,5 h. Nerozpustná látka se odfiltruje a filtrát se odpaří na rotační odparce. Výsledný zbytek se purifikuje sloupcovou chromatografií (C-18, eluce 65% směsí acetonitril/voda s 0,1 % kyseliny trifluoroctové). Příslušné frakce se neutralizují hydrogenuhličitanem sodným a extrahují methylenchloridem (3 x 20 ml) a poté se vysuší síranem hořečnatým. Po zfiltrování a odpaření rozpouštědla se obdrží sloučenina II-5 (5,1 mg) ve formě bílého prášku, který vykazuje následující vlastnosti.

Nukleární magnetická resonance ^XH NMR (DMSO-d_e) δ 9,22 (d, J = 7,4, 1H), 8,67 (s, 1H) , 8,14 (s, 1H), 7,86 (d,

J = 8,7, 1H), 7,72 (d, J = 7,0, 1H), 7,63 (d, J = 7,8, 1H) ,

7,42 (dd, J = 7,5, 7,3, 1H), 7,35 (dd, J = 7,3, 7,2, 1H), 6,86 (d, J = 6,0, 1H), 5,63-5,58 (m, 1H), 4,94 (s, 2H),

4,54 (d, J = 3,1, 1H), 2,30-2,14 (m, 1H) , 2,00-1,82 (m,

1H), 0,96-0,88 (m, 1H), 0,62-0,50 (m, 1H) .

Hmotnostní spektrometrie m/z (M+H) vypočteno 457/9 (1:1), naměřeno 457/9 (1:1).

Příklad 6

Příprava meziproduktu XV (obr. 4)

* ·		•	i	«··	i · ’ i
	•	•	«	• ·	• «	•
	•	«V	«·		·· ·

K roztoku sloučeniny VIII-A (A^x, A²= H^, B^x, B³ = 0, R³ = R⁴ = R⁵ = R^G= H) (1,05 g) v dimethylformamidu (25 ml) se přidá triethylamin (0,75 ml) a terč.butyldimethylsilylchlorid (TBS-C1) (0,65 g). Po míchání po dobu 3 h se reakce ukončí přídavkem nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a směs se extrahuje ethylacetatem. Organická vrstva se promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného a vysuší síranem hořečnatým. Po filtraci a odpaření rozpouštědla se výsledný zbytek trituruje etherem s obdržením sloučeniny XV (848 mg). Promývací podíly se odpaří s obdržením zbytku, který se purifikuje sloupcovou chromatografií (na silikagelu, eluce 1% směsí ethylacetat/dichlormethan) a poskytuje další produkt (502 mg, celkový výtěžek 94 %), který vykazuje následující vlastnosti.

Nukleární magnetická resonance ^XH NMR (DMSO-d₆) δ 11,94 (S, 1H), 9,32 (d, J = 7,6, 1H), 8,03 (d, J = 7,7, 1H), 7,64 (d, J = 7,2, 1H), 7,58 (d, J = 8,1, 1H), 7,44 (dd, J = 7,7, 7,6, 1H), 7,39 (dd, J = 7,7, 7,6, 1H), 7,32 (d, J = 7,3, 1H), 7,25 (dd, J = 7,6, 7,3, 1H) , 5,00 (s, 2H), 4,14 (s, 2H), 0,99 (s, 9H), 0,46 (s, 6H).

Hmotnostní spektrometrie m/z (M+H) vypočteno 425, naměřeno 425.

Příklad 7

Příprava sloučeniny II-l způsobem B (obr. 7)

Roztok Tritonu B v pyridinu (0,45 M) se připraví rozpuštěním 40% roztoku Tritonu B v methanolu (10 ml) a pyridinu (10 ml). Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku • · ♦ i · ··♦ i i '· • · · · · · · · · · * · _· · · ·««···· ·· · e· «« λλ ·♦♦

2,66 kPa (20 mm rtuťového sloupce) na konečný objem zhruba 8 ml. Zbytek se zředí pyridinem na 50 ml, zfiltruje a uloží pod atmosférou dusíku. Roztok sloučeniny XV (20,3 mg) v pyridinu (2,0 ml) se promyje proudem argonu a zpracuje 300 μΐ Tritonu B (0,45 M roztok pyridinu) a diethoxybutyraldehydu (50 μΐ). Po míchání po dobu 2 h se reakční směs extrahuje ethylacetatem, promyje IN vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové, nasyceným roztokem chloridu sodného a vysuší síranem hořečnatým. Po filtraci a odpaření rozpouštědla se adukt vyjme dichlormethanem (10 ml) a zpracuje etheratem fluoridu boritého (10 μΐ) Po míchání po dobu 2 h se roztok promyje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným roztokem chloridu sodného a poté se vysuší síranem hořečnatým. Odstranění rozpouštědla na rotační odparce poskytuje zbytek, který se purifikuje preparátivní vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií (Zorbax RX-8, 2,5 x 25 cm, eluce 65% směsí acetonitril/voda s 0,1 % kyseliny trifluoroctové). Příslušné frakce se zneutralizují hydrogenuhličitanem sodným, extrahují methylenchloridem (3 x 20 ml) a vysuší síranem hořečnatým. Po zfiltrování a odpaření rozpouštědla se obdrží sloučenina II-l (11,8 mg, 65% výtěžek), jejíž spektra nukleární magnetické resonance a hmotnostní spektrometrie a doby retence při vysokovýkonné kapalinové chromatografií jsou identické s látkou připravenou a izolovanou způsobem A popsaným v příkladu 3-A.

Příklad 8

Příprava sloučeniny II-9 (obr. 8)

K suspenzi brómované sloučeniny II-5 (6,2 mg) v 1-propanolu (4,0 ml) se přidá kyselina 3-aminofenylboritá (3,8 mg) . Po míchání po dobu 0,25 h se přidá octan palladna- 73 tý {2,0 mg), trifenylfosfin (4,8 mg), uhličitan sodný (2,8 mg) a voda (2,0 ml) . Směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 0,75 h, ochladí, extrahuje dichlormethanem a promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného a rozpouštědlo se odpaří na rotační odparce s obdržením zbytku, který se čistí preparativní vysokovýkonnou kapalinovou chromatograf:ií (Zorbax RX-8, 2,5 x 25 cm, 50% směs acetonitril/voda s 0,1 % kyseliny trifluoroctové). Příslušné frakce se neutralizují hydrogenuhličitanem sodným a extrahují methylenchloridem (3 x 20 ml) a poté se vysuší síranem hořečnatým. Po filtraci a odpaření rozpouštědla se obdrží sloučenina II-9 (3,1 mg, výtěžek 49 %), která vykazuje následující spektrální vlastnosti .

Nukleární magnetická resonance ^XH NMR (DMSO-d_e) δ

9,22 (d, J = 7,5, 1H), 8,66 (s, 1H), 8,00-7,25 (m, 8H) , 7,12 (dd, J = 7,1, 7,0, 1H), 6,95-6,80 (m, 3H), 6,53 (d, J = 6,0, 1H), 5,63-5,58 (m, 1H), 4,99 (s, 2H), 4,55 (s, 1H), 2,25-2,10 (m, 1H) , 1,95-1,90 (m, 1H) , 0,98-0,88 (m, 1H), 0,65-0,57 (m, 1H).

Hmotnostní spektrometrie m/z (M+H) vypočteno 470, naměřeno 470.

Příklad 9

Příprava sloučeniny 11-10 (obr. 9)

K roztoku sloučeniny II-l (5,0 mg) v dimethylsulfoxidu (1 ml) se přidá kyanid sodný (4,3 mg) a směs se ohřívá na 145 °C po dobu 1 h. Poté se ochladí, extrahuje ethylacetatem a promyje vodou (3 x 20 ml) a nasyceným roztokem chloridu sodného. Organická vrstva se vysuší síranem hořečnatým, • · ··«* ·· · ♦ * · «· ·· ·« ·»· zfiltruje a odpaří s obdržením zbytku, který se purifikuje preparativní vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií (Zorbax RX-8, 2,5 x 25 cm, 55¾ směs acetonitril/voda s 0,1 % kyseliny trifluoroctové). Příslušné frakce se zneutralizují hydrogenuhličitanem sodným, extrahují methylenchloridem (3 x 20 ml) a vysuší síranem hořečnatým. Po filtraci a odpaření rozpouštědla se obdrží sloučenina 11-10 (2,7 mg, výtěžek 50 %) vykazující následující spektrální vlastnosti.

Nukleární magnetická resonance ^XH NMR (DMSO-d₆) δ

11,4 (s, 1H), 8,86 (d, J = 7,9, 1H), 8,79 (d, J = 7,6, 1H),

7,90	(d, J =	8,3,	1H), 7,62-7,55	(m,	2H), 7,49 (dd, J =
7,6,	7,4,	3H)	, 7,	40 (dd, J = 7,4,	7,	3, 1H), 7,35 (dd, J
7/5,	7,4,	1H)	, 6,	86 (d, J = 6,0,	1H)	, 6,03 (S, 1H),
5,40-	-5,30	(m,	1H)	, 2,25-2,14 (m,	1H)	, 2,03-1,90 (m, 1H),
1,10-	-0,98	(m,	1H)	, 0,82-0,77 (m,	1H)

Příklad 10

Příprava sloučeniny II-11 (způsob A, obr. 6)

Podle způsobu A reaguje pryskyřice XlIIa (150,2 mg) s ethylmagnesiumbromidem (1,0 ml) a poté s ethyl-2,5-dioxopentanoatem [Schmidt a kol., Synthesis, 1993. 809] (1,5 ml). Po zpracování a odštěpení od pryskyřice se surová směs reakčního produktu vyjme methylenchloridem a zpracuje etheratem fluoridu boritého (20 μΐ). Po míchání po dobu 2,5 h se roztok promyje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným roztokem chloridu sodného a vysuší se síranem hořečnatým. Po filtraci a odstranění rozpouštědla se výsledný zbytek purifikuje preparativní vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií (Zorbax RX-8, 2,5 χ 25 cm, gradient 55¾ - 75% směsi acetonitril/voda s 0,1 % kyseliny trifluor• ··· _4 4 4

4« «

4 4 4 4 4 4

44 44 4·4 octové) a obdrží se sloučenina 11-11 (6,4 mg), která má následující vlastnosti.

Nukleární magnetická resonance ^XH NMR (DMSO-d^) δ 9,36 (d, J = 7,7, 1H), 8,68 (s, 1H), 8,00 (d, J = 7,7, 1H),

7,83 (d, J = 8,3, 1H), 7,58-7,15 (m, 5H), 6,97 (d, J = 5,9,

1H), 4,93 (S, 2H), 4,82 (s, 1H) , 4,48 (q, J = 7,1, 2H),

2,42-1,91 (m, 2H), 1,37 (t, 3H, J = 7,1), 1,25-0,63 (m, 2H) .

Příklad 11

Příprava sloučeniny 11-12

Roztok sloučeniny 11-11 (3,4 mg) v tetrahydrofuranu (2 ml) se zpracuje 2M roztokem lithiumborohydridu (1,0 ml v tetrahydrofuranu) a reakční směs se míchá po dobu 1,5 h. Reakce se ukončí přídavkem 1N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové (4 ml). Po míchání po dobu 20 min se přidá 10% vodný roztok hydroxidu sodného (15 ml) a směs se extrahuje methylenchloridem (3 x 10 ml). Po vysušení síranem hořečnatým se směs zfiltruje a rozpouštědlo se odpaří s obdržením sloučeniny 11-12 (0,32 mg), která vykazuje následující vlastnosti.

Nukleární magnetická resonance ^XH NMR (DMSO-d_e) δ

9,35 (d, J = 7,7, 1H), 8,62 (s, 1H), 7,98 (d, J = 7,7, 1H) ,

7,83 (d, J = 8,2, 1H), 7,75 (d, J = 8,2, 1H) , 7,50-7,25 (m,

4H), 6,84 (d, J = 7,7, 1H), 6,11 (s, 1H), 4,91 (s, 2H),

4,71 (s, 1H), 4,50-4,40 (m, 1H), 4,30-4,20 (m, 1H) ,

2,42-1,91 (m, 2H), 1,25-0,63 (m, 2H).

Hmotnostní spektrometrie m/z (Μ + H) vypočteno 409, naměřeno 409.

-- * · · · «9* • · « Φ Φ *·« φ φ • · · · φ φ φ Φ •· Φ Φ Φ φφ ΦΦ

Příklad 12

Zvýšení aktivity ChAT míchy

ChAT je specifický biochemický markér funkčních cholinergních neuronů. Cholinergní neurony představují hlavní cholinergní vstup do hipokampálního útvaru, olfaktorického jádra interpedunkulárního jádra, kůry, mandlového jádra a částí thalamu. Motoneurony v míše jsou cholinergními neurony, které obsahují ChAT [Phelps a kol., J.Comp. Neurol., 273, 459-472 (1988)]. Aktivita ChAT se užívá pro studium účinků neurotropinů (například NGF nebo NT-3) na přežívání a/nebo funkci cholinergních neuronů. Stanovení ChAT slouží též jako indikace regulace hladin ChAT v cholinergních neuronech.

Fetální buňky krysí míchy se disociují a pokusy se provádějí podle popisu v literatuře [Smith a kol., J. Cell Biology, 101, 1608-1621 (1985), Glicksman a kol., J. Neurochem., 61, 210-221 (1993)]. Disociované buňky se připraví z míchy vyjmuté z krys (stáří embrya 14 až 15 d) standardními trypsinovými disociačními způsoby (Smith a kol., výše). Buňky se umisúují do plastových jamek potažených poly-1-ornithinem v množství 6 x 10⁵ buněk/cm² v médiu N2 bez séra obohaceném 0,05 % hovězího serumalbuminu [Bottenstein a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 76, 514-517 (1979)]. Buněčné kultury se inkubují při 37 °C ve zvlhčované atmosféře 5 % oxidu uhličitého/95 % vzduchu po dobu 48 h. Aktivita ChAT se měří po 2 d in vitro s použitím modifikace způsobu Fonnuma [Fonnum, Neurochem., £4, 407-409 (1975)] podle McManamana a kol. a Glicksmana a kol. [McManaman a kol., Develop. Biol., 125. 311-320 (1988), Glicksman a kol., J. Neu77 rochem., výše].

Sloučeniny obecného vzorce II popisované v příkladech shrnuje tabulka 2. Substituenty R^X,R⁴, R^s a R^v jsou vesměs atomy vodíku, Y je atom kyslíku a n je 1.

Tabulka 2

Sloučenina č.	A A ZL 2	B	R 2	R 3	R s	R a	Z	m
II-l	0	H,H	H	H	H	H	vazba	1
II-2	0	H,H	Et	H	H	H	vazba	1
II-3	0	H,H	H	H	H	Me	vazba	1
II-4a	0	H,H	H	H	H	Me	vazba	2
II-4b	0	H,H	H	H	H	Me	vazba	2
II-5	0	H,H	H	Br	H	Me	vazba	1
II-6	0	H,H	H	H	10- OMe	H	vazba	1
ll-7a	0	H,H	H	H	H	Me	vazba	1
II-7b	0	H,H	H	H	H	Me	vazba	1
II-8	H,H	0	H	H	H	H	vazba	1
II-9	0	H,H	H	3' - NH -Ph 2	H	H	vazba	1
11-10	0	0	0 H	H	H	H	vazba	1
11-11	0	H,H	H	H	H	CO 2 Et	vazba	1
11-12	0	H,H	H	H	H	CH - 2 OH	vazba	1

Příklad 13 pCDNA3-EE-MLK3, pcDNA3-EE-MLK3(K144R)

MLK3 se klonuje podle popisu [Lee a kol., Oncogene,

8, 3403-3410 (1993), Ezoe a kol., Oncogene, <), 935-938 (1994)]. cDNA se připraví z 200 ng poyladenylované melanocytové mRNA a 5 % směsi se použije jako templat pro amplifikaci repertoáru cDNA PTK s použitím směsí bud' dvou nebo čtyř vysoce degenerovaných oligonukleotidových primerů odvozených od sekvencí konsensu konservovaných subdoménami VIb a IX známých PTK: PTK1, 5'-CGGATCCACMGIGAYYT-3' (číslo identifikace sekvence 1), PTK2, 5'-GGAATTCCAWAGGACCASACRTC-3' (číslo identifikace sekvence 2), PTK3, 5'-CGGATCCRTICAYMGIGAYYTIGCIGCIMGIAA-3' (číslo identifikace sekvence 3), PTK4, 5'-GGAATTIAYIGGAWAIGWCCAIACRTCISW-3’ (číslo identifikace sekvence 4). Provede se 40 cyklů PCR s použitím Taq DNA-polymerasy (AmpliTaq, Perkin-Elmer/Cetus) a automatického tepelného cyklovače DNA. Každý cyklus zahrnuje 40 s při 94 °C, 2 min při 37 °C a 3 min při 63 °C. Produkty z osmi PCR se spojí, zpracují DNA polymerasou (Klenow), štěpí BamHl plus EcoRl a podrobí elektroforese v 5% poylakrylamidovém gelu. Barvení ethidiumbromidem identifikuje převládající pás 200 až 230 bp, který se vyřízne, eluuje a klonuje do M13mpl8. V jednom experimentu se část amlifikované cDNA PCR neštěpí, avšak klonuje se do M13mpl8 štěpeného Smál. Nukleotidové sekvence se stanoví způsobem sekvenování zakončení řetězce.

Jedna cDNA identifikovaná jako PTK1 se používá jako sonda pro screening knihoven cDNA lidského melanomu a melanocytu. Klon označený PTK1-3.2 zahrnuje celý otevřený čtecí rámec 2541 nt kódující protein o 847 aminokyselinách. Tato cDNA se vyřízne s Ncol, zpracuje DNA polymerasou (Klenow), opět vyřízne s EcoRl a váže se na vektor pCDNA3-EE vyříznutý s BamHl, zpracuje se DNA polymerasou a poté se vyřízne s EcoRl. Vektor pCDNA3-EE se konstruuje vložením oligonukle79 • · · · ♦ « · · ·· « ·♦ «· ·· otidu do místa HindiII/BamHl kódujícího výchozí kodon s následným epitopem EE, MEEEEYMPME (Číslo identifikace sekvence 5) [Grussenmeyer a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 82. 7952-7954 (1985)]. Verse MLK3 kinase-dead se připraví mutací K144R s použitím PCR podle dříve publikovaného způsobu [Chen a kol., Biotechniques, 17, 657-659 (1994)]. První mutagenní oligonukleotid je 5'-GTGGCTGTGCGGGCAGCTCGCCAG-3' (číslo identifikace sekvence 6) a druhý oligonukleotid je 5'-GAGACCCTGGATCTCGCGCGCTT-3' (číslo identifikace sekvence 7). S použitím MLK3 jako templátu se použijí tyto oligonukleotidy v PCR pro generování fragmentu 806 bp použitého v druhé reakci PCR s primerem T7 jako dalším amplimerem a MLK3 jako templátem pro vytvoření fragmentu 1285 bp. Fragment se separuje agarosovou gelovou elektroforesou, izoluje, klonuje do pGEM-5 (Promega) a sekvenuje. Fragment se vyřízne HindlII a Hpal a vloží do pCDNA3-EE-MLK3 vyříznuté HindlII a Hpal. Další bodová mutace se detekuje při nukleotidu 1342. Pro opravu se fragment PflMl (nt 1093-1418) vyřízne z přirozeného MLK3 a použije pro náhradu identického fragmentu v K144R mutovaného MLK3.

Příklad 14 pFB-FLAG-MLK3

Pro obdržení proteinu MLK3 se cDNA klonuje do vektoru bakulovirové exprese pFB-FLAG. MLK3 se vyřízne z PTK1-3.2 zpracováním s Ncol, dále se zpracuje DNA-polymerasou (Klenow), opět vyřízne Notl a naváže na pFB-FLAG zpracovanou Stul a Notl. pFB-FLAG se odvozuje od pFB (Life Technologies) a má kódovací sekvenci pro epitop FLAG [Hopp a kol., Biotechnology, £, 1205-1210 (1988)] se zahajovacím kodonem MDYKDDDDK (číslo identifikace sekvence 8) přidaným k póly80 ’ ’ ’ · · ♦4 4 • · · · · 4·· 4 4· • · 4 **44 444 ·· · ·· 44 «·4« linkeru v místě BamHl.

Příklad 15 pFB-GST-MLK3(KD)

Bakulovirová exprese kinasové domény MLK3 se dosahuje vyříznutím fragmentu MLK3 z pGEXKG-MLK3(KD) použitím EcoRl a Xhol a navázáním do vektoru pFB vyříznutého EcoRl a Xhol, ve kterém se vzestupně klonuje kódovací sekvence glutathionS-transferasy (GST). Toho se dosáhne obdržením kódovací sekvence GST a polylinkeru z vektoru pGEXKG pomocí PCR s použitím vektoru jako templatu [Guan a kol., Anal. Bioch., 192, 262-267 (1991)]. 5' oligonukleotid pro PCR vytváří restrikční místo Bgl2 na konci 5' fragmentu. Tento izolovaný fragment se poté zpracuje Bgl2 a HinD3 a naváže do pFB zpracované BamHl a HinD3.

Příklad 16 pGEXKG-MLK3(KD)

Fragment cDNA zahrnující kinasovou doménu MLK3 i část leucinového zipperu (nt 736-1791) se obdrží pomocí PCR s použitím PTK1 cDNA. Izolovaný fragment se zpracuje restrikčními enzymy EcoRl a Xhol, místa obsažená v oligonukleotidech PCR, a klonovaná do pGEX-KG se zpracují EcoRl a Xhol. Tento fragment v pGEX-KG se poté zkrátí pomocí PCR tak, aby zahrnoval pouze kinasovou doménu (nt 736-1638).

Příklad 17 pKH3-MLK2, pKH3-MLK2(KA)

MLK2 se klonuje pomocí degenerované PCR [Dorow a kol., Eur. J. Biochem., 213. 701-710 (1993), Dorow a kol., Eur. J. Biochem., 234, 492-500 (1995)]. Segmenty cDNA kódující katalytické subdomény proteinových kinas exprimované v linii buněk tumoru epithelu Colo 16 se amplifikují z RNA reversní transkriptasou PCR. Degenerované primery PCR spočívají v sekvencích kódujících konservované motivy v subdoménách Vib a VIII katalytických domén skupiny kinas receptorů epidermálního růstového faktoru. Sekvence primarů jsou následuj ící: přímý primer 5' -CGGATCCGTG(A)CACC(A)GT (CG)G (A) ACC(T)T-3' (číslo identifikace sekvence 9), zpětný primer 5'-GGAATTCACCA(G)TAA(G)CTCCAG(C)ACATC-3' (číslo identifikace sekvence 10). Několik produktů PCR se klonuje do M13 a sekvenuje s použitím sekvenovací soupravy T7 Super-Base (Bresatec). Jeden produkt PCR 216-bp se použije jako sonda pro screening knihovny cDNA lambdagtll cDNA lidského tlustého střeva (Clontech, katalog#HL10346). Fragment se náhodně značí, hybridizace se provede při 65 °C a filtry se důkladně promyjí 0,2X chloridem sodným/citratem (koncentrace 150 mM chloridu sodného, 15 mM citrátu sodného, pH 7,0) a 0,5% SDS při 65 °C. Provede se autoradiografie filtrů expozicí filmu Kodak XAR-5 po dobu 16 h při teplotě -70 °C. Izolují se čtyři klony a nejdelší z nich, 1,2 kb, se použije pro ověření stejné knihovny za stejných podmínek. Zvolí se čtyři další klony a jeden z nich představuje fragment 1034 bp MLK2. Tento klon se použije jako sonda pro knihovnu lambdagtlO lidského mozku. Zhruba 500000 klonů se podrobí screeningu a izoluje se jeden klon, 3454 bp, představující celou kódovací oblast MLK2.

MLK2 se klonuje z ATG na chvost polyA do vektoru pKH3 mezi BamHl a EcoRl ve dvou krocích, kde místo BamHl je • · · · · · · ♦ · · ·· ·· ·· ve středu sekvence MLK2. Vektor pKH3 se konstruuje vložením tří kopií značky epitopu tag HA s následujícím místem BamHl mezi Xbal a EcoRl polylinkeru pRK7. Pro obdržení mutované verse K125A se fragment BamHl MLK2 5' klonuje do vektoru PromegapAlter a mutuje podle doporučení výrobce. Tento fragment se poté klonuje zpět do vektoru pKH3 MLK2.

Příklad 18 pcDNA3-HA-JNK1 cDNA JNK1 se obdrží podle popisu [Coso a kol., Cell, 81. 1137-1146 (1995)]. cDNA se obdrží pomocí PCR s použitím cDNA lidského kosterního svalu jako templátu (Invitrogen) a klonuje se do míst Bgl2/Sall pcDNA3-HA, plasmidu exprese modifikované pcDNA3 kódujícího epitop HA [Wilson a kol., Cell, 37, 767-778 (1984)]. Ten se poté vyřízne z pcDNA3 včetně epitopu HA a naváže do pGEX-4T3 (Pharmacia). cDNA JNK1 se vyřízne z fragmentu pGEX-4T3 jako fragment Bgl2/ /Sall a naváže do pcDNA3-HA, vektoru s epitopem HA přidaným v místě HinD3/BamHl pcDNA3.

Příklad 19 pFLAG-DLK

DLK se klonuje do vektoru exprese pcDNA3 epitopem FLAG přidaným podle popisu [Holzman a kol., J. Biol. Chem., 269, 30808-30817 (1994)]. Fragment cDNA pro DLK se izoluje klonováním PCR na bázi degenerovaného oligonukleotidu. Celková RNA se extrahuje z ledvin (32 orgánů) od stáří embrya

13,5 d a z ledvin (16 orgánů) od stáří embrya 17,5 d s použitím komerčně připraveného fenol/guanidinisothiokyana83 • · * * · ♦»· · 44

- ♦ · 4 4 > « 4 444 ·· · 44 44 4*44« tového činidla způsobem podle pokynů výrobce (TRIzol Reagent, Life Technologies, lne.). Po zpracování DNAsou I prostou RNasy se podrobí celková RNA reversní transkripci s RNasovou H-reversní transkriptasou (Superscript, Life Technologie, lne.) z oligo(dT) syntetického oligonukleotidového primeru na jednovláknovou cDNA. Degenerované oligonukleotidové primery odpovídající proteinovým tyrosínkinasovým katalytickým subdoménám Vib a IX původně navršeným Wilksem [Wilks, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, ££, 1603-1607 (1989)] se modifukují na místa 5' EcoRI a HindlII (5'-ATAATTC(GT)GC(TAGC)GCCA(GA)GTC(TAGC)CGGTG-3¹ (číslo identifikace sekvence 11), respektive 5’-ATAAGCTTCC(TC)(AG)T(GC)AAGTGGA(TC)(GC)GC(AGC)CC(CT)GA-3') (číslo identifikace sekvence 12). Čtyřicet cyklů PCR se provádí po dobu 1,5 min při 94 °C, 12 min při 37 °C a 3 min při 63 °C. Přidají se čerstvá činidla a provede se dalších 40 cyklů před konečným pokračováním po dobu 10 min při 72 °C. Výsledný produkt amplifikace DNA 200-210 bp se izoluje na gelu, subklonuje do připraveného plasmidu pGEM7zf(+) (Promega) a transformuje do Escherichia coli. DNA plasmidu miniprep se připraví z transformovaných bakterií a podílu zpracovaného restrikčními endonukleasami EcoRI a HindlII. Sekvenují se klony obsahující vložené části .

Fragment cDNA DLK 195-bp obdržený z degenerované PCR se značí radionuklidem a používá pro screening zhruba 1 x 10⁶ n rekombinantů Uni-ZAP II (Stratagene, La Jolla, CA) , knihovny cDNA v mozku dospělých krys zpracované primerem oligo(dT) [Holzman a kol., Mol. Cell Biol., 10. 5830-5838 (1990)]. Filtry se hybridizují v pufru obsahujícím 50 % formamidu, 5 x SSC, 3 x Denhardtovým roztokem, 0,2% SDS, kyselinou polyadenylovou 1 mg/ml a DNA lososího spermatu 200 mg/ml při 42 °C. Filtry se promyjí jednou při teplotě míst84 _ - - - · 4 · 44 • · » 4 4 444 «· * · · · · · 4 4444 _ · · 4 444«44 ·♦ · ·· ·4 444 nosti, 2χ SCC, 0,2 % SDS a dvakrát po dobu 30 min při 65 °C. Identifikuje se 25 jedinečných klonů. Deset klonů se purifikuje pro dosažení homogenity, vyřízne in vivo podle pokynů výrobce a provede se restrikční mapování. Dva nejdelší klony (3401 a 3397 bp, které se liší pouze při svých koncích 5') se sekvenují podél obou vláken po celé délce.

Fragment cDNA DLK Notl-Xhol plné délky (3401 bp) se subklonuje do pcDNA3 eukaryotického vektoru exprese na bázi cytomegalovirového promotoru (Invitrogen, San Diego, CA) (fragment označený pcDNA3-DLK). Poté se připraví fragment (pFLAG-DLK) označený epitopem NH^-Met FLAG (DYKDDDDK) (číslo identifikace sekvence 13). PCR se použije pro amplifikaci fragmentů cDNA kódujících místo 5' HindlII, Kozákovu sekvenci konsensu DLK včetně iniciace ATG, epitop FLAG a sekvenci otevřeného čtecího rámce cDNA DLK od nukleotidu 88 do vnitřního místa EcoRI při nukleotidu 758. [Syntetické oligonukleotidy purifikované vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií se používají v ekvimolárních množstvích: 5 ¹-ATAAAGCTTCCAGAGGCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGCCTGCCTCCATGAAACCCGAACA- 3' (číslo identifikace sekvence 14) pro primer ve směru fragmentu FLAG a 5' -GACAGGGCGGCCGGCTCT-3' {číslo identifikace sekvence 15) pro primer v opačném směru]. Gelově purifikované HindlII a amplifikované fragmenty zpracované EcoIII se subklonují do HindlII-EcoRl pro přípravu plasmidu pcDNA3-DLK. Fragmenty se sekvenují podél obou vláken pro zajištění věrnosti Taq polymerasy a udržení čtecího rámce.

Příklad 20

PCDNA3-MLK1

Část 5¹ MLK1 se obdrží z databáze EST (přístup # *

- - 9 · * · · · ··· · · • · ·· ·· ··· · ·· · ·· · ··

AA160611). Tento klon je fúzí mezi MLK1 a další cDNA neznámé identity. Obsahuje dříve nepublikovanou sekvenci 5' MLK1 spolu s částí dříve publikované kinasové domény MLK1 [Dorow a kol., Eur. J. Biochem., 213. 701-710 (1993)]. Sekvence cDNA MLK1 z klonu EST je následující: GAATTCGGCA CGAGAGGACT CGCAGGTGTC CGGCGACGAG GGCTGGTGGA CCGGGCAGCT GAACCAGCGG GTGGGCATCT TCCCCAGCAA CTACGTGACC CCGCGCAGCG CCTTCTCCAG CCGCTGCCAG CCCGGCGGCG AGGACCCCAG TTGCTACCCG CCCATTCAGT TGTTAGAAAT TGATTTTGCG GAGCTCACCT TGGAAGAGAT TATTGGCATC GGGGGCTTTG GGAAGGTCTA TCGTGCTTTC TGGATAGGG ATGAGGTTGC TGTGAAAGCA GCTCGCCACG ACCCTGATGA GGACATCAGC CAGACCATAG AGAATGTTCG CCAAGAGGCC AAGCTCTTCG CCATGCTGAA GCACCCCAAC ATCATTGCCC TAAGAGGGGT ATGTCTGAAG GAGCCCAACC TCTGCTTGGT CATGGAGTTT GCTCGTGGAG GACCTTTGAA TAGAGTGTTA TCTGGGAAAA GGATTCCCCC AGACATCCTG GTGAATTGGG CTGTGCAGAT TGCCAGAGGG ATGAACTACT TACATGATGA GGCAATTGTT CCCATCATCC ACCGCGACCT TAAGTCCAGC AAC (číslo identifikace sekvence 16). To se překládá: NSAREDSQVS GDEGWWTGOL NQRVGIFPSN YVTPRSAFSS RCQPGGEDPS CYPPIQLLEI DFAELTLEEI IGIGGFGKVY RAFWIGDEVA

VKAARHDPDE DISQTIENVR QEAKLFAMLK HPNIIALRGV CLKEPNLCLV

MEFARGGPLN RVLSGKRIPP DILVNWAVQI ARGMNYLHDE AIVPIIHRDL KSSN (Číslo identifikace sekvence 17).

Část 3' MLK1 se nejprve klonuje degenerovanou PCR podle dřívější publikace [Dorow a kol., Eur. J. Biochem., 213. 701-710 (1993)]. Postup klonování části 3' MLK1 je stejný, jako se popisuje výše pro MLK2 s následujícími výjimkami. Ze čtyř klonů obdržených z opětovného screeningu knihovny s klonem 1,2 kb představují tři ze čtyř klonů MLK1. Žádný z klonů nezahrnuje celou kinasovou doménu, která se obdrží pomocí PCR.

Fág z alikvotů 1 ml amplifikovaných knihoven, cDNA ’ - - - w ι «Η

J · · · · ··♦ · Φ« _ · · Φ · · φ · · φ· ·· · ·· ·· ΦΦ ΦΦ* v lUni-ZAPXR normálních buněk epitelu lidského tlustého střeva a buněčné linie karcinomu tlustého střeva T84 (Stratagene cat #937204) se podrobí rozkladu suspendováním ve 20 ml vody a zmrazením. Vzorek 5 ml lýzovaného fágu se použije jako templát PCR ve dvou reakcích pro každou knihovnu. Primery představující vektory se odeberou z nukleotidových sekvencí přiléhajících k místům klonování. V případě knihovny buněčné linie tlustého střeva T84 se použijí sekvenovací primery T3 a T7 (Promega). V každé reakci pochází jeden primer z vlákna 3' - 5' genu MLK1, zhruba 100 bp od konce 5' známé sekvence. Druhý primer je jeden ze dvou primerů vektoru. Reakce PCR obsažené v pufru IX PCR, 2,5 mM chloridu hořečnatého, 1 jednotka Tag polymerasy (vše od Bresatec), 0,2 mM dNTP a 0,4 mM každého primeru v 50 ml. Reakční podmínky jsou 60 s při 95 °C, 90 s při 52 °C, 90 s při 72 °C po 30 cyklů s dobou prodloužení 15 min v konečném cyklu. Produkty PCR se klonují a sekvenují, jak se popisuje výše. Nejdelší klon ze screeningu knihovny a fragment PCR, který zahrnuje přídavnou sekvenci MLK1, se navzájem váží s vytvořením cDNA MLK1 1,08 kb v pUC18.

Klon MLK1 z databáze EST se opatří vektorem pBluescript (Stratagene). cDNA MLK1 z knihovny tlustého střeva se váže do klonu EST zpracováním tohoto klonu EcoRI podle Klenowa s následným odříznutím pomocí AflII. Tento izolovaný fragment se klonuje do cDNA MLK1 z databáze EST odříznuté pomocí Xhol upraveného podle Klenowa a odříznutého pomocí AflII. Tento nový fragment se vyřízne z pBluescript zpracováním s Notl a Apal a naváže do pcDNA3-EE též odříznutého pomocí Motl a Apal. Veškeré klonovací spojky se sekvenčně ověří.

Příklad 21

’ - W · » V * * ··· ·

Exprese GST-MLK3 v E. coli pGEXKG-MLK3(KD) se transformuje do E. coli kmene

BL21 elektroporací. Bakterie obsahující plasmid se naočkují do fermentačního zařízení Applikon obsahu 15 litrů v objemu 10 litrů následujícího obohaceného média: 1,95 g/1 hydrogenfosforečnanu draselného, 0,9 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,1 g/1 ampicilinu, 0,3 g/1 síranu amonného, 0,92 g/1 krystalického síranu hořečnatého, 42,7 g/1 citrátu sodného, 21,8 mg/1 krystalického síranu železnatého, 0,5 ml stopových kovů Pichia [Higgins a kol., Methods Molecular Biology, 103, 149-1778 (1998)], 20 g/1 kasaminových kyselin, 40 g/1 glycerolu, 25,5 mg/1 chloridu vápenatého. Bakterie se pěstují přes noc při frekvenci otáčení 800 min^-1, při 68 % rozpuštěného kyslíku, při 30 °C, až kultura dosáhne hodnoty optické hustoty OD_soo = 4,4. Tvorba rekombinantního proteinu se indukuje přídavkem 1 mM isopropyl-S-D-thiogalaktosidu s pokračováním fermentace při 25 °C po dobu až 6 h. Bakterie se potom získají centrifugací a buněčná pasta se uloží ve zmrazeném stavu při teplotě -20 °C do doby purifikace.

Příklad 22

Purifikace bakteriální GST-MLK3

KD

Parciálně purifikovaný GST-MLK3_kej se připraví sonikací 100 g bakteriální buněčné pasty ve 100 mM Tris-HCl, 150 mM chloridu sodném, 1 mM EDTA, 5 mM dithiothreitolu (DTT), pH 7,5 (pufr A). Roztok se upraví na 1% koncentraci Tritonu X-100, poté se míchá na ledu po dobu 1 h. Supernatant po centrifugací po dobu 45 min při 20000 g se míchá po dobu 1 h na ledu s 10 ml glutathionsepharosové pryskyřice 4B

- <··· ··» ♦ · ♦ · · · • · ♦ · · · B · · · ·· ♦ ·· ·· «· ··· (Pharmacia) ekvilibrované s pufrem A. Peletovaná pryskyřice se promyje dvakrát 12,5 násobkem svého objemu pufrem A, poté se eluuje 20 ml 100 mM Tris-HCl, 150 mM chloridu sodného, 5 mM DTT (pufr B) o koncentraci 20 mM glutathionu, pH 7,5. Protein se dialyzuje přes noc proti pufru B a ukládá v alikvotech při teplotě -80 °C.

Příklad 23

Bakulovirová exprese FLAG-MLK3 a GST-MLK3

Rekombinantní bakuloviry exprimující FLAG-MLK3 a GST-MLK3_kd se získávají z jejich příslušných přenosových vektorů pFB-FLAG-MLK3 a pFB-GST-MLK3_KD s použitím systému BAC-TO-BAC (Life Technologies) podle instrukční příručky. Kultury buněk Sf21 v suspenzi [Vaughn a kol., In Vitro, 13, 213-217 (1977)] se pěstují při 27 °C/frekvence otáčení 120 min~^x v obohaceném Graceho médiu [Hink, Nátuře, 226. 466-467 (1970)] s 10 % fetálního bovinního séra inaktivovaného teplem. Pro tvorbu rekombinantní FLAG-MLK3 se buňky Sf21 při hustotě 1,5 x 10⁶ buněk/ml v obohaceném Graceho médiu obsahujícím 5 % fetálního bovinního séra infikují multiplicitní infekcí (MOI) 3,1 a odebírají se 39 h po infekci. Pro tvorbu rekombinantní GST-MLKS^ se buňky Sf21 při hustotě 1,5 x 10^s buněk na ml v obohaceném Graceho médiu obsahujícím 5 % fetálního bovinního séra infikují MOI 2 a odebírají se 41 h po infekci. V obou případech se peletované buňky resuspendují v pufru, který obsahuje koncentrace 10 mM HEPES, 50 mM chloridu sodného, 0,5 mM Pefabloc SC, 5 μΜ pepstatinu, 10 gg/ml aprotininu, 10 Mg/ml leupeptinu, pH 7,4. Roztok supernatantu po centrifugaci po dobu 1 h při 147000 g se znovu upraví na pH 7,4 roztokem 3M báze Tris a poté se uloží do doby purifikace při teplotě -70 °C.

• ·	•	• · ··· · ·	• · •
• *	•	• · ·	• · * t ·	•
89 -	•	• ·	• · · ·	*
4	««	·· «0	·♦·

Příklad 24

Purifikace bakulovirového GST-MLK3

KD

Parciálně purifikovaný bakulovirový GST-MLK3_kd se připraví glutathionovou afinitní chromatografií. Na 10 ml buněčného extraktu (26,6 mg celkového proteinu) se přidá 1 ml glutathionové pryskyřice Sepharose 4B (Pharmacia) ekvilibrované v 10 iriM HEPES, 150 mM chloridu sodného, pH 7,4 (pufr C) a umožní se navázání proteinu v průběhu 45 min při teplotě 4 °C. Poté se pryskyřice promyje ve sloupci 30 objemy sloupce pufru C, dále se eluuje 5 objemy sloupce pufru C o koncentraci 2 mM glutathionu. Spojený konečný produkt se dialyzuje přes noc proti pufru C a ukládá v alikvotech při teplotě -70 °C.

Příklad 25

Purifikace bakulovirového FLAG-MLK3

Částečně purifikovaný bakulovirový FLAG-MLK3 se připraví protilátkovou afinitní chromatografií. Protein z 15 ml extraktu (19,5 mg celkového proteinu) s přidaným 0,1 M roztokem chloridu sodného se naváže na sloupec 0,25 ml M2 monoklonální FLAG peptidové protilátky navázané na agarosovou pryskyřici (Sigma) opakovaným nanesením (celkem třikrát). Pryskyřice je v rovnováze s 5 objemy sloupce promývacích podílů 50 mM Tris-HCl, 150 mM chloridu sodného, pH 7,4 (TBS), promytí 3 objemy sloupce 0,1 glycinu, pH 3,5 s následným promytím 5 objemy sloupce TBS před chromatografií. Rekombinantní protein se nejprve eluuje 5 objemy sloupce 0,2 mM peptidu FLAG (N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C) (číslo • v · · 4 *« V 4 « 4·«4· 94

999 9999 99·

4 44 99 44·· identifikace sekvence 18) v TBS. Protein se před rozborem ukládá v alikvotech při teplotě -80 °C.

Příklad 26

Dominantní negativní mutant: Dominantní negativní mutant skupiny MLK blokuje zánik diferencovaných buněk PC12 po odstranění faktoru růstu nervů

Linie buněk PC-12 odvozená od krysího pheochromocytomu se široce používá jako model neuronové buňky pro zkoumání molekulových dějů, které vedou k zániku neuronu (přehled viz Troy a kol., Adv. Neurology, 1997, 103-111). Faktor růstu nervů (NGF) indukuje diferenciaci buněk PC-12 na fenotyp neuronu sympathiku [Greene, Cell Biol., 78, 747-755 (1978)1. Buňky PC-12 diferencované NGF jsou dependentní na NGF ohledně přežívání a při odstranění NGF z média se morfologicky prokazuje apoptický zánik. Byl vyvinut buněčný systém pro stanovení účinku členů skupiny kinas směsné vazby na zánik buněk PC-12 po odstranění NGF. Do buněk PC-12 se přenáší cDNA kódující dominantní negativní (DN) mutant MLK-3 s použitím systému přenosu lipidu Pfx podle doporučení výrobce (Invitrogen, Carlsbad, CA). Byla zvolena stabilní skupina transfektantů exprimujících DN-MLK-3 s použitím sulfátu G418 (Mediatech lne., Herndon, VA). Zhruba 30 % buněk v těchto směsích exprimuje DN MLK3, jak se popisuje imunohistochemicky. Směsi buněk stabilně exprimujících kinasu mutantu se nanášejí na 96-jamkové desky potažené polyornithinem/lamininem (10 gg/ml každé látky ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem) při hustotě 2 x 10⁴ buněk na jamku a zpracují se v průběhu 7 d 100 ng/ml NGF. Medium obsahující NGF se odstraní, monovrstva buněk se promyje fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a medium obsahující neutrali91 začni protilátku NGF (číslo katalogu #N6655, Sigma, St. Louis, MO) při konečném zředění 1:1000 se vyměňuje po dobu 1 až 5 d. Životnost buněk se vyjadřuje kvantitativně rozborem životnosti buněk s použitím konverse tetrazoliové soli, MTS, na barevný formazan, jehož absorbance se měří při 570 nm na CytoFluor 2350 (Millipore, Bedford, MA) podle doporučení výrobce (Promega, Madison, WI). Stabilní směsi exprimující DN-MLK-3 se částečně zachraňují před zánikem způsobeným odebráním NGF (obr. 10).

Příklad 27

Rozbor enzymatické aktivity rekombinantního proteinu MLK

Pro průkaz toho, že protein MLK exprimovaný bud' v bakulovirovém nebo bakteriálním systému exprese je enzymaticky aktivní, lze použít několik způsobů rozboru. Protein MLK může být fragmentem plné délky nebo kinasové domény exprimované bud' v bakulovirovém nebo v bakteriálním systému exprese. Zkouška může být založena na protilátkách, jako je imunoabsorpční rozbor vazby na enzym (ELISA), časově rozlišená fluorescence (TRF) nebo fluorescenční polarizace (FP). Protilátka může být monoklonální nebo polyklonální s reaktivitou na fosfoserin, fosfothreonin nebo fosfospecifický substrát. Alternativně lze použít jiný způsob než jsou způsoby založené na protilátkách, jako je radioaktivní zkouška prováděná na gelu (viz obr. 11), multiscreeningový rozbor precipitace s kyselinou trifluoroctovou (obr. 13), scintilační analýza proximity (SPA), způsob flashplate nebo analýza s použitím fosfocelulosového filtru (obr, 13). Zkouška může být zaměřena na monitorování přímé fosforylace některého substrátu nebo připojeného systému používajícího při signalizaci cesty sestupných kinas. Substrát může být specifickým substrátem, jako je SEK-1, nebo relativně nespecifickým substrátem, jako je myelinový bázický protein (MBP).

Příklad 28

Kinasové rozbory (1) Radioaktivní kinasový rozbor na gelu

Kinasová aktivita MLK-3 byla stanovena sledováním inkorporace ³²P z [gama-³³P]-ATP do substrátu MLK (například kinase-dead SEK-1, myelinový bázický protein). Směs pro rozbor 50 μΐ obsahuje pufr A (20 mM MOPS, pH 7,2, 25 mM β-glycerolfosfatu, 5 mM EGTA, 1 mM orthovanadičnanu sodného, 1 mM dithiothreitolu), 15 mM chloridu hořečnatého, 100 μΜ ATP, 10 μ(2ΐ [gama-³²P]-ATP a 0,1 gg kinase-dead substrátu SEK-1 [Stressgen, lne., navázaný glutathion S-transferasa-SEK-1 (GST-SEK-l) se uvolňuje z glutathion-agarosových kuliček s 10 mM glutathionu, pH 8,0] nebo 25 μ$ MBP (Sigma Chemical Co.). Reakce se zahajuje přídavkem proteinu MLK (kinasová doména nebo přípravek obsahující plnou délku i kinasovou doménu) nebo kontrolního proteinu. Směs se inkubuje po dobu 30 min při teplotě 30 °C. Na konci reakce se 2x přidá pufr pro redukci vzorku. Směs se vaří po dobu 5 min a nanáší se bud' na 12% gel SDS-PAGE (s použitím MBP jako substrátu) nebo na 8% gel (SEK-1 jako substrát). Po elktroforese se gel vysuší. Kvantitativní vyjádření inkorporace fosfátu do substrátu, SEK-1, se provede pomocí Molecular Dynamics Phosphorimager (Sunnyvale, CA). Výsledky pokusů určených pro prokázání enzymatických aktivit MLK-3 exprimovaného bakulovirem (plná délka značená FLAG nebo kinasová doména značená GST) s použitím kinase-dead GST-SEK-l nebo MBP jako substrátu ukazují obr. 11A a 11B.

(2) Westernovo Plotování

Kinasová aktivita MLK-3 exprimovaného bakulovirem se zjišťuje imunoblotovou analýzou. Směs pro rozbor, 20 gl, obsahuje pufr A, o koncentraci 15 mM chloridu horečnatého, 100 gM ATP a 0,1 gg kinase-dead SEK-1 substrátu. Reakce se ponechá probíhat po dobu 30 min při teplotě 30 °C a poté se ukončí 10 gl 4x redukujícího pufru vzorku. Proteiny se oddělí na 8% Tris-glycinovém gelu a elektroforeticky se přenesou na membránu Immobilon PVDF. Tato membrána se inkubuje s fosfo-specifickou SEK-1 (Thr223) protilátkou (New England Niolabs, lne.) a poté s kozím protikráličím imunoglobulinem značeným křenovou peroxidasou (Bio-Rad). Detekce imunoreaktivních pásů se provádí na základě zvýšené chemiluminiscence (Amersham). Fosforylace kinase-dead GST-SEK-1 proteinem FLAG-MLK-3 (bakulovirový přípravek obsahující plnou délku i kinasovou doménu) ukazuje obr. 12.

(3) Multiscreeningový precipitační rozbor s kyselinou trichloroctovou

Kinasová aktivita bakteriálně exprimované kinasové domény GST-MLK-3 se hodnotí s použitím rozboru s kyselinou trichloroctovou Millipore Multiscreen, jak popisuje Pitt a kol., J. Biomol. Screening, 1, 47-51 (1996). Rozbor se provádí na 96-jamkových deskách Multiscreen Durapore (Millipore) . Každá směs pro rozbor 50 gl obsahuje koncentrace 20 mM Hepes, pH 7,4, 20 mM chloridu horečnatého, 20 mM chloridu manganatého, 2 mM DTT, 0,1 mM Na₃V0₄, 1 gCi[gama-R³²]ATP a 30 gg substrátu MBP. Reakce se zahajuje přídavkem proteinu MLK a ponechá se probíhat po dobu 15 min při teplotě 37 °C. Reakce se zastaví 25 gl 50% kyseliny trichloroctové. Desky « ··* • φ φ φ φ · Φ·· φφ • · φ * φ φ φ · φ· • · · φ · φ · φφ·«φ se uvedou do stavu rovnováhy v průběhu 30 min při teplotě 4 °C a poté se promyjí ledově chladnou 25% kyselinou trichloroctovou. Na desky se přidá kapalný scintilátor a radioaktivita se měří scintilačním počítačem Wallac MicroBeta 1450 PLUS. Proteinovou dávkovou odpověď proti tvorbě MBP značeného ³²P ukazuje obr. 13.

(4) Analýza s fosfocelulosovým filtrem

Kinasový rozbor se provádí v reakční směsi 50 μΐ obsahující koncentrace 20 mM Hepes, pH 7,4, 20 mM chloridu hořečnatého, 20 mM chloridu manganatého, 20 mM DTT, 0,1 mM vanadičnanu sodného, 1 gCi [gama-³²P]ATP a 30 ^g MBP. Reakce se zahajuje přídavkem proteinu MLK a ponechá se probíhat po dobu 15 min při teplotě 37 °C. Reakce se ukončí přídavkem 75 μΐ 75 mM roztoku kyseliny fosforečné. Alikvot roztoku se po ukončení reakce přivádí přímo na fosfocelulosovou membránu (Pierce). Alternativně lze použít fosfocelulosovou multiscreeningovou desku s 96 jamkami (Millipore). Membrány se promyjí 75 mM roztokem kyseliny fosforečné. Navázaný fosforylovaný MBP značený ^3aP se eluuje ve sběrných trubkách přídavkem 1 M roztoku hydroxidu sodného. Radioaktivita se stanoví měřením Čerenkovova záření v Beckmanově scintilačním počítači (Somerset, NJ). Tvorba fosforylovaného MBP se stoupající koncentrací bakteriálně exprimované GST-MLK-3 kinasové domény je znázorněná na obr. 13.

Příklad 29

Rozbor pro stanovení vazby sloučenin s rekombinantní skupinou MLK

K-252a (sloučenina III-3, viz tab. 4), indolokarbazo- 95 lový metabolit druhu Nocardia, se váže na řadu serínových/ /threoninových a tyrosinových kinas [Angeles a kol., Anal. Biochem., 236. 49-55 (1996), Knight a kol., Anal. Biochem., 247. 376-381 (1997)]. Triciovaný ligand K-252 se používá pro vyhodnocení vazby na lidský rekombinantní MLK-3 plné délky ze surového preparátu buněk infikovaných bakulovirem. [³H]K-252a je specificky značený tritiem v polohách 3 a 9 podle smlouvy s NEM Research products (Billerica, MA) a má specifickou aktivitu 40 Ci/mmol. Vazebné reakce se provádějí v 1 ml v 96-jamkové desce. Reakční směs obsahuje pufr o koncentracích 50 mM MOPS, pH 7, 150 mM chloridu sodného, 5 mM chloridu manganatého, 1 mg/ml hovězího serumalbuminu, 1 % dimethylsulfoxidu a 0,25 nM [³H]K252a. Vzorky se analyzují po trojicích při koncentraci 5 gg/ml surového MLK-3 odvozeného od bakuloviru. Nespecifická vazba se definuje jako vazba za přítomnosti neznačeného 1,2 μΜ K252a a odečítá se od celkové vazby pro obdržení specifické vazby. Při tomto zředění se 12 až 15 % celkové aktivity váže nespecificky na protein a 75 až 85 % této aktivity se váže specificky na MLK-3 (obr. 14) . Všechny pokusy se provádějí po dobu 2 h při teplotě 4 °C. Komplexy [³H]K252a/MLK-3 se sbírají na filtrech GF/C Whatman s použitím Brandelova zařízení, promývají chladným pufrem MOPS/chlorid sodný a aktivita se měří na počítači Wallac Micro Beta. Saturační vazebný experiment se provádí pro obdržení K^ K252a. Příklad výsledků z jednoho z těchto experimentů ukazuje obr. 14. Obdržená hodnota K* je 0,89 nM (interval spolehlivosti 0,2 až 1,5 nM) .

Příklad 30

Rozbory s intaktními buňkami (A) Systém nadměrné exprese Cos 7 » ··· ·· ·

Materiály

K-252a a deriváty této sloučeniny pocházejí od Kyowa-Hakko Kogyo Co., Ltd. (Tokyo, Japonsko) (Kaneko a kol., 1997). Sloučeniny se rozpustí v dimethylsulfoxidu pro buněčné kultury a ukládají ve tmě při teplotě 4 °C. Veškerá zředění sloučenin se provádějí v modifikovaném mediu Eagle, Dulbecco (DMEM) s obsahem 1 % hovězího serumalbuminu. Hemaglutininová protilátka (HA) pochází od BAbCO (Richmond, CA). Substrát AP-1 (c-jun) pochází od Promega (Madison, WI). [gama-³²P]ATP (6000 Ci/mmol) pochází od Amersham (Arlington Heights, IL).

Kultura buněk Cos7

Buňky ledvin kočkodana zeleného pocházejí od ATCC, Rockville, Maryland (CRL 1651) a udržují se v DMEM s 10 % hovězího sera, 2 mM glutaminem, 1 mM pyruvatem, 50 jednotek/ml penicilinu/streptomycinu při 37 °C v atmosféře obsahující 10 % oxidu uhličitého a 90 % vzduchu. Buňky Cos7 se odpojují pro pasážování přídavkem 0,25% trypsinu.

(1) Nadměrná exprese členů skupiny MLK a JNK1 v buňkách Cos7

Buňky Cos7 se nanášejí při 80% konfluenci a přenášejí s 2 gg každého z fragmentů cDNA s použitím lipofektaminu, jak doporučuje dodavatel (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). cDNA plné délky lidského MLK-3, MLK-2 nebo myšího DLK nebo parciálního humánního MLK-1, jak se popisuje výše, a lidský JNK1 plné délky značený hemaglutíninem A, laskavě poskytnuté J. Silvio Gutkindem (NIH, Bethesda, MD), se subklonují do vektoru pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) . 48 h po přenesení * · * · » ··· « · '<

- 97 ·· · ·· ·· ·· «« se buňky zpracují 0,025% dimethylsulfoxidem nebo 500 nM roztokem uvedených sloučenin po dobu 2 h s následující lýzou v 0,4 ml tritonového pufru [1% Triton X-100, 50 mM chlorid sodný, 10 mM Tris (pH 7,6), 0,1% hovězí serumalbumin, 30 μΜ pyrofosfat sodný, 50 mM fluorid sodný, 20 gg/ml aprotinin, 1 mM fenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM vanadičnan sodný] . Aktivita JNK z lysátu se podrobí imunoprecipitačnímu/kinasovému rozboru popsanému níže.

(2) Imunoprecipitační a kinasový rozbor z celkových buněk

Lysat buněk Cos 7 se měří ohledně koncentrace proteinu s použitím soupravy Micro BCA od Pierce (Rockford, IL) a stejná množství proteinu se podrobí imunoprecipitaci s protilátkou HA po dobu 1 h při teplotě 4 °C. Imunoprecipitáty se peletují centrifugací na mikrocentrifuze po dobu 20 s, resuspendují v tritonovém pufru, promyjí 2x s další centrifugací, podrobí konečnému promytí v kinasovém pufru (20 mM Hepes pH 7,4, 20 mM chlorid hořečnatý, 2 mM dithiothreitol, 0,1 mM vanadičnan sodný). Imunoprecipitát se resuspenduje v kinasovém pufru obsahujícím 1 μΜ ATP a 50 μθί [gama-³²P]ATP a substrátu (1 μg vzorku AP-1) a inkubuje po dobu 15 min při teplotě 30 °C. Kinasová reakce se zastaví přídavkem redukčního pufru vzorku [Laemmli, Nátuře, 227. 680-685 (1970)] . Vzorky se zahřívají na 80 °C po dobu 5 min a nanášejí na 10% SDS-polyakrylamidové gely. Proteiny se oddělují elektroforesou. Gel se vysuší a kvantitativní stanovení radioaktivity AP-1 substrátu se provede na Molecular Dynamics Phosphorimager (Sunnyvale, Ca.). Výsledky z pokusů, ve kterých jsou MLK-3, MLK-2 a DLK koexprimované s HA-JNK1 a inkubované v nepřítomnosti či přítomnosti K-252a, ukazují obr. 15A a 15B. Oproti tomu derivát parenterální sloučeniny K-252a nazvané sloučenina III-3 (viz tabulku 4), který je φφ φ ·· φ* selektivnějším kinasovým inhibitorem, neinterferuje s cestou JNK aktivovanou jiným MAPKKK vzestupně od JNK, MEKK1 (obr. 15C) .

(B) Celobuněčné reportérové stanovení MLK aktivovaného JNK

Snaha o derivaci klonů konstitutivně exprimujících skupinu MLK byla neúspěšná, což ukazuje, že nadměrná exprese MLK může ovlivňovat přežívání buněk [Bergeron a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun., 231. 153-155 (1997), Nagata a kol., EMBO J., 17, 149-158 (1998)]. Proto při vývoji celobuněčného stanovení pro sledování biochemických dějů indukovnaých MLK může nastat požadavek na buněčnou linii obsahující indukovatelný systém exprese dané kinasy vyvinutý způsoby genetického inženýrství. Příkladem je buněčná linie PC-12 s přeneseným transaktivátorem řízeným tetracyklinem. Pokud se na buňky dále přenáší daný gen řízený indukovatelným promotorem teto, je exprese tohoto genu těsně kontrolovaná tetracyklinem v mediu [Shockett a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 12, 6522 (1995)].

Pro kvantitativní zjištění aktivace MLK lze měřit fosforylaci sestupných substrátů, jako je MEK4, JNK nebo c-jun ve formátech pro násobné analýzy, jak se popisují výše. Další přístup ke kvantitativním stanovením aktivace MLK v plných buňkách je použití reportérové enzymatické aktivity, jako je reporterový systém c-jun liciferasy komerčně dostupný jako systém PathDetect™ (Stratagene, LaJolla, CA) . V tomto systému se na tetracyklin-indukovatelnou buněčnou linii přenášejí dva plasmidy. Jeden plasmid konstitučně exprimuje fúzi c-jun NH^-terminální transaktivační domény s kvasinkovou GAL4 DNA vazebnou doménou (cJun-DBD protein) . Další plasmid nese kódovací sekvence pro luciferasu světlu • ··· • · šek řízenou pěti tandemovými opakováními vazebného místa GAL4. Při aktivaci MLK se sestupný substrát JNK, cJun-DBD protein, fosforyluje, váže se na vazebná místa GAL4 a indukuje transkripci liciferasového genu. Luciferasa se snadno stanoví v buněčných lysátech přídavkem jejího substrátu (Promega, Madison, WI) a měřením chemiluminiscence.

Příklad 31

Souvislost inhibice členů skupiny MLK s přežíváním motoneuronových a kortikálních buněk

Přežívání krysích buněk míchy obohacených o motoneurony

Míchy se vyjmou z embryí krys Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) v embryonálním stáří (E)

14,5 až 15 d. Buňky z ventrální části míchy se disociují a dále obohacují motoneurony centrifugací při gradientu metrizamidu s krokem 6,5 %, jak popsali dříve Henderson a kol., 1993 a analýza čistoty se provádí barvením nízkoafinitní neurotropinovou receptorovou protilátkou (IgG-192, Boehring-Mannheim) (údaje se neuvádějí). Buňky se nanášejí na 96-jamkové desky předem potažené poly-l-ornithinem a lamininem (5 ^g/ml každé látky) při hustotě 6 χ 10⁴ buněk/cm² v chemicky definovaném médiu N2 bez séra (Bottenstein a kol., 1979, výše). Pro oddělení adhese od účinků přežívání se přídavek sloučenin ke kulturám provádí po počáteční době adhese 1 až 3 h. Přežívání neuronů se hodnotí po 4 d s použitím kalceinu AM (Molecular Probes, Eugene, OR) fluorometrickou zkouškou životnosti (Bozyczko-Coyne a kol., 1993, výše) . Mikroskopické počítání neuronů vykazuje přímou korelaci s relativními hodnotami fluorescence. Ve stručnosti se medium sériově zředí v DPBS (fyziologický roztok pufrovaný fos-

100 fatem Dulbeccos) a do každé z 96 jamek se přidá konečná koncentrace 6 μΜ zásobního roztoku kalceinu AM. Desky se inkubují po dobu 30 min při teplotě 37 °C s následným sériovým zředěním promývacích podílů v DPBS. Fluorescenční signál se odečítá s použitím fluorimetru pro odečítání desek Millipore (Cytofluor 2350) při excitační vlnové délce 485 nm a vlnové délce emise 538 nm. Pro každou desku se střední pozadí odvozuje od jamek s kalceinem AM, které však neobsahují žádné buňky, a tato hodnota se odečítá od všech hodnot. Linearita

Fin v-λ r* nan λη t* rx j_ _i_ m.j_ tz

se

a inkubačnímu času pro rozmezí hustot buněk v těchto experi mentech. Příklad procentického přežívání oproti kontrole mo toneuronů za přítomnosti testovaných sloučenin při 250 nM ukazuje tabulka 3.

Přežívání kortikálních neuronů

Mozková kůra se odebírá z embryí krys o stáří 18 d a enzymaticky zpracuje pro obdržení suspenze jednotlivých buněk. Buňky se nanášejí při hustotě 1,56 x 105/cm² na 96-jamkové desky potažené poly-ornithinem/lamininem v neutrálním basálním mediu bez séra obsahujícím doplňky B27. Desky se potahují roztokem poly-ornithinu/lamininu (8 /ig/ml každé látky) ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem po dobu nejméně 2 h při teplotě 37 °C. Ve dnech in vitro 5 až 7 se kortikální neurony exponují Ab25-35 (20 μΜ), buď za přítomnosti testovaných sloučenin nebo bez nich. Zásobní roztoky (1 mM) Ab25-35 (Sigma, St. Louis, MO) se připraví v deionizované destilované sterilní vodě. Relativní přežívání neuronů se určí 48 h po přidání peptidu na základě uvolňování laktatdehydrogenasy jako indikátoru integrity plasmatické membrány/životnosti buněk. Laktatdehydrogenasa se měří s použitím soupravy Cytotoxicity Detection Kit (Boehringer101 • ···

-Mannaheim, Indianapolis, IN) v souladu s návody výrobce. Údaje se vyjadřují jako procento inhibice laktatdehydrogenasy uvolněné vzhledem ke kulturám zpracovaným samotným Ab25-35.

Tabulka 3

	Kortikální neurony	Motoneurony	Buňky Cos-7	Buňky Cos-7	Buňky Cos-7	Buňky Cos-7
Vzorec	Přežívání	přežívání	% JNK	DLK	MLK-3	MLK-2	MLK-1
	% kontrol	% kontrol	inhi-	% JNK	% JNK	% JNK	% JNK
	při 250	při 250	biče	inhi-	inhi-	inhi-	inhi-
	nM	nM	při	biče	biče	biče	biče
			500nM	500nm	500nm	500nm	500nm
III1 2	46,56	300%	65%	63,73	99,98	89,67	97,96
III3	47,80	315 %	88 %	36,22	94,94	69,44	92,64
				42
I3	22,54	177 %	88 %	20,25	94,93	0	79,29
I4	29,39	165 %	97 %	58,13	84,92	0	63,38
				52,8	90

^Sloučenina má vzorec III, ve kterém Z , Z , R a R jsou atomy vodíku, X je skupina CO^CH^ a R je hydroxylová skupina.

²Sloučenina má vzorec III, ve které Ζ_χ a Z₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂CH₃, R_x a R_, jsou skupiny CH₂SCH₂CH₃ a R je hydroxylová skupina.

³Sloučenina má vzorec I, ve kterém A , A , R , R , R a R jsou atomy vodíku, B a B^ společně představují atom kyslíku, R je skupina CH CH OAc, R je skupina CH CH (2-pyri2 2 2 2 2 • · • ···

- 102 dyl) a X je skupina CH^.

^Sloučenina má vzorec I, ve kterém Α_χ, A₂, R^, R₃, R_s a R_e jsou atomy vodíku, Β_χ a B_a společně představují atom kyslíku, R₂ je atom vodíku, R₄ je skupina CH₂CH₂(2-pyrimidinyl) a X je skupina CH₂.

Příklad 32

Imunoprecipitace aktivity endogenního JNK z motoneuronových kultur v nepřítomnosti nebo za přítomnosti indolokarbazolu nebo kondenzovaných pyrrolokarbazolů

Purifikované motoneurony se nanášejí při hustotě x 10⁴ buněk/cm² do jamek o průměru 16 mm. Buňky se ponechají přilnout před zpracováním během 2 h. Buňky se zpracují bud' 0,0125% roztokem dimethylsulfoxidu nebo 500 nM roztokem sloučeniny po dobu 2 h v definovaném mediu N2. Poté se buňky propláchnou ledově chladným fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem s následnou lýzou v 0,4 ml tritonového pufru, jak se popisuje výše v příkladu 30. Lysát z motoneuronových kultur se normalizuje vzhledem k počtu buněk a podrobí imunoprecipitaci s protilátkou JNK1 (číslo katalogu #sc-474) od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Aktivita JNK z imunoprecipitátů se stanoví za přítomnosti ³²P-ATP a substrátu c-jun, jak se popisuje výše. Profil inhibiční aktivity 4 zkoušených látek se srovnává v motoneuronech a buňkách Cos7 s nadměrnou expresí DLK, MLK-1, MLK-2 nebo MLK-3 (tabulka 3).

Příklad 33

Korelace mezi inhibicí aktivity JNK indukované MLK3 v buňkách Cos7 a aktivitou cholinacetyltransferasy v primárních

- 103 - • · ♦ 9 · 999 9 99 • · ♦ 9999 9 9· ♦ · · 99 99 9·*·♦ embryonálních kulturách

Pro stanovení, zda inhibice cesty JNK regulované kinasami koreluje s neurotropními sloučeninami se vyhodnocuje účinek sloučenin na aktivitu JNK v buňkách Cos7 s nadměrnou expresí HA-JMK a MLK3. Po době transfekce 48 h se buňky inkubují se sloučeninami při koncentraci 500 nM po dobu 2 h s následující lýzou buněk. Lysát se podrobí imunoprecipitaci a aktivita kinasy se měří podle popisu výše. Výsledky se uvádějí jako procento inhibice kontrolního vzorku, kde kontrola je aktivita JNK za přítomnosti DMSO. Jak lze vidět z tabulky 4, většina látek, které vykazují aktivitu ChAT v míše nebo předním mozku, působí jako účinné inhibitory aktivace MLK-3 pomocí JNK.

Tabulka 4

Účinek indolo- a indenokarbazolů na aktivitu JNK v buňkách Cos7 s nadměrnou expresí MLK3

Aktivita cholinacetyl- % inhibice JNK transferasy aktivity (průměr)

Sloučenina Mícha Basální přední MLK3 v buňkách Cos7 mozek

ΙΙΙ-1Χ	+	+	84
III-22	+	+	96
III-33	+	+	94
I-l4	+	+	93
I-2S	+	+	85
I-36	+	+	93,5
I-4V	-	+	95

- 104 • ··· • · · ··«···· ·♦ · ♦· ·· ·· ··♦

1-5®	-	+	97
I-6* 2 3 * * * * * 9	-		58
I-710	-	+	85.5
III-411	-	+	66
III-512	-	+	96
III-713	-	+	54
I-814	+	-	89
III-815	+	-	94
III-91S	+	+	98,5
111-1017	+	-	n o t u
I-9ia	+	-	88
I-1019	+	-	94
III-ll20	-	-	92,5
I-ll21	-	+	33
I-1222	-	-	11
I-1323	-		1

^Sloučenina obecného vzorce III, ve kterém Z a Z jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂CH₃, R_x je skupina NHC0NHC₂H₅, R₂ je CH^CH^(2-pyridyl) a R je hydroxylová skupina.

²Sloučenina obecného vzorce III, ve kterém Z a Z jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂CH₃, R_x a R₌ jsou skupiny CH₂OCH₂OCH₂CH₃ a R je hydroxylová skupina.

³Sloučenina obecného vzorce III, ve které Ζ_χ a Z₌ jsou atomy vodíku, X je skupina CO CH , R a R jsou skupiny CH SCH CH a R je hydroxylová skupina.

'‘Sloučenina obecného vzorce I, ve kterém A , A , R , R a R jsou atomy vodíku, Β_χ a B₂ společně představují atom kyslíku, R_, je skupina CH₂CH₂OH, R_s a R_e jsou skupiny OCH₃ a

X je skupina CH₂.

^sSloučenina obecného vzorce I, ve kterém A , A , R , R , R a R_g jsou atomy vodíku, Β_χ a B₂ společně představují atom

- 105 - • · · · · ··· í· '* • · · · · · · *· • to · to* ·· ···«« kyslíku, R₂ je skupina CH₂CH₂OH, R^ je atom bromu X a je skupina CH₂.

^Sloučenina obecného vzorce I, ve kterém A , A , R , R , R a R_e jsou atomy vodíku, Β_χ a B₂ společně představují atom kyslíku, R₂ je skupina CH₂CH₂OAc, R^ je skupina CH₂CH₂(2-pyridyl) a X je skupina CH₂.

^Sloučenina obecného vzorce I, ve kterém A , A , R , R , R⁴, R__ a R_e jsou atomy vodíku, Β_χ a B₂ společně představují atom kyslíku, R je skupina CH₂CH₂OH a X je skupina CH₂. ®Sloučenina obecného vzorce I, ve kterém A , A , R , R , r 1'2'13'

R⁴, Rs a Re jsou atomy vodíku, B a Bz společně představují atom kyslíku, R2 je skupina CH2CH2CH2OH a X je skupina CH2. ^Sloučenina obecného vzorce I, ve kterém A , A , R , R , R , R⁴, R5 a R_e jsou atomy vodíku, Β_χ a B₌ společně představují atom kyslíku a X je atom síry.

¹⁰Sloučenina obecného vzorce I, ve kterém A , A , R , R , R⁴, R_s a R_fi jsou atomy vodíku, a B₂ společně představují atom kyslíku, R₂ je skupina CH^CH^CH^NHCO(4-(OH)Ph) a X je skupina CH₂.

¹¹Sloučenina obecného vzorce III, ve kterém Z , Z , R a R jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂(CH₂)₄CH₃ a R je hydroxylová skupina.

¹²Sloučenina obecného vzorce III, ve kterém Z , Z , R a R ' 1'2'1 2 jsou atomy vodíku, R_z je skupina CH₂OH, X je skupina CO₂CH₃ a R hydroxylová skupina.

^X3Sloučenina obecného vzorce III, ve kterém Ζ_χ a Z₂ společně vytvářejí =0, R_x a R_z jsou atomy bromu, X je skupina C0₂CH₃ a R hydroxylová skupina.

¹⁴Sloučenina obecného vzorce I, ve kterém A , A , R , R ,

R_s a R_e jsou atomy vodíku, Β_χ a B₂ společně představují atom kyslíku, R₂ je atom vodíku, je skupina

CH₂CH₂(2-pyrimidinyl) a X je skupina CH₂.

¹⁵Sloučenina obecného vzorce III, ve kterém Ζ_χ a Z₂ jsou

106 * ··· « · · « ·· ·· • · » ·· ·Μ atomy vodíku, R je atom bromu, R je atom jodu, X je skupí na CO₂CH₃ a R je hydroxylová ^xeSloučenina obecného vzorce a R₂ jsou atomy vodíku, X je lova skupina.

^Sloučenina obecného vzorce skupina.

III, ve kterém Z a Z , R

12'1 skupina CO₂CH₃ a R je hydroxy-

III, ve kterém Z a Z jsou ' 1 2 ^J atomy vodíku, R a R₂ skupiny CH₂CH₂SCH₃ X je skupina

CO^CH^ a R je hydroxylová skupina.

^Sloučenina obecného vzorce I, ve kterém A , A , R , R , R_a, R_s a R_e jsou atomy vodíku, Β_χ a B_a společně představují atom kyslíku, R₄ je CH^CH^(2-pyridazinyl) a X je skupina

CH .

^xs,Sloučenina obecného vzorce I, ve kterém A , A , R , R . R₃, R_s a R_e jsou atomy vodíku, Β_χ a B₂ společně představují atom kyslíku, R₂ je atom vodíku, R₄ je CH₂CH₂(2-pyridyl) a X je skupina CH₂.

^2OSloučenina obecného vzorce III, ve kterém je Ζ_χ, Z₌, R_x a R_a jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂CH₃ a R je skupina OCH .

²¹Sloučenina obecného vzorce I, ve kterém A , A , R , R , ’ 1'213

R₄, R_s a R_e jsou atomy vodíku, Β_χ a B₌ společně představují atom kyslíku, R₂ je skupina (CH₂)₃-NH-C(=O)-3,5-dihydroxyfenyl a X je skupina CH₂. ²²Sloučenina obecného vzorce I, ve kterém A , A , R , R , R₄, R_s a R_g jsou atomy vodíku, Β_χ a B_a společně představují atom kyslíku, R₂ je benzoylová skupina a X je skupina CH₂. ²³Sloučenina obecného vzorce I, ve kterém A , A , R , R , ¹ X ^r 2 ¹ X ' 2 ’

R₃, R_S a R_s jsou atomy vodíku, B a B₌ společně představují atom kyslíku, R₄ je CH=CH-C=N a X je skupina CH₂.

Příklad 34

Gelová analýza posunu pro aktivaci MLK

107 • · · · · ··· · · · • ·· ·· ·· · · · · · ··· ····«· ·· ♦ ·· ·· ·· ··

Aktivace MLK může vést k indukci transkripce c-jun a tím ke zvýšení proteinu c-Jun. Zvýšené množství proteinu c-Jun lze měřit standardní analýzou nazývanou gelová analýza posunu, publikace Garner a kol., Nucleic Acids Res., 3047-3060 (1981), která se zde zahrnuje v plném znění formou odkazu. Dvouvláknové oligomery DNA značené radioaktivním nuklidem, které kódují vazebné místo DNA c-Jun se inkubují s nukleárním buněčným extraktem s následnou gelovou akrylamidovou k nižší pohyblivosti. Tento výsledek představuje podíl DNA navázaný na protein c-Jun a je přímo úměrný množství protei nu c-Jun v extraktu.

Aktivace MLK může též indukovat fosforylaci c-Jun. Ta se může detekovat s použitím protilátek, které specificky rozpoznávají fosforylovanou formu proteinu v detekčních systémech, jako je například Westernovo blotování nebo ELISA.

Příklad 35

Přežívání kuřecích embryonálních neuronů

Materiály

Leibovitzovo medium L15, glukosa, hydrogenuhličitan sodný, trypsin a antibiotika pocházejí od společnosti Gibco. Svalový extrakt se připraví podle popisu v literatuře [Henderson a kol., Nátuře, 302, 609-611 (1983) a tato publikace se zde v úplnosti zahrnuje formou odkazu]. Veškerá činidla jsou od firmy Sigma, pokud se neuvádí jinak.

4 44

- 108 ···

Buněčná kultura

Motoneurony (stáří embrya 5,5 d) se izolují imunologickým způsobem popsaným v Bloch-Gallego a kol., Development, 111, 221-232 (1991), a tato publikace se zde zahrnuje v plném rozsahu formou odkazu, s modifikacemi popsanými v publikaci Weng a kol., Neuro Report, 7, 1077-1081 (1996), která se zde rovněž zahrnuje v plném znění formou odkazu. Purifikované motoneurony se nanášejí na misky pro tkáňové kultury o průměru 35 mm (Nunc) předem potažené poly-DL-ornithinem a lamininem (1 gg/ml, Upstate Biotech). Medium je L15 obsahující hydrogenuhličitan sodný (22,5 mM), glukosu (20 mM), progesteron (2 x 10'^β M), seleničitan sodný (3 x 10~⁸ M) , conalbumin (0,1 mg/ml), insulin (5 μ9/τη1) , penicilin-streptomycin a 10 % koňského krevního séra inaktivovaného teplem. Doplněk svalového extraktu činí 30 μg/ml. Sloučenina III-3 se připraví jako 4 mM zásobní roztok v dimethylsulfoxidu a chrání před světlem při teplotě 4 °C. Konečná koncentrace DMSO v ošetřovaných a kontrolních kulturách činí 0,125 %.

Paravertebrální sympatické gangliony [SG, stáří embrya 12 d (E12)], gangliony dorsálních kořenů (DRG, E9) a ciliární gangliony (CG, E8) se vyjmou z kuřecích embryí v určený den, jak popisuje Lindsay a kol., Dev. Biol., 112, 319-328 (1985) a tato práce se zde jako celek zahrnuje formou odkazu. Po trypsinizaci a disociaci se nervové buněčné suspenze nanášejí na misky potažené polyornithinem-lamininem v Hamově mediu F14 obohaceném o 10 % koňského krevního séra. Ihned po nanesení se přidávají faktory pro přežití v následujících koncentracích: nervový růstový faktor (NGF) 20 ng/ml, ciliární neurotropní faktor (CNTF) 10 ng/ml. Kultury se udržují při teplotě 37 °C ve zvlhčené atmosféře ob109 • * !

·« sáhující 5 % oxidu uhličitého.

Počítání buněk

Neurony se nanášejí na misky o průměru 35 mm s mřížkou (Nunc). Zvolené plochy každé misky zahrnující celkem zhruba 10 % povrchu se snímají ohledně přítomnosti fázově zářících buněk ihned po nanesení a opět po 48 h pro vyhodnocení procenta přežití. Přežívání buněk se ověřuje vitálním barvením tryptsnovou modří (výsledky se neuvádějí)

Intaktní DRG

Gangliony se umístí na 96-jamkové desky předem potažené poly-l-ornithinem a lamininem (5 p.g každé těchto látek/ml fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem) v mediu N2 bez séra [Bottenstein a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 76, 514-517 (1979)] (tato práce se zde jako celek zahrnuje formou odkazu) obsahujícím 0,05 % bovinního serumalbuminu a udržuje se po dobu 48 h při teplotě 37 °C ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 % oxidu uhličitého. Na ošetřované gangliony se aplikuje buď 250 nM roztok sloučeniny III-3 nebo roztok 20 ng/ml NGF 2 h po nanesení.

Sloučenina III-3 podporuje přežívání kuřecích embryonálních periferních neuronů způsobem závislým na koncentraci

Odejmutí NGF z disociovaných kultur sensorických neuronů dorsálních kořenů E9 (DRG) a neuronů ganglionů sympatiku E12 (SG) způsobuje PCD v průběhu 48 h. Tomu se brání přídavkem sloučeniny III-3 k mediu v době odebrání NGF. Při koncentraci 1 μΜ sloučenina III-3 udržuje 94 % neuronů SG a 89 % neuronů DRG živých po 48 h (kontrola ošetřovaná NGF:

110 • * £ «· *

SG 65 fc, DRG 66 fc). Podobně sloučenina III-3 podporuje přežívání 76 % neuronů CNTF-dependentních ciliárních ganglionů (CG) po 24 h (kontrola ošetřovaná CNTF 67 fc) . Za přítomnosti 10 % séra byly účinky sloučeniny III-3 na přežívání závislé na koncentraci s plateau dosaženým okolo 1 μΜ pro všechny tři populace neuronů (obr. 16A-C). Přežívající neurony vykazují rozsáhlý růst neuritů, které jsou silnější a zakřivenější ve srovnání s kontrolními kulturami (obr. 17 E-H). Po 4 d je dosud neporušená účinnost podporující přežívání: DRG - ql nnron i na TTT-7 RO Sr Vnnřrril □ rížSah řpn á Fqb-hArcm

-¹- vs* W*****Mi w> sj A, Q f *k k* A- XJkJ Ví L·*. C A 1Q J-U.kJUV/vjUL J_ CL1 i. UV/A. LIL fc, SG - sloučenina III-3 83 fc, kontrola ošetřená NGF 55 fc, CG - sloučenina III-3 58 fc, kontrola ošetřená CNTF 50 fc. Za optimálních podmínek by bylo možné udržet kultury ze sloučeninou III-3 po dobu jednoho týdne nebo déle (výsledky nej sou ukázány).

Sloučenina III-3 podporuje přežívání motoneuronů kuřecích embryí způsobem závislým na koncentraci

Kuřecí motoneurony pěstované v kultuře mohou přežívat za přítomnosti svalového extraktu, zatímco v jeho nepřítomnosti odumírají. V pokusech, které se zde provádějí, přežívalo po 48 h 65 % motoneuronů za přítomnosti svalového extraktu ve srovnání se 14 % neoŠetřených kontrol. V nepřítomnosti séra byl účinek sloučeniny III-3 na přežívání maximální při koncentraci 300 nM a byl poněkud vyšší (79 fc) než účinek vyvolaný svalovým extraktem. Závislost účinku sloučeniny III-3 na přežívání na koncentraci v tomto systému je jiná než v případě periferních neuronů, jelikož koncentrace sloučeniny III-3 převyšující 300 nM vykazují progresivní snížení účinku (obr. 16A). To by mohlo ukazovat na zvláštní citlivost motoneuronů vůči některému aspektu aktivity sloučeniny III-3. Morfologicky vykazují motoneurony zachráněné

111 ♦ ··· 4* φ

4» · 4 φ · 44 • 44» 4·4 «φ 44 Φ 4 sloučeninou ΙΙΙ-3 fázově zářivé buňky a jsou schopné tvořit dlouhé neurity, které jsou mírně silnější než ty, které jsou indukované svalovým extraktem (Obr. 17). Po 4 d v kultuře je za přítomnosti sloučeniny III-3 56 % živých motoneuronů oproti 42 % se svalovým extraktem. Při 300 nM přežívají neurony ošetřené sloučeninou III in vitro po dobu alespoň jednoho týdne (výsledky se neuvádějí).

Sloučenina III-3 podporuje vyrůstání neuritů z intaktních ganglionů dorsálních kořenů

Výsledky výše popsaných pokusů prokazují, že sloučenina III-3 nejen podporuje přežívání embryonálních neuronů z periferních a centrálních nervových systémů, avšak též vede k vyrůstání robustních neuritů. Mnohé z těchto neuritů jsou silnější než ty, které vznikají za přítomnosti růstových faktorů (obr. 17 A-D až obr. 17 E-H). Tento účinek lze též pozorovat při vyrůstání neuritů z intaktních embryonálních ganglionů dorsálních kořenů za přítomnosti sloučeniny III-3 o koncentraci 250 nM (obr. 18C). Neurity vyrůstají v rámci odpovědi na NGF (obr. 18B) a sloučeninu III-3. Ty, které vyrůstají účinkem NGF, jsou jemnější a rozvětvenější než ty, které rostou za přítomnosti sloučeniny III-3, které jsou silnější a případně svazkovité.

Příklad 36

Ošetření in vivo

Vývojově regulovaný zánik motorických neuronů u kuřecích embryí

Tento příklad popisují podrobně Glicksman a kol., J.

112

Neurobiol., 35, 361-370 (1998) a tato publikace se zde zahrnuje jako celek formou odkazu. Na E6 se ve skořápce slepičích vajec (Spafas, Preston, CT) vytvoří okénko a přímo na vaskularizovanou chorioallantoidní membránu se jednou denně aplikuje buď vehikulum [5% Solutol™ HS 15, póly ethyl englykol 660 hydroxystearat, BASF Aktiengesellschaft, Ludwigshafen, Německo (ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem, pH 7,2)] nebo určená dávka sloučeniny II1-3 ve vehikulu, jak se popisuje v publikaci Oppenheim a kol., Science, 251, 1616-1617 (1991), která se zde zahrnuje jako celek formou odkazu. Embrya se usmrtí v den E10 a vyjmou se jejich míchy, fixují se v Carnoyově roztoku (10% ledová kyselina octová, 60% absolutní ethanol, 30% chloroform), zpracují se pro přípravu sériových parafinových řezů a obarví thioninem. Každý 20. řez lumbálních segmentů 1 až 8 se počítá podle výše popsaných kriterií (publikace Clarke a kol., Methods in Cell Biology: Cell Death, 1995, Schwart & Osborne, redakce Academie Press, New York, s. 277-321, která se zde jako celek zahrnuje formou odkazu).

Vývojově regulovaný zánik motorických neuronů u novorozených krys

Předčasně gravidní krysy Sprague-Dawley pochází od Harlan Laboratories (Indianapolis, IN). Krysí mláďata, samice, dostávají denně subkutánní injekci k cílovým perineálním svalům sloučeniny II1-3 v 5% Solutolu™ HS 15 nebo vehikulum počínaje od dne narození (Pl) s pokračováním po dobu 5 d (P5). V den P10 nebo P60 se mláďata dekapitují, krev se odebírá do heparinizovaných kapilár a oblast míchy obsahující sexuálně dimorfický míšní nucleus bulbocavernosus (SNB) a perineální oblast obsahující bulbocavernosus (BC) a levator ani (LA) se vyjmou po perfusi zvířat fyziologickým

- 113 • «·· roztokem/formalinem. Oblast míchy obsahující SNB se poté fixuje, zalévá do Paraplastu, řeže na tloušťku 10 gm a barví Cresylechtovou violetí [publikace Nordeen a kol., Science, 229. 671-673 (1985), která se zde jako celek zahrnuje formou odkazu]. Motorické neurony se počítají při zvětšení 500x v sériových řezech z lumbální 5 až sakrální 1 oblasti míchy, podle dřívějšího popisu (Nordeen a kol., výše). Mikroskopické vyhodnocení se provádí na kódovaných řezech se zaslepením skupin pro pozorovatele. Počty motorických neuronů se korigují na velikost buněk a tloušťku řezů (publikace Konisgsmark, Contemporary Research Methods in Neuroanatomy, Nauta & Ebbesson, redakce, 1970, Springer-Verlag, New York, s. 315-340, která se zde jako celek zahrnuje formou odkazu) a statistická analýza se provádí jednosměrným rozborem variance (ANOVA). Perineální svalovina se fixuje, dekalcifikuje, zalévá do Paraplastu, řeže při tloušťce 10 gm a barví barvivém Milligan Trichrom, S použitím mikroskopie v zářivém poli (zvětšení 250x) se svaly BC a LA u normálních samic a u samic ošetřených sloučeninou III-3 (405 zvířat/skupina) positivně identifikují umístěním a přítomností pruhovaných vláken. Obrys svalové tkáně se určuje z řezů s použitím projekčního mikroskopu (62.5) a průřez se měří s použitím číslicové podložky a počítačového morfometrického systému (Sigmascan, Jandel Scientific). Svalový objem se počítá z celkového průřezu, který se násobí tloušťkou řezu a koriguje na procento odebrané struktury.

Odebraná krev se centrifuguje po dobu 5 min při teplotě místnosti, poté se plasma odstraní a zmrazí při -20 °C. Hladiny testosteronu v krevním séru (6-7 zvířat/skupina) se měří radioimunoesejí následujícími způsoby popsanými v publikaci Wingfield a kol., Steroids, 26. 311-327 (1975), která se zde jako celek zahrnuje formou odkazu.

- 114 * «φ*

Φ «Φ ·· « · ···

Dediferenciace motorických neuronů vyvolaná axotomií u dospělé krysy

Levý hypoglosální nerv se přetne v krku dospělé krysí samice Sprague-Dawley (120 až 180 g) pod Neumbutolovou anestesí a 50 μΐ sloučeniny III-3 nebo jejího vehikula (5% Solutol™ HS 15) se aplikuje na Gelfoam™ (AJ Buck, Owings Mills, MD), který se obalí okolo proximálního konce přetnu

4% paraformaldehydem v Sorensonově pufru, 0,07 M fosfát, pH

7,2. Vyjme se mozkový kmen a řežou se koronární řezy o tloušfce 40 gm na kryostatu [publikace Chiu a kol., Neuro

Report, 5, 693-690 (1994), která se zde jako celek zahrnuje formou odkazu]. Každý pátý řez se zpracuje pro imunohi stochemické stanovení ChAT, jak se popisuje výše [publikace

Chiu a kol., J. Comp. Neurol., 328. 351-363 (1993), která se zde zahrnuje jako celek formou odkazu] s použitím zředění 1:350 monoklonální protilátky proti ChAT obdržené od Chemicon. Buňky, které se obarvily zřetelně nad hodnotu pozadí, se v obarvených řezech počítají. Počet vyhodnocených buněk se vyjádří jako poměr ChAT-imunoreaktivních buněk na axotomizované straně hypoglosálního jádra proti počtu imunoreaktivních buněk na kontrolní (nepoškozené) straně.

Sloučenina III-3 zachraňuje motorické neurony krysího embrya před apoptickou smrtí in vitro a inhibuje signální cestu vedoucí k aktivaci JNK1 v těchto buňkách [publikace Maroney a kol., Neurosci., 18. 104-111 (1998), která se zde jako celek zahrnuje formou odkazu]. Pro stanovení potenciální aktivity in vivo se sloučenina III-3 hodnotí ve dvou modelech vývojově regulovaného programovaného zániku motorického neuronu a v modelu dediferenciace dospělých motorických • ··

- 115 neuronů vyvolané axotomií. U kuřat se zhruba 50 % motorických neuronů míchy podrobuje PCD v průběhu dnů E5-10 [publikace Hamburger a kol., J. Neurosci., 1, 38-55 (1982), Purves a kol., Body and Brain: A Trophic Theory of Neural Connections, 1988, Harvard University Press, Cambridge, MA, které se zde obě zahrnují jako celek formou odkazu]. Aplikace sloučeniny III-3 na chorioallantoidní membránu v tomto období zabraňuje zániku motorického neuronu dávkově závislým způsobem (obr. 19) . 40 % motorických neuronů, které by normálně odum-

v vn 1 if zx zx	*» Π VX ťS Ί YX,**X í“1 Vx <*» 1/- Λί -ι Λ ΛτΧ·/*γ ř“1 τ τ-Ίτ- 3 Λ %Χ ς±ιχ_ι_ J_ J-VWU vyobJUVll L·!! udvÁClCXl
(2,3 a 7	μg/d), zatímco při nižších dávkách (1,2 a 1,8
gg/d) se	zachrání 25 % motorických neuronů (obr. 19).

V průběhu časného perinatálního života krysích samic [poslední embryonální stádium do postnatálního dne (PN 4)] se více než 50 % motorických neuronů v SNB eliminuje cestou PCD [publikace Breedlove, J. Neurobiol., 17, 157-176 (1986), která se zde jako celek zahrnuje formou odkazu]. U samců motorické neurony tohoto jádra inervují pruhované penilní svaly, které se účastní kopulačních reflexů I. Testikulární sekrece androgenních steroidů snižuje zánik motorických neuronů SNB u samců a zabraňuje z větší části atrofii svalů BC a LA inervovaných těmito neurony. Podávání testosteronu mláďatům samičího pohlaví vede k plně maskulinnímu počtu motorických neuronů SNB (Nordeen a kol., výše) a zabraňuje atrofii svalů BC a LA [publikace Waiman, a kol., Endocrinology, 29. 955-978 (1941) , která se zde zahrnuje jako celek formou odkazu]. Denní subkutánní podávání sloučeniny III-3 (PN 1-5) krysím samicím významně zeslabuje zánik motorických neuronů (obr. 20A). Zabránění zániku motorických neuronů SNB sloučeninou III-3 nastává při dvou dávkách (0,5 a 1 mg/kg denně). Při těchto maximálně účinných dávkách 0,5 a 1 mg/kg denně vedlo podávání sloučeniny III-3 k 70% zvýše • 4··

- 116 ní přežívání motorických neuronů, které se vyrovnalo účinku testosteronu (obr. 20A) . Sloučenina m-3 nepozměňuje hladiny testosteronu v krevní plasmě u léčených samic. Radioimunitní měření hladin plasmatického testosteronu u skupiny, která dostávala 1 mg/kg denně, nevedlo k žádnému signifikantnímu rozdílu při srovnání s kontrolní skupinou vehikula (0,016±0,008 ng/ml respektive 0,029+0,015 ng/ml standardní chyby střední hodnoty).

Pro zjištění, zda je léčení sloučeninou III-3 účinné při dlouhodobém udržování přežívání motorických neuronů, se samice ošetřovaly sloučeninou III-3 (0,5 a 1 mg/kg denně) po stejné časové období PN (1-5). Polovina zvířat ve skupině vehikula i v ošetřované skupině se utratí dne PN10. Zbývající zvířata se poté udržují bez dalšího ošetřování sloučeninou III*·3 až do utracení v den PN60. v souhlasu s dřívějším pozorováním (obr. 20A) způsobuje léčení sloučeninou III-3 70% zvýšení přežívání motorických neuronů (obr. 2OB). Dále 100 % těchto zachráněných motorických neuronů lze morfologicky identifikovat 55 d po posledním podání sloučeniny III-3 (obr. 20B). Inhibice zániku motorických neuronů sloučeninou III-3 v průběhu neonatálního období umožňuje přežívání motorických neuronů do dospělosti.

Přes zřejmý průkaz vyčerpávajících účinků ztráty motorických neuronů při lidských onemocněních v dospělosti, jako je amyotropická laterální sklerosa, u většiny zvířecích modelů poškození motorických neuronů jsou motorické neurony v dospělosti resistentní do konce života. Avšak axonální poškození nevede k morfologickým (Oppenheim a kol., výše) ani biochemickým změnám [publikace Oppenheim a kol., výše, Rende a kol., J. Comp. Neurol., 319, 285-298 (1992), která se zde jako celek zahrnuje formou odkazu, a Chiu a kol., J.

• * · · · ··· » · ·

- 117 - ·· · *· ·· ·· ··

Comp. Neurol., 328. 351-363 (1993), která se zde jako celek zahrnuje formou odkazu], u dospělých neuronů, které mohou napodobovat degenerativní změnu předcházející zániku u patologických a degenerujících motorických neuronů. Jedním příkladem tohoto typu změny je axotomie hypoglosálního nervu, který inervuje jazyk. Unilaterální přetnutí tohoto nervu u dospělé krysy vedlo ke ztrátě 95 % ChAT-imunoreaktivních hypoglosálních motorických neuronů v ipsilaterálním jádru po 7 d [publikace Chiu a kol., Neuro Report, 5., 693-696 (1994), která se zde jako celek zahrnuje formou odkazu]. Ztráta ChAT-imunoreaktivity nebyla trvalá. Čtyři týdny po axotomii mělo 100 % motorických neuronů obnovené hladiny ChAT-imunoreaktivity [publikace Borke a kol., J. Neurocytol., 22, 141-153 (1993), která se zde zahrnuje jako celek formou odkazu]. ChAT-imunoreaktivita v kontralaterálních hypoglosálních motorických neuronech zůstala neovlivněná (Chiu a kol., výše) (obr. 21 a Tabulka 5).

Při aplikaci prostředku Gelfoam™ k proximálnímu konci hypoglosálního nervu sloučenina III-3 zeslabovala způsobem závislým na dávce pokles ChAT-imunoreaktivity v ipsilaterálních hypoglosálních motorických neuronech při vyhodnocení 7 d po axotomii. Maximální účinná dávka (50 ^g) vedla ke 40% zvýšení počtu ChAT-imunoreaktivních motorických neuronů ve srovnání s axotomizovanou neléčenou kontrolou (obr. 21B a tabulka 5). Dávková závislost byla ve tvaru zvonu, kdy nižší i vyšší dávky vedly k přežívání, které bylo vyšší než u neléčených kontrol, avšak menší než při hodnotě 50 μg. V souladu s modelem SNB nedocházelo k žádným souvisejícím hmotnostním úbytkům, mortalitě nebo ke hrubému poškození tkáně u těchto zvířat při kterékoliv z testovaných dávek.

Ve třech oddělených modelech degenerace motorických • « *«· neuronů in vivo vykazovala sloučenina III-3 neuroprotektivní účinnost: vývojově regulovaný PCD motorických neuronů lumbální míchy u embryí (obr. 19), androgen-sensitivní zánik postnatálních motorických neuronů SNB (obr. 20) a axotomií indukovaná ztráta funkčního markéru, ChAT, u dospělých hypoglosálních motorických neuronů (obr. 21 a tabulka 5). Sloučenina III-3 byla účinná při periferním podání subkutánní injekcí lokálně k řezu na nervu nebo přímo na chorioallantoidní membránu kuřecího embrya. Oproti mateřské molekule K-252a byla sloučenina III-3 zhruba pětkát účinnější při zprostředkování přežívání kultur obohacených o motorické neurony (data se neuvádějí) a nevykazovala inhibiční aktivitu proti tyrosikinase trkA a několika serin-threoninkinasam [publikace Maroney a kol., výše, Kaneko a kol., J. Med. Chem., 40, 1863-1869 (1997), které se zde zahrnují jako celek formou odkazu].

Tabulka 5

Účinek sloučeniny III-3 na cholinacetyltransferasovou imunoreaktivitu u axotomizováných hypoglosálních motorických neuronů

ChAT positivní motorické neurony

Ošetření	n	Experimentální/ /kontrolní skupina	o_ o	Průměr/ /skupina
vehikulum	2	20/544	3,68	4,01
		19/437	4,35
3,6 Mg III-3	2	55/420	13,10	12,84*
		72/572	12,59
25 gg III-3	2	95/597	15,91	19,01*
		142/642	22,12

* »99

- 119

50 μς III-3	2	188/484 278/637	38.84 43.85	41,34* *
100 /xg III-3	4	465/920	50,54	32,61*
		235/784	29,98
		178/770	23,12
		182/679	26,80
200 μς III-3	2	99/461	21,48	24,96*
		159/559	28,44
operované	2	350/335	104,48	101,24
bez přetnutí		292/298	oo nn W f w

Sloučenina III-3 nebo vehikulum se podává v gelové pěně k proximálnímu konci hypoglosálního nervu ihned po jeho přetnutí. Po 7 d se zvířata utratí a zhotoví se sériové řezy hypoglosálního jádra a každý pátý řez se podrobí imunologickému barvení s použitím protilátek proti ChAT. Počty ChAT-positivních neuronů se zjišťují na ipsilaterální (experimentální) a kontralaterální (kontrolní) straně jádra.

*p<0,05, statisticky významné ve srovnání se zvířaty ošetřenými kontrolním vehikulem.

Inhibitor cesty MLK-3 prokazuje účinnost in vivo a blokuje fosforylační děje sestupně od MLK-3 v modelu MPTP

MPTP se podává při dávce 40 mg/kg, která vede ke ztrátě striatálních dopaminergních terminálů a buněk v substantia nigra. Tyrosinhydroxylasa se používá jako markér pro dopaminergní nervové terminály v substantia nigra. Systematické podávání sloučeniny III-3 zmenšuje ztráty tyrosinhydroxylasa-imunoreaktivních neuronů v substantia nigra po poškození MPTP (obr. 22a, Saporito a kol., 1999). Jelikož sloučenina III-3 je známým inhibitorem MLK3, lze pozorovat • ΦΦΦ • « φ · Φ · · · Φ φ ·♦ · ·♦ Φ« ·Φ Φ*Β aktivaci sestupného substrátu MLK3 u myší vystavených MPTP. Hladiny fosforylováného MKK4 se měří s použitím fosfo-MKK4- specifické protilátky (New England Biolabs, Beverly, MA) , která rozpoznává monofosforylovanou formu MKK4 buď imunoblotovým stanovením (obr. 22b) nebo stanovením ELISA (obr. 22c). Podávání MPTP zvyšuje hladiny fosforylováného MKK4 v substantia nigra až pětinásobně oproti hladinám kontrol (obr. 22b). Vrcholové vzrůsty nastaly 4 h po podání MPTP a koincidovaly s vrcholovými hladinami MPP* v CNS. Fosforylace MKK4 zprostředkovaná MPTP se zeslabila předchozím ošetřením 1-deprenylem, což ukazuje, že tyto fosforylační děje jsou zprostředkované MPP* (obr. 22c) . Navíc se fosforylace MKK4 částečně inhibovala předchozím ošetřením sloučeninou III-3 v dávce 1 mg/kg, která poskytuje ochranu proti nigrostriatální dopaminergní ztrátě indukované MPTP (obr. 22c). Tyto údaje dokazují, že MPTP (MPP*) aktivuje MKK4, sestupný substrát od MLK3. Navíc tato data prokazují, že známý inhibitor MLK3 inhibuje aktivaci této kinasové cesty in vivo.

Příklad 37

Zánět

Indukce IL-1 a TNF-α pomocí LPS v buňkách THP-1 a účinek indolokarbazolů a pyrrolokarbazolů na tuto indukci

Byly zvoleny buňky imunitního systému, jelikož se mnohé kinasy účastní regulace různých imunologických funkcí, například indukce syntesy cytokinů a indukce cytokinové biologické odpovědi. Nedávná zpráva [Hambleton a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 21, 2774-2778 (1996), která se zde zahrnuje jako celek formou odkazu], ukazuje, že léčení buněčných linií odvozených od monocytů pomocí LPS způsobuje rych • * • » ·« ·

lou aktivaci aktivity JNK. Když monocyty přicházejí do styku s bakteriálními endotoxiny, jako je lipopolysacharid {LPS), poskytují zánětlivé cytokiny, IL-1 a TNF-α. Inhibice tvorby těchto dvou cytokinů může být použitelná při léčení určitých zánětlivých poruch imunitního systému. Tyto cytokiny lze snadno měřit komerčními soupravami ELISA. Původci tohoto vynálezu navrhují pokusy pro stanovení (1) zda indolové a kondenzované pyrrolokarbazoly mohou inhibovat syntesu IL-1 a TNF-α v dané linii monocytů THP-1, (2) zda se JNK aktivuje LPS v buňkách THP-1 a (3) zda lze aktivaci JNK způsobenou LPS inhibovat indolovými a kondenzovanými pyrrolokarbazoly.

Způsoby experimentálního provedení

Buňky THP-1 se pěstují na mediu RPMI 1640 obohaceném 10 % fetálního hovězího séra. LPS (serotyp E, coli 0111.B4, extrahovaný kyselinou trichloroctovou) pochází od Sigma a je rozpuštěný ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem. Soupravy ELISA pro stanovení IL-1 a TNF-α pocházejí od Boerhinger-Mannheim a stanovení v mediu THP-1 se provádějí podle pokynu výrobce. S každou soupravou se dodávají standardní křivky podle pokynů.

Experimenty se provádějí na 12-jamkových deskách s 1 nebo 2 ml THP-1 při hustotě buněk 4 x 10^s buněk/ml. IL-1 a TNF-α se indukují přídavkem LPS do media a medium se odebírá v různých časech po tomto přídavku pro stanovení cytokinů. Buňky se odstraní centrifugací a supernatanty se zmrazí při -70 °C do doby jejich použití pro rozbor. Pro minimalizaci nákladů na experimenty se stanovení provádí ve dvojicích kultur a dvojice supernatantů se po centrifugací spojují. Každý spojený supematant se analyzuje ve dvojicích. Zásobní roztoky indolových a kondenzovaných pyrrolo- 122 * · ·»· karbazolů ve 100% dimethylsulfoxidu se zředí na žádané koncentrace buď v médiu obsahujícím 10% fetální hovězí sérum nebo v mediu obsahujícím 0.5 mg/ml bovinního serumalbuminu. Pokud se neuvádí jinak, přidávají se sloučeniny k buňkám THP-1 1 h před přídavkem LPS.

Stanovení aktivity JNK se provádí po imunoprecipitaci proteinu JNK z extraktu lýzovaných buněk THP-1. Peletované buňky THP-1 se lýzují na ledu v průběhu 15 min v 500 μΐ putru Frac (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM chlorid sodný, 30 μΜ pyrofosforečnan sodný, 1 mg/ml bovinního serumalbuminu, 1% Triton-X-100). Extrakt se centrifuguje po dobu 10 min při 14K a k supernatantu se přidá 5 μΐ protilátky JNK (Santa Cruz). Extrakt se otáčí po dobu 60 min při 4 °C, přidá se 75 μΐ promyté protein A Sepharosy (20 hmotnostních % ve Frac) a extrakt se otáčí dalších 30 min pro navázání protilátkového komplexu na protein A Sepharosu. Protein A Sepharosa se dvakrát promyje pufrem Frac, jednou 20 mM Hepes, pH 7,6, 20 mM chlorid hořečnatý, 2 mM DTT, poté se inkubuje po dobu 15 min při teplotě 30 °C ve 30 μΐ kinasového pufru (20 mM Hepes, 20 mM chlorid hořečnatý, 2 mM DTT, 1 μ<$ rekombinantního c-jun a 2 μΜ ATP-gama-³²P, 2 μ€ί. Reakce se ukončí přídavkem 10 μΐ pufru pro gelové nanášení 4x SDS, vzorek se zahřívá na 80 °C po dobu 3 min a proteiny se analyzují na 10% gelu SDS. Gel se suší, exponuje na desce Phosphorimager a radioaktivní pásy se analyzují na zařízení Phosphorimager.

Výsledky z prvních experimentů ukazují, že LPS při 2 Mg/ml poskytuje maximální výtěžek IL-1 a tato koncentrace LPS se používá v dalších pokusech. Minimální čas po přídavku LPS pro dosažení maximálního výtěžku cytokinů se určuje odebráním alikvotů media pro stanovení různých časů po přídavku LPS. První experiment ukazuje, že IL-1 i TNF-o dosahu• ♦··

- 123 jí maximálního výtěžku v době kratší než 5 h po přídavku LPS. Jelikož nej časnější doba odběrů v prvním experimentu je 2,4 h, provádí se další experiment s odběry media počínaje od 15 min po přídavku LPS. výsledky tohoto experimentu, kde se stanovuje pouze TNF-α, ukazují, že maximální výtěžek se dosahuje 3 h po přídavku LPS. Do 90 min po přídavku LPS není v mediu žádné významné množství TNF-a.

Rychlé dosažení maximálního výtěžku ukazuje na velmi těsnou regulaci tvorby 2 cytokinů - rychlá synthesa a rychlá regulace směrem dolů. Kultury buněk se ošetřují po dobu 30 min před přídavkem LPS buď Aktinomycinem D, inhibitorem synthesy RNA nebo cykloheximidem, inhibitorem proteinové synthesy. Medium se odebírá 3 h po přídavku LPS a stanoví se TNF-α. Pro indukci TNF-Cť se požaduje nová synthesa nukleové kyseliny i proteinu, jelikož v mediu buněk zpracovaných kterýmkoliv inhibitorem není přítomen žádný TNF-α. Další experimenty se provádějí pro zjištění, zda sloučenina III-3 inhibuje indukci IL-1 a TNF-α. Sloučenina III-3 inhibuje indukci IL-1 i TNF-α s hodnotami IC50 267 nM, respektive 139 nM. Výsledky těchto experimentů se obdrží s buňkami v mediu obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra. Jelikož rozbory s tkání míchy a tkání basálního předního mozku pro stanovení neurotropní aktivity sloučenin se provádějí v mediu bez séra (500 ^g/ml bovinního serumalbuminu) je zajímavé stanovit hodnoty IC50 pro inhibici IL-1 a TNF-α v mediu bez séra. Jestliže se buňky THP-1 zpracují sloučeninou III-3 v mediu bez séra (500 μg/ml bovinního serumalbuminu) IC50 se snižuje desetkrát z 269 nM na 23 nM. Pokud se neuvádí jinak, provádějí se všechny další experimenty v mediu bez séra. Inhibice indukce IL-1 a TNF-α v buňkách THP-1 sloučeninou III-3 ukazuje, že sloučeninu III-3 lze použít jako terapeutický prostředek při léčení patologických stavů způsobených tvorbou

- 124 nadnormálních množství těchto cytokinů. Takovým stavem je septický šok. Septický šok je způsobený růstem gramnegativních bakterií v oběhu, které uvolňují velká množství endotoxinu, LPS. Tento LPS poté stimuluje primárně monocyty a makrofágy k tvorbě větších množství IL-1 a TNF-α, které poté způsobují masivní poškození tkáně a v mnoha případech smrt.

Výsledky testování několika sloučenin ohledně jejich schopnosti inhibovat TNF-α ve srovnání se schopností inhibovat JNK ukazuje tabulka 6.

Tabulka 6

Buňky THP-1 Nadměrně exprimovaný MLK3 v buňkách Cos7

Sloučenina	IC50 TNF-cy, nM	% in. JNK, 500 nM	% in. JNK, 500 nM
III-l	49,5	93,5	83,8
III-3	29	93	94
1-2	>5000	78,5	85
1-3	366	80,5	93,7
1-4	75,5	79,5	95
1-5	514	89	97,2
1-6	817,5	77,5	57,8
1-7	1009	74	85,5
III-4	462,5	81	66
III-5	4	84,5	96
III-7	590,5	11,5	54
III-8	11,5	51	94

- 125 4298

I-1O

III-ll

4500

686

94

92,5

Účinek sloučeniny III-3 na indukci IL-2 v Jurkatových buňkách

Experimenty se provádějí pro zjištění, zda sloučenina III-3 inhibuje indukci IL-2 v Jurkatových buňkách.

Způsob experimentálního provedení

Jurkatovy buňky se pěstují v mediu RPMI 1640 obohaceném o 10 % fetálního bovinního séra. TNF-α pochází od Promega a protilátky proti CD3 a CD28 od Pharmigen. Jurkatovy experimenty se provádějí ve 200 μΐ na 96-jamkové desce. IL-2 se měří soupravou ELISA obdrženou od Boehringer Mannheim. Protilátky proti CD3 a CD28 se ponechají navázat na plastovou 96-jamkovou desku (18 h ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem) před přídavkem Jurkatových buněk. Buňky se zpracují sloučeninami 1 h před přídavkem na desku potaženou protilátkou. Pro aktivaci receptorů T buněk a indukci IL-2 se používají protilátky proti CD3 a CD28. IL-2 se uvolňuje z Jurkatových buněk mezi 6 h a 24 h po zahájení indukce (obr. 23A). Konstitučně se nevytváří žádný IL-2 (obr. 23A CNT). Účinek zpracování sloučeninou III-3 (1 h se sloučeninou III-3 před indukcí) na indukci IL-2 byl dále vyhodnocen (obr. 23B). Koncentrace sloučeniny III-3 50 nM inhibovala indukci IL-2 o více než 80 % (obr. 23B). Rozsáhlejší pokus zaměřený na dávkovou odpověď se provádí se sloučeninou III-3 a sloučeninou 1-4 s obdržením hodnot IC 139 nM pro sloučeninu III-3 a 207 nM pro sloučeninu 1-4 (obr. 230 .

- 126 • ··· • · · ·· · • ·· • ··

4 4 4 · ·· «4 4444

Záměrem je, že veškeré patenty, přihlášky a tištěné publikace citované v tomto patentovém dokumentu se zde zahrnují jako celek formou odkazu.

Jak zjistí ten, kdo má zkušenost v oboru, lze provést četné změny a modifikace preferovaných ztělesnění tohoto vynálezu bez odchylky od ducha tohoto vynálezu. Zamýšlí se, že veškeré tyto změny spadají do rozsahu tohoto vynálezu.

jUDr. Petr Kalenský advokát

127

• ·		* ·	v	* ·	V »
•	•	•	•	•	···	• ·
•	•	•	•	•	• ·	• ·
«·	•	··	4«	4·	··

?l^z jjcci-jďi

Claims (2)

PATENTOVÉ NÁROKY
1. -(1,2,4-triazin)], CH CH SCH a CH OH,

   X se zvolí z případu atom vodíku, skupina CH₂OH,

   CH N-serin, CO CH , CONHC H , CH NHCO. C H , CH NHCO CH , CH N , CONHC H , CH NH-glycin,

   2 23' 23' 25' 2 ^J

   CON(CH ) , -CH NHCO CONH , CONHC H , CH NH-serin, CH₂SOCH₃, CH=NOH, CH₂NH-Prolin, CH₂CH₂(2-pyridyl), CH=NNHC(=NH)NH₂, CONH(CH_a)_aOH, CH=NNHCONH₂,

   CH OCOCH , -CH OC(CH ) 0-, CH SCH , CH SOC H ,

   2 3 ' 2 3 2 2ۇS 2 C5

   C0₂(n-hexylová) skupina, CONHCH₃ a C0₂(CHJ^CH₂ nebo ze skupin následujících vzorců

   R se zvolí z případů hydroxylová skupina a skupina

   OCH .

   • » • ···

   176

   119. Způsob podle nároku 118, vyznačuj ící se t í m, že Ζ_χ a Z^ jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂CH_3> je skupina NHCONHC_zH_s, R₂ je skupina CH_zCH_z(2-pyridyl) a R je hydroxylová skupina.

   120. Způsob podle nároku 118, vyznačuj ící se t í m, že Ζ_χ a Z₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂CH₃, Ε_χ a R^ jsou skupiny CH₃OCH₂OCH₂CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   121. Způsob podle nároku 118, vyznačuj ící se t í m, že Z_i a Z₂ jsou atomy vodíku, X je skupina

   CO CH , R a R jsou skupiny CH SCH CH a R je hydroxylová

   2 3 1- 2 ·2 ^3 skupina.

   122. Způsob podle nároku 118, vyznačuj ící se t í m, že Z , Z₂, a R₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   123. Způsob podle nároku 118, vyznačuj ící se tím, že Z , Z₂, R_r a R₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂(CH₂)₄CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   124. Způsob podle nároku 118, vyznačuj ící se t í m, že Z , Z₂ a R_x jsou atomy vodíku, R_a je skupina CH^OH, X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   125. Způsob podle nároku 118, vyznačuj ící se t í m, že Ζ_χ a Z₂ jsou atomy vodíku, R^ a R_, jsou skupiny H₂S [3-(1,2,4-triazin)], X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   • 4 • ···

   177

   126. Způsob podle nároku 118, vyznačuj ící se t í m, že Z^ a Z_a jsou atomy vodíku, R_x je atom bromu, R_a je atom jodu, X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina .

   127. Způsob podle nároku 118, vyznačuj ící se t í m, že Z a Z jsou atomy vodíku, R_x a R₂ jsou skupiny CH₂CH₂SCH₃, X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   128. Způsob podle nároku 118, vyznačuj ící se t í m, že Ζ_χ, Z_., R a R₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂CH₃ a R je skupina OCH₃.

   129. Způsob podle nároku 118, vyznačuj ící se t í m, že Z^ a Z₂ spolu tvoří =0, R^ a R_, jsou atomy bromu, X je skupina C0₂CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   130. Způsob podle nároku 104, vyznačuj ící tím, že tato sloučenina má obecný vzorec ve kterém je atom vodíku a Z je atom vodíku nebo Z a Z ^J 12 * * ···

   178 * ♦ « ·♦ *«· společně tvoří =0, je atom vodíku nebo atom bromu, je atom vodíku, je atom vodíku, skupina CH^CH-CH^, CH₂CH₂CH_aOH nebo

   CH CH CH —N C ² ’ ² je atom vodíku, skupina CH₂CH=CH₂ nebo skupina CH CH CH OH.

   131. Způsob podle nároku 130, vyznačuj íc í se tím, že R , R_a, R , Z a Z₂ jsou atomy vodíku a R₃ je skupina CH₂CH=CH₂.

   132. Způsob podle nároku 130, vyznačuj ící se t í m, že R je atom bromu a R , R₃, R , Ζ_χ a Z₂ jsou atomy vodíku.

   133. Způsob podle nároku 130, vyznačuj ící se tím, že R , R , Z a Z₂ jsou atomy vodíku a R₃ a R^ jsou skupiny CH₂CH=CH₂.

   134. Způsob podle nároku 130, vyznačuj ící se tím, že R , R , R , Z^ a Z₂ jsou atomy vodíku a R₄ je skupina CH_aCH=CH₂.

   135. Způsob podle nároku 130, vyznačující tím, že R , R , Z aZ jsou atomy vodíku a R a R

   - 179 jsou skupiny vodíku a R

   CH CH CH OH nebo R , R , R ,

   1) každá alkylová, alkenylová nebo alkinylová skupina je nesubstituovaná nebo

   2) každá alkylová, alkenylová nebo alkinylová skupina je substituovaná 1 až 3 skupinami zvolenými z případů: arylová skupina o 6 až 10 atomech uhlíku, heteroarylová skupina, arylalkoxyskupina, heterocykloalkoxyskupina, hydroxyalkoxyskupina, aIkoxy-alkoxyskupina, hydroxyalkylthioskupina, alkoxy-alkylthioskupina, atom fluoru, atom chloru, atom bromu, atom jodu, kyanoskupina, nitroskupina, hydroxylová skupina, skupina -0R®, -X²(CH ) NR^XXR¹², -X²(CH ) C(=0)NR^XXR^X2, -X²(CH ) 0C (=0) NR^XXR^X2 , -X²(CH ) CO R®, -X²(CH ) S(0) R®,

   2 p 2 p 2 2 p y

   -X²(CH ) NR^XOC(0)NR^XXR^X2, -0C(=0)R⁹, -0C0NHR², -0-tetra2 p hydropyranylová skupina, skupina -NR^XXR^X2, -NR^XOC(=0)R®, -NR^xoC02R⁹, -NR^xoC{=0)NR^xxR^x2( -NHC(=NH)NH₂, NR^xoS(0)2r®, -S(O)yR®, -CO2R², -C(=0)NR^xxR^x2, -C(=O)R², -CH^OR¹⁰, -CH=NNR²R^2A, -CH=NOR², -CH=NR®, -CH=NNHCH(N=NH)NH2, -S(=0)₂NR²R^2A, -P(=0)(0R^xo)₂, -0R^X4 a monosacharidová skupi • ··♦

   172 na mající 5 až 7 atomů uhlíku, ve které je každá hydroxylová skupina monosacharidu nezávisle buď nesubstituované nebo nahrazená atomem vodíku, alkylovou skupinou o 1 až 4 atomech uhlíku, alkylkarbonyloxyskupinou o 2 až 5 atomech uhlíku nebo alkoxyskupinou o 1 až 4 atomech uhlíku,

   X² je atom kyslíku, atom síry nebo skupina NR¹⁰,

   R⁷ a R^s se nezávisle na sobě volí z případů atom vodíku, alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku, alkoxyskupina o 1 až 4 atomech uhlíku, substituovaná či nesubstituovaná arylalkylová skupina o 6 až 10 atomech uhlíku, substituovaná či nesubstituované heteroarylalkylová skupina, skupina - (CHJ_p0R¹⁰, - (-CHJ ^00(=0)NR^1XR¹² a - (CH ) NR^ilR^:L2 nebo R⁷ a R^s spolu vytvářejí spoj o2 vací skupinu obecného vzorce -CH₂-X³-CH₂-, ve které X³ je X² nebo vazba, man jsou nezávisle na sobě 0, 1 nebo 2,

   Y se volí z případů -0-, -S-, -N(R¹⁰)-, -N*(0~)(R¹⁰)-,

   -N(0R¹⁰)- a -CH₂-,

   Z se volí z případů vazba, -0-, -CH=CH-, -S-, -C(=0)-,

   -CH(0R¹⁰)-, -N(R¹⁰)-, -N(0R¹⁰)-, CH (NE^R¹²) - , -C(=0)N(R’⁷)-, -N(R¹⁷)C(=0)-, -N(S(O)_yR⁹)

   -N(S(0) NR^1XR¹²)-, -N(C(=0)R¹⁷)-, -C(R¹⁵R¹⁶)-, y

   -r(0')R¹⁰)-, -CH(OH) -CH(OH) - a -CH(O(C=O)R⁹)CH(OC(=O)R^9A) -, kde R^9A má stejný význam jako R⁹,

   R¹⁵ a R¹⁶ se navzájem nezávisle volí z případů atom vodíku, hydroxylová skupina, skupina -C(=0)R¹⁰, -O(C=O)R⁹, ♦ 9

   V «94

   - 173 hydroxyalkylová skupina a skupina -CO^R¹⁰,

   R¹⁷ se volí z případů atom vodíku, alkylová skupina, arylová skupina a heteroarylová skupina,

   A¹ a A² se volí z případů 2 atomy vodíku, atom vodíku a skupina OR², atom vodíku a skupina -SR², atom vodíku a skupina -N(R²)₂ a skupina, ve které A¹ a A² spolu vytvářejí zbytek zvolený z případů =0, =S a =NR²,

   B¹ a B ² se volí z případů 2 atomy vodíku, atom vodíku a skupina -OR², atom vodíku a skupina -SR², atom vodíku a skupina -N(R²)₂ a skupina, ve které B^T a B² vytvářejí zbytek zvolený z případů =0, =S a =NR², s podmínkou, že alespoň jeden z párů A¹ a A² nebo B¹ a B² tvoří =0.

   118. Způsob podle nároku 104, vyznačuj ící se t í m, že tato sloučenina má obecný vzorec

   174 ve kterém

   Z je atom vodíku a Z₂ je atom vodíku nebo Ζ_χ a Z,. spolu vytvářejí =0,

   R^x se volí z případů atom vodíku, atom chloru,

   CH SO C H , atom bromu, CH S(CH ) NH ,

   CH₂S(CH₂)₂N(CH₃)₂, CH_aS(CH₂)₂NH₂, n-C₄H_s,

   NHCONHC H , NHCONHC H , CH SC H , CH SC Η , N(CH ) , CH , CH OCONHC H , NHCO CH , CH OC H , CH N(CH ) , OH, 0-(n-propylová) skupina, CH-NNH-C ( =NH)NH__, CH=N-N(CH ) , CH S (CH ) NH-(n-C H ) , CH OCH OCH CH ,

   3 2 2 2 2 4 © 2 2 2 3

   CH₌S[3-(1,2,4-triazin)], CH^CH^SCH^,

   Λλ

   CH=N—N^__/NCH]

   A“\

   CH2CH2CH2— ® • · * ···

   175

   R_a se zvolí z případů atom vodíku, atom bromu, atom chloru, atom jodu, skupina CH₂S(CH₂)₂N(CH₃)₂, NHCONHC H , CH SC H , CH OCH OCH CH , CH S[32S^Z 225* 2 2 2 3' 2

   1) R^X1 a R¹² se zvolí nezávisle na sobě z případů atom vodíku a alkylová skupina mající 1 až 4 atomy uhlíku nebo

   2) R^X1 a R¹² spolu vytvářejí spojovací skupinu obecného vzorce -(CH2)2-X^x-(CH2)₂-, ve kterém se X¹ volí z případů -0-, -S- a -CH₂-,

   R² se volí z případů atom vodíku, alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku, hydroxylová skupina, alkoxyskupina o 1 až 4 atomech uhlíku, skupina -OC(=O)R⁹, -OC(=O)NR^XXR¹², -O(CH ) NR^i:LR¹², -O(CH ) 0R^xo, sub2 p 2 p stituovaná či nesubstituovaná arylalkylová skupina o 6 až 10 atomech uhlíku a substituovaná či nesubstituovaná heteroarylalkylová skupina,

   R³, R'¹, R^s a R⁶ se navzájem nezávisle volí z následujících případů:

   a) atom vodíku, arylová skupina, heteroarylová skupina, atom

   I Μ» • »

   171 fluoru, atom chloru, atom bromu, atom jodu, kyanoskupina, skupina CF₃, nitroskupina, hydroxylová skupina, skupina OR®, -O(CH ) NR^XXR^X2, -OC(=O)R®, -0C (=0) NR²R^V,

   -0C(=0)NR^XXR¹², -O(CH ) 0R^xO, -CH 0R^xo, -NR^XXR¹²,

   2 2 -NR^xoS(=0)₂R®, -NR^XOC(=0)R®,

   b) skupina -CH^OR¹⁴, ve které R^X4 je zbytek aminokyseliny po odstranění hydroxylové skupiny z karboxylové skupiny,

   C) skupina -NR^XOC(=0)NR^XXR^X2, -CO2R², -C(=0)R², -C(=0)NR^XXR^X2, -CH=N0R², -CH=NR⁹, -(CH=)^NR^XXR^X2,

   - (CH ) NHR^X4 nebo -CH=NNR²R^2A, ve které R^2a má stejný význam ² P jako R²,

   d) skupina -S(0) R²-(CH ) S(0) R®, -CH S(0) R^x4, ve které y je 0, 1 nebo 2,

   e) alkylová skupina mající od 1 do 8 atomů uhlíku, alkenylová skupina mající od 2 do 8 atomů uhlíku a alkinylová skupina mající od 2 do 8 atomů uhlíku, kde

   1) jeden atom uhlíku nahradí atomem kyslíku, atomem dusíku nebo atomem síry,

   2) dva atomy uhlíku nahradí atomem síry a atomem dusíku, atomem kyslíku a atomem dusíku nebo dvěma atomy dusíku

   3) nebo se tři atomy uhlíku nahradí třemi atomy dusíku,

   - 170

   -Ψ 9 ***** * «4

   J I · ·······*9 • · · · · 4 · 4 ·* ·· · ·· «· «· *·

   R¹ se volí z následujících případů:

   a) atom vodíku, substituovaná nebo nesubstituovaná alkylová skupina mající 1 až 4 atomy uhlíku, substituovaná nebo nesubstituovaná arylová skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná arylalkylová skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná heteroarylová skupina nebo substituovaná či nesubstituovaná heteroarylalkylová skupina,

   b) skupina -C(=O)R⁹, ve které se R⁹ volí z případů alkylová skupina, arylová skupina a heteroarylová skupina,

   c) skupina -0R^xo, ve které R^xo se volí z případů atom vodíku a alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku,

   d) skupina -C(=0)NH₂, -NR^t:lR^X2, - (CH2) pNR^xxR¹² , - (CH2) ^OR¹⁰, -O(CH ) OR^xo a -O(CH ) NR^X1R^X2, ve které p je od 1 do 4 a ve

   2 p 2 p které buď

   1-3 arylovými skupinami o 6-10 atomech uhlíku (včetně), přednostně fenylovou či naftylovou skupinou, heteroarylovou skupinou, atomem fluoru, atomem chloru, atomem bromu, atomem jodu, kyanoskupinou, nitroskupinou, hydroxylovou skupinou, skupinou OR⁹, -0(CHJnNR⁷R^a, -OCOR⁹, -0C0NHR⁹, O-tetrahydropyranylovou skupinou, aminoskupinou, skupinou -NR⁷R^b, -NR^1oC0R⁹, -NR^1oC02R⁹, -NR^1oC0NR^vR⁸, -NHC(=NH)NH2, -NR^1oS02R⁹, -S(O)^R^1x, kde R¹¹ je atom vodíku nebo alkylová skupina o 1-4 atomech uhlíku, arylová skupina o 6-10 atomech uhlíku, přednostně fenylová či naftylová skupina nebo heteroarylová skupina a y je 1 nebo 2, skupina -SR¹¹, -co2r⁹, -CONR^R³, -CHO, COR⁹, -CH^OR⁷, -CH=NNR¹¹R¹², -CH=NOR^T1, -CH=NR⁹, -CH=NNHCH(N=NH)NH2, -SO₂NR¹²R¹³, -POÍOR¹¹)^ nebo OR¹⁴, kde R¹⁴ je zbytek aminokyseliny po odstranění hydroxylové skupiny z karboxylově skupiny a buď

   R¹² a R¹³ jsou nezávisle na sobě atom vodíku, alkylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně), arylová skupina o 6-10 atomech uhlíku, přednostně fenylová či naftylová skupina ·· · nebo heteroarylová skupina, nebo

   R¹² a R¹³ se spolu spojují s vytvořením spojovací skupiny, přednostně -(CH3)2-X¹-(CH2)₂,

   R³, R⁴, R^s a R^e jsou nezávisle na sobě atom vodíku, arylová skupina, přednostně arylová skupina o 6-10 atomech uhlíku (včetně), přednostněji fenylová skupina či naftylová skupina, heteroarylová skupina, atom fluoru, atom chloru, atom bromu, atom jodu, kyanoskupina, skupina CF₃, nitroskupina, hydroxylová skupina, skupina -OR⁹, -O(CH ) NR^vR^a, -OCOR⁹, -OCONHR⁹, NH , -CH OH, -CH OR¹⁴, -NR⁷R^S, -NR^loC0R⁹, -NR^loC0NR⁷R⁸,

   2. ' 2

   -SR¹¹, -S(O)^R¹¹> kde y je 1 nebo 2, skupina -C0₂R®, -COR⁹, -CONR⁷R^S, -CHO, -CH^NOR¹¹, -CH=NR⁹, -CH=NNRiiRia -(CH ) SR⁹, kde n je celé číslo 1 až 4 (včetně), skupina -(CH ) S(0) R⁹, -CH SR¹⁵, kde R¹⁵ je alkýlová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně), skupina -CH S(0) R¹⁴, -(CH ) NR^VR®, -(CH ) NHR¹⁴, alkylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), přednostně alkylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně), alkenylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), přednostně alkenylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně), alkinylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), přednostně alkinylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně) a buď každá alkylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), alkenylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně) nebo alkinylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně) je nesubstituovaná nebo každá alkylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), alkenylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně) nebo alkinylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně) je substituovaná, jak se popisuje • · ·_ • · »· výše,

   X je buď nesubstituovaná alkylenová skupina o 1-3 atomech uhlíku (včetně) nebo

   X je alkylenová skupina o 1-3 atomech uhlíku (včetně) substituovaná jednou skupinou R², přednostně skupinou OR¹⁰, -SR¹⁰, R¹⁵, kde R¹⁵ je alkylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně), fenylová skupina, naftylová skupina, arylalkylová skupina o 7-14 atomech uhlíku (včetně), přednostně benzylová skupina nebo

   X je skupina -CH=CH-, -CH(OH)-CH(OH)-, -0-, -S(=0)-, -S(=0)₂-, -CR^1O)2-, -C(=0)-, -C(=N0R¹¹)-, -C(OR)¹¹)(R¹¹)-, -C(=0)CHR^1S-, -CHR^1SC(=0)-, -C(=NOR^1X)CHR¹⁵-, CHR¹⁵C(=N0R¹¹)-, -CH2Z-, -ZCH -, -CH ZCH -, kde Z je skupina C(OR¹¹)(R¹¹), atom kyslíku, atom síry, C(=0) , C(=N0R^1:L) nebo NR¹¹, nebo

   A¹ a A² jsou společně a každý nezávisle dva atomy vodíku, atom vodíku a skupina -OR¹¹, atom vodíku a skupina -SR¹¹, atom vodíku a skupina -NR^1:LR¹², nebo spolu tvoří =S nebo =NR^X1, B¹ a B² spolu tvoří atom kyslíku a všechny R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ a X se definují výše vc), d), e) af), nebo

   A¹ a A² spolu tvoří atom kyslíku, B¹ a B² jsou společně každý nezávisle dva atomy vodíku, atom vodíku a skupina -OR¹¹, atom vodíku a skupina -SR¹¹, atom vodíku a skupina -NR^1:LR¹² nebo spolu tvoří =S nebo =NR^1T a všechny R¹, R², R³, R⁴, R^s, R⁶ a X se definují výše v c), d), e) a f).

   ··· * *

   - lei ··

   106. Způsob podle nároku 105, vyznačuj ící se tím, že Α_χ, A₂, R , R₃ a R jsou atomy vodíku, Β_χ a B₂ společně představují atom kyslíku, R₂ je skupina CH^CH^OH, R_s a R_e je skupina 0CH_a a X je skupina CH₌.

   107. Způsob podle nároku 105, vyznačuj ící se tím, že Α_χ, A_z, R_x, R^, R_s a R_e jsou atomy vodíku, B a B_a společně představují atom kyslíku, R₂ je skupina CH^CH^OAc, R₄ je atom bromu a X je skupina CH₂.

   108. Způsob podle nároku 105, vyznačuj ící se tím, že A , A₂, R , R₃, R₅ a R_fe jsou atomy vodíku,

   B a B společně představují atom kyslíku, R₂ je skupina CH₂CH₂0Ac, R₄ je skupina CH^CH^(2-pyr) a X je skupina CH₂.

   109. Způsob podle nároku 105, vyznačuj ící se tím, že A , A , R , R , R aR jsou atomy vodíku, B a B společně představují atom kyslíku, R je atom vodí-

   X Ξ 2 ku, R₄ je skupina CH₂CH₂(2-pyrimidinyl) a X je skupina CH₃.

   110. Způsob podle nároku 105, vyznačuj ící se tím, že Α_χ, A₂, R , R₃, R_s a R_e jsou atomy vodíku, B a B₂ společně představují atom kyslíku, R₂ je atom vodíku, R₄ je skupina CH₂CH₂(2-pyr) a X je skupina CH₂.

   111. Způsob podle nároku 105, vyznačuj ící se tím, žeA,A,R,R,R,R aR jsou atomy vodíku, Ba B₂ společně představují atom kyslíku, R₄ je skupina CH₂CH₂(2-pyridazinyl) a X je skupina CH₂.

   112. Způsob podle nároku 105, vyznačuj ící se tím, žeA,A,R,R,R,R aR jsou atomy vodíku, B a B₂ společně představují atom kyslíku, R₂ je skupina

   I • ·♦

   168

   CH₃CH₂OH a X je skupina CH₂.

   113. Způsob podle nároku 105, vyznačuj ící se tím, že A_t, A_z, R_x, R_a, R^, R_s a R_e jsou atomy vodíku, a společně představují atom kyslíku, R₂ je skupina CH CH OH a X je skupina CH .

   114. Způsob podle nároku 105, vyznačuj ící se tím, žeA,A,R,R,R,R,R aR jsou atomy

   12'1'2 3'4 5 β ^{J J} vodíku, a B₂ společně představují atom kyslíku a X je skupina síry.

   115. Způsob podle nároku 105, vyznačuj ící se tím, že A₂, R_x, R , R^, R_s a R_e jsou atomy vodíku, B^ a B_a společně představují atom kyslíku, je skupina CH₂CH_aCH₂NHCO[4-(OH)Ph] a X je skupina CH₂ .

   116. Způsob podle nároku 105, vyznačuj ící se tím, že Α_χ, A₂, R , R₃, R , R_s a R_g jsou atomy vodíku, B_i a B₂ společně představují atom kyslíku, R₂ je skupina CH₂CH₂CH₂OH a X je skupina CH₂.

   117. Způsob podle nároku 104, vyznačuj ící se t í m, že tato sloučenina má obecný vzorec • 9

   9 9 • · • · 9

   169

   9 · ·

   Ri ve kterém kruh B a kruh F se nezávisle na sobě, každý spolu s atomy uhlíku, ke kterému se připojuje, volí z následujících případů

   a) nenasycený šestičlenný karbocyklický aromatický kruh, ve kterém se mohou 1 až 3 atomy uhlíku nahradit atomy dusíku,

   b) nenasycený petičlenný karbocyklický aromatický kruh a

   c) nenasycený pětičlenný karbocyklický aromatický kruh, ve kterém se

   1 ^J 2 3 X 2 ^J atomy vodíku.

   101. Způsob podle nároku 98, vyznačuj ící se t í tn, že R , R , Z a Z₂ jsou atomy vodíku a R₃ a R^ jsou skupiny CH₂CH=CH₂.

   102. Způsob podle nároku 98, vyznačuj ící se tím, že R , R , R , Z aZ jsou atomy vodíku a R je skupina CH__>CH=CH₂.

   103. Způsob podle nároku 98, vyznačuj ící se t i m, že R , R , Ζ_χ a Z₂ jsou atomy vodíku a R_ a R^ jsou skupiny CH₂CH₂CH₂OH nebo R_x, R^, R^, Ζ_χ a Z₂ jsou atomy vodíku a R₃ je skupina CH₂CH₂CH₂—N

   9 ·

   104. Způsob léčení savce majícího zánět, vyznačující se tím, že se tomuto savci podává sloučenina, která inhibuje kinasový protein s násobnou vazbou, ve farmaceuticky přijatelné soli či zřeďovacím prostředku.

   105. Způsob podle nároku 104, vyznačuj ící se t í m, že tato sloučenina má obecný vzorec

   Ri

   Ri ve kterém

   E¹ a E² nezávisle na sobě spolu s atomy uhlíku, ke kterým se připojují, vytvářejí bud' nenasycený 6-členný karbocyklický aromatický kruh, ve kterém jeden až tři atomy uhlíku mohou být nahrazeny atomy dusíku nebo nenasycený 5-členný karbocyklický aromatický kruh, ve kterém buď jeden atom uhlíku je nahrazen atomem kyslíku, dusíku nebo síry nebo dva atomy uhlíku jsou nahrazeny atomem síry • * 4*4

   - 163 a atomem dusíku nebo atomem kyslíku a atomem dusíku,

   A¹ a A² spolu představují 0 a B¹ a B² spolu představují 0,

   R¹ je atom vodíku, alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku (včetně), arylová skupina, arylalkylová skupina, heteroarylová skupina a heteroarylalkylová skupina, skupina COR®, kde R® je alkylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně), nebo arylová skupina, přednostně fenylová či naftylová skupina, skupina -OR¹⁰, kde R^1Q je atom vodíku nebo alkylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně), skupina -CONH₂, -NR^VR®, -(CH ) NR⁷R®, kde n je celé Číslo 1-4 (včet2 n ně) nebo skupina -0(CH_a)_nNR^vR^s a buď

   R⁷ a R^a nezávisle na sobě jsou atom vodíku nebo alkylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně) nebo

   R⁷ a R^e se spolu spojují s vytvořením spojovací skupiny obecného vzorce -(CH^)2-X^T-(CH2)_z-, kde X¹ je atom kyslíku, atom síry nebo skupina CH₂,

   R² je atom vodíku, skupina -SO^R®, -CO^R®, -COR®, alkylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), přednostně alkylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně), alkenylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), přednostně alkenylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně) nebo alkinylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), přednostně alkinylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně) nebo monosacharid o 5-7 atomech uhlíku (včetně), kde každá hydroxylová skupina monosacharidu nezávisle je buď nesubstituovaná nebo je nahrazena atomem vodíku, alkylovou skupinou o 1-4 atomech uhlíku (včetně), alkylkarbonyloxyskupinou o 2-5 atomech uhlíku (včetně) nebo alkoxyskupinou o 1-4 atomech uhlíku (včetně) a buď každá alkylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), alkenylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně) nebo alkinylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně) je nesubstituovaná nebo každá alkylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), alkenylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně) nebo alkinylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně) je nezávisle na sobě substituovaná

   -(1,2,4-triazin)], CH CH SCH a CH OH,

   X se zvolí z případu atom vodíku, skupina CH₂OH,

   CH N-serin, CO CH , CONHC Η , CH NHCO C Η , CH NHCO CH , CH N , CONHC Η , CH NH-glycin,

   2 23' 23 25 2 -t

   CON(CH ) , -CH NHCO CONH , CONHC Η , CH NH-serin, CH₂SOCH₃, CH=NOH, CH^NH-Prolin, CH₂CH₂(2-pyridyl), CH=NNHC(=NH)NH , CONH(CH ) OH, CH=NNHCONH ,

   CH OCOCH , -CH OC(CH ) 0-, CH SC Η , CH SOC Η ,

   2 3 2 3 2 2 6 5 2 6 5

   C0₂(n-hexylová) skupina, CONHCH₃ a C0₂(CH₂)₄CH₃ nebo ze skupin následujících vzorců a

   R se zvolí z případů hydroxylová skupina a skupina

   0CH₃ .

   87. Způsob podle nároku 86, vyznačuj ící se t í m, že Ζ_χ a Z₂ jsou atomy vodíku, X je skupina » » - — — •♦ ·· · · · • ♦ * * · · · • » · · · · · ·· «· ·· ··♦

   CO₂CH₃, R_x je skupina NHCONHC₃H_s, je skupina CH₂CH₂(2-pyridyl) a R je hydroxylová skupina.

   88. Způsob podle nároku 86, vyznačuj í c í se t 1 m, že Z a Z₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂CH₃, R_x a R₂ jsou skupiny CH^OCH^OCH^CH^ a R je hydroxylová skupina.

   89. Způsob podle nároku 86, vyznačuj ící se t i m, že Z^ a Z₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO_aCH₃, R_x a R_a jsou skupiny CH₂SCH₂CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   90. Způsob podle nároku 86, vyznačuj ící se t í m, že Z^ a Z₂ jsou atomy vodíku, R_t a R₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   91. Způsob podle nároku 86, vyznačuj ící se t í m, že Z^, Z₂, R_x a R_a jsou atomy vodíku, X je skupina C0₂(CH )₄CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   92. Způsob podle nároku 86, vyznačuj ící se t í m, že Z , Z_a a R_x jsou atomy vodíku, R₂ je skupina CH₂OH, X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina,

   93. Způsob podle nároku 86, vyznačuj ící se t í m, že a Z₂ jsou atomy vodíku, R^ a R₂ jsou skupiny H₂S[3-(1,2,4-triazin)], X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   94. Způsob podle nároku 86, vyznačuj ící se t í m, že a Z₂ jsou atomy vodíku, R^ je atom bromu,

   R₂ je atom jodu, X je skupina CO^CH^ a R je hydroxylová skupina.

   95. Způsob podle nároku 86, vyznačuj ící se t í m, že Ζ_χ a Z₂ jsou atomy vodíku, R_x a R₂ jsou skupiny CH^CH^SCH^, X je skupina CO^CH^ a R je hydroxylová skupina.

   96. Způsob podle nároku 86, vyznačuj ící se t í m, že Z , Z_., R^ a R₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂CH₃ a R je skupina OCH₃.

   97. Způsob podle nároku 86, vyznačuj ící se t í m, že Ζ_χ a Z₂ spolu tvoří =0, R_x a R₌ jsou atomy bromu, X je skupina CO_,CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   98. Způsob podle nároku 72, vyznačuj ící se t í m, že tato sloučenina má obecný vzorec

   H ve kterém je atom vodíku a Z léčně tvoří =0, je atom vodíku nebo Z^ a Z₂ spoje atom vodíku nebo atom bromu, je atom vodíku, je atom vodíku, skupina

   CH ₂ch ch —n o \—/ • ·

   - 1S1 «

   ·_

   ♦ ♦ • ·· · * • · » • · » · · • • * • · • · • ·· ♦ · ·· ♦

   CH CH=CH , CH

   2 2 '

   CH OH nebo je atom vodíku, skupina CH₂CH=CH₂ nebo skupina

   CH CH CH OH.

   2 2 2

   99. Způsob podle nároku 98, vyznačuj ící se t i m, že R , R₂, R₄, Ζ_χ a Z₂ jsou atomy vodíku a R₃ je skupina CH₂CH=CH₂.

   100. Způsob podle nároku 98, vyznačuj ící se tím, že R je atom bromu a R , R , R , Z a Z jsou

   1) každá alkylová, alkenylová nebo alkinylová skupina je nesubstituovaná nebo

   2) každá alkylová, alkenylová nebo alkinylová skupina je substituovaná 1 až 3 skupinami zvolenými z případů: arylová skupina o 6 až 10 atomech uhlíku, heteroarylová skupina, arylalkoxyskupina, heterocykloalkoxyskupina, hydroxyalkoxyskupina, alkoxy-alkoxyskupina, hydroxyalkylthioskupina, alkoxy-alkylthioskupina, atom fluoru, atom chloru, atom bromu, atom jodu, kyanoskupina, nitroskupina, hydroxylová skupina, skupina -OR⁹, -X² (CHJ ^NR^R¹² , -X²(CH^)_pC(-0)NR^X1R¹², -X²(CH ) 0C(=O)NR^lxR¹², -X²(CH ) CO R⁹, -X²(CH ) S(0) R⁹,

   2 P 2 p 2 2 p y

   -X²(CH ) NR^iOC(0)NR^xlR^X2, -OC(=O)R⁹, -OCONHR², -0-tetra• ·«· .iBs: • · · · · · ·· «· ·· <♦· hydropyranylová skupina, skupina -NR^XXR^X2, -NR^xoC{=0) R⁹, -NR^xoC02R⁹, -NR^xOC{=0)NR^xxR^:l2, -NHC(=NH)NH2, NR^xoS(0)₂R⁹, -S(0) R⁹, -CO R², -C(=O)NR^XXR^X2, -C(=O)R², -CH 0R^xo, y 2 2

   -CH=NNR²R^2a, -CH=NOR², -CH=NR⁹, -CH=NNHCH(N=NH)NH2, -S(=0)2NR²R^2A, -P(=0)(0R^xo)2, -0R^X4 a monosacharidová skupina mající 5 až 7 atomů uhlíku, ve které je každá hydroxylová skupina monosacharidu nezávisle buď nesubstituovaná nebo nahrazená atomem vodíku, alkylovou skupinou o 1 až 4 atomech uhlíku, alkylkarbonyloxyskupinou o 2 až 5 atomech uhlíku nebo alkoxyskupinou o 1 až 4 atomech uhlíku,

   X² je atom kyslíku, atom síry nebo skupina NR^XO,

   R⁷ a R^s se nezávisle na sobě volí z případů atom vodíku, alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku, alkoxyskupina o 1 až 4 atomech uhlíku, substituovaná či nesubstituovaná arylalkylová skupina o 6 až 10 atomech uhlíku, substituovaná či nesubstituovaná heteroarylalkylová skupina, skupina -(CHJ^OR³⁰, -(-CH2)^00(=0)NR^XXR¹² a -{CHa)^NR^XXR^X2 nebo R⁷ a R® spolu vytvářejí spojovací skupinu obecného vzorce -CH2-X³-CH2-, ve které X³ je X² nebo vazba, man jsou nezávisle na sobě 0, 1 nebo 2,

   Y se volí z případů -0-, -S-, -N(R^XO)-, -N*(0’)(R^xo)-,

   -N(0R^LO)- a -CH₂-,

   Z se volí z případů vazba, -0-, -CH=CH-, -S-, -C(=0)-,

   -CH(OR^xo)-, -N(R^XO)-N(0R^xo)-, CH(NR^XXR^X3)-, -C(=0)N(R^X7)-, -N(R¹⁷)C(=0)-, -N(S(0)_yR⁹)-, -N(S(0) NR^XXR^X2)-, -N(C(=0)R^X7)-, -C(R^xsR^xe)-, y

   -N*(0)R^xo)-, -CH(OH)-CH(OH)- a

   -CH (O (C=0) R⁹) CH (OC (=0) R^9A) - , kde R^9A má stejný význam j ako R⁹,

   R^ls a Rⁱ⁶ se navzájem nezávisle volí z případů atom vodíku, hydroxylová skupina, skupina -C(=0)R¹⁰, -O(C=O)R⁹, hydroxyalkylová skupina a skupina -CO^R¹⁰,

   R¹⁷ se volí z případů atom vodíku, alkylová skupina, arylová skupina a heteroarylová skupina,

   A¹ a A² se volí z případů 2 atomy vodíku, atom vodíku a skupina OR², atom vodíku a skupina -SR², atom vodíku a skupina -N(R²)₂ a skupina, ve které A^T a A² spolu vytvářejí zbytek zvolený z případů =0, =S a =NR²,

   B¹ a B ² se volí z případů 2 atomy vodíku, atom vodíku a skupina -OR², atom vodíku a skupina -SR², atom vodíku a skupina -N(R²)₂ a skupina, ve které B^T a B² vytvářejí zbytek zvolený z případů =0, =S a =NR², s podmínkou, že alespoň jeden z párů A¹ a A² nebo B¹ a B² tvoří =0.

   86. Způsob podle nároku 72, vyznačuj ící se t í m, že tato sloučenina má obecný vzorec • · * · · ··· » ^:.1S7C * ¹ ve kterém

   Z_± je atom vodíku a Z₂ je atom vodíku nebo Z_± a Z₂ spolu vytvářejí =0,

   R^T se volí z případů atom vodíku, atom chloru,

   CH SO C H , atom bromu, CH S(CH ) NH,

   CH S(CH ) N(CH ) , CH S(CH ) NH , n-C H,

   2 2 ' 2 3 2 ' 2 2 2 2'4 O '

   NHCONHC H , NHCONHC H , CH SC H , CH SC Η , N(CH) ,

   CH , CH OCONHC H , NHCO CH , CH OC H , CH N(CH ),

   OH, 0-(n-propylová) skupina, CH=NNH-C(=NH)NH^, CH=N-N(CH ) , CH S(CH ) NH-(n-C H ), CH OCH OCH CH ,

   3 2' 2 2 2 49 2 223

   CH₂S[3-(1,2,4-triazin)], CH^CH^SCH^, • · • » -• 000 * · * 0 0*0 9 • 0 · 0 * 0 ·· *· 00 a

   R se zvolí z případů atom vodíku, atom bromu, atom chloru, atom jodu, skupina CH₂S(CH₂)₂N(CH₃)₂, NHCONHC Η , CH SC Η , CH OCH OCH CH , CH S[325 225 2 2 2 3 2

   1) R^xx· a R¹² se zvolí nezávisle na sobě z případů atom vodíku a alkylová skupina mající 1 až 4 atomy uhlíku nebo

   2) R^xx a R^x2 spolu vytvářejí spojovací skupinu obecného vzorce -(CH ) -X^X-(CH ) ve kterém se X¹ volí z případů -o-, -s- a -CH

   R² se volí z případů atom vodíku, alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku, hydroxylová skupina, alkoxyskupina o 1 až 4 atomech uhlíku, skupina -OC(=O)R®, -OC(=0)NR^XXR^X2, -O(CH ) NR^XXR^X2, -O(CH ) 0R^xo, sub2 p> 2 stituovaná či nesubstituovaná arylalkylová skupina o 6 až 10 atomech uhlíku a substituovaná či nesubstituovaná heteroarylalkylová skupina, • · ··

   - · · « « ·* φ ·· ·· ·· «*·

   R³, R⁴, R⁵ a R^G se navzájem nezávisle volí z následujících případů:

   a) atom vodíku, arylová skupina, heteroarylová skupina, atom fluoru, atom chloru, atom bromu, atom jodu, kyanoskupina, skupina CF₃, nitroskupina, hydroxylová skupina, skupina OR⁹, -O(CH ) NR^XXR¹², -OC(=O)R⁹, -0C(=0)NR²R^V,

   2 p

   -0C(=O)NR^XiR¹², -O(CH ) 0R^xo, -CH 0R^xo, -NR^1XR¹²,

   2 p 2

   -NR^1OS(=0)₂R⁹, -ΝΗ^χο0(=0)Η⁹,

   b) skupina -CH₂OR^X4, ve které R¹⁴ je zbytek aminokyseliny po odstranění hydroxylové skupiny z karboxylové skupiny,

   c) skupina -NR^1OC(=0)NR^X1R¹², -CO_zR², -C(=O)R², -C(=0)NR^1:LR¹², -CH=N0R², -CH=NR⁹, - (CH ) NR^±XR¹²,

   -(CH ) NHR¹⁴ nebo -CH=NNR²R^2A, ve které R^2A má stejný význam 2 P jako R²,

   d) skupina -S(0) R²-(CH ) S(0) R⁹, -CH S(0) R¹⁴, ve které y j e 0, 1 nebo 2,

   e) alkylová skupina mající od 1 do 8 atomů uhlíku, alkenylová skupina mající od 2 do 8 atomů uhlíku a alkinylová skupina mající od 2 do 8 atomů uhlíku, kde

   1) jeden atom uhlíku nahradí atomem kyslíku, atomem dusíku nebo atomem síry,

   2) dva atomy uhlíku nahradí atomem síry a atomem dusíku, atomem kyslíku a atomem dusíku nebo dvěma atomy dusíku

   3) nebo se tři atomy uhlíku nahradí třemi atomy dusíku,

   R^x se volí z následujících případů:

   a) atom vodíku, substituovaná nebo nesubstituovaná alkylová skupina mající 1 až 4 atomy uhlíku, substituovaná nebo nesubstituovaná arylová skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná arylalkylová skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná heteroarylová skupina nebo substituovaná či nesubstituovaná heteroarylalkylová skupina,

   b) skupina -C(=O)R®, ve které se R® volí z případů alkylová skupina, arylová skupina a heteroarylová skupina,

   c) skupina -0R^xo, ve které R^xo se volí z případů atom vodíku a alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku,

   d) skupina -C(=O)NH , -NR^XXR^X2, - (CH ) NR^XXR^X2, - (CH ) 0R^xo,

   2 2 p 2 p?

   -O(CH ) 0R^xo a -O(CH ) NR^XXR^X2, ve které p je od 1 do 4 a ve 2 p 2 p které buď

   1-3 arylovými skupinami o 6-10 atomech uhlíku (včetně), přednostně fenylovou či naftylovou skupinou, heteroarylovou skupinou, atomem fluoru, atomem chloru, atomem bromu, atomem jodu, kyanoskupinou, nitroskupinou, hydroxylovou skupinou, skupinou OR⁹, -0(CH₂)_nNR^vR^e, -OCOR⁹, -OCONHR⁹, 0-tetrahydropyranylovou skupinou, aminoskupinou, skupinou -NR^R®, -NR^loC0R⁹, -NR^XOCC\R⁹, -NR^xoCO• ··· « · ·

   -·44» • ♦ * · » · ♦ · ·· ··

   NPJR⁰, -NHC(=NH)NH2, -NR^1oS02R^s, -S/OJ^R¹¹, kde R¹¹ je atom vodíku nebo alkylová skupina o 1-4 atomech uhlíku, arylová skupina o 6-10 atomech uhlíku, přednostně fenylová či naftylová skupina nebo heteroarylová skupina a y je 1 nebo 2, skupina -SR¹¹, -CO2R⁹, -CONR^VR⁸, -CHO, COR⁹, -CH2OR'⁷, -CH=NNR¹¹R¹², -CH=NOR^1X, -CH=NR⁹, -CH=NNHCH(N=NH)NH2, -SO2NR^x2R¹³, -PO(OR^xx)2 nebo OR¹⁴, kde R¹⁴ je zbytek aminokyseliny po odstranění hydroxylová skupiny z karboxylové skupiny a buď

   R¹² a R¹³ jsou nezávisle na sobě atom vodíku, alkylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně), arylová skupina o 6-10 atomech uhlíku, přednostně fenylová či naftylová skupina nebo heteroarylová skupina, nebo

   R¹² a R¹³ se spolu spojují s vytvořením spojovací skupiny, přednostně -(CH2)2-X¹-(CH2)₃,

   R³, R⁴, R⁸ a R⁶ jsou nezávisle na sobě atom vodíku, arylová skupina, přednostně arylová skupina o 6-10 atomech uhlíku (včetně), přednostněji fenylová skupina či naftylová skupina, heteroarylová skupina, atom fluoru, atom chloru, atom bromu, atom jodu, kyanoskupina, skupina CF3, nitroskupina, hydroxylová skupina, skupina -OR⁹, -O(CH2)_nNR^vR⁸, -OCOR⁹, -OCONHR⁹, , -ch2oh, -CH20R¹⁴, -NR^vR⁸, -NR^xoCOR⁹, -NR^1OC0NR^vR⁸, -SR¹¹, -S(O) R¹¹, kde y je 1 nebo 2, skupina -CO R⁹, -COR⁹, -CONR⁹R⁸, -CHO, -CH=NOR^X1, -CH=NR⁹, -CH=NNR^1XR¹², -(CH2)_nSR⁹, kde n je celé číslo 1 až 4 (včetně), skupina -(CH ) S(O) R⁹, -CH SR¹⁵, kde R¹⁵ je alkýlová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně), skupina -CH S(0) R¹⁴, -(CH ) NR⁷R^e, -(CH ) NHR¹⁴, alkylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), přednostně alt t t r kýlová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně), alkenylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), přednostně alkenylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně), alkinylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), přednostně alkinylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně) a buď každá alkylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), alkenylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně) nebo alkinylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně) je nesubstituovaná nebo každá alkylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), alkenylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně) nebo alkinylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně) je substituovaná, jak se popisuje výše,

   X je buď nesubstituovaná alkylenová skupina o 1-3 atomech uhlíku (včetně) nebo

   X je alkylenová skupina o 1-3 atomech uhlíku (včetně) substituovaná jednou skupinou R², přednostně skupinou QR¹⁰, -SR¹⁰, R¹⁵, kde R^1S je alkylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně), fenylová skupina, naftylová skupina, arylalkylová skupina o 7-14 atomech uhlíku (včetně), přednostně benzylová skupina nebo

   X je skupina -CH=CH-, -CH(OH)-CH(OH)-, -0-, -S(=0)-, -S(=0)_E-, -CR^1O)₂-, -C(=0)-, -C(=NOR^1X)-, -C(OR)¹¹)(R¹¹)-, -C(=0)CHR^1S-, -CHR^1SC(=O)-, -C(=N0R¹¹)CHR¹⁵-, CHR¹’⁵C(=N0R¹¹)-, -CH^Z-, -ZCH -CH ZCH kde Z je skupina CfOR¹¹)(R¹¹), atom kyslíku, atom síry, C(=0), C(=N0R^1:L) nebo NR¹¹, nebo » » » v · ·· · • · · ·«« · ·· •Λλ· ··· · ·· •150 - ·· ·· ·♦···

   A¹ a A² jsou společně a každý nezávisle dva atomy vodíku, atom vodíku a skupina -OR¹¹, atom vodíku a skupina -SR¹¹, atom vodíku a skupina -NR¹¹R¹², nebo spolu tvoří =S nebo =NR^1:L, B¹ a B² spolu tvoří atom kyslíku a všechny R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ a X se definují výše v c), d), e) a f) , nebo

   A¹ a A² spolu tvoří atom kyslíku, B¹ a B² jsou společně každý nezávisle dva atomy vodíku, atom vodíku a skupina -OR¹¹, atom vodíku a skupina -SR¹¹, atom vodíku a skupina -NR^irR¹² nebo spolu tvoří =S nebo =NR^1:L a všechny R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ a X se definují výše v c), d), e) a f).

   74. Způsob podle nároku 73, vyznačující se tím, že Α_χ, A₂, R_x, R₃ a jsou atomy vodíku, B a B_a společně tvoří atom kyslíku, je skupina CH^CH^OH, R^ a R_s je skupina OCH₃ a X je skupina CH₌.

   75. Způsob podle nároku 73, vyznačuj ící se tím, že A^, A₂, R^, R , R__ a R_e jsou atomy vodíku, Β_χ a B^ společně představují atom kyslíku, R^ je skupina CH₂CH₂OAc, R₄ je atom bromu a X je skupina CH₂.

   76. Způsob podle nároku 73, vyznačuj ící se t í m, že A^, A₂, R^, R₃, R__ a R_g jsou atomy vodíku, B_± a B₂ společně představují atom kyslíku, R._; je skupina CH₂CH₂OAc, R₄ je skupina CH₂CR₂(2-pyr) a X je skupina CH₃.

   77. Způsob podle nároku 73, vyznačující se tím, že A^ A_z, R_t, R₃, R_g a R_e jsou atomy vodíku, Β_χ a B₂ společně představují atom kyslíku, R₂ je atom vodí▼ * · · « · * 9 ·· • 49 99«4*9 • · ♦ · 9 99 49* ·♦ • Ί ft Ί · · ·· · · ·· ~ **D±* ~ 9« 94 ·*··· ku, R₄ je skupina CH^CH.. (2-pyrimidinyl) a X je skupina CH_a .

   78. Způsob podle nároku 73, vyznačující se tím, že A^ A , R , R , a R_g jsou atomy vodíku, B ^{a B}z společně představují atom kyslíku, R_a je atom vodíku, R^ je skupina CH^CH^(2-pyr) a X je skupina CH₌.

   79. Způsob podle nároku 73, vyznačující se tím, že Α_τ, A_a, R^, R_a, R₃, R_s a R_g jsou atomy vodíku, Β_χ a B₌ společně představují atom kyslíku, R^ je skupina CH₂CH₂(2-pyridazinyl) a X je skupina CH₌ .

   80. Způsob podle nároku 73, vyznačující se tím, že A^, A_a, R , R , R^, R__ a R_g jsou atomy vodíku, Β_χ a B_a společně představují atom kyslíku, R_a je skupina CH^CH^OH a X je skupina CH_a .

   81. Způsob podle nároku 73, vyznačující se tím, že Α_χ, A_a, R , R , R , R__ a R_g jsou atomy vodíku, a B_a společně představují atom kyslíku, R_a je skupina CH^CH^OH a X je skupina CH_a.

   82. Způsob podle nároku 73, vyznačující se tím, žeA,A,R,R,R,R,R aR jsou atomy vodíku, Β_χ a B_a společně představují atom kyslíku a X je skupina síry.

   83. Způsob podle nároku 73, vyznačující se tím, že Α_χ, A_z, R^, R_a, R^, R_g a R_g jsou atomy vodíku, Β_χ a B_a společně představují atom kyslíku, R^ je skupina CH^CH^CH^NHCO[4-(OH)Ph] a X je skupina CH₂ .

   84. Způsob podle nároku 73, vyznačující tím, žeA,A,R,R,R,R a R jsou atomy vodíku, Β_χ a B^ společně představují atom kyslíku, R_a je skupina CH^CH^OH a X je skupina CH_a.

   85. Způsob podle nároku 72, vyznačuj ící se t í m, že tato sloučenina má obecný vzorec

   R1 ve kterém kruh B a kruh F se nezávisle na sobě, každý spolu s atomy uhlíku, ke kterému se připojuje, volí z následujících případů

   a) nenasycený šestičlenný karbocyklický aromatický kruh, ve kterém se mohou 1 až 3 atomy uhlíku nahradit atomy dusíku,

   b) nenasycený pětiČlenný karbocyklický aromatický kruh a

   c) nenasycený pětičlenný karbocyklický aromatický kruh, ve kterém se

   1) každá alkylová, alkenylová nebo alkinylová skupina je nesubstituovaná nebo

   2) každá alkylová, alkenylová nebo alkinylová skupina je substituovaná 1 až 3 skupinami zvolenými z případů: arylová skupina o 6 až 10 atomech uhlíku, heteroarylová skupina, arylalkoxyskupina, heterocykloalkoxyskupina, hydroxyalkoxyskupina, alkoxy-alkoxyskupina, hydroxyalkylthioskupina, alkoxy-alkylthioskupina, atom fluoru, atom chloru, atom bro134 • « · · ♦ ·»♦ * * * * · * · · · 4 · · · * * ··* ·*· · · · ·· 9 ·♦ «· ·· «· · mu, atom jodu, kyanoskupina, nitroskupina, hydroxylová skupina, skupina -0R⁹, -X²(CH ) NR^XXR^X2, -X² (CH ) C (=0) NR^x:LR^x2, -X²(CH ) 0C(=0)NR^XXR^X2, -X²(CH ) CO R⁹, -X²(CH ) S(0) R⁹, -X²(CH ) NR^xoC(0)NR^y;iRⁱ², -OC(=O)R⁹, -0C0NHR², -0-tetraΞ jp hydropyranylová skupina, skupina -NR^XXR^X2, -NR^XQC(=0)R⁹, -NR^xoC02R⁹, -NR^xoC(=0)NR^xxR^x2, -NHC(=NH)NH2, NR^xoS(0)₂R⁹, -S(0) R⁹, -CO R², -C(=O)NR^XXR^X2, -C(=0)R², -CH 0R^xo, y 2 2

   -CH=NNR²R^2a, -CH=N0R², -CH=NR⁹, -CH=NNHCH(N=NH)NH2, -S(=0)2NR²R^2A, -P(=O)(0R^xo)2, -0R^X4 a monosacharidová skupina mající 5 až 7 atomů uhlíku, ve které je každá hydroxylová skupina monosacharidu nezávisle bud' nesubstituovaná nebo nahrazená atomem vodíku, alkylovou skupinou o 1 až 4 atomech uhlíku, alkylkarbonyloxyskupinou o 2 až 5 atomech uhlíku nebo alkoxyskupinou o 1 až 4 atomech uhlíku,

   X² je atom kyslíku, atom síry nebo skupina NR^iO,

   R⁷ a R^e se nezávisle na sobě volí z případů atom vodíku, alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku, alkoxyskupina o 1 až 4 atomech uhlíku, substituovaná či nesubstituovaná arylalkylová skupina o 6 až 10 atomech uhlíku, substituovaná Či nesubstituovaná heteroarylalkylová skupina, skupina -(CH2)p0R^xo, -(-CHa)_p0C(=0)NR^XXR^X2 a -(CHa)^NR^XXR^X2 nebo R⁷ a R^s spolu vytvářejí spojovací skupinu obecného vzorce -CH2-X³-CH₂-, ve které X³ je X² nebo vazba, man jsou nezávisle na sobě 0, 1 nebo 2,

   Y se volí z případů -0-, -S-, -N(R^XO)-, -N*(0 )(R^xo)-,

   -N(0R^xo)- a -CH₂-,

   Z se volí z případů vazba, -0-, -CH=CH-, -S-, -C(=0) * · « · · * « · • · * ··»· B « ·

   - 135 - ·· · ........

   -CH(OR^xo)-, -N(R^XO)-, -NťOR¹⁰)-, CH(NR^X1R¹²)-, -C(=O)N(R^T7)-N(R^X7)C(=0)-, -N(S(0) R⁹)-, y

   -N(S (O)^NR¹’R^J2) - , -N(C(=0)R¹⁷)-, -C (R^X5R^XS) - ,

   -N*(0“)R^XO)-CH(OH)-CH(OH)- a

   -CH(O(C=O)R⁹)CH(OC(=O)R^9A)-, kde R^9a má stejný význam jako R⁹,

   R¹⁵ a R^ltí se navzájem nezávisle volí z případů atom vodíku, hydroxylová skupina, skupina -C(=0)R^xO, -O(C=O)R⁹, hydroxyalkylová skupina a skupina -CO^R*⁰,

   R¹⁷ se volí z případů atom vodíku, alkylová skupina, arylová skupina a heteroarylová skupina,

   A^x a A² se volí z případů 2 atomy vodíku, atom vodíku a skupina OR², atom vodíku a skupina -SR², atom vodíku a skupina -N(R²)₂ a skupina, ve které A^x a A² spolu vytvářejí zbytek zvolený z případů =0, =S a =NR²,

   B¹ a B ² se volí z případů 2 atomy vodíku, atom vodíku a skupina -OR², atom vodíku a skupina -SR², atom vodíku a skupina -N(R²)₂ a skupina, ve které B¹ a B² vytvářejí zbytek zvolený z případů =0, =S a =NR², s podmínkou, že alespoň jeden z párů A¹ a A² nebo B^x a B² tvoří --0.

   30. Způsob pozměňování aktivity kinasového proteinu s násobnou vazbou, vyznačující se tím, že se tento protein nebo buňka obsahující tento protein uvádí do styku se sloučeninou obecného vzorce • »*

   - 136 ve kterém

   Z je atom vodíku a Z₂ je atom vodíku nebo Z^ a Z₂ spolu vytvářejí =0,

   R¹ se volí z případů atom vodíku, atom chloru,

   CH SO C H , atom bromu, CH S(CH ) NH ,

   2225 2222

   CH S(CH ) N(CH ) , CH S(CH ) NH , n-C H ,

   2 2 2 3 2 ' 2 2 2 2 ' 49

   NHCONHC H , NHCONHC H , CH SC H , CH SC Η , N(CH ) , es 2 3 2 2 5 2 e532

   CH , CH OCONHC H , NHCO CH , CH OC H , CH N(CH ),

   OH, O-(n-propylová) skupina, CH=NNH-C(=NH)NH^, CH=N-N(CH ) , CH S(CH ) NH-(n-C H ), CH OCH OCH CH , CH₂S[3-(1,2,4-triazin)], CH₂CH₂SCH₃, • · ♦··

   - 137 ·«*

   A—N

   CH=N—N

   CH=N— r~\

   N O <_/

   CH2CH2CH2—N a

   R,, se zvolí z případů atom vodíku, atom bromu, atom chloru, atom jodu, skupina CH^S (CH_J _,N (CH J , NHCONHC Η , CH SC Η , CH OCH OCH CH , CH S[3-3 r= ' r? ~i a ' -j —> —> -a ' 1 • · ·

   - 138 -(1,2,4-triazin)], CH CH SCH a CH OH,

   X se zvolí z případu atom vodíku, skupina CH₂OH,

   CH N-serin, CO CH , CONHC H , CH NHCO C H ,

   CH NHCO CH , CH N , CONHC H , CH NH-glycin,

   2 2 3 23 2S 2 -^{1 J}'

   CON(CH ) , -CH NHCO CONH , CONHC H , CH NH-serin,

   3 2 2 2 2 3 72

   CH₂SOCH₃, CH=NOH, CH_NH-Prolin, CH^CH^(2-pyridyl), CH=NNHC(=NH)NH₂, CONH(CH₂)₃OH, CH=NNHCONH₂, CH OCOCH , -CH OC(CH ) 0-, CH SC H , CH SOC H ,

   2 3 2 3 2 265 265

   C0₂(n-hexylová) skupina, CONHCH₃ a C0₂(CH₂)^CH₃ nebo ze skupin následujících vzorců a

   R se zvolí z případů hydroxylová skupina a skupina

   OCH₃.

   31. Způsob podle nároku 30, vyznačuj ící se t í m, že Z a Z jsou atomy vodíku, X je skupina CO^CH^, R_x je skupina NHCONHC^H^, R₌ je CH^CH^(2-pyridylová) skupina a R je hydroxylová skupina.

   • « • ···

   - 139

   32. Způsob podle nároku 30, vyznačuj ící se t í m, že Z^ a Z₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂CH₃, a R^ jsou skupiny CH^OCf^OCH^CH^ a R je hydroxylová skupina.

   33. Způsob podle nároku 30, vyznačuj ící se t í m, že Z a Z₂ jsou atomy vodíku, X je skupina C0₂CH₃, a R₂ jsou skupiny CH^SCH^CH.^ a R je hydroxylová skupina.

   34. Způsob podle nároku 30, vyznačuj ící se t í m, že Ζ_χ, Z₂, R^ a R₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   35. Způsob podle nároku 30, vyznačuj ící se tím, že Ζ_χ, Z₂, R_x a R₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO (CH )₄CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   36. Způsob podle nároku 30, vyznačuj ící se t i m, že Ζ_χ( Z₂ a R_x jsou atomy vodíku, R₂ je skupina CH^OH, X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   37. Způsob podle nároku 30, vyznačující se t í m, že Z^ a Z₂ jsou atomy vodíku, R a R₂ jsou skupiny H_aS[3-(1,2,4-triazin)], X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   38. Způsob podle nároku 30, vyznačuj ící se t í m, že Z^ a Z₂ jsou atomy vodíku, R je atom bromu, R₂ je atom jodu, X je skupina CO_,CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   - 140 ’ * · ··· • « · ·« ♦

   39. Způsob podle nároku 30, vyznačuj ící se t í m, že Ζ_χ a Z₂ jsou atomy vodíku, R a R₂ jsou skupiny CH^CH^SCH^, X je skupina CO^CH^ a R je hydroxylová skupina.

   40. Způsob podle nároku 30, vyznačuj ící se t í m, že Z_;, Z₂, R_l a R₂ jsou atomy vodíku, X je skupina CO₂CH₃ a R je skupina 0CH₃.

   41. Způsob podle nároku 30, vyznačuj ící se t í m, že Z a Z₂ spolu tvoří =0, a R₂ jsou atomy bromu, X je skupina CO₂CH₃ a R je hydroxylová skupina.

   42. Způsob pozměňování aktivity proteinu kinasy s násobnou vazbou, vyznačující se tím, že se tento protein nebo buňka obsahující tento protein uvádí do styku se sloučeninou obecného vzorce ve kterém

   - 141 • * «ί* • i · ··* «·«··* « • a · ·« ·· ·» ··· je atom vodíku a Z₂ je atom vodíku nebo Ζ_χ a Z₂ spolu tvoří =0.

   R_x je atom vodíku nebo atom bromu,

   R₂ je atom vodíku,

   R je atom vodíku, skupina CH CH=CH , CH CH CH OH nebo

   CH CH CH —N \) ^{2 2 2} w a

   R₄ je atom vodíku, skupina CH₂CH=CH₂, CH₂CH₂CH₂OH.

   43. Způsob podle nároku 42, vyznačuj ící se tím, že R_x, R₂, Ζ_χ a Z₂ jsou atomy vodíku a R₃ je skupina CH₂CH=CH₂.

   44. Způsob podle nároku 42, vyznačuj ící se tím, že R je atom bromu a R , R , R , Z a Z jsou atomy vodíku.

   45. Způsob podle nároku 42, vyznačuj ící se t í m, že R_x, R₂, Ζ_χ a Z₂ jsou atomy vodíku a R₃ a R₄ jsou skupiny CH₂CH=CH₂.

   46. Způsob podle nároku 42, vyznačuj ící se t í m, že R_x, R₌, R , Ζ_χ a Z₌ jsou atomy vodíku a je skupina CH₂CH=CH₃.

   47. Způsob podle nároku 42, vyznačuj ící se tím, že R , R , Z aZ jsou atomy vodíku a R a R ^ř X 2 X 2 ^{J J} 3 4

   - 142 jsou skupiny CH^CH^CH^OH nebo R , R , R , Ζ_χ a jsou atomy vodíku a R je skupina CH CH CH —N 0 ³ 2 Ξ Ξ \/

   48. Způsob identifikace sloučeniny, kterou lze použít při léčení neurodegenerativní poruchy, vyznačující se t í m, že se buňka nebo buněčný extrakt obsahující kinasový protein s násobnou vazbou uvede do styku se sloučeninou a stanoví se, zda tato sloučenina snižuje aktivitu tohoto kinasového proteinu s násobnou vazbou.

   49. Způsob podle nároku 48, vyznačuj ící se t í m, že se tento protein volí ze skupiny zahrnující kinasu s násobnou vazbou 1, kinasu s násobnou vazbou 2, kinasu s násobnou vazbou 3, kinasu nesoucí leucinový zipper, kinasu nesoucí dvojitý leucinový zipper a kinasu s násobnou vazbou 6.

   50. Způsob podle nároku 49, vyznačuj ící se t í m, že se tyto buňky přivádějí do styku in vitro.

   51. Způsob podle nároku 49, vyznačuj ící se t í m, že se tyto buňky přivádějí do styku in vivo.

   52. Způsob podle nároku 49, vyznačuj ící se t í m, že se tento protein stanovuje měřením aktivity nebo stavu fosforylace substrátu tohoto proteinu.

   53. Způsob podle nároku 52, vyznačuj ící se t í m, že se tento substrát volí ze skupiny zahrnující JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, p38a, p38S, p38gama, p385, MEK1, MEK2, MKK3, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2 , ELK1 a savčí homolog AEX-3.

   143

   • a • · • a • • * • * a • • · • · a • a 9 • • • • a a « * « ·· • a et a·*

   54. Způsob podle nároku 49, vyznačuj ící se t í m, že se aktivita tohoto proteinu stanoví měřením aktivity substrátu tohoto proteinu, množství substrátu tohoto proteinu nebo mRNA kódující tento substrát nebo tento protein.

   55. Způsob podle nároku 49, vyznačuj ící se t í m, že se tato aktivita proteinu určí kinasovým rozborem nebo vazebným rozborem in vitro.

   56. Způsob podle nároku 49, vyznačuj ící se t í m, že tyto buňky jsou primární embryonální motoneuronové buňky.

   57. Způsob podle nároku 49, vyznačuj ící se t í m, že tyto buňky nadměrně exprimují tento kinasový protein s násobnými vazbami.

   58. Způsob podle nároku 49, vyznačuj ící se t í m, že touto buňkou je neuronová buňka.

   59. Způsob podle nároku 49, vyznačuj ící se t í m, že tato neuronová buňka je postižená neurodegenerativním onemocnění.

   60. Způsob identifikace sloučeniny, který může být použitelný při léčení zánětu, vyznačující se tím, že se buňka nebo buněčný extrakt obsahující kinasový protein s násobnou vazbou uvádí do styku se sloučeninou a stanoví se, zda tato sloučenina snižuje aktivitu tohoto kinasového proteinu s násobnou vazbou.

   ♦ · · ♦ ··· ···· · · ♦

   -••14*1 - .........

   61. Způsob podle nároku 60, vyznačuj ící se t í m, že se tento protein volí ze skupiny zahrnující kinasu s násobnou vazbou 1, kinasu s násobnou vazbou 2, kinasu s násobnou vazbou 3, kinasu nesoucí leucinový zipper, kinasu nesoucí dvojitý leucinový zipper a kinasu s násobnou vazbou 6.

   62. Způsob podle nároku 61, vyznačuj ící se t í m, že se tyto buňky přivádějí do styku in vitro.

   63. Způsob podle nároku 61, vyznačuj ící se t í m, že se tyto buňky přivádějí do styku in vivo.

   64. Způsob podle nároku 61, vyznačuj ící se t í m, že se aktivita tohoto proteinu stanovuje měřením aktivity nebo stavu fosforylace substrátu tohoto proteinu .

   65. Způsob podle nároku 64, vyznačující se t í m, že se tento substrát volí ze skupiny zahrnující JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, p38a, p38£, p38gama, ρ38δ, MEK1, MEK2, MKK2, MKK4 (SEK1) , MEK5, NIKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1 a savčí homolog AEX-3.

   66. Způsob podle nároku 61, vyznačuj ící se t í m, že se aktivita tohoto proteinu stanoví měřením aktivity substrátu tohoto proteinu, množství substrátu tohoto proteinu nebo mRNA kódující tento substrát nebo tento protein.

   67. Způsob podle nároku 61, vyznačuj ící se t í m, že se tato aktivita proteinu určí kinasovým rozborem in vitro nebo vazebným rozborem.

   • ··· «·· ·>··♦*·

   -•145 - .........

   68. Způsob podle nároku 61, vyznačuj ící se t í m, že tyto buňky jsou primární embryonální motoneuronové buňky.

   69. Způsob podle nároku 61, vyznačuj ící se t í m, že tyto buňky nadměrně exprimují tento kinasový protein s násobnými vazbami.

   70. Způsob podle nároku 61, vyznačuj ící se t í m, že touto buňkou je neuronová buňka.

   71. Způsob podle nároku 610, vyznačuj ící se t í m, že je tato buňka postižená zánětem.

   72. způsob léčení savce s neurodegenerativní poruchou, vyznačující se tím, že se tomuto savci podává sloučenina, která inhibuje kinasový protein s násobnou vazbou ve farmaceuticky přijatelné soli či zřeďovacím prostředku.

   73. Způsob podle nároku 72, vyznačuj ící se t í m, že tato sloučenina má obecný vzorec • · ·

   -·14β - • 4 ··« ·· • · 4 4 · ♦♦ • 4 4 · ·· • 4 ·44 4· · ve kterém

   Ε¹ a Ε² nezávisle na sobě spolu s atomy uhlíku, ke kterým se připojují, vytvářejí buď nenasycený 6-členný karbocyklický aromatický kruh, ve kterém jeden až tři atomy uhlíku mohou být nahrazeny atomy dusíku nebo nenasycený 5-členný karbocyklický aromatický kruh, ve kterém buď jeden atom uhlíku je nahrazen atomem kyslíku, dusíku nebo síry nebo dva atomy uhlíku jsou nahrazeny atomem síry a atomem dusíku nebo atomem kyslíku a atomem dusíku,

   A¹ a A² spolu představují 0 a B¹ a B² spolu představují 0,

   R¹ je atom vodíku, alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku (včetně), arylová skupina, arylalkylová skupina, heteroarylová skupina a heteroarylalkylová skupina, skupina COR⁹, kde R⁹ je alkylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně), nebo arylová skupina, přednostně fenylová či naftylová skupina, skupina -0R^TO, kde R¹⁰ je atom vodíku nebo alkylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně), skupina -C0NH₂, -NR^R⁸, -(CH ) NR^VR⁸, kde n je celé číslo 1-4 (včetně) nebo skupina -0(CH ) NR⁷R^a a buď

   R^v a R^B nezávisle na sobě jsou atom vodíku nebo alkylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně) nebo

   R^v a R^s se spolu spojují s vytvořením spojovací skupiny obecného vzorce -(CH^)^-X¹-(CH^)₂-, kde X¹ je atom kyslíku, atom síry nebo skupina CH^, je atom vodíku, skupina -SO₂R⁹, -CO^R⁹, -COR⁹, alkylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), přednostně alkylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně), alkenylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), přednostně alkenylová skupina o 1-4 atomech uhlíku (včetně) nebo alkinylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), přednostně alkmylova skupina o a t omech uhlíku (včetně) nebo monosacharid o 5-7 atomech uhlí ku (včetně), kde každá hydroxylová skupina monosacharidu nezávisle je bud' nesubstituovaná nebo je nahrazena atomem vodíku, alkylovou skupinou o 1-4 atomech uhlíku (včetně), alkylkarbonyloxyskupinou o 2-5 atomech uhlíku (včetně) nebo alkoxyskupinou o 1-4 atomech uhlíku (včetně) a bud' každá alkylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), alkenylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně) nebo alkinylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně) je nesubstituovaná nebo každá alkylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně), alkenylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně) nebo alkinylová skupina o 1-8 atomech uhlíku (včetně) je nezávisle na sobě substituovaná

   1) R^xx a R^x2 se zvolí nezávisle na sobě z případů atom vodíku a alkylová skupina mající 1 až 4 atomy uhlíku nebo

   2) R^xx a R^x2 spolu vytvářejí spojovací skupinu obecného vzorce -(CH2)2-X^x-(CH2)₂-, ve kterém se X^x volí z případů -0-, -S- a -CH₂-,

   R² se volí z případů atom vodíku, alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku, hydroxylová skupina, alkoxyskupina o 1 až 4 atomech uhlíku, skupina -OC(=O)R®,

   - 133 • ··«

   -OC(=0)NR^X1R¹², -O(CH ) NR^X1R¹², -O(CH ) 0R^xo, sub² l^{3 2} F>

   stituovaná či nesubstituovaná arylalkylová skupina o 6 až 10 atomech uhlíku a substituovaná či nesubstituovaná heteroarylalkylová skupina,

   R³, R⁴, R⁵ a R^e se navzájem nezávisle volí z následujících případů:

   a) atom vodíku, arylová skupina, heteroarylová skupina, atom fluoru, atom chloru, atom bromu, atom jodu, kyanoskupina, skupina CF₃, nitroskupina, hydroxylová skupina, skupina

   OR⁹, -O(CH ) NR^1:LR¹², -0C(=0)R⁹, -OC (=0) NR²R^V, -OC(=O)NR^1:LR^X2, -O(CH ) 0R^xo, -CH 0R^xo, -NR^XXR^X2,

   2 jp 2

   -NR^XOS(=0)₂R⁹, -NR^xoC(=0)R⁹,

   b) skupina -CH₂0R^X4, ve které R^X4 je zbytek aminokyseliny po odstranění hydroxylové skupiny z karboxylové skupiny,

   c) skupina -NR^xoC(=0)NR^xxR^x2, -CO^R², -C(=O)R², -C^ONR^R¹², -CH=N0R², -CH=NR⁹, - (CH ) NR^XXR^X2,

   2 p

   -(CH^) NHR^X4 nebo -CH=NNR²R^2A·, ve které R^2A má stejný význam j ako R²,

   d) skupina -S(0) R²-(CH ) S(0) R⁹, -CH S(0) R^X4, ve které y je 0, 1 nebo 2,

   e) alkylová skupina mající od 1 do 8 atomů uhlíku, alkenylová skupina mající od 2 do 8 atomů uhlíku a alkinylová skupina mající od 2 do 8 atomů uhlíku, kde

   1) jeden atom uhlíku nahradí atomem kyslíku, atomem dusíku nebo atomem síry,

   2) dva atomy uhlíku nahradí atomem síry a atomem dusíku, atomem kyslíku a atomem dusíku nebo dvěma atomy dusíku

   3) nebo se tři atomy uhlíku nahradí třemi atomy dusíku,

   R^x se volí z následujících případů:

   a) atom vodíku, substituovaná nebo nesubstituovaná alkylová skupina mající 1 až 4 atomy uhlíku, substituovaná nebo nesubstituovaná arylová skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná arylalkylová skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná heteroarylová skupina nebo substituovaná či nesubstituovaná heteroarylalkylová skupina,

   b) skupina -C(=O)R®, ve které se R® volí z případů alkylová skupina, arylová skupina a heteroarylová skupina,

   c) skupina -0R^xo, ve které R^xo se volí z případů atom vodíku a alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku,

   d) skupina -C(=O)NH₂, -NR^xxR^x2, - (CHJpNR^xxR¹², - (CHJp0R^xo, -O(CH ) 0R^xo a -O(CH ) NR^XXR¹², ve které p je od 1 do 4 a ve které buď

   1. Způsob indentifikace sloučeniny, která pozměňuje aktivitu kinasového proteinu s násobnými vazbami a podporuje přežívání buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

   (a) uvedení těchto buněk, které obsahují tento kinasový protein s násobnými vazbami, do styku s touto sloučeninou, (b) stanovení, zda tato sloučenina snižuje aktivitu tohoto kinasového proteinu s násobnou vazbou a (c) stanovení, zda tato sloučenina podporuje přežívání buněk .

   2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se tento protein volí ze skupiny zahrnující kinasu s násobnou vazbou 1, kinasu s násobnou vazbou 2, kinasu s násobnou vazbou 3, kinasu nesoucí leucinový zipper, kinasu nesoucí dvojitý leucinový zipper a kinasu s násobnou vazbou

   6.

   3. Způsob podle nároku 2, vyznačuj ící tím, že se tyto buňky přivádějí do styku in vitro.

   4. Způsob podle nároku 2, vyznačuj ící tím, že se tyto buňky přivádějí do styku in vivo.

   5. Způsob podle nároku 2,vyznačuj ící se tím, že se tento protein stanovuje měřením aktivity nebo stavu fosforylace substrátu tohoto proteinu.

   6. Způsob podle nároku 5,vyznačuj ící se tím, že se tento substrát volí ze skupiny zahrnující JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, p38a, p38S, p38gama, p38ó,

   128

   MEK1, MEK2 , MKK3, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1 a savčí homolog AEX-3,

   7. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se aktivita tohoto proteinu stanoví měřením aktivity substrátu tohoto proteinu, množství substrátu tohoto proteinu nebo mRNA kódující tento substrát nebo tento protein ,

   8. Způsob podle nároku 2,vyznačující se tím, že se tato aktivita proteinu určí kinasovým rozborem nebo vazebným rozborem in vitro.

   9. Způsob podle nároku 2,vyznačující se tím, že se tato podpora přežívání buněk určí použitím buněk s rizikem zániku a srovnáním množství žijících buněk, které byly v kontaktu s touto sloučeninou, s množstvím žijících buněk, které nebyly v kontaktu s touto sloučeninou.

   10. Způsob podle nároku 9,vyznačující se tím, že tyto buňky jsou primární embryonální motoneuronové buňky.

   11. Způsob podle nároku 9,vyznačující se tím, že tyto buňky nadměrně exprimují tento kinasový protein s násobnými vazbami.

   12. Způsob podle nároku 2,vyznačující se tím, že se tato podpora přežívání buněk stanoví pozorováním poklesu apoptosy.

   13. Způsob podle nároku 2, vyznačuj ící tím, že touto buňkou je neuronová buňka.

   129 • 4

   4 · 4 4 444 • « 4 * * 4 4 4* 4 4 • · • 4 44 « ·

   14. Způsob podle nároku 2,vyznačující se tím, že tato buňka je postižená neurodegenerativním onemocněním.

   15. Způsob indentifikace sloučeniny, která pozměňuje aktivitu kinasového proteinu s násobnými vazbami a podporuje zánik buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

   (a) uvedení těchto buněk, které obsahují tento kinasový protein s násobnými vazbami, do styku s touto sloučeninou, (b) stanovení, zda tato sloučenina zvyšuje aktivitu tohoto kinasového proteinu s násobnou vazbou a (c) stanovení, zda tato sloučenina podporuje zánik buněk.

   16. Způsob podle nároku 15, vyznačuj ící se t í m, že se tento protein volí ze skupiny zahrnující kinasu s násobnou vazbou 1, kinasu s násobnou vazbou 2, ki nasu s násobnou vazbou 3, kinasu nesoucí leucinový zipper, kinasu nesoucí dvojitý leucinový zipper a kinasu s násobnou vazbou 6.

   17. Způsob podle se t í m, že se tyto

   18. Způsob podle se t í m, že se tyto nároku 16, v y z n buňky přiváděj í do nároku 16, v y z n buňky přiváděj í do a č u j ící styku in vitro.

   a č u j ící styku in vivo.

   19. Způsob podle nároku 16, vyznačuj ící se t í m, že se aktivita tohoto proteinu stanovuje měře ním aktivity substrátu tohoto proteinu.

   20. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící

   130

   4 4 4 · · 4 4 4 · ·· • · 4 44 4 ··· *·

   444 4444 44* • 4 4 4 4 ·· 444 4 4 se t i m, že se tento substrát volí ze skupiny zahrnující JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, p38tt, p38S, p38gama, ρ38δ, MEK1, MEK2, MKK3, MKK4 (SEK1), MEK5, MKK6, MKK7, jun, ATF2, ELK1 a savčí homolog AEX-3.

   21. Způsob podle nároku 16, vyznačuj ící se t í m, že se aktivita tohoto proteinu stanoví měřením aktivity substrátu tohoto proteinu, množství tohoto proteinu nebo mRNA kódující tento protein.

   22. Způsob podle nároku 16, vyznačuj ící se t í m, že se tato aktivita proteinu určí kinasovým rozborem nebo vazebným rozborem in vitro.

   23. Způsob podle nároku 16, vyznačuj ící se t í m, že se tato podpora přežívání buněk určí použitím buněk s rizikem zániku a srovnáním množství žijících buněk, které byly v kontaktu s touto sloučeninou s množstvím žijících buněk, které nebyly v kontaktu s touto sloučeninou.

   24. Způsob podle nároku 23, vyznačuj ící se t í m, že tyto buňky jsou primární embryonální motoneuronové buňky.

   25. Způsob podle nároku 23, vyznačuj ící se t í m, že tyto buňky nadměrně exprimují tento kinasový protein s násobnými vazbami.

   26. Způsob podle nároku 16, vyznačuj ící se t í m, že se tato podpora přežívání buněk stanoví pozorováním vzrůstu apoptosy.

   27. Způsob podle nároku 16, vyznačuj ící

   131 se t ί m, že touto buňkou je neuronová buňka.

   28. Způsob podle nároku 16, vyznačuj ící se t í m, že tato buňka je postižená neurodegenerativním onemocněním.

   29. Způsob pozměňování aktivity kinasového proteinu s násobnou vazbou, vyznačující se tím, že se tento protein nebo buňka obsahující tento protein uvádí do styku se sloučeninou obecného vzorce

   Rl ve kterém kruh B a kruh F se nezávisle na sobě, každý spolu s atomy uhlíku, ke kterému se připojuje, volí z následujících případů

   a) nenasycený šestičlenný karbocyklický aromatický kruh, ve kterém se mohou 1 až 3 atomy uhlíku nahradit atomy dusíku, * ♦··

   - 132 - ..... ..

   b) nenasycený pětičlenný karbocyklický aromatický kruh a

   c) nenasycený pětičlenný karbocyklický aromatický kruh, ve kterém se
2. 2 2 2 12 4

   Ζ_χ a Z₌ jsou atomy e skupina CH CH CH—N O ^F 222 f

   JUDr. Petr Kalenský