CN1948341A - 糖尿病性心血管病变相关基因及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的糖尿病性心血管病变相关蛋白－RDCR2蛋白，编码RDCR2蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种RDCR2蛋白的方法。本发明还公开了编码这种RDCR2蛋白的多核苷酸的用途。RDCR2蛋白具有在高糖环境下启动心肌细胞线粒体途径诱导细胞凋亡作用。

Description

糖尿病性心血管病变相关基因及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码大鼠糖尿病性心血管病变相关蛋白RDCR2的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。

背景技术

2型糖尿病性心血管病变不仅是患者的主要死因，也较一般人群发生率高、发展进程快、病情重，加强其发病机理的研究十分必要。

虽然人们已认识到发病过程中蛋白质非酶糖化、自由基产生过多、多元醇代谢亢进、脂蛋白的多态性、细胞因子和生长因子多种介质等的相互作用，但这方面的研究进展甚微，主要有两方面的原因，一是临床上心脏及血管标本取材困难；二是受研究方法学的限制。

疾病的发生、发展无不源于相互作用的相关基因尤其它们早期表达的差异，但迄今为止对于糖尿病性心血管病变相关基因早期的差异表达及其网络调控研究几乎处于空白。随着人类基因组草图的完善，以及生物信息学的迅速发展，用整体、动态的观点去探索疾病的发生机理势在必行，揭示疾病早期相关基因表达谱的变化不仅是生命科学研究的一个重要方向，对于指导下一步的临床研究也具有重要意义。

然而，迄今为止人们对与糖尿病性心血管病变相关基因还知之甚少，因此，本领域迫切需要寻找和开发新的糖尿病性心血管病变相关基因及其编码蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的糖尿病性心血管病变相关蛋白RDCR2蛋白以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的RDCR2多肽，它包括：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

较佳地，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有在高糖环境下启动心肌细胞线粒体途径诱导细胞凋亡作用功能的由(a)衍生的多肽。

更佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：(a)编码上述大鼠RDCR2多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中86-646位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-1594位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有RDCR2蛋白活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达RDCR2蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有RDCR2蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的RDCR2多肽特异性结合的抗体。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗RDCR2多肽活性的化合物，以及抑制RDCR2多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是RDCR2多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在另一优选例中，提供了一种筛选影响RDCR2蛋白表达的物质的方法，包括步骤：

(a)在测试物质存在下，培养大鼠心肌细胞作为测试组，并且在无测试物质存在下，培养大鼠心肌细胞作为对照组；

(b)测定测试组和对照组中RDCR2蛋白的表达情况，其中如果测试组中RDCR2蛋白的表达量显著高于对照组就表明该测试物质是促进RDCR2蛋白表达的物质，如果测试组中RDCR2蛋白的表达量显著低于对照组就表明该测试物质是抑制RDCR2蛋白表达的物质。

较佳地，步骤(b)是通过RT-PCR法或ELISA法检测RDCR2蛋白表达情况。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在RDCR2蛋白的方法，它包括：将样品与RDCR2蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在RDCR2蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种检测与RDCR2多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进RDCR2多肽活性的激动剂，或者筛选抑制RDCR2多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的RDCR2蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在本发明的第十方面，提供了一种组合物(如药物组合物)，它含有安全有效量(如0.001-99wt％)的本发明的RDCR2多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗糖尿病性心血管病变等病症。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了扫描电子显微镜观察到的心肌层

图2显示了用mRNA差示法显示的2型糖尿病性心血管病变大鼠模型中的表达模式(N，正常对照；D，糖尿病模型)。表达改变的片段用箭头标出。

图3显示了半定量RT-PCR鉴别出的cDNA判断的差异表达(2％琼脂糖凝胶电泳的照片)，其中M是分子量标准DL2000；N是正常对照；D是糖尿病组；而GAPDH作为529bp的参照片段。

图4显示了在2型糖尿病性心血管病变大鼠模型中mRNA差异表达的基因(N是正常对照；0.5D是0.5个月糖尿病模型动物的切片；2D是2个月糖尿病模型动物的切片；6D是6个月糖尿病模型动物的切片)

图5显示了RDCR2在Northern blot后的辉度扫描结果。

图6显示了RDCR2的滴定曲线及等电点。

图7显示了对RDCR2二级结构的预测。图中H＝螺旋，E＝strand，-＝无预测。

图8显示了RDCR2在不同组织中的表达情况，其中泳道1-11分别是下丘脑、垂体、肺、脾、胰脏、脂肪、肾上腺、肾脏、肝脏、骨骼肌和主动脉。

图9显示了RDCR2在不同组织中的mRNA水平柱型图。

图10显示了RDCR2在不同糖浓度培养下在心肌中的表达情况。

图11显示了PIRES2-EGFP-RDCR2载体对不同细胞的转染结果。图A是HEPG2细胞；图B是原代大鼠心肌细胞。

图12显示了转染细胞RDCR2表达丰度鉴定。

图13显示了高丰度表达RDCR-2的细胞内线粒体电势位消失，线粒体功能受损。

图14A为低糖培养转染阳性的细胞(绿色，被黄色箭头所指)，可见细胞核为hochest33324染色(蓝色.)而PI(红色)未染色，说明细胞处于凋亡状态。

图14B：为同样低糖条件下阴性对照细胞，绿色荧光表达的细胞未呈现调亡及坏死现象。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首先从建立2型糖尿病性心血管病变的大鼠模型入手，以荧光标记的mRNA差异显示技术筛选出病变早期差异表达基因RDCR2，并应用生物信息学分析该相关基因及其蛋白的结构和功能，并用试验验证了RDCR2的确是一种与2型糖尿病性心血管病变相关的蛋白。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人成功建立了2型糖尿病性心血管病变大鼠模型并对其进行系统分析。2月龄SD大鼠高热量饮食喂养2个月后给予小剂量STZ(15mg/kg)建立2型糖尿病模型，模型建立后半个月、1.5-2个月、6个月取大鼠心肌电镜观察及胰岛素-葡萄糖耐量试验、胰岛免疫组化和其它糖代谢相关指标的检测，并与大、小剂量STZ、单纯高热量饮食等各组大鼠相应指标比较。各项指标说明，该模型具有外周胰岛素抵抗和胰岛功能仅轻微受损等特征，超微结构观察证实心肌病变随着病程延长而加重。

本发明的2型糖尿病性心血管病变模型的主要特点在于：

①与人类普通2型糖尿病的发生、发展过程相似。

②STZ用量小，而低剂量的STZ应用能最大限度地避免其胰腺外非选择性的作用。

③无需治疗生命即能维持较长时间，可用于2型糖尿病慢性并发症的相关研究。

④2型糖尿病模型建立后，心肌包括线粒体的数量和质量、细胞间质在内的超微结构先后发生改变，同时也观察到电镜下主动脉内皮损伤和平滑肌增殖等。由于这种接近人类普通2型糖尿病模型的大鼠具备多个罹患心血管疾病的危险因素：高血糖、高血脂、高胰岛素血症，并随着病程逐渐出现人类心血管病变的特征性改变，从而为糖尿病这种特定状态下心血管系统病变相关基因的筛选奠定了基础。

基于糖尿病性心血管病变模型，本发明人应用荧光标记的DDRT-PCR技术筛选相关基因。具体地，在2型糖尿病大鼠模型建立后半个月，抽提大鼠心肌总RNA进行荧光标记的mRNA差异显示分析，Northern印迹及半定量RT-PCR证实候选基因的差异表达。从5000多个条带中选择分离并克隆得到63个差异表达的序列，其中已知基因32个，已知EST 10个，新EST 21个，新基因若干。一种新的糖尿病性心血管病变相关基因是RDCR2，该基因在糖尿病并发心肌病大鼠的心肌中表达上调。

运用相同组织mRNA进行Norhern验证，和组织表达谱研究，进一步证明了DD-PCR的结果。另外，新生鼠原代心肌细胞培养，进行高糖和低糖培养干预实验。运用RT-PCR技术证实高糖情况下RDCR2基因的表达高于低糖(p＜0.05)。这表明，RDCR2可以作为早期诊断或辅助诊断糖尿病性心血管病变的一个标志物。

在本发明中，术语“RDCR2蛋白”、“RDCR2多肽”或“糖尿病性心血管病变相关蛋白RDCR2”可互换使用，都指具有大鼠糖尿病性心血管病变相关蛋白RDCR2氨基酸序列(SEQ IDNO：2)的蛋白或多肽。应理解，该术语还包括其他哺乳动物中的同源蛋白，例如人的RDCR2蛋白。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的糖尿病性心血管病变相关蛋白RDCR2。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的RDCR2蛋白或多肽”是指RDCR2多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化RDCR2蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。RDCR2多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括大鼠RDCR2蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然大鼠RDCR2蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“RDCR2多肽”指具有RDCR2蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与大鼠RDCR2蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括RDCR2蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与RDCR2 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗RDCR2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含RDCR2多肽或其片段的融合蛋白(如GST融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了RDCR2多肽的可溶性片段。通常，该片段具有RDCR2多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供RDCR2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然大鼠RDCR2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“RDCR2蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳至多8个，更佳至多5个，最佳至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala

Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

在本发明中，术语“RDCR2蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有RDCR2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1中第86-646位核苷酸序列及其简并序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸第86-646位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO：1中从核苷酸第86-646位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的RDCR2相同功能的蛋白的、SEQ ID NO：1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码RDCR2蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的RDCR2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，等人Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或RDCR2蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的RDCR2多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码大鼠RDCR2多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，RDCR2多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，等人Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Leeand Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含RDCR2编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，等人molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.NewYork，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的RDCR2蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗RDCR2蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗RDCR2蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组RDCR2蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激RDCR2蛋白功能的多肽分子。由于RDCR2在高糖条件下表达上调，因此预期可以抑制或减少RDCR2表达的物质是治疗糖尿病性心血管病变的潜在候选物。

另一方面，本发明还包括对RDCR2 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于RDCR2基因产物或片段。较佳地，指那些能与RDCR2基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制RDCR2蛋白的分子，也包括那些并不影响RDCR2蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的RDCR2基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的RDCR2基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达RDCR2蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature256；495，1975；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断RDCR2蛋白功能的抗体以及不影响RDCR2蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用RDCR2基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与RDCR2基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗RDCR2蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的RDCR2蛋白。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与RDCR2蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断RDCR2蛋白的产生或活性。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如大鼠RDCR2蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭大鼠RDCR2蛋白阳性的细胞。

多克隆抗体的生产可用大鼠RDCR2蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与RDCR2蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于糖尿病性心血管病变方面的治疗。在使用本发明RDCR2蛋白时，还可同时使用其他治疗剂，如黄莲素(小檗碱)等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明RDCR2多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的RDCR2蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

大鼠RDCR2蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于RDCR2蛋白的无表达或异常/无活性的RDCR2蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的RDCR2蛋白，以抑制内源性的RDCR2蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将RDCR2基因转移至细胞内。构建携带RDCR2基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，等人)。另外重组大鼠RDCR2基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

抑制大鼠RDCR2mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

能与大鼠RDCR2蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对大鼠RDCR2蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测RDCR2蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的RDCR2蛋白水平，可用于辅助诊断RDCR2蛋白起作用的疾病(如糖尿病性心血管病变)。

一种检测检测样品中是否存在RDCR2蛋白的方法是利用RDCR2蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与RDCR2蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在RDCR2蛋白。

RDCR2蛋白的多聚核苷酸可用于RDCR2蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，RDCR2蛋白的多聚核苷酸可用于检测RDCR2蛋白的表达与否或在疾病状态下RDCR2蛋白的异常表达。如RDCR2 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断RDCR2蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用RDCR2蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测RDCR2蛋白的转录产物。

检测RDCR2基因的突变也可用于诊断RDCR2蛋白相关的疾病。RDCR2蛋白突变的形式包括与正常野生型RDCR2 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从大鼠2型糖尿病的心肌细胞中克隆获得的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1594个碱基，其开放读框位于86-646位，编码全长为187个氨基酸的大鼠RDCR2蛋白(SEQ ID NO：2)。

大鼠RDCR2蛋白和基因为治疗糖尿病性心血管病变等疾病提供新的治疗途径，因而具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.制备糖尿病大鼠模型

1.1动物和材料

清洁级雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠100只，2月龄，体重(250±20)g，购自BK公司提供，动物合格证号：沪动152；STZ(链脲佐菌素)购自Sigma公司提供；血糖、甘油三酯、胆固醇等生化检测试剂盒购自名典生物工程有限公司；中性单峰纯胰岛素购自万邦生化制药有限公司；胰岛素一抗及相关免疫组化试剂购自迈新公司；大鼠专用胰岛素放免试剂盒购自Linco公司。

饮食成分：普通饲料平均热量3.9cal/g，其中碳水化合物占60％，蛋白质占22％，脂肪占10％(豆油为主)，包括纤维素在内的其他成分占8％；高脂饲料平均热量5.1cal/g，其中碳水化合物占50％，蛋白质占13％，脂肪占30％(动物油脂为主)，包括纤维素在内的其他成分占7％。

1.2预实验。

确定各组STZ的剂量、高脂饮食后STZ干预时间。

1.3动物分组。

大鼠随机(按随机排列表法)分为A-F共6组，A、E每组20只，其余每组15只。每日光照12h，自由饮水进食。

A组：正常对照组，普通饲料喂养后2个月大鼠一次性尾静脉注射pH4.5，0.1mol/L柠檬酸缓冲液0.5mL(同以下注射液量)。B组：小剂量STZ组即15mg/kg STZ组，普通饲料喂养后2个月大鼠STZ15mg/kg一次性尾静脉注射(STZ溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液中，pH4.5)。C组：大剂量STZ组即50mg/kg STZ组，普通饲料喂养后2个月大鼠STZ50mg/kg一次性尾静脉注射。D组：高脂组，高脂饲料喂养后2个月的大鼠一次性尾静脉注射柠檬酸缓冲液。E组：高脂喂养2个月后15mg/kg STZ组，大鼠高脂饲料喂养2个月后一次性尾静脉注射STZ15mg/kg。F组：高脂喂养一个月后15mg/kg STZ组，普通饲料和高脂先后喂养一个月后大鼠一次性尾静脉注射STZ15mg/kg。尾静脉注射后A、B、C组继续普通饲料喂养，D、E、F组继续高脂饲料喂养。

1.4标本采集及检测。

1.4.1动态观察大鼠体重、饮水量、食量。

1.4.2 STZ或柠檬酸缓冲液尾静脉注射后2天(即大鼠喂养至4月龄)的标本采集。A-F组大鼠分别进行空腹状态下(禁食8h，以下同)尾静脉采血，测其血糖、血脂水平。

1.4.3 STZ注射后2个月(即大鼠喂养至6月龄)A-F组的标本采集及相关糖代谢分析。

14.3.1分别测定空腹状态下血中葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、胰岛素含量。

1.4.3.2通过葡萄糖-胰岛素耐量试验测胰岛素敏感性。

方法如下：大鼠禁食8h后苯巴比妥钠50mg/kg腹腔注射，行股静脉、股动脉插管。继股静脉注射葡萄糖0.7g/kg后注射胰岛素0.175U/kg，于0，2，4，6，8，10，20，30min股动脉抽血0.3ml，分离血清检测血糖值，胰岛素敏感性以10min内血糖下降速度来衡量，对数线性回归(Loglinear regression)程序计算，以拟合曲线的平均斜率K值表示。

1.4.3.3测定上述指标后，每组大鼠各5只，断头处死，迅速取胰腺、心脏、主动脉，一部分液氮保存，一部分备病理检查(包括本部分大鼠的形态学分析)。另外，留取A组大鼠全身不同组织液氮保存以备基因组织分布表达谱分析。

1.4.3.4胰腺的病理学观察。胰腺用10％中性甲醛溶液固定，常规包埋，5μm切片，免疫组化采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶法，经由过氧化酶阻断、正常非免疫动物血清封闭、目的抗体湿盒内4℃过夜、生物素二抗标记、链亲和素-过氧化物酶孵育、DAB显色、苏木素复染、盐酸酒精分色、脱水、二甲苯透明，中型树胶封片等步骤，详见试剂手册。采用多媒体彩色病理图像分析系统(KS400)，在分辨率、对比度、亮度等相同条件下测胰岛Ins免疫组化染色阳性部分的平均吸光度。

1.5大鼠心血管系统形态学观察。

1.5.1A、C、D、E各组大鼠喂养至4.5、5.5-6、10月龄即C、D大鼠糖尿病模型建立后半个月、1.5-2个月、6个月，分别断头处死，迅速分离心脏组织(心尖部)、主动脉置液氮保存，并各留取适当大小置10％中性甲醛溶液固定以备HE染色光镜观察、1mm×1mm组织块置4℃预冷的戊二醛固定液以备电镜观察。

1.5.2透射电镜标本的制备。经2％戊二醛和1％锇酸双固定，乙醇逐级脱水，环氧丙烷两次置换，环氧树脂618包埋液包埋浸透，LKB机切片，盐酸铅染，HITACHI，H-500透射电镜观察。

1.5.3扫描电镜标本的制备。经2％戊二醛和1％锇酸双固定，乙醇和醋酸乙戊酯逐级脱水，HCP-2临界点干燥，BAL-TEC离子溅射，PHILIPS，XL30 ESEM扫描电镜观察。

1.6数据处理。测定指标采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用方差分析。数据由SPSS(10.0)统计软件包进行处理并制图，以P＜0.05为有显著性意义。

实施例2大鼠2型糖尿病早期心肌病变相关基因筛选

2.1材料

2.1.1主要仪器设备

Genomyx LRS荧光差异显示分析系统(Beckman)，该系统包括(1)Genomyx LR电泳仪，含自动干胶装置(2)Genomyx SC扫描仪(3)分析软件系统包括Acquire SC，Clarity SC，ExtendLRS，Virtual Grid System等(4)切胶工作站。分光光度仪(Beckman DU650)，9700型PCR仪(PE)，Fluor-s^TMmultilmager凝胶图像分析仪(Bia-RAD)，低温高速离心机(Beckman)，杂交炉(Robbins Scientific 2000)。

2.1.2主要试剂

HIEROGLPH mRNA Profile试剂盒(Beckman)包括：(1)12个3’端未标记荧光的T7(dT12)锚定引物(Anchored Primer，AP)(2)20个5′M13r随机引物(Arbitrary Primer，ARP)。Fluoro-DDRT-PCR试剂盒(Beckman)包括：(1)12个含与上述锚定引物相应的四甲基罗丹明(TMR)标记引物(2)dNTP混合物(3)TMR标记的DNA分子量标记(4)fluoro-DD上样缓冲液。

TRIZOL总RNA抽提试剂为Gibco-BRL公司产品；不含RNA酶的DNA酶I为Promega公司产品；pMD18-T Vector、DNA Markers2000、Ex Taq酶及RT-PCR Kit(该试剂盒包括AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)-Adaptor引物，10×RNA PCR缓冲液，MgCl₂等)为TaKaRa公司产品；柱离心琼脂糖凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒及柱离心质粒微量回收试剂盒为Qiagen公司产品；GST Purification Kit购自PIERCE公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHI、XhoI、中分子量标准蛋白质购自Promega公司；Exp Taq DNA聚合酶、DNA Marker2000、IPTG购自TaKaRa公司，羊抗人GST多克隆抗血清为Phamacia公司产品；联苯二胺(DAB)显色剂为迈新公司产品。RNA ladder为NEB公司产品；Northern HRP标记及检测试剂盒为Pierce公司产品；正电荷尼龙膜为Millipore产品。

2.1.3质粒和菌种

GST蛋白融合表达质粒pGEX4T-1为Phamacia公司产品；大肠杆菌DH5α(E.coli DH5α)及BL21(E.coli BL21)购自北京博大泰克公司。

2.1.4动物 同实施例1。

2.2方法

2.2.1动物分组及标本采集。

大鼠分组同实施例1：糖尿病大鼠模型制备。

DD-PCR分析的标本来自本发明第一部分液氮保存的组织。E组(2型糖尿病模型组)建模后半个月所取的心肌、主动脉组织，分别以A组相应组织为对照。免疫组化标本来自来自正常对照及E组模型建立后0.5、2和6个月的心肌组织。

2.2.2样品总RNA的提取。

组织捣碎后置TRIZOL液中彻底匀浆，加入氯仿、异丙醇分离RNA，乙醇洗涤沉淀，DEPC水溶解，-20℃保存备用。具体按试剂手册操作。

2.2.3不含RNA酶的DNA酶处理以去除少量基因组DNA，

10×PCR缓冲液                      5.0μl

50mmol/LmgCl₂                    1.5μl

RNasin                             50u

DNA酶I(RNase-Free)                 45u

总RNA                              20μg

加DEPC处理过的双蒸水至             50μl

混匀→37℃，30min→加DEPC处理过的双蒸水至500μl→酚/氯仿抽提后溶解于20μl DEPC水中。

2.2.4采用比色法和电泳法鉴定总RNA的质量。

2.2.4.1比色法

上述RNA溶液稀释100倍后于260nm和280nm波长处测吸光度(A)，分析RNA浓度和A260/A280比值。RNA的定量根据下列公式求出其浓度。

RNA溶液的浓度(μg/ml)＝A260×40×稀释倍数。

2.2.4.2电泳法

2.2.4.2.1凝胶的制备：称取琼脂糖1.2g，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液12ml，DEPC处理过的双蒸水37.3ml，加热溶解。待溶液冷却至60℃时加入12.3mol/L的甲醛贮存液10.7ml，10mg/ml的溴乙锭3.0μl，混匀，于室温中静置0.5h使凝胶凝固。

2.2.4.2.2样品的制备及电泳。在一灭菌的Eppendorf管中加入下述各成分混匀后65℃温育15min后迅速置于冰浴中，加2μl灭菌的并经EDPC处理的10×甲醛凝胶上样缓冲液，混匀。凝胶预电泳5min(5V/cm)后上样。在1×甲醛凝胶电泳缓冲液中以4V/cm的场强电泳。紫外灯下观察电泳结果。

RNA样品                        4.5μl

5×甲醛凝胶电泳缓冲液          2.0μl

甲醛                           3.5μl

甲酰胺                         10.0μl

2.2.5样品RNA的DDRT-PCR反应。

各组RNA样品以T7(dt12)AP作为3’端引物，进行逆转录反应，反应体系20μl：25mmol/LmgCl₂ 4μl，10×PCR缓冲液2μl，250μM dNTP混合物2μl，RNase抑制剂0.5μl，0.25U/μl反转录酶1μl，T7(dt12)AP各4μl，Total RNA 0.8ug，剩余容积以H₂O补足。反应条件如下：42℃30min，50℃30min，70℃15min，反应结束后4℃保存。以M13rARP为随机引物，TMR-T7(dt12)AP为锚定引物，对各组cDNA产物进行PCR扩增。反应体系10μl：10×PCR缓冲液1.0μl，25mMmgCl₂ 1.5μl，250mM dNTPs 2.0μl，M13r-ARP各1.75μl，TMR-T7(dt12)AP各0.7μl，RT mix 1.0μl，EX Taq酶0.1μl，H₂O1.95μl。条件如下：(1)95℃2min(2)4个循环：92℃15s，50℃30s，72℃2min(3)30个循环：92℃15s，60℃30s，72℃2min(4)72℃7min(5)4℃保存。

2.2.6DD-PCR电泳流程

2.2.6.1蒸馏水反复冲洗玻璃板、垫片和梳子。将无切迹玻璃板的内面用4mol/L NaOH处理，将有切迹玻璃板的内面用Glass Shield硅化，随后用乙醇处理，自然晾干。将无切迹玻璃板的内面朝上置灌胶工作台上，垫片紧贴于玻板的两侧，将另一块玻板的处理面朝下覆盖在上述玻璃板上。在70ml 5.6％变性HR-1000胶中加入560μl新鲜制备的10％APS和56μlTEMED，水平灌胶，并将梳子的水平一侧插入凝胶内，玻板的两边用夹子固定，使胶充分聚合。

2.2.6.2在200μl薄壁管中加入4.0μl DD-PCR产物和1.5μl上样缓冲液，95℃变性2min，迅速置于冰内。上样前，将胶放在扫描仪上预扫描，以减少背景干扰。

2.2.6.3DD-PCR电泳条件如下：电压3000V，时间5h。

1.2.6.4电泳结束后，打开Acquire SC程序并启动扫描仪，相关分析软件进行差异条带的定位。

2.2.6.5将胶板从扫描仪取下，移走有切迹的玻璃板，干胶并用蒸馏水冲洗15min，反复操作3次。割胶工作台上操作，差异条带浸泡于50μl TE中，37℃温育1h。切割完毕后将玻璃板放入扫描仪重新扫描，检测割胶的准确性。

2.2.7差异条带的再扩增，通用引物为

T7 promoter(22-mer)，5’gtaatacgactcactatagggc 3’(SEQ ID NO：3)

M13 reverse(24-mer)，5’agcggataacaatttcacacagga 3’(SEQ ID NO：4)

其它PCR条件同DD-PCR过程。

反应结束后，用2％琼脂糖凝胶电泳，检测扩增出的特异条带。

2.2.8割胶和胶回收(Qiagen)按实际手册说明进行：每100g琼脂糖凝胶加入300μl比例加入S1液，置55℃水浴10min每2min颠倒混匀一次；加入1/3S1液体积的异丙醇，混匀，55℃温浴1min；将溶化后的Agarose液移入吸附柱，W1液反复冲洗；在吸附膜中央加入30μlT1液后高速离心1min；过柱液-20℃保存。

2.2.9差异片断的亚克隆

2.2.9.1连接反应16℃过夜：

DNA片段             4μl

PMD 18-T Vector     1μl(50ng)

Solution I          5μl

加去离子水至        10μl

2.2.9.2转化

2.2.9.2.1感受态细菌的制备

无铂丝蘸取-70℃冻存的E.coli(DH52)，在LB平板上划线接种，平板置于37℃16h；挑取单菌落置于5ml LB培养基中，37℃振摇16h；取1ml上述培养液接种到一含有50ml LB培养基的烧瓶中，37℃振摇培养3h，测A600，待其值达到0.3-0.4时将烧瓶取出，立即置冰浴10min；在无菌条件下将细菌转移到一消毒过的预冷的50ml离心管；4℃4000rpm离心10min，弃去上培养液，将离心管倒立于滤纸上1min使培养液流尽；向离心管中加入10ml预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液，重悬沉淀的菌体，置冰浴30min；4℃4000rpm离心10min，弃去上清液，将离心管倒立于滤纸上1min；加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，轻轻重悬菌体；将上述菌体置于4℃冰箱中12～24h，然后分装保存于15％的甘油中-20℃备用。

2.2.9.2.1质粒的转化

连接产物5μl+感受态细菌200μl→冰浴30min→42℃水浴90s→加入800μl LB培养基，混匀→37℃振摇90min(120rpm)→将菌液接种于含有10μg/ml氨苄青霉素及IPTG/X-Gal的LB培养板上→培养板于37℃正放30min→37℃倒放20h→挑取白色菌斑，接种于5ml含有10μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中→37℃振摇(120rpm)

2.2.9.2.3质粒的抽提

采用柱离心式质粒抽提试剂盒从上述菌液中抽取质粒，按试剂手册操作(博大泰克，mini质粒抽提试剂盒)。

2.2.9.2.4重组质粒的双酶切鉴定

EcoRI、HindIII各1μl，10×M buffer 2μl，质粒1μg，加水至20μl，37℃孵育1h，1％琼脂糖凝胶电泳，挑选含目的片段的克隆。

2.2.10对阳性克隆片段进行测序、半定量RT-PCR初步证实

根据测序获得的cDNA序列设计特异引物，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参照，应用半定量RT-PCR初步证实在病变组织中的差异表达，反应体系25μl如下：10×PCR缓冲液2.5μl，25mMmgCl₂ 2μl，2.5μM dNTPs 2μl，引物各2μl，RT mix 1.5μl，EX Taq酶0.2μL，H₂O12.8μl。经1个循环：95℃反应3min；25-28个循环：94℃变性反应45sec，55-62℃退火反应30sec-1min，72℃延伸反应1min；1个循环：72℃反应7min，4℃保存。

2.2.11Northern杂交对克隆片段的再证实。

21.11.11设计目的序列片段及内参照GAPDH的引物进行PCR。反应体系25μl如下：10×PCR缓冲液2.5μl，25mMmgCl₂ 2μl，2.5μM dNTPs 2μl，引物各2μl，RT mix 1.5μl，EX Taq酶0.2μL，H₂O12.8μl。经1个循环：95℃3min；30个循环：94℃45sec，56℃45sec，72℃1min；1个循环：72℃7min，4℃保存。

2.2.11.2探针的标记。取上述PCR产物纯化(具体按Qiagen PCR纯化试剂手册操作)，取浓度为10ng/μl的纯化产物10μl变性后进行辣根过氧化物酶(HRP)法标记(Northern2Southern，Piece)，探针浓度为1.67ng/μl。

2.2.11.3杂交及显色。10-30μg心肌组织RNA(除了用于RDCR2内参照GAPDH检测的RNA量为10μg外，其余RNA的用量均为30μg)变性甲醛凝胶电泳(70V，4h)后，凝胶用DEPC水、20×SSC依次浸泡，采用毛细管洗脱法将RNA转移至尼龙膜，经真空干燥2h，尼龙膜预杂交(0.1ml杂交液/cm²尼龙膜)15min，杂交4h(杂交液含10ng/ml探针)，温度55℃(具体操作见试剂手册)，在新鲜配制的2×SSC/0.1％SDS、2×SSC液中依次洗膜各3次，每次5min。HRP化学发光显色系统作用后6h内曝光1min，底片扫描，并进行辉度比较。

2.2.12生物信息学分析、Genbank的提交和新序列全长的克隆。

筛选得到的序列与Genbank+EMBL+DDBJ+PDB中已知序列进行同源性比较，对未知序列进行Genbank的提交。生物信息学分析和新序列全长的克隆详见后。

实施例3、新生大鼠原代心肌细胞分离培养

取新生1-2天S-D大鼠12只，先于75％酒精浸泡1分钟后取出。酒精棉球擦干，拉断颈椎处死。于剑突与左第5-6肋交界处胸壁斜上剪两公分切口，暴露心尖，快速剪下心室部分，浸泡于D-Hanks溶液中。取得全部十二只心脏后，分别于冰D-Hanks溶液中洗涤6次，冲去心室腔内淤血，并破坏心室内膜细胞。用眼科剪将上述心肌组织剪碎为1mm×1mm大小碎块后，移入50ml玻璃锥型烧瓶中，继续用D-Hanks溶液洗涤，待组织沉淀，吸走上清。反复两次。加0.125％胰酶+0.01％EDTA(二乙烯四乙酸二钠)溶液(Gbico)或0.1％II型胶原酶(Gbico)，于37℃水浴10分钟，振摇50-100次/分钟。第一次消化后，吹打沉淀，吸弃上清。继续加上述酶液消化，反复4-5次，收集上清与另一离心管与加血清的低糖培液中终止消化。离心1200rpm 5分钟，弃去上清，用20％小牛血清(四季清)的低糖DMEM(Gbico)20ml混悬，于5％CO2，37℃条件下孵育90分钟，让成纤维细胞预先贴壁。然后收集细胞悬液，按每孔2×10⁵密度接种两个六孔细胞培养板(Corning)，吹打细胞尽量使其均匀铺于板底，并加0.1mM的溴脱氧尿苷(Bromodeoxyuridine，BrdU；Sigma)，抑制成纤维细胞有丝分裂。24-48小时后换液，观察心肌细胞。进行干预实验时，换以1％BSA+DMEM∶M199(Sigma)4∶1+500ng/ml转铁蛋白的高糖25M，低糖5.6M培液，高糖高脂(0.5mM软脂酸，Sigma)，低糖高脂等四种干预情况。

实施例4、EGFP-RDCR2质粒构建

4.1编码框cDNA扩增：以抽提的糖尿病大鼠心肌RNA逆转录的cDNA为模板，用以下引物扩增RDCR2全长编码框序列。其中上下引物5′端分别接XhoI和BamHI两个酶切位点，PCR片段全长591bp。PCR扩增：94℃ 4′，95℃ 30″-56℃ 45″-72℃ 45″26个循环，72℃ 7分钟。Taq酶同上述部分。

引物序列：

正向引物：GAAGCTTCAGAGAACCATGGAGTCTGG(SEQ ID NO：5)

反向引物：CTCGAGCACAGGAGGCAGATTTCAG(SEQ ID NO：6)

4.2载体克隆构建：扩增PCR片段用胶回收法纯化，与PMD18-T载体(购自TAKARA公司)连接16℃过夜，第二天转化，铺板，用IPTG/X-Gal/AMP筛选，37℃孵育过夜。挑白色菌斑振摇12-16小时，小规模抽提质粒，XhoI/BamHI酶切及双向测序鉴定。并将酶切RDCR2片段割胶纯化，PIRES2-EGFP(购自BD公司)也用上述两种酶切纯化，将两者以T4连接酶连接16℃过夜，第二天转化，铺板，卡那霉素筛选，37℃孵育过夜，挑菌落于含卡那霉素50mg/L的LB培液中振摇12-16小时，30％甘油保存菌株，小规模抽提质粒，双酶切及双向测序鉴定。将保存菌株复苏，按试剂盒说明中等规模抽提质粒(Qiagen Midi Filter)，测OD值和浓度。

结果

§1 2型糖尿病大鼠模型制备结果

1.1.相关糖代谢特征分析

1.1.1STZ注射后2天(即4月龄)的血中糖脂测定。C、E组大鼠空腹血糖在尾静脉注射STZ的第二天已增高，与正常对照及单纯高脂组有显著性差异(P＜0.05)，较之两个月后的空腹血糖增高幅度明显。血中甘油三酯仅D、E、F组升高。各组大鼠血中胆固醇水平无显著性差异，见表1。

表1糖代谢相关指数的比较(4月，n＝6)

	A组	B组	C组	D组	E组	F组
							FBG(mmol/L)TG(mmol/L)Ch(mmol/L)	5.65±0.771.11±0.201.40±0.47	5.10±0.320.96±0.121.38±0.21	28.7±5.36*#1.23±0.34*1.37±0.52	5.34±0.251.97±0.63*1.42±0.23	23.4±2.76*#1.85±0.64*1.51±0.31	5.63±0.771.92±1.00*1.39±0.68

(^*其他组vsA组，#C、E组vsD组，P＜0.05。A组-F组的分组见实施例1中1.3节。FBG，空腹血糖；TG，甘油三酯；Ch，胆固醇)

1.1.2STZ注射后2个月(即6月龄)的糖代谢相关指标测定。C、D、E组血中甘油三酯水平高于A、B组，E组较之D组升高差异亦具显著性。血中胆固醇的升高改变程度与甘油三酯不同步，C组与A组比较差异并无显著性。空腹基础胰岛素值在C组降低，在D组增加，在E组较之A组虽略有增加，但差异无显著性。各项指标具体见表2。

表2糖代谢相关指数的比较(6月，n＝6)

	A组	B组	C组	D组	E组
						BW(g)FBG(mmol/L)TG(mmol/L)CL(mmol/L)FSI(ng/ml)K值Ins-pBP(mmHg)HR(/min)	550±355.17±0.550.95±0.151.31±0.30.52±0.1355.72±3.7982.09±1.71120±24430±36	553±375.35±0.590.98±0.221.3±0.50.53±0.1156.44±4.3681.09±0.99118±16400±42	352±32*#17.93±2.40*#2.58±0.52*1.38±0.43#0.29±0.11*#49.68±6.02*63.48±2.04*#128±20420±35	670±105*5.59±0.612.5±0.42*1.92±0.62*0.93±0.13*45.6±2.97*89.12±1.57*114±19398±52	595±33#16.92±1.68*#3.82±0.88*#2.38±0.55*#0.66±0.15#38.72±3.47*#83.95±1.15#123±12440±39

(^*其他组vsA组，#C、E组vsD组，P＜0.05。A组-F组的分组见实施例1中1.3节。BW＝体重；FBG＝空腹血糖；TG＝甘油三酯；Ch＝胆固醇；FSI＝空腹血清胰岛素；Ins-p＝胰岛素蛋白表达量；BP＝血压；HR＝心率)

1.1.3C、E组大鼠表现多饮(每日饮水量较之正常组高3倍以上)、多尿(每日尿量较之正常组高2倍以上)、多食(每日食量较之正常组高2倍以上)等糖尿病症状。C组体重较之A组(对照组)减轻明显，在E组则与A组无明显差异，但与F组比较体重降低。

1.1.4胰岛素-葡萄糖耐量试验中血糖变化。，以K值表示的胰岛素敏感性在C组、D组、E组均降低，其中E组较前两者更严重。

1.1.5胰岛的免疫组化分析。A、B组胰岛大小均一，形状规则，界限清楚；C组胰岛萎缩，小胰岛多见；D、E、F组胰岛增生，胰腺组织可见散在增生胰岛。单位胰岛β细胞中，D组胰岛素含量增加，表现为吸光度增强，C组则降低，见表1.2。

1.2大鼠心脏形态学观察。

心肌组织超微结构的改变。正常对照：肌原纤维粗细肌丝整齐排列，明暗带清晰可见。D组大鼠6月龄，肌原纤维排列规则，线粒体排列密集，在此之前的超微结构与正常无明显区别。C、E组大鼠模型建立后半个月：肌原纤维排列规则，线粒体嵴发达，排列密集；模型建立后1.5个月，部分视野可见肌原纤维排列紊乱，线粒体明显增多，呈堆积状，肿胀、空泡样变性；模型建立后6个月，肌纤维间和肌纤维与线粒体间间隙扩大，细胞间质胶原增生，微血管基膜增厚，见图1。

§2 2型糖尿病性心血管病变早期相关基因的筛选和分析结果

2.1RNA完整性的检测。紫外分光光度计检测OD260/OD280均在1.80-2.00范围内，进行的1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果18s、28s条带清晰可见，而且进行的辉度扫描显示28s亮度是18s的2倍左右。这表明RNA是完整的。

2.2 DDRT-PCR及克隆片段的序列分析结果。每一种引物组合在单一电泳泳道可稳定显示数十个条带。按差异表达至少3倍以上的标准，在电泳图谱中从5000个条带中选择分离并克隆得到63个差异表达的序列，其中已知基因32个，已知表达序列标签(expressed sequencetag，EST)10个，新EST 21个。部分结果见图2。

2.3选择其中25个序列应用半定量RT-PCR初步证实其中18个在两组心肌或主动脉中的表达趋势与DD-PCR一致。图3所示为部分序列的差异表达。

2.4选取其中3个差异片段进行Northern杂交再证实，一个为已知基因，即肌型肉碱棕榈酰转移酶(muscle camitine palmitoyltransferase 1，M-CPT-1)，与Genbank中相应序列比较同源性高达99％，在病变心肌组织中的表达增强；两个为新基因，DCM5和RDCR-0202-2(即后来所命名的RDCR2，以下均称为RDCR2)，前者在病变心肌组织中的表达降低，后者增强。Northern探针PCR引物见表3。

杂交结果见图4，经辉度扫描M-CPT-1、DCM5、RDCR2与内参照GAPDH比值，对照组为0.341±0.115(M-CPT-1)、0.338±0.007(DCM5)；糖尿病组为0.749±0.119(M-CPT-1)、0.164±0.045(DCM5)，两组的相应指标差别具显著性差异，P＜0.05。

RDCR2在DD-PCR过程中获得的长度880bp，在Northern blot中显示大小为1.5Kb，因此可考虑对其已知序列进行延伸。在DM组病程的不同阶段，RDCR2的表达水平不一：以病变的极早期(超微结构尚未发生显著性改变)为甚，随着病程的发展，表达量有所下降，但始终高于正常对照。RDCR2根据Northern blot后辉度扫描结果见图5。

表3引物序列

              上游引物(3′)     下游引物(3′)   PCR产物长度(bp)

RDCR2    AAGCATGTCAGACTGATGCGGAGGACGCCTGATTTAAC       607

                 CTA                 A

M-CPT-1  CACGCATCCCAGGCAAAG TGGCACTGCTCGGGAATGT       634

                  AG                 C

DCM5     ATTTGAATCTGGGTCCTCT TCATGCTTTCTCCATCACA      523

                  G                  G

GAPDH    ATGATTCTACCCACGGCAA TTCAGCTCTGGGATGACCT      529

                  G                  T

2.5获得的新EST及全长cDNA提交Genbank，在本申请之前尚未公开。

§3新基因RDCR2的电子克隆及功能预测

3.1RDCR-2的克隆：

RDCR-2克隆后由原来的880bp向5′端延伸至1594bp，其长度符合Northern杂交结果。

3.2经反复证实新基因序列如下所示。

GAGCGGCGCAAGCTGCCCTGCTACCTC TCAGTGGT ¹CACTTCCCAGGCCTGTCGCAGTTGGGCTCCGGCTCCTTTGCGGAGCCACC ATGTCGCAGAGCGGGGAGGAGAACCTGCAGGGCTCCTGGGTAGAACTGCACTTCAGCAATGGGAATGGGAGCAGCGTTCCAGCTTCCGTCTCTATTTATAATGGTGACATGGAAAAAATACTGCTGGATGCGCAGCATGAATCTGGACGAAGCAGCTCCAAGAGCTCTCACTGTGACAGCCCACCTCGCTCCCAGACACCACAAGATACCAACAGAGCTGAAATAGACACCCACAGCTTTGGTGAGAAAAACAGCACTCTGTCTGAGGAAGATTATATTGAGAGAAGAAGAGAAGTTGAAAGTATCCTg^*AAGAAAAACTCAGATTGGATATGGGATTGGTCAAGTCGGCCAGAAAATGTTCCCCCCAAGGAGTTCCTTTTTAAACACCCGAAGCGCACAGCTACTCTCAGCATGAGAAACACAAGCGTTATGAAGAAAGGGGGTATTTTCTCAGCAGACTTTCTGAAGGTTTTCCTTCCATCTCTGTTACTGTCTCATCTGTTAGCCATTGGATTGGGGATCTACATTGGAAGGCGTCTGACAACTTCCACTAGTACCTTT TGATGAGACTTGGATCTGCCTTCTGCTCACACAGTGAGGATTCACGCTGAGCTGTGACAGCTAATTGAAGAGCTAGCATGATCCTTGGGTGTCTGCACT ATGTGTGTTTAT ³TTGTTTTGTAAATGCGGTGTTCCTGATTTAGTGAGACAGAATAGACTCTTACCACGACCTATAATTATACCTATGGGATCAATTAATAAGCATGTCAGACTGATGCCTATTGTAGCATTTATTAGTAAATTTCTTTGAATATATTAGATATAAATAGTATAAATAATTTTAATATAGTAGCAATAGTGTATTTAAAAATGATCTGTAATTGTAATCCAGTTAAGACACCTTACACTTCAAAAGAATGACTTAAGTGATATTAA AATCATTAAA ²GGGTTTTCCCCAAAGGAATTCTGTGGCCTTATAATCCTATTATGTAG TAGAAAATTA ⁴AAGGGTGTGGG TTATTTGTAAAG ³GCCTCTTACTTTATGAATTCAGTAGCAAGGAGAGACTAAGGTTACCCACAAACTCCACTTTGCAGTCCCCCTCTTCTTGCTTGCAGGATGAGGATTCCAGCCTTGCTGTCCACCATTACCTTGGGTGGGCAGTTGTGTTACGCCTTTATCTCTCTGCTGAGTGAAGTTCTACGGTTTGTACTTAAATTTTG TGTGCTTTTA ²AAATCAGCTGTATTGTAAGCAAATCTGTCTACTTTAAAAGACTGGAAATGAA AAAAATCTTTG ³CCAAATTCTTTGGGGAATACTGGATTTGCATATGAATTAATCAGTATCCAGCACTTCTGTTAAATCAGGCGTCCTCCCAGTCTTCTCTTTTCTATAGCA TGGCTTTAAA ²GCCTGCCTCCTTGACATGCTGTATATATGCTATTGTATTTGTGTCATTGTCCCACACTTAACTCAG GTGTGCTAAA ⁴AATAAAAGTAATTTTTAACAGTCAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：1)

其中：

1.转录起始cap信号基序

2.Dof2-单锌指转录因子基序

3.CCAAT/增强子结合蛋白基序

4.Dof1/MNB1a-单锌指转录因子基序

^*与bnip3的ORF相比存在的核苷酸突变

3.3获得的新序列以BLASTN数据库进行查询，并寻找开放阅读框架(open reading frame，ORF)，进行全长cDNA的识别及基因转录调控基序分析。

RDCR2全长1594bp，经BLASTN得到最相近的一个序列为2004年8月登录于GenBank上的大鼠BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白(Rattus norvegicus BCL2/adenovirus E1B 19kDa-interacting protein 3，Bnip3)(登录号NP_445872)，其mRNA长为1271bp，无polyA尾及加尾信号，不是一个完整基因。两者匹配范围1271bp，主要在5′端，同源性达98％，有11个碱基不匹配；均包含编码187个氨基酸的ORF。其中在编码区内仅一个碱基突变，即RDCR2的第394个碱基为G(CTG)，而Bnip3的相应位置为A(CTA)。其余300bp左右大小的核苷酸序列，无同源序列。

RDCR2的序列5′段富含GC序列，最大ORF第一个起始密码子ATG，紧邻ACC序列，具典型的Kozak序列，符合真核细胞RNA有效转录的需要。而且距polyA尾前18bp处具有AATAA加尾信号，含完整的3′端，因此这提示是一完整的cDNA序列。RDCR2有多个转录调控基序，如转录起始因子、单个锌指转录因子、CCAAT/增强子等。

RDCR2编码的187个氨基酸的蛋白序列如下：

MSQSGEENLQ GSWVELHFSN GNGSSVPASV SIYNGDMEKI LLDAQHESGR SSSKSSHCDS      60

PPRSQTPQDT NRAEIDTHSF GEKNSTLSEE DYIERRREVE SILKKNSDWI WDWSSRPENV     120

PPKEFLFKHP KRTATLSMRN TSVMKKGGIF SADFLKVFLP SLLLSHLLAI GLGIYIGRRL     180

TTSTSTF                                                               187

(SEQ ID NO：2)

3.4蛋白同源性分析，并进行多重序列联配(Multiple_Sequence Alignment)。

获得小鼠、人类同种蛋白bnip3(同源性分别为98％和90％)，Homo sapiens pro-apoptoticprotein(BNIP3L)(同源性44％)，Rat calbindin D28 protein(同源性63％)。

3.5蛋白理化特性的计算和分析，包括氨基酸的组成、分子量、等电点等，主要应用GCG相关模块进行。

RDCR2的187个氨基酸中含有52个疏水性氨基酸、59个极性氨基酸及55个带电氨基酸。其分子量为20977.43m.w.，等电点为6.96，图6为RDCR2的滴定曲线及等电点。

2.5保守序列或结构域的功能预测。

GCG软件包的Spscan预测的类信号肽分值在3.5以上的区域有：RDCR2：144MKKGGIFSADFLKVFLPSLLLSHLLAIGLGIY 175。PSORT预测其跨膜区域在158-174，属于一种Ib型膜蛋白(Nexo Ccyt)，暴露于胞浆的尾部约有14个残基(175-187)，而且在氨基酸残基5位置可能有线粒体导向序列。Coiled-coil预测在120-140之间，可能存在一卷曲的-卷曲区域。

另外，还发现RDCR2中存在多个蛋白修饰位点，共计3个N-糖基化位点、2个cAMP、cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、5个蛋白激酶C磷酸化位点、7个酪蛋白激酶II磷酸化位点、3个N-豆蔻酰化位点、1个酰胺化位点。

2.6二级结构预测。

2.6.1RDCR2蛋白可能出现的α、β及混合型蛋白结构域的比例分别为19.8％、16.6％和63.6％。根据α型：％H＞45、％E＜5；β型：％H＜5、％E＞45；α-β型：％H＞30、％E＞20；其余为混合型的标准，RDCR2应属于一种混合型蛋白(图7)。

2.6.2二级结构的亲水性、表面可及性、可塑性及抗原指数预测。

将编码RDCR2的N端第1个残基定义为1，以此类推，C末端的残基为187。RDCR2表面可及性指的是特定残基或侧链暴露于溶剂的面积，其计算方法与亲水性类似，并进一步考虑了构象因素。结果表明，表面可及性较高的区域有：3-9，45-54，61-72，80-99，113-121，128-133等。

可塑性主要反映分子中肽链各部分的柔性强度，往往位于蛋白质结构的环区，在RDCR2中可塑性较高的主要区域有：45-77，80-92，113-124等。

抗原指数分析综合了亲水性、表面可及性、可塑性及二级结构预测所获得的信息，对于推测RDCR2蛋白质的抗原表位较有价值，可能的蛋白质抗原表位区域：1-11，20-27，32-111，113-135，137-149，178-186等。

2.7 RDCR2的组织分布。

以GAPDH为内标，半定量RT-PCR初步了解RDCR2在正常大鼠不同组织中的分布。2％琼脂糖凝胶电泳见图8。

经3次半定量RT-PCR及辉度扫描，以目的基因与内标GAPDH产物辉度比值×10表示表达丰度，柱型图表示，见图9。

§3 RDCR2在不同糖浓度培养及中药小檗碱干预下原代心肌细胞的表达情况。

3.1不同糖浓度干预原代心肌细胞24h，RDCR2表达有明显差异。重复三次实验，结果均证明高糖浓度下RDCR2表达明显高于低糖浓度(P＜0.05)，这验证了其在糖尿病和非糖尿病大鼠心肌组织表达的结果(图10)。

3.2中药小檗碱(黄莲素)，在临床和基础实验中已经证明有明显降低糖尿病动物模型胰岛素抵抗，协助磺脲类药物降低糖尿病患者餐后血糖的作用。但其在糖尿病各项并发症的作用还尚未有深入研究。

本实验初步应用黄莲素干预不同糖浓度的原代培养心肌细胞，以观察其对新基因表达的影响。结果发现其在高糖浓度培养下心肌细胞RDCR2的表达无明显作用。

§4 PIRES2-EGFP-RDCR2载体构建，初步转染结果

对于实施例4中制备的载体PIRES2-EGFP-RDCR2，通过质粒双酶切和双向测序鉴定，均证实构建成功。

将载体PIRES2-EGFP-RDCR2分别转染入H9C2细胞株(购自ATCC公司)及原代大鼠心肌细胞中。结果表明，转染细胞株时的转染效率高(50％)，而转染原代细胞的效率相对低(30％)。(图11)。SybgreenI实时荧光定量PCR(ABgene公司)证实阳性转染H9C2和心肌细胞表达量明显高于阴性对照。(图12)

实施例5重组RDCR2的产生

RDCR2基因在大肠杆菌中的融合表达

1.RDCR2序列的PCR扩增：

按RDCR2序列设计并合成引物，

上游引物Gp1：

5’-GAAGCTTCAGAGAACCATGGAGTCTGG-3’(SEQ ID NO：5)，

下游引物Gp2：

5’-CTCGAGCACAGGAGGCAGATTTCAG -3’(SEQ ID NO：6)，

扩增可获得600bp的RDCR2序列，编码144个氨基酸；

2.重组构建pMD18T-RDCR2质粒

SD大鼠心肌组织总RNA，逆转录后获得cDNA，用上述方法进行PCR扩增，得到相应序列，测序证实后，割胶纯化。与pMD18T的T载体16℃连接过夜(详见TAKARA公司说明书)。

3.感受态细菌的制备

无铂丝蘸取-70℃冻存的E.coli(DH52)，在LB平板上划线接种，平板置于37℃16h；挑取单菌落置于5ml LB培养基中，37℃振摇16h；取1ml上述培养液接种到一含有50mlLB培养基的烧瓶中，37℃振摇培养3h，测A600，待其值达到0.3-0.4时将烧瓶取出，立即置冰浴10min；在无菌条件下将细菌转移到一消毒过的预冷的50ml离心管；4℃4000rpm离心10min，弃去上培养液，将离心管倒立于滤纸上1min使培养液流尽；向离心管中加入10ml预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液，重悬沉淀的菌体，置冰浴30min；4℃4000rpm离心10min，弃去上清液，将离心管倒立于滤纸上1min；加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，轻轻重悬菌体；将上述菌体置于4℃冰箱中12～24h，然后分装保存于15％的甘油中-20℃备用。

4.质粒的转化

连接产物5μl+感受态细菌200μl→冰浴30min→42℃水浴90s→加入800μl LB培养基，混匀→37℃振摇90min(120rpm)→将菌液接种于含有10μg/ml氨苄青霉素及IPTG/X-Gal的LB培养板上→培养板于37℃正放30min→37℃倒放20h→挑取白色菌斑，接种于5ml含有10μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中→37℃振摇(120rpm)

小规模纯化质粒(详见北京博大泰克说明书)，纯化质粒EcoII和SalI双酶切和ABI3700测序鉴定，证实RDCR2片段被插入pMD18T载体，pMD18T-RDCR2质粒构建成功

5.重组质粒pGEX-4T-RDCR2的构建，

将pMD18T-RDCR2用EcoII和SalI双酶切获得RDCR2片段，定向插入载体pGEX-4T-1的MCS。应用上述方法将质粒转化抽提，双酶切鉴定按文献设计5’端pGEX-4T-1(869-891)测序引物5’-GGGCTGGCAAGCCACCTTTGGTG-3’(SEQ ID NO：7)。进行测序证实GST-RDCR2克隆成功

6.GST-RDCR2融合蛋白的表达纯化

按PIERCE公司和Phamacia公司产品手册操作。

7.表达鉴定及条件优化：

(1)将筛选获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取新鲜单个菌落于5ml2×YT液(含100μg/ml Amp)中，37℃200rpm振摇过夜；

(2)将饱和菌液以1∶100比例转接于5ml 2×YT液中，37℃振摇培养3-4h至A6000.5；

(3)加入IPTG至终浓度为300μM，37℃，250rpm下继续培养4h。4℃、7000g离心收集菌体沉淀，细菌裂解液破碎，按诱导前全菌、诱导后全菌、上清、沉淀进行SDS-PAGE。电泳胶的配制：底层使用12％分离胶(10ml含30％聚丙烯胺4ml、1.5mM Tris(pH 8.8)2.5ml、10％SDS 0.1ml、10％过硫酸胺0.1ml、TEMED 4μl、ddH₂O 0.1ml)，灌注适当高度后，覆盖一层饱和正丁醇，胶聚合后ddH₂O洗数次，吸干；配制5％成层胶(2ml含30％聚丙烯胺0.33ml、1.0mM Tris(pH 6.8)0.25ml、10％SDS 0.02ml、10％过硫酸胺0.02ml、TEMED 1μl、ddH₂O 1.4ml)，聚合后拔出梳子，电泳缓冲液冲洗上样孔。蛋白样品与2×SDS凝胶加样缓冲液等体积混匀，置100℃5min后上样，于4℃，100V恒压在1×Tris-甘氨酸缓冲液中电泳0.5h后，将电压改为150V至结束。

(4)电泳结束后取出凝胶，考马斯亮兰染色，脱色。根据电泳结果，取表达最佳的单个克隆接入3ml 2×YT/Amp培养液中，37℃，250rpm培养4-5h至A₆₀₀1.5，加入终浓度为15％的甘油，混匀后分装于0.5ml离心管，-70℃保存。

(5)取上述菌落，同法进行表达分析，分别在33℃、35℃、37℃三个温度段，IPTG诱导后继续培养4、6、8h，取少量样品，制备电泳样品，按全菌、上清、沉淀进行SDS-PAGE。选择最佳表达条件(包括可溶性及表达产量)。

8.原核表达及融合蛋白的纯化

(1)取10ul复融的甘油菌种接入10ml 2×YT培养液于100ml三角瓶中，30℃、250rpm，振荡培养过夜；

(2)按2％比例接种入250ml的2×YT培养基中，37℃培养至A₆₀₀为0.5时，加入IPTG至终浓度0.3mM；

(3)改35℃继续培养4h后收获菌体，7000rpm离心10min沉淀菌体；

(4)将菌体重悬于细菌裂解液10ml中直至液相均一，室温下轻微振荡10min。

(5)将裂解液14000rpm离心15min，菌液上清加入1mL固化谷胱苷肽树脂室温震荡10min，2500rpm离心10min；

(6)弃上清，加入0.25ml洗涤缓冲液重悬树脂，将其移入B-PER^TM纯化柱中，10000rpm离心2min；

(7)加入0.5ml洗涤缓冲液，孵育5min，10000rpm离心2min；

(8)另取0.5ml洗涤缓冲液，配制洗脱缓冲液(含还原型谷胱苷肽15mg)；(9)将洗脱液加入B-PER^TM纯化柱，孵育5min，10000rpm离心2min；收集离心洗脱液，其中含有表达产物GST-RDCR3。取10ul样品与诱导前、诱导后全菌样品进行SDS-PAGE，灰度扫描分析目的蛋白并计算其在总蛋白中的含量。

9..表达产物的免疫印迹鉴定

9.1融合蛋白GST-RDCR3进行SDS-PAGE。

9.2转膜

电泳完毕，取下凝胶，切一张和凝胶等大的硝酸纤维素膜(NC膜)和2张Whatman3MM滤纸，按滤纸、凝胶、NC膜、方向排好，排除各层气泡，前后端用海棉和多孔有机玻璃板加紧，置电转移槽中。在转移缓冲液中恒压100V，电转移1.5h，SDS-PAGE分离后的凝胶中蛋白电转移至硝酸纤维素膜。

9.3.免疫印迹实验

(1)将NC膜放入可热密封塑料袋，加5ml封闭液(TTBS，0.1％(v/v)Tween20，100mMTris.Cl(pH 7.5)，0.9％(w/v)NaCl)，室温置摇床1h；

(2)将NC膜放入用封闭液以1∶1000稀释的羊抗人GST多克隆抗血清中^[12]，37℃孵育1h；

(3)TTBS缓冲液洗膜，5min×3次；

(4)将NC膜移入用TTBS以1∶1000稀释的IgG-HRP二抗中，37℃孵育1h；

(5)TBS洗膜，5min×3次；

(6)置DAB(50mg DAB/100ml PBS缓冲液+10ul 30％ H₂O₂)中显色；

(7)条带显示清楚后自来水冲洗，终止反应。

实施例6抗RDCR2蛋白抗体的产生

将实施例5中获得的重组大鼠RDCR2蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀大鼠RDCR2蛋白基因翻译产物的能力加以评估。

结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生结合。

实施例7

筛选影响RDCR2蛋白表达的物质

在本实施例中，重复实施例3的培养，不同点在高糖条件下，在培养液中加入500μg/L黄连素，作为测试组。另外，在无黄莲素存在下，培养大鼠心肌细胞作为对照组。

在培养48小时，用RT-PCR法测定测试组和对照组中RDCR2蛋白的表达情况，结果显示，测试组中RDCR2蛋白的表达量与对照组基本上无区别，这表明黄莲素不是抑制RDCR2蛋白表达的物质。

实施例8

检测转染PIRES2-EGFP-RDCR2成功的心肌细胞线粒体功能及凋亡

在本实施例中，将实施例4中构建的PIRES2-EGFP-RDCR2(阳性)以及空质粒PIRES2-EGFP(阴性对照)分别瞬时转染原代心肌细胞，转染试剂(Quiagen公司Effectene)，转染后48小时可见绿色荧光蛋白表达。此时在活细胞状态下采用MitoTRACK RED(Moleculer ProbeInvitrogen公司)的线粒体示踪剂标记心肌细胞线粒体。或在转染后即用低糖(葡萄糖浓度＝5.6mM)和高糖(葡萄糖浓度＝25mM)继续培养48小时后，采用原位染色的方法用VybreenV(Moleculer Probe Invitrogen公司)观测转染阳性细胞在不同糖浓度干预后凋亡情况。

结果显示：在转染阳性细胞中，绿色荧光基本与线粒体染色共定位，但其线粒体染色明显低于未转染细胞，可见RDCR2的确表达在线粒体膜，而高丰度表达RDCR-2的细胞内线粒体电势位消失，线粒体功能受损(见图13)。而在凋亡实验中，转染阳性细胞在低糖培养条件下凋亡率与高糖培养条件下阴性对照心肌细胞的无差异，但要高于同样低糖培养下的阴性对照心肌细胞(见图14)。

讨论

本发明用方法建立的2型糖尿病动物模型，其特点主要是胰岛细胞受损程度较轻微、高血糖、高血脂与胰岛素抵抗并存，这与人类普通2型糖尿病发生、发展过程相似。在该模型建立后即半个月左右时间可观察到心肌组织线粒体嵴发达，排列密集；1.5个月时可见肌原纤维排列紊乱、线粒体的空泡变性等现象，与单纯STZ诱导的糖尿病大鼠模型心肌改变相似。而在前半个月乃至模型建立前予以高脂饮食的2个月，以及单纯高脂饮食4个月并不能观察到心肌超微结构的这些明显改变，提示在相同时间内高血糖或高血糖合并高血脂对心肌的影响程度更大。线粒体的变性导致三羧酸循环障碍，ATP生成减少，影响心脏的能量供给。肌原纤维是心脏收缩的结构单位，排列紊乱和断裂必然降低心脏收缩功能。本发明中2型糖尿病发生后心脏组织的超微结构包括线粒体的数量和质量、肌原纤维、毛细血管、细胞间质等先后发生改变，这种改变是一种渐进的过程，并无截然时间界线。

组织结构和功能的变化无不源于基因的选择性表达。本发明采用的HIEROGLYPHTMmRNAProfile通过特异性引物的优化设计，随机引物和锚定引物的片段较长，在荧光DDRT2PCR过程中允许更为严格的退火条件，有效防止碱基错配，降低非特异性产物的形成，具有重复性好、假阳性低的特点。以DDRT2PPCR方法进行筛查，糖尿病组和正常对照组大鼠心脏某些基因在发生上述超微结构改变前其mRNA水平表达已存在差异。

进一步的细胞学实验也证明在用高糖干预原代培养新生大鼠心肌细胞后，RDCR2的表达明显升高。通过上述研究，克隆获得新基因RDCR2，在不同位置设计特异引物多次PCR、T-A克隆、测序证实了它的存在和序列的准确性。

GCG软件包的Spscan预测RDCR2的类信号肽区域位于144-175，即蛋白的C端。类信号肽是疏水性的一段结构，可以是信号肽或膜蛋白的跨膜区。由于信号肽(signal peptide，SP)是分泌蛋白质前体的15-30个碱基组成的导向序列，多位于N-端，通过识别膜表面的信号肽受体介导新生肽进入内质网或细胞内膜并不断延伸。因此RDCR2可能是一种膜蛋白，定位于如细胞胞膜、线粒体、核膜、内质网等亚细胞器的膜上。这与PSORT预测它在158-174处存在一跨膜区域以及Garmier-Robson和Chou-Fasman方法预测其疏水区域位于这一相应位置相符。根据预测获悉该蛋白各亲水性区域程度不高，可以排除是一种细胞胞膜蛋白的可能。结合PSORT蛋白亚细胞定位预测，该蛋白属于一种Ib型膜蛋白(Nexo Ccyt)，暴露于胞浆的尾部约有14个残基(175-187)，在氨基酸残基5位置附近可能有类似线粒体导向序列(mitochondrialtargeting peptide，mTP)。mTP能够引导胞浆中合成的蛋白质定位到线粒体内外膜，这一导向序列在完成导向任务后由线粒体加工蛋白酶水解切除。

实际上，与RDCR2具同源的bnip3以及pro-apoptotic protein(BNIP3L)正是一种线粒体膜蛋白。bnip3在酵母和哺乳动物细胞中表达，是bcl-2家族蛋白中的一员，与bcl-2、bcl-Xl和CED相互作用(Imazu T，Shimizu S，Tagami S，等人Bcl-2/E1B 19 kDa-interacting protein 3-likeprotein(Bnip3L)interacts with bcl-2/Bcl-xL and induces apoptosis by altering mitochondrialmembrane permeability.Oncogene.1999，18：4523)，介导Bcl-2/Bcl-XL异二聚体产生，启动凋亡程序，并增加其他细胞死亡信号所诱导的凋亡作用。bnip3某些位点突变研究说明NH端(残基1-49)和跨膜区(transmembrane，TM)对Bcl-2异二聚体的产生起关键作用。这些蛋白以TM功能域为介导定位于线粒体外膜、内质网或核膜，松弛地与线粒体膜相连直至凋亡信号的出现改变自身位置，与线粒体外膜紧密相联，形成N端在胞浆、C端在膜内的布局(5.YasudaM，Theodorakis P，Subramanian T等人Adenovirus E1B-19K/BCL-2 interacting protein BNIP3contains a BH3 domain and a mitochondrial targeting sequence.J Biol Chem.1998，273：12415；RayR，Chen G，Vande Velde C，等人BNIP3 heterodimerizes with Bcl-2/Bcl-X(L)and induces cell deathindependent of a Bcl-2 homology 3(BH3)domain at both mitochondrial and nonmitochondrial sites.JBiol Chem.2000，275：1439.)。与凋亡相关的RDCR2表达差异在心血管并发症的早期即已发生，这值得注意。近年研究表明，血管内皮细胞凋亡与多种心血管疾病有关，促进动脉粥样硬化形成的介质(如血管紧张素2、氧化型LDL、氧自由基等)均能诱导血管内皮细胞凋亡，而抑制其形成的因子(如NO、氧化抑制剂等)可防止内皮细胞凋亡(Dimmmeler S.Apoptosis ofendothelial cells，contribution to the pathophysiology of atherosterosis.Eur cytokine netw.1998，9：697)。

本发明首次提出RDCR2蛋白与心血管慢性并发症的关系，观察到包括线粒体在内病变的早期病理形态尚未发生改变时RDCR2基因表达的差异，而且随着病情的发展RDCR2表达增加，与线粒体的变性平行。虽然线粒体在诱导细胞死亡中通过凋亡源性蛋白的释放、中断电子转运/氧化磷酸化、增加氧化应激等作用是有目共睹的，RDCR2过表达时还会通过线粒体体大孔径电导通道(渗透性改变孔)释放凋亡因子，RDCR2与线粒体的关系，包括与两者功能域的相互作用和随之而来的凋亡级联反应仍不为人所知。研究表明，RDCR2可能与心肌细胞在缺氧合并酸中毒的情况下导致的线粒体膜电位改变，线粒体肿胀相关。最终使心肌细胞能量匮乏直至调亡及坏死。

钙结合素(calbindin)D28蛋白，属EF手形的钙结合蛋白家族，它能提高钙通道或Ca⁺⁺-Mg⁺⁺-ATP酶的活性从而增加腔膜对钙的摄取；钙浓度的改变也影响钙结合素D28的表达。RDCR2与钙结合素D28存在一定同源性，提示它同时可能是一种钙调类蛋白。钙离子浓度的调节有严格的时间顺序、空间间隔和限制。钙不但可以作为胞内次级信使进一步启动钙信号系统参与广泛的生理过程，它在IP3/Ca⁺⁺和DG/PKC双信使系统本身的调节上也是非常重要。细胞内钙稳态失调是许多外界因素引起细胞死亡的共同机制。有文献报道，在DM状况下血管内皮内Ca⁺⁺浓度增加，将激活Ca⁺⁺依赖性激酶或磷酸酶，诱导与调亡有关的基因表达；同时激活蛋白酶和核酸内切酶，诱发DNA的损伤。

经PROSITE发现RDCR2有多个cAMP、cGMP、蛋白激酶C依赖的蛋白激酶和酪蛋白激酶磷酸化位点，推测该类蛋白能够接受多种信号的调控。在氨基酸序列120-140之间，存在的coiled-coil区域，证实它本身也可参与信号的转导。

另外，RDCR2组织表达谱广泛，以胰腺、脂肪、肝脏等糖代谢调节关键组织中表达较高。

非编码区域同源性较低，决定了在转录、翻译过程中调控方式的差异。在新克隆的全长RDCR2非编码区发现若干转录调控基序，如转录起始因子、单个锌指转录因子、CCAAT/增强子等。这提示可能通过调控序列的干预调节RDCR2的表达。

RDCR2还为治疗糖尿病性心血管病变药物筛选提供新的候选靶点。例如，可以将候选物质添加到高糖条件下培养的心肌细胞培养物中，观察其对RDCR2表达影响。

目前不断新开发的糖尿病治疗药物的疗效中都会有提及对糖尿病慢性并发症的作用：比如对于磺脲类药物可能作用于心肌上类似胰岛细胞的钾离子通道而影响糖尿病患者的心脏功能，而噻唑皖二酮类又可能参与心肌的保护机制，任何与糖尿病性心血管病变相关的基因都可以作为糖尿病治疗药物对患者心脏影响的筛选指标。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                         序列表

<110>上海市内分泌代谢病研究所

<120>糖尿病性心血管病变相关基因及其用途

<130>050055

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1594

<212>DNA

<213>大鼠(rat)

<220>

<221>CDS

<222>(86)..(646)

<223>

<400>1

 gagcggcgca agctgccctg ctacctctca gtggtcactt cccaggcctg tcgcagttgg     60

 gctccggctc ctttgcggag ccacc atg tcg cag agc ggg gag gag aac ctg      112

                             Met Ser Gln Ser Gly Glu Glu Asn Leu

                             1               5

cag ggc tcc tgg gta gaa ctg cac ttc agc aat ggg aat ggg agc agc       160

Gln Gly Ser Trp Val Glu Leu His Phe Ser Asn Gly Asn Gly Ser Ser

10                  15                  20                  25

gtt cca gct tcc gtc tct att tat aat ggt gac atg gaa aaa ata ctg       208

Val Pro Ala Ser Val Ser Ile Tyr Asn Gly Asp Met Glu Lys Ile Leu

                30                  35                  40

ctg gat gcg cag cat gaa tct gga cga agc agc tcc aag agc tct cac       256

Leu Asp Ala Gln His Glu Ser Gly Arg Ser Ser Ser Lys Ser Ser His

            45                  50                  55

tgt gac agc cca cct cgc tcc cag aca cca caa gat acc aac aga gct       304

Cys Asp Ser Pro Pro Arg Ser Gln Thr Pro Gln Asp Thr Asn Arg Ala

        60                  65                  70

gaa ata gac acc cac agc ttt ggt gag aaa aac agc act ctg tct gag       352

Glu Ile Asp Thr His Ser Phe Gly Glu Lys Asn Ser Thr Leu Ser Glu

    75                  80                  85

gaa gat tat att gag aga aga aga gaa gtt gaa agt atc ctg aag aaa       400

Glu Asp Tyr Ile Glu Arg Arg Arg Glu Val Glu Ser Ile Leu Lys Lys

90                  95                  100                 105

aac tca gat tgg ata tgg gat tgg tca agt cgg cca gaa aat gtt ccc       448

Asn Ser Asp Trp Ile Trp Asp Trp Ser Ser Arg Pro Glu Asn Val Pro

                110                 115                 120

ccc aag gag ttc ctt ttt aaa cac ccg aag cgc aca gct act ctc agc       496

Pro Lys Glu Phe Leu Phe Lys His Pro Lys Arg Thr Ala Thr Leu Ser

            125                 130                 135

atg aga aac aca agc gtt atg aag aaa ggg ggt att ttc tca gca gac       544

Met Arg Asn Thr Ser Val Met Lys Lys Gly Gly Ile Phe Ser Ala Asp

        140                 145                 150

ttt ctg aag gtt ttc ctt cca tct ctg tta ctg tct cat ctg tta gcc       592

Phe Leu Lys Val Phe Leu Pro Ser Leu Leu Leu Ser His Leu Leu Ala

    155                 160                 165

att gga ttg ggg atc tac att gga agg cgt ctg aca act tcc act agt      640

Ile Gly Leu Gly Ile Tyr Ile Gly Arg Arg Leu Thr Thr Ser Thr Ser

170                 175                 180                 185

acc ttt tgatgagact tggatctgcc ttctgctcac acagtgagga ttcacgctga       696

Thr Phe

gctgtgacag ctaattgaag agctagcatg atccttgggt gtctgcacta tgtgtgttta    756

tttgttttgt aaatgcggtg ttcctgattt agtgagacag aatagactct taccacgacc    816

tataattata cctatgggat caattaataa gcatgtcaga ctgatgccta ttgtagcatt    876

tattagtaaa tttctttgaa tatattagat ataaatagta taaataattt taatatagta    936

gcaatagtgt atttaaaaat gatctgtaat tgtaatccag ttaagacacc ttacacttca    996

aaagaatgac ttaagtgata ttaaaatcat taaagggttt tccccaaagg aattctgtgg   1056

ccttataatc ctattatgta gtagaaaatt aaagggtgtg ggttatttgt aaaggcctct   1116

tactttatga attcagtagc aaggagagac taaggttacc cacaaactcc actttgcagt   1176

ccccctcttc ttgcttgcag gatgaggatt ccagccttgc tgtccaccat taccttgggt   1236

gggcagttgt gttacgcctt tatctctctg ctgagtgaag ttctacggtt tgtacttaaa   1296

ttttgtgtgc ttttaaaatc agctgtattg taagcaaatc tgtctacttt aaaagactgg   1356

aaatgaaaaa aatctttgcc aaattctttg gggaatactg gatttgcata tgaattaatc   1416

agtatccagc acttctgtta aatcaggcgt cctcccagtc ttctcttttc tatagcatgg   1476

ctttaaagcc tgcctccttg acatgctgta tatatgctat tgtatttgtg tcattgtccc   1536

acacttaact caggtgtgct aaaaataaaa gtaattttta acagtcaaaa aaaaaaaa     1594

<210>2

<211>187

<212>PRT

<213>大鼠(rat)

<400>2

Met Ser Gln Ser Gly Glu Glu Asn Leu Gln Gly Ser Trp Val Glu Leu

1               5                   10                  15

His Phe Ser Asn Gly Asn Gly Ser Ser Val Pro Ala Ser Val Ser Ile

            20                  25                  30

Tyr Asn Gly Asp Met Glu Lys Ile Leu Leu Asp Ala Gln His Glu Ser

        35                  40                  45

Gly Arg Ser Ser Ser Lys Ser Ser His Cys Asp Ser Pro Pro Arg Ser

    50                  55                  60

Gln Thr Pro Gln Asp Thr Asn Arg Ala Glu Ile Asp Thr His Ser Phe

65                  70                  75                  80

Gly Glu Lys Asn Ser Thr Leu Ser Glu Glu Asp Tyr Ile Glu Arg Arg

                85                  90                  95

Arg Glu Val Glu Ser Ile Leu Lys Lys Asn Ser Asp Trp Ile Trp Asp

            100                 105                 110

Trp Ser Ser Arg Pro Glu Asn Val Pro Pro Lys Glu Phe Leu Phe Lys

        115                 120                 125

His Pro Lys Arg Thr Ala Thr Leu Ser Met Arg Asn Thr Ser Val Met

    130                 135                 140

Lys Lys Gly Gly Ile Phe Ser Ala Asp Phe Leu Lys Val Phe Leu Pro

145                 150                 155                 160

Ser Leu Leu Leu Ser His Leu Leu Ala Ile Gly Leu Gly Ile Tyr Ile

               165                  170                 175

Gly Arg Arg Leu Thr Thr Ser Thr Ser Thr Phe

            180                 185

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<400>3

gtaatacgac tcactatagg gc                                              22

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>引物

<400>4

agcggataac aatttcacac agga                                            24

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>引物

<400>5

gaagcttcag agaaccatgg agtctgg                                         27

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>引物

<400>6

ctcgagcaca ggaggcagat ttcag                                           25

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>引物

<400>7

gggctggcaa gccacctttg gtg                                             23

Claims (10)

1.一种分离的RDCR2多肽，其特征在于，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有在高糖环境下启动心肌细胞线粒体途径诱导细胞凋亡作用功能的由(a)衍生的多肽。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中86-646位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中1-1594位的序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

8.一种多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出RDCR2蛋白多肽。

9.RDCR2基因或蛋白的用途，其特征在于，用于制备检测2型糖尿病性心血管病变的试剂或作为筛选RDCR2表达的抑制剂。

10.一种筛选影响RDCR2蛋白表达的物质的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在测试物质存在下，培养大鼠心肌细胞作为测试组，并且在无测试物质存在下，培养大鼠心肌细胞作为对照组；

(b)测定测试组和对照组中RDCR2蛋白的表达情况，其中如果测试组中RDCR2蛋白的表达量显著高于对照组就表明该测试物质是促进RDCR2蛋白表达的物质，如果测试组中RDCR2蛋白的表达量显著低于对照组就表明该测试物质是抑制RDCR2蛋白表达的物质。

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