CN1589788A - 调节多谱系激酶蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴定调节多谱系激酶蛋白活性和促进细胞存活和死亡的化合物的方法，该方法包括下述步骤：使含有所述的多谱系激酶蛋白的细胞同所述化合物接触；测定所述化合物是否使多谱系激酶蛋白的活性减少；和测定所述化合物是否促进细胞存活。本发明还涉及可用于治疗神经变性疾病和/和炎症的化合物的鉴定方法。本发明提供了调节多谱系激酶蛋白活性的方法，该方法包括使含有所述蛋白的细胞与的茚－并或吲哚并－化合物接触；本发明还提供了治疗神经变性疾病和/和炎症的方法。

Description

调节多谱系激酶蛋白
本申请为中国专利申请No.99810135.4的分案申请
发明领域
本发明部分涉及调节多谱系激酶蛋白(MLK)家族成员的方法，鉴定能够调节多谱系激酶蛋白和有助于细胞存活或者促进细胞死亡的化合物的方法，鉴定能够用于治疗神经变性疾病和/或炎症的化合物的方法，以及应用能够抑制多谱系激酶蛋白的化合物治疗神经变性疾病的方法。
发明的背景技术
MLK家族包括一组蛋白，其中家族成员激酶区的蛋白质序列与MAPKKKs极为相似，但是和其它的MAPKKKs相互之间更为相似。MLK的家族成员包含有很复杂激酶串部分，例如产生紧张信号的激酶串，该激酶串特别涉及c-Jun N-终止的激酶(JNK)的调变，所述的调变可依次调节转录因子，这包括c-Jun、ATF2和ELK-1。JNK在USP5,534,426、5,593,884、5,605,808和WO 95/03324中已有描述，本发明引用上述各篇专利全文作为参考。
MLK家族有部分包括下述各组：1)多谱系激酶1(MLK1)；2)多谱系激酶2(MLK2)；3)多谱系激酶3(MLK3)；4)亮氨酸拉链携带激酶(LZK)；5)双亮氨酸拉链携带激酶(DLK)；和6)多谱系激酶6(MLK6)。MLK1具有和对Tyr和Ser/Thr有特异性的两种激酶类似的催化区。Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710。MLK2也具有和对Tyr或Ser/Thr有特异性的两种激酶类似的催化区。Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710。已知MLK2也如同是MST。Katoh等人，Oncogene，1995，10，1447-1451。MLK3含有的蛋白质附加于激酶区，其中含有两个亮氨酸拉链，带有相邻的羧基终止的基本区域，并富含有脯氨酸区。Ing等人，Oncogene，1994，9，1745-1750。已知MLK3也是SPRK(Gallo等人，J.BioL Chem.，1994，269，15092-15100)，和PTKI(Eeoe等人，Oncogene，1994，9，935-938)。LZK是亮氨酸拉链支撑的激酶。Sakuma等人，J.Biol.Chem.，1997，272，28622-28629。DLK具有激酶区和两种推定的亮氨酸拉链基序。Holzman、等人，J.Biol.Chem.，1994，269，30808-30817。已知DLK也是ZPK(Reddy、等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1994，202，613-620)和MUK(Hirai等人，Oncogene，1996，12，641-650)。MLK家族的成员在例如下述专利和文献中已有描述：U.S.P5,676,945；5,554,523；WO 93/15201；CA 2,148,898；Diener，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94，9687-9692；DeAizpurua等人，J.Biol.Chem.，1997，272，16364-16373；Tung等人，Oncogene，1997，14，653-659；Sells等人，Trends in Cell Biol.，1997，7，161-167；Mata，等人，J.BioLChem.，1996，271，16888-16896；Hirai等人，J.BioL Chem.，1997，272，15167-15173；Fan等人，].Biol Chem.，1996，271，24788-24793；Blouin等人，DNA and Cell Biol.，1996，15，631-642；Pombo等人，Nature，1995，377，750-754；Kiefer等人，EMBO 1，1996，15，7013-7025；Hu等人，Genes & Dev.，1996，10，2251-2264；Su等人，EMBO J.，1997，16，1279-1290；和Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1995，234，492-500。最近，在EST数据库中还鉴定出其它MLK相关的激酶。此克隆体MLK6的序列用七个重叠的通道(entries)表述。这些克隆体的ID数目是：1007489，1460085，510915，666323，F5555，482188和178522，本发明引用本段各篇文献全文作为参考。
最近，如群体形成试验所测定的，已指出ZPK的稳定表达可减少NIH3T3成纤维细胞的增生能力。Bergeron等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1997，231，153-155。但是，Bergeron等人没有提供任何数据来说明ZPK可调节ZPK基质的活性，或者说明ZPK是否能够促进细胞的死亡。
已有人指出在Swiss 3T3细胞中构成编码Myc-MLK2的表达在注射后大约20小时是能够导致编程性细胞死亡，Nagata等人，EMBOI，1998，17，149-158。
申请人研究了某些吲哚并和茚并化合物，它们可抑制与过度增生状态有关的细胞生长，以及在各种胚胎培养物，如脊神经节、纹状体、高级颈神经中枢和运动神经元中抑制细胞死亡。USP 5,475,110、5,591,855、5,594,009、5,461,146、5,621,100、5,621,101、5,705,511和5,756,494，它们已经转让给本申请人的受让人，本申请引用上述全文作为参考。U.S.P 5,705,511中所述的化合物具有式G结构，本申请引用作为参考，为式I。申请人还指出K-252a衍生物可抑制运动神经元编程性细胞死亡，所述化合物是吲哚并咔唑，它还可以调节紧张信号级联扩增。Maroney等人，J.Neurosci.，1998，18，104-111，本申请引用上述全文作为参考。
由于筛选的调节紧张信号级联扩增以及促进细胞死亡和存活的化合物功能不全，因此仍然需要得到新的，筛选化合物的选择性方法。此外，也需要有用于治疗炎症和神经变性疾病的治疗筛选试验方法。本发明就涉及了上述目的，以及其它一些重要的目的。
发明概述
本发明提供了能够调节多谱系激酶蛋白和促进细胞存活的化合物的鉴定方法，该方法包括使含有多谱系激酶蛋白的细胞与所述化合物接触，测定化合物是不是造成了多谱系激酶蛋白活性的下降，和测定化合物是不是有助于细胞的存活的步骤。
本发明还提供了能够调节多谱系激酶蛋白和促进细胞死亡的化合物的鉴定方法，该方法包括使含有多谱系激酶蛋白的细胞与所述化合物接触，测定化合物是不是造成了多谱系激酶蛋白活性的提高，和测定化合物是不是促进了细胞的死亡的步骤。
本发明还提供了用于治疗神经变性疾病的化合物的鉴定方法，该方法包括使含有多谱系激酶蛋白的细胞或细胞萃取物与所述化合物接触，并测定化合物是不是造成了多谱系激酶蛋白活性的下降。
本发明还提供了用于治疗炎症的化合物的鉴定方法，该方法包括使含有多谱系激酶蛋白的细胞或细胞萃取物与所述化合物接触，并测定化合物是不是造成了多谱系激酶蛋白活性的下降。
本发明还提供了哺乳动物已有或疑有神经变性疾病的治疗方法，该方法包括给所述的哺乳动物施用能够抑制或减少多谱系激酶蛋白活性的化合物。
本发明还提供了哺乳动物已有或疑有炎症的治疗方法，该方法包括给所述的哺乳动物施用能够抑制或减少多谱系激酶蛋白活性的化合物。
本发明还提供了调节多谱系激酶蛋白活性的方法，该方法包括使所述的蛋白或含有该蛋白的细胞与下述式II化合物接触：
Figure A20041004910800261
式中：
环B和环F都与它们所连接的碳原子成环，并分别各自选自下述基团：，
不饱和的6元芳香碳环，环上的1-3个碳原子可被氮原子置换；
不饱和的5元芳香碳环；和
不饱和的5元芳香碳环，在环上或
1个碳原子被氧、氮或硫原子置换；
2个碳原子被硫和氮原子、氧和氮原子或两个氮原子置换；或
3个碳原子被3个氮原子置换；
R1选自下述基团：
H，取代或未取代的1-4个碳原子的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基，取代或未取代的杂芳基，或取代或未取代的杂芳烷基；
-C(＝O)R9，其中R9选自烷基、芳基或杂芳基；
-OR10，其中 R10选自H和1-4个碳原子的烷基；
-C(＝O)NH2，-NR11R12，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)POR10，-O(CH2)POR10和-O(CH)PNR11R12，其中p为1-4；和其中或
R11和R12分别各自选自H和1-4个碳原子的烷基；或
R11和R12一起构成式(CH2)2-X1-(CH2)2-的连接基团，其中X1选自-O-，-S-和-CH2-；
R2选自下述基团：H，1-4个碳原子的烷基，-OH，1-4个碳原子的烷氧基，-OC(＝O)R9，
-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)PNR11R12，-O(CH2)POR10，取代或未取代的6-10个碳原子的芳烷基，取代或未取代的杂芳烷基；
R3，R4，R5和R6各自分别选自下述基团：
H，芳基，杂芳基，F，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH，-OR9，-O(CH2)pNR11R12，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR2R7，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)POR10，-CH2OR10，-NR11R12，-NR10S(＝O)2R9，-NR10C(＝O)R9；
-CH2OR14，其中R14是在羧基的羟基脱除后的氨基酸残基；
-NR10C(＝O)NR11R12，-CO2R2，-C(＝O)R2，-C(＝O)NR11R12，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-(CH2)PNR11R12，-(CH2)PNHR14，或CH＝NNR2R2A，其中R2A同R2；
-S(O)YR2-(CH2)PS(O)YR9，-CH2S(O)YR14其中y是0，1或2；
1-8个碳原子的烷基，2-8个碳原子的烯基，2-8个碳原子的炔基，其中
每个烷基、烯基、炔基是未取代的，或
每个烷基、烯基、炔基是由下述1-3个基团取代的：6-10个碳原子的芳基、杂芳基、芳基烷氧基、杂环烷氧基、羟基烷氧基、烷氧基-烷氧基、羟基烷硫基、烷氧基-烷硫基，F，Cl，Br，I，-CN，-NO2，-OH，-OR9，-X2(CH2)PNR11R12，-X2(CH2)PC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pOC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pCO2R9，-X2(CH2)pS(O)YR9，-X2(CH2)PNR10C(＝O)NR11R12，-OC(＝O)R9，-OCONHR2，-O-四氢吡喃基，-NR11R12，-NR10C(＝O)R9，-NR10CO2R9，-NR10C(＝O)NR11R12，-NHC(＝NH)NH2，-NR10S(O)2R9，-S(O)YR9，-CO2R2，-C(＝O)NR11R12，-C(＝O)R2，-CH2OR10，CH＝NNR2R2A，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-S(＝O)2NR2R2A，-P(＝O)(OR10)，-OR14，和5-7个碳原子的单糖，其中单糖的每个羟基各自分别或未取代或由H、1-4个碳原子的烷基、2-5个碳原子的烷基酰氧基或1-4个碳原子的烷氧基；
X2是O，S或NR10；
R7和R8是各自分别选自H、1-4个碳原子的烷基、1-4个碳原子的烷氧基、取代或未取代6-10个碳原子的芳烷基或取代或未取代的杂芳烷基、-(CH2)POR10、-(CH2)POC(＝O)NR11R12和-(CH2)PNR11R12；或R7和R8一起构成结构式-CH2-X3-CH2-的连结基团，其中X3是X2或单键；
m和n各自分别是0，1，或2；
Y选自-O-，-S-，-N(R10)-，-N+(O-)(R10)-，-N(OR10)和-CH2-；
Z选自单键、-O-，-CH＝CH-，-S-，-C(＝O)-，-CH(OR10)-，-N(R10)，-N(OR10)，CH(NR11R12)-，-C(＝O)N(R17)-，-N(R17)C(＝O)-，-N(S(O)YR9)-，-N(S(O)YNR11R12)-，-N(C(＝O)R17)-，-C(R15R16)-，-N+(O-)(R10)-，-CH(OH)-CH(OH)-，和-CH(O(C＝O)R9)CH(OC(＝O)R9A)-，其中R9A同R9；
R15和R16各自分别选自H，-OH，-C(＝O)R10，-O(C＝O)R9，羟基烷基和-CO2R10；
R17选自H，烷基，芳基，和杂芳基；
A1和A2选自H，H；H，OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和A1与A2一起构成的部分选自＝O，＝S，和＝NR2的基团；
B1和B2选自H，H；H，-OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和B1与B2一起构成的部分选自＝O，＝S，和＝NR2的基团；
同时以A1与A2或B1与B2中的至少一对形成＝O为条件。
本发明还提供了调节多谱系激酶蛋白活性的方法，包括使该蛋白或包含该蛋白的细胞同式III化合物接触：
Figure A20041004910800291
式中：
Z1是H和Z2是H或Z1和Z2共同构成＝O；
R1选自下述基团：H，Cl，CH2SO2C2H5，Br，CH2S(CH2)2NH2，CH2S(CH2)2N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH2n-C4H9，NHCONHC6H5，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC6H5，N(CH3)2，CH3，CH2OCONHC2H5，NHCO2CH3，CH2OC2H5，CH2N(CH3)2，OH，O-正丙基，CH＝NNH-C(＝NH)NH2，CH＝N-N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH-n-C4H9，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S(3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，
Figure A20041004910800301
R2选自下述基团：H，Br，Cl，I，CH2S(CH2)2N(CH3)2，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，和CH2OH；
X选自下述基团：H，CH2OH，CH2NH-丝氨酸H，CO2CH3，CONHC6H5，CH2NHCO2C6H5，CH2NHCO2CH3，CH2N3，CONHC2H5，CH2NH-甘氨酸，CON(CH3)2，-CH2NHCO2-，CONH2，CONHC3H7，CH2NH-丝氨酸，CH2SOCH3，CH＝NOH，CH2NH-脯氨酸，CH2CH2(2-吡啶基)，CH＝NNHC(＝NH)NH2，CONH(CH2)2OH，CH＝NNHCONH2，CH2OCOCH3，-CH2OC(CH3)2O-，CH2SC6H5，CH2SOC6H5，CO2正己基，CONHCH3，和CO2(CH2)4CH3；或下述结构式之一
Figure A20041004910800302
和
R选自OH和OCH3。
本发明还提供了调节多谱系激酶蛋白活性的方法，包括使该蛋白或包含该蛋白的细胞同式IV化合物接触：
Figure A20041004910800311
其中：
Z1是H和Z2是H或Z1和Z2一起构体＝O；
R1是H或Br；
R2是H；
R3是H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，或和
R4是H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
附图的简要说明
为了说明本发明的实施方案，在附图中说明了某些技术特征。可以理解的是，本发明并不限于副图所示确定的实施方案。
图1是桥连的茚并吡咯并咔唑的一般制备方法示意图。
图2是桥连的茚并吡咯并咔唑的一般制备方法示意图。
图3是树脂键连的茚并吡咯并咔唑的一般制备方法示意图。
图4是被保护的、可溶解的茚并吡咯并咔唑的一般制备方法示意图。
图5是中间体V的一般制备方法示意图。
图6是用方法A制备桥连的茚并吡咯并咔唑的示意图。
图7是用方法B制备桥连的茚并吡咯并咔唑的示意图。
图8是B-环取代的桥连茚并吡咯并咔唑的制备方法示意图。
图9是桥连茚并吡咯并咔唑的E环衍生方法示意图。
图10描述了在没有NGF的情况下培养5天后，可生存的神经分化PC-12细胞的数量的两组不同试验的图解。结果以每组的NGF控制百分数表示(没有NGF的情况下的载体对照组，n＝12；所有其它组，n＝3)。通过双侧T-检验，载体对照组和在没有NGF时主要表达为阴性的MLK-3突变体的稳定的细胞库之间的差别是令人满意的。
图11A说明了用放射性胶基试验，死亡激酶GST-SEK-1通过杆状病毒群表达的FLAG-MLK-3(全长和激酶区的混合物)磷酸化。
图11B说明了杆状病毒群表达的FLAG-MLK-3(全长和激酶区的混合物)或GST-MLK-3激酶区催化的激酶反应结果所形成的32P标记的磷酸化髓磷脂碱性蛋白质产物。
图12的免疫印迹分析指出通过杆状病毒群表达的FLAG-MLK-3(全长和激酶区的混合物)磷酸化的死亡激酶GST-SEK-1以磷酸-特异性SEK-1抗体的形式检出。
图13说明了通过细菌表达的GST-MLK-3激酶区的髓磷脂碱性蛋白质的磷酸化作用，试验采用了(o)多筛选三氯乙酸沉淀试验，或(·)磷酸纤维素膜方法。
图14给出了用MLK-3杆状病毒群感染的昆虫细胞的裂解物孵化的[3H]K252的饱和结合曲线。
图15A说明了用细胞过量表达的MLK-3，MLK-2或DLK，和经过0.025％DMSO(对照组)或500nM K-252a处理，在免疫沉淀物/激酶反应中32P标记的c-jun的数量。
图15B以图示说明了用图15A所述样品，在免疫沉淀物/激酶反应中保留的定量的活性百分数。各柱高表示多个样品的平均值，误差线条说明了平均范围。
图15C说明了用细胞过量表达HA-JNK1单独使用，或如图所示在各种cDNA量的情况下与MEKK1一起，经过0.025％DMSO(对照组)或500nM化合物III-3(见表3)处理，在免疫沉淀物/激酶反应中32p标记的c-jun的数量。各柱高表示多个样品的平均值，其中的误差线条说明了平均范围。
图16说明了化合物III-3促进神经元存活与浓度的关系。将取自交感神经节(SG)(A)、背根神经节(DRG)(B)、睫状神经节(CG)(C)和运动神经元(MN)(D)的分离的神经元在有或没有所指明的营养因子的情况下进行培养。如材料和方法部分所述，在平皿接种48小时后对细胞计数，数据以三次或四次重复试验的平均值±SD表示。
图17给出了在有或没有各自的神经营养因子(对交感神经元和感觉神经元而言为20ng/ml NGF，对睫状神经元而言为10ng/ml CNTF，对运动神经元(A-D)而言为30μg/ml肌萃取物(MEX))，或在1μM化合物III-3(E-H)存在下培养48小时后，E12 DRG(A，E)、交感神经E9(B，F)、睫状E8(C，G)和E5.5运动神经元(D，H)培养物的相差显微照片。Bar＝2Ooμm。
图18给出了体外背根神经节外植体的显微照片。取自小鸡DRG(E9)的外植体置入96穴培养板，其中的介质含有0.05％BSA。附着期2小时后，再加入下述附加物：(A)用于对照的DMSO；(B)20ng/mlNGF；(C)250nM化合物III-3。48小时后，移出介质，外植体在磷酸盐缓冲液中用多聚甲醛固定。
图19说明了每天用特定剂量的化合物III-3处理(E5-9)后，存活在E10中的小鸡腰运动神经元数目。所示的数据是每个处理组5-6只动物的平均值±SD。所报告的试验重复两次。数据取自一有代表性的试验，并用腰柱的一侧表示。用Bonferroni校正化合物III-3和对照组之间的斯氏T试验的*p＜0.01，**p＜0.001。
图20说明了每天用化合物III-3处理(PN1-5)后，或是对照载体组(5％SolutoITM)，生存于PN 10或PN6O中的雌性大鼠脊柱的球海绵体肌(SNB)的神经核中的运动神经元的数目。在PN10(A，B)或PN 60(B)的情况下，处死大鼠，分割出含有SNB的脊髓部位，用组织学方法加工，然后如文献所述(Wingfield等人，Steroids，1975，26，311-327)，在脊髓的腰5-骶骨1区的一系列切片上对Cresylecht紫染色的运动神经元计数。试验数据是每一处理组4-8只动物的平均值±SD。
图21说明了成年大鼠用化合物III-3在舌下神经axotomy处理后ChAT免疫活性的损失。在把舌下神经横断和用载体溶液(5％SolutoITM)处理之后(A)，和在横断处用200μg化合物III-3处理(B)的舌下神经核显微照片。(C)是在上述(A)和(B)处理ChAT-免疫反应性舌下运动神经元的数目。结果表示为ChAT-免疫反应性舌下运动神经元的百分数，100％定义为对侧、未损害的舌下神经核中ChAT-免疫反应性运动神经元的数目。
图22说明了MLK-3途径的体内抑制作用显示出来的效力和磷酸化作用后的保护。图22A说明了在化合物III-3系统用药造成MPTP损害后，黑质酪氨酸羟化酶免疫反应性神经元的增加。图22B是说明MPTP诱导的磷酸化MKK4水平提高的有代表性的免疫印迹。图22C给出了有代表性的免疫印迹，以及ELISA说明了在有化合物III-3存在时，MPTP诱导的磷酸化MKK4的衰减。
图23说明了Jurkat细胞中IL-2的诱导作用。图23A说明了IL-2诱导与时间的关系。图23B说明了化合物III-3对IL-2诱导的抑制作用。图23C说明了化合物III-3和化合物I-4对IL-2诱导的抑制作用。
发明的详细描述
上文及本发明全文所用的下述术语应理解为具有下述定义，除非另有说明。
“编程性细胞死亡”是指细胞死亡的特定形态学形式，其特征在于细胞的碎片和细胞核在膜结合的颗粒之内。编程性细胞死亡可由例如能诱导编程性细胞死亡的化合物触发，这些化合物例如是依托泊甙、癌基因抑活药、肿瘤坏死因子、cerurnide等，或者是由如X-射线的条件触发。
术语“细胞死亡”是指细胞由于编程性细胞死亡、坏死或其它本领域普通技术人员所熟知的手段造成的细胞死亡。例如，“细胞死亡”的特征在于总细胞数的减少，或与未处理对照组的细胞种群相比细胞的生存能力下降。与未处理对照组的种群相比，“促进细胞死亡”的化合物能够引起细胞数的减少，或细胞生存能力下降。与此相反，“促进细胞存活”的化合物可使细胞数增加，或提高细胞的生存能力，或减缓或减少细胞死亡的速率。
术语“选择性地反应”或“特异性结合”是指化合物以物理的或化学的方式直接与MLK蛋白发生作用。与此相反，不能“选择性地反应”或“特异性结合”的化合物可以与MLK蛋白的上游或下游作用，以及可以影响MLK蛋白的活性，但是不能以物理的或化学的方式直接与MLK蛋白发生作用。
术语“调节”是指特定蛋白或基质活性的增加或减少。
本发明部分地涉及能够调节MLK蛋白活性，和促进细胞存活或细胞死亡的化合物的鉴定方法。能够提高MLK蛋白活性和可以促进细胞死亡的化合物，另一方面，该化合物也能够降低MLK蛋白活性和促进细胞存活。
MLK蛋白可以是任何鉴定为属于MLK蛋白质。优选的，MLK蛋白选自上文所述的一组蛋白：MLK1、MLK2、MLK3(SPRK，PTK1)、LZK，DLK(ZPK，MUK)和MLK6。在本发明一个优选实施方案中，对直接作用于或结合于MLK蛋白的化合物进行鉴定的方法可以通过结合试验、激酶试验或其它等同的试验完成。
为了鉴定能够调节MLK蛋白活性和促进细胞存活或细胞死亡的化合物，使细胞或含有MLK蛋白的细胞与所述化合物接触。接触可在本领域普通技术人员已知的缓冲溶液或介质中进行。另外，接触也可以在体内进行，在此情况下，使诸如小鼠的动物或本领域普通技术人员已知的其它的适当动物通过施用与含有试验化合物的药物组合物以及药用盐、载体或稀释剂接触。此外，也可以改变细胞的数目和试验化合物的浓度。可以测定出试验化合物使MLK蛋白的活性增加还是减少，以及也可以测定出试验化合物促进细胞的存活还是死亡。
与试验化合物接触的细胞可以是任何哺乳动物的细胞，优选神经元细胞。优选涉及神经变性疾病的细胞。为实现本发明的目的，“神经变性疾病”、“神经变性障碍”和“神经变性症状”是可以互换的，并可用来描述与神经元细胞或涉及神经元系统的细胞有关的疾病或失调，这包括，但不限于阿耳茨海默氏病、运动神经元疾病、肌萎缩侧索硬化、帕金森氏病、脑血管疾病、局部缺血症状、AIDS、痴呆、癫痫、杭廷顿氏舞蹈病以及脑或脊髓的震动或贯通伤。
MLK蛋白活性可由多种技术测定。例如MLK活性可用蛋白质基质的活性测定。这些基质是已知的，对本领域熟练技术人员而言是很容易辨别的。优选的，所述的基质是一种丝分裂素活化的蛋白质激酶，激酶家族或丝分裂素活化的蛋白质激酶家族或更下游的基质包括，但不限于选自下述的一组蛋白：JNK1、JNK2、JNK3、ERK1、ERK2、p38α、p38β、P38γ、P38δ、MEK1、MEK2、MKK3、MKK4(SEK1)、MEK5、MKK6、MKK7、jun、ATF2、ELK1和哺乳动物的AEX-3类似物，还包括Ser/Thr蛋白激酶的一般基质如髓磷脂碱性蛋白(MBP)。测定这些基质活性的试剂和方法是本领域熟练技术人员已知的。通过测定MLK蛋白或mRNA编码的MLK蛋白可以确定MIX的存在。测定DNA或蛋白质，包括RNA印迹和蛋白质印迹的试剂，以及测定的方法是本领域熟练技术人员已知的，所述的试剂包括抗体和寡核苷酸探针。MLK蛋白的活性也可用体外的激酶试验方法测定。体外激酶试验方法也是本领域熟练技术人员已知的。测量蛋白质活性的其它方法是本领域熟练技术人员已知的，并且包括在本发明的范围之内。因此，本领域熟练技术人员可以确定试验化合物是不是能够调节，即提高或减少MLK蛋白的活性。
试验化合物是不是能够促进细胞的存活或死亡可以用多种方法确定。优选的，可使用频死细胞测定是否能够促进细胞的存活或死亡，并且将与试验化合物接触的细胞并存活的数目，和没有与试验化合物接触并存活的细胞数目进行比较。优选的，所述的细胞是在预程序中死亡的初级的胚胎运动神经元细胞。初级的胚胎运动神经元细胞在Maroney等人，J.Neurosci，1998，18，104-111中已有描述，该文献的全文被引用作为参考。除非由试验化合物营救，所述的初级的胚胎运动神经元细胞会死。因此，与不用试验化合物处理的运动神经元细胞种群中活着的运动神经元细胞相比，用试验化合物处理的运动神经元细胞种群中活着的运动神经元细胞更多，这说明试验化合物可以促进细胞存活。相反，与不用试验化合物处理的运动神经元细胞种群中活着的运动神经元细胞相比，用试验化合物处理的运动神经元细胞种群中活着的运动神经元细胞更少时，说明试验化合物可以促进细胞死亡。
在本发明的另一实施方案中，如下面的实施例所述，由于MLK蛋白的过表达，正常细胞、野生型细胞可转化成有死亡危险的细胞，然后，使其与试验化合物接触。除非由试验化合物营救，所述过表达的MLK蛋白细胞会死亡。用能够表达特定蛋白质内侧细胞的载体可以完成MLK的过表达。表达用的载体是本领域熟练技术人员已知的。此外，制备表达载体的方法也是本领域熟练技术人员已知的。表达任何MLK蛋白的表达载体可以按照本发明实施例所述类似的方法制备。与不用试验化合物处理的过表达细胞种群中活着的细胞相比，用试验化合物处理的细胞种群中活着的细胞数目更多，说明试验化合物可以促进细胞存活。相反，与不用试验化合物处理的过表达细胞种群中活着的细胞相比，用试验化合物处理的细胞种群中活着的细胞数目更少，说明试验化合物可以促进细胞死亡。
在另一实施方案中，通过观察或测定编程性细胞死亡减少，说明可促进细胞存活。相反，与不用试验化合物处理的过表达细胞种群中活着的细胞相比，用试验化合物处理的细胞种群中活着的细胞数目更少，说明试验化合物可以促进细胞死亡。细胞质的皱缩和细胞核的浓缩与编程性细胞死亡有关。因此，本领域熟练技术人员通过观察或测定细胞质的皱缩和/或细胞核的浓缩测定编程性细胞死亡减少。此外，本领域熟练技术人员通过观察或测定细胞质的皱缩和/或细胞核的浓缩测定编程性细胞死亡减少。此外，本领域熟练技术人员用常规的染色法可测定编程性细胞死亡。
在本发明的另一实施方案中，可使用正常细胞、野生型神经元细胞鉴定能促进细胞死亡的化合物。除非由试验化合物营救，所述的正常细胞会死亡。与不用试验化合物处理的正常细胞种群中活着的细胞相比，用试验化合物处理的正常细胞种群中活着的细胞数目更少，说明试验化合物可以促进细胞死亡。相反，与不用试验化合物处理的正常细胞种群中活着的细胞相比，用试验化合物处理的正常细胞种群中活着的细胞数目更多或相等时，不说明试验化合物可以促进细胞死亡。
本发明还部分的涉及调节MIX蛋白活性的方法，该方法包括使所述蛋白或含有所述蛋白的细胞与式G(本文表示为式I)化合物接触，该化合物公开在USP 5,705,511，该专利由本申请的受让人申请，这里引用其全文作为参考。
本发明还部分地涉及调节MLK蛋白活性的方法，包括用下述式III化合物接触该蛋白或包含该蛋白的细胞：
式中：
Z1是H和Z2是H或Z1和Z2共同构成＝O；
R1选自下述基团：H，Cl，CH2SO2C2H5，Br，CH2S(CH2)2NH2，CH2S(CH2)2N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH2 n-C4H9，NHCONHC6H5，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC6H5，N(CH3)2，CH3，CH2OCONHC2H5，NHCO2CH3，CH2OC2H5，CH2N(CH3)2，OH，O-正丙基，CH＝NNH-C(＝NH)NH2，CH＝N-N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH-n-C4H9，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S(3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，
Figure A20041004910800391
R2选自下述基团：H，Br，Cl，I，CH2S(CH2)2N(CH3)2，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，和CH2OH；
X选自下述基团：H，CH2OH，CH2NH-丝氨酸H，CO2CH3，CONHC6H5，CH2NHCO2C6H5，CH2NHCO2CH3，CH2N3，CONHC2H5，CH2NH-甘氨酸，CON(CH3)2，-CH2NHCO2-，CONH2，CONHC3H7，CH2NH-丝氨酸，CH2SOCH3，CH＝NOH，CH2NH-脯氨酸，CH2CH2(2-吡啶基)，CH＝NNHC(＝NH)NH2，CONH(CH2)OH，CH＝NNHCONH2，CH2OCOCH3，-CH2OC(CH3)2O-，CH2SC6H5，CH2SOC6H5，CO2正己基，CONHCH3，和CO2(CH2)4CH3；或下述结构式之一
Figure A20041004910800401
和
R选自OH和OCH3。
在本发明的优选实施方案中，Z1和Z2都是H，X是CO2CH3，R1是NHCONHC2H5，
R2是CH2CH2(2-吡啶基)，和R是OH。在本发明的其他优选实施方案中，Z1和Z2都是H，X是CO2CH3，R1和R2都是CH2OCH2OCH2CH3，和R是OH；或Z1和Z2都是H，X是CO2CH3，R1和R2都是CH2SCH2CH3和R是OH；或Z1，Z2，R1和R2是H，X是CO2CH3；和R is OH；或Z1，Z2，R1，和R2是H，X是CO2(CH2)4CH3，和R is OH；或Z1，Z2和R1是H，R2是CH2OH，X是CO2CH3，和R是OH；或Z1和Z2是H，R1和R2是H2S[3-(1，2，4-三嗪)]，X是CO2CH3，和R是OH；或Z1和Z2是H，R1是Br，R2是I，X是CO2CH3；和R是OH；或Z1和Z2是H，R1和R2是CH2CHSCH3，X是CO2CH3，和R是OH；或Z1，Z2，R1，和R2是H，X是CO2CH3；和R是OCH3；或Z1和Z2一起构成＝O，R1和R2是Br，X是CO2CH3，和R是OH。
本发明还部分地涉及调节MLK蛋白活性的方法，包括用下述式II化合物接触该蛋白或包含该蛋白的细胞：
Figure A20041004910800411
式中：
环B和环F都与它们所连接的碳原子成环，并分别各自选自下述基团：，
a)不饱和的6元芳香碳环，环上的1-3个碳原子可被氮原子置换；
b)不饱和的5元芳香碳环；和
c)不饱和的5元芳香碳环，在环上或
1)1个碳原子被氧、氮或硫原子置换；
2)2个碳原子被硫和氮原子、氧和氮原子或两个氮原子置换；或
3)3个碳原子被硫3个氮原子置换；
R1选自下述基团：
a)H，取代或未取代的1-4个碳原子的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基，取代或未取代的杂芳基，或取代或未取代的杂芳烷基；
b)-C(＝O)R9，其中R9选自烷基、芳基或杂芳基；
c)-OR10，其中R10选自H和1-4个碳原子的烷基；
d)-C(＝O)NH2，-NR11R12，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)POR10，-(CH2)POR10和-O(CH)pNR11R12，其中p为1-4；和其中或
1)R11和R12分别各自选自H和1-4个碳原子的烷基；或
2)R11和R12一起构成式(CH2)2-X1-(CH2)2-的连接基团，其中X1选自-O-，-S-和-CH2-；
R2选自下述基团：H，1-4个碳原子的烷基，OH，1-4个碳原子的烷氧基，-OC(＝O)R9，
-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)PNR11R12，-O(CH2)POR10，取代或未取代的6-10个碳原子的芳烷基，取代或未取代的杂芳烷基；
R3，R4，R5和R6各自分别选自下述基团：
a)H，芳基，杂芳基，F，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH，-OR9，
-O(CH2)pN R11R12，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR2R7，-OC(＝O)NR11R12，
-O(CH2)POR10，-CH2OR10，-NR11R12，-NR10S(＝O)2R9，-NR10C(＝O)R9；
b)-CH2OR14，其中R14是在羧基的羟基脱除后的氨基酸残基；
c)-NR10C(＝O)NR11R12，-CO2R2，-C(＝O)R2，-C(＝O)NR11R12，
-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-(CH2)PNR11R12，-(CH2)PNHR14，或
CH＝NNR2R2A，其中R2A同R2；
d)-S(O)YR2-(CH2)PS(O)YR9，-CH2S(O)YR14其中y是0，1或2；
e)1-8个碳原子的烷基，2-8个碳原子的烯基，2-8个碳原子的炔基，其中
1)每个烷基、烯基、炔基是未取代的，或
2)每个烷基、烯基、炔基是由下述1-3个基团取代的：6-10个碳原子的芳基、杂芳基、芳基烷氧基、杂环烷氧基、羟基烷氧基、烷氧基-烷氧基、羟基烷硫基、烷氧基-烷硫基，F，Cl，Br，I，-CN，-NO2，-OH，-OR9，-X2(CH2)PNR11R12，-X2(CH2)PC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pOC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pCO2R9，-X2(CH2)pS(O)YR9，-X2(CH2)PNR10C(＝O)NR11R12，-OC(＝O)R9，-OCONHR2，-O-四氢吡喃基，-NR11R12，-NR10C(＝O)R9，-NR10CO2R9，-NR10C(＝O)NR11R12，-NHC(＝NH)NH2，-NR10S(O)2R9，-S(O)YR9，-CO2R2，-C＝O)NR11R12，-C(＝O)R2，-CH2OR10，CH＝NNR2R2A，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-S(＝O)2NR2R2A，-P(＝O)(OR10)，
-OR14，和5-7个碳原子的单糖，其中单糖的每个羟基各自分别或未取代或由H、1-4个碳原子的烷基、2-5个碳原子的烷基酰氧基或1-4个碳原子的烷氧基；
X2是O，S或NR10；
R7和R8是各自分别选自H、1-4个碳原子的烷基、1-4个碳原子的烷氧基、取代或未取代6-10个碳原子的芳烷基或取代或未取代的杂芳烷基、-(CH2)P-OR10，
-(CH2)POC(＝O)NR11R12和-(CH2)PNR11R12；或R7和R8一起构成结构式-CH2-X3-CH2-的连结基团，其中X3是X2或单键；
m和n各自分别是0，1，或2；
Y选自-O-，-S-，-N(R10)-，-N+(O-)(R10)-，-N(OR10)和-CH2-；
Z选自单键、-O-，-CH＝C H-，-S-，-C(＝O)-，-CH(OR10)-，-N(R10)，-N(OR10)，CH(NR11R12)-，-C(＝O)N(R17)-，-N(R17)C(＝O)-，-N(S(O)YR9)-，-N(S(O)YNR11R12)-，-N(C(＝O)R17)-，-C(R15R16)-，-N+(O-)(R10)-，-CH(OH)-CH(OH)-，和-CH(O(C＝O)R9)CH(OC(＝O)R9A)-，其中R9A同R9；
R15和R16各自分别选自H，-OH，-C(＝O)R10，-O(C＝O)R9，羟基烷基和-CO2R10；
R17选自H，烷基，芳基，和杂芳基；
A1和A2选自H，H；H，OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和A1与A2一起构成的部分选自＝O，＝S，和＝NR2的基团；
B1和B2选自H，H；H，-OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和B1与B2一起构成的部分选自＝O，＝S，和＝NR2的基团；
条件是A1与A2或B1与B2之中至少一对形成＝O。
本发明还部分地涉及调节MLK蛋白活性的方法，包括用下述式IV化合物接触该蛋白或包含该蛋白的细胞：
其中：
Z1是H和Z2是H或Z1和Z2一起构体＝O；
R1是H或Br；
R2是H；
R3是H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，或 和
R4是H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
在本发明的优选实施方案中，R1，R2，R4，Z1和Z2是H和R3是CH2CH＝CH2。在本发明的其他优选实施方案中，R1是Br和R2，R4，Z1和Z2是H；或R1，R2，Z1和Z2是H和R3和R4是CH2CH＝CH2；或R1，R2，R3，Z1和Z2是H和R4是CH2CH＝CH2；或R1，R2，Z1和Z2是H，和R3和R4 CH2CH2CH2OH；或R1，R2，R4，Z1和Z2是H和R3是
本发明还提供鉴定可用于治疗神经变性疾病的化合物的方法，包括使包含有多谱系激酶的细胞或细胞抽提物同该化合物接触，并测定该化合物是否减少多谱系激酶蛋白的活性。细胞和细胞抽提物包括前面提到的那些。由本方法找到的化合物(即抑制或减少多谱系激酶蛋白的活性的那些化合物)可以用来治疗神经变性疾病。这种蛋白优选多谱系激酶1、多谱系激酶2、多谱系激酶3、亮氨酸拉链携带激酶、双元亮氨酸拉链携带激酶、多谱系激酶6。该细胞在体外或在体内接触。该蛋白的活性优选通过测试所说蛋白基质的活性或磷酸化态来测定。所说的基质优选JNK1，JNK2，JNK3，ERKI，ERK2，p38α，p38β p38γ，p38δ，MEK1，MEK2，MKK3，MKK4(SEKI)，MEK5，MKK6，MKK7，jun，ATF2，ELKI，和AEX-3的哺乳动物同系物以及一般的Ser/Thr基质，如髓磷脂碱性蛋白(MBP)。蛋白的活性还可以通过测定蛋白基质的活性、蛋白基质的数量或mRNA编码的蛋白基质来测定。蛋白活性也可通过体外激酶试验或键合试验来测定。细胞优选初级胚运动神经元细胞、充分表达多谱系激酶蛋白的细胞，或神经元细胞，但可以是任何细胞或其抽提物。如上所述，直接键合多谱系激酶蛋白的化合物优选被鉴定。
本发明还提供鉴定可用于治疗炎症的化合物的方法，包括使包含有多谱系激酶的细胞或细胞抽提物同该化合物接触，并测定该化合物是否减少多谱系激酶蛋白的活性。细胞和细胞抽提物包括前面提到的那些。由本方法找到的化合物(即抑制或减少多谱系激酶蛋白的活性的那些化合物)可以用来治疗炎症。这种蛋白优选多谱系激酶1、多谱系激酶2、多谱系激酶3、亮氨酸拉链携带激酶、双元亮氨酸拉链携带激酶、多谱系激酶6。该细胞在体外或在体内接触。该蛋白的活性优选通过测试所说蛋白基质的活性或磷酸化态来测定。所说的基质优选JNK1，JNK2，JNK3，ERKI，ERK2，p38α，p38β p38γ，p38δ，MEK1，MEK2，MKK3，MKK4(SEKI)，MEK5，MKK6，MKK7，jun，ATF2，ELKI，和AEX-3的哺乳动物同系物以及一般的Ser/Thr基质，如髓磷脂碱性蛋白(MBP)。蛋白的活性还可以通过测定蛋白基质的活性、蛋白基质的数量或mRNA编码的蛋白基质来测定。蛋白活性也可通过体外激酶试验或键合试验来测定。
细胞优选初级胚运动神经元细胞、充分表达多谱系激酶蛋白的细胞，或神经元细胞，但可以是任何细胞或其抽提物。这种细胞还包括但不限于涉及炎症的那些细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞和其他本领域内的专业技术人员公认的白细胞。直接键合多谱系激酶蛋白的化合物优选被鉴定。
本发明还提供治疗患有或被怀疑患有神经变性疾病的哺乳动物的方法，包括给该哺乳动物服用抑制或减少多谱系激酶蛋白活性的化合物。抑制或减少多谱系激酶蛋白活性的化合物包括但不限于具有式I，II，III和IV的化合物。优选的化合物包括上述有关筛选调节多谱系激酶蛋白活性，或促进细胞存活或死亡的化合物的方法所描述化合物。优选的哺乳动物是人。如果一个人具有特定的神经变性疾病的症状，或是处高危险的群体，或有神经变性疾病家族史，他就被怀疑患有神经变性疾病。
本发明还提供治疗患有炎症疾病的哺乳动物的方法，包括给该所说的哺乳动物服用抑制或减少多谱系激酶蛋白活性的化合物。抑制或减少多谱系激酶蛋白活性的化合物包括但不限于具有式I，II，III和IV的化合物。优选的化合物包括上述有关筛选调节多谱系激酶蛋白活性，或促进细胞存活或死亡的化合物的方法所描述化合物。优选的哺乳动物是人。
与式I-IV化合物的接触可在缓冲液或介质中进行，这是本领域内的专业技术人员所熟知的。另外，这种接触可通过给适宜的动物或哺乳动物，如小鼠或本领域内的专业技术人员熟悉的其他适宜动物，服用包含有试验化合物的药用组合物和药用盐、载体或稀释剂来进行。此外，各种各样的细胞和化合物浓度都可使用。优选的细胞是神经元细胞。优选的细胞涉及神经变性疾病，如阿尔茨姆默氏病；运动原神经元疾病；肌肉萎缩硬化；帕金森病；脑血管疾病；局部缺血；AIDS；痴呆；癫痫；杭廷顿氏病和脑或脊髓的振荡性或穿透性损伤。式I化合物及其制备方法描述在美国专利5,705,511中，引用于此以供参考。式III化合物及其制备方法描述在美国专利5,741,8098，5,621,100，5,621,101，5,461,146，和5,756,494，以及WO 97/46567，全部引用于此以供参考。式IV化合物及其制备方法描述在美国专利5,741,8098，5,621,100，5,621,101，5,461,146，和5,756,494，以及WO97/46567，全部引用于此以供参考。
式II化合物包括环绕连接取代基R2，R7，和R8的碳原子的非对映异构体和对映异构体。
优选的桥式茚并吡咯并咔唑由式II表示：
Figure A20041004910800471
在式II化合物某些优选的实例中，R1 is H。在更优选的实例中，R2是H，羟基或取代或未取代烷基。
在其他优选的实例中，R3，R4，R5和R6各自分别是H，取代或未取代烷基、卤素、取代或未取代烷氧基、或取代或未取代氨基、或取代或未取代芳基。在更优选的实例中，R7和R8各自分别选自是H，取代或未取代烷基。
在某些优选的实例中，Y是O。在更优选的实例中，Z是单键、O、S或取代或未取代的N。在更进一步优选的实例中，m和n各自分别是1或2。在某些特别优选的实例中，Y是O，Z是单键或O，m和n各自分别是1或2。
在进一步优选的实例中，A1A2和B1B2是＝O或H，H。
在某些特别优选的实例中，R1，R4，R6和R7都是H，Y是＝O，n为1，A1A2和B1B2是＝O或H，H，R2是H，OH或低级烷基，R3是H，取代或未取代烷基，R5和R8都是H或烷氧基，优选甲氧基，Z是单键或O，m和n是1或2。
式II化合物特别优选的实例是在下面表1列出的化合物II-1，II-2，II-3，II-4a，II-4b，II-5，II-6，II-7a，II-7b，II-8，II-9，II-10，II-11和II-12。
由式II化合物表示的化合物此后表示为化合物(II)。
这里所用的术语“碳环”指环的部分仅由碳原子组成的环基。术语“杂环”或“杂环的”指环的部分至少包含一个杂原子如O，N或S的环基。
这里所用的术语“烷基”指1-8个碳原子的直链的、环状的或支链的烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、1-乙基丙基、己基、辛基、环丙基和环戊基。包含烷基基团的烷基部分如烷氧基、烷氧羰基和烷氨基羰基的烷基部分与上述定义的烷基意思相同。低碳烷级优选上述定义的具有1-4个碳原子烷基。术语“烷烯基”指至少有一个碳-碳双键的直链的或支链的烃链。烯基的实例包括乙烯基或丙烯基。这里所用的术语“炔基”指至少有一个碳-碳三键的直链的或支链的烃链。炔基的实例包括乙炔基或丙炔基。
包含酰基基团如酰氧基的酰基部分指1-6个碳原子的直链的或支链的烷酰基，如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、新戊酰基或己酰基。
这里所用的术语“芳基”指具有6-12个碳原子的芳基，如苯基、二苯基和萘基。优选的芳基包括未取代或取代的苯基和萘基。这里使用的术语“杂芳基”指一个或多个环碳原子被杂原子(即非碳原子)如N，O或S取代的芳基。优选的杂芳基包括吡啶基、嘧啶基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、三唑基、四唑基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、噻唑基、吡唑基和苯并噻唑基。
术语“芳烷基”(或“芳基烷基”)用来表示由带有芳基的烷基构成的具有7-15个碳原子基团。芳烷基的实例包括苄基、苯乙基、二苯甲基和萘基甲基。
烷基和取代基包含的烷基部分，如芳烷基、烷氧基、芳烷氧基、羟基烷氧基、烷氧-烷氧基、羟基烷硫基、烷氧基烷硫基、烷基酰氧基、羟基烷基和酰氧基，可以是取代或未取代的。取代的烷基具有1-3个各自独立的选择性取代基，优选羟基、低级烷氧基、低级烷氧基烷氧基、取代或未取代的芳烷氧基低级烷氧基、取代或未取代的芳烷氧基低级杂芳基烷氧基-低级烷氧基、取代或未取代的芳烷氧基、取代或未取代的杂环烷氧基、氢、羧基、低级烷氧羰基、硝基、氨基、单或双低级烷氨基、二氧戊环、二氧六环、二硫戊环、二硫六环、呋喃、内酯或内酰胺。
取代芳基、取代杂芳基、取代芳烷基都具有1-3个各自独立的选择性取代基，优选的是低级烷基、羟基、低级烷氧基、羧基、低级烷氧羰基、硝基、氨基、单或双低级烷氨基和氢。
与氮原子形成的杂环基包括吡咯烷基、哌啶基、哌啶子基、吗啉基、吗啉子基、硫代吗啉子基、N-甲基哌嗪基、吲哚基、异吲哚基、咪唑基、咪唑啉基、噁唑啉基、噁唑基、三唑基、三唑啉基、吡唑基和吡唑啉酮基。与氧原子形成的杂环基包括呋喃、四氢呋喃、吡喃和四氢吡喃基。
“羟基烷基”是带有羟基的烷基。卤素包括氟、氯、溴和碘。
这里使用的术语“杂芳烷基”指含有杂原子的芳烷基。术语“氧”表示氧原子的存在。因而，“烷氧基”是由氧原子连接的烷基，“酰氧基”是由氧原子连接的羰基。
术语“杂环烷氧基”指具有连接在烷基部分上的杂环基的烷氧基，术语“芳烷氧基”指具有连接在烷基部分上的芳基的烷氧基。术语“烷基酰氧基”指结构式为-O-C(＝O)-的基团。
这里使用的术语“烷氧基烷氧基”指在它的烷基部分含有烷氧基的烷氧基。术语“烷氧烷硫基”指在它的烷基部分含有烷氧基的烷硫基(即结构式-S-烷基表示的基团)。术语“羟基烷硫基”指在它的烷基部分含有羟基的烷硫基(即结构式-S-烷基表示的基团)。
这里使用的术语“单糖”，其习惯含义表示简单的糖。
这里使用的术语“氨基酸”，表示含有氨基和羧基的分子。氨基酸的实例包括α-氨基酸，即通式HOOC-CH(NH2)-(侧链)表示的羧酸。
氨基酸的侧链包括天然存在和非天然存在的两部分。非天然存在的氨基酸侧链是在同类氨基酸中用来取代天然存在的氨基酸侧链的部分。例如，参阅Lehninger，Biochemistry，第二版，Worth Publishers，Inc，1975，73-75引用于此作为参考。
优选的α-氨基酸包括具有D构型、L构型或作为外消旋的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸和赖氨酸。
更有代表性的α-氨基酸的侧链示于下面表1。
                      表1
CH3-                                   HS-CH2-
HO-CH2-                                HO2C-CH(NH2)-CH2-S-S-CH2-
C6H5-CH2-                           CH3-CH2-
HO-C6H4-CH2-                        CH3-S-CH2-CH2-
Figure A20041004910800511
                CH3-CH2-S-CH2-CH2-
                                       HO-CH2-CH2-
                                       CH3-CH(OH)-
                                       HO2C-CH2-NHC(＝O)-CH2-
                                      
Figure A20041004910800513
                                       HO2C-CH2-CH2-
                                       NH2C(＝O)-CH2-CH2-
                                       (CH3)2-CH-
                                       (CH3)2-CH-CH2-
                                       CH3-CH2-CH2-
                                       H2N-CH2-CH2-CH2-
                                       H2N-C(＝NH)-NH-CH2-CH2-CH2-
                                       H2N-C(＝O)-NH-CH2-CH2-CH2-
                                       CH3-CH2-CH(CH3)-
                                       CH3-CH2-CH2-CH2-
                                       H2N-CH2-CH2-CH2-CH2-
在某些优选的实例中，式II化合物的取代基包括在脱除了羧基的羟基后的氨基酸残基，即结构式-C(＝O)-CH(NH2)-(侧链)。
式II化合物上存在的官能团可包括保护基。例如，式II化合物的氨基酸侧链取代基可由苄氧基羰基或叔丁氧基羰基这样的保护基取代。保护基在本质上被认为是可选择性地连接到羟基和羰基等官能团以及从这些官能团上脱除的化学官能团。化合物中存在的这些基团，使这种官能团对化合物所经受的化学反应条件成惰性。任何一种保护基都可用于本发明。这种保护基之一是苄氧羰(Cbz；Z)基。本发明的其他优选保护基可参阅Greene，T.W和Wuts，P.G.M.，“Protective Groupsin Organic Synthesis”，第二版，Wiley&Sons，1991。
桥式茚并吡咯并咔唑化合物具有十分重要的功能药物活性，在许多方面都有用途。这些衍生物可用作治疗药剂。这些化合物的活性对营养因子响应细胞的功能和/或存活显示正效应。对营养因子响应细胞如神经谱系细胞的功能和/或存活的影响，已利用下述任一试验进行了验证：(1)培养的脊髓乙酰胆碱转移酶(“ChAT”)试验；或(2)培养的基前脑神经ChAT活性试验。
这里所使用的术语“影响”，当用来修饰术语“功能”或“存活”时，指正或负的改变或变化。正效应这里可能指“增强”或“增加”，负效应这里可能指“抑制”或“抑制作用”。
这里所使用的术语“增强”或“增加”，当用来修饰术语“功能”或“存活”时表示，桥式茚并吡咯并咔唑化合物对营养因子响应细胞的功能和/或存活的影响，与不存在该化合物的细胞相比，具有正效应。例如，但并不局限于此，相对于神经元的存活而言，如果被治疗的人群比未被治疗的人群具有更长的官能度期，与不存在这种化合物的人群胆碱能神经元相比，该化合物能显著增加处于死亡危险(如损伤、疾病、退化条件或自然进化)的人群胆碱能神经元存活期。
这里所使用的术语“抑制”或“抑制作用”，指在桥式茚并吡咯并咔唑化合物存在下，指定材料的特殊响应(如酶活性)相对减少。
这里所使用的术语“trk”，指目前包含trkA、trkB和trkC的高亲和性的一组神经营养蛋白受体和神经营养蛋白可结合其上的其他膜结合蛋白。
这里所使用的VEGFR的抑制作用，指在血管发生起重要作用的疾病中的应用，如实体瘤癌症、子宫内膜异位症、糖尿病人的视网膜病、牛皮癣、成血管细胞瘤以及其他眼病和癌症。
Trk的抑制作用，指在前列腺疾病中的应用，如前列腺癌和良性前列腺增生，以及治疗炎症痛。
血小板引发的增长因素受体(PDGFR)的抑制作用，指用于各种形式的瘤形成、类风湿关节炎、肺纤维质生成、骨髓纤维质生成、非正常创伤愈合、心血管末端疾病如粥样硬化、再狭窄(尤指心瓣的)、血管形成术后再狭窄等。
这里所使用的术语“癌”或“癌性的”，指任何哺乳动物细胞的恶性增生。实例包括前列腺、良性前列腺增生、卵巢、乳房、脑、肺、胰腺、结肠、胃的实体瘤、头和颈的成神经细胞瘤、肾细胞瘤、淋巴瘤、白血病、其他已识别出的造血系统癌症以及其他已识别的癌症。
这里所使用的“神经元”、“神经元系细胞”和“神经元细胞”包括但不限于具有单一或复合递质和/或单一或复合功能的异基因人群神经元类型；优选胆碱能神经元和感觉神经元。这里所使用的词组“胆碱能神经元”指神经元递质是乙酰转移酶的中枢神经系统(CNS)和周围神经系统(PNS)的神经元；实例是前脑神经元、纹状体神经元和脊髓神经元。这里所使用的词组“感觉神经元”包括皮肤、肌肉和关节对环境条件(如温度、运动)产生响应的神经元，实例是脊神经节的神经元。
这里所定义的“营养因子响应细胞”，是包括营养因子可以特别结合其上的受体的细胞；实体包括神经元(如胆碱能神经元和感觉神经元)和非神经元细胞(如单核细胞和肿瘤性转化细胞)。
这里描述的桥式茚并吡咯并咔唑化合物在研究领域和治疗领域都能找到用途，例如，抑制酶的活性。例如，在研究领域，该化合物可用来开发某些试验和方法，以进一步加深对丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸蛋白激酶(如PKC、trk酪氨酸激酶)的抑制作用在相关的失调和疾病的机理方面所起作用的理解。在治疗领域，抑制这些酶活性的化合物，可用来抑制这些酶对失调如癌症带来的有害结果。
像后面的实施例证明的那样，利用桥式茚并吡咯并咔唑化合物对酶活性的抑制作用可由下面的试验确定：
1.trkA酪氨酸激酶活性抑制试验；
2.在所有细胞制备中NGF-摸拟trk磷酸化的抑制作用；
3.血管内皮生长因子受体(VEGFR)激酶抑制试验；
4.PKC活性抑制试验；
5.PDGFR活性抑制试验。
公开的桥式茚并吡咯并咔唑化合物可用来增强哺乳动物如人的神经谱系细胞的功能和/或存活期。在这些应用中，该化合物可单独使用，或同其他稠合的吡咯并咔唑化合物和/或吲哚并咔唑化合物一起使用，或同其他也能影响所说细胞功能和/或存活期的有益的分子一起使用。
各种各样的神经紊乱由死亡的、受损的、功能减退的、正遭受轴突退化的、处于死亡危险的神经元细胞所表征。这些紊乱包括但不限于：阿尔茨姆默氏病；运动原神经元紊乱(肌肉萎缩硬化)；帕金森病；脑血管紊乱(如冲程、局部缺血)；杭廷顿氏病；AIDS痴呆；癫痫；多发性硬变；包括糖尿病人神经病在内的外周神经病(如在治疗外周神经病的化学疗法中影响DRG神经元的那些病)；由兴奋性氨基酸引起的疾病；和脑或脊髓的振荡性或穿透性损伤相关的疾病。
ChAT催化神经元递质乙酰胆碱的合成，它被看作是功能胆碱能神经元的酶标志。功能神经元也是能存活的。神经元存活通过活的神经元对染料(如钙黄绿素AM)的特定吸收量和酶转化量来测试。
这里描述的化合物，包括由这里描述的方法鉴定的化合物，由于它们用途的多样性，在许多领域都可找到应用。这里化合物可用来开发神经元细胞存活、功能、鉴定的体外摸型，或区分与这里描述的化合物或由这里描述的方法鉴定的化合物具有相同活性的其他合成化合物。这里描述的化合物以及由这里描述的方法鉴定的化合物，可在研究领域应用，以研究、定义和确定与功能响应相关的分子目标。例如，通过放射性标记桥式茚并吡咯并咔唑化合物或由这里描述的方法鉴定的化合物，结合特定的细胞功能(如分裂)，该衍生物结合的目标实体可被鉴定、分离、纯化以进行表征。
这里描述的化合物以及由这里描述的方法鉴定的化合物，尤其用来不仅增强营养响应细胞的营养因子诱导活性，如胆碱能神经元，而且还可作为其他神经元细胞的存活保护剂，如多巴胺能神经元或谷氨酸能神经元。通过包括但不限于ras，rac和cdc42在内的小GTP结合蛋白向下游的信号级联扩增，生长因子可调节神经元的存活期(Denhardt，Biochem.J.，1996，318，729)。具体地说，ras的活性导致磷酸化和胞外受体活化激酶(ERK)的活化，这同生物生长过程和微分过程相联系。rac和cdc42的刺激作用导致NJK和p38活性以及同胁迫、编程性细胞死亡和炎症相关的响应的增加。虽然生长因子响应主要是通过ERK路线，但后面这些过程的影响，可导致摸拟增强存活性生长因子的神经元存活机理的改变(Xia等，Science，1995，270，1326)。该化合物还可作为神经元细胞和非神经元细胞的存活保护剂，这是通过与生长因子平均存活相关的机理，但不同于该机理而实现的，例如，由抑制编程性细胞死亡过程可导致存活的JNK和p38路线的抑制作用。
本发明的化合物可用来治疗与ChAT活性减少或死亡以及脊髓运动神经元损伤相关的疾病，还可用于内部和周围神经元系统、免疫系统的编程性细胞死亡相关的疾病以及炎症疾病。
本发明的化合物还可用来治疗涉及癌细胞增殖的疾病，如各种癌症。
这里描述的化合物以及由本发明的方法鉴定的化合物的药用盐，包括药用的酸加成盐、金属盐、氨盐、有机胺加成盐和氨基酸加成盐。酸加成盐的实例有无机酸加成盐，如盐酸盐、硫酸盐和磷酸盐，以及有机酸加成盐如乙酸盐、马来酸盐、反丁烯二酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐和乳酸盐；金属盐的实例有碱金属盐如锂盐、钠盐和钾盐，碱土金属盐如镁盐和钙盐、铝盐和锌盐；铵盐的实例有铵盐和四甲基铵盐；有机胺加成盐的实例有同吗啉和哌啶加成的盐；氨基酸加成盐的实例有同甘氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和赖氨酸加成的盐。
这里提供的化合物，包括由本发明的方法鉴定的化合物，通过与药用可接受的赋形剂和载体混合，可配制成药用组合物。这些组合物可制备成不经肠给药的用剂，特别是溶液或悬浮液；可制备成口服给药的用剂，特别是丸剂或胶囊；可制备成鼻内给药的用剂，特别是粉剂、鼻滴剂或烟雾剂；可制备成经皮肤给药的用剂，例如，经皮肤的膜片剂。
该组合物可以单剂量的形式常规给药，可由药物领域内众所周知的任何方法制备，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(MarkPub.Co.，Easton，PA，1980)内描述的方法。不经肠给药的制剂可含有普通的赋形剂，如无菌水或盐水、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、油和菜油、氢化萘等。特别是，生物可适应的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物是可用作控制活性化合物释放的赋形剂。这些活性化合物的其他潜在有用的不经肠的输送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、反渗透泵、可植入的注入系统和脂质体。吸入给药的制剂作为赋形剂包含的有乳糖，或是包含如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或作为鼻滴剂形式给药的油性溶液，或作用凝胶经鼻内使用。不经肠给药的制剂还可包含颊给药用甘胆酸盐、直肠给药用水杨酸盐或阴道给药用柠檬酸。经皮肤膜片剂优选亲油性乳化液。
本发明的化合物在药用组合物中可作为单一活性剂使用。另外，它们可同其他活性组分一块使用，如其他有助于病人或失调者神经元存活或轴突再生的生长因子。
本发明的化合物及其药用盐可口服或非口服，如软膏剂和注射剂。本发明的化合物在治疗组合物中的浓度是可变化。其浓度将取决于所服药的总剂量、所用化合物的化学特性(如疏水性)、服药的方式、病人的年龄、体重和症状等。本发明的化合物一般是提供包含大约0.1-10％w/v为非肠道给药化合物的生理缓冲水溶液。一般的剂量范围从大约1μg/kg到大约1g/kg体重/每天；优选的剂量范围从大约0.01mg/kg到大约100mg/kg体重/每天，更优选大约0.1-20mg/kg，每天1-4次服用。服药的优选剂量似乎取决于很多因素，如疾病或失调的类型和发展程度、具体病人的总的健康状况、所选择化合物的相对生物有效性、化合物赋形剂的配制和服用的方式。
本发明的化合物，包括试验化合物和由本发明的方法鉴定化合物，及其药用盐，依照药理活性和服用的目的，可单独服用，也可以各种药用组合物的形式服用。本发明的药用组合物可通过均匀混合作为活性组分的有效量的化合物或其药用盐同药用载体来制备。根据适于服用的组合物的各种形式，载体可从很宽的范围选取。制备成适合于口服或非口服的单剂形式的那些药用组合物是所希望的。非口服的制剂包括膏剂和针剂。
片剂可按照常规方法利用赋形剂如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇和甲基纤维素；分散剂如淀粉、藻酸钠、羧基甲基纤维素钙和晶态纤维素；润滑剂如硬脂酸镁和滑石；粘合剂如明胶、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素和甲基纤维素；表面活性剂如蔗糖脂肪酸酯和山梨醇脂肪酸酯等来制备。优选每片剂包含15-300mg的活性组分。
粒剂可按照常规方法利用赋形剂如乳糖、蔗糖、分散剂如淀粉、粘合剂如明胶等来制备。粉粒可按照常规方法利用赋形剂如乳糖、甘露糖醇等来制备。胶囊剂可按照常规方法利用明胶、水、蔗糖、阿拉伯树胶、山梨醇、甘油、晶态纤维素、硬脂酸镁和滑石等来制备。优选每粒胶囊包含15-300mg的活性组分。
糖浆制剂可按照常规方法利用糖如蔗糖、水、乙醇等来制备。
膏剂可按照常规方法利用膏剂基料如凡石林、液体石腊、羊毛脂和大粒凝胶；乳化剂如十二烷基乳酸钠、苯札氯铵、脱水山梨醇单脂肪酸酯、羧基甲基纤维素钠和阿拉伯树胶等来制备。
针剂可按照常规方法利用溶剂如水、生理盐水、植物油(如橄榄油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇；增溶剂如苯甲酸钠、水杨酸钠和尿烷；等渗剂如氯化钠、葡萄糖；防腐剂如酚、苯甲酚、对羟基苯甲酸酯和氯化丁醇；抗氧化剂如抗坏血酸和焦亚硫酸钠等来制备。
本发明由下述用来解释本发明的实施例进一步说明。这些实施例不是要限制本发明的范围，也不构成对本发明范围的限制。
实施例
实施例1：合成方法和实施例概述
为制备本发明式II表示桥式茚并吡咯并咔唑化合物所采用的一般合成路线示于图1和2。茚并吡咯并咔唑(III)/(XIII)合成的一般程序可按美国专利No.5,705,511中描述的方法进行，其公开内容特此引用以全面参考。当R1是H时，茚并吡咯并咔唑(III)/(VIII)的内酰胺氮由导致(IV)/(X)的适当的保护基保护。将该被保护的化合物用合适的碱在无水有机溶剂中处理，就产生被认为是碳负离子的暗红色溶液。碳负离子同双功能试剂(V)反应，导致亲电加成到(V)的C＝Y键上，形成初始中间体(VI)/(X)。用磺酸或路易斯酸如三氟化硼乙醚合物处理中间体(VI)/(X)和/或(VII)/(XI)，就得到桥式茚并吡咯并咔唑(I)/(II)。
内酰胺氮保护方法(示于图3和4)可由酸或碱催化法进行。酸催化反应可由能够把茚并吡咯并咔唑(III)/(VIII)固定在聚合物载体上的树脂结合试剂，如聚苯乙烯基的Rink酸树脂(XII)(图3)进行，由此得到(XIII)。另外，酸催化反应可由可溶性试剂进行，得到化合物(XIV)(图4)。硅烷基保护的化合物(XV)由碱催化制备(图4)。
图5描述了几种制备中间体(V)的方法。方法(a)描述的是各种缩醛(XVI)向(XVII，Z＝键)的转化。例如，酯-缩醛/缩酮(XVI，D＝COOR)完全被还原成相应的醇，接着被氧化(例如，Swern or Dess-Martin氧化)为醛-缩醛/缩酮(XVII，R8＝H)。另外，酯-缩醛/缩酮(XVI，D＝COOR)部分由DIBAL还原，直接得到醛(XVII，R8＝H)。同样，腈-缩醛(XVI，D＝CN)由DIBAI还原，给出醛(XVII，R8＝H)。氧代-缩醛/缩酮通过把格利雅试剂加入到Weinreb胺-缩醛/缩酮(XVI，D＝CON(OMe)Me)中而制备。
中间体(XVII，Z＝键)还可通过方法(b)概述的两步法制备。有机金属试剂(XIX)加入到缩醛/缩酮(XVIII)中得到烯(XX)，臭氧分解后再进行还原反应分离，得到缩醛/缩酮(XVII)。中间体(XVII，Z＝杂原子)的两步法制备概述于方法(c)。偶联缩醛(XXII)与烯(XXI)，接着臭氧分解(用还原剂)所得到的烯，得到氧代-缩醛/缩酮(XVII)。另外，中间体(XVII，Z＝杂原子)由方法(d)概述的两步法制备。化合物(XXIV)与缩醛/缩酮(XVIII)反应给出(XXV)，再由方法(a)描述的方法转化为氧代-缩醛/缩酮(XVII)。氧代-缩醛/缩酮(XVII)与羟基胺、肼、N-烷基-N-烷氧基胺和胺缩合，给出亲电性C＝N功能基的中间体(XXVI)。
树脂结合的茚并吡咯并咔唑(XIII)(图6，方法A)用过量的作为碱的格利雅试剂处理，结果产生暗红色的负碳离子溶液。接着与(V)反应，得到亲电加成到C＝Y基上的产品。用稀酸(1％TFA在二氯甲烷中)使该产品从其树脂上分离净化，就分离出化合物(XXVII)和/或(XXVIII)。用磺酸或路易斯酸如三氟化硼醚合物处理中间体(XXVII)和/或(XVVIII)，得到桥式茚并吡咯并咔唑(II)。
类似的方法被用于可溶性内酰胺保护的中间体，如(XV)(图7，方法B)。但是，在这种情况，中间体(XV)是用在吡啶中的氢氧化四烃铵(Triton B)作为碱来处理，而不是用格利雅试剂。中间体(XXIX)和/或(XXX)可同内酰胺保护的接触而分离出来，它们适合于用色谱法纯化。如方法A，(图6)，用路易斯酸(如三氟化硼醚合物)，就得到桥式茚并吡咯并咔唑(II)，其中R1＝H。
引入基团R3，R4，R5and R6可照美国专利Nos.5,705.511和4,923,986中描述的方法进行，整体引入其公开内容以供参考。R3取代基可在构成桥式茚并吡咯并咔唑后另外引入，如图8所示。B环的3位置由NBS溴化就得到化合物(XXXI)。碳片断通过利用钯催化的Stille，Suzuki，Heck，Kumada或Castro-Stephens反应随后引入，得到(XXXII)，(XXXIII)等类型的化合物。此外，化合物(XXXI)可利用溴被杂原子取代的化合物，如胺作基础的基团，由Buchwald′s钯催化的铵中和反应制备。
通过氧化方法，氧连接基可在E环的茚碳上引入，如图9所示的化合物(XXXIV)。这个化学反应还可导致内酰胺(A环)亚甲基的氧化，得到亚胺衍生物，如所示。
实施例2：Rink树脂结合的中间体(XIII-A)，(XIII-B)和(XIII-C)的制备，(图3)
实施例2A
在装备有塔顶机械搅拌器和Dean-Stark阱的三颈圆底烧瓶中顺序加入Rink酸树脂XII(10.00g，0.64mmol/g)，1-甲基-2-吡咯烷酮(80mL)，苯(350mL)，VIII-A(A1，A2＝H2，B1，B2＝O，R3＝R4＝R5＝R6＝H))(3.00g)和对甲苯磺酸(1.00g)。该反应混合物被加热到回流20小时，而后过滤。树脂用THF(5×175mL)过滤，滤液放置一边。而后树脂顺序用DMSO(4×100mL)，2％NaHCO3水溶液(4×100mL)，水(4×100mL)，DMSO(2×200mL)，THF(4×100mL)和乙酸乙酯(4×100mL)洗涤。使树脂真空干燥(24小时)，得到11.70(0.47mmol/g)树脂结合的VIII-A，(XIII-A)。
蒸发第一次的THF洗涤液，残留物用水(750mL)洗涤，过滤所得沉淀，再顺序用水2％NaHCO3水溶液(4×100mL)和水(4×100mL)洗涤。真空干燥后重新获得VIII-A(1.28g)。
实施例2-B
按照类似的方法，将VIII-B(A1，A2＝O，B1，B2＝H2，R3＝R4＝R5＝R6＝H)(0.5g)偶联到Rink酸树脂XII(1.52g)上，得到1.58g树脂结合的VIII-B，(XIII-B)。
实施例2-C
按类似的方法，将VIII-C(A1，A2＝H2，B1，B2＝O，R3＝R4＝R5＝H，R6＝10-OMe)(1.02g)偶联到Rink酸树脂XII(3.12g)上，得到3.70g(0.46mmol/g)树脂结合的VIII-C，(XIII-C)以及重新获得的VIII-C(0.44g)。
实施例3：化合物(II-1)，(II-2)，(II-3)，(II-4a)，(II-4b)，(II-6)和(II-8)的制备(方法A，图6)
向(XIII-A)(1.25g)在THF(24mL)悬浮液加入1.0M的EtMgBr(6.25mL在THF)溶液，反应混合物在加入HMPA(5.0mL)之前搅拌1小时。搅拌10分钟后，加入二乙氧基丁醛(3.0g)(按照Paquette等，J.Am.Chem.Soc.，1997，119，9662-71文献中的方法制备)，该反应搅拌20小时。反应用10％NH4C1(5mL)水溶液淬灭，并过滤。该树脂连续用10％NH4Cl(3×10mL)水溶液，水(3×10mL)，THF(3×10mL)，DMF(3×10mL)，水(3×10mL)，THF(3×10mL)，和乙醚(3×10mL)洗涤。再将该树脂真空干燥，溶解在二氯甲烷(15mL)中，用三氟乙酸(0.15mL)处理。搅拌1小时后，过滤反应物，蒸发滤液。所得到的残留物溶解在二氯甲烷(20mL)中，并用吡啶鎓甲苯磺酸盐(50mg)处理，将所得溶液搅拌4小时。这时用饱和的NaHCO3水溶液和盐水洗涤反应物，用MgSO4干燥。
过滤和蒸发溶剂后，残留物用制备性HPLC(Zorbax RX-8，4×25cm，由60％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)纯化。适当的馏分用NaHCO3中和并萃取到二氯甲烷(3×50mL)中，MgSO4干燥。过滤和蒸发溶剂后，得到70.2mg的化合物II-1，为白色粉末，具有以下特性：13CNMR(DMSO 171.8，143.3，142.4，141.4，140.1，140.0，136.6，129.2，127.9，127.4，127.1，126.8，124.1(2C)，122.7，121.6，121.5，118.3，112.1，88.1，79.2，56.6，45.6，33.4，24.8；1H NMR(DMSO-d6)d 9.21(d，J＝7.5，1H)，8.62(s，1H)，7.98(d，J＝7.7，1H)，7.86(d，J＝8.3，1H)，7.71(d，J＝7.3，1H)，7.49(dd，J＝7.9，7.4，1H)，7.41(dd，J＝7.5，7.4，1H)，7.36-7.27(m，2 H)，6.86(d，J＝6.0，1H)，5.63-5.58(m，1H)，4.91(s，2H)，4.53(d，J＝3.3，1H)，2.23-2.14(m，1H)，1.96-1.92(m，1H)，0.96-0.88(m，1H)，0.60-0.57(m，1H)；MS m/z(M+H)计算值379，实测值379。
化合物II-2(0.5mg)也可由该反应混合物用制备性HPLC分离得到，具有以下的特性：1H NMR(DMSO-d6)δ9.17(d，J＝8.1，1H)，8.62(s，1H)，7.98(d，J＝7.0，1H)，7.85(d，J＝6.8，1H)，7.57(d，J＝6.8，1H)，7.49(dd，J＝7.9，7.4，1H)，7.44-7.26(m，3H)，6.81(d，J＝6.0，1H)，5.43-5.33(m，1H)，4.43(s，2H)，2.23-2.14(m，1H)，1.96-1.92(m，1H)，1.45-1.55(m，2H)，0.96-0.88(m，1H)，0.60-0.57(m，1H)，0.29(t，J＝7.0，3H)；MS m/z(M+H)计算值407，实测值407。
实施例3-B
按照同样的方法，像上面制备化合物II-1描述的那样，树脂(XIII-A)(70.3 25mg)用1，1-二乙氧基-2-戊酮(0.75mL)(按照Sworin等，J.Org.Chem.，1988，53，4894-6文献中的方法制备)处理，得到化合物II-3(3.5mg)，由制备性TLC(硅胶，用50％EtOAc/甲苯洗脱)分离，具有以下特性：1H NMR(DMSO-d6)δ9.42(d，J＝8.2，1H)，8.58(s，1H)，7.95(d，J＝7.4，1H)，7.79(d，J＝8.3，1H)，7.71(d，J＝7.1)，7.50-7.20(m，4H)，6.81(d，J＝5.9，1H)，4.90(s，2H)，4.46(s，1H)，2.35-2.20(m，1H)，1.98(s，3H)，1.75-1.60(m，1H)，1.25-1.00(m，1H)，0.35-0.15(m，1H)；MS m/z(M+H)计算值393，实测值393。
实施例3-C
按照同样的方法，(XIII-A)(74.3mg)用1，1-二乙氧基-2-己酮(按照Brenner，J.org.Chem.1961，26.22-7文献中的方法制备)(0.75mL)处理，得到化合物II-4a(2.10mg)和化合物II-4b(1.06mg)，分别由制备性HPLC(Zorbax RX-8，4×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)分离。化合物II-4a具有以下特性：1H NMR(DMSO-d6)δ9.30(d，J＝8.3，1H)，8.55(s，1H)，7.97(d，J＝7.2，1H)，7.65(d，J＝8.5，1H)，7.59(d，J＝7.5)，7.48(dd，J＝7.8，7.2，1H)，7.39-7.15(m，3H)，6.31(dd，J＝5.9，5.5，1H)，5.02(s，1H)，4.88(s，2H)，0.88(s，3H)其他脂族讯号在溶剂峰下损失；MS m/z(M+H)计算值407，实测值407。化合物II-4b具有以下特性：1H NMR(DMSO-d6)δ9.43(d，J＝8.1，1H)，8.59(s，1)，7.99(d，J＝7.3，1H)，7.75-7.65(m，2H)，7.49(dd，J＝7.0，6.4，1H)，7.43(dd，J＝8.2，8.1，1H)，7.36-7.25(m，2H)，6.75(s，1H)，4.91(s，2H)，4.50(s，1H)，1.95(s，3H)其他脂族讯号在溶剂峰下损失；MS m/z(M+H)计算值407，实测值407。
实施例3-D
按照同样的方法，(XIII-C)(1.00g)用二乙氧基丁醛(3.65g)处理，得到化合物II-6(87.8mg)，由制备性HPLC(Zorbax RX-8，4×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)分离。具有以下特性：1H NMR(DMSO-d6)δ9.09(d，J＝8.6，1H)，8.60(s，1H)，7.95(d，J＝7.4，1H)，7.84(d，J＝8.3，1H)，7.47(dd，J＝7.2，7.0，1H)，7.35(s，1H)，7.29(dd，J＝7.0，7.0，1H)，6.98(dd，J＝8.6，1.9，1H)，6.83(d，J＝6.0，1H)，5.65-5.55(m，1H)，4.88(s，2H)，4.48(d，J＝3.9，1H)，3.82(s，3H)，225-2.10(m，1H)，2.08-1.85(m，1H)，0.96-0.75(m，1H)，0.65-0.50(m，1H)；MS m/z(M+Na)计算值431，实测值431。
实施例3-E
按照同样的方法，树脂(XIII-B)(153.2mg)用二乙氧基丁醛(1.5mL)处理，得到化合物II-8(3.6mg)，由制备性HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)分离。具有以下特性：1H NMR(DMSO-d6)δ9.09(d，J＝7，9，1H)，8.81(s，1H)，7.81-7.73(m，3H)，7.48-7.35(m，3H)，7.24(dd，J＝7.6，7.5，1H)，6.85(d，J＝6.2，1H)，5.63-5.59(m，1H)，4.86(s，2H)，4.61(d，J＝3.6，1H)，3.82(s，3H)，2.21-2.13(m，1H)，1.96-1.90(m，1H)，0.87-0.79(m，1H)，0.61-0.56(m，1H)；MS m/z(M+H)计算值379，实测值379。
实施例4：化合物II-7a and I1-7b制备(方法A，图6)
实施例4A：
(1，1-二乙氧基乙氧基)丙酮的制备
向冷的(0℃)NaH(2.68g，60％)在THF(150mL)悬浮液加入在THF(20mL)中的1，1-二乙氧基乙醇(按照Zirkie等，J.Org.Chem.，1961，26，395-407文献中的方法制备)(9.00g)，在加入二氯甲烷(8.0mL)前使该反应混合物在室温下搅拌1小时。将该反应混合物加热到回流过液，冷却，通过塞里塑料管塞过滤。旋转蒸发除去溶剂，残留物由柱色谱法纯化(硅胶，20％乙醚/己烷)，得到1，1-二乙氧基乙基甲代烯丙基醚(11.5g，90％)。对该醚(6.00g)在EtOAc(80mL)中冷却了的(-30℃)溶液进行臭氧分解，至到起始原料不能被TLC(1小时)检出止。这时，反应物用氧清洗，用Pd(OH)2(150mg)处理，在氢气氛下搅拌过夜。滤除催化剂，滤液由旋转蒸发浓缩。所得到的残留物用柱色谱法纯化(硅胶，20％EtOAc/己烷)，得到标题化合物(4.53g，82％)。
实施例4-B
按照方法A(图6)，树脂(XllI-A)(230.2mg)用EtMgBr(1.25mL)处理，而后用(1，1-二乙氧基乙氧基)丙酮(实施例3-A)(1.2mL)处理。在从树脂上分离净化后，将一部分粗反应产物混合物(10.5mg)溶解在二氯甲烷(20μL)中，并用BF3醚合物(20μL)处理。在搅拌2.5小时后，该溶液用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，而后用MgSO4干燥。在过滤并蒸除溶剂后，残留物用制备性HPLC(Zorbax RX-8，4×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)净化，得到化合物II-7a(2.34mg)和化合物II-7b(1.34mg)。化合物II-7a具有以下特性：1H NMR(CDCl3)δ9.35-9.20(m，1H)，7.87(d，J＝7.6，1H)，7.62(d，J＝7.0，1H)，7.60-7.45(m，1H)，7.49(dd，J＝7.7，7.5，1H)，7.40(d，J＝8.1，1H)，7.37-7.26(m，3H)，6.22(s，1H)，5.20-4.85(m，1H)，4.47(s，1H)，3.67(d，J＝12.7，1H)3.52(d，J＝11.8，1H)，3.40(d，J＝12.7，1H)，3.38(d，J＝11.8，1H)，1.91(s，3H)；MS m/z(M+H)计算值409，实测值409。化合物II-7b具有以下特性：1H NMR(CDCl3)δ9.58-9.22(m，1H)，7.82(d，J＝7.4，1H)，7.60-7.40(m，3H)，7.37-7.27(m，3H)，7.21(d，J＝8.1，1H)，5.81(s，1H)，5.21(s，1H)，5.10-4.80(m，1H)，4.59(d，J＝13.5，1H)，4.38(dd，J＝13.5，5.3，IH)，4.21(d，J＝13.1，1H)，3.82(d，J＝13.2，1H)，1.13(s，3H)；MS m/z(M+H)计算值409，实测值409。
实施例5：化合物II-5的制备(图8)
向化合物II-1(8.1mg)在THF(2mL)中的溶液加入NBS(4.6mg)，使反应搅拌过夜。加入另外的NBS(4.5mg)使该反应搅拌2.5小时。滤除不溶物，滤液由旋转蒸发浓缩。所得到的残留物用柱色谱法纯化(C-18，65％MeCN/水wI 0.1％三氟乙酸)。适当的馏分用NaHCO3中和，并萃取到二氯甲烷(3×20mL)中，用MgSO4干燥。过滤并蒸除溶剂后，得到化合物II-5(5.1mg)，白色粉末，具有以下特性：1H NMR(DMSO-d6)δ9.22(d，J＝7.4，1H)，8.67(s，1H)，8.14(s，1H)，7.86(d，J＝8.7，1H)，7.72(d，J＝7.0，1H)，7.63(d，J＝7.8，1H)，7.42(dd，J＝7.5，7.3，1H)，7.35(dd，J＝7.3，7.2，1H)，6.86(d，J＝6.0，1H)，5.63-5.58(m，1H)，4.94(s，2H)，4.54(d，J＝3.1，1H)，2.30-2.14(m，1H)，2.00-1.82(m，1H)，0.96-0.88(m，1H)，0.62-0.50(m，1H)；MS m/z(M+H)计算值457/9(1∶1)，实测值457/9(1∶1)。
实施例6：中间体XV的制备(图4)
向VIII-A[A1，A2＝H2，B1，B2＝O，R3＝R4＝R5＝R6＝H)](1.05g)在DMF(25ml)中的溶液加入三乙胺(0.75mL)和氯代叔丁基二甲基硅(TBS-Cl)(0.65g)。搅拌3小时后，该反应用饱和NaHCO3淬火，并萃取到EtOAc中。有机层用水和盐水洗涤，用MgSO4干燥。在过滤蒸出溶剂后，所得到的残留物用乙醚研制，得到化合物XV(848mg)。洗涤液蒸发留下残留物，用柱色谱法纯化(硅胶，1％EtOAc/CH2CI2)，得到另一份产品(502mg，结合产率94％)，具有以下特性：1H NMR(DMSO-d6)δ11.94(s，1H)，9.32(d，J＝7.6，1H)，8.03(d，J＝7.7，1H)，7.64(d，J＝7.2，1H)，7.58(d，J＝8.1，1H)，7.44(dd，J＝7.7，7.6，1H)，7.39(dd，J＝7.7，7.6，1H)，7.32(d，J＝7.3，1H)，7.25(dd，J＝7.6，7.3，1H)，5.00(s，2H)，4.14(s，2H)，0.99(s，9H)，0.46(s，6H)；MS m/z(M+H)计算值425，实测值425。
实施例7：由方法B制备化合物II-1(图7)
Triton B在吡啶(0.45M)中的溶液通过在吡啶(10mL)中溶解40％的Triton B甲醇溶液(10mL)而制备。减压(20mm Hg)排除溶剂到最后剩8mL。残留物由吡啶稀释到50mL，在氮气氛下过滤保存。XV(20.3mg)在吡啶(2.0mL)的溶液用氩气清洗，用300μL的TritonB(0.45M在吡啶中)和二乙氧基丁醛(50μL)处理。在搅拌2小时后，将反应物萃取到EtOAc中，用1N的HCl水溶液、盐水洗涤，MgSO4干燥。过滤并蒸出溶剂，加成物溶解在CH2Cl2(10mL)，用BF3醚合物(10mL)处理。在搅拌2小时后，该溶液用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，而后MgSO4干燥。由旋转蒸发排除溶剂，得到的残留物用制备性HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)纯化。适当的馏分用NaHCO3中和，并萃取到中二氯甲烷(3×20mlL)中，并用MgSO4干燥。过滤蒸出溶剂后，得到II-1(11.8mg，产率65％)，其1HNMR和MS光谱以及HPLC保留时间同由实施例3-A描述的方法A制备和分离的产品相同。
实施例8：化合物II-9的制备(图8)
向溴代化合物II-5(6.2mg)在1-丙醇(4.0mL)中的溶液加入3-氨基苯基硼酸(3.8mg)。搅拌0.25小时后，顺序加入Pd(OAc)2(2.0mg)，Ph3P(4.8mg)，Na2CO3(2.8mg)，and水(2.0mL)。将该混合物加热回流0.75小时，冷却，萃取到CH，Cl2中，用水和盐水洗涤。有机层用MgSO4干燥，旋转蒸发排除溶剂，得到的残留物用制备性HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，50％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)纯化。适当的馏分用NaHCO3中和，并萃取到中二氯甲烷(3×20mL)中，用MgSO4干燥。过滤蒸出溶剂后，得到II-9(3.1mg，产率49％)，具有以下特性：1H NMR(DMSO-d6)δ9.22(d，J＝7.5，1H)，8.66(s，1H)，8.00-7.25(m，8H)，7.12(dd，J＝7.1，7.0，1H)，6.95-6.80(m，3H)，6.53(d，J＝6.0，1H)，5.63-5.58(m，1H)，4.99(s，2H)，4.55(s，1H)，2.25-2.10(m，1H)，1.95-1.90(m，1H)，0.98-0.88(m，1H)，0.65-0.57(m，1H)；MS m/z(M+H)计算值470，实测值470。
实施例9：化合物II-10的制备(图9)
向化合物II-1(5.0mg)在DM50(1mL)中的溶液加入NaCN(4.3mg)，反应混合物加热到145℃1小时。使该混合物冷却，萃取到EtOAc，用水(3×20mL)和盐水洗涤。有机层用MgSO4干燥，过滤蒸发，得到的残留物用制备性HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，55％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)纯化。适当的馏分用NaHCO3中和，并萃取到二氯甲烷(3×20mL)中，用MgSO4干燥。过滤蒸出溶剂后，得到II-10(2.7mg，产率50％)，具有以下特性：1H NMR(DMSO-d6)δ11.4(s，1H)，8.86(d，J＝7.9，1H)，8.79(d，J＝7.6，1H)，7.90(d，J＝8.3，1H)，7.62-7.55(m，2H)，7.49(dd，J＝7.6，7.4，3H)，7.40(dd，J＝7.4，7.31H)，7.35(dd，J＝7.5，7.4，1H)，6.86(d，J＝6.0，1H)，6.03(s，1H)，5.40-5.30(m，1H)，2.25-2.14(m，1H)，2.03-1.90(m，1H)，1.10-0.98(m，1H)，0.82-0.77(m，1H)。
实施例10：化合物II-11的制备(方法A，图6)
按照方法A，树脂(XIIIa)(150.2mg)同EtMgBr(1.0mL)反应，接着用2，5-二氧代戊酸乙酯(Schmidt等，Synthesis，1993，809)(1.5mL)处理。在与树脂分离净化后，将粗反应产物混合物溶解在二氯甲烷(20mL)中，并用BF3醚合物(20μL)处理。在搅拌2.5小时后，该溶液用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，而后用MgSO4干燥。在过滤除去溶剂后，残留物用制备性HPLC(Zorbax RX-8，4×25cm，55-57％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)净化，得到化合物II-11(6.4mg)，具有以下特性：1H NMR(DMSO-d6)δ9.36(d，J＝7.7，1H)，8.68(s，1H)，8.00(d，J＝7.7，1H)，7.83(d，J＝8.3，1H)，7.58-7.15(m，5H)，6.97(d，J＝5.9，1H)，4.93(s，2H)，4.82(s，1H)，4.48(q，J＝7.1，2H)，2.42-1.91(m，2H)，1.37(t，3H，J＝7.1)，1.25-0.63(m，2H)。
实施例11：化合物II-12的制备
化合物II-11(3.4mg)在THF(2mL)中的溶液用2M的LiBH4溶液(1.0mL在THF中)处理，使该反应搅拌1小时。加入IN的HCI(4mL)水溶液使反应淬火。在搅拌20分钟后，加入10％NaOH水溶液(15mL)，并将该混合物萃取到二氯甲烷(3×10mL)中。用MgSO4干燥后，过滤反应混合物，蒸出溶剂，得到化合物II-12(0.32mg)，具有以下特性：1H NMR(DMSO-d6)δ9.35(d，J＝7.7，1H)，8.62(s，1H)，7.98(d，J＝7.7，1H)，7.83(d，J＝8.2，1H)，7.75(d，J＝8.2，1H)，7.50-7.25(m，4H)，6.84(d，J＝7.7，1H)，6.1 1(s，1H)，4.91(s，2H)，4.71(s，1H)，4.50-4.40(m，1H)，4.30-4.20(m，1H)2.42-1.91(m，2H)，1.25-0.63(m，2H)；MS m/z(M+H)计算值.409，实测值409。
实施例12：脊髓ChAT活性的增加
ChAT是功能性胆碱能神经元的特定标记物。胆碱能神经元表示输入海马趾结构、嗅觉神经核、脚间核、皮质、扁桃体和部分背侧丘脑的主要胆碱能。在脊髓中，运动神经元是含有ChAT的运动神经元(Phelps等人，J.Comp.NeuroL，1988，273，459-472)。ChAT活性用于研究神经营养因子(例如，NGF或NT-3)对胆碱能神经元的存活和/或功能的影响。ChAT试验也用作调整胆碱能神经元内ChAT水平的指示。
方法：分离出大鼠胎儿脊髓细胞，试验按Smith等人，J.CellBiology，1985，101，1608-1621；Glicksman等人，J.Neurochem.，1993，61，210-221所述的方法进行。用标准的胰蛋白酶技术(Smith等人，见上文)，由大鼠(14-15天的胚胎)分割出来的脊髓制备分离的细胞。在多鸟氨酸涂覆的塑料组织培养皿上，在补充了0.05％牛血清白蛋白(BSA)的无血清N2介质(Bottenstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1979，76，514-517)中，以6×105细胞/cm2进行平板培养。培养物在37℃，于潮湿的5％CO2/95％空气气氛中孵化48小时。2天后，用改进的Fonnum方法(Fonnum，Neurochem.，1975，24，407-409)，按照McManaman等人和Glicksman等人的方法(McManaman等人，Develop.Biol.，1988，125，311-320；Glicksman等人，J.Neurochem..见上文)，进行ChAT活性的体外测定。
实施例所述式II化合物列于表2，其中R1、R4、R6和R7是H；Y是O；和n是1。
                                              表2
   化合物编号     A1A2   B1B2   R2     R3     R5   R8 Z     M
    II-1     O   H，H   H     H     H   H 单键     1
    II-2     O   H，H   Et     H     H   H 单键     1
    II-3     O   H，H   H     H     H   Me 单键     1
    II-4a     O   H，H   H     H     H   Me 单键     2
    II-4b     O   H，H   H     H     H   Me 单键     2
    II-5     O   H，H   H     Br     H   Me 单键     1
    II-6     O   H，H   H     H     10-OME   H 单键     1
    II-7a     O   H，H   H     H     H   Me O     1
    II-7b     O   H，H   H     H     H   Me O     1
    II-8     H，H   O   H     H     H   H 单键     1
    II-9     O   H，H   H     3′-NH2-Ph     H   H 单键     1
    II-10     O   O   OH     H     H   H 单键     1
    II-11     O   H，H   H     H     H   CO2-Et 单键     1
    II-12     O   H，H   H     H     H   CH2-OH 单键     1
实施例13：pCDNA-3-EE-MLK3，pcDNA3-EE-MLK(K144R)
MLK3如文献所述克隆(Lee等人，Oncogene，1993，8，3403-3410；Ezoc等人，Oncogene.1994，9，935-938)。由200ng聚腺苷酸盐黑素细胞mRNA制备cDNA，用5％反应液作为扩增PTK cDNAs所有组成成分的模板，使用由保存的下述PTKs的VIb和IX子域的共有序列衍生的2或4种高简并的寡核苷酸引物：PTK1，5′-CGGATCCACMGIGAYYT-3′(SEQ ID NO：1)；PTK2，5′-GGAATTCCAWAGGACCASACRTC-3′(SEQ ID NO：2)；PTK3，5′-CGGATCCRTICAYMGIGAYYTIGCIGCIMGIAA-3′(SEQ ID NO：3)；PTK4，5′-GGAATTIAYIGGAWAIGWCCAIACRTCISW-3′(SEQ ID NO：4)。用Taq DNA聚合酶(AmpliTaq；Perkin-Elmer/Cetus)和DNA自动热循环物，使PCR进行40个循环，每个循环在94℃进行40秒，在37℃进行2分钟，和在63℃进行3分钟。将8种PCRs产物置于池中，用DNA聚合酶(Kienow)处理，用BamH1加上EcoR1分离以及在5％聚丙酰胺凝胶中进行电泳操作。溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色鉴定出占优势的200-230bp带，将其酶切开、洗涤和克隆到M13mp18。在一实施方案中，不把部分PCR扩增的cDNA分开，而是直接克隆到用Smal分开的M13mp18。用链-终止的测序方法测定核苷酸序列。
鉴定为PTK1的一种cDNA可用作探针，以筛选人体黑色素瘤和黑素细胞cDNA文库。定义为PTK1-3.2的克隆体，包括2541n完全开放的读框，847个氨基酸编码。此cDNA用Ncol酶切开，用DNA聚合酶(Kienow)钝化，再用EcoR1酶切开和载体pCDNA3-EE连接，以BamH1酶切开，钝化和用EcoR1酶切。通过在HindIII/BamH1位点插入寡核苷酸构成载体PCDNA3-EE，寡核苷酸编码起始密码子随后是EE抗原表位，MEEEEYMPME(SEQ ID NO：5)(Grussenmeyer，等人，Proc.Natl Acad.Sci，USA，1985，82，7952-7954)。应用以前已经公开的方法(Chen等人，Biotechniques，1994，17，657-59)，通过用PCR制备K144R突变体来制备MLK3的激酶死亡模型。第一种诱导有机体突变的寡核苷酸是5′-GTGGCTGTGCGGGCAGCTCGCCAG-3′(SEQ ID NO：6)，以及第二种寡核苷酸是5′-GAGACCCTGGATCTCGCGCTT-3′(SEQ ID NO：7)。用MLK3作为模板，这些寡核苷酸被用于PCR，以产生806碱基对片段，在第二PCR反应中使用T7引物作为其它扩增引物，用MLK3作为模板可产生1285碱基对片段。用琼脂糖凝胶电泳分离片段，克隆至pGEM-5(Promega)和测序。所述片段以HindIII和Hpal酶切开，并插入到用HindIII和HpaI切开的pCADA3-EE-MLK3。在核苷酸1342测出另外的点突变。为了进行校正，由野生型MLK3上酶切下Pf1M1片段(nt 1093-1418)，并用来代替KI44R突变的MLK3片段。
实施例14：pFB-FLAG-MLK3
为了得到MLK3蛋白，将cDNA克隆成为杆状病毒表达的载体pFB-FLAG。通过用Nco 1消化由PTK1-3.2上酶切下MLK3，用DNA聚合酶(Kienow)钝化，再用Not1酶酶切，和用Stul和Noti消化的pFB-FLAG连接。pFB-FLAG由pFB衍生而来(Life Technologies)，并具有FLAG表位编码序列(Hopp等人，Biotechnology，1988，6，1205-1210)，起始密码子是MDYKDDDDK(SEQ D NO：8)，再加上在BamH1位点的多接头。
实施例15：pFB-GST-MLK3(KD)
用EcoR1和Xho1由pGEXKG-MLK3(KD)上酶切下MLK3片段得到MLK3激酶区的杆状病毒表达，并使其和用EcoR1和Xho1酶切下的pFB载体结合，其中谷光甘肽5-转移酶(GST)的编码序列被向上游克隆。这可用载体为模板，通过得到GST的编码序列和用PCR，由pGEXKG载体的多接头来实现(Guan等人，Anal.Bioch.，1991，192，262-267)。为得到PCR，5′寡核苷酸可制成在片段的5′端基为Bg12的限制酶酶切位点。然后，将此分离的片段用Bg12和HinD3消化，并和用BamH1及HinD3消化的pFB连接。
实施例16：pGEXKG-MLK3(KD)
通过用PTK1 cDNA的PCR，可以得到包括有MLK3激酶区和有部分亮氨酸拉链(nt 736-1791)两部分的cDNA片段。分离的片段用限制酶EcoR1和Xho1消化，位点包括在PCR寡核苷酸中，和克隆至用EcoR1和Xho1消化的pGEX-KG。然后将在pGEX-KG上的此片段用PCR缩短，以便只含有激酶区(nt 736-1638)。
实施例17：pKH3-MLK3，pKH3-MLK3(KA)
用简并的PCR克隆MLK2(Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710；Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1995，234，492-500)。在上皮肿瘤细胞系Colo16中表达的cDNAs编码催化的蛋白激酶子域片段由RNA被反转录酶PCR扩增。在对表皮生长因子受体家族激酶催化的区域的子域Vib和VIII中基序序列编码中是以简并的PCR引物为基础。引物的序列如下：前引物5′-CGGATCCGTG(A)CACC(A)GT(CG)G(A)ACC(T)T-3′(SEQ ID NO：9)，反转引物5′-GGAATTCACCA(G)TAA(G)CTCCAG(C)ACATC-3′(SEQ ID NO：10)。将几种PCR产物克隆为M13和用T7 Super-Base测序试剂盒(Bresatec)测序。用一216-碱基对PCR产物作为探针以筛选人体克隆λgt11 cDNA文库(Clontech，catalog #HL 10346)。将片段随机标号，在65℃杂化，和在65℃洗涤过滤器至stringency 0.2X NaCl/柠檬酸盐(150mM氯化钠，15mM柠檬酸钠，pH7.0)和0.5％SDS。过滤器在-70℃用Kodak XAR-5胶片放射能照像16小时。分离4种克隆产品，在相同的条件下最长的1.2kb用作同一文库的反探针(reprobe)。对4个更长的克隆体进行选择，其中之一表示为MLK3的1034bp片段。此克隆体用作人脑λgt11文库的探针。差不多筛选了500,000克隆体，并分离出一3454bp的克隆体，代表MLK2的整个编码区。
由ATG至polyA尾，用2个步骤，将MLK2克隆至BamH1和EcoR1位点之间的载体pKH3，在MLK2序列的中间有BamH1。插入3份HA抗原表位标记构建载体pKH3，接着在pRK7多接头的Xbal和EcoR1之间插入BamH1。为了制成诱导有机体突变的物质的模型，MLK2 5′BainH1片段K125A被克隆为Promega pAlter载体，并按生产者所推荐的方法使之突变。然后把片段克隆回到MLK2 pKH3载体。
实施例18：pcDNA3-HA-JNK1
如(Coso等人，Cell，1995，81，1137-1146)所述可得到JNKI cDNA。用人体骨骼肌cDNA(Invitrogen)模板，通过PCR得到cDNA，它可被克隆成为pcDNA3-HA的Bg12/Sal1位点，是一种改性的pcDNA3表达质粒编码HA表位(Wilson等人，Cell，1984，37，767-778)。然后由包括HA表位的pcDNA3上酶切，并引入pGEX-4T3(Pharmacia)。由构建成Bg12/Sal1片段的pGEX-4T3上酶切得到JNK1 cDNA，并引入pcDNA3-HA，带有HA表位的载体加在pcDNA3-HA的HinD3/BamH1位点。
实施例19：pFLAG-DLK
如(Holzman等人，J.BioL Chem.，1994，269，30808-30817)所述将DLK克隆为带FLAG表位的表达载体pcDNA3。用简并寡核苷酸-基PCR克隆法分离DLK的cDNA片断。按照制造者(TRIzol Reagent，LifeTechnologies，Inc.)的指示用常规的制备酚/异硫氰酸胍试剂的方法由13.5天胚胎的肾(32个器官)和17.3天胚胎的肾(16个器官)萃取得到总RNA。在用无DN酶的RN酶消化后，总RNA用RNA酶H-反转录酶(Superscript，Life Technologies，Inc.)从寡核苷酸(dT)合成寡核苷酸引物反转录为单链cDNA。与蛋白质酪氨酸激酶催化的子域Vib和IX相应的，简并寡核苷酸引物最先由Wilks提出(Wilks，Proc Nad AcadSci USA.，1989，86，1603-1607)，将其改性为5′EcoR1和HindIll位点，分别为(5′-ATAATTC(GT)GC(TAGC)GCCA(GA)GTC(TAGC)CGGTG-3′(SEQ ID NO：11)，5′-ATAAGCTTCC(TC)(AG)T(GC)AAGTGGA(TC)(GC)GC(AGC)CC(CT)GA-3′)(SEQ ID 25 NO：12)。在94℃，1.5分钟，37℃，2分钟，63℃，3分钟可进行40个PCR循环。加入新鲜试剂，在72℃最后延长的10分钟之前，再完成40个循环。得到的200-210-bp DNA扩增产物进行硅胶分离，亚克隆为制备的pGEM7zf(+)质粒(Promega)，并变换成大肠杆菌(Escherichia coli)。小量制备的DNA质粒可由被变换的细菌制备，和用EcoRI和HindIII限制核酸内切酶部分消化；对含有插入体的克隆体进行测序。
将由简并的PVR得到的195-bp DLK cDNA片段进行放射性标记，并用于筛选差不多1×106 Uni-ZAP II重组体(Stratagene，LaJolla，CA)，寡核苷酸(dT)-引导的抗原的成年小鼠脑cDNA文库(Holzman等人，Mol Cell Biol，1990，10，5830-5838)。42℃下，过滤器在含有50％甲酰胺、5xSSC、3xDenhardt′s溶液、0.25％SDS，1mg/ml聚腺苷二磷酸和200mg/ml鲑鱼精子DNA的缓冲溶液中杂化，并于室温下用2xSSC，0.2％SDS洗涤一次，于65℃以同样的溶液在30分钟内洗涤二次。鉴定出25个独特的克隆体，按照制造者的方法和限制性内切酶图进行体内酶切，将10个克隆体纯化为同质性。对两种最长的克隆体(分别为3401和3397bp，，其差别仅在于5′末端)沿着其全长的链测序。
将全长的NotI-Xho1 DLK cDNA片段(3401bp)亚克隆为巨细胞病毒促进剂为基的真核生物表达载体pcDNA3(Invitrogen，SanDiego，CA)(注册为pcDNA3-DLK的构成)。下一步，制备标记的NH4-Met FLAG表位(DYKDDDDK)(SEQ ID NO：13)构成(pFLAG-DLK)。用PCR扩增cDNA片段，该片段编码5′HindIII表位，DLK′s Kozak′s共有序列，其中包括有由核苷酸88扩展到核苷酸758 EcoRI的内表位的启动子ATG、FLAG表位和DLKcDNA可读框序列。(以等量使用的HPLC纯化合成寡核苷酸：对FLAG构成有义引物而言为5′-ATAAAGCTTCCAGAGGCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGCCTGCCTCCATGAAACCCGAACA-3′(SEQ ID NO：14)，对反义引物而言为5′-GACAGGGCGGCCGGCTCT-3′(SEQ IDNO：15))。凝胶纯化的HindIII和EcoR1消化扩增的片段经亚克隆成为HindIII-EcoR1，以制备pcDNA3-DLK质粒。沿双链对构成测序，以确认Taq聚合酶的精确度和保持可读框。
实施例20：pcDNA3-MLK1
由EST数据库(注册号# AA 160611)得到MLK1的5’部分。该克隆体是MLK1和其它未知同一性的cDNA的融合体。它含有以前没有公布的MLK1的5′序列，所述的MLK1伴随有以前公布的MLK1激酶区(Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710)。来自EST克隆体的MLK1 cDNA序列如下：GAATTCGGCACGAGAGGACTCGCAGGTGTC CGGCGACGAG GGCTGGTGGA CCGGGCAGCT GAACCAGCGGCTGGGCATCT TCCCCAGCAA CTACGTGACC CCGCGCAGCG CCTTCTCCAGCCGCTGCCAG CCCGGCGGCG AGGACCCCAG TTGCTACCCG CCCATTCAGTTGTTAGAAAT TGATTTTGCG GAGCTCACCT TGGAAGAGAT TATTGGCATCGGGGGCTTTG GGAAGGTCTA TCGTGCTITC TGGATAGGGG ATGAGGTTGCTGTGAAAGCA GCTCGCCACG ACCCTGATGA GGACATCAGC CAGACCATAGAGAATGTTCG CCAAGAGGCC AAGCTCTTCG CCATGCTGAA GCACCCCAACATCATTGCCC TAAGAGGGGT ATGTCTGAAG GAGCCCAACC TCTGCTTGGTCATGGAGTTT GCTCGTGGAG GACCTTTGAA TAGAGTGTTA TCTGGGAAAAGGATTCCCCC AGACATCCTG GTGAATTGGG CTGTGCAGAT TGCCAGAGGGATGAACTACT TACATGATGA GGCAATTGTT CCCATCATCC ACCGCGACCTTAAGTCCAGC AAC(SEQ ID NO：16).    它译成为：NSAREDSQVSGDEGWWTGQL NQRVGIFPSN YVTPRSAFSS RCQPGGEDPS CYPPIQLLEIDFAELTLEEI IGIGGFGKVY RAFWIGDEVA VKAARHDPDE DISQTIENVRQEAKLFAMLK HPNIIALRGV CLKEPNLCLV MEFARGGPLN RVLSGKRIPPDILVNWAVQI ARGMNYLHDE AIVPIIHRDL KSSN(SEQ ID NO：17)。
如以前所公开的，MLK1的3’部分最初可被简并PCR克隆(Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710)。上文描述了将MLK1的3’部分克隆为MLK2的方法，除了下述例外。由具有1.2kb克隆体文库的再筛选中得到的四个克隆体中有三个被表示为MLK1。没有包括整个激酶区的克隆体可由PCR获得。
由每等份1ml的扩增文库得到的噬菌体(在1Uni-ZAPXR(Stratagene，cat #937204)正常人体结肠上皮和人体T84结肠癌细胞系cDNA)通过悬浮于20ml水溶解，并快速冷冻。在每一文库的两个反应中均使用5ml溶解了噬菌体的样品作为PCR模板。由核苷酸序列侧区克隆位点得到代表载体的引物。在T84结肠癌细胞系文库中，使用T3和T7序列的引物(Promega)。在各个反应中，一个引物取自基因的3′-5′链，由已知序列的5’端起在100bp左右。第二个引物是两个载体引物中的一个。在总量50ml中，PCR反应物含有1XPCR缓冲溶液、2.5mM氯化镁、1U Taq聚合酶(都购自Bresatec)、0.2mMdNTP和0.4mM各种引物。反应条件是在95℃60秒，52℃90秒和在72℃90秒进行30个循环，在最后一个循环中时间扩展到15分钟。如上所述克隆PCR产物并测序。从文库中筛选出的最长的克隆体和含有附加MLK1序列的PCR片段结合在一起形成pUCI18的1.08kbMLKI cDNA。
来自EST数据库的MLK1克隆体可在载体pBluescript 10(Stratagene)中获得。来自结肠文库的MLK1 cDNA结合成为EST克隆体，这是通过将前者用EcoR1消化，用Kienow钝化，用AflII酶切。将此分离的片段克隆成为来自EST数据库的，用Xhol酶切，Kienow钝化，用AflII酶切的MLK1 cDNA。由pBluescript酶切得到的新构成用Notl和Apal消化，并结合到用Notl和Apal酶切的pcDNA3-EE中。所有克隆的结合物进行序列检测。
实施例21：GST-MLKKD D的E.coli表达
通过电穿孔将PGEXKG-MLK3(KD)转变为E.coli菌株BL12。将含有质粒的细菌在15升Applikon发酵罐(fermenter)中于10升体积下述介质中接种：1.95g/L K2HPO4、0.9g/L KH2PO4、0.1g/L氨苄青霉素、0.3g/L(NH4)2SO4、0.92g/L MgSO4·7H2O、42.7mg/L柠檬酸钠、21.8mg/L FeSO4·7H2O、0.5ml毕赤酵母属痕量金属(Higgins等人，Methods Molecular Biology，1998，103，149-177)、20g/酪蛋白氨基酸、40g/L甘油、25.5mg/L CaCl2。细菌在800rpm/68％溶解氧/30℃生长过夜，直到培养物达到OD600＝4.4。重组蛋白质的生成由加入1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷诱导，在25℃连续发酵达6小时。然后，离心回收细菌，细胞糊在-20℃冷冻储存直至纯化。
实施例22：细菌GST-MLK3KD的纯化
在100mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，5mM二硫苏糖醇(DTT)，pH7.5(缓冲液A)中超声处理100gm细菌糊可制备部分纯化的GST-MLK3KD。所述溶液用1％Triton X-100制备，然后在冰中搅拌1小时。在20,000xg离心45分钟后，在冰中将澄清的溶液和以缓冲液A平衡的10ml谷光甘肽琼脂糖凝胶4B树脂(Pharmacia)混合1小时。压成片的树脂用12.5x体积的缓冲液A洗涤二次，然后用20mL 100mM Tris-HCl，150mM NaCl，5mM DTT(缓冲液B)洗脱，缓冲液B中含有20mM谷光甘肽，pH为7.5。蛋白质用缓冲液B透析，并以多份于-80℃储存。
实施例23：FLAG-MLK3和GST-MLK3KD的杆状病毒群表达
用BAC-TO-BAC系统(Life Technologies)，按照手册的指示，表达FLAG-MLK3和GST-MLK3KD的重组体杆状病毒群由它们各自的转移载体pFB-FLAG-MLK3和pFB-GST-MLK3KD生成。Sf21细胞(Vaughn等人，In Vitro，1977，13，213-217)的悬浮培养物在27℃/120rpm，和在补充的Grace介质(Hink，Nature，1970，226，466-467)中，与10％热失活的胎儿牛血清(FBS)一起培养。为了生成重组体FLAG-MLK3，使细胞密度1.5×106细胞/ml补充的Grace介质的Sf21细胞多次重复感染3.1(MOI)，介质中含有5％FBS，在感染39小时后收获。为了得到重组GST-MLK3KD，使细胞密度1.5×106细胞/ml补充的Grace介质的Sf21细胞多次重复转染2(MOI)，介质中含有5％FBS，在转染41小时后收获。在两种情况下，见压成片的细胞再悬浮于含有10mMHEPES，50mM NaCl，0.5mM Pefabloc SC，5μM胃酶抑素，10μg/mL抗蛋白酶肽和10μg/ml白胃素的缓冲液，pH7.4。在147,000xg离心1小时后，用3M Tris碱调整上清液溶液的pH为7.4，在纯化前于-70℃储存。
实施例24：杆状病毒群GST-MLK3KD的纯化
部分纯化的杆状病毒群GST-MLK3KD由谷光甘肽亲和色谱制备。就10ml细胞萃取液(26.6mg总蛋白)而言，需要加入在10mMHEPES、150mM NaCl，pH7.4(缓冲液C)平衡的1ml谷光甘肽琼脂糖凝胶4B树脂(Pharmacia)，使蛋白在4℃结合45分钟。然后在柱中以30倍柱体积的缓冲液C洗涤树脂，以5倍柱体积的，含有20mM谷光甘肽的缓冲液C洗脱。把汇集的最终产物用缓冲液C透析，并以多份于-70℃储存。
实施例25：杆状病毒群FLAG-MLK3的纯化
部分纯化的杆状病毒群FLAG-MLK3用抗体亲和色谱制备。15mL萃取液的蛋白(19.5mg总蛋白)和0.1M NaCl在0.25ml柱中结合，所述的柱为与琼脂糖树脂(Sigma)偶合的M2单克隆FLAG肽抗体，该柱需要重复负载(共三次)。在进行色谱层析之前，树脂用5倍柱体积的50mM Tris-HCI、150mM NaCl，pH7.4(TBS)洗涤平衡，和用3倍柱体积的0.1M甘氨酸(pH3.5)，接着用另外5倍柱体积的TBS洗涤。重组体蛋白主要由5倍柱体积的0.2mM FLAG肽(N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C)(SEQ ID NO：18)TBS的溶液洗脱。试验前以多份于-80℃储存。
实施例26：显性负性突变体：在不同的PC12细胞除去神经生长因子后，MLK家族区组死亡的显性负性突变体
由大鼠嗜铬细胞瘤肿瘤衍生的PC12细胞广泛用于测定导致神经元死亡的分子行为的神经元细胞模型(参见综述Troy等人，Adv.Neurology，1997，103-111)。神经生长因子(NGF)诱导PC-12细胞分化成交感神经神经元表型(Greene，Cell BioL，1978，78，747-755)。在由培养介质中移动出NGF后，NGF分化的PC-12细胞的存活依赖于NGF和经历形态学描述的编程性细胞死亡。为了测定NGF排出后各种混合谱系激酶家族对PC-12细胞死亡的作用，给细胞系统显影。PC-12细胞用cDNA编码的MLK-3显性负性(DN)突变体转染，制造者推荐使用Pfx脂质体转移系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用G418硫酸盐(Mediatech Inc.，Henidon，VA)选择转染体表达DN-MLK-3的稳定池。在该池中30％左右的细胞表达了用免疫组织化学法测定的DNMLK3。细胞池稳定的表达的突变激酶在多鸟氨酸/层粘连蛋白(在磷酸盐缓冲盐水中每个为10μg/ml)涂覆的组织培养96穴培养板上铺板，密度为2×104细胞/穴，并用100ng/ml NGF处理7天。除去含有NGF的介质，细胞单层用磷酸盐缓冲液和含有中和抗体(cat.#N6655；Sigma，St.Louis，MO)的介质洗涤，最后以1∶1000稀释替代1-5天。用细胞生存试验定量测定细胞的生存能力，如制造者(Promega，Madison，WI)所推荐的，使用四唑盐，MTS转化成染色的甲(formazan)，它可用CytoFluor 2350(Millipore，Bedford，MA)仪器上，于570nm读出吸收值。稳定池中表达的DN-MLK-3可部分救活由于NGF排出造成的细胞死亡(图10)。
实施例27：重组体MLK蛋白的酶活性试验
为了显示以杆状病毒群或细菌表达系统表达的MLK蛋白具有酶活性，可采用几种试验方式。MLK蛋白可以是全长构成或是以杆状病毒群或细菌表达系统表达的激酶区。试验可以抗体为基础，例如酶连接的免疫吸附试验(ELISA)，时间分辨荧光免疫测定法(ThF)或荧光偏振(FP)。抗体可以是对磷丝氨酸、磷苏氨酸或磷-特异性基质具有活性的单克隆的或多克隆抗体。另外，也可以使用非-抗体为基础的方法，例如放射性-胶基试验(见图11)、多筛选三氯乙酸(TCA)沉淀试验(见图13)、闪烁亲近试验(SPA)、快速板层析法或磷酸纤维素过滤试验法(phosphocellulose filter assay format)(见图13)。设计试验，以控制基质的直接磷酸化或在形成信号的途径中用下游激酶控制偶合试验系统。所述的基质可以是特异性的基质，如SEK-1，或是相对非特异性的基质如髓磷脂碱性蛋白(MBP)。
实施例28：激酶试验：
(1)放射性胶-基激酶试验(Radioactive Gel-Based Kinase Assay)
MLX-3激酶活性通过控制[γ-32P]-ATP的32p与MLK基质的结合(如死亡激酶SEK-1；髓磷脂碱性蛋白)。50μl试验混合物含有缓冲液A(20mM MOPS，pH7.2，25mM β-甘油磷酸酯，5mM EGTA，1mM原钒酸钠，1mM二硫代苏糖醇)、15mM MgCl2、100μMATP，10μCi[γ-32P]-ATP和0.1μg死亡激酶SEK-1基质(Stressgen，Inc；由带有10mM谷光甘肽，pH8.0的谷光甘肽-琼脂糖串释放出结合的谷光甘肽5-转移酶-SEK-1(GST-SEK-1))或25μg MBP(SigmaChemical Co.)。通过加入MLK蛋白(激酶区或含有全长和激酶区两者的制剂)或控制蛋白质开始反应。混合物于30℃孵化30分钟。反应最后加入2x还原样品的缓冲液。使混合物沸腾5分钟，负载于12％SDS-PAGE凝胶(以MBP为基质)或8％凝胶(SEK-1)。电泳后，干燥凝胶。对结合基质SEK-1的磷酸盐定量，试验在Molecular DynamicsPhosphorimager(Sunnyvale，CA)上进行。试验结果说明杆状病毒群表达MLK-3(FLAG-标记的全长或GST-标记的激酶区)具有酶活性，以死亡激酶GST-SEK-1或MBP为基质的活性如图11A和11B所示。
(2)蛋白质印迹分析
杆状病毒群表达MLK-3的激酶活性通过免疫印迹法进行分析。20μl试验混合物含有缓冲液A，15mM Mgcl2，100μM ATP和0.1μg死亡激酶SEK-1基质。使反应于30℃进行30分钟，然后用10μl4x还原样品的缓冲液使反应停止。在8％Tris-甘氨酸凝胶上分离蛋白质，并用电泳法转移至固定PVDF膜。所述膜与磷-特异性的SEK-1(Thr223)抗体(New England Biolabs，Inc.)一起孵化，接着加入用标记了山羊抗-兔IgG(Bio-Rad)的辣根过氧化物酶。免疫活性带的测定是通过化学荧光(Amersham)的增加来测定。死亡激酶GST-SEK-1由FLAG-MLK-3蛋白(含有全长和激酶区的杆状病毒群制剂)磷酸化在图12说明。
(3)多筛选三氯乙酸(TCA)沉淀试验
细菌表达GST-MLK3激酶区的激酶活性用Pitt等人，J.Biomol.Screening，1996，1，47-51所述的Millipore Multiscreen三氯乙酸(CA)″in-plateTM试验方法评价。试验在96穴Multiscreen Durapore板(Millipore)上进行。每一50-μl试验混合物含有20mM Hepes，pH7.4，20mM MgCl2，20mM MgCl2，2mM DTT，0.1mM Na3VO4，1μCi[γ-32P]ATP和30μg MBP基质。加入MLK蛋白使反应开始，并使反应于37℃进行15分钟。加入25μl 50％TCA使反应停止。将所述的板于4℃平衡30分钟，然后用冰冷却的25％TCA洗涤。在板上加入闪烁的混合物，并用Wallac MicroBeta 1450 PLUS闪烁计数器测定其放射性。蛋白质的剂量响应与32P-标记MBP的关系如图13所示。
(4)磷酸纤维素过滤试验
激酶试验在50-μl反应混合物中进行，该混合物含有20mMHepes，pH7.4，20mM MgCl2，20mM MnCl2，2mM DTT，0.1mMNa3VO4，IμCi[γ-32P]ATP和30μg MBP。加入MLK蛋白使反应开始，并使反应于37℃进行15分钟。加入75μl 75mM磷酸使反应停止。将停止反应的等份溶液直接负载于磷酸纤维素膜(Pierce)。另外，可使用96穴磷酸纤维素多筛选板(MiIlipore)。所述膜用75mM H3PO4洗涤。加入1M氢氧化钠洗脱出结合的32P-标记的磷酸化的MBP，收集在收集管中。用Beckman闪烁计数器(Somerset，NJ)通过Cerenkov计数测定放射活性。随着细菌表达GST-MLK-3激酶区浓度的增加形成磷酸化的MBP，结果如图13所示。
实施例29：测定化合物和重组体MLK家族结合的试验
K-252a(化合物III-3；见表4)，Nocardia物种的吲哚并咔唑代谢物，与多种丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶结合(Angeles等人，AnaLBiochem，1996，236，49-55；Knight等人，AnaL Biochem.，1997，247，376-381)。用氚化的K-252a配体评价与人体重组体全长MLK-3的结合，所述MLK-3来自杆状病毒群感染细胞粗制剂。通过NEN研究产物(Billerica，MA)感染在[3H]K-252a的3-和9-位用氚标记，并具有40Ci/mmol的特定活性。结合试验在96穴板上于1ml试剂中进行。反应混合物含有50mM MOPS缓冲液，pH7，150mM NaCl，5mMMnCl2，1mg/ml BSA，1％DMSO和0.25nM[3H]K252a。以5μg/ml浓度的粗制杆状病毒群衍生MLK-3进行三次重复试验。非特异性结合在未标记的1.2μM[3H]K252a存在下鉴定，并由总的特异性结合中减去。总量的12-15％稀释对蛋白质是非特异性结合，总量的75-85％对MLK-3为特异性结合(图14)。所有的试验在4℃进行2小时。使用Brandel收集器，在GF/C Whatman过滤器上收集[3H]K252a/MLK-3复合物，用冷的MOPS/NaCl缓冲液洗涤，并在Wallac Micro Beta计数器上计数。进行饱和结合试验以得到K-252a的Kd。这些试验中的一个实施例如图14所示，得到的Kd值为0.89nM(置信界限：0.2-1.5nM)。
实施例30：完整细胞试验
(A)Cos7过表达系统
材料
K-252a和此化合物的衍生物由Kyowa-Hakko Kogyo Co.Ltd.(Tokyo，Japan)(Kaneko等人，1997)提供。将化合物溶解于细胞培养级的二甲亚砜(DMSO)，储存于4℃，黑暗中。化合物的所有稀释液在Dulbecco改性的Eagle介质(DMEM)中进行，其中含有1％牛血清白蛋白。红血球凝聚素(HA)抗体购自BAbCO(Richmond，CA)。AP-l(c-jun)基质购自Promega(Madison，WI)。[γ-32P]ATP(6000Ci/mmol)购自Amersham(Arlington Heights，IL)。
Cos7细胞培养
Green Monkey Kidney Cos7细胞由ATCC，Rockville，Maryland(CRL 1651)得到，保存在DMEM中，其中含有10％牛血清，2mM谷酰胺，1mM丙酮酸盐，50U/ml青霉素/链霉素，保存需要在37℃，10％CO2和90％空气的气氛中。加入0.25％胰蛋白酶分离Cos7细胞以传代。
(I)MLK家族膜的过表达和Cos7细胞中的JNK1
用提供者(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)推荐的脂质转染胺制剂(lipofectamine)，将Cos7细胞以80％融合铺板，和以每个cDNA构成物2μg转染。人体MLK-3，MLK-2或小鼠DLK的长cDNA或部分的人体MLK-1如上文所述，全长红血球凝聚素A-标记的人体JNK1由J.Silvio Gutkind(NIH，Bethesda，MD)善意地提供，将它们亚克隆为pcDNA载体(Invitrogen，San Diego，CA)。转染48小时后，细胞用0.025％DMSO或500nM指定的化合物处理2小时，接着溶解在0.4ml Triton缓冲液(1％Triton X-100，50mM氯化钠，10mM Tris(pH7.6)，0.1％牛血清白蛋白，30μM磷酸钠，50mM氟化钠，20μg/ml抑蛋白酶肽，1mM苯基甲基磺酰基氟化物，1mM钒酸钠)中。溶解物中JNK的活性用上文所述免疫沉淀激酶试验测定。
(2)全细胞的免疫沉淀和激酶试验
用Pierce(Rockford，IL)的Micro BCA药盒，测定由Cos7细胞获得的溶解产物的蛋白质浓度，将等同量的蛋白质与HA抗体于4℃免疫沉淀1小时。用微型离心机离心20秒，再悬浮于Triton缓冲液离心洗涤2次以上，最后以激酶缓冲液洗涤(20mM Hepes pH7.4，20mMMgCl2，2mM二硫代苏糖醇，0.1mM钒酸钠)。将免疫沉淀再悬浮于激酶缓冲液，该缓冲液含有1μM ATP和5μCi[γ-32P]ATP和基质(1μg/AP-1样品)，于30℃孵化15分钟。通过加入还原样品的缓冲液(Laemmli，Nature 1970：227；680-685)停止反应。样品于80℃加热5分钟，负载于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶。用电泳分离蛋白质。干燥凝胶，用Molecular Dynamics Phosphorimager(Sunnyvale，Ca.)，在AP-1基质上对放射性进行定量分析，试验结果见图15A和15B，该试验中MLK-3，MLK-2和DLK与HA-JNK1共表达，以及在有或没有K-252a的情况下孵化。与此相反，命名为化合物-3(见表4)的母体K-252a化合物衍生物是选择性更好的激酶抑制剂，不受其他JNK上游MAPKKK，MEKK1活化的JNK途径的干扰(图15C)。
(B)JNK活化的MIK的全细胞报道试验
用衍生的克隆体组成型表达MLK家族的尝试没有成功，MLK的过表达可能影响细胞的存活(Bergeron等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1997，231，153-1SS；Nagata等人，EMBO J.，1998，17，149-158)。因此，在诱导生物化学作用的跟踪MLK的显影全细胞试验中，可能需要含有感兴趣的激酶的基因工程形成的诱导型表达系统的细胞系。例如，用反式激活蛋白控制的四环素转染的PC-12细胞系。当细胞进一步被感兴趣的基因转染时，基因的表达被介质中的四环素严格控制(Shockett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，6522)，所述的基因是由诱导型的启动子衍生的。
为了对MLK的活性定量，一种方法是在上文所述多次重复试验方法中测量下游基质如MEK4，JNK或c-jun的磷酸化。另一在全细胞中定量MLK活性的方法是利用报道基因酶活性，所述的酶例如可以是c-jun荧光素酶报道基因系统，可通过PathDetectTM系统(Stratagene，LaJolla，CA)购买。在此系统中，四环素诱导的细胞系是由两种质粒转染的。一种质粒组成型地表达了cJun NH2-端基的反式激活区与酵母GAL4 DNA结合区的融合(cjun-DBD融合蛋白)。另一种质粒带有有荧光的荧光素酶的编码序列，所述的酶是由GAL4结合位点的5个串联重复部分衍生的。根据MIK的活性，JNK、cJun-DBD融合蛋白的下游基质是被磷酸化的，键合于GAL4结合位点，并诱导荧光素酶基因转录。加入其基质就很容易进行荧光素酶在细胞溶解产物中的试验(Promega，Madison，WI)和测定化学发光。
实施例31：MLK家族成员对运动神经元的抑制和皮质存活两者的结合
大鼠脊髓富集运动神经元培养物的存活
由Sprague-Dawley大鼠胎儿分割出脊髓(Charles RiverLaboratories，Wilmington，MA)，胚胎龄(E)14.5-15。从脊髓仅有的腹部部分，如前文所述(Henderson等人，1993)，通过用6.5％三碘苯甲酰氨基葡萄糖进行梯度离心可进一步富集运动神经元，以及通过用低亲和力的神经营养蛋白受体抗体(IgG-192，Boehringer-Mannheim)进行分析纯化(数据未显示)。将细胞接种在96穴板上，该板用以化学方法鉴定为无血清N-介质(Bottenstein的人，1979.见前文)中的多鸟氨酸和层粘连蛋白(每穴5μg/ml)预涂，密度为6×104细胞/ml。为了由存活作用中分离出附着物，在附着期开始后1-3小时在培养物中加入化合物。4天后用钙黄绿素AM(Molecular Probes，Eugene，OR)，以荧光测定生存能力(BozyczkO-Coyne等人，1993，同前)来评价存活的神经元。用显微镜对相对荧光质直接有关的神经元计数。主要的是，培养介质在DPBS中进行系列稀释(Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水)，将最后浓度为6μM的钙黄绿素AM储备液加入96-穴板的每个穴。该板在37℃孵化30分钟，接着用DPBS的下列稀释液洗涤。用Millipore(Cytofluor 2350)的读板荧光计对荧光信号读数，激发波长＝485nm，放射波长＝538nm。对每板而言，只接受钙黄绿素AM，但不含细胞而得到的平均本底由总数值中减去。在这些试验中，荧光信号于细胞密度范围的线形关系随浓度和孵化时间变化。在试验化合物以250nM存在时上述试验中运动神经元存活百分数的实施例见表3。
皮质神经元的存活
由18天大鼠胎儿的胚胎分割出大脑皮质，酶消化后得到单一的脑分散液。所述细胞在含有B27补充材料的无血清Neural BasalMedium介质中，接种在用多鸟氨酸和层粘连蛋白预涂的96穴组织培养板上，密度为1.56×105/cm2。培养板用PBS中的多鸟氨酸和层粘连蛋白(每穴8μg/ml)涂覆，在37℃至少为2小时。在离体5-7天后，在有或没有试验化合物的情况下，使皮质神经元与Ab25-35(20μM)接触。Ab2S-35(Sigma，SL Louis，MO)储备溶液(1mM)在去离子无菌蒸馏水中制备。在后肽(post-peptide)加入后48小时测定神经元的相对存活，用乳酸盐脱氢酶(LDH)释放作为质粒膜完整性/细胞生存能力的指示物。根据制造者的说明书用Cytotoxicity Detection Kit(Boelrringer-Mannheim，Indianapolis，IN)测定LDH。数据以相对于只用Ab25-35处理的培养物而言，释放LDH的抑制百分数表示。
                                         表3
  皮质神经元   运动神经元   Cos-7细胞   Cos-7细胞   Cos-7细胞   Cos-7细胞   Cos-7细胞
  式   250nM时的存活％对照   250nM时的存活％对照   500nM时的JNK抑制％   500nM时DLK对JNK的抑制％   500nM时MLK-3对JNK的抑制％   500nM时MLK-2对JNK的抑制％   500nM时MLK-1对JNK的抑制％
  III1   46.56   300％   65％   63.73   99.98   89.67   97.96
  III2   47.80   315％   88％   36.22，42   94.94   69.44   92.64
  I3   22.54   177％   88％   20.25   94.93   0   79.29
  I4   29.39   165％   97％   58.13，52.8   84.9290   0   63.38
1式III化合物，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2CH3；以及R是OH。
2式III化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1和R2是CH2SCH2CH3；以及R是OH。
3式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2OAc；R4是CH2CH2(2-吡啶基)；以及X是CH2。
4式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是H；R4是CH2CH2(2-嘧啶基)；以及X是CH2。
实施例32：在有或没有吲哚并咔唑或稠合吡咯并咔唑类化合物存在下，运动神经元培养物中内源JNK活性的免疫沉淀测定
在16mm的穴中，以6×104细胞/cm2将纯化的运动神经元铺板。在处理之前使细胞附着2小时。将细胞用0.0125％DMSO或500nM化合物在前文所定义的N2介质中进行处理。然后用冰冷却的磷酸盐缓冲溶液洗涤，接着溶于实施例30所述的0.4ml Triton缓冲液。对运动神经元培养物的溶解产物的细胞数目进行归一化处理，用购自SantaCruz Biotechnology(Santa Cniz，CA)的JNK1抗体(cat #sc-474)进行免疫沉淀。在如上述32P-ATP和c-jun基质存在下由免疫沉淀测定JNK的活性。将四种化合物的抑制活性与运动神经元和Cos7细胞过表达的DLK，MLK-1，MLK-2或MLK-3进行比较(表3)。
实施例33：最初的胚胎培养物中，诱导MLK的JNK活性的抑制作用在Cos7细胞和乙酰胆碱转移酶活性两者中的相关性
为了测定通过激酶(所述的激酶与神经营养化合物相关)调节的JNK途径的抑制作用，可以评价化合物对Cos7细胞过表达的HA-JNK和MLK3中的JNK活性的作用。在转染48小时后，将细胞与500nM的化合物一起孵化2小时，接着进行细胞溶解。将溶解产物进行免疫沉淀试验，并如上文所述测定激酶活性。所报告的结果以对照样品的抑制百分数表示，所述的对照是在DMSO存在下的JNK活性。如表4中所看到的，对于脊髓和/或基本的前脑ChAT活性而言，大多数化合物具有活性，其趋势是JNK的MLK-3活性的有效抑制剂。
                            表4
            Cos7细胞过表达MLK-3中吲哚并-和
                茚并-咔唑对JNK活性的影响
    乙酰胆碱转移酶活性 ％JNK活性抑制(平均)
    化合物     脊髓     基本的前脑     Cos7细胞中的MLK3
    III-11     +     +     84
    III-22     +     +     96
    III-33     +     +     94
    I-14     +     +     93
    I-25     +     +     85
    I-36     +     +     93.5
    I-47     -     +     95
I-58 - + 97
    I-69     -     +     58
    I-710     -     +     85.5
    III-411     -     +     66
III-512 - + 96
    III-713     -     +     54
    I-814     +     -     89
    III-815     +     -     94
III-916 + + 98.5
    III-1017     +     -     78
    I-918     +     -     88
    I-1019     +     -     94
    III-1120     -     -     92.5
    I-1121     -     +     33
    I-1222     -     -     11
    I-1323     -     -     1
1式III化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1是NHCONHC2H5；R2是CH2CH2(2-吡啶基)；以及R是OH。
2式III化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1和R2是CH2OCH2OCH2CH3；以及R是OH。
3式III化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1和R2是CH2SCH2CH3；以及R是OH。
4式I化合物，其中A1，A2，R1，R3和R4是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2OH；R5和R6是OCH3；以及X是CH2。
5式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2OAc；R4是Br；以及X是CH2。
6式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2OAc；R4是CH2CH2(2-吡啶基)；以及X是CH2。
7式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2OH；以及X是CH2。
8式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2CH2OH；以及X是CH2。
9式I化合物，其中A1，A2，R1，R2，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；以及X是CH2。
10式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2CH2NHCO(4-(OH)Ph)；以及X是CH2。
11式III化合物，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2(CH2)4CH3；以及R是OH。
12式III化合物，其中Z1，Z2和R1是H；R2是CH2OH；X是CO2CH3；以及R是OH。
13式III化合物，其中Z1和Z2一起形成＝O；R1和R2是Br；X是CO2CH3；以及R是OH。
14式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是H；R4是CH2CH2(2-嘧啶基)；以及X是CH2。
15式III化合物，其中Z1和Z2是H；R1是Br；R2是碘；X是CO2CH3；以及R是OH。
16式III化合物，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2CH3；以及R是OH。
17式III化合物，其中Z1和Z2是H；R1和R2是CH2CH2SCH3；X是CO2CH3；以及R是OH。
18式I化合物，其中A1，A2，R1，R2，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R4是CH2CH2(2-哒嗪基)；以及X是CH2。
19式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是H；R4是CH2CH2(2-吡啶基)；以及X是CH2。
20式III化合物，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2CH3；以及R是OCH3。
21式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是(CH2)3-NH-C(＝O)-3，5-二羟基苯基；以及X是CH2。
22式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是苯甲酰基；以及X是CH2。
23式I化合物，其中A1，A2，R1，R2，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R4是CH＝CH-C≡N；以及X是CH2。
实施例34：MLK活性的凝胶位移试验
MLK的活性可能导致c-jun转录，致使c-jun蛋白增加。c-Jun蛋白增加的量可以用标准试验方法测量，以凝胶位移试验鉴定，Garner等人，Nucleic Acids Res.，1981，9，3047-3060，本申请引用该文献全文作为参考。将c-Jun DNA-结合位点编码的放射性标记双链DNA低聚体和核细胞萃取物一起孵化，接着丙烯酰胺凝胶电泳，和放射性标记DNA定量位移至更缓慢的流动性。这代表了与c-Jun结合的DNA蛋白，并且与萃取物中c-Jun蛋白的量有直接的比例关系。此方法可用对检测系统如蛋白质印迹或ELISAs之中的蛋白质的磷酸化形式有特异性的抗体进行测定。.
实施例35：鸡胚神经元的存活
材料：
购自Gibco的Leibovitz L 15介质、葡萄糖、碳酸氢钠、胰蛋白酶和抗生素。肌萃取物如Henderson等人，Nature，1983，302，609-611所述制备，本申请引用该文献全文作为参考。所有的试剂来自Sigma，除非另有说明。
细胞培养
按照Bloch-Gallego等人，Development，1991，111，221-232确定的方法，用免疫方法分离运动神经元(5.5天胚胎)，本申请引用该文献全文作为参考，并用Weng等人，NeuroReport，1996，7，1077-1081所述的方法改进，本申请也引用该文献全文作为参考。运动神经元的纯化按下述方法进行：将其接种于35mm组织培养盘(Nunc)，该盘用聚-DL-鸟氨酸和层粘连蛋白(1μg/ml，Upstate Biotech)预涂。培养介质是L 15，其中含有碳酸氢钠(22.5mM)、葡萄糖(20mM)、黄体酮(2×10-8M)、亚硒酸钠(3×10-8M)、伴白蛋白(0.1mg/ml)、胰岛素(5μg/ml)、青霉素-链霉素和10％热失活的马血清。补入30μg/ml肌萃取物。将化合物III-3制成DMSO中的4mM储备液，并于4℃避光保存。在处理和对照培养物中DMSO的最终浓度是0.125％。
如Lindsay等人，Dev.Biol，1985，112，319-328所述(本申请引用该文献全文作为参考)，在指定的胚胎天数，由鸡胚分割得到脊柱交感神经节(SG，12天胚胎(E12))，背根神经节(DRG；E9)和睫状神经节(CG；E8)。在胰蛋白酶消化和分离之后，将神经细胞悬浮液在Ham F14培养介质中涂于预涂了聚鸟氨酸和层粘连蛋白的板上，补充10％马血清。在涂板之后，立刻以下述浓度加入存活因子：神经生长因子(NGF)，20ng/ml；睫状中性粒细胞因子(CNTF)，10ng/ml。将培养物保存在37℃，和5％CO2的潮湿环境中。
细胞计数
将神经元在35mm培养盘上以栅格(Nunc)铺板。在铺板后立即在每盘存在明亮细胞的面积选择扫瞄面积的10％左右，48小时后评估存活的百分数。用锥虫蓝(未显示)活体染色确定细胞的存活。
完整的(intact)DRG
将神经节铺于96穴板，该板预涂了在无血清的N-介质中的聚鸟氨酸和层粘连蛋白(每穴5μg/ml磷酸盐缓冲液)(Bottenstein等人，Proc.Natl Acad.Sci，USA，1979，76，514-517，本申请引用该文献全文作为参考)，其中含有0.05％牛血清白蛋白(BSA)，培养物在37℃和5％CO2的潮湿环境中保存48小时。铺板后2小时神经节用250nM化合物III-3或20ng/ml NGF处理。
化合物III-3支持小鸡胚胎外周神经元的存活，且和浓度有依赖关系。
来自分开的E6脊神经节感觉神经元(DRG)和交感神经节(SG)培养物的NGF的退缩行为使它们在48小时内经过了PCD。通过在NGF的退缩的时间内于培养介质中加入化合物III-3可阻止退缩行为。48小时后，1μM化合物III-3可使SG神经元保持94％，保持890％DRG神经元存在活(NGF-处理对照：SG 65％，DRG 66％)。与此类似，24小时后，化合物III-3促进76％的CNTF-依赖的睫神经节(CG)神经元存活(CNTF-处理对照67％)。在10％血清存在下，化合物III-3促进存活的作用是浓度依赖型的，在1μM左右，对三种神经元种群达到一个平台(图16A-C)。与对照培养物相比，存活的神经元显示出广泛的轴突生长晕，具有更厚的和更弯曲的轴突(图17E-H)。4天后，促进存活的活性依然是完整的DRG：化合物III-3 52％，处理对照的生长因子41％；SG：化合物III-3 83％，处理对照的NGF 55％；CG：化合物III-3 58％，处理对照的CNTF 50％)。在最佳条件下培养物与化合物III-3一起保存一周或更长(未显示)。
化合物III-3支持小鸡胚胎运动神经元的存活，且和浓度有依赖关系。
在有肌肉萃取物存在的情况下，培养后的小鸡运动神经元可以存活，而在缺少时会迅速死亡。在我们的试验中，与14％未处理对照组相反，在没有肌肉萃取物存在的情况下，48小时后有65％存活的运动神经元。在没有血清的条件下，化合物III-3的存活作用在300nM时最大，比肌肉萃取物诱导的更高(79％)。在此系统中，化合物III-3存活作用对浓度的依赖性和在外周神经元不同，因为化合物III-3浓度大于300nM时显示出日益增多地还原作用(图16A)。这些可能说明化合物III-3活性方面对运动神经元的特定灵敏度。就形态学而言，化合物III-3营救出的运动神经元显示出阶段明亮细胞体，并能够扩展长轴突，与由肌肉萃取物诱导的那些相比似乎更粗(图17)。培养4天后，与用肌肉萃取物大42％相比，用化合物III-3时的运动神经元存活56％。在300nM时，化合物III-3处理组神经元的离体存活至少达到一周(未显示)。
化合物III-3对完整背根神经节的轴突生长晕的促进作用
上述试验结果表明化合物III-3不仅能够促进外周和中枢神经系统胚胎神经元的存活，而且会产生粗壮的轴突生长晕。在有生长因子存在时，许多这样的扩展似乎比有生长因子存在时所引起(elicted)的更粗(将图17A-D与图17E-H比较)。在250nM化合物III-3存在下，由完整胚胎背根神经节的轴突生长晕引起的轴突生长晕之中还观察到上述作用(图18C)。对NGF(图18B)和化合物III-3两者的响应是轴突生长；由NGF引起的比只存在化合物III-3时的生长更细和有更多的分枝，在只有化合物III-3时似乎生长的粗和可能是簇生的。
实施例36：体内处理
在小鸡胚胎中试验性调节运动神经元死亡
此实施例在Glicksman等人，J.NeurobioL，1998，1535，361-370中有详细描述，本申请引用其全文作为参考。如Oppenheim等人，Science，1991，251，1616-1617中所述(本申请引用其全文作为参考)，在鸡蛋壳(Spafas，Preston，CT)上开口E6，由E6-E9，每天一次将任意载体，(5％SolutolTM HS15、聚乙二醇660羟基硬脂酸酯；BASF Aktiengesellschaft，Ludwigshafen，Germany(于磷酸盐缓冲盐水溶液中，pH7.2))或特定剂量化合物III-3载体溶液直接用于血管化的绒膜尿囊膜。在E10处死胚胎，取出脊髓，在Carnoy溶液(10％冰乙酸，60％绝对乙醇，30％氯仿)中固定，进行系列石蜡切片，用硫堇染色。按前文所述的标准方法(Clarke等人，Methods In CellBiology：Cell Death，1995，Schwart & Osborne，Eds.，Academic Press，New York，pp277-321，本申请引用其全文作为参考)，取腰段1-8的每个第20切片计数。
在大鼠新生儿中试验性调节运动神经元死亡
由Harlan实验室(lndianapolis，IN)得到Untimed怀孕的Sprague-Dawley大鼠。每天在雌性大鼠的幼儿(pups)上，就作为靶标的会阴肌肉皮下(SC)注射，化合物III-3于5％SolutolTM HS 15中的溶液，或者注射载体，从出生的那天(P1)，连续注射到第5天(P5)。在P10或P60那天，处死幼儿，用肝素化的毛细管收集血液，在动物体用盐水/福尔马林灌流之后，分割出含有球海绵体肌(SNB)的性双态脊柱核，和含有球海绵体肌(BC)和提肌(LA)肌肉的会阴面。将含有SNB的脊髓部分进行后固定，包埋至Paraplast中，切片成10μm，用Cresylecht紫染色(Nordeen等人，Science，1985，229，671-673，本申请引用其全文作为参考)。如前所述(Nordeen等人，同上)，在由脊髓的腰段5至骶骨1区的连续切片中以X500对运动神经元计数。通过观察者对盲试到处理组对编号的切片进行显微镜计数。运动神经元计数用于细胞大小和切片厚度校正(Konisgsmark，Contemporary ResearchMethods in Neuroanatomy，Nauta & Ebbesson，Eds.，1970，Springer-Verlag，New York，pp.315-340，本申请引用其全文作为参考)，并用单向反差分析(one-way analysis of variance)(ANOVA)进行统计学分析。将会阴肌肉组织后固定，脱钙，包埋至Paraplast中，切片成10μm，用Milligan′s Trichrome染色。使用明视场显微镜(X250)，以正常雌性的BC和LA肌肉和化合物III-3-处理组的雌性动物(405只动物/组)作为阳性检测组，对其部位和存在的条纹状纤维进行测定。用投影显微镜(62.5)由另外的切片跟踪肌肉组织的轮廓，并用数字化的垫和计算机为基础的形态计量系统(Sigrnascan，Jandel Scientific)测定横断面积。用横断面的总面积计算肌肉的体积，乘以切片厚度，并校正为样品结构的百分数。
收集的血液于室温离心5分钟，然后取出质粒，于-20℃冷冻。按照。Wingfield等人于Steroids，1975，26，311-327中所确定的反射线免疫试验方法测定睾丸素水平(6-7只动物/组)，本申请引用其全文作为参考。
成年大鼠诱导Axotomy的运动神经元去分化
在Neumbutol感觉缺失的条件下，将雌性Sprague-Dawley大鼠(120-180g)颈部横切得到左舌下神经，将50μl化合物III-3和其载体(5％SolutolTM HS 15)用于GelfoamTM(AJ Buck，Owings Mills，MD)部分，然后围着横切神经的近端缠绕。七天后，麻醉动物，并撒以4％聚甲醛于Sorenson缓冲液中的溶液，该缓冲液是0.07M磷酸盐溶液，pH7.2。取出脑干，在低温槽中切下40-μm粗串状冠须部分(Chiu等人，NeuroReport，1994，5，693-696，本申请引用其全文作为参考)。按照前文所述(Chiu等人，J.Comp.NeuroL，1993，328，351-363，本申请引用其全文作为参考)，用从Chemicon得到的抗-ChAT的单克隆抗体的1∶350稀释液对每5个切片部分进行ChAT免疫组织化学加工。在上述本底的基础上进行清晰染色的细胞在染色区计数；计数细胞的数目以舌下神经核解剖端(axotomized side)的ChAT-免疫活性细胞数目与对照端(未伤害的)的免疫活性细胞数目之比例表示。
化合物III-3可营救离体大鼠胚胎运动神经元使之免于编程性细胞死亡，并抑制信号通道，从而引起这些细胞中JNKI的活化(Maroney等人，J.Neurosci.，1998，18，104-111，本申请引用其全文作为参考)。为了测定体内的有效活性，以发育调节编程性细胞死亡程序的两种模型，和对成年大鼠运动神经元解剖诱导(axotomyinduced)的去分化模型对化合物III-3进行评价。在小鸡中，在ES-b期间，差不多有50％的脊髓运动神经元经过了PCD(Hamburger等人，J.NeuroscL，1982，1，38-55；Purves等人，Body and Brain：A Trophic Theoiy of NeuralConnections，1988，Harvard University Press，Cambridge，MA，本申请引用两者的全文作为参考)。在此期间，应用化合物III-3在尿囊绒膜上防止运动神经元死亡时是剂量依赖模式(图19)。40％的会发生正常死亡的运动神经元在两个最高剂量的试验中得到了营救(2.3和7μg/天)，在最低剂量(1.2和1.8μg/天)时可营救25％的运动神经元。
在雌性大鼠的围产早期(后期胚胎阶段直到出生日(PN)4)，SNB中50％以上的运动神经元PCD消除(Breedlove，J.NeurobioL，1986，17，157-176，本申请引用其全文作为参考)。在雄性大鼠的神经核中，运动神经元神经支配与交配反射有关的有纹阴茎肌肉。睾丸的雄激素类固醇分泌诱导雄性大鼠的SNB运动神经元死亡，并防止大部分被运动神经元神经支配的BC和LA肌肉的萎缩。给雌性幼儿以睾酮用药，使其达到雄性的全部SBN运动神经元数目(Nordeen等人，同上)和防止BC和LA肌肉萎缩(Waiman等人，Endocrinology，1941，29，955-978，本申请引用其全文作为参考)。每天给雌性大鼠经皮下给药化合物III-3(PN 1-5)，可使运动神经元死亡显著变少(图20A)。在两种剂量(每天0.5和1mg/kg)时可用化合物III-3营救SBN运动神经元使其免于死亡。在以每天0.5和1mg/kg的最高有效剂量施用化合物III-3时，可使运动神经元的存活提高70％，这与睾酮的效果相等(图20A)。化合物III-3不会使被处理的雌性大鼠的血浆睾酮水平发生变化。对血浆睾酮水平为1mg/kg/天的处理组进行放射性免疫测定，将其与载体对照组比较，两者没有显著的区别。(分别为0.016±0.008ng/ml和0.029±0.015ng/ML的平均标准误差(S.E.M.))。
为了测定化合物III-3处理是不是长期有效，以维持运动神经元存活，在同样的时间期限内PN(1-5)，将雌性大鼠用化合物III-3t处理(0.5和1mg/kg/天)。一半动物用载体处理，两种处理组都在PN1O时处死。然后将其余的动物不用额外的化合物III-3处理，并在PN6O时处死。如前面所观察到的(图20A)，用化合物III-3处理可使运动神经元的存活提高70％(图20B)。进一步的，在最后用化合物III-3处理后55天，由形态学鉴定可知，对运动神经元的营救可达到100％(图20B)。在新生儿期，对化合物III-3动神经元死亡的抑制使运动神经元存活至成年期。
尽管有清楚的论证，和对成人疾病如肌萎缩侧索硬化的运动神经元损失的破坏性作用，在大多数动物运动神经元损伤模型中，成人运动神经元有稳定的死亡。但是，轴突的损伤不会导致形态学变化(Oppenheim等人，同上)，和成人运动神经元的生物化学变化(Oppenheim等人，同上；Rende等人，J.Comp.NeuroL，1992，319，285-298，本申请引用其全文作为参考；Chiu等人，J.Comp.NeuroL，1993，328，351-363，本申请引用其全文作为参考)，在变性性改变的运动神经元中，所述的成人运动神经元在因病死亡前可能会有模仿的变性性改变。此种变化的一个实施例起因于舌下神经的axotomy，它可刺激舌的活动。7天后，对成年大鼠此神经的单向横切会导致同侧神经核中95％的ChAT-免疫反应性舌下运动神经元损失(Chiu等人，NeuroReport，1994，5，693-696，本申请引用其全文作为参考)。ChAT-免疫活性的损失是永久性的。axotomy四个星期后，100％运动神经元的ChAT-免疫活性恢复到对照组水平(Borke等人，J.Neurocytol.，1993，22，141-153，本申请引用其全文作为参考)。对侧舌下运动神经元的ChAT-免疫活性不受影响(Chiu等人，同上)(图21和表5)。
当在舌下神经的近端应用GelfoamTM时，在axotomy7天后，评价同侧的舌下运动神经元的ChAT-免疫活性，其减少依赖于化合物III-3剂量的减少。最高有效剂量(50μg/天)时，与axotomized，的未处理组的ChAT-免疫活性相比多40％图21B和表5)。对使存活大于未处理组的较低或较高剂量而言，两者都有铃形的剂量依赖关系，但是比在50μg时达到的要小。正如在SNB模型中确实存在的，在动物的任何剂量试验中，这些都与重量损失、死亡率或总的阻止损伤无关。
在此体内运动神经元退化病变的三个模型中，化合物III-3表现出神经保护活性：发展性的调节胚胎腰脊髓运动神经元的PCD(图19)，出生后的SNB运动神经元对雄激素敏感的死亡(图20)，和axotomy诱导的成年舌下运动神经元的功能性标记物ChAT的的损失图21和表示5)。经皮下注射外围给药，在神经的切下端局部用药，或直接覆盖于小鸡胚胎的尿囊绒膜时，化合物III-3是有效的。与母体分子K-252a相反，在调节富含运动神经元的培养物中的存活率时化合物III-3多5倍左右(数据未显示)，并且对trkA酪氨酸激酶和几种丝氨酸苏氨酸激酶未显示出活性(Maroney等人，同上；Kaneko等人，J.Med.Chem.，1997，40，1863-1869，本申请引用其全文作为参考)。
                         表5
           在axotomized舌下运动神经元中化合物III-3
                对乙酰胆碱转移酶免疫活性的作用
    ChAT-阳性运动神经元
  处理   N     试验/对照     ％   平均/组
  载体   2     20/544     3.68   4.01
    19/437     4.35
  3.6μg III-3   2     55/420     13.10   12.84*
    72/572     12.59
  25μg III-3   2     95/597     15.91   19.01*
    142/642     22.12
  50μg III-3   2     188/484     38.84   41.34*
    278/637     43.85
  100μg III-3   4     465/920     50.54   32.61*
    235/784     29.98
    178/770     23.12
    182/679     26.80
  200μg III-3   2     99/461     21.48   24.96*
    159/559     28.44
  Sham operated   2     350/335     104.48   101.24
    292/298     98.00
在横切之后立刻在舌下神经的近端加入于凝胶泡沫中的化合物III-3或载体，7天后，将动物处死，并把整个舌下神经核系列切片，每五个切片用抗-ChAT抗体免疫染色，在神经核的同侧(试验组)和对侧(对照组)进行ChAT-阳性神经核计数，将对照载体组和处理组进行比较有统计学意义，*p＜0.05。
MLK-3途径的抑制剂在体内显示的效力以及在MPTP模型中对MLK-3下游磷酸化作用的阻断
将MPTP以(40mg/kg)的剂量给药，所述剂量在黑质中会产生条纹状多巴胺能终端和细胞体的损失。酪氨酸羟基化酶被用作黑质中多巴胺能神经终端的标记物。MPTW损害之后，将化合物III-3系统给药可减少黑质酪氨酸羟基化酶免疫活性神经元的损失(图22a；Saporito等人，1999)。因为化合物III-3是已知的MLK3抑制剂，可在MPTP-处理的小鼠中测定MLK3基质下游的活性。磷酸化MKK4的水平可用磷酸化-MKK4特异性抗体测定(New England Biolabs，Beverly，MA)，用任一免疫印迹(图22b)或ELISA(图22c)方法可识别MKK4的单磷酸化形式。相对于对照的水平，MPTP给药可将黑质中磷酸化MKK4的水平提高达到5倍(图22b)。MPTP给药后4小时可达到峰值，同时达到MPP+、MPTP-介导的MKK4磷酸化的CNS峰值，上述提高可由于1-丙炔苯丙胺(deprenyl)预处理而减少，这说明MKK4磷酸化作用可由MPP+介导(图22c)。而且，当用1mg/kg剂量的化合物III-3预处理时，MKK4的磷酸化作用可部分地受到抑制，因而对MPTP-诱导的黑质纹状体多巴胺能损失具有保护作用(图22c)。这些数据说明MPTP(MPP+)活化了MLK3下游的基质，MKK4。另外，这些数据也说明已知的抑制剂可以抑制这些激酶途径在体内的活性。
实施例37：炎症
THP-1细胞中的LPS对IL-1和TNF-α的诱导以及吲哚并咔唑和吡咯并咔唑对所述诱导的影响
选择免疫系统的细胞，由于许多激酶与多种免疫功能的调节有关，例如诱导细胞因子的合成和诱导细胞因子的生物响应。最近的研究报告(Hambleton等人，Proc.Natl Acad.Sci.，USA，1996，93，2774-2778，本申请引用其全文作为参考)指出用LPS处理衍生单核细胞的细胞系能引起JNK活性的迅速活化。当单核细胞与细菌内毒素如脂多糖(LPS)接触，它们能够产生炎性细胞因子IL-1和TNF-α。抑制这两种细胞因子的产生，可用于治疗免疫系统的某些炎症疾病。这些细胞因子易于由商品化的ELISA试剂盒测定。我们设计的一些实验用来确定：(1)是否吲哚和稠合的吡咯并咔唑能够在单核细胞系THP-1中抑制IL-1和TNF-α的合成，(2)是否JINK被THP-1细胞中的LPS活化，(3)是否JNK被LPS的活化可由吲哚和稠合的吡咯并咔唑抑制。
实验方法
THP-1细胞生长在10％胎牛血清补加的RPMI 1640培养基中。LPS(大肠肝菌血清型0111.B4，TCA萃取的)由Sigma购买，并溶解在PBS中。用于IL-1和TNF-α测试的ELISA试剂盒购于Boerhinger Mannheim，THP-I培养基的试验按制造商的指示进行。依照说明得到每个试验的标准曲线。
实验是在12穴扳中进行的，采用1或2ml的THP-1细胞，细胞数为4×105个细胞/ml。IL-1和TNF-α通过加入LPS诱导到该培养基中，在不同时间收集培养基，而后进行细胞因子试验。离心排除细胞，试验前上清液在-70℃冷冻。为减少费用，实验在双份培养基中进行，在离心后使双份上清液合并，合并的上清液均两次试验。吲哚和稠合的吡咯并咔唑在100％DMSO中的原液，在包含10％胎牛血清的培养基或包含0.5mg/ml BSA的培养基中，被稀释到所希望的浓度。除非另有说明，是在加入LPS1小时前将化合物加入到THP-1细胞中。
JNK活性试验在从溶解THP-1细胞的萃取液中免疫沉淀JNK蛋白后进行的。沉淀的THP-1细胞在500μl的Frac缓冲液(10mMTris-Hcl，pH7.5，50mM NaCl，30μM焦磷酸钠1mg/ml BSA，1％Triton-X-100)中的冰上溶解15分钟。萃取液在在14K离心10分钟，向上清液加入5μl的JNK抗体(Santa Cruz)。萃取液在4℃旋转60分钟，加入75μl洗涤蛋白A Sepharose(20％w/v in Frac)。萃取液再旋转30分钟，以使抗体复合物结合到蛋白A Sepharose上。蛋白ASepharose用Frac缓冲液洗涤两次，每次用20mM Hepes，pH7.6，20mMMgCl2，2mM DTT，而后在30℃在30μl激酶缓冲液(20mMhepes，20mM MgCl2，2MM DTT，1μg重组体c-jun，和2μM ATP-γ-32P，2μCi)中孵化15分钟。反应通过加入10μl的4XSDS凝胶加样缓冲液而终止，在80C加热3分钟，该蛋白在10％SDS凝胶上分析。干燥凝胶，放到磷光板(Phosphorimager plate)上，在磷光板上分析放射性带。
初步试验结果表明，在2ug/ml的LPS给出最大的IL-1产量，这个浓度的LPS用于此后的所有实验中。在加入LPS后，获取该细胞因子最大产量的最小时间，通过利用在加入LPS后为在不同时间试验的同等试样的培养基来测定。第一个实验表明，IL-1和TNF-α加入LPS后在低于5小时内获得最大产量。因为第一个实验最早的收集时间是2.4小时，所以第二个实验用加入LPS后15分钟开始收集的培养基进行。这个仅用来评价TNF-α的实验结果表明，它在加入LPS后3小时获得最大产量。在加入LPS后90分钟内培养基中未发现明显的TNF-α。
最大产量的迅速获得表明非常紧密地调节2细胞因子的合成一迅速合成和迅速减量调节。细胞的培养物在加入LPS前用ActinomycinD、RNA合成抑制剂、或一种蛋白合成抑制剂环己酰亚胺处理30分钟。加入LPS后3小时后收集培养基，并进行TNF-α试验。新RNA和蛋白合成需要TNF-α诱导，因为在用各个抑制剂处理的细胞培养基中没有发现TNF-α。接下去的实验是为了确定化合物III-3是否能抑制IL-1和TNF-α的诱导。化合物III-3抑制IL-1和TNF-α的诱导分别在IC50值267nM和139Nm。这些实验结果是在包含10％胎牛血清培养基的细胞中获得的。因为对脊髓组织和基前脑组织就化合物的神经营养性活性试验是在无血清的培养基(500μg/ml BSA)中进行的，所以确定无血清培养基中抑制IL-1和TNF-α的IC50值是有意义的。当THP-1细胞用化合物III-3在无血清培养基(500μg/ml BSA)中处理时，IC50值减少10倍，从269mM到23mM。除非另有说明，后面所有实验都是在无血清培养基中进行的。化合物III-3在THP-1细胞中IL-1和TNF-α的抑制作用表明，化合物III-3可用作由产生这些正常量的细胞因子而引起的病理性疾病的治疗剂。脓毒性休克就是这种疾病。脓毒性休克是由在循环中革兰氏阴性菌的增长并接着释扩增量的内毒素LPS引起的。LPS主要刺激单核细胞和巨噬细胞，并产生大量的IL-1和TNF-α，它们又引起大量组织损伤，并在许多情况下导致组织死亡。
测定了某些化合物抑制TNF-α的能力，并同抑制JNK的能力做了比较。结果示于表6。
                           表6
    THP-1细胞   Cos7细胞超量表达的MLK3
  化合物     TNF-αIC50nM   500nM时抑制JNK％   500nM时抑制JNK％
  III-1     49.5   93.5   83.8
  III-3     29   93   94
  I-2     ＞5000   78.5   85
  I-3     366   80.5   93.7
  I-4     75.5   79.5   95
  I-5     5 14   89   97.2
  I-6     817.5   77.5   57.8
  I-7     1009   74   85.5
  III-4     462.5   81   66
  III-5     4   84.5   96
  III-7     590.5   11.5   54
  III-8     11.5   51   94
  III-10     4298   48   78
  I-10     4500   62   94
  III-11     686   51   92.5
在Jurkat细胞中化合物III-3对诱导II-2的影响
进行这些实验是为了确定在Jurkat细胞中化合物III-3是否抑制化合物II-2的诱导作用。
实验方法
Jurkat细胞生长在10％胎牛血清补加的RPMI 1640培养基中。TNF-α由Promega购买，抗CD3和抗CD28抗体由Pharmigen购买。Jurkat实验在96穴扳中进行的。IL-1由购于Boerhinger Mannheim的ELISA试剂盒测定。在加入细胞前，使CD3和CD28抗体结合到96穴扳的塑料板上(在PBS中18小时)。细胞在加入到抗体涂抹的板以前用化合物1处理。CD3和CD28抗体用来活化T细胞受体和诱导IL-2。诱导作用开始后的6小时和24小时之间，IL-2从Jurkat细胞上释放(图23A)。IL-2基本上未产生(图23ACNT)。下面评价化合物-III(在诱导前用化合物-III处理1小时)对IL-2诱导作用的影响(图23B)。浓度为500nM的化合物III-3抑制了80％以上的IL-2诱导作用(图23B)。用化合物III-3和化合物I-4进行了更大范围的剂量响应实验，得到的1C50值，化合物III-3是139nM，化合物I-4是207nM(图23C)。
我们希望本专利文献所引用的每一个专利、专利申请和印刷出版物都从整体上予以参考。
正如本领域内的专业技术人员所公认的那样，本发明的优选实施方案在不偏离本发明精神的前提下可进行很多的变化和改进。我们期望所有这些变化都处于本发明的范围内。

Claims (64)

1.一种抑制多谱系激酶蛋白的化合物在制备用于治疗哺乳动物神经变性疾病的药物中的应用。
2.权利要求1的应用，其中所述化合物具有以下结构式：
Figure A2004100491080002C1
式中：
E1和E2各自分别都与它们所连接的碳原子构成或
不饱和的6元芳香碳环，环上的1-3个碳原子可被氮原子置换；或
不饱和的5元芳香碳环，在环上或
1个碳原子被氧、氮或硫原子置换；
或
2个碳原子被硫和氮原子或氧和氮原子置换；
A1和A2一起代表O，B1和B2一起代表O；
R1是H，1-4个(含)碳原子的烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，或杂芳烷基；COR9，其中R9是1-4个(含)碳原子的烷基或芳基，优选苯基或萘基；OR10，其中R10是H或1-4个(含)碳原子的烷基；-CONH2，-NR7R8，-(CH2)nNR7R8，其中n是1-4(含)的整数；或-O(CH2)nNR7R8；和或
R7和R8分别各自是H或1-4(含)个碳原子的烷基；或
R7和R8一起构成式(CH2)2-X1-(CH2)2-的连接基团，其中X1是-O-，-S-和-CH2-；
R2是H，SO2R9；-CO2R9，-COR9，1-8个(含)碳原子的烷基，优选1-4个(含)碳原子的烷基，1-8个(含)碳原子的烯基，优选1-4个(含)碳原子的烯基，1-8个(含)碳原子的炔基，优选1-4个碳原子的炔；或5-7个(含)碳原子的单糖，每一个单糖的羟基是末取代的或由H，1-4个(含)碳原子的烷基，2-5个(含)碳原子的烷基酰氧基，或1-4个(含)碳原子的烷氧基取代的；和或
1-8个(含)碳原子的烷基，1-8个(含)碳原子的烯基，1-8个(含)碳原子的炔基是末取代的，或
1-8个(含)碳原子的烷基，1-8个(含)碳原子的烯基，1-8个(含)碳原子的炔基各自分别是由1-3个含6-10个碳原子的芳基取代，优选苯基或萘基；杂芳基，F，Cl，Br，I，-CN，-NO2，OH，-OR9，-O(CH2)nNR7R8，-OCOR9，-OCONHR9，O-四氢吡喃基，NH2，-NR7R8，-NR10COR9，-NR10CO2R9，-NR10CONR7R8，-NHC(＝NH)NH2，-NR10SO2R9，-S(O)YR11，其中R11是H，1-4个(含)碳原子的烷基，6-10个(含)碳原子的芳基，优选苯基或萘基，或杂芳基和Y是1或2；-SR11，-CO2R9，-CONR7R8，-CHO，COR9，CH2OR7，-CH＝NNR11R12，-CH＝NOR11，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-SO2NR12R13，-PO(OR11)2，或OR14，其中R14是羧基的羟基除去后氨基酸的残基和或
R12和R13各自分别是H，1-4个(含)碳原子的烷基，6-10个(含)碳原子的芳基，优选苯基或萘基，或杂芳基或R12和R13一起构成连结基团，优选(CH2)2-X1-(CH2)2-；
R3，R4，R5和R6各自分别是：H，芳基，优选6-10个(含)碳原子的芳基，更优选苯基或萘基；杂芳基；F，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH，-OR9，-O(CH2)nNR7R8，-OCOR9，-OCONHR9，NH2，-CH2OH，-CH2OR14，-NR7R8，-NR10COR9，-NR10CONR7R8，SR11，-S(O)YR11，其中Y是1或2；-CO2R9，-COR9，-CONR7R8，-CHO，-CH＝NOR11，-CH＝NR9，-CH＝NNR11R12，-(CH2)nSR9，其中n是1-4(含)的整数，-(CH2)nS(O)YR9，-CH2SR15其中R15是1-4个(含)碳原子的烷基，-CH2S(O)YR14，-(CH2)nNR7R8，-(CH2)nNHR14，1-8个(含)碳原子的烷基，优选1-4个(含)碳原子的烷基；1-8个(含)碳原子的烯基，优选1-4个(含)碳原子的烯基；1-8个(含)碳原子的炔基，优选1-4个(含)碳原子的炔基；和或
1-8个(含)碳原子的烷基，1-8个(含)碳原子的烯基，1-8个(含)碳原子的炔基是未取代的或
1-8个(含)碳原子的烷基，1-8个(含)碳原子的烯基，1-8个(含)碳原子的炔基是取代的，如前面d)2)中所述；
X或是
未取代的1-3个(含)碳原子的烯基；或
X是由R2取代的1-3个(含)碳原子的烯基，优选OR10，-SR10，R15，其中R15是1-4个(含)碳原子的烷基；苯基，萘基，7-14个(含)碳原子的芳烷基，优选苄基；或
X是-CH＝CH-，-CH(OH)-CH(OH)-，-O-，-S-，-S(＝O)-，-S(＝O)2-，CR10)2-，-C(＝O)-，-C(＝NOR11)-，-C(OR11)(R11)-，-C(＝O)CHR15-，-CHR15)C(＝O)-，-C(＝NOR11)CHR15)-，CHR15)C(＝NOR11)-，CH2Z-，-ZCH2-，-CH2Z-CH2-，
其中Z是C(OR11)(R11)，O，S，C(＝O)，C(＝NOR11)-或NR11；
或者
A1和A2各自分别是H，H；H，OR11；H，-SR11；H，-NR11R12；或一起代表＝S或＝NR11；B1和B2一起代表O；R1，R2，R3，R4，R5R6和X同前面c)，d)，e)和f)的定义；或
A1和A2一起代表O；和B1和B2各自分别是H，H；H，OR11；H，-SR11；H，-NR11R12；或一起代表＝S或＝NR11；R1，R2，R3，R4，R5R6和X同前面c)，d)，e)和f)的定义。
3.权利要求2的应用，其中A1，A2，R1，R3和R4是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2OH；R5和R6是OCH3；和X是CH2。
4.权利要求2的应用，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2OAc；R4是Br；和X是CH2。
5.权利要求2的应用，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2OAc；R4是CH2CH2(2-吡啶基)；和X是CH2。
6.权利要求2的应用，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是H；R4是CH2CH2(2-嘧啶基)；和X是CH2。
7.权利要求2的应用，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是H；R4是CH2CH2(2-吡啶基))；和X是CH2。
8.权利要求2的应用，其中A1，A2，R1，R2，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R4是CH2CH2(2-哒嗪基)；和X是CH2。
9.权利要求2的应用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2OH；和X是CH2。
10.权利要求2的应用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2 CH2CH2OH；和X是CH2。
11.权利要求2的应用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；和X是S。
12.权利要求2的应用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2 CH2CH2NHCO(4-(OH)Ph)；和X是CH2。
13.权利要求2的应用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2(OH)；和X是CH2。
14.权利要求1的应用，其中所述的的化合物具有以下结构式：
式中：
环B和环F都与它们所连接的碳原子成环，并分别各自选自下述基团：，
a)不饱和的6元芳香碳环，环上的1-3个碳原子可被氮原子置换；
b)不饱和的5元芳香碳环；和
c)不饱和的5元芳香碳环，在环上或
1)1个碳原子被氧、氮或硫原子置换；
2)2个碳原子被硫和氮原子、氧和氮原子或两个氮原子置换；或
3)3个碳原子被3个氮原子置换；
R1选自下述基团：
a)H，取代或未取代的1-4个碳原子的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代芳烷基，取代或未取代的杂芳基，或取代或未取代的杂芳烷基；
b)-C(＝O)R9，其中R9选自烷基、芳基或杂芳基；
c)-OR10，其中  R10选自H和1-4个碳原子的烷基；
d)-C(＝O)NH2，-NR11R12，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)POR10，-O(CH2)POR10和-O(CH2)PNR11R12，其中p为1-4；和其中或
1)R11和R12分别各自选自H和1-4个碳原子的烷基；或
2)R11和R12一起构成式(CH2)2-X1-(CH2)2-的连接基团，其中X1选自-O-，-S-和-CH2-；
R2选自下述基团：H，1-4个碳原子的烷基，OH，1-4个碳原子的烷氧基，-OC(＝O)R9，
-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)PNR11R12，-O(CH2)POR10，取代或未取代的6-10个碳原子的芳烷基，取代或未取代的杂芳烷基；
R3，R4，R5和R6各自分别选自下述基团：
a)H，芳基，杂芳基，F，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH，-OR9，-O(CH2)pNR11R12，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR2R7，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)POR10，-CH2OR10，-NR11R12，-NR10S(＝O)2R9，-NR10C(＝O)R9；
b)-CH2ORR14，其中R14是在羧基的羟基脱除后的氨基酸残基；
c)-NR10C(＝O)NR11R12，-CO2R2，-C(＝O)R2，-C(＝O)NR11R12，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-(CH2)PNR11R12，-(CH2)PNHR14，或CH＝NNR2R2A，其中R2A同R2；
d)-S(O)YR2-(CH2)PS(O)YR9，-CH2S(O)YR14，其中y是0，1或2；
e)1-8个碳原子的烷基，2-8个碳原子的烯基，2-8个碳原子的炔基，其中
1)每个烷基、烯基、炔基是未取代的，或
2)每个烷基、烯基、炔基是由下述1-3个基团取代的：6-10个碳原子的芳基、杂芳基、芳基烷氧基、杂环烷氧基、羟基烷氧基、烷氧基-烷氧基、羟基烷硫基、烷氧基-烷硫基F，Cl，Br，I，-CN，-NO2，-OH，-OR9，-X2(CH2)PNR11R12，-X2(CH2)PC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pOC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pCO2R9，
-X2(CH2)pS(O)YR9，-X2(CH2)PNR10C(＝O)NR11R12，-OC(＝O)R9，
-OCONHR2，-O-四氢吡喃基，-NR11R12，-NR10C(＝O)R9，
-NR10CO2R9，-NR10C(＝O)NR11R12，-NHC(＝NH)NH2，
-NR10S(O)2R9，-S(O)YR9，-CO2R2，-C(＝O)NR11R12，-C(＝O)R2，
-CH2OR10，CH＝NNR2R2A，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，
-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-S(＝O)2NR2R2A，-P(＝O)(OR10)2，
-OR14，和5-7个碳原子的单糖，其中单糖的每个羟基各自分别或未取代或由H、1-4个碳原子的烷基、2-5个碳原子的烷基酰氧基或1-4个碳原子的烷氧基；
X2是O，S，或NR10；
R7和R8是各自分别选自H、1-4个碳原子的烷基、1-4个碳原子的烷氧基、取代或未取代6-10个碳原子的芳烷基或取代或未取代的杂芳烷基、-(CH2)POR10，-(CH2)POC(＝O)NR11R12和-(CH2)PNR11R12，或R7和R8一起构成结构式-CH2-X3-CH2-的连结基团，其中X3是X2或单键；
m和n各自分别是0，1，或2；
Y选自-O-，-S-，-N(R10)-，-N+(O-)(R10)-，-N(OR10)和-CH2-；
Z选自单键、-O-，-CH＝CH-，-S-，-C(＝O)-，-CH(OR10)--N(R10)，-N(OR10)，CH(NR11R12)--C(＝O)N(R17)-，-N(R17)C(＝O)-，-N(S(O)YR9)-，-N(S(O)YNR11R12)-，-N(C(＝O)R17)-，-C(R15R16)-，-N+(O-)(R10)-，-CH(OH)-CH(OH)-，和-CH(O(C＝O)R9)CH(OC(＝O)R9A)-，其中R9A同R9；
R15和R16各自分别选自H，-OH，-C(＝O)R10，-O(C＝O)R9，羟基烷基和-CO2R10，
R17选自H，烷基，芳基，和杂芳基；
A1和A2选自H，H；H，OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和A1与A2一起构成的部分选自＝O，＝S，和＝NR2的基团；
B1和B2选自H，H；H，-OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和B1与B2一起构成的部分选自＝O，＝S，和＝NR2的基团；
条件是A1与A2和B1与B2中至少有一对形成＝O。
15.权利要求1的应用，其中所述的化合物具有以下结构式：
Figure A2004100491080008C1
式中：
Z1是H和Z2是H或Z1和Z2共同构成＝O；
R1选自下述基团：H，Cl，CH2SO2C2H5，Br，
CH2S(CH2)2NH2，CH2S(CH2)2N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH2n-C4H9，NHCONHC6H5，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC6H5，N(CH3)2，CH3，CH2OCONHC2H5，NHCO2CH3，CH2OC2H5，CH2N(CH3)2，OH，O-正丙基，CH＝NNH-C(＝NH)NH2，CH＝N-N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH-n-C4H，，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S(3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，
Figure A2004100491080009C1
R2选自下述基团：H，Br，Cl，I，CH2S(CH2)2N(CH3)2，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，和CH2OH；
X选自下述基团：H，CH2OH，CH2NH-丝氨酸H，CO2CH3，CONHC6H5，CH2NHCO2C6H5，CH2NHCO2CH3，CH2N3，CONHC2H5，CH2NH-甘氨酸，CON(CH3)2，-CH2NHCO2-，CONH2，CONHC3H7，CH2NH-丝氨酸，CH2SOCH3，CH＝NOH，CH2NH-脯氨酸，CH2CH2(2-吡啶基)，CH＝NNHC(＝NH)NH2，CONH(CH2)2OH，CH＝NNHCONH2，CH2OCOCH3，-CH2OC(CH3)2O-，CH2SC6H5，CH2SOC6H5，CO2正己基，CONHCH3，和CO2(CH2)4CH3；或下述结构式之一
Figure A2004100491080010C1
和
R选自OH和OCH3。
16.权利要求15的应用，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1是NHCONHC2H5；R2是CH2CH2(2-吡啶基)；和R是OH。
17.权利要求15的应用，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1和R2是CH2OCH2OCH2CH3；和R是OH。
18.权利要求15的应用，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1和R2是CH2SCH2CH3；和R是OH。
19.权利要求15的应用，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2CH3；和R是OH。
20.权利要求15的应用，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2(CH2)4CH3；和R是OH。
21.权利要求15的应用，其中Z1，Z2和R1是H；R2是CH2OH；X是CO2CH3；和R是OH。
22.权利要求15的应用，其中Z1和，Z2是H；R1和R2是H2S(3-(1，2，4-三嗪)；X是CO2CH3；和R是OH。
23.权利要求15的应用，其中Z1和Z2是H；R1是Br；R2是I；X是CO2CH3；和R是OH。
24.权利要求15的应用，其中Z1和Z2是H；R1和R2是CH2SCH2CH3；X是CO2CH3；和R是OH。
25.权利要求15的应用，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2CH3；和R是OCH2。
26.权利要求15的应用，其中Z1和Z2构成＝O；R1和R2是Br；X是CO2CH3；和R是OH。
27.权利要求1的应用，其中所述的的化合物具有以下结构式：
其中：
Z1是H和Z2是H或Z1和Z2一起构体＝O；
R1是H或Br；
R2是H；
R3是H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，或
和
R4是H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
28.权利要求27的应用，其中R1，R2，R4，Z1和Z2是H和R3是CH2CH＝CH2。
29.权利要求27的应用，其中R1是Br，和R2，R3，R4，Z1和Z2是H。
30.权利要求27的应用，其中R1，R2，Z1，和Z2是H；R3和R4是CH2CH＝CH2。
31.权利要求27的应用，其中R1，R2，R3，Z1，和Z2是H；R4是CH2CH＝CH2。
32.权利要求27的应用，其中R1，R2，Z1和Z2是H；R3和R4是CH2CH2＝CH2OH或R1，R2，R4，Z1，和Z2是H；R3是
33.一种抑制多谱系激酶蛋白的化合物在制备用于治疗哺乳动物炎症疾病的药物中的应用。
34.权利要求33的应用，其中所述的的化合物具有以下结构式；
式中：
E1和E2各自分别都与它们所连接的碳原子构成或不饱和的6元芳香碳环，环上的1-3个碳原子可被氮原子置换；或
不饱和的5元芳香碳环，在环上或
1个碳原子被氧、氮或硫原子置换；
或
2个碳原子被硫和氮原子或氧和氮原子置换；
A1和A2一起代表O，B1和B2一起代表O；
R1是H，1-4个(含)碳原子的烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，或杂芳烷基；COR9，其中R9是1-4个(含)碳原子的烷基或芳基，优选苯基或萘基；OR10，其中R10是H或1-4个(含)碳原子的烷基；-CONH2，-NR7R8，-(CH2)nNR7R8，其中n是1-4(含)的整数；或-O(CH2)nNR7R8；和或
R7和R8分别各自是H或1-4(含)个碳原子的烷基；或
R7和R8一起构成式(CH2)2-X1-(CH2)2-的连接基团，其中X1是-O-，-S-和-CH2-；
R2是H，SO2R9；-CO2R9，-COR9，1-8个(含)碳原子的烷基，优选1-4个(含)碳原子的烷基，1-8个(含)碳原子的烯基，1-4个(含)碳原子的烯基，1-8个(含)碳原子的炔基，1-4个碳原子的炔；或5-7个(含)碳原子的单糖，每一个单糖的羟基是末取代的或由H，1-4个(含)碳原子的烷基，2-5个(含)碳原子的烷基酰氧基，或1-4个(含)碳原子的烷氧基取代的；和或
1-8个(含)碳原子的烷基，1-8个(含)碳原子的烯基，1-8个(含)碳原子的炔基是末取代的，或
1-8个(含)碳原子的烷基，1-8个(含)碳原子的烯基，1-8个(含)碳原子的炔基各自分别是由1-3个含6-10个碳原子的芳基取代，优选苯基或萘基；杂芳基，F，Cl，Br，I，-CN，-NO2，OH，-OR9，-O(CH2)nNR7R8，-OCOR9，-OCONHR9，O-四氢吡喃基，NH2，-NR7R8，-NR10COR9，-NR10CO2R9，-NR10CONR7R8，-NHC(＝NH)NH2，-NR10SO2R9，-S(O)YR11，其中R11是H或1-4个(含)碳原子的烷基，6-10个(含)碳原子的芳基，优选苯基或萘基，或杂芳基和Y是1或2；-SR11，-CO2R9，-CONR7R8，-CHO，COR9，CH2OR7，-CH＝NNR11R12-CH＝NOR11，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-SO2NR12R13，-PO(OR11)2或OR14，
其中R14是羧基的羟基除去后氨基酸的残基和或
R12和R13各自分别是H，1-4个(含)碳原子的烷基，6-10个(含)碳原子的芳基，优选苯基或萘基，或杂芳基或
R12和R13一起构成连结基，优选(CH2)2-X1-(CH2)2-；
R3，R4，R5和R6各自分别是：H，芳基，优选6-10个(含)碳原子的芳基，更优选苯基或萘基；杂芳基；F，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH，-OR9，-O(CH2)nNR7R8，-OCOR9，-OCONHR9，NH2，-CH2OH，-CH2OR14，-NR7R8，-NR10COR9，-NR10CONR7R8，SR11，-S(O)YR11，其中Y是1或2；-CO2R9，-COR9，-CONR7R8，-CHO，-CH＝NOR11，-CH＝NR9，-CH＝NNR11R12，-(CH2)nR9，其中n是1-4(含)的整数，-(CH2)nS(O)YR9，-CH2SR15其中R15是1-4个(含)碳原子的烷基，-CH2S(O)YR14，-(CH2)nNR7R8，-(CH2)nNHR14，1-8个(含)碳原子的烷基，优选1-4个(含)碳原子的烷基；1-8个(含)碳原子的烯基，优选1-4个(含)碳原子的烯基；1-8个(含)碳原子的炔基，优选1-4个(含)碳原子的炔基；和或
1-8个(含)碳原子的烷基，1-8个(含)碳原子的烯基，1-8个(含)碳原子的炔基是未取代的或
1-8个(含)碳原子的烷基，1-8个(含)碳原子的烯基，1-8个(含)碳原子的炔基是取代的，如前面d)2)中所述；
X或是
未取代的1-3个(含)碳原子的烯基；或
X是用R2取代的1-3个(含)碳原子的烯基，优选OR10，-SR10，R15，其中R15是1-4个(含)碳原子的烷基；苯基，萘基，7-14个(含)碳原子的芳烷基，优选苄基；或
X是-CH＝CH-，-CH(OH)-CH(OH)-，-O-，-S-，-S(＝O)-，-S(＝O)2-，CR10)2-，-C(＝O)-，-C(＝NOR11)-，-C(OR11)(R11)-，-C(＝O)CHR15-，-CHR15)C(＝O)-，-C(＝NOR11)CHR15)-，CHR15)C(＝NOR11)-，CH2Z-，-ZCH2-，-CH2Z-CH2-，
其中Z是C(OR11)(R11)，O，S，C(＝O)，C(＝NOR11)-或NR11；
或者
A1和A2各自分别是H，H；H，OR11；H，-SR11；H，-NR11R12；或一起代表＝S或＝NR11；B1和B2一起代表O；R1，R2，R3，R4，R5R6和X同前面c)，d)，e)和f)的定义；
或
A1和A2一起代表O；和B1和B2各自分别是H，H；H，OR11；H，-SR11；H，-NR11R12；或一起代表＝S或＝NR11；R1，R2，R3，R4，R5R6和X同前面c)，d)，e)和f)的定义。
35.权利要求34的应用，其中A1，A2，R1，R3和R4是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2OH；R5和R6是OCH3；和X是CH2。
36.权利要求34的应用，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2OAc；R4是Br；和X是CH2。
37.权利要求34的应用，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2OAc；R4是CH2CH2(2-吡啶基)；和X是CH2。
38.权利要求34的应用，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是H；R4是CH2CH2(2-嘧啶基)；和X是CH2。
39.权利要求34的应用，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是H；R4是CH2CH2(2-吡啶基))；和X是CH2。
40.权利要求34的应用，其中A1，A2，R1，R2，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R4是CH2CH2(2-哒嗪基)；和X是CH2。
41.权利要求34的应用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2OH；和X是CH2。
42.权利要求34的应用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2CH2OH；和X是CH2。
43.权利要求34的应用，其中A1，A2，R1，R2，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；和X是S。
44.权利要求34的应用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2CH2NHCO(4-(OH)Ph)；和X是CH2。
45.权利要求34的应用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2(OH)；和X是CH2。
46.权利要求33的应用，其中所述的化合物具有以下的结构式：
Figure A2004100491080016C1
式中：
环B和环F都与它们所连接的碳原子成环，并分别各自选自下述基团：，
a)不饱和的6元芳香碳环，环上的1-3个碳原子可被氮原子置换；
b)不饱和的5元芳香碳环；和
c)不饱和的5元芳香碳环，在环上或
1)1个碳原子被氧、氮或硫原子置换；
2)2个碳原子被硫和氮原子、氧和氮原子或两个氮原子置换；或
3)3个碳原子被3个氮原子置换；
R1选自下述基团：
a)H，取代或未取代的1-4个碳原子的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基，取代或未取代的杂芳基，或取代或未取代的杂芳烷基；
b)-C(＝O)R9，其中R9选自烷基、芳基或杂芳基；
c)-OR10，其中R10选自H和1-4个碳原子的烷基；
d)-C(＝O)NH2，-NR11R12，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)POR10，-(CH2)POR10和-O(CH2)PNR11R12，其中p为1-4；和其中或
1)R11和R12分别各自选自H和1-4个碳原子的烷基；或
2)R11和R12一起构成式(CH2)2-X1-(CH2)2-的连接基团，其中X1选自-O-，-S-和-CH2-；
R2选自下述基团：H，1-4个碳原子的烷基，OH，1-4个碳原子的烷氧基，-OC(＝O)R9，
-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)PNR11R12，-O(CH2)POR10，取代或未取代的6-10个碳原子的芳烷基，取代或未取代的杂芳烷基；
R3，R4，R5和R6各自分别选自下述基团：
a)H，芳基，杂芳基，F，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH，-OR9，
-O(CH2)pNR11R12，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR2R7，-OC(＝O)NR11R12，
-O(CH2)POR10，-CH2OR10，-NR11R12，-NR10S(＝O)2R9，-NR10C(＝O)R9；
b)-CH2ORR14，其中R14是在羧基的羟基脱除后的氨基酸残留；
c)-NR10C(＝O)NR11R12，-CO2R2，-C(＝O)R2，-C(＝O)NR11R12，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-(CH2)PNR11R12，-(CH2)PNHR14，或CH＝NNR2R2A，其中R2A同R2；
d)-S(O)YR2-(CH2)PS(O)YR9，-CH2S(O)YR14，其中y是0，1或2；
e)1-8个碳原子的烷基，2-8个碳原子的烯基，2-8个碳原子的炔基，其中
1)每个烷基、烯基、炔基是未取代的，或
2)每个烷基、烯基、炔基是由下述1-3个基团取代的：6-10个碳原子的芳基、杂芳基、芳基烷氧基、杂环烷氧基、羟基烷氧基、烷氧基-烷氧基、羟基烷硫基、烷氧基.-烷硫基，F，Cl，Br，I，-CN，-NO2，-OH，-OR9，-X2(CH2)PNR11R12，-X2(CH2)PC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pOC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pCO2R9，
-X2(CH2)pS(O)YR9，-X2(CH2)PNR10C(＝O)NR11R12，-OC(＝O)R9，
-OCONHR2，-O-四氢吡喃基，-NR11R12，-NR10C(＝O)R9，
-NR10CO2R9，-NR10C(＝O)NR11R12，-NHC(＝NH)NH2，
-NR10S(O)2R9，-S(O)YR9，-CO2R2，-C(＝O)NR11R12，-C(＝O)R2，
-CH2OR10，CH＝NNR2R2A，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，
-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-S(＝O)2NR2R2A，-P(＝O)(OR10)2，
-OR14，和5-7个碳原子的单糖，其中单糖的每个羟基各自分别或未取代或由H、1-4个碳原子的烷基、2-5个碳原子的烷基酰氧基或1-4个碳原子的烷氧基；
X2是O，S，或NR10；
R7和R8是各自分别选自H、1-4个碳原子的烷基、1-4个碳原子的烷氧基、取代或未取代6-10个碳原子的芳烷基或取代或未取代的杂芳烷基、-(CH2)POR10，
-(CH2)POC(＝O)NR11R12，和-(CH2)PNR11R12，或R7和R8一起构成结构式-CH2-X3-CH2-的连结基团，其中X3是X2或单键；
m和n各自分别是0，1，或2；
Y选自-O-，-S-，-N(R10)-，-N+(O-)(R10)-，-N(OR10)和-CH2-；
Z选自单键、-O-，-CH＝CH-，-S-，-C(＝O)-，-CH(OR10)--N(R10)，-N(OR10)，CH(NR11R12)--C(＝O)N(R17)-，-N(R17)C(＝O)-，-N(S(O)YR9)-，-N(S(O)YNR11R12)-，-N(C(＝O)R17)-，-C(R15R16)-，-N+(O-)(R10)-，-CH(OH)-CH(OH)-，和-CH(O(C＝O)R9)CH(OC(＝O)R9A)-，其中R9A同R9；
R15和R16各自分别选自H，-OH，-C(＝O)R10，-O(C＝O)R9，羟基烷基和-CO2R10，
R17选自H，烷基，芳基，和杂芳基；
A1和A2选自H，H；H，OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和A1与A2一起构成的部分选自＝O，＝S，和＝NR2的基团；
B1和B2选自H，H；H，-OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和B1与B2一起构成的部分选自＝O，＝S，和＝NR2的基团；
条件是A1与A2和B1与B2中至少有一对形成＝O。
47.权利要求33的应用，其中所述的的化合物具有以下结构式：
Figure A2004100491080019C1
式中：
Z1是H和Z2是H或Z1和Z2共同构成＝0；
R1选自下述基团：H，Cl，CH2SO2C2H5，Br，CH2S(CH2)2NH2，CH2S(CH2)2N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH2n-C4H9，NHCONHC6H5，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC6H5，N(CH3)2，CH3，CH2OCONHC2H5，NHCO2CH3，CH2OC2H5，CH2N(CH3)2，OH，O-正丙基，CH＝NNH-C(＝NH)NH2，CH＝N-N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH-n-C4H，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S(3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，
Figure A2004100491080019C2
R2选自下述基团：H，Br，Cl，I，CH2S(CH2)2N(CH3)2，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，和CH2OH；
X选自下述基团：H，CH2OH，CH2NH-丝氨酸H，CO2CH3，CONHC6H5，CH2NHCO2C6H5，CH2NHCO2CH3，CH2N3，CONHC2H5，CH2NH-甘氨酸，CON(CH3)2，-CH2NHCO2-，CONH2，CONHC3H7，CH2NH-丝氨酸，CH2SOCH3，CH＝NOH，CH2NH-脯氨酸，CH2CH2(2-吡啶基)，CH＝NNHC(＝NH)NH2，CONH(CH2)2OH，CH＝NNHCONH2，CH2OCOCH3，-CH2OC(CH3)2O-，CH2SC6H5，CH2SOC6H5，CO2正己基，CONHCH3，和CO2(CH2)4CH3；或下述结构式之一
Figure A2004100491080020C2
和
R选自OH和OCH3。
48.权利要求47的应用，其中Z1和Z2都是H，X是CO2CH3，R1是NHCONHC2H5，
R2是CH2CH2(2-吡啶基)，和R是OH。
49.权利要求47的应用，其中Z1和Z2都是H，X是CO2CH3，R1和R2都是CH2OCH2OCH2CH3，和R是OH。
50.权利要求47的应用，其中Z1和Z2都是H，X是CO2CH3，R1和R2都是CH2SCH2CH3，和R是OH。
51.权利要求47的应用，其中Z1，Z2，R1和R2都是H，X是CO2CH3，和R是OH。
52.权利要求47的应用，其中Z1，Z2，R1和R2是H，X是CO2(CH2)4CH3，和R是OH。
53.权利要求47的应用，其中Z1，Z2，和R1是H，R2是CH2OH，X是CO2CH3，和R是OH。
54.权利要求47的应用，其中Z1和Z2是H，R1和R2是H2S[3-(1，2，4-三嗪)]，X是CO2CH3，和R是OH。
55.权利要求47的应用，其中Z1和Z2是H；R1是Br；R2是I；X是CO2CH3；和R是OH。
56.权利要求47的应用，其中Z1和Z2是H；R1和R2是CH2CH2SCH3；X是CO2CH3；和R是OH。
57.权利要求47的应用，其中Z1，Z2，R1，和R2是H；X是CO2CH3；和R是OCH3。
58.权利要求47的应用，其中Z1和Z2一起构成＝O，R1和R2是Br，X是CO2CH3，和R是OH。
59.权利要求33的应用，其中所述的的化合物具有以下结构式：
其中：
Z1是H和Z2是H或Z1和Z2一起构体＝O；
R1是H或Br；
R2是H；
R3是H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，或
Figure A2004100491080022C2
和
R4是H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
6O.权利要求59的应用，其中R1，R2，R4，Z1和Z2是H；R3是CH2CH＝CH2。
61.权利要求59的应用，其中R1是Br；R2，R3，R4，Z1和Z2是H。
62.权利要求59的应用，其中R1，R2，Z1，和Z2是H；R3和R4是CH2CH＝CH2。
63.权利要求59的应用，其中R1，R2，R3，Z1，和Z2是H；R4是CH2CH＝CH2。
64.权利要求59的应用，其中R1，R2，Z1，和Z2是H，和R3和R4是CH2CH2CH2OH；或R1，R2，R4，Z1和Z2是H和R3是
Figure A2004100491080022C3
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102307593A (zh) * 2008-10-22 2012-01-04 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 轴突变性的调节

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6811992B1 (en) 1998-05-14 2004-11-02 Ya Fang Liu Method for identifying MLK inhibitors for the treatment of neurological conditions
US6841567B1 (en) 1999-02-12 2005-01-11 Cephalon, Inc. Cyclic substituted fused pyrrolocarbazoles and isoindolones
US7122679B2 (en) * 2000-05-09 2006-10-17 Cephalon, Inc. Multicyclic compounds and the use thereof
CZ2003680A3 (cs) * 2000-08-11 2003-11-12 Cephalon, Inc. Způsob modulace kinasových proteinů s vícenásobnou vazbou a vyhledávání sloučenin modulujících kinasové proteiny s vícenásobnou vazbou
US7018999B2 (en) 2001-05-16 2006-03-28 Cephalon, Inc. Methods for the treatment and prevention of pain
FR2826653B1 (fr) * 2001-06-29 2005-10-14 Servier Lab Nouveaux derives de pyrido-pyrido-pyrrolo[3,2-g]pyrrolo [3,4-e]-indole et pyrido-pyrrolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c] carbazole, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
JP2003052395A (ja) * 2001-08-09 2003-02-25 Japan Tissue Engineering:Kk 移植適正判定方法
AR069501A1 (es) 2007-11-30 2010-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti- vegf (factor de crecimiento endotelial vascular)
JP2011517339A (ja) * 2008-02-04 2011-06-02 ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 神経変性疾患の治療に有用な分子標的及び化合物並びにこれらの同定方法
US20100056609A1 (en) * 2008-08-26 2010-03-04 Washington University Methods and compositions for inhibition of axonal degeneration by modulation of the dlk/jnk pathway
AU2015202365B2 (en) * 2008-10-22 2016-11-24 Genentech, Inc. Modulation of axon degeneration
MX2012004638A (es) * 2009-10-22 2012-07-04 Genentech Inc Modulacion de degeneracion de axones.
ES2385157B1 (es) * 2010-02-25 2013-07-08 Universidad Del País Vasco Compuestos para el tratamiento de alzheimer.
EP2852388A4 (en) 2012-05-23 2016-01-13 Univ Johns Hopkins COMPOUNDS AND METHOD FOR USE THEREOF FOR THE TREATMENT OF NEURODEEGENERATIVE DISEASES
CN109060472A (zh) * 2018-07-20 2018-12-21 上海市农业科学院 一种适于荧光染色的草菇菌褶组织切片的制备方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5756494A (en) * 1992-07-24 1998-05-26 Cephalon, Inc. Protein kinase inhibitors for treatment of neurological disorders
US5475110A (en) * 1994-10-14 1995-12-12 Cephalon, Inc. Fused Pyrrolocarbazoles
US5705511A (en) * 1994-10-14 1998-01-06 Cephalon, Inc. Fused pyrrolocarbazoles
US6811992B1 (en) * 1998-05-14 2004-11-02 Ya Fang Liu Method for identifying MLK inhibitors for the treatment of neurological conditions

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102307593A (zh) * 2008-10-22 2012-01-04 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 轴突变性的调节
CN104689316A (zh) * 2008-10-22 2015-06-10 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 轴突变性的调节

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CZ2001701A3 (cs) 2002-04-17
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