NO325689B1

NO325689B1 - Kondenserte pyrrolokarbazoler, samt anvendelser og farmasoytiske preparater

Info

Publication number: NO325689B1
Application number: NO20030845A
Authority: NO
Inventors: Robert L Hudkins; Diane E Gingrich
Original assignee: Cephalon Inc
Priority date: 2000-08-25
Filing date: 2003-02-24
Publication date: 2008-07-07
Also published as: WO2002017914A3; HK1053989A1; BG107659A; ES2250463T3; PL365683A1; US6630500B2; DE60114215D1; US20020061920A1; ATE306920T1; AU8520501A; BR0113776A; EP1311263A2; NO20030845D0; CA2420592A1; IL154590A0; EA200300293A1; US20030203957A1; DK1311263T3; EP1311263B1; NZ524288A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår generelt utvalgte kondenserte pyrrolkarbazoler, innbefattende anvendelser og farmasøytiske preparater derav, Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot mellomprodukter og fremgangsmåter for fremstilling av disse kondenserte pyrrolkarbazoler.

Forskjellige syntetiske små organiske molekyler som er biologisk aktive og alminnelig kjent på området som "kondenserte pyrrolkarbazoler", er blitt fremstilt (se US-patenter nr. 5 475 110, 5 591 855, 5 594 009 og 5 616 724). Dessuten beskriver US-patent nr. 5 705 511 kondenserte pyrrolkarbazolforbindelser som har mange forskjellige funksjonelle farmakologiske virkninger. De kondenserte pyrrolkarbazoler ble beskrevet anvendt på mange forskjellige måter, innbefattende: forsterkning av virkningen og/eller overlevelsen av celler i neuronlinjen, enten alene eller i kombinasjon med neurotrofisk(e) faktor(er) og/eller indolkarbozoler; forsterking av trofisk faktor-indusert aktivitet; inhibering av proteinkinase C-("PKC")-aktivitet; inhibering av frfr-tyrosinkinaseaktivitet; inhibering av proliferasjon av en prostatakreft-cellelinje; inhibering av de cellulære veier som inngår ved inflammasjonsprosessen; og forøking av overlevelsen av nerveceller som står i fare for å dø.

De nærværende oppfinnere har funnet at visse utvalgte kondenserte pyrrolkarbazoler valgt blant de generiske formler ifølge US-patent nr. 5 705 511, men ikke spesifikt beskrevet i denne, har overraskende og uventede biologiske virkninger sammenliknet med forbindelsene beskrevet i US-patent nr. 5 705 511.

Følgelig er ett formål med oppfinnelsen å tilveiebringe nye kondenserte pyrrolkarbazolforbindelser representert ved den generelle formel I:

hvor: R<1> og R<2> er de samme eller forskjellige og uavhengig er valgt blant H eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, eller -OR4 hvor R<4> er et alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl eller resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; og

R<3> er -CH2OH; -CH2OR<7>; -(CH2)nSR<5>; -(CH2)nS(0)yR<5>; -CH2SR<5>; eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, -OR<5>, -OR<8>,

-CH2OR<7>, -S(0)yR<6> eller -SR<6>; og hvor

R<5> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl;

R<6> er H, alkyl med 1 -4 karbonatomer (inklusiv) eller aryl med 6-10 karbonatomer;

R<7> er H eller alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv);

R<8> er resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet;

n er et helt tall på 1 -4 (inklusiv); og

y er 1 eller 2, med det unntak at når R<1> er (CH2)3OH og R2 er H, da er R<3> ikke

-CH2OH, -CH2OCH2CH3 eller -CH2SCH2CH3.

Foretrukne kondenserte pyrrolkarbazoler ifølge oppfinnelsen er representert ved følgende formel II:

hvor:

R<1> og R<2> er de samme eller forskjellige og er uavhengig valgt blant H eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, eller -OR4 hvor R4 er et alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl eller resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; og

R<3> er -CHzOH; -CH2OR<7>; -(CH2)nSR5;-(CH2)nS(0)yR<5>; -CH2SR<5>; eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, -OR<5>, -OR<8>,

-CH2OR<7>, -S(0)yR<6> eller SR<6>; og hvor

R<5> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv) pyridyl eller pyrimidyl;

R<6> er H, alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv) eller aryl med 6-10 karbonatomer;

R<7> er H eller alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv);

n er et helt tall på 1 -4 (inklusiv); og

y er 1 eller 2, med det unntak at når R<1> er (CH2)3OH og R<2> er H, da er R<3 >ikke -CH2OH, -CH2OCH2CH3 eller-CH2SCH2CH3.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre forbindelser ifølge formel I eller II som er representert i tabellen under:

De kondenserte pyrrolkarbazoler ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes på mange forskjellige måter, innbefattende: til inhibering av angiogenese; som antitumormidler; til forøking av funksjonen og/eller overlevelsen av celler i neuronlinjen, enten enkeltvis eller i kombinasjon med neurotrofisk(e) faktor(er) og/eller indolkarbozoler; forøking av trofisk faktor-indusert aktivitet; inhibering av kinaser; inhibering av vaskulær endotelial vekstfaktor-reseptor-(VEGFR)-kinase, fortrinnsvis VEGFR2; inhibering av blandet-linje-kinase (MLK); fr/c-kinase; inhibering av blodplate-avledet vekstfaktor-reseptor-(PDGFR)-kinase; inhibering av NGF-stimulert f/fr-fosforylering; inhibering av proteinkinase C-("PKC")-aktivitet; inhibering av fr/c-tyrosinkinaseaktivitet; inhibering av proliferasjon av en prostatakreft-cellelinje; inhibering av celleveier som inngår ved inflammasjonsprosessen; og øking av overlevelsen av neuronceller som er i fare for å dø. Dessuten kan de kondenserte pyrrolkarbazoler være anvendelige for inhibering av c-met, c-kit og mutert Flt-3-holdige indre tandem-duplikasjoner i juxtamembran-doménet. På grunn av disse varierte aktiviteter, finner de beskrevne forbindelser anvendelse innenfor mange forskjellige rammer, innbefattende forsknings- og terapeutiske miljøer.

Et annet formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe farmasøytiske preparater omfattende en kondensert pyrrolkarbazol ifølge foreliggende oppfinnelse. Preparatene omfatter en farmasøytisk akseptabel excipiens eller bærer og en terapeurisk effektiv mengde av minst én av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, eller en farmasøytisk akseptabel salt- eller esterform derav.

Et annet formål med foreliggende oppfinnelse er anvendelse av en forbindelse ifølge formel I eller II som er representert i tabellen under

for fremstilling av et farmasøytisk preparat.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av en forbindelse ifølge formel I:

hvor:

R<1> og R2 er de samme eller forskjellige og uavhengig er valgt blant H eller

alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, eller -OR<4> hvor R4 er et alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl eller resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; og

R<3> er -CH2OH; -CH2OR<7>;-(CH2)nSR<5>; -(CH2)nS(0)yR<5>; -CH2SR<5>; eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, -OR<5>, -OR<8>,

-CH2OR<7>, -S(0)yR<6> eller -SR<6>; og hvor

R<5> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv) pyridyl eller pyrimidyl;

R<7> er H eller alkyl med 1 -4 karbonatomer (inklusiv);

n er et helt tall på 1 -4 (inklusiv); og

y er 1 eller 2, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av prostataforstyrrelser.

Det er videre beskrevet anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge formel I:

hvor:

R<1> og R2 er de samme eller forskjellige og uavhengig er valgt blant H eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, eller -OR<4> hvor R<4> er et alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl eller resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; og

-CH2OR<7>, -S(0)yR<6> eller -SR<6>; og hvor

R<5> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl;

R<7> er H eller alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv);

n er et helt tall på 1 -4 (inklusiv); og

y er 1 eller 2, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av angiogene forstyrrelser.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge formel I:

hvor:

R<1> og R<2> er de samme eller forskjellige og uavhengig er valgt blant H eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, eller -OR4 hvor R4 er et alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl eller resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; og

R3 er -CH2OH; -CH2OR<7>; -(CH2)nSR5;-(CH2)nS(0)yR<5>; -CH2SR<5>; eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, -OR<5>, -OR<8>,

-CH2OR<7>, -S(0)yR<6> eller -SR<6>; og hvor

R<5> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl;

R7 er H eller alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv);

n er et helt tall på 1 -4 (inklusiv); og

y er 1 eller 2 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av patologiske forstyrrelser.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge formel I:

hvor:

R<1> og R<2> er de samme eller forskjellige og uavhengig er valgt blant H eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, eller -OR<4> hvor R4 er et alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl eller resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; og

-CH2OR<7>, -S(0)yR6 eller -SR<6>; og hvor

R5 er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl;

R7 er H eller alkyl med 1 -4 karbonatomer (inklusiv);

n er et helt tall på 1-4 (inklusiv); og

y er 1 eller 2 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av neurodegenerative sykdommer og forstyrrelser, Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateralsklerose, Parkinsons sykdom, slag, iskemi, Huntingtons sykdom, AIDS-demens, epilepsi, multippel sklerose, perifer neuropati,

kjemoterapi-indusert perifer neuropati, Al DS-ti I knyttet perifer neuropati eller skader i hjernen eller ryggmargen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge formel I:

hvor:

R<1> og R<2> er de samme eller forskjellige og uavhengig er valgt blant H eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, eller -OR<4> hvor R4 er et alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl, eller resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; og

R3 er -CH2OH; -CH2OR<7>;-(CH2)nSR<5>;-(CH2)nS(0)yR<5>; -CH2SR<5>; eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, -OR<5>, -OR<8>,

-CH2OR<7>, -S(0)yR<6> eller -SR<6>; og hvor

R<5> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl;

R7 er H eller alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv);

n er et helt tall på 1-4 (inklusiv); og

y er 1 eller 2 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av multippelt myelom og leukemier.

Disse og andre formål, trekk og fordeler ved de kondenserte pyrrolkarbazoler vil bli beskrevet i følgende detaljerte beskrivelse av patent-redegjørelsen.

Ved visse foretrukne utførelsesformer er forbindelsene ifølge krav 1 eller 2, hvor: R<1> er et alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH eller -OR4 hvor R4 er resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet;

R<2> er H; og

R<3> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv) substituert med -OH, -OR<5>,

-OR<8>, -CH2OR<7>, -S(0)yR6 eller -SR<6>; og hvor

R<5> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl;

R<6> er H, alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl;

R<7> er H eller alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv); og

R<8> er resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet.

Ved visse angitte utførelsesformer er R<1> -CH2CH2CH2OH eller -CH2CH2CH20COCH2N(CH3)2; R<2> er H; og R<3> er -CH2OR<7> hvor R<7> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv).

Ved visse enda mer foretrukne utførelsesformer er de kondenserte pyrrolkarbazoler ifølge formel I og formel II dem som er vist i tabell I:

Foretrukne kondenserte pyrrolkarbazoler ifølge formel II er vist strukturelt I tabell II.

Spesielt foretrukne forbindelser ifølge tabell II innbefatter forbindelsene 1, 3, 4, 5, 6, 7 og 22, idet forbindelsene 3 og 22 er mest foretrukket.

Forbindelsene representert ved formel I og II og vist i tabeller I og II kan også omtales i det foreliggende som "forbindelsene", "forbindelsen(e) ifølge foreliggende oppfinnelse"," kondensert(e) pyrrolkarbazol(er)","kondensert(e) pyrrolkarbazol(er) ifølge foreliggende oppfinnelse" og liknende.

Noen forbindelser ifølge US-patent nr. 5 705 511 er vist i tabell lia.

Anvendt i det foreliggende med henvisning til definisjonene av R<1> og R<2 >angir betegnelsen "aminosyre" et molekyl som både inneholder en aminosyregruppe og en karboksylgruppe. Den innbefatter en "a-aminosyre" som har sin vanlige betydning som en karboksylsyre som bærer en aminofunksjonalitet på karbonatomet i nabostilling til karboksylgruppen. a-Aminosyrer kan være naturlig forekommende eller ikke naturlig forekommende. Aminosyrer innbefatter også "dipeptider" som er definert i det foreliggende som to aminosyrer som er sammenknyttet i en peptidbinding. Følgelig er bestanddeler i dipeptider ikke begrenset til oc-aminosyrer og kan være hvilket som helst molekyl inneholdende både en aminogruppe en karboksylgruppe. a-Aminosyrer, dipeptider så som lysyl-p-alanin og aminoalkansyrer med 2-8 karbonatomer, f.eks. 3-dimetylamino-smørsyre, er foretrukket.

Farmasøytisk akseptable salter av de kondenserte pyrrolkarbazoler ifølge foreliggende oppfinnelse er også innenfor rammen for forbindelsene beskrevet i det foreliggende. Betegnelsen "farmasøytisk akseptable salter" anvendt i det foreliggende angir et uorganisk syreaddisjonssalt så som hydroklorid, sulfat og fosfat, eller et organisk syreaddisjonssalt så som acetat, maleat, fumarat, tartrat og citrat. Eksempler på farmasøytisk akseptable metallsalter er alkalimetallsalter så som natriumsalt og kaliumsalt, jordalkalimetallsalter så som magnesiumsalt og kalsiumsalt, aluminiumsalt og sinksalt. Eksempler på farmasøytisk akseptable ammoniumsalter er ammoniumsalt og tetrametylammoniumsalt. Eksempler på farmasøytisk akseptable organiske aminaddisjonssalter er salter med morfolin og piperidin. Eksemplere på farmasøytisk akseptable aminosyreaddisjonssalter er salter med lysin, glycin og fenylalanin.

Forbindelser tilveiebrakt i det foreliggende kan utformes til farmasøytiske preparater ved blanding med farmasøytisk akseptable ikke-toksiske excipienser eller bærere. Som angitt ovenfor, kan slike preparater fremstilles for anvendelse ved parenteral administrering, spesielt i form av flytende oppløsninger eller suspensjoner; eller oral administrering, spesielt i form av tabletter eller kapsler; eller intranasalt, spesielt i form av pulvere, nesedråper eller aerosoler; eller dermalt for eksempel via transdermale plastre.

Følgelig er et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse farmasøytiske preparater omfattende en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse eventuelt i blanding med én eller flere farmasøytisk akseptable excipienser eller bærere. De farmasøytiske preparater omfatter fortrinnsvis en forbindelse ifølge formel II. Mer foretrukket omfatter de farmasøytiske preparater en forbindelse ifølge tabell I eller tabell II.

I noen foretrukne farmasøytiske preparater har preparatet det formål å inhibere én eller flere av fr/c-kinaseaktivitet, VEGFR-kinaseaktivitet, PKC- eller PDGFR-aktivitet, hvor preparatet omfatter en forbindelse ifølge formel I, formel II, tabell I eller tabell II og eventuelt én eller flere farmasøytisk akseptable bærere. I andre foretrukne farmasøytiske preparater har preparatet det formål å forsterke trofisk faktor eller ryggmarg-ChAT-aktivitet hvor preparatet omfatter en forbindelse ifølge formel I, formel II, tabell I eller tabell II og en farmasøytisk akseptabel bærer.

I andre foretrukne farmasøytiske preparater har preparatet det formål å behandle eller forebygge angiogenese og angiogene forstyrrelser så som kreft i faste tumorer, endometriose, retinopati, diabetisk retinopati, psoriasis, hemangioblastom, okulære forstyrrelser eller makuladegenerasjon. I andre foretrukne farmasøytiske preparater har preparatet det formål å behandle eller forebygge neoplasi, reumatoid artritt, pulmonalfibrose, myelofibrose, unormal sårheling, aterosklerose eller restenose. I andre foretrukne farmasøytiske preparater har preparatet det formål å behandle eller forebygge neurodegenerative sykdommer og forstyrrelser, Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateralsklerose, Parkinsons sykdom, slag, iskemi, Huntingtons sykdom, AIDS-demens, epilepsi, multippel sklerose, perifer neuropati, kjemoterapi-indusert perifer neuropai, AIDS-tilknyttet perifer neuropati, eller skader i hjernen eller ryggmargen. I andre foretrukne farmasøytiske preparater har preparatet det formål å behandle eller forebygge prostatasykdommer så som prostatakreft eller benign prostatahyperplasi. I enda andre foretrukne farmasøytiske preparater anvendes preparatet for behandling eller forebygging av multiple myelomer og leukemier innbefattende, men ikke begrenset til, akutt myelogen leukemi, kronisk myelogen leukemi, akutt lymfocyttleukemi og kronisk lymfocyttleukemi.

Preparatene kan hensiktsmessig administreres i enhetsdoseringsform og kan fremstilles ved hvilken som helst av metodene som er velkjente på det farmasøytiske område, for eksempel som beskrevet i Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980). Utformninger for parenteral administrering kan inneholde som felles excipienser sterilt vann eller saltoppløsning, polyalkylenglykoler så som polyetylenglykol, oljer av vegetabilsk opprinnelse, hydrogenerte naftalener og liknende. Spesielt kan biokompatibel, bionedbrytbar laktidpolymer, laktid/glykolid-kopolymer eller polyoksyetylen-polyoksypropylen-kopolymerer være anvendelige excipienser for regulering av frigjøringen av aktive forbindelser. Andre potensielt anvendelige parenterale avgivelsessystemer for disse aktive forbindelser innbefatter etylen-vinylacetat-kopolymerpartikler, osmosepumper, implanterbare infusjonssystemer og liposomer. Utformninger for inhaleringsadministrering inneholder som excipienser for eksempel laktose, eller de kan være vandige oppløsninger inneholdende for eksempel polyoksyetylen-9-lauryleter, glykocholat og deoksycholat, eller oljeaktige oppløsninger for administrering i form av nesedråper eller som en gel for intranasal påføring. Utformninger for parenteral administrering kan også innbefatte glykocholat for buccal administrering, et salicylat for rektal administrering eller citronsyre for vaginal administrering. Utformninger for transdermale plastre er fortrinnsvis lipofile emulsjoner.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes som det eneste aktive middel i et farmasøytisk preparat, eller de kan anvendes i kombinasjon med andre aktive bestanddeler, f.eks. andre vekstfaktorer som kan lette neuronoverlevelsen eller akson-regenerering ved sykdommer eller forstyrrelser, eller andre angiogenese- eller antitumormidler.

Konsentrasjonene av forbindelsene beskrevet i det foreliggende i et terapeutisk eller farmasøytisk preparat vil variere avhengig av en rekke faktorer, innbefattende doseringen av medikamentet som skal administreres, de kjemiske egenskaper (f.eks. hydrofobisiteten) av forbindelsene som anvendes, samt administreringsmåten. Generelt angitt kan forbindelsene ifølge denne oppfinnelse tilveiebringes i en vandig fysiologisk bufferløsning inneholdende ca. 0,1-10 vekt/volum% forbindelse for parenteral administrering. Typiske doseområder er fra ca. 1 (ig pr. kg til ca. 1 g pr. kg kroppsvekt pr. dag; et foretrukket doseområde er fra ca. 0,01 mg pr. kg til 100 mg pr. kg kroppsvekt pr. dag. Den foretrukne dose av medikament som administreres, avhenger sannsynligvis av slike variabler som typen og omfanget av utviklingen av sykdommen eller forstyrrelsen, den totale helsetilstand hos den bestemte pasient, den relative biologiske effektivitet av den valgte forbindelse, samt utformingen av forbindelses-excipiensen, samt administreringsmåten.

Anvendt i det foreliggende angir betegnelsen "virkning", når den anvendes til modifisering av betegnelsene "funksjon" og "overlevelse", en positiv eller negativ endring eller forandring. En virkning som er positiv, kan i det foreliggende omtales som en "forbedring" eller" forbedre", og en virkning som er negativ, kan i det foreliggende omtales som "inhibering" eller" inhiberende".

Anvendt i det foreliggende angir betegnelsene "bedre" eller "bedring" ved anvendelse til modifisering av betegnelsene "funksjon" eller "overlevelse", at tilstedeværelse av en kondensert pyrrolkarbazol har en positiv effekt på funksjonen og/eller overlevelsen av en trofisk faktor-responderende celle sammenliknet med en celle i fravær av den kondenserte pyrrolkarbazol. For eksempel, og ikke som en begrensning, med hensyn til overlevelse av f.eks. et cholinergt neuron, vil den kondenserte pyrrolkarbazol sannsynliggjøre forbedring av overlevelse av en cholinerg neuronpopulasjon som er i fare for å dø (på grunn av f.eks. skade, en sykdomstilstand, en degenererende tilstand eller naturlig utvikling) sammenliknet med en cholinerg neuronpopulasjon som ikke presenteres med slik kondensert pyrrolkarbazol, hvis den behandlede populasjon har et forholdsvis større funksjonalitetstidsrom enn den ikke-behandlede populasjon. Som et ytterligere eksempel, og igjen ikke som en begrensing, når det gjelder funksjonen av f.eks. et sensorisk neuron, vil den kondenserte pyrrolkarbazol sannsynliggjøre forbedring av funksjonen (f.eks. neurittekstensjon) av en populasjon av sensoriske neuroner sammenliknet med en populasjon av sensoriske neuroner som ikke er presentert med slik kondensert pyrrolkarbazol, hvis neurittekstensjonen i den behandlede populasjon er forholdsvis større enn neurittekstensjonen i den ikke-behandlede populasjon.

Anvendt i det foreliggende angir "inhibere" og "inhibering" at en spesifisert respons hos et angitt materiale (f.eks. enzymatisk aktivitet) er forholdsvis redusert i nærvær av en kondensert pyrrolkarbazol ifølge foreliggende oppfinnelse.

Anvendt i det foreliggende innbefatter betegnelsen "neuron", "celle i neuronlinjen" og "neuroncelle", men er ikke begrenset til, en heterogen populasjon av neurontyper med enkelt- eller multippel-transmittere og/eller enkelt- eller multippelfunksjoner; disse er fortrinnsvis cholinerge og sensoriske neuroner. Anvendt i det foreliggende angir uttrykket "cholinergt neuron" neuroner i sentralnervesystemet (CNS) og det perifere nervesystem (PNS) hvis neurotransmitter er acetylcholin; eksempler er basal-forhjerne- og ryggmarg-neuroner. Anvendt i det foreliggende innbefatter uttrykket "sensorisk neuron" neuroner som er ansvarlige for miljø-"cues" (f.eks. temperatur, bevegelse) fra f.eks. hud, muskel og ledd; eksempler på disse er et neuron fra DRG.

Anvendt i det foreliggende er en "trofisk faktor" et molekyl som direkte eller indirekte påvirker overlevelsen eller funksjonen av en trofisk faktor-responderende celle. Eksempler på trofiske faktorer innbefatter ciliær neurotrofisk faktor (CNTF), basisk fibroblast-vekstfaktor (bFGF), insulin- og insulinliknende-vekstfaktorer (f.eks. IGF-I, IGF-II, IGF-III), interferoner, interleukiner, cytokiner, samt neurotrofinene, innbefattende nervevekstfaktor (NGF), neurotrofin-3 (NT-3), neurotrofin-4/5 (NT-4/5) og hjerneavledet neurotrofisk faktor (BDNF).

En "trofisk faktor-responderende celle" definert i det foreliggende er en celle som innbefatter en reseptor til hvilken en trofisk faktor spesifikt kan bindes; eksempler innbefatter neuroner (f.eks. cholinerge og sensoriske neuroner) og ikke-neuron-celler (f.eks. monocytter og neoplastiske celler).

Anvendt i det foreliggende er "trofisk faktor-aktivitet" og "trofisk faktor-indusert aktivitet" definert som hvilken som helst respons som direkte eller indirekte er et resultat av binding av en trofisk faktor (f.eks. NGF) til en celle omfattende en reseptor for trofisk faktor (f.eks. neuron omfattende en trk). Når det gjelder f.eks. NGF-binding med trk, vil et eksempel på en respons innbefatte autofosforylering av fr/c-tyrosinrester som fører til øket ChAT-aktivitet som resulterer i bedret neuronoverlevelse og/eller -funksjon.

Anvendt i uttrykkene"trofisk faktor-aktivitet" og "trofisk faktor-indusert aktivitet" innbefatter betegnelsen "trofisk faktor" både endogene og eksogene trofiske faktorer, hvor "endogen" angir en trofisk faktor som normalt er tilstede, og "eksogen" angir en trofisk faktor som tilføres til et system. Ifølge definisjon innbefatter "trofisk faktor-indusert aktivitet' aktivitet indusert ved (1) endogene trofiske faktorer; (2) eksogene trofiske faktorer; og (3) en kombinasjon av endogene og eksogene trofiske faktorer.

Anvendt i det foreliggende angir betegnelsen " trk"familien av høyaffinitets-neurotrofinreseptorer som for tiden omfatter trk A, trkB og trkC, og andre membrantilknyttede proteiner som et neurotrofin kan bindes til.

Anvendt i det foreliggende angir uttrykket "hyperproliferativ tilstand" ved henvisning til betegnelsen "celler" celler hvis uregulerte og/eller unormale vekst kan føre til utvikling av en uønsket tilstand, for eksempel en krefttilstand eller en proriatisk tilstand.

Anvendt i det foreliggende angir "kreft" og "kankrøs" en hver malign proliferasjon av celler i et pattedyr. Eksempler innbefatter prostatakreft, benign prostata-hyperplasi, ovariekreft, brystkreft og andre kjente krefttyper. Anvendt i det foreliggende angir betegnelsen "psorias" og "psoriatisk tilstand" forstyrrelser som innbefatter keratinocytt-hyperproliferasjon, inflammatorisk celleinfiltrasjon og cytokinforandring.

Anvendt i det foreliggende angir uttrykket "i fare for å dø" i forbindelse med et biologisk materiale, f.eks. en celle så som et neuron, en tilstand eller et forhold som innvirker negativt på det biologiske materiale slik at materialet har øket sannsynlighet for å dø på grunn av en slik tilstand. For eksempel kan forbindelser beskrevet i det foreliggende "redde" eller øke overlevelsen av motoneuroner som naturlig er i fare for å dø, i en in oro-modell for programmert celledød. Likeledes kan for eksempel et neuron være i fare for å dø på grunn av den naturlige aldringsprosess som foranlediger et neurons død, eller på grunn av en skade, så som en traume i hodet, som kan være slik at for eksempel neuroner og/eller glia som er påvirket av traumet, kan stå i fare for å dø. Videre kan for eksempel et neuron stå i fare for å dø på grunn av en sykdomstilstand eller -forhold, som i tilfellet hvor neuroner står i fare for å dø, foranlediget ved sykdommen ALS. Med forbedring av overlevelsen av en celle som står i fare for å dø, ved anvendelse av en forbindelse ifølge den patentsøkte oppfinnelse, menes således at en slik forbindelse reduserer eller hindrer risikoen for at en celle dør.

Anvendt i det foreliggende angir betegnelsen "bringe i kontakt" direkte eller indirekte forårsaking av sammenføring av enheter, slik at enhetene direkte eller indirekte kommer i fysisk forbindelse med hverandre, hvorved det oppnås et ønsket utfall. Anvendt i det foreliggende kan således en målcelle "bringes i kontakt" med en forbindelse beskrevet i det foreliggende, selv om forbindelsen og cellen ikke nødvendigvis fysisk sammenføyes (noe som for eksempel er tilfellet når en ligand og en reseptor fysisk sammenføyes) så lenge det ønskede utfall oppnås (f.eks. forbedring av cellens overlevelse). Følgelig innbefatter å "bringe i kontakt" handlinger så som at enheter bringes sammen i en beholder (f.eks. tilsetting av en forbindelse som beskrevet i det foreliggende i en beholder omfattende celler for in vitro-undersøkelser) samt administrering av forbindelsen til en mål-enhet (f.eks. injisering av en forbindelse beskrevet i det foreliggende, i et laboratoriedyr for in vivo-testing, eller i et menneske for terapi- eller behandlings-formål).

"Promedikament" er ment å innbefatte hvilke som helst kovalent bundne bærere som frigjør sitt aktive opphavsmedikament som en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse in vivo når et slikt promedikament administreres til et pattedyrindivid. Siden promedikamenter er kjent for å forbedre tallrike ønskelige kvaliteter hos farmasøytiske midler (f.eks. løselighet, biotilgjengelighet, fremstilling osv.), kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse avgis i promedikamentform. Promedikamenter for en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. med formel I, kan fremstilles ved modifisering av funksjonelle grupper som finnes i forbindelsen, på en slik måte at modifikasjonene, enten ved rutinemanipulasjon eller in vivo, spaltes til opphavsforbindelsen. Følgelig innbefatter promedikamenter for eksempel forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse hvor en hydroksy-, amino- eller karboksygruppe er bundet til hvilken som helst gruppe som, når promedikamentet administreres til et pattedyrindivid, spaltes under dannelse av henholdsvis et fritt hydroksyl, et fritt amino eller en karboksylsyre. Eksempler innbefatter, men er ikke begrenset til, resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksyl-gruppen er fjernet, acetat-, formiat- og benzoatderivater av alkohol- og aminfunksjonjelle grupper; og alkyl-, karbocykliske, aryl- og alkylarylestere så som metyl-, etyl-, propyl-, isopro-pyl-, butyl-, isobutyl-, sek.-butyl-, tert.-butyl-, cyklopeopyl-, fenyl-, benzyl- og fenetylestere og liknende.

De kondenserte pyrrolkarbazoler ifølge foreliggende oppfinnelse har viktige funksjonelle farmakologiske virkninger som finner anvendelse innenfor forskjellige rammer, innbefattende både forsknings- og terapeutiske arenaer. For lettvint presentasjon og for ikke å begrense området for anvendelser for hvilke disse forbindelser kan karakteriseres, beskriver vi generelt virkningene av de kondenserte pyrrolkarbazoler som følger:

6. Inhibering av enzymatisk aktivitet

6. Effekt av funksjonen og/eller overlevelse av trofisk faktor-responderende celler

6. Inhibering av inflammasjons-tilknyttede responser

6. Inhibering av cellevekst knyttet til hyperproliferative tilstander

6. Inhibering av utviklingsmessig programmert motoneuron-død.

Inhibering av enzymatisk aktivitet kan bestemmes for eksempel under anvendelse av VEGFR-inhiberings- (f.eks. VEGFR2-inhiberings-), MLK-inhiberings- (for eksempel MLK1-, MLK2- eller MLK3-inhiberings-), PDGFR-kinase-inhiberings-, NGF-stimulert fr/c-fosforylerings-, PKC-inhiberings- eller trk-tyrosinkinase-inhiberings-analyser. Virkning på funksjonen og/eller overlevelsen av trofisk faktor-responderende celler, f.eks. celler i en neuronlinje, kan påvises ved anvendelse av hvilken som helst av følgende analyser: (1) dyrket ryggmarg-kolinacetyl-transferase-("ChAT")-analyse; (2) dyrket dorsalrotganglie-("DRG")-neuritt-ekstensjonsanalyse; (3) dyrket basal-forhjerneneuron-("BFN")-ChAT-aktivitetsanalyse. Inhibering av inflammasjonstilknyttet respons kan påvises ved anvendelse av en indolamin-2,3-dioksygenase-("IDO")-mRNA-analyse. Inhibering av cellevekst i tilknytning til hyperproliferative tilstander kan bestemmes ved måling av veksten av aktuelle cellelinjer, så som en AT2-linje når det gjelder prostatakreft. Inhibering av utviklingsmessig programmert motoneuron-død kan bedømmes in ovo under anvendelse av somatiske motoneuroner fra kylling i fosterstadiet, hvilke celler gjennomgår naturlig forekommende død mellom embroy-dagene 6 og 10, og analysering av inhibering av slik naturlig forekommende celledød mediert ved forbindelsene beskrevet i det foreliggende.

Inhiberingen av enzymatisk aktivitet ved de kondenserte pyrrolkarbazolforbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kan bestemmes for eksempel under anvendelse av følgende analyser:

VEGFR-inhiberingsanalyse

MLK-inhiberingsanalyse

PKC-aktivitets-inhiberingsanalyse

frfc4-tyrosinkinaseaktivitets-inhiberingsanalyse

Inhibering av NGF-stimulert trk-fosforylering i et helcellepreparat. Blodplateavledet vekstfaktor-reseptor (PDGFR)-inhiberingsanalyse

Spesielt innebærer inhibering av vaskulær endotelial vekstfaktor-(VEGFR)-reseptoren anvendelse for eksempel ved sykdommer hvor angiogenese spiller viktige roller, så som kreft i faste tumorer, endometriose, diabetisk retinopati, psoriasis, hemangioblastom samt andre okulære sykdommer og

-krefttyper. Inhibering av MLK innebærer anvendelse for eksempel ved neurologiske sykdommer. Inhibering av trk innebærer anvendelse for eksempel

ved sykdommer i prostata så som prostatakreft og benign prostatahyperplasi, og behandling av inflammatorisk smerte. Inhibering av reseptoren for blodplateavledet vekstfaktor (PDGFR) innebærer anvendelse for eksempel ved forskjellige former for neoplasi, reumatoid artritt, pulmonalfibrose, myelofibrose, unormal sårheling, sykdommer med kardiovaskulære endepunkter, så som aterosklerose, restenose, post-angioplasti-restenose og liknende.

Kondenserte pyrrolkarbazoler er også blitt vist å ha positive virkninger på funksjonen og overlevelsen av trofisk faktor-responderende celler ved befordring av overlevelsen av neuroner. Når det for eksempel gjelder overlevelsen av et cholinergt neuron, kan forbindelsen konservere overlevelsen av en populasjon av cholinerge neuroner som står i fare for å dø (på grunn av f.eks. skade, en sykdomstilstand, en degenerativ tilstand eller naturlig utvikling) sammenliknet med en populasjon av cholinerge neuroner som ikke er presentert med en slik forbindelse, hvis den behandlede populasjon har et forholdsvis større funksjonalitets-tidsrom enn den ikke-behandlede populasjon.

Mange forskjellige neurologiske forstyrrelser er kjennetegnet ved neuronceller som er døende, skadet, funksjonelt kompromittert, gjennomgår akson-degenerering, er i fare for å dø, osv. Disse forstyrrelser innbefatter, men er ikke begrenset til, neurologiske sykdommer og forstyrrelser, Alzheimers sykdom, forstyrrelser i motoriske neuroner (f.eks. amyotrofisk lateralsklerose); Parkinsons sykdom; cerebrovaskulære forstyrrelser (f.eks. slag, iskemi); Huntingtons sykdom, AIDS-demens, epilepsi, multippel sklerose, perifere neuropatier (f.eks. slike som angriper DRG-neuroner ved kjemoterpi-tilknyttet perifer neuropati) innbefattende diabetisk neuropati og AIDS-tilknyttet perifer neuropati; forstyrrelser indusert ved eksitatoriske aminosyrer; og forstyrrelser knyttet til skader ved rystelser, eller inntrengende skader i hjernen eller ryggmargen.

Forbindelsene er ikke bare anvendelige for øking av trofisk faktor-induserte aktiviteter av trofisk-responderende celler, f.eks. cholinerge neuroner, men kan også virke som overlevelsesbefordrende midler for andre neuroncelletyper, f.eks. dopaminerge eller glutamaterge. Vekstfaktor kan regulere overlevelsen av neuroner ved signalisering av kaskader nedstrøms for de små GTP-bindende proteiner ras, rac og cdc42 (D.T. Denhardt, Biochem. J., 1996, 318, 729). Spesifikt fører aktivering av ras til fosforylering og aktivering av ekstracellulær reseptor-aktivert kinase (ERK), som er blitt knyttet til biologiske vekst- og differensierings-prosesser.

Stimulering av rac/cdc42 fører til en økning i aktiveringen av JNK og p38, responser som er forbundet med stress, apoptose og inflammasjon. Skjønt vekstfaktor-responser hovedsakelig skjer via ERK-veien, kan påvirkning av disse sistnevnte prosesser føre til alternative mekanismer for neuronoverlevelse som kan etterlikne vekstfaktor-forbedrende overlevelsesegenskaper (Xia et al., Science, 1995,270,1326). Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også virke som overlevelsesbefordrende midler for neuron- og ikkeneuron-celler ved mekanismer beslektet med, men også forskjellige fra, vekstfaktormediert overlevelse, for eksempel inhibering av JNK- og p38 MAPK-veiene som kan føre til overlevelse ved inhibering av prosesser for apoptotisk celledød.

Foreliggende forbindelser er også anvendelige ved behandling av forstyrrelser som er knyttet til redusert ChAT-aktivitet, eller død eller skade av ryggmarg-motoneuroner, men har også anvendelse for eksempel ved sykdommer som er knyttet til apoptotisk celledød i det sentrale og perifere nervesystem, immunsystemet og ved inflammatoriske sykdommer. ChAT katalyserer syntesen av neurotransmitteren acetylcholin og anses som en enzymatisk markør for et funksjonelt cholinergt neuron. Et funksjonelt neuron er også i stand til å overleve. Neuronoverlevelse analyseres ved kvantifisering av det spesifikke opptak og enzymatisk omdannelse av et fargestoff (f.eks. calcein AM) ved levende neuroner. Forbindelsene beskrevet i det foreliggende kan også finne anvendelse ved behandling av sykdomstilstander som involverer proliferasjon av maligne celler, så som mange krefttyper.

På grunn av isomere kondenserte pyrrolkarbazolers og isoindoloners varierte anvendelser, kan deres egenskaper utforskes innenfor andre rammer, så som forskning. For eksempel kan forbindelsene anvendes ved utvikling av in vitro-modeller av neuroncelleoverlevelse, -funksjon, -identifikasjon eller for screening av andre syntetiske forbindelser som har liknende aktiviteter som for isomere kondenserte pyrrolkarbazol- og isoindolonforbindelser. Følgelig er forbindelsene som tilveiebringes ved denne oppfinnelse, anvendelige som standard- eller referanseforbindelser for anvendelse ved tester eller analyser for bestemmelse av aktiviteten av et middel i et farmasøytisk forskningsprogram.

Forbindelsene kan også anvendes til undersøkelse, definering og bestemmelse av molekylære mål knyttet til funksjonelle responser. Ved for eksempel radiomerking av en isomer kondensert pyrrolkarbazol- eller isoindolonforbindelse knyttet til en spesifikk cellefunksjon (f.eks. mitogenese), kan målenheten som derivatet bindes til, identifiseres, isoleres og renses for karakterisering. Som en ytterligere illustrasjon kan forbindelsene anvendes ved utvikling av analyser og modeller for ytterligere forbedring av forståelsen av rollene som inhibering av serin/treonin eller tyrosinproteinkinase (f.eks. PKC, trk tyrosinkinase) spiller ved de mekanistiske aspekter ved de tilknyttede forstyrrelser og sykdommer. Således er forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendelige som diagnostiske reagenser ved diagnostiske analyser, så som analysene beskrevet i det foreliggende.

Resultatene oppnådd ved VEGFR- og MLK-analysene, er angitt nedenfor. Andre analyser er også beskrevet mer detaljert. De er ikke påtenkt, og heller ikke skal de forstås, som begrensende for beskrivelsens ramme. Visse forkortelser som anvendes til skissering av resultatene nedenfor, er definert som følger: "u.g" angir mikrogram, "mg" angir milligram, "g" angir gram, "uJ" angir mikroliter, "ml" angir milliliter, "I" angir liter, "nM" angir nanomolar, "uJvl" angir mikromolar, "mM" angir millimolar, "M" angir molar og "nm" angir nanometer.

Syntese

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles på en rekke måter som er velkjente for fagfolk på^området. Forbindelsene kan for eksempel syntetiseres ved metodene beskrevet i skjemaene nedenfor, eller variasjoner av disse ifølge en fagpersons vurdering. De hensiktsmessige modifikasjoner og substitusjoner er åpenbare og velkjente eller lett oppnåelige for fagfolk på området ut fra den vitenskapelige litteratur. Alle prosesser beskrevet i forbindelse med foreliggende oppfinnelse er påtenkt utført i hvilken som helst målestokk, innbefattende milligram-, gram-, multigram-, kilogram-, multikilogram- eller kommersiell industriell skala.

Det vil være klart at forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan inneholde ett eller flere asymmetrisk substituerte karbonatomer og kan isoleres i optisk aktive eller racemiske former. Følgelig er alle kirale, diastereomere, racemiske former og alle geometriske isomere former av en struktur påtenkt, dersom ikke den spesifikke stereokjemi eller isomere form er spesifikt angitt. Det er velkjent på området hvordan slike optisk aktive former fremstilles. For eksempel kan blandinger av stereoisomerer separeres ved standardteknikker, innbefattende, men ikke begrenset til, spalting av racemiske former, normal, revers fase- og kiral kromatografi, preferensiell saltdannelse, omkrystallisering og liknende, eller ved kiral syntese enten ut fra aktive utgangsmaterialer eller ved tilsiktet kiral syntese av målsentre.

Som man lett vil forstå, kan funksjonelle grupper som finnes på forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, inneholde beskyttende grupper. For eksempel kan aminosyresidekjede-substituentene av forbindelsene substitueres med beskyttende grupper så som benzyloksykarbonyl- eller t-butoksykarbonyl-grupper. Beskyttende grupper er i og for seg kjent som kjemiske funksjonelle grupper som selektivt kan tilføyes til og fjernes fra funksjonaliteter, så som hydroksylgrupper og karboksylgrupper. Disse grupper er tilstede i en kjemisk forbindelse slik at slik funksjonalitet gjøres inert overfor kjemiske reaksjons-betingelser som forbindelsen utsettes for. Hvilken som helst av mange forskjellige beskyttende grupper kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse. Foretrukne beskyttende grupper innbefatter benzyloksykarbonyl-(Cbz; Z)-gruppen og tert.-butyloksykarbonyl-(Boc)-gruppen. Andre foretrukne beskyttende grupper ifølge oppfinnelsen kan finnes i T.W. Greene og P.G.M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2. utg., Wiley & Sons, 1991.

Beskrivelse av syntese

Forbindelsene A og B ble fremstilt ved alkyleringer av indol I med 2-brometylbenzyleter (A) eller med 3-bromfenylbenzyleter (B) under anvendelse av NaH i DMF, fulgt av debenzylering (Pd(OH)2/H2) som beskrevet i US-patent nr.

5 705 511. Referanseforbindelse C ble fremstilt ved kopling av B med Boc-leucin, fulgt av fjerning av den beskyttende BOC-gruppe under anvendelse av standardmetoder kjent for fagfolk på området organisk syntese. Forbindelse B kan også fremstilles ved reduksjon av ester IV med reduksjonsmidler så som LiBH4, fulgt av fjerning av den beskyttende benzhydrolgruppe. Metodene for fremstilling av benzylesterne og tioleterne er skissert i skjemaene. To metoder anvendes til fremstilling av 3-hydroksymetyl-mellomproduktene 28-30,33,35. Skjema 1 (metode A) skisserer en karbonyleringsmetode, mens skjema 2 (metode B) anvender en formyleringsmetode. I skjema 1 gir Michael-reaksjon mellom I og etylakrylat og en base så som DBU, II, fulgt av laktamnitrogen-beskyttelse med dimetoksybenzhydrol til III. Reduksjon av etylesteren under anvendelse av reduksjonsmidler så som litiumborhydrid, fulgt av bromering med N-bromsuksinimid, ga mellomprodukt V i godt totalt utbytte. Palladiumkatalysert karbonylering av V i metoksyetanol ga metoksyetoksyesteren VI. Etter fjerning av beskyttende gruppe til VII, kunne esteren reduseres med reduksjonsmidler, for eksempel diisobutylaluminiumhydrid (DIBAL-H), under dannelse av diolen 29. Formyleringsveien til hydroksymetylforbindelsene (metode B, skjema 2) anvender for eksempel HMTA i TFA eller cc,a-diklormetyleter og en Lewis-syre. Aldehydene kan reduseres til hydroksymetylforbindelser ved anvendelse av reduksjonsmidler så som natriumborhydrid eller diisobutylaluminiumhydrid. Metyleter- eller tioetereksemplene kan fremstilles under anvendelse av en generell metode skissert i skjema 4. Ved én fremgangsmåte kan diolen 29 for eksempel omdannes til et trifluoracetat-mellomprodukt med trifluoreddiksyreanhydrid og en base så som trietylamin, fulgt av behandling av dette mellomprodukt med en passende alkylalkohol eller alkyltiol under oppnåelse av benzyleteren (1-25, 27, 31, 32, 36-40) direkte. I visse tilfeller kan trifluoracetatesteren av den primære alkohol isoleres. I disse eksempler kan alkoholen isoleres ved behandling av trifluoracetatet med en base så som litiumhydroksid. Ved en annen fremgangsmåte kan eterne og tioeterne fremstilles ved omsetting av en diol, for eksempel 28 eller 29, med en alkohol og en syrekatalysator, så som p-toluensulfonsyre eller kamfersulfonsyre i et løsningsmiddel, for eksempel metylklorid, toluen eller 1,2-dikloretan.

Alkoholene 33-35 ble anvendt til fremstilling av etereksemplene 10-13,15, 16 og 36. Eksemplene 33-35 ble fremstilt ut fra ketonene XI og XII som skissert i skjema 3. Eterne og tioeterne ble fremstilt under anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet tidligere og skissert i skjema 4.

Eksempel 7 ble fremstilt som vist i skjema 5. Eksempel 31 ble alkylert med mesylglycidol, hvorved man fikk forbindelse XIII. Reduksjon med trietylborhydrid i THF ga sekundæralkohol-eksempel 7. Eksempel 14 ble fremstilt (skjema 6) ved behandling av forbindelse XIV med cesiumkarbonat og acetaldehyd i metylenklorid/metanol. Eksempel 40 ble fremstilt som vist i skjema 7. Den Di-TBS-beskyttede XVIII ble alkylert med paraformaldehyd under anvendelse av triton B/pyridin, fulgt av fjerning av beskyttende grupper under anvendelse av TMSCI, hvorved man fikk eksempel 40. Aminosyreesterne, eksempel 18-23, ble fremstilt ut fra eksempel 3 og den tilsvarende karboksylsyre under anvendelse av standard-koplingsreaksjon kjent for fagfolk på området organisk syntese.

Andre trekk ved oppfinnelsen vil bli åpenbare ved følgende beskrivelser av utførelsesform-eksempler. Disse eksempler er gitt for illustrasjon av oppfinnelsen og er ikke påtenkt å være begrensende for den.

Eksempler

Visse forkortelser anvendt i det foreliggende er definert som følger: "°C" for grader celsius, "d" for dublett, "dd" for dublett eller dubletter, "t" for triplett, "m" for multiplett, "ekv" for ekvivalenter, "g" for gram, "mg" for milligram, "ml" for milliliter, "H" for hydrogen eller hydrogener, T for time eller timer, "m" for multiplett, "M" for molar, "min" for minutt eller minutter, "MHz" for megahertz, "MS" for massespektroskopi, "nmr" eller "NMR" for nukleærmagnetisk resonans-spektroskopi.

Fremstilling av forbindelse II:

Til en suspensjon av I (8,0 g, 0,258 mol) i acetonitril (300 ml) ved romtemperatur under nitrogen ble det tilsatt etylakrylat (4,19 ml, 0,387 mol) fulgt av 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-en (DBU) (1,93 ml, 0,013 mol). Etter tilsetting av DBU, forandret reaksjonsblandingen farge fra oransje til grønn. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til tilbakeløp natten over. Blandingen forble heterogen i løpet av hele reaksjonen og fikk mørk farge. En liten porsjon ble uttatt etter 181, og faststoffet ble oppsamlet ved filtrering. <1>H-NMR for prøven viste at det ikke var igjen noe utgangsmateriale. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur, og faststoffet ble oppsamlet ved filtrering. Faststoffet ble vasket flere ganger med kald acetonitril og tørket i vakuum ved 55°C, hvorved man fikk et lys-oransje faststoff (5,4 g, 78% utbytte). <1>H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz): 5 9,72 (t, 3H, J = 6,8), 2,87 (m, 2H), 3,89 (q, 2H, J = 6,8), 4,49 (s, 2H), 4,88 (s, 2H), 4,92 (m, 2H), 7,29-7,48 (m, 3H), 7,50-7,73 (m, 3H), 7,96 (d, 1H, J = 7,33), 8,56 (s, 1H), 9,47 (d, 1H, J = 7,33).

Fremstilling av forbindelse III:

Til en suspensjon av II (5,62 g, 0,0137 mol) i benzen (300 ml) og N-metylpyrrolidin (NMP) (60 ml) ved romtemperatur under nitrogen ble det tilsatt p-toluensulfonsyre-monohydrat (2,48 g, 0,013 mol) og 4,4'-dimetoksybenzhydrol (3,19 g, 0,013 mol). Innholdet i kolben ble oppvarmet til tilbakeløp i 81. Etter 45 min., ble den innledningsvis heterogene reaksjonsblanding homogen. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur, fortynnet med etylacetat (300 ml) og vasket med mettet bikarbonatoppløsning, vann og saltoppløsning. Den organiske fase ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og konsentert i vakuum til et oransje faststoff (8,31 g, 95% utbytte). <1>H-NMR (CDCI3, 300 MHz): 81,18 (t, 3H, J = 7,1), 2,84 (m, 2H), 3,80 (6H, s), 4,12 (q, 2H, J = 7,1), 4,38 (s, 2H), 4,72 (2H, s), 4,94 (m, 2H), 6,90 (d, 4H, J = 8,5), 6,955 (s, 1H), 7,26 (d, 4H, J = 8,5), 7,34-7,49 (m, 5H), 7,61 (d, 1H, J = 7,4), 7,69 (d, 1H, J = 7,7), 9,65 (d, 1H, J = 7,8).

Fremstilling av forbindelse IV:

Til en omrørt oppløsning av III (7,8 g, 0,0122 mol) i THF (480 ml) og metanol (93 ml) ble litiumborhydrid (18,9 ml av en 2,0 M oppløsning, 0,0379 mol) tilsatt dråpevis. Reaksjonsblandingen var innledningsvis homogen, men etter hvert som reaksjonen skred frem, ble blandingen heterogen. Når alt utgangsmaterialet var blitt oppbrukt, ble reaksjonsblandingen avkjølt i isbad og reaksjonen forsiktig avbrutt med 2N HCI (60 ml). Reaksjonsblandingen ble homogen og fikk lys oransje farge. Vann (750 ml) ble tilsatt til blandingen, og det ble dannet en melkeaktig hvit utfelning. Det utfelte materiale ble oppsamlet ved filtrering og tørket i vakuum, hvorved man fikk et fnugget hvitt faststoff (7,2 g, 99% utbytte). <1>H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz): 8 1,93 (m, 2H), 3,66 (m, 2H), 3,71 (s, 6H), 4,55 (s, 2H), 4,73 (m, 2H), 4,79 (s, 2H), 6,70 (s, 1H), 6,93 (d, 4H, J = 8,44), 7,22 (d, 4H, J = 8,4), 7,26 (m, 1H), 7,34-7,46 (m, 2H), 7,49 (m, 1H), 7,65 (d, 1H, J = 7,01), 7,70 (d, 1H, J = 8,26), 7,86 (d, 1H, J = 7,82), 9,49 (d, 1H, J = 7,49).

Fremstilling av forbindelse V:

Til en suspensjon av IV (2,02 g, 0,0034 mol) i THF (131 ml) ved romtemperatur under nitrogen ble det tilsatt N-bromsuksinimid (0,63 g, 0,0036 mol) i én porsjon. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur natten over. Reaksjons-løsningsmidlet ble fjernet i vakuum, hvorved det ble tilbake et blekgult faststoff. Faststoffet ble finfordelt med kald metanol og oppsamlet ved filtrering. Faststoffet ble tørket i vakuum, hvorved man fikk et blekgult faststoff (1,98 g, 87% utbytte). <1>H-NMR (DMSO-de, 300 MHz): 8 1,91 (m, 2H), 3,44 (m, 2H), 3,72 (s, 6H), 4,53 (s, 2H), 4,74 (m, 2H), 4,87 (s, 2H), 6,71 (s, 1H), 6,93 (d, 4H, J = 8,14), 7,25 (d, 4H, J = 8,1), 7,37 (m, 2H), 7,59-7,69 (m, 3H), 8,08 (s, 1H), 9,50 (d, 1H, J = 7,01).

Fremstilling av forbindelse VI:

I et Schlenk-rør ble det fylt V (0,79 g, 0,0017 mol) i metoksyetanol (25 ml), fulgt av natriumaceat (0,57 g, 0,00702 mol) og diklorbis(trifenylfosfin)-palladium(ll) (0,082 g, 0,000117 mol). Røret ble evakuert og fylt med karbonmonoksid. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet i det forseglede rør ved 155°C i oljebad i 31. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur, og ytterligere karbonmonoksid ble tilsatt. Blandingen ble oppvarmet på nytt til 150°C i ytterligere 31. Ytterligere CO og PDCI2 (PPh3)2 ble tilsatt og blandingen oppvarmet i 41. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med metylenklorid og spylt gjennom en pute av celite. Filtratet ble konsentrert i vakuum til et residuum, som ble oppløst i etylacetat og vasket med vann. Den organiske fase ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og konsentert i vakuum til et faststoff, som ble finfordelt med etyleter og oppsamlet ved filtrering, hvorved man fikk et lys-oransje faststoff (0,7 g, 85% utbytte). <1>H-NMR (CDCI3, 300 MHz): 8 2,14 (m, 2H), 3,44 (s, 3H), 3,67-3,78 (m, 4H), 3,81 (s, 6H), 4,44 (s, 2H), 4,51 (m, 2H), 4,81 (m, 4H), 6,91 (d, 4H, J = 8,53), 6,98 (s, 1H), 7,28 (d, 4H, 8,6), 7,34-7,61 (m, 4H), 8,21 (d, 1H, J = 8,32), 8,42 (s, 1H), 9,67 (d, 1H, J = 7,61).

Fremstilling av forbindelse VII:

Til en oppløsning av VI (0,96 g, 0,00138 mol) i CH2CI2 (30 ml) ved 0°C under nitrogen ble det tilsatt tioanisol (3,2 ml, 0,110 mol) fulgt av trifluoreddiksyre (TFA)

(8,5 ml, 0,0276 mol). Ved tilsetting av TFA fikk reaksjonsblandingen rød farge. Blandingen ble omrørt ved 0°C i 1 t og oppvarmet til romtemperatur natten over. Reaksjonsløsningsmidlet ble fjernet i vakuum, idet det ble tilbake en mørkerød olje. Etyleter ble tilsatt til oljen, og reaksjonsblandingen fikk gul farge, og et gyllenbrunt faststoff ble utfelt fra oppløsningen. Faststoffet ble oppsamlet ved filtrering (0,6 g, 92% utbytte). <1>H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz): 8 2,29 (m, 2H), 3,3 (m, 2H), 3,73 (m, 2H), 4,45 (m, 2H), 4,54 (m, 3H), 4,82 (m, 2H), 4,99 (s, 2H), 7,40 (m, 2H), 7,58 (d, 1H), 7,85 (d, 1H), 8,13 (d, 1H), 8,52 (s, 1H), 8,6 (s, 1H), 9,49 (d, 1H).

Eksempel 29 (metode A): Til en omrørt suspensjon av VII (4,4 g, 0,00935 mol) i CHCI2 (220 ml) ved 0°C under nitrogen ble DIBAL-H tilsatt langsomt dråpevis. Reaksjonsblandingen ble gradvis homogen. Den oransjefargede reaksjonsblanding ble omrørt ved 0°C i 11, og deretter ble den oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 61. Blandingen ble avkjølt til 0°C i isbad, og vann (50 ml) ble tilsatt meget langsomt innledningsvis. Kraftig utvikling av gass ble observert. En vandig oppløsning av NaOH (1M, 300 ml) ble tilsatt og reaksjonsblandingen omrørt ved romtemperatur i 11. Det ble dannet en utfelning, og denne ble oppsamlet ved filtrering, hvorved man fikk et gyllenbrunt faststoff (3,6 g, 96%). <1>H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz): 8 1,92 (m, 2H), 3,46 (m, 2H), 4,50 (s, 2H), 4,65 (s, 2H), 4,71 (m, 2H), 4,88 (s, 2H), 7,32-7,39 (m, 2H), 7,47 (d, 1H, J = 8,34), 7,65 (m, 2H), 7,89 (s, 1H), 8,53 (s, 1H), 9,46 (d, 1H, J = 7,44).

Fremstilling av forbindelse X:

Til en omrørt oppløsning av II (2,77 g, 6,75 mmol) i metylenklorid/toluen (3:1, 30/10 ml) ble det tilsatt tinnklorid (15 ekv.) og a,a-diklormetylmetyleter (20 ekv.). Blandingen forandret farge fra oransje til mørkegrønn. Reaksjonsblandingen ble overvåket ved hjelp av HPLC med henblikk på forsvinning av utgangsmateriale. Blandingen ble avkjølt til 0°C og reaksjonen bråavsluttet ved tilsetning av vandig HCI. Materialet ble overført til en rundbunnet kolbe og konsentert i vakuum til en grønnbrun olje. Ytterligere HCI og etylacetat ble tilsatt, og materialet ble igjen konsentert i vakuum. Et brunrosa faststoff ble utfelt av oppløsningen. Faststoffet ble finfordelt med heksaner og løsningsmidlet dekantert. Denne prosess ble gjentatt 5 ganger. Faststoffet ble oppsamlet ved filtrering og tørket, hvorved man fikk et lyst rosa-brunt faststoff 2,65 g (90% utbytte). MS (ESI): m/e 439 (M+H)<+>, <1>H-NMR (DMSO-de, 300 MHz): 8 1,00 (t, 3H), 2,94 (m, 2H), 3,93 (q, 2H), 4,50 (s, 2H), 4,97 (m, 4H), 7,37 (m, 2H), 7,65 (d, 1H), 7,96 (d, 1H), 8,03 (d, 1H), 8,52 (s, 1H), 8,67 (s, 1H), 9,48 (d, 1H), 10,49 (s, 1H).

Eksempel 29 (metode B): Til en suspensjon av forbindelse X (2,37 g, 0,005 mol) i THF (50 ml) ved 0°C under nitrogen ble det tilsatt litiumborhydrid (10 ekv.). Den lysebrune blanding ble omrørt ved romtemperatur i 3<1>/21, hvoretter det ikke ble observert noe utgangsmateriale ved HPLC. Blandingen ble avkjølt til 0°C, og metanol ble tilsatt meget langsomt til det ikke ble observert noen utvikling av gass. Blandingen ble homogen, og deretter begynte det å dannes en utfelning. Blandingen ble konsentert i vakuum til et blekgult faststoff, som ble finfordelt med vann og oppsamlet ved filtrering, hvorved man fikk 2,0 g produkt (96% utbytte).

Utfelling av forbindelse VIII:

Til en suspensjon av forbindelse 29 (1,13 mmol, 1 ekv.) i metylenklorid (30 ml) ved 0°C under nitrogen ble det tilsatt trifluoreddiksyreanhydrid (3 ekv.), fulgt av trietylamin (3 ekv.). Reaksjonsblandingen ble gradvis homogen og ble omrørt ved 0°C i 11, og deretter oppvarmet til romtemperatur natten over. Blandingen ble fortynnet med metylenklorid og vasket med vann og saltoppløsning. Den organiske fase ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og konsentert i vakuum til et faststoff. Dette materiale ble anvendt videre uten rensing.

Generell metode for eterdannelse (generell struktur IX):

VIII ble oppløst i en passende alkohol (0,025 M) og oppvarmet til 80°C i oljebad. Reaksjonsblandingen ble overvåket med henblikk på forsvinning av utgangsmateriale. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur og løsningsmidlet fjernet i vakuum, hvorved det ble tilbake et faststoff. Det resulterende faststoff ble finfordelt med eter og oppsamlet ved filtrering. I noen tilfeller ble produktene renset ytterligere under anvendelse av kromatografiteknikker.

Følgende forbindelser ble fremstilt i henhold til ovennevnte generelle metode: Eksempel 1: R<5> = Oet, 18% renset utbytte; MS (m/z): 427 (M<+>+1); <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-de) 8 (ppm): 1,148 (t, 3H), 1,94 (m, 2H), 3,46-3,52 (m, 4H), 4,53 (s, 2H), 4,60 (s, 2H), 4,73 (m, 2H), 4,91 (s, 2H), 7,36 (m, 3H), 7,48 (d, 1H), 7,64 (m, 2H), 7,90 (s, 1H), 8,55 (s, 1H), 9,47 (d, 1H).

Eksempel 2: R<3> = Orne, 95% utbytte; MS (m/z): 413 (M<+>+1); 435 (M+Na); <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm): 1,99 (m, 2H), 3,36 (s, 3H), 3,54 (m, 2H), 4,58 (s, 2H), 4,66 (s, 2H), 4,79 (m, 2H), 4,96 (s, 2H), 7,40-7,49 (m, 2H), 7,52 (d, 1H), 7,65-7,84 (m, 2H), 7,98 (s, 1H), 8,60 (s, 1H), 9,51 (d, 1H).

Eksempel 3: R<3> = OiPr, 31% utbytte; MS (m/z): 441 (M<+>+1); (300 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm): 1,15 (d, 6H), 1,92 (m, 2H), 3,45 (m, 2H), 3,67 (m, 1H), 4,52 (s, 2H), 4,61 (s, 2H), 4,73 (m, 2H), 4,89 (s, 2H), 7,3-7,39 (m, 2H), 7,47 (d, 1H), 7,62-7,69 (m, 2H), 7,89 (s, 1H), 8,54 (s, 1H), 9,47 (d, 1H).

Eksempel 4: R<3> = OCH(CH3)CH2CH3, 25% utbytte; MS (m/z): 455 (M<+>+1); <1>H-NMR (300 MHz, CDCI3) 8 (ppm): 0,98 (t, 3H), 1,26 (d, 3H), 1,65 (m, 2H), 2,03 (m, 2H), 3,56 (m, 2H), 4,095 (m, 1H), 4,24 (s, 2H), 4,57 (m, 2H), 4,70 (m, 2H), 4,71 (s, 2H), 6,12 (s, 1H), 7,33 (t, 1H), 7,42-7,58 (m, 4H), 7,75 (s, 1H), 9,48 (d, 1H).

Eksempel 5: R<3> = (R)-OCH(CH3)CH2CH3, 61% utbytte; MS (m/z): 455 (M<+>+1); <1>H-NMR (300 MHz, CDCI3) 8 (ppm): 0,98 (t, 3H), 1,26 (d, 3H), 1,65 (m, 2H), 2,03 (m, 2H), 3,56 (m, 2H), 4,095 (m, 1H), 4,24 (s, 2H), 4,57 (m, 2H), 4,70 (m, 2H), 4,71 (s, 2H), 6,12 (s, 1H), 7,33 (t, 1H), 7,42-7,58 (m, 4H), 7,75 (s, 1H), 9,48 (d, 1H).

Eksempel 6: R<3> = (S)-OCH(CH3)CH2CH3, 93% utbytte; MS (m/z): 455 (M<+>+1); <1>H-NMR (300 MHz, CDCI3) 8 (ppm): 0,98 (t, 3H), 1,26 (d, 3H), 1,65 (m, 2H), 2,03 (m, 2H), 3,56 (m, 2H), 4,095 (m, 1H), 4,24 (s, 2H), 4,57 (m, 2H), 4,70 (m, 3H), 4,71 (s, 2H), 6,12 (s, 1H), 7,33 (t, 1H), 7,42-7,58 (m, 4H), 7,75 (s, 1H), 9,48 (d, 1H).

Eksempel 8: R<3> = O-nPr, 62% utbytte; MS (m/z): 441 (M<+>+1), 462 (M<+>+Na); <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm): 0,88 (t, 3H), 1,55 (m, 2H), 1,933 (m, 2H), 3,36-3,58 (m, 4H), 4,53 (s, 2H), 4,61 (s, 2H), 4,73 (m, 3H), 4,90 (s, 2H), 7,33-7,39 (m, 2H), 7,47 (d, 1H), 7,62-7,70 (m, 2H), 8,54 (s, 1H), 9,47 (d, 1H).

Eksempel 9: R<3> = O-nBu, 92% utbytte; MS (m/z): 455 (M<+>+1); <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-de) 8 (ppm): 0,854 (t, 3H), 1,34 (m, 2H), 1,52 (m, 2H), 1,93 (m, 2H), 3,48 (m, 2H), 4,52 (s, 2H), 4,60 (s, 2H), 4,73 (m, 3H), 4,89 (s, 2H), 7,30-7,42 (m, 2H), 7,47 (d, 1H), 7,62-7,70 (m, 2H), 7,89 (s, 1H), 8,54 (s, 1H), 9,47 (d, 1H).

Eksempel 17: R<3> = O-tBu, 35% utbytte; MS (m/z): 455 (M<+>+1), 477 (M<+>+Na); <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm): 1,28 (s, 9H), 1,97 (m, 2H), 3,62 (m, 2H), 4,56

(s, 2H), 4,52 (s, 2H), 4,77 (m, 3H), 4,94 (s, 2H), 7,35-7,72 (3m, 3H), 7,72 (m, 2H), 7,90 (s, 1H), 8,57 (s, 1H), 9,50 (d, 1H).

Eksempel 25: R<6> = Set, 96% utbytte; MS (m/z): 443 (M<+>+1); <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm): 1,17 (t, 3H), 1,93 (m, 2H), 2,42 (q, 2H), 3,48 (m, 2H), 3,93 (s, 2H), 4,52 (s, 2H), 4,72 (m, 3H), 4,89 (s, 2H), 7,33-7,49 (m, 3H), 7,65 (m, 2H), 7,88 (s, 1H), 8,56 (s, 1H), 9,46 (d, 1H).

Eksempel 26: R<6> = SOCH(CH3)2, MS (m/z): 494 (M<+>+Na); <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-de) 8 (ppm): 1,21 (dd, 6H), 1,93 (m, 2H), 2,82 (m, 1H), 3,49 (m, 2H), 4,12 (d, 1H), 4,23 (d, 1H), 2,52 (s, 2H), 4,75 (m, 3H), 4,88 (s, 2H), 7,33-7,45 (m, 2H), 7,55 (d, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,71 (d, 1H), 7,94 (s, 1H), 8,58 (s, 1H), 9,47 (d, 1H).

Eksempel 27: R<6> = SCH(CH3)2, MS (m/z): 457 (M<+>+1), 479 (M<+>+Na); <1>H-NMR (300 MHz, CDCI3) 8 (ppm): 1,31 (d, 6H), 2,34 (m, 2H), 2,86 (m, 1H), 3,98 (s, 2H), 4,29 (s, 2H), 4,45 (m, 1H), 4,74 (m, 2H), 4,92 (s, 2H), 6,07 (s, 1H), 7,39 (m, 2H), 7,51 (m, 2H), 7,57 (m, 1H), 7,80 (s, 1H), 9,53 (d, 1H).

Eksempel 37: R6 = nPrS (Trifluoracetat), 66% utbytte; <1>H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz,) 8 0,92 (t, 3H), 1,58 (q, 2H), 2,29 (m, 2H), 2,44 (t, 2H), 3,95 (s, 2H), 4,53 (m, 4H), 4,82 (m, 2H), 4,93 (s, 2H), 7,41 (m, 2H), 7,52 (d, 1H), 7,60 (d, 1H), 7,72 (d, 1H), 7,93 (s, 1H), 8,62 (s, 1H), 9,51 (d, 1H).

Eksempel 38: R6 = S(C5H4N), 51% utbytte; MS (ESI): m/e 514 (M+NaV, <1>H-NMR (DMSO-de, 300 MHz): 8 1,014 (m, 2H), 3,45 (m, 2H), 4,51 (s, 2H), 4,60 (s, 2H), 4,72 (m, 3H), 4,85 (s, 2H), 7,11 (m, 1H), 7,30-7,41 (m, 3H), 7,54-7,67 (m, 4H), 8,02 (s, 1H), 8,48 (d, 1H, J = 3,97), 8,55 (s, 1H), 9,46 (d, 1H, J = 7,36).

Eksempel 39: R<6> = S(C4H3N2), 52% utbytte; MS (m/z): 493 (M+H); <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-de) 8 (ppm): 1,93 (m, 2H), 3,45 (m, 2H), 4,51 (s, 3H), 4,60 (s, 2H), 4,72 (m, 2H), 4,88 (s, 2H), 7,22 (t, 1H), 7,32-7,68 (m, 6H), 8,05 (s, 1H), 8,55 (s, 1H), 8,66 (d, 1H), 9,46 (d, 1H).

Eksempel 30: R<5> = H, 44% utbytte; <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm): 4,13 (s, 2H), 4,64 (s, 2H), 4,89 (s, 2H), 7,28-7,42 (m, 3H), 7,53 (d, 1H), 7,64 (d, 1H), 7,89 (s, 1H), 8,49 (s, 1H), 9,34 (d, 1H), 11,83 (s, 1H).

Eksempel 31: R<5> = Oet, 83% utbytte; <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm): 1,18 (t, 3H), 3,55 (q, 2H), 4,62 (s, 2H), 4,93 (s, 2H), 7,34-7,46 (m, 3H), 7,58 (d, 1H), 7,68 (d, 1H), 7,92 (s, 1H), 8,54 (s, 1H), 9,39 (d, 1H), 11,91 (s, 1H).

Eksempel 32: R<5> = OiPr, 41% renset utbytte; <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm): 1,15 (d, 6H), 3,68 (m, 1H), 4,13 (s, 2H), 4,59 (s, 2H), 4,89 (s, 2H), 7,28-7,42 (m, 3H), 7,54 (d, 1H), 7,64 (d, 1H), 7,88 (s, 1H), 8,49 (s, 1H), 9,35 (d, 1H), 11,87 (s, 1H).

Fremstilling av forbindelse XI:

Til en suspensjon av aluminiumklorid (3 ekv.) i 1,2-dikloretan/metylenklorid (1:1,8 ml) ble det tilsatt acetylklorid (3 ekv.) under nitrogen. Reaksjonsblandingen ble homogen og ble avkjølt til 0°C på isbad. En oppslemning av B (0,84 mmol, 1 ekv.) i metylenklorid (3 ml) ble tilsatt dråpevis, og blandingen fikk brun farge. Isbadet ble fjernet, og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til romtemperatur. Blandingen ble oppvarmet til tilbakeløp i 21 og deretter avkjølt til romtemperatur. HPLC viste intet tilstedeværende utgangsmateriale. Blandingen ble helt over isvann, og konsentrert HCI (5 ml) ble tilsatt. Det ble dannet et utfelt materiale, og dette ble oppsamlet ved filtrering og tørket. 340 mg (89% utbytte), MS (m/z): 453 (M<+>+1); <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-de) 8 (ppm): 2,02 (s, 3H), 2,18 (m, 2H), 2,74 (s, 3H), 4,12 (m, 2H), 4,56 (s, 2H), 4,83 (m, 2H), 5,05 (s, 2H), 7,43 (m, 2H), 7,68 (d, 1H), 7,86 (d, 1H), 8,17 (d, 1H), 8,56 (s, 1H), 8,72 (1H), 9,53 (d, 1H).

Eksempel 33: Til en suspensjon av XI (0,18 mmol, 1 ekv.) i THF (6 ml) under nitrogen ble det tilsatt litiumborhydrid (10 ekv.) ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0°C i 11 og deretter oppvarmet til romtemperatur i 41. Blandingen ble avkjølt til 0°C, og metanol ble langsomt tilsatt dråpevis. Kraftig utvikling av gass ble observert under brå-avslutningen av overskudd av borhydrid. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur natten over. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med etylacetat og vasket med vann og saltoppløsning. Den organiske fase ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og konsentert i vakuum til et hvitt faststoff, 69 mg (90% utbytte). MS (m/z): 413 (M<+>+1), 435 (M<+>+Na); <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm): 1,41 (d, 3H), 1,92 (m, 2H), 3,46 (m, 2H), 4,52 (s, 2H), 4,71 (m, 3H), 4,89 (s, 3H), 5,18 (s, 1H), 7,32-7,39 (m, 2H), 7,50 (d, 1H), 7,64 (m, 2H), 7,89 (s, 1H), 8,55 (s, 1H), 9,46 (d, 1H).

Følgende forbindelser ble fremstilt I henhold til den generelle metode for eterdannelse under anvendelse av tri-trifluoracetat-mellomproduktene: Eksempel 10: R5 = Oet, 68% utbytte: MS (m/z): 441 (M<+>+1), 395 (M+-0CH2CH3); <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm): 1,08 (t, 3H), 1,41 (d, 3H), 1,93 (m, 2H), 3,47 (m, 2H), 4,52 (s, 2H), 4,60 (m, 1H), 4,73 (m, 2H), 4,90 (m, 2H), 7,33-7,39 (m, 2H), 7,47 (d, 1H), 7,63 (d, 1H), 7,69 (d, 1H), 7,86 (s, 1H), 8,55 (s, 1H), 9,47 (d, 1H).

Reversert-fase-HPLC-separasjon av 10 ga isomerer 11 og 12.

Eksempel 11 (kiralt): R<5> = Oet, MS (m/z): 441 (M<+>+1); 395 (M+-0CH2CH3). Eksempel 12 (kiralt): R<5> = Oet, MS (m/z): 441 (M<+>+1); 395

(M+-0CH2CH3).

Eksempel 13: R<5> = Orne, 76% utbytte; MS (m/z): 427 (M +1); <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-de) 8 (ppm): 1,45 (d, 3H), 1,98 (m, 2H), 3,14 (s, 3H), 3,50 (m, 2H), 4,58 (m, 3H), 7,75 (m, 2H), 4,93 (s, 2H), 7,33 (m, 2H), 7,48 (d, 1H), 7,67 (d, 1H), 7,72 (d, 1H), 7,88 (s, 1H), 8,58 (s, 1H), 9,49 (d, 1H).

Eksempel 15: R5 = Obu, 73% utbytte; <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm): 0,81 (t, 3H), 1,27-1,43 (m, 7H), 1,93 (m, 2H), 3,48 (m, 2H), 4,53 (s, 2H), 4,58 (m, 1H), 4,73 (m, 4H), 4,92 (m, 2H), 7,33-7,39 (m, 2H), 7,46 (d, 1H), 7,63 (d, 1H), 7,69 (d, 1H), 7,86 (s, 1H), 8,55 (s, 1H), 9,47 (d, 1H).

Eksempel 16: R<5> = OiPr, 63% utbytte; <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm): 1,01 (d, 3H), 1,10 (d, 3H), 1,38 (d, 3H), 1,95 (m, 2H), 3,47 (m, 2H), 3,98 (q, 1H), 4,26 (m, 1H), 4,52 (s, 2H), 4,74 (m, 3H), 4,90 (m, 2H), 7,33-7,39 (m, 2H), 7,48 (d, 1H), 7,62-7,69 (m, 2H), 7,87 (s, 1H), 8,54 (s, 1H), 9,47 (d, 1H).

Eksempel 35: R<5> = H, 98% utbytte; MS (m/z): 455 (M<+>+1), 337 (M<+->H20); <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-de) 5 (ppm): 1,45 (d, 3H), 4,25 (m, 3H), 4,86 (s, 2H), 5,16 (d, 1H), 7,28-7,39 (m, 2H), 7,43 (d, 1H), 7,56 (d, 1H), 7,66 (d, 1H), 7,92 (s, 1H), 8,49 (s, 1H), 9,35 (d, 1H), 11,78 (s, 1H).

Eksempel 36: R<5> = Orne, 50% utbytte: MS (m/z): 369 (M+1); <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-de) 8 (ppm): 1,43 (d, 3H), 3,16 (s, 3H), 4,15 (m, 2H), 4,49 (m, 1H), 4,93 (s, 2H), 7,32-7,40 (m, 3H), 7,58 (d, 1H), 7,67 (d, 1H), 7,84 (s, 1H), 8,50 (s, 1H), 9,44 (d, 1H), 11,87 (s, 1H).

Eksempel 34: R<5> = H, (77% utbytte over 2 trinn); MS (m/z): 427 (M<+>+1), 409 (M<+->H20); <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm): 0,848 (t, 3H), 1,70 (m, 2H), 1,93 (m, 2H), 3,47 (m, 2H), 4,52 (s, 2H), 4,61 (m, 1H), 4,72 (m, 3H), 4,89 (s, 2H), 5,14 (s, 1H), 7,29-7,39 (m, 2H), 7,44 (d, 1H), 7,64 (m, 2H), 7,87 (s, 1H), 8,54 (s, 1H), 9,46 (d, 1H).

Generell metode for esterdannelse ifølge eksempel 3: En ovnstørket, 3 liters, 3-halset rundbunnet kolbe utstyrt med mekanisk rører, en treveis stoppekran forbundet med en argonballong og et nedsenkingstermometer ble ifylt forbindelse 3 (148,6 mmol), fulgt av vannfritt N,N-dimetylacetamid (654 ml). 4-(dimetylamino)-pyridin (DMAP) (0,5 ekv.), aminosyre (2,5 ekv.) og 1 -[3-(dimetylamino)propyl]-3-etylkarbodiimidhydroklorid (2,5 ekv.) ble tilsatt sekvensielt ved 35°C til den klare rødfargede oppløsning. Reaksjons-suspensjonen ble oppvarmet til 42-45°C i 21, og ytterligere mengder av DMAP (0,08 ekv.), aminosyre (0,5 ekv.) og 1 -[3-(dimetylamino)propyl]-3-etylkarbodiimidhydroklorid (0,5 ekv.) ble tilsatt sekvensielt. Etter VÆ time ble reaksjonsblandingen avkjølt til 0-5°C, og reaksjonen brått avsluttet med vann. Kjølebadet ble fjernet, og den resulterende blekgule suspensjon ble omrørt ved romtemperatur i 11. Suspensjonen ble filtrert, vasket med vann til pH 8 og tørket natten over under anvendelse av husvakuum. Det blekgule faststoff ble ikke tørket fullstendig, det ble oppløst i metylenklorid og vannfasen ble fraskilt. Den organiske fase ble vasket med saltoppløsning, tørket over MgS04, filtrert over celite og konsentert under anvendelse av rotasjonsfordamper, hvorved man fikk det ubearbeidede faststoff. Råmaterialet ble igjen oppløst i metylenklorid og overført til en 31,3-halset rundbunnet kolbe, som ble utstyrt med mekanisk rører. Etylacetat (1 I) ble tilsatt dråpevis ved romtemperatur til den klare rødfargede oppløsning i 70 min. med kontinuerlig omrøring. Etter tilsetting av etylacetat (15 ml), ble det dannet en utfelning. Oppslemningen ble omrørt i 2<1>/21, fulgt av oppsamling av faststoffet ved filtrering. Det utfelte materiale ble vasket sekvensielt med etylacetat, en blanding av etylacetat/metyl-tert.-butyleter (3:2) og metyl-t-butyleter og tørket til et varm hvitt faststoff, 78% utbytte.

Eksempel 18: MS (m/z): 498 (M<+>+1)

Eksempel 19: MS (m/z): 566 (M<+>+1)

Eksempel 20: MS (m/z): 569 (M<+>+1)

Eksempel 21: MS (m/z): 512 (M<+>+1)

Eksempel 22: MS (m/z): 554 (M<+>+1)

Eksempel 23: MS (m/z): 526 (M<+>+1)

Eksempel 24: MS (m/z): 554 (M<+>+1)

Fremstilling av XIII:

Eksempel 31 (0,33 mmol) ble oppløst i DMF (10 ml), og halvdelen av volumet ble fjernet ved destillasjon. Kolben ble avkjølt til romtemperatur, og natriumhydrid (1 ekv.) ble tilsatt og blandingen omrørt i 11. Mesylglycidol (1,5 ekv.) ble tilsatt og blandingen oppvarmet til 50°C i 241 og deretter avkjølt til romtemperatur. Blandingen ble filtrert og løsningsmidlet fjernet i vakuum. Reaksjonsblandingen ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel, hvorved man fikk XIII i 73% utbytte. 1,19 (t, 3H), 2,78 (t, 1H), 3,53 (m, 4H), 4,53 (s, 2H), 4,65 (s, 2H), 4,78 (dd, 1H), 4,96 (s, 2H), 5,20 (d, 1H), 7,35-7,47 (m, 2H), 7,51 (d, 1H), 7,68 (d, 1H), 7,75 (d, 1H), 7,95 (s, 1H), 8,62 (s, 1H), 9,55 (d, 1H).

Eksempel 7: Forbindelse XIII (100 mg) ble oppløst I THF (10 ml), og trietylborhydrid (2 ml) ble tilsatt dråpevis. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 70°C i 41. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur, og 1N HCI ble tilsatt. Løsningsmidlet ble fjernet i vakuum, og materialet ble tatt opp i en blanding av metanol/vann. Det resulterende utfelte materiale ble oppsamlet ved filtrering og tørket. 1,19 (t, 3H), 1,25 (d, 3H), 3,55 (q, 2H), 4,13 (m, 2H), 4,58 (s, 2H), 4,61 (s, 2H), 4,64 (s, 2H), 4,93 (s, 2H), 4,97 (t, 1H), 7,34-7,45 (m, 2H), 7,49 (d, 1H), 7,69 (t, 2H), 7,92 (s, 1H), 8,57 (s, 1H), 9.50 (d, 1H).

Eksempel 14: Til en oppslemning av XIV (0,75 mmol) i metylenklorid/metanol/- HMPA (4:2:1 ml) ble det tilsatt cesium karbonat (4,0 ekv.). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 30 min., fulgt av tilsetting av acetaldehyd. Ytterligere acetaldehyd ble tilsatt, med liten forandring observert ved TLC. Blandingen ble fortynnet med metylenklorid og vasket med vann og saltoppløsning. Den organiske fase ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og konsentert i vakuum. Råproduktet XV ble isolert ved hjelp av kolonnekromatografi (33% utbytte). XV (0,3 mmol) ble oppløst i metylenklorid og avkjølt til 0°C. Etantiol (2 dråper) og trifluoreddiksyre (TFA) (1 dråpe) ble tilsatt til oppløsningen og blandingen omrørt ved 0°C i 11. Blandingen ble oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 1 t. Ytterligere TFA (2 dråper) ble tilsatt til reaksjonsblandingen, og etter 30 minutter var reaksjonen fullstendig. Produktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel under anvendelse av metylenklorid/etylacetat. En enkelt diastereomer ble isolert, 65 mg (53%). 0,52 (d, 3H), 1,21 (t, 3H), 2,47 (q, 2H), 3,96 (s, 2H), 4,49 (s, 1H), 4,86 (m, 1H), 4,94 (s, 2H), 6,18 (s, 1H), 7,35-7,45 (m, 3H), 7,64 (d, 1H), 7,72 (d, 1H), 7,92 (s, 1H), 8,57 (s, 1H), 9,41 (d, 1H), 10,99 (s, 1H).

Fremstilling av XVII: Til en oppløsning av heksametylentetraamin (1,6 g, 11,4 mmol) i TFA ble det tilsatt XVI (2,0 g, 4,6 mmol) ved 60-65°C. Etter omrøring i 2 timer, ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur, fulgt av dråpevis tilsetting i 2N H2S04 - aceton (150 ml) (2:1). Faststoffet ble oppsamlet, oppslemmet i dioksolan (150 ml) og oppvarmet til tilbakeløp i 30 minutter. Det uoppløste materiale ble fjernet ved filtrering, og løsningsmidlet ble konsentert til ca. 25 ml. MeOH (50 ml) ble tilsatt for utfelling av produktet, som ble oppsamlet og tørket, hvorved man fikk 700 mg av et gulaktig ("off yellow") faststoff. MS ES<+> 467 (M + 1).

Eksempel 28: En oppslemning av XVII (500 mg, 1,1 mmol) i CHCI^metanol (60 ml, 5/1) ble tilsatt fast NaBH4 (200 mg). Oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur i 41. CHCI3 ble fjernet ved redusert trykk, fulgt av tilsetting av 2 N HCI. Oppløsningen ble omrørt i 21 og deretter oppsamlet og tørket, hvorved man fikk 420 mg av et varmhvitt faststoff. MS (ES<+>) 469 (M + 1). Den ubearbeidede alkohol ble oppslemmet i CHCI3-MeOH (25 ml + 10 ml) og deretter tilsatt 0,7 ml 1 M NaOMe, fulgt av røring i 12 timer ved romtemperatur. Løsningsmidlet ble konsentert, faststoffet finfordelt med MeOH og produktet oppsamlet, hvorved man fikk diolen, 420 mg (84%). <1>H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz): 8 3,8 (m, 2H), 4,55 (s, 2H), 4,63 (d, 2H), 4,75 (m, 2H), 4,97 (s, 2H), 5,0 (m, 1H), 5,23 (m, 1H), 7,34-7,51 (m, 4H), 7,68 (m, 2H), 7,94 (s, 1H), 8,57 (s, 1H), 9,51 (d, 1H), MS (ES<+>) 385 (M + 1).

Eksempel 24: En oppslemning av eksempel 28 (50 mg, 0,13 mmol) i CHCI3 ble tilsatt kamfersulfonsyre (30 mg, 0,26 mmol) og etandiol (0,39 mmol), fulgt av omrøring 12 under nitrogen. Overskudd av CHCI3 ble tilsatt, og deretter ble oppløsningen vasket med 2 M Na2C03-oppløsning, vann og saltoppløsning, og tørket (MgS04). Løsningsmidlet ble konsentrert og produktet oppsamlet etter finfordeling med MeOH. <1>H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz): 8 1,1, 2,3 (m, 2H), 3,85 (m, 2H), 4,0 (s, 2H), 5,5 (s, 2H), 4,8 (m, 2H), 4,9 (s, 2H), 5,0 (t, 1H), 7,35-7,5 (m, 4H), 7,7 (m, 2H), 8,6 (s, 1H), 9,5 (d, 1H), (m, 3H), MS (ES+) 429, 451 (M + 1, + 23).

Eksempel 40: Til en oppløsning ifølge eksempel 3 (210 mg, 0,48 mmol) i DMF (10 ml) ble det tilsatt DMAP (1 mg), Et3N (267 uJ, 1,92 mmol) og tBDMSCI (220 mg, 1,47 mmol). Etter omrøring i 201, ble blandingen tatt opp i EtOAc og suksessivt vasket med vandig NaHC03, vann og saltoppløsning. Den organiske fase ble tørket over MgS04, filtrert og inndampet, hvorved man fikk et residuum, som ble renset ved kolonnekromatografi (silikagel, 10% EtOAc/heksan), hvorved man fikk 225,1 mg av mellomproduktet XVIII (70%).

En blanding av XVIII (68,1 mg, 0,10 mmol) og paraformaldehyd (63,1 mg, 2,1 mmol) i pyridin (4 ml) ble behandlet med en 0,25 M oppløsning av Triton B i pyridin (100 (il, 0,025 mmol). Etter omrøring i 21, ble det tilsatt ytterligere Triton B i pyridin (150 (il, 0,038 mmol). Etter 11 ble blandingen tatt opp i EtOAc og vasket grundig med vandig CuS04. Etter vasking med vann, vandig NaHC03 og saltoppløsning, ble den organiske fase tørket over MgS04, filtrert og inndampet, hvorved man fikk et residuum, som ble renset ved kolonnekromatografi (silikagel, 22% EtOAc/heksan), hvorved man fikk 45,2 mg av IXX (64%) som hadde følgende spektrale egenskaper: <1>H-NMR (DMSO-d6) 8 9,42 (d, 1H, J = 7,7), 7,97 (s, 1H), 7,75-7,72 (m, 2H), 7,52 (d, 1H, J = 8,5), 7,44 (dd, 1H, J = 7,7, 7,5), 7,36 (dd, 1H, J = 7,7, 7,5), 5,13 (m, 1H), 5.04 (s, 2H), 4,77 (m, 1H), 4,70 (s, 2H), 4,10 (m, 1H), 3,76 (sep, 1H, J = 6,1), 3,54 (m, 1H), 3,44 (m, 1H), 3,31 (m, 3H), 1,79 (m, 2H), 1,22 (m, 6H), 1,07 (s, 9H), 0,85 (s, 9H), 0,52 (s, 6H), 0,00 (s, 3H), -0,03 (s, 3H); MS (m/z): 699 (M+H).

Til en oppløsning av XXI (22,5 mg, 0,032 mmol) i PrOH (10 ml) ble det tilsatt TMSCI (100 |xl), og blandingen ble omrørt i 2>h t. Etter inndamping av løsningsmidlet, ble residuet finfordelt med eter (3x1 ml) og tørket, hvorved man fikk 10,8 mg av eksempel 40 (72%), som hadde følgende spektrale egenskaper: <1>H-NMR (DMSO-de) 9,49 (d, 1H, J = 7,7), 8,59 (s, 1H), 7,96 (s, 1H), 7,80 (d, 1H, J = 7,3), 7,77 (d, 1H, J = 8,5), 7,55 (d, 1H, J = 7,3), 7,45 (m, 1H), 7,37 (m, 1H), 4,98 (m, 3H), 4,78 (m, 2H), 4,70 (s, 2H), 4,20-4,16 (m, 2H), 3,76 (sep, 1H, J = 6,1), 3,38 (m, 1H), 3,36-3,25 (m, 2H), 1,80 (m, 2H), 1,23 (d, 6H, J = 6,1); MS m/ z471 (M+H).

Inhibering av vaskulær endotelial vekstfaktor-reseptor-kinaseaktivitet

Kondenserte pyrrolkarbazolforbindelser ble undersøkt med henblikk på sine inhiberende virkninger på kinaseaktiviteten av baculovirus-uttrykt VEGF-reseptor-(human flk-1, KDR, VEGFR2)-kinasedoméne under anvendelse av metoden beskrevet for trkA-kinase-ELISA-analysen beskrevet nedenfor. Kinasereaksjons-blandingen, bestående av 50 mM Hepes, pH 7,4,40 \ lM ATP, 10 mM MnCI2, 0,1% BSA, 2% DMSO og forskjellige konsentrasjoner av inhibitor ble overført til PLC-y/GST-belagte plater. VEGFR-kinase ble tilsatt, og reaksjonen fikk foregå i 15 min. ved 37°C. Påvisning av fosforylert produkt ble utført ved tilsetting av anti-fosfotyrosin-antistoff (UBI). Et sekundært enzymkonjugert antistoff ble avgitt for oppfanging av det antistoff-fosforylerte PLC-y/GST-kompleks. Aktiviteten av det bundne enzym ble målt via et amplifisert påvisningssystem (Gibco-BRL). Inhiberingsdataene ble analysert under anvendelse av den sigmoidale doserespons-(variabel helning)-likning i GraphPad Prism. Resultatene er oppsummert i tabell III.

Inhibering av blandet- linie- kinase- 1-( MLK1)- aktivitet

Kinaseaktiviteten av MLK1 ble fastsatt ved anvendelse av Millipore Multiscreen TCA "i-plate"-formatet som beskrevet for proteinkinase C (Pitt & Lee, J. Biomol. Screening, 1: 47-51,1996). Kort angitt inneholdt hver 50 uJ analyseblanding 20 mM Hepes, pH 7,2, 5 mM EGTA, 15 mM MgCI2, 25 mM p-glycerofosfat, 60 ^M ATP, 0,25 uCi [f<32>P]ATP, 0,1% BSA, 500 ug/ml myelin-basisk protein (UBI nr. 13-104), 2% DMSO, 1 (iM testforbindelse og 1 |ig/ml baculoviral GST-MLK1Kd- Prøvene ble inkubert i 15 min. ved 37°C. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetting av iskald 50% TCA, og proteinene fikk utfelles i 30 min. ved 4°C. Platene ble så vasket med iskald 25% TCA. Supermix-scintillasjonsblanding ble tilsatt, og platene fikk ekvilibreres i 1 -2 timer før telling under anvendelse av Wallac MicroBeta 1450 PLUS-scintillasjonstelleren.

Inhiberin<g> av blandet- linle- kinase- 2 ( MLK2)- aktivitet

Det ble utført analyser med anvendelse av Millipore Multiscreen-plateformat som beskrevet for MLK1. Hver 50 uJ analyseblanding inneholdt 20 mM Hepes, pH 7,2, 5 mM EGTA, 15 mM MgCI2, 25 mM p-glycerofosfat, 100 uM ATP, 0,25 uCi [7-<32>P]ATP, 0,1% BSA, 500 ug/ml myelin-basisk protein (UBI nr. 13-104), 2% DMSO, forskjellige konsentrasjoner av testforbindelse og 3 u.g/ml av baculovirus-GST-MLK2kdlz- Prøvene ble inkubert i 15 min. ved 37°C. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetting av iskald 50% TCA, og proteinene fikk utfelles i 30 min. ved 4°C. Platene ble så vasket med iskald 25% TCA. Supermix-scintillasjonsblanding ble tilsatt, og platene fikk ekvilibreres i 1 -2 timer før telling.

Inhibering av blandet- linie- kinase- 3-( MLK3)- aktivitet

Det ble utført analyser under anvendelse av Millipore Multiscreen-plateformatet som beskrevet for MLK1. Kort angitt inneholdt hver 50 (il analyseblanding 20 mM Hepes, pH 7,2, 5 mM EGTA, 15 mM MgCI2, 25 mM p-glycerofosfat, 100 u.M ATP, 0,25 uCi [y^PjATP, 0,1% BSA, 500 ug/ml myelin-basisk protein (UBI nr. 13-104), 2% DMSO, forskjellige konsentrasjoner av testforbindelse og 2 ug/ml av baculovirus-GST-MLK3xD- Prøvene ble inkubert i 15 min. ved 37°C. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetting av iskald 50% TCA, og proteinene fikk utfelles i 30 min. ved 4°C. Platene ble så vasket med iskald 25% TCA. Supermix-scintillasjonsblanding ble tilsatt, og platene fikk ekvilibreres i 1 -2 timer før telling.

Inhibering av trkA- tvrosinkinaseaktivitet

Utvalgte isomere kondenserte pyrrolkarbazol- og isoindolonforbindelser kan testes med henblikk på sin evne til å inhibere kinaseaktiviteten av baculovirus-uttrykt humant trkA-cytoplasmadoméne under anvendelse av en ELISA-basert analyse som tidligere beskrevet (Angeles et al., Anal. Biochem. 236: 49-55,1996). Kort angitt belegges 96 brønns-mikrotiterplaten med substratoppløsning (rekombinant humant fosfolipase C-yl/glutation S-transferase-fusjonsprotein (Rotin et al., EMBO J., 11: 559-567,1992). Inhiberingsundersøkelser utføres i 100 |il analyseblandinger inneholdende 50 mM Hepes, pH 7,4, 40 u.M ATP, 10 mM MnCI2, 0,1% BSA, 2% DMSO, og forskjellige konsentrasjoner av inhibitor. Reaksjonen startes ved tilsetting av trkA-kinase og får foregå i 15 minutter ved 37°C. Et antistoff mot fosfotyrosin (UBI) blir så tilsatt, fulgt av et sekundært enzymkonjugert antistoff, alkalisk fosfatase-merket geite-antimus-IgG (BioRad). Aktiviteten av det bundne enzym måles ved hjelp av et amplifisert påvisningssystem (Gibco-BRL). Inhiberingsdataene analyseres under anvendelse av den sigmoidale doserespons-(variabel helning)-likning i GraphPad Prism. Konsentrasjonen som resulterte i 50% inhibering av kinaseaktiviteten, omtales som "IC50".

Inhibering av NGF- stimulert trk- fosforvlerinq i et helcellepreparat

Inhiberingen av NGF-stimulert fosforylering av trk ved forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan utføres under anvendelse av en modifisert metode, som beskrevet nedenfor, i forhold til den som er tidligere beskrevet (se US-patent nr. 5 516 771). NIH3T3-celler transfektert med trkA dyrkes i 100 mm skåler. Subkonfluente celler serumsultes ved at mediet erstattes med serumfritt 0,05% BSA-DMEM inneholdende forbindelse (100 nM og 1 M) eller DMSO (tilsatt til kontrollene) i én time ved 37°C. NGF (Harlan/Bioproducts for Science) blir så tilsatt til cellene med en konsentrasjon på 10 ng/mg i 5 minutter. Cellene lyseres i bufferholdig detergent og proteaseinhibitorer. Klarede cellelysater normaliseres til protein under anvendelse av BCA-metode, og immunutfelles med anti-trk-antistoff. Det frremstilles polyklonalt anti-trk-antistoff mot et peptid svarende til de 14 aminosyrer i den karboksyterminale ende av trk (Martin-Zanca et al., Mol. Cell. Biol. 9:24-33, 1989).

Immunkompleksene oppsamles på Protein A-sepharosekuler (Sigma Chem. Co., St. Lois, MO), separeres ved SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) og overføres til en polyvinylidendifluorid-(PVDF)-membran. Membranen immunblottes med anti-fosfotyrosin-antistoff (UBI), fulgt av inkubering med pepperrotperoksidase-koplet geite-antimus-IgG (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Fosforylerte proteiner ble visualisert under anvendelse av ECL (Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, IL). Området for trk-proteinbåndet måles og sammenliknes med NGF-stimulert kontroll. Inhiberings-vurderingssystemet som anvendes, basert på prosent reduksjon i trk-proteinbånd, kan være som følger: 0 = ingen reduksjon; 1 = 1-25%; 2 = 26-49%; 3 = 50-75%; 4 = 76-100%.

Inhibering av blodplateavledet vekstfaktor- reseptor- kinaseaktivitet

Isomere kondenserte pyrrolkarbazol- og isoindolonforbindelser kan undersøkes med henblikk på sine inhiberende virkninger på kinaseaktiviteten hos baculovirus-uttrykt PDGFp-reseptor-kinasedoméne under anvendelse av trkA-kinase-ELISA beskrevet ovenfor. Analyser utføres i substrat-(PLC-y-GST)-belagte 96-brønns-mikrotiterplater. Hver 100 uJ reaksjonsblanding inneholder 50 mM HEPES, pH 7,4, 20 uM ATP, 10 mM MnCI2, 0,1% BSA, 2% DMSO og forskjellige konsentrasjoner av inhibitor. Reaksjonen startes ved tilsetting av prefosforylert rekombinant humant enzym (10 ng/ml PDGFRp) og får foregå i 15 minutter ved 37°C. Det prefosforylerte enzym fremstilles før anvendelse ved inkubering av kinasen i buffer inneholdende 20 u.M ATP og 10 mM MnCI2 i 1 time ved 4°C. Påvisning av fosforylert produkt utføres ved tilsetting av pepperrotperoksidase-(HRP)-konjugert anti-fosfotyrosin-antistoff (UBI). HRP-substratoppløsningen inneholdende 3,3'-5,5'-tetrametylbenzidin og hydrogenperoksid tilsettes senere, og platene inkuberes i 10 minutter ved romtemperatur. Reaksjonen bråavsluttes med syre, og den resulterende absorbans avleses ved 450 nm under anvendelse av en Microplate Bio-kinetics-avleser (Bio-Tek Instrument EL 312e). Inhiberingsdataene analyseres under anvendelse av den sigmoidale doserespons-(variabel helning)-likning i GraphPad Prism.

Claims

1. Forbindelser ifølge formel I: hvor: R<1> og R2 er de samme eller forskjellige og uavhengig er valgt blant H eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, eller -OR4 hvor R<4> er et alkyl med 1 -4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl eller resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; og R<3> er -CH2OH; -CH2OR<7>; -(CH2)nSR5;-(CH2)nS(0)yR<5>; -CH2SR<5>; eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, -OR<5>, -OR<8>, -CH2OR<7>, -S(0)yR<6> eller -SR<6>; og hvor R<5> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl; R<6> er H, alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv) eller aryl med 6-10 karbonatomer; R<7> er H eller alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv); R<8> er resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; n er et helt tall på 1 -4 (inklusiv); og y er 1 eller 2, med det unntak at når R<1> er (CH2)3OH og R<2> er H, da er R<3 >ikke -CH2OH, -CH2OCH2CH3 eller -CH2SCH2CH3.

2. Forbindelser ifølge formel II: hvor: R<1> og R2 er de samme eller forskjellige og uavhengig er valgt blant H eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, eller -OR<4> hvor R<4> er et alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl eller resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; og R<3> er -CHzOH; -CH2OR<7>; -(CH2)nSR<5>; -(CH2)nS(0)yR<5>; -CH2SR<5>; eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, -OR<5>, -OR<8>, -CH2OR<7>, -S(0)yR<6> eller SR<6>; og hvor R<5> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv) pyridyl eller pyrimidyl; R<6> er H, alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv) eller aryl med 6-10 karbonatomer; R<7> er H eller alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv); R<8> er resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; n er et helt tall på 1 -4 (inklusiv); og y er 1 eller 2, med det unntak at når R<1> er (CH2)3OH og R2 er H, da er R<3 >ikke -CH2OH, -CH2OCH2CH3 eller-CH2SCH2CH3.

3. Forbindelser ifølge krav 1 eller 2, hvor: R<1> er et alkyl med 1 -4 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH eller -OR4 hvor R4 er resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; R<2> er H; og R<3> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv) substituert med -OH, -OR<5>, -OR<8>, -CH2OR<7>, -S(0)yR<6> eller -SR<6>; og hvor R<5> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl; R<6> er H, alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl; R<7> er H eller alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv); og R<8> er resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet.

4. Forbindelser ifølge krav 1 eller 2, hvor: R<1> er -CH2CH2CH2OH eller -CH2CH2CH2OCOCH2N(CH3)2; R<2> er H; og R<3> er -CH2OR7 hvor R7 er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv).

5. Forbindelser ifølge krav 1 eller 2 representert i tabell I:

6. Farmasøytisk preparat omfattende en forbindelse ifølge krav 1.

7. Forbindelser ifølge formel I eller II som er representert i tabellen under:

8. Forbindelse ifølge formel I eller II som er representert i tabellen under:

9. Forbindelse ifølge formel I eller II som er representert i tabellen under:

10. Farmasøytisk preparat som omfatter forbindelsen ifølge krav 8.

11. Farmasøytisk preparat som omfatter forbindelsen ifølge krav 9.

12. Anvendelse av en forbindelse ifølge formel I eller II som er representert i tabellen under for fremstilling av et farmasøytisk preparat.

13. Anvendelse av en forbindelse ifølge formel I: hvor: R<1> og R2 er de samme eller forskjellige og uavhengig er valgt blant H eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, eller -OR<4> hvor R<4> er et alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl eller resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; og R<3> er -CHzOH; -CH2OR<7>; -(CH2)nSR<5>;-(CH2)nS(0)yR<5>; -CH2SR<5>; eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, -OR<5>, -OR<8>, -CH2OR<7>, -S(0)yR<6> eller -SR<6>; og hvor R<5> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv) pyridyl eller pyrimidyl; R<6> er H, alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv) eller aryl med 6-10 karbonatomer; R<7> er H eller alkyl med 1 -4 karbonatomer (inklusiv); R<8> er resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; n er et helt tall på 1-4 (inklusiv); og y er 1 eller 2, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av prostataforstyrrelser.

14. Anvendelse ifølge krav 13, hvor prostataforstyrrelsen er prostatakreft eller benign prostatahyperplasi.

15. Anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse formel I: hvor: R<1> og R2 er de samme eller forskjellige og uavhengig er valgt blant H eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, eller -OR4 hvor R4 er et alkyl med 1 -4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl eller resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; og R3 er -CH2OH; -CH2OR<7>;-(CH2)nSR5;-(CH2)nS(0)yR<5>; -CH2SR<5>; eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, -OR<5>, -OR<8>, -CH2OR<7>, -S(0)yR<e> eller -SR<6>; og hvor R<5> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl; R6 er H, alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv) eller aryl med 6-10 karbonatomer; R7 er H eller alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv); R<8> er resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; n er et helt tall på 1 -4 (inklusiv); og y er 1 eller 2, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av angiogene forstyrrelser.

16. Anvendelse ifølge krav 15, hvor den angiogene forstyrrelse er kreft i faste tumorer, okulære forstyrrelser, makuladegenerasjon, endometriose, diabetisk retinopati, psoriasis eller hemangioblastom.

17. Anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge formel I: Formel I hvor: R<1> og R2 er de samme eller forskjellige og uavhengig er valgt blant H eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, eller -OR<4> hvor R<4> er et alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl eller resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; og R<3> er -CH2OH; -CH2OR<7>;-(CH2)nSR5;-(CH2)nS(0)yR<5>; -CH2SR<5>; eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, -OR<5>, -OR<8>, -CH2OR<7>, -S(0)yR<6> eller -SR<6>; og hvor R<5> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl; R<6> er H, alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv) eller aryl med 6-10 karbonatomer; R<7> er H eller alkyl med 1 -4 karbonatomer (inklusiv); R<8> er resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; n er et helt tall på 1 -4 (inklusiv); og y er 1 eller 2 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av patologiske forstyrrelser.

18. Anvendelse ifølge krav 17, hvor den patologiske forstyrrelse er neoplasi, reumatoid artritt, kronisk artritt, pulmonalfibrose, myelofibrose, unormal sårheling, aterosklerose eller restenose.

19. Anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge formel I: hvor: R<1> og R<2> er de samme eller forskjellige og uavhengig er valgt blant H eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, eller -OR4 hvor R<4> er et alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl eller resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; og R<3> er -CH2OH; -CH2OR<7>; -(CH2)nSR<5>; -(CH2)nS(0)yR<5>; -CH2SR<5>; eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, -OR<5>, -OR<8>, -CH2OR<7>, -S(0)yR<6> eller -SR<6>; og hvor R<5> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl; R<6> er H, alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv) eller aryl med 6-10 karbonatomer; R7 er H eller alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv); R<8> er resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; n er et helt tall på 1 -4 (inklusiv); og y er 1 eller 2 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av neurodegenerative sykdommer og forstyrrelser, Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateralsklerose, Parkinsons sykdom, slag, iskemi, Huntingtons sykdom, AIDS-demens, epilepsi, multippel sklerose, perifer neuropati, kjemoterapi-indusert perifer neuropati, AIDS-tilknyttet perifer neuropati eller skader i hjernen eller ryggmargen.

20. Anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge formel I: hvor: R<1> og R2 er de samme eller forskjellige og uavhengig er valgt blant H eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, eller -OR<4> hvor R<4> er et alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl, eller resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; og R<3> er -CH2OH; -CH2OR<7>;-(CH2)nSR<5>;-(CH2)nS(0)yR<5>; -CH2SR<5>; eller alkyl med 1-8 karbonatomer (inklusiv), substituert med -OH, -OR<5>, -OR<8>, -CH2OR<7>, -S(0)yR<6> eller -SR<6>; og hvor R<5> er alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv), pyridyl eller pyrimidyl; R<6> er H, alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv) eller aryl med 6-10 karbonatomer; R<7> er H eller alkyl med 1-4 karbonatomer (inklusiv); R<8> er resten av en aminosyre etter at hydroksylgruppen i karboksylgruppen er fjernet; n er et helt tall på 1 -4 (inklusiv); og y er 1 eller 2 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av multippelt myelom og leukemier.

21. Anvendelse ifølge krav 20, hvor leukemien er akutt myelogen leukemi, kronisk myelogen leukemi, akutt lymfocyttleukemi eller kronisk lymfocyttleukemi.