UA74772C2 - Compound for simulating activity of multiple lineage protein kinase and a method for identifying the compound; method for simulating activity of multiple lineage protein kinase (variants) - Google Patents

Compound for simulating activity of multiple lineage protein kinase and a method for identifying the compound; method for simulating activity of multiple lineage protein kinase (variants) Download PDF

Info

Publication number
UA74772C2
UA74772C2 UA2001031963A UA2001031963A UA74772C2 UA 74772 C2 UA74772 C2 UA 74772C2 UA 2001031963 A UA2001031963 A UA 2001031963A UA 2001031963 A UA2001031963 A UA 2001031963A UA 74772 C2 UA74772 C2 UA 74772C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
carbon atoms
group
сно
compound
protein
Prior art date
Application number
UA2001031963A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Cephalon Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cephalon Inc filed Critical Cephalon Inc
Publication of UA74772C2 publication Critical patent/UA74772C2/uk

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/9121—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Description

Опис винаходу
Напрямом даного винаходу частково є способи модулювання представників сімейства кіназ множинних ліній 2 (МІК), способи ідентифікації сполук, які модулюють кіназний білок множинних ліній, і або підвищують виживаність клітин, або стимулюють загибель клітин, способи ідентифікації сполук, які можуть бути придатні для лікування нейродегенеративних захворювань і/або запалення, і способи лікування нейродегенеративних захворювань сполуками, які інгібують кіназний білок множинних ліній.
Сімейство МІК включає в себе групу білків, в яких білкові послідовності кіназних доменів представників 70 сімейства мають близьку схожість з МАРККК, але більш схожі один з одним, чим з іншими МАРККК.
Представники сімейства МІ К охоплюють частину дуже складних кіназних каскадів, таких, наприклад, як каскад передавання сигналу при стресі, в який залучено модулювання в числі інших М-кінцевої кінази с-)ип (МК), яка в свою чергу модулює в числі інших білків фактори транскрипції, включаючи с-)Шп, АТЕ2 і ЕЇ К-1. Кіназа УМК описана |в патентах США 5534426, 5593884, 5605808 і заявці УМО 95/03324|, кожний з цих документів включений 12 тут у вигляді посилання в повному об'ємі.
Сімейство МІК включає в себе, зокрема, наступні групи: 1) кіназу множинних ліній 1 (МІ КІ); 2) кіназу множинних ліній 2 (МІ К2); 3) кіназу множинних ліній З (МІ КЗ), 4) кіназу, що несе лейциновий "зіппер"(17К); 5) кіназу, що несе подвійний лейциновий "зіппер'(0бІК); і б) кіназу множинних ліній б (МІКб) МІКІ має каталітичний домен, схожий як з кіназами, специфічними для Туг, так і з кіназами, специфічними для Зег/ТНг.
ІОогому, еї аІ., Еиг. У. Віоспет., 1993, 213, 701-710). МІК2 також має каталітичний домен, схожий з обома кіназами, специфічними для Туг або Зег/Тпг. (Оогому, еї аїЇ., Еиг. 9. Віоспет., 1993, 213, 701-710. МІ К2 відома також як МВТ. (Кан, еї аІ., Опсодепе, 1995, 10, 1447-1451). МІ КЗ включає в себе білок, який крім кіназного домену містить два лейцинових "зіппери" з примикаючим основним районом на карбоксильному кінці і район, багатий проліном. (под, еї аіІ., Опсодепе, 1994, 9, 1745-1750). МІ КЗ також відома як ЗРЕК |саїюо, еї с 29 а, 9. Віої. Спет., 1994, 269, 15092-15100) і РТКІ (Елое, еї аю, Опсодепе, 1994, 9, 935-938Ї1. І17К є (3 кіназою, що несе лейциновий "зіппер". |(ЗаКита, еї аї., 9. Віої Спет., 1997, 272, 28622-28629|. БІК має кіназний домен і два передбачуваних мотиви лейцинового "зіппера". |Ноії2тап, еї аї., У. Віої. Спет., 1994, 269, 30808-30817)|. 0 К також відома як 2РК ГКеадау, еї аї., Віоспет. Віорпувз. Кевз. Сотт., 1994, 202, 613-620) і МОК |Нігаї, еї аЇ., Опсодепе, 1996, 12, 641-650). Представники сімейства МІ К також описані, наприклад, |в с патентах США 5676945, 5554523, МО 93/15201, патенті Канади 2148898, Оіепег, еї аїЇ.,, Ргос. Май). Асай. Зеї. -
БА, 1997, 94, 9687-9692, РеАїі2ригаа, еї аї., 9. Віої. Спет., 1997, 272, 16364-16373, Типод, еї а), Опсодепе, 1997, 14, 653-659, БЗеїІв, еї аїЇ.. Тгепдз іп Сей Віої., 1997, 7, 161-167, Мага, еї. аїЇ., 9. ВіоЇї. СпНет., - 1996, 271, 16888-16896, Нігаї, ек аїЇ., У. Віої. Спет., 1997, 272, 15167-15173, Рап, еї аї., У. Віої Спет., «г 1996, 271, 24788-24793, Віоціп, ес аі., ОМА апа СеїІ Віо!Ї., 1996, 15, 631-642, Ротбро, еї аїЇ., Маїцге, 1995,
Зо 377, 750-754, Кієїег, єї аі., ЕМВО .., 1996, 15, 7013-7025, Ни, єї аі., Сепез 8. Оєм., 1996, 10, 2251-2264, ЗИ, єї - а, ЕМВО 3., 1997, 16, 1279-1290, і ЮОогому, ек аіІ., Еиг. 9). Віоспет., 1995, 234, 492-500). Недавно в базі даних Е5БТ була ідентифікована інша кіназа, споріднена з МІК. Послідовність ДНК цього клону, МІ Кб, описується сімома елементами, що перекриваються. Ідентифікаційні номери їх клонів: 1007489, 1460085, « 510915, 666323, Г5555, 482188 і 178522, послідовності кожного з яких включені тут у вигляді посилання в З 70 повному об'ємі. Кожне з посилань, цитованих в даному параграфі, включене тут у вигляді посилання в повному с об'ємі.
Із» Недавно було показано, що стабільна експресія 7РК знижує проліферативну здатність фібробластів МІН ЗТ3, що було виміряно за допомогою аналізу утворення колоній. |Вегдегоп, еї а!., Віоспет. Віорпуз. Кев. Сопип., 1997, 231, 153-155). Однак Вегдегоп з співавторами не вдалося представити будь-яких даних, які вказують на 49 те, що 2РК модулював активність субстрату 2РК або що 2РК стимулював загибель клітин. і Було показано, що експресія конструкції, що кодує Мус-МІ К2, в клітинах Зм/ізв ЗТЗ приводить до апоптозу «» приблизно через 20 годин після ін'єкції. (Мадайа, еї аі., ЕМВО .)., 1998,17,149-1581.
Заявники розробили численні індоло- і інденосполуки, які нарівні з іншими діями інгібують ріст клітин, і асоційований з станом гіперпроліферації, і інгібують загибель в різних ембріональних культурах, таких як -і 20 культури ганглія дорсального корінця, смугастого тіла, верхніх шийних гангліїв і мотонейронів. (Патенти США 5475110, 5591855, 5594009, 5461146, 5621100, 5621101, 5705511 і 5756494), кожний з яких поступається місцем із правонаступника даній заявці, включені тут у вигляді посилання в повному об'ємі. Сполуки, перераховані в (патенті США 5705511), що мають формулу 0, вказані в даній заявці як сполуки, що мають формулу І. Заявники також показали, що апоптоз мотонейронів інгібується похідним К-252а, індолокарбазолом, який також модулює 22 каскад передавання сигналу при стресі. |Робота Магопеу еї аї., у). Меиговсі., 1998, 18,104-111| включена тут у
ГФ) вигляді посилання в повному об'ємі.
Внаслідок неадекватності сполук, що відбираються, які модулюють представники каскаду передавання о сигналу при стресі і або стимулюють загибель клітин, або підвищують виживаність клітин, залишається необхідність в нових виборчих способах скринінгу сполук. Крім того, залишається необхідність в скринінгових 60 дослідженнях терапевтичних засобів, які можуть бути придатні при лікуванні запалення і нейродегенеративних захворювань. Даний винахід направлений на досягнення цих, а також інших важливих цілей.
Даний винахід надає способи ідентифікації сполук, які модулюють активність кіназного білка множинних ліній і підвищують виживаність клітин, що включають в себе етапи контактування клітини, що містить кіназний білок множинних ліній, з сполукою, визначення того, чи знижує сполука активність кіназного білка множинних бо ліній, і визначення того, чи підвищує сполука виживаність клітин.
Даний винахід також надає способи ідентифікації сполук, які модулюють активність кіназного білка множинних ліній і стимулюють загибель клітин, які включають в себе етапи контактування клітини, що містить кіназний білок множинних ліній, із сполукою, визначення того, чи збільшує сполука активність кіназного білка
МНОЖИННИХ ліній, і визначення того, чи стимулює сполука загибель клітин.
Даний винахід також надає способи ідентифікації сполук, які можуть бути придатні для лікування нейродегенеративних захворювань, що включають в себе контактування клітини або клітинного екстракту, що містить кіназний білок множинних ліній, із сполукою і визначення того, чи знижує сполука активність кіназного білка множинних ліній. 70 Даний винахід також надає способи ідентифікації сполук, які можуть бути придатні для лікування запалення, що включають в себе контактування клітини або клітинного екстракту, що містить кіназний білок множинних ліній, із сполукою і визначення того, чи знижує сполука активність кіназного білка множинних ліній.
Даний винахід також надає способи лікування ссавця, що хворіє або можливо хворіє на нейродегенеративне захворювання, що включають в себе введення указаному ссавцеві сполуки, яка інгібує або знижує активність 7/5 Кіназного білка множинних ліній.
Даний винахід також надає способи лікування ссавця при запаленні, що включають в себе введення вказаному ссавцеві сполуки, яка інгібує або знижує активність кіназного білка множинних ліній.
Даний винахід також надає способи модулювання активності кіназного білка множинних ліній, що включають в себе контактування білка або клітини, що містить білок, із сполукою, що має формулу ІІ: щі Кі с з Аз А у/тв о с
С | т
Д - /й ую в (СнНут СНУ но) . М
І» ; ра -і щ»
В. Н -і де: що) кільце В і кільце Е, незалежне, і кожне разом з атомами вуглецю, з якими вони зв'язані, вибираються з групи, що складається з: ненасиченого б--ленного карбоциклічного ароматичного кільця, в якому від 1 до З атомів вуглецю можуть бути заміщені атомами азоту; о ненасиченого 5--ленного карбоциклічного ароматичного кільця; і ненасиченого 5-членного карбоциклічного ароматичного кільця, в якому або іме) один атом вуглецю заміщений атомом кисню, азоту або сірки, два атоми вуглецю заміщені атомами сірки і азоту, атомами кисню і азоту, або двома атомами азоту; або три 60 атоми вуглецю заміщені трьома атомами азоту;
В" вибирається з групи, що складається з:
Н, заміщеного або незаміщеного алкілу, що має від 1 до 4.вуглеців, заміщеного або незаміщеного арилу, заміщеного або незаміщеного арилалкілу, заміщеного або незаміщеного гетероарилу, або заміщеного або незаміщеного гетероарилалкілу; бо -С(хО)ВУ, де ВЗ вибирається з групи, що складається з алкілу, арилу і гетероарилу;
-оО879, де Ге вибирається з групи, що складається з Н і алкілу, що має від 1 до 4 вуглеців; -Ф(хо)МмНно, «МА В2, «СНо)рМв ве, «СНо)рОВ Я, -О(СНо)рОВ о ї «О(СНо)р МАВ, де р рівне від 1 до 4; і де або кожний з радикалів В! і 212 незалежно вибирається з групи, що складається з Н і алкілу, що має від 1 до 4 вуглеців; або
В" її В? разом утворять зв'язану групу формули -(СН 2)2Х!-(СНо)»-, де Х! вибирається з групи, що складається з -О-, -5- і -СН»-;
В2 вибирається з групи, що складається з Н, алкілу, що має від 1 до 4 вуглеців, -ОН, алкоксигрупи, що має 70 від 1 до 4 вуглеців, -ОС(-ОВУ, -ОС(-ОМВ В, -Ф(СНо)рме В, «О(СНо)рОв У, заміщеного або незаміщеного арилалкілу, що має від 6 до 10 вуглеців, і заміщеного або незаміщеного гетероарилалкілу; кожний з радикалів Кз, 27, Во і 29 незалежно вибирається з групи, що складається з:
Н, арилу, гетероарилу, Е, СІ, Вг, І, -СМ, СЕз, -«МО», -ОН, «ОВУ, О(СНо)рМв в, -ос(хО)вУ, -ОС(-Оо)Мв2 в, 75 Оос(хоМА в 2, «Ф(СНо)рОВ Я, «СНоОВ Я, «МЕ в», МА о8(х0)289, -«МА'ос(-ОВУ, -СНОВ, де ВУ є залишком амінокислоти після видалення гідроксилу карбоксильної групи; -мв'ос( ОМА в'я, -с0582, -0б(50)В?, (ОМА "В? -сН-МОК?, -сН-МеУ, «СНОМ В, «СНО)рМНА", або «СН-ММВ"ВА, де К?А означає те, що і К2; р. -«(оув2снора(оув, «сНноВ(Оут я, де у рівний 0,1 або 2; що Щ алкілу, що має від 1 до 8 вуглеців, алкенілу, що має від 2 до 8 вуглеців, і алкінілу, що має від 2 до 8 вуглеців, де кожна з алкільної, алкенільної або алкінільної групи незаміщена; або кожна з алкільної, алкенільної або алкінільної групи заміщена групами в кількосії від 1 до 3, вибраними з сч 25 групи, що складається з арилу, що має від б до 10 вуглеців, гетероарилу, арилалкоксигрупи, гетероциклоалкоксигрупи, гідроксиалкоксигрупи, алкілоксиалкоксигрупи, гідроксиалкілтіогрупи, (С) алкоксиалкілтіогрупи, ЕР, СІ, Вг, І, -СМ, -МО», «ОН, -ОВУ, -ху(СснНага)рМв В», -Х7(СНо)рс(-о)МА В, -Х(СНо)дрос(хоМА в'я, -ХЯ(СНо)рсОовВУ, -ХУ(СНо)ра(ОуВУ, -ХУ(СНорМв ос(хоМв вл? 0 -ос(-Ов, -ОСОМНЕ, -О-тетрагідропіранілу, -МВ 872, -МА'9с(5Оо)89, -МЕ со», «МА ос(-ОМе 172, МНС(-МНІМНо, с зо Мв'ов(Оо)2ве, -В(0)уВУ, -СОов2, -С(О)МА В, -с(-0)В2, «СНО, «СнНАММввгА, «СНАМОв?, «СН-МАУ, ча -СН-ММНСН(М-МНМН », -8(-0)2Мв2в2А, -Р(ІХОХОВ 92, «ОВ ії моносахариду, що має від 5 до 7 вуглеців, де кожна гідроксильна група моносахариду незалежно або незаміщена, або заміщена Н, алкілом, що має від'до4 її вуглеців, алкілкарбонілоксигрупою, що має від 2 до 5 вуглеців, або алкоксигрупою, що має від 1 до 4 вуглеців; «
Х2 означає 0, 5 або МВ 19; 35 кожний з радикалів В ії 28 незалежно вибирається з групи, що складається з Н, алкілу, що має від 1 до 4 - вуглеців, алкоксигрупи, що має від 1 до 4 вуглеців, заміщеного або незаміщеного арилалкілу, що має від б до вуглеців, заміщеного або незаміщеного "гетероарилалкілу, -(СНо)рОВ'Я, -«(СНо)рОос(-ОМА "Ві «сном "в'я; або В і Е8 разом утворюють зв'язану групу формули -СН»-Х2-СН»-, де ХО являє собою Х? або « 40 зв'язок; з с кожний з індексів т і п незалежно рівні 0, 1 або 2;
Й Х вибирається з групи, що складається з -О-, -5-, -МЩ(К19)-, -М"(О-) (В 193-, -ЩОВ 9)- і -СН»-; "» 7 вибирається з групи, що складається із зв'язку, -О--СН-СН-, -5-, -(-0)-, -СН(ОВ 793-, -Щ(2193-, -ОВ19-, сн(мв в"23-, «(ож А, -щв'с(-0)-, -(8В(0)увт)-, -Щ(В(Оуме виг), -Мщ(о(о)в3-, -о(в'5вВ)., 45. -МчО-Х879)-, --(ОН)-(СН(ОН)І-, і-СН(О(С-:ОВУСН(ОС(ОВ2А))-, де ВЗА являє собою те ж, що і КУ; і В" 279 незалежно вибираються з групи, що складається з Н, -ОН, -С(-О)В 79, -О(С-О)КУ, гідроксиалкілу і ї- -б0589; -1 В" вибирається з групи, що складається з Н, алкілу, арилу і гетероарилу; 50 А, і А» вибираються з групи, що складається з Н, Н; Н, ов; Нн.-5в2;Н, -Щ2)»; і групи, в якій А; і А» разом 7 утворять фрагмент, вибраний з групи, що складається з 50, -5 і -МА2; до) Ву і В» вибираються з групи, що складається з Н, Н; н-АоВ2; нН.-582; Н-АМЖ(В2)»; і групи, в якій Ву; і Во разом утворять фрагмент, вибраний з групи, що складається з 50, -5 і -МА2; при умові, що, щонайменше, одна з пар А»; і А» або В. і В», утворить 0.
Даний винахід також надає способи модулювання активності кіназного білка множинних ліній, що включають
Ге! в себе контактування білка або клітини, що містить білок, із сполукою, що має формулу ІП: іме) 60 б5 н
Ц її о
ЖІ т в б Ф - 70 о
Ї щу Ї де 714 являє собою Н, і 7» являє собою Н, або 7). і 72» разом утворять 50;
Ку вибирається з групи, що складається з Н, СІ, СН 5505СоНв, Вг, СНОЗ(СНО)»МН»о, СНЬ(СНО)»М(СНЗ)»,
СнЬВ(СНО»МН» п-СаНо, МНСОМНС»Нь, МНСОМНОС»Нь, СН»ЗС»Нз, СНоЗзСеНеь, М(СН3з)», СНз3, СНООСОМНОС»Нв,
МНСОСО»СН», СНОСЬН5, СНоМ(СН»)», ОН, О-Н-пропілу, СНАММН-С(-МНУ)МН», сСНАМ-М(СНг», СМ 29. СсНоВ(СНО»МН-п-СНо, СНгОСНоОСН»СН», СН» 5|3-(1,2,4-триазину)), СНЬСНоЗСН»; о
М М | М ) їч- н -
М Н ч й стою) Сто (С СНо5-« Й | М / /хк т з снов--К, ян х СН-М-М ОО
М -М ,чщ
І
-І во СЮ - СЕН М-М СНя- - 50 (8; М
І» І / х І; х
Ф) сСНн--М-М МС СНаСНІСНУ М о й х/ бо Ко вибирається з групи, що складається з Н, Вг, СІ, І. СН 25(СНаІ»М(СН3з)», МНСОМНОС»Нь, СН»ЗС»Нв,
СнНОоСнНоОоСсНньсН», СН ЗІЗ-(1,2,4-триазину)), СНСНоЗзСН з і СНоООН;
Х вибирається з групи, що складається з Н, СН ОН, СНОМН-серінн, СОСНз, СОМНС»Нв, СНОМНСО»СьНв,
СН»МНОСО»СНЗУ, СНЬМ3, СОМНСоНе, СНоМН-гліцину, СОМ(СН5і)», -СНо.МНСО»- СОМН», СОМНнезН»;,
СНьЬМН-серіну, СНоБОСН», СснН-МОнН, СНоМН-проліну, СНьЬСНаІ(2-піридилу), СНАММНОТ(-МН)МН», 65 СОМН(СНО»ОН, СНАММНСОМНо, СНоОСОСН»З, -СНоОС(СН3з)»О-, СНьЗСеНь, СНьЗОСеНь, СО»Н-гексилу,
СОМНеН» і СОХСНо) СН»; або однієї з наступних формул снеееКІЧНА-Х / і СО : , сом о
Н КІ М і 70 К вибирається з групи, що складається з ОН і ОСН 3. Даний винахід також надає способи модулювання активності кіназного білка множинних ліній, що включають в себе контактування білка або клітини, що містить білок, із сполукою, що має формулу ІМ:
Нн 2 щ о її
К поабаФи я С
Вз вт с щі ТМ о де 74 означає Н і 7» означає Н, або 72. і 25 разом утворять ЗО;
Ку означає Н або ВГ; с зо РЕ» означає Н;
Ез означає Н, СНЄСНАСН», СНОСНЬСНООН, або і -
Ку означає Н, СНЬСНАСН» або СНОСНЬСНООН. М
З метою ілюстрації варіантів даного винаходу деякі деталі показані на малюнках. Однак потрібно розуміти, що цей винахід не обмежений показаними певними варіантами. -
Фігура 1 являє собою схематичний малюнок, на якому показане загальне одержання інденопіролокарбазолів ча з місточковим зв'язком.
Фігура 2 являє собою схематичний малюнок, на якому показано загальне одержання інденопіролокарбазолів з місточковим зв'язком.
Фігура З являє собою схематичний малюнок, на якому показано одержання зв'язаних зі смолою « інденопіролокарбазолів. з с Фігура 4 являє собою схематичний малюнок, на якому показано одержання захищених, розчинних інденопіролокарбазолів. ;» Фігура 5 являє собою схематичний малюнок, на якому показано одержання проміжної сполуки М.
Фігура б являє собою схематичний малюнок, на якому показано одержання інденопіролокарбазолів з
Місточковим зв'язком за допомогою методу А. -І Фігура 7 являє собою схематичний малюнок, на якому показано одержання інденопіролокарбазолів з місточковим зв'язком за допомогою методу В. ве Фігура 8 являє собою схематичний малюнок, на якому показано одержання інденопіролокарбазолів з -І місточковим зв'язком, заміщених в В кільці.
Фігура 9 являє собою схематичний малюнок, на якому показана дериватизація ЄЕ кільця
Ш- інденопіролокарбазолів з місточковим зв'язком.
Ге На Фігурі 10 показана діаграма двох окремих експериментів, що представляє кількість життєздатних диференційованих за нейронним шляхом клітин РОС-12, які залишаються після 5 днів культивування при відсутності МОРГ. Результати виражені у вигляді відсотка від контролю в присутності МОБ в кожній групі (векторний контроль при відсутності МОР, п-12; всі інші групи, п-3). Відмінність між векторним контролем і стабільними пулами клітин, експресуючими домінантний негативний мутант МІК-3, при відсутності МОБ
Ф) статистично значуща, що було визначено за двостороннім Т-критерієм (р«е0,05). ка На Фігурі 11А показано фосфорилування непрацюючої кінази ("мертвої" кінази) 551-5ЕК-1, експресованої бакуловірусами РГАС-МІК-3 (суміш повнорозмірного білка і кіназного домену) з використанням аналізу, бо заснованого на визначенні радіоактивності в гелі.
На Фігурі 118 показаний З2Р-мічений продукт фосфорилування основного білка мієліну, утворений внаслідок кіназної реакції, каталізованої експресованої бакуловірусами РГАС-МІК-3 (суміш повнорозмірного білка і кіназного домену) або кіназним доменом З5Т-МІ К-3.
Фігура 12 являє собою аналіз імуноблотів, на якій показане фосфорилування "мертвої" кінази З5Т-ЗЕК-1, 65 експресованої бакуловірусами РІ АС-МІ К-3 (суміш повнорозмірного білка і кіназного домену), як було визначено за допомогою антитіл, специфічних для фосфорилованої 5ЕК.
На Фігурі 13 показане фосфорилування основного білка мієліну кіназним доменом експресованої бакуловірусами ЗЗІ-МІК-3 з використанням (0) множинного скринінгового аналізу при осадженні трихлороцтовою кислотою, або (г) методу дослідження на фосфоцелюлозних мембранах.
На Фігурі 14 показана крива насичення скріплення | ЗНІК252а, інкубованого з лізатом клітин комах, інфікованих МІ К-3 бакуловірусами.
На Фігурі 15А показана кількість З2Р-міченого с-їмп при імунопреципітації/реакції з кіназою, одержаної з клітин, понадекспресуючих МІ К-3, МІ К-2 або БІК і оброблених або 0,02595 ДМСО (контроль), або 500нМ
К-252а.
На Фігурі 158 показана діаграма кількісного визначення відсотка активності що залишається при імунопреципітації/реакція з кіназою в зразках, приведених в описі до Фіг.15А. Колонки представляють середнє для двох зразків, де величина помилки показує межі середньої.
На Фігурі 15С показана кількість З2Р-міченого с-їічп при імунопреципітації/реакції з кіназою, одержаної з клітин, понадекспресуючих одну тільки НА-)МКІ або в поєднанні з МЕККІ при різних кількостях КДНК, як 72 показано, і оброблених або 0,02595 ДМСО (контроль), або 500нНМ сполуки ПІ-3 (дивись таблицю 3). Колонки представляють середнє для двох зразків, де величина помилки показує межі середньої.
На Фігурі 16 показано, що сполука ПІ-3 підвищує виживаність нейронів залежним від концентрації чином.
Дисоційовані нейрони з симпатичного ганглія (5С)(А), ганглія дорсального корінця (ОКО) (В), циліарного ганглія (СО) (С) і мотонейрони (ММ) (0) культивували в присутності або при відсутності вказаних трофічних 20 факторів. Через 48 годин після посіву підраховували клітини, як описано в матеріалах і методах. Дані представлені у вигляді середнього - стандартне відхилення з визначень в трьох або чотирьох повторах.
Показаний один з трьох експериментів.
На Фігурі 17 показані фазово-контрастні мікрознімки культур Е12 ОКО (А, Е), симпатичних Е9 (В, Б), циліарних Е8 (С, С) і мотонейронів 35,5 (0, Н) після культивування протягом 48 годин (24 години для циліарних с 25 нейронів) в присутності відповідного нейротрофічного чинника (2Онг/ммл МОБ для симпатичних і чутливих Го) нейронів, ТОнг/мл СМТЕ для циліарних нейронів, ЗОмкг/мл м'язового екстракту (МЕХ) для мотонейронів (А-0), або в присутності 1мкМ сполуки 1ПІ1-3 (Е-Н). Смужка-20Омкм.
На Фігурі 18 показаний мікрофотознімок експлантатів гангліїв дорсальних корінців іп мйго. Експлантати
ОКО курчат (Е9) висівали в 9б-лункові планшети в середовище, що містить 0,05906 БСА. Після 2час. періоду сч 30 прикріплення робили добавки: (А) контроль ДМСО; (В) 20Онг/мл МОБ; (С) 250нМ сполуки 1-3. Через сорок вісім ї- годин середовище видаляли, і експлантати фіксували 495 параформальдегідом в фосфатно-сольовому буфері.
На Фігурі 19 показана кількість люмбальних мотонейронів курчати, що виживають на Е10 після щоденної - обробки (Е5-9) певними дозами сполуки 1ІІ-3. Представлені дані є середніми 4 стандартне відхилення для 5-6 «І тварин/групу обробки. Викладений експеримент повторювали два рази. Дані є даними одного типового 35 експеримента і представляють одну сторону поперекового стовпа. "р«0,01, ""р«0,001, за (критерієм Стьюдента - з поправкою Бонферроні між групою, якій вводили сполуку ІІ-3 і контрольною групою.
На Фігурі 20 показана кількість мотонейронів в спиномозговому ядрі БиЇросамегпозиз самиць пацюків (ЗМВ), що виживають на ПНІО або ПНбО після щоденної обробки (ПНІ1-5) сполукою ПІ-3, або контрольним « наповнювачем (595 ЗоіІціоЇїтм). На ПНО (А, В) або ПНбО (В) пацюків забивали і робили зрізи району спинного З 70 мозку, що містить ЗМВ, і обробляли їх для гістології; потім підраховували мотонейрони, забарвлені крезиловим с фіолетовим (Сгезуїесні місіед), в серійних зрізах поперекового 5 - крижового 1 району спинного мозку, як :з» описано раніше |МУіпоїйеїа, еї а!., З(егоїдв, 1975, 26, 311-327). Експериментальні дані являють собою середні стандартне відхилення для 4-8 тварин/групу обробки.
На Фігурі 21 показана втрата ХАТ-імунореактивності після під'язикової аксотомії у дорослих пацюків після -1 обробки сполукою ІПІ-3. Мікрофотографії під'язичного ядра після розтину під'язичного нерва і обробки (А) розчином одного наповнювача (595 Боішіоітм) і (В) 20Омкг сполуки ІШ-3, нанесеним в місце розтину. (С) - Кількість ХАТ-імунореактивних під'язичних мотонейронів після обробок, описаних вище в пунктах (А) і (В). - Результати виражені у вигляді відсоткового вмісту ХАТ-імунореактивних мотонейронів при цьому за 10090 приймали кількість ХАТ-імунореактивних мотонейронів у розташованому на протилежній стороні -і непошкодженому під'язичному ядрі.
Кз На Фігурі 22 показано інгібування шляху МІ К-3, яке відбувається ефективно іп мімо і блокує наступні етапи фосфорилування. На Фігурі 22А показане збільшення імунореактивних при аналізі на тирозингідроксилазу нейронів чорної субстанції після пошкодження МРТР при систематичному введенні сполуки ІПІ-3. Фігура 228
ЯВЛЯЄ собою типовий імуноблот, що показує індуковане МРТР збільшення рівнів фосфорилованої МКК4. На
Фігурі 223 зображений типовий імуноблот і результати ЕГІЗА, що демонструють ослаблення індукованого МРТР (Ф) збільшення рівня фосфорилованого МККА в присутності сполуки ПІ-3.
ГІ На Фігурі 23 показана індукція І/-2 в клітинах Одигкаї. На Фігурі 23А показана тимчасова крива індукції
І/-2. На Фігурі 238 показане інгібування індукції /-2 сполукою 1-3. На Фігурі 23С показане інгібування во індукції І--2 сполукою ІІІ-3 і сполукою 1-4
Наступні терміни, які використані вище і протягом всієї заявки, якщо не обумовлено особливо, потрібно розуміти як терміни, що мають наступні значення.
Термін "апоптоз" стосується особливої морфологічної форми загибелі клітин, що характеризується фрагментацією клітин і їх ядер на мембрано-зв'язані частинки. Апоптоз може бути запущений, наприклад, бе обробкою сполуками, що індукують апоптоз, такими як етопозид, стауроспорин, фактор некрозу пухлини «с, церамід і їм подібні, або в таких умовах, як х-опромінення.
Термін "загибель клітин" стосується загибелі клітин шляхом апоптозу, некротичним або іншим способом, широко відомим фахівцям в даній області. "Загибель клітин" може бути охарактеризована, наприклад, у вигляді зниження загальної кількості клітин або зниження виживаності клітин в порівнянні з необробленими контрольними популяціями клітин. Сполуки, які "стимулюють загибель клітин" приводять, в результаті, до зниження кількості клітин або зниження виживаності клітин в порівнянні з контрольними популяціями. Навпаки, сполуки, які "підвищують виживаність клітин" приводять, в результаті, до збільшення кількості клітин або виживаності клітин, або ці сполуки сповільнюють або знижують швидкість загибелі клітин.
Термін "виборче реагує" або "виборче зв'язує" описує сполуки, які безпосередньо фізично або хімічно /о взаємодіють з білком МІ К. Навпаки, сполуки, які "не виборче реагують" або "не виборче зв'язують" можуть впливати на білки нижче за течією або вище за течією білка МІК, і таким чином можуть впливати на активність білків МІ К, але не взаємодіяти безпосередньо фізично або хімічно з білком МІ К.
Термін "модулює" стосується підвищення або зниження активності конкретного білка або його субстрату.
Частковим напрямом даного винаходу є способи ідентифікації сполук, які модулюють активність білка МІК і або підвищують виживаність клітин, або стимулюють загибель клітин. Сполуки, які в результаті, приводять до збільшення активності білка МІК, можуть стимулювати загибель клітин, тоді як сполуки, які в результаті, приводять до зниження активності білка МІ К, можуть підвищувати виживаність клітин.
МІК білком може бути будь-який білок, віднесений при ідентифікації до МІ К класу білків. Переважно МІ К білок вибирається з групи, що складається з МІ КТ, МІ К2, МІ КЗ (5РЕК, РТКТІ), ІК, ОПІК (РК, МИК) і МІ Кб, які 2о описані вище. У переважних варіантах винаходу ці способи ідентифікують сполуки, які безпосередньо взаємодіють або зв'язуються з МІ К-білком, що визначається за допомогою досліджень скріплення, досліджень кіназ або іншими рівноцінними аналізами.
Щоб ідентифікувати сполуки, які модулюють активність МІ К-білка і стимулюють або виживаність клітин, або загибель клітин, клітину або клітини, що містять МІК білок, піддають контакту із сполукою, що тестується. сч Контактування може відбуватися в буферах або середовищах, добре відомих фахівцям в даній області. В альтернативному випадку контактування може відбуватися іп мімо, при цьому тварину, таку, наприклад, як мишу і) або іншу відповідну тварину, відому фахівцям в даній області, піддають контакту шляхом введення фармацевтичної композиції, що містить сполуку, що тестується і фармацевтично прийнятну сіль, носій або розріджувач. Додатково можуть бути використані варіюючи кількості клітин і концентрації сполук, що с зо тестуються. Визначають, чи збільшує або зменшує сполука, що тестується активність білка МІ К. Крім того, також визначають, чи стимулює сполука, що тестується виживаність або загибель клітин. -
Клітинами, які піддають контакту із сполуками, що тестуються, можуть бути будь-які клітини ссавців. М
Переважно клітиною є нервова клітина. Переважно клітина залучена до нейродегенеративного захворювання. З метою даного винаходу терміни "нейродегенеративне захворювання", "нейродегенеративне порушення" і « "нейродегенеративний стан" взаємозамінні і використовуються, щоб описати будь-яке захворювання або стан, в ї- який залучаються нервові клітини або клітини, зв'язані з нервовою системою, включаючи, але не обмежуючись цим, хвороба Альцгеймера, захворювання мотонейронів, бічний аміотрофічний склероз, хвороба Паркінсона, цереброваскулярне захворювання, ішемічні стани, деменція при СНІДІі, епілепсія, хвороба Гентінгтона і пошкодження при струсі або проникаюче поранення головного або спинного мозку. «
Активність МІК білка може бути визначена багатьма способами. Наприклад, активність МІК може бути п) с визначена шляхом вимірювання активності субстрату МІ К білка. Такі субстрати добре відомі і без великих зусиль відмітні фахівцями в даній області. Переважно субстрат є представником сімейства кіназ мітогеном ;» протеїнкіназ, що активуються або сімейства мітогеном протеїнкіназ, що активуються, або субстрату, що продовжує шлях нижче, які включають в себе, але не обмежені цим, білок, вибраний з групи, що складається з
МК, УМК2, УМКЗ, ЕККТ, ЕКЗ, рЗво, рЗвр, рЗву, раво, МЕКТ, МЕК2, МККЗ, МККА (ЗЕКТ), МЕК5, МКК, МКК, -і |шп, АТЕ2, ЕК! ії гомолог АЕХ-3 ссавців, а також загальні субстрати Зег/ТНг протеїнкіназ, такі як основний білок мієліну (МВР). Реактиви і способи вимірювання активності субстрату також добре відомі фахівцям в даній ть області. Присутність МІ К також може бути визначена шляхом вимірювання кількості МІ К білка або мРНК, що -І кодує МІ К білок. Реактиви, включаючи антитіла і олігонуклеотидні зонди, а також способи вимірювання кількості
ДНК або білка, включаючи нозерн- і вестерн-блотти, добре відомі фахівцям в даній області. Активність МІК
Ше білка також може бути визначена шляхом аналізу кінази іп міго. Аналізи кіназ іп міго добре відомі фахівцям
ГЯ6) в даній області. Інші способи вимірювання активності білка відомі фахівцям в даній області, і мається на увазі, що вони включені в даний винахід. Таким чином, фахівець в даній області може визначити, чи модулює сполука, що тестується (тобто збільшує або знижує) активність МІ К-білка.
Чи стимулює або не стимулює сполука, що тестується виживання клітин або загибель клітин, може бути визначено багатьма шляхами. Переважно підвищення виживаності клітин або стимуляція загибелі клітин іФ) визначається з використанням клітин, для яких існує ризик загибелі, і при порівнянні кількості клітин, які ко зазнавали контакту із сполукою, що тестується і залишилися живими, з кількістю клітин, які не зазнавали контакту із сполукою, що тестується і залишилися живі. Переважно клітинами є первинні ембріональні клітини бо мотонейронів, які заздалегідь запрограмовані на смерть. Первинні ембріональні клітини мотонейронів описані в роботі (Магопеу, еї аї., у). Меийгозсі., 1998, 18, 104-111), яка включена тут у вигляді посилання в повному об'ємі. Первинні ембріональні клітини мотонейронів загинуть, якщо не будуть врятовані за допомогою сполуки, що тестується. Таким чином, більша кількість живих клітин мотонейронів в популяції клітин мотонейронів, оброблених сполукою, що тестується, в порівнянні з кількістю клітин мотонейронів в популяції мотонейронних 65 Клітин, які не були оброблені сполукою, що тестується, є показником сполуки, що тестується, яка підвищує виживаність клітин. Навпаки, менша кількість живих клітин мотонейронів в популяції мотонейронних клітин,
оброблених сполукою, що тестується, в порівнянні з кількістю живих клітин мотонейронів в популяції мотонейронних клітин, які не були оброблені сполукою, що тестується, є показником сполуки, що тестується, яка стимулює загибель клітин.
У іншому варіанті винаходу нормальні клітини, або клітини дикого типу, перетворюють в клітини, для яких існує ризик загибелі, шляхом понадекспресії білка МІК, як описано нижче в прикладах, і потім піддають контакту із сполукою, що тестується. Клітини, понадекспресуючі білки МІК, можуть загинути, якщо не будуть врятовані за допомогою сполуки, що тестується. Понадекспресія білків МІ К може бути досягнута з допомогою векторів, здатних до експресії конкретного білка всередині клітини. Експресуючі вектори добре відомі фахівцям змо В даній області. Крім того, способи підготовки експресуючих векторів також добре відомі фахівцям в даній області. Експресуючі вектори, які експресують будь-які білки МІК, можуть бути одержані способом, подібним тим, які описані в прикладах. Більша кількість живих клітин в популяції понадекспресуючих клітин, оброблених сполукою, що тестується, в порівнянні з кількістю живих клітин в популяції понадекспресруючих клітин, які не були оброблені сполукою, що тестується, є показником сполуки, що тестується, яка підвищує виживаність клітин. /5 Навпаки, менша кількість живих клітин в популяції понадекспресуючих клітин, оброблених сполукою, що тестується, в порівнянні з кількістю живих клітин в популяції понадекспресуючих клітин, які не були оброблені сполукою, що тестується, є показником сполуки, що тестується, яка стимулює загибель клітин.
У іншому варіанті винаходу підвищення виживаності клітин визначається шляхом спостереження або вимірювання зменшення апоптозів. З апоптозом асоційоване стиснення цитоплазми і конденсація ядер. Таким чином, фахівець в даній області може виміряти зменшення апоптозу шляхом вимірювання або спостереження за зменшенням скорочення цитоплазми і/або конденсації ядер. Крім того, фахівець в даній області може виміряти апоптоз із застосуванням традиційних способів фарбування.
У іншому варіанті винаходу для ідентифікації сполук, які стимулюють загибель клітин, можуть бути використані нормальні нервові клітини дикого типу. Нормальні нервові клітини будуть виживати, якщо вони не сч будуть індуковані до смерті сполукою, що тестується. Менша кількість живих клітин в популяції нормальних клітин, оброблених сполукою, що тестується, в порівнянні з кількістю живих клітин в популяції нормальних і) клітин, які не були оброблені сполукою, що тестується, є показником сполуки, що тестується, яка стимулює загибель клітин. Навпаки, більша або рівна кількість живих клітин в популяції нормальних клітин, оброблених сполукою, що тестується, в порівнянні з кількістю живих клітин в популяції нормальних клітин, які не були с оброблені сполукою, що тестується, не є показником сполуки, що тестується, яка стимулює загибель клітин.
Частково даний винахід направлений також на способи модулювання активності білка МІ К, які включають в - себе контактування білка або клітини, що містить білок, із сполукою, що має формулу о (позначена тут як М формула І), заявлену в (патенті США Мо. 5705511), правонаступником якого є даний винахід і який включений тут у вигляді посилання в повному об'ємі. «
Частково даний винахід направлений також на способи модулювання активності білка МІ К, що включають в ї- себе контактування білка або клітини, що містить білок, із сполукою, що має формулу Ії, приведену нижче: н ж М о « її ші с за в лай
Широляв ря о, М - сни у; їх Не
Гл - Х - 50
Ко) ш де:
Ф! 714 являє собою Н, і 7» являє собою Н, або 7). і 72» разом утворять 50;
Ку вибирається з групи, що складається з Н, СІ, СН 5505СоНв, Вг, СНЗ(СНО)2МН»о, СНЬ(СНО)».М(СНЗ)», о СснНьВ(СНО»МН» п-С.Но, МНСОМНС»оН5, МНСОМНОС»Нвь, СНЬЗСоНвь, СНоЗСеНв, М(СНУЗ)», СНз, СНООСОМНС Нв,
МНОСО»СН», СНоОСЬНВ, СНМ(СН 3)», ОН, О-н-пропілу, СнНАММН-С(-МН)МН», СНАМ-Ж(СН»З)», 60 сНоВ(СНО»МН-п-С.НОЯ, СНОСНоОСНоСсН», СН» ЗІ3-(1,2,4-триазину), СНОСНоЗСН з; б5
СНО с / -0 Н ммн--й | сна--0 70 СНО) (Ф) сне) но ай т
М М | СНеЕ- ЇМ-- М о с з» СНОБС й кн) Й
М с їч- . ли У і -
Х Га М / в.
Ко вибирається з групи, що складається з Н, Вг, СІ, І, СН 55(СНО»М(СНаз)», МНСОМНОС»Нв, СНоЗС»Нв,
СнНОоСнНоОоСсНньсН», СН ЗІЗ-(1,2,4-триазину)), СНСНоЗзСН з і СНоООН; «
Х вибирається з групи, що складається з Н, СНООН, СНОМН-серинН, СО»СНз, СОМНС»еНь, СНОМНСО»СьНв, З т0 СН»МНОСО»СНЗУ, СНоМ3, СОМНСоНь, СНазШ-гліцину, СОМ(СН5з)», - СНОМНСО»- СОМН», СОМНнезН», с СНоМН-серину, СНЬБОСН», СснН-МОнН, СНОМН-проліну, СНьЬСНІ(2-піридилу), СНАММНОТ(-МН)МН», "» СОоМН(СНО»ОН, СНАММНСОМНо, СНоОСОСНУЗ, -СН»ОС(СН3з)»О-, СНоЗСеНь, СНьЗОСеНь, СО»Н-гексилу, " СОМНеН » і СОХ(СН») СН»; або однієї з наступних формул
В. по бнееММ / лин СТО
М СОМ о -І 7 і
Із К вибирається з групи, що складається з ОН і ОСН.».
В переважних варіантах винаходу 425 і 225 є Н, Х являє собою СО2СН», Кі означає МНСОМНОС»НвБ, Ко означає
СНЬСН» (2-піридил), і К означає ОН. У інших переважних варіантах винаходу 27.4 і 75» є Н, Х являє собою СО»СН»з, Ку і К» являють собою СН2ОСНоОСН»СН з і К означає ОН; або 7. і 7» є Н, Х являє собою СО2СН», МК. і К» являють собою СН Зз5СНоСН», і К означає ОН; або 7.4, 22, Ку і К» є Н, Х означає СОСН», і К означає ОН; (Ф. або 714, 272, Ку і Ко є Н, Х означає СОХ(СН»), СНУ», і К означає ОН; або 75, 7» і Ку є Н, Ко являє собою СНЬОН, Х ка означає СОСН», і К означає ОН; або 71 і 75 є Н, К, і Ко являють собою Н 2551|3-(1,2,4-триазин)), Х означає
СОСНУ», і К означає ОН; або 42. і 25 с Н, РК. є Вг, К» є І, Х означає СО5СН», і К означає ОН; або 74 і 22 є Н, Ку і Ко» бр являють собою СНоОСНоЬЗСН», Х означає СОСН», і К означає ОН; або 7, 2», К, і К» є Н, Х означає СО5СН», і
К означає ОСН»; або 7. і 75 разом утворять -О, К. і К» є Вг, Х означає СО5СН 5, і К означає ОН.
Напрямом частини даного винаходу також є способи модулювання активності білка МІ К, що включають в себе контактування білка, або клітини, що містить білок, із сполукою, що має формулу ІЇ, приведену нижче: б5
Ві
А М Ві
А А / ВІ линуть тю ВЗ Ту К: з- з» Ка св; М В ї б
Ю
КІ ю Кв (Суп
СНІ
Кг с 7 о с н їч- де: ге кільце В і кільце Е, незалежно, і кожне разом з атомами вуглецю, з якими вони зв'язані, вибираються з «І групи, що складається з: а) ненасиченого 6б-ч-ленного карбоциклічного ароматичного кільця, в якому від 1 до З атомів вуглецю можуть - бути заміщені атомами азоту; р) ненасиченого 5--ленного карбоциклічного ароматичного кільця; і с) ненасиченого 5--ленного карбоциклічного ароматичного кільця, в якому або « 1) один атом вуглецю заміщений атомом кисню, азоту або сірки; з 70 2) два атоми вуглецю заміщені атомами сірки і азоту, атомами кисню і азоту, або двома атомами азоту; або с З) три атоми вуглецю заміщені трьома атомами азоту; :з» В" вибирається з групи, що складається з: а) Н, заміщеного або незаміщеного алкілу, що має від 1 до 4 вуглеців, заміщеного або незаміщеного арилу, 415 заміщеного або незаміщеного арилалкілу, заміщеного або незаміщеного гетероарилу, або заміщеного або -1 незаміщеного гетероарилалкілу; в) -С(хО В, де 2? вибирається з групи, що складається з алкілу, арилу і гетероарилу; е с) -ОВ 9, де КЕ !9 вибирається з групи, що складається з Н і алкілу, що має від 1 до 4 вуглеців; -І а) -С(50)МН», «МА в, «СНОМ В, «СНО, «СНо)рОВИЯ ї «С(СН)рМАе В», де р дорівнює від 1 -1 50 до 4; іде або 1) кожний з радикалів В! і 212 незалежно вибирається з групи, що складається з Н і алкілу, що має від 1
Ко) до 4 вуглеців; або 2) В" ї "2 разом утворять зв'язану групу формули - (СН 2)5-Х!-(СНо)»-, де Х вибирається з групи, що складається з -О-, -5 - і -СНо-; 22 вибирається з групи, що складається з Н, алкілу, що має від 1 до 4 вуглеців, -ОН, алкоксигрупи, що має
ГФ) від 1 до 4 вуглеців, -ОС(О)ВУ, -ОС(О)МА В, «(СНОМ Ве, «О(СНо)рОВ У, заміщеного або незаміщеного 7 арилалкілу, що має від 6 до 10 вуглеців, і заміщеного або незаміщеного гетероарилалкілу; кожний з радикалів Кз, 27, Во і 29 незалежно вибирається з групи, що складається з: во а) Н, арилу, гетероарилу, Б, СІ, Ві, І, -СМ, СЕз, -МО», «ОН, -ОВ?, -Ф(СнНо)Мв В? -ос(-ОУ, -ос(-о)мв2вВ", -ос(-оМв в 2, «О(СНо)рОв о, «СНО Я, «МВ виг, «МВ'98(-0)288, -МА ос(-О)Н8; в) -СН»5ОВ У, де В" є залишком амінокислоти після видалення гідроксилу карбоксильної групи; с) -МА'с(хоОМв вВл?, -с0582, -С(-0)82, с(о)МА" В", -сн-МОоВ?, -сН-МАУ, «СНОМ В, «СНО)РМНА "Я, або -«СН-ММА?В2А, де В2А означає те, що і В2; бо а) -(оув2 «СНо)рВ(ОуВ», -СНоВ(О)уВ , де у рівний 0, 1 або 2;
е) алкілу, що має від 1 до 8 вуглеців, алкенілу, що має від 2 до 8 вуглеців, і алкінілу, що має від 2 до 8 вуглеців, де 1) кожна з алкільної, алкенільної або алкінільної групи незаміщена; або 2) кожна з алкільної, алкенільної або алкінільної групи заміщена групами в кількості від 1 до 3, вибраними з групи, що складається з арилу, що має від б до 10 вуглеців, гетероарилу, арилалкоксигрупи, гетероциклоалкокси групи, гідроксиалкоксигрупи, алкілокси-алкоксигрупи, гідроксиалкілтіогрупи, алкокси-алкілтіогрупи, ЕР, СІ, Вб І, -СМ, -МО», «ОН, -ОКУ, -Х2 (СНо)рМв в, -Х7(СНо)рс( ОМА В, -ХУ(СНо)рОос(ЗоО)МА ВЛ, 0 -ХУ(СНо)рСОоВ 0 -Х7(СНо)рВ(ОУуВ, Х(СНо)рМмв ос(зо)Мв в'я, 0 -ос(-Ов, 70. -ОСОМНВ, -О-тетрагідропіранілу, -МЕ!1812, «-«МВ бс(«о3в8, «МА !9сОо289, Ме ос(хОМА в 72, «-«МНО(-МН МН», мА 'ов(0)289, -В(ОУ, -с0282, с(хоМА вия, -С(-50)В2, «СНоОВ'о, «СН-ММе?вА, «СНАМОК?, -СН-МАУ, -СНЕММНСН(МАМНМН », -5 (х0)2М2В2Х, -Р(-ОХОВ 9)», «ОВ Я | моносахариду, що має від 5 до 7 вуглеців, де кожна гідроксильна група моносахариду незалежно або незаміщена, або заміщена Н, алкілом, що має від 1 до 4 вуглеців. алкілкарбонілоксигрупою, що має від 2 до 5 вуглеців, або алкоксигрупою, що має від 1 до 4 вуглеців; т Х2 означає О, 5 або МВ 19; кожний з радикалів В ії 28 незалежно вибирається з групи, що складається з Н, алкілу, що має від 1 до 4 вуглеців, алкоксигрупи, що має від 1 до 4 вуглеців, заміщеного або незаміщеного арилалкілу, що має від б до вуглеців, заміщеного або незаміщеного гетероарилалкілу, -(СНо)рОВ'У, -(СНо)р ОВ'МА" В? і 20. «СНо)рМА В 2; або В" і К8 разом утворять зв'язану групу формули -СН 2-ХЗ-СН»о-, де Х являє собою Х або зв'язок; кожний з індексів т і п незалежно рівні 0, 1 або 2;
М вибирається з групи, що складається з -О-, -5-, -М(В193-, -М'(О-ХВ193-, -ЩОВ19)- і -«СН»-; 7 вибирається з групи, що складається із зв'язку, -О-, - СНАСН-, -8-, -С(-0)-, -СН(ОВ 719-, -Щ(Е9-, с -щОвВ', сн(мв' В), -с(ощ( 3, -М(В')с(-0)-, -м(8(0)уве), -Щ(В(Оумв в), -М(с(-овВ'- (у -в(В158193-, -М(О-Х8193-, -СН(ОН)-СН(ОН)-, і -СН(ІО(С-ОВУСН(ОС(ОВ 9А)-, де ВЗА являє собою те ж, що і КУ;
В" ї Е"ЗУ незалежно вибираються з групи, що складається з Н, -ОН, -С(-О3В 19, -О(С-ОВ, гідроксиалкілу і -602879; с зо В" вибирається з групи, що складається з Н, алкілу, арилу і гетероарилу;
А, і А» вибираються з групи, що складається з Н, Н; Н, ов; н,-582; НАМ»; і групи, в якій А; і А» разом - утворять фрагмент, вибраний з групи, що складається з 50, -5 і -«МК2; -
Ву і В» вибираються з групи, що складається з Н, Н; н-АОоВ2; нН.-5в82; Н, -Щ2)»; і групи, в якій В; і Во разом « утворять фрагмент, вибраний з групи, що складається з 50, -5 і -МА2; при умові, що, щонайменше, одна з пар А». і А», або В. і В», утворить 50. -
Частково даний винахід направлений також на способи модулювання активності білка МІ К, що включають в себе контактування білка або клітини, що містить білок, із сполукою, що має формулу ІМ, приведену нижче: н « 7. М - с о з г; я бана
І
Ще нова с ь й т В т -І - 50 "з ЇМ де 74 означає Н і 7» означає Н, або 72. і 25 разом утворять ЗО;
Ку означає Н або ВГ;
РЕ» означає Н; (Ф) Ез означає Н, СНЬСН-СН», СНЬСНЬСНЬООН, або » СВСНІСНА М о і
Ку означає Н, СНЄСНАСН» або СНЬСНЬСНООН. 65 У переважних варіантах винаходу Кі, К»о, Ку, 214 і 7» є Н, і Ку означає СНОСНАСН»о. У інших переважних варіантах винаходу К. є Вг і К», Кз, Ка, 214 і 7» є Н; або Ку, К», 24 і 2» є Н і Кз і К; означають СНЬСНАСН»; або
Ку, К», Кз, є Н і К; означає СНЬСНАСН»; або Ку, Ко», 24 і 7» є Н, і Кз і К; означають СНОСНЬСНЬОН; або Ку,
Р», Ку, 44 і 2» є Н і К5з означає "о сНосСНОснУА--М 2СНОСНІ- й
Даний винахід також надає способи ідентифікації сполук, які можуть бути придатні при лікуванні 70 нейродегенеративних захворювань, що включають в себе контактування клітини або клітинного екстракту, Що містить кіназний білок множинних ліній, із сполукою, і визначення того, чи знижує сполука активність кіназного білка множинних ліній. Клітини і їх екстракти включають в себе такі, які описані вище. Сполуки, які виявляються даними способами (тобто, ті сполуки, які інгібують, або знижують активність кіназного білка множинних ліній) можуть бути придатні для лікування нейродегенеративних захворювань. Білок переважно 75 вибирається з групи, що складається з кінази множинних ліній 1, кінази множинних ліній 2, кінази множинних ліній З, кінази, що несе лейциновий "зіппер", кінази, що несе подвійний лейциновий "зіппер", і кінази множинних ліній б. Клітину піддають контакту іп мйго або іп мімо. Переважно активність білка визначають шляхом вимірювання активності або рівня фосфорилування субстрату вказаного білка. Переважно субстрат вибирається з групи, що складається з /МК1, УМК2, УМКЗ, ЕКК!Т, ЕКК2, рЗво, рЗа8р, рЗ3ву, рЗаво, МЕК!І, МЕК2О, МККЗ, МККА (ЗЕКТ), МЕК5, МКК, МКК, |шп, АТЕ2, ЕК і гомолога АЕХ-3 ссавців, а також загальних Зег/Тпг субстратів, таких, наприклад, як основний білок мієліну (МВР). Активність білка також може бути визначена шляхом вимірювання активності субстрату білка, кількості субстрату білка, або мРНК, що кодує субстрат білка.
Активність білка також може бути визначена шляхом аналізу кінази іп міго або аналізу скріплення. Клітинами переважно є первинні ембріональні клітини мотонейронів, клітини, які понадекспресують кіназний білок Ге множинних ліній, або нервова клітина, але може бути будь-яка клітина або клітинний екстракт. Переважно (5) ідентифікуються сполуки, які безпосередньо зв'язують кіназний білок множинних ліній, як описано вище.
Даний винахід також надає способи ідентифікації сполук, які можуть бути придатні при лікуванні запалення, що включають в себе контактування клітини або клітинного екстракту, що містить кіназний білок множинних ліній, із сполукою, і визначення того, чи знижує сполука активність кіназного білка множинних ліній. Клітини с і їх екстракти включають в себе такі, які описані вище. Сполуки, які виявляються даними способами (тобто ті їм сполуки, які інгібують, або знижують активність кіназного білка множинних ліній) можуть бути придатні для лікування запалення. Білок переважно вибирається з групи, що складається з кінази множинних ліній 1, кінази - множинних ліній 2, кінази множинних ліній З, кінази, що несе лейциновий "зіппер", кінази, що несе подвійний « лейциновий "зіппер" і кінази множинних ліній б. Клітину піддають контакту іп мйго або іп мімо. Переважно активність білка визначають шляхом вимірювання активності або рівня фосфорилування субстрату вказаного - білка. Переважно субстрат вибирається з групи, що складається з ХМК, УМК2, УМКЗ, ЕККТ, ЕКК2З, рЗВо, рЗ8р, рЗву, рЗ3во,, МЕКТ, МЕК2, МККЗ, МККА (ЗЕКТ), МЕК5, МКК, МКК, |шп, АТЕ2, ЕК і гомолога АЕХ-3 ссавців, а також загальних Зег/ТНг субстратів, таких, наприклад, як основний білок мієліну (МБР). Активність білка також « може бути визначена шляхом вимірювання активності субстрату білка, кількості субстрату білка або мРНК, що кодує субстрат білка. Активність білка також може бути визначена шляхом аналізу кінази іп мйго або аналізу в) с скріплення. "» Клітинами переважно є первинні ембріональні клітини мотонейронів, клітини, які понадекспресують кіназний " білок множинних ліній, або нервова клітина, але може бути будь-яка клітина або клітинний екстракт. Клітини також включають в себе, не обмежуючись цим, клітини, що беруть участь в запаленні, такі, наприклад, як лімфоцити, макрофаги і інші лейкоцити, добре відомі фахівцям в даній області. Переважно ідентифікуються - сполуки, які безпосередньо зв'язують кіназний білок множинних ліній. ї» Даний винахід також надає способи лікування ссавця, що хворіє або можливо хворіє нейродегенеративним захворюванням, що включають в себе введення ссавцеві сполуки, яка інгібує або знижує активність кіназного - білка множинних ліній. Сполуки, які інгібують або знижують активність кіназного білка множинних ліній, -І 20 включають в себе, не обмежуючись цим, сполуки, що мають формули І, ІЇ, ПІ ї ІМ. Переважні сполуки включають в себе сполуки, приведені вище в описі, які стосуються способу скринінгу сполук, які модулюють активність ще кіназного білка множинних ліній, і або підвищують виживаність клітин, або стимулюють загибель клітин.
Переважним ссавцем є людина. Можна передбачати, що у людини є нейродегенеративне захворювання, якщо у людини с симптоми конкретного нейродегенеративного захворювання, вона відноситься до групи підвищеного 25 ризику, або є нейродегенеративне захворювання в історії сім'ї.
ГФ! Даний винахід також надає способи лікування ссавця при запаленні, що включають в себе введення вказаному ссавцеві сполуки, яка інгібує або знижує активність кіназного білка множинних ліній. Сполука, яка о інгібує або знижує активність кіназного білка множинних ліній, включає в себе, не обмежуючись цим, сполуки, що мають формули І, ІІ, Ш ї ІМ. Переважні сполуки включають в себе сполуки, приведені вище в описі, в 60 зв'язку зі способом скринінгу сполук, які модулюють активність кіназного білка множинних ліній, і або підвищують виживаність клітин, або стимулюють загибель клітин. Переважним ссавцем є людина.
Контактування із сполуками, що мають формули І-ІМ, може відбуватися в буферах, або середовищах, які добре відомі фахівцям в даній області. У альтернативному випадку контактування може здійснюватися шляхом введення фармакологічної композиції, що містить сполуки, які тестується і фармацевтично прийнятну сіль, носій бо або розріджувач, відповідній тварині або ссавцеві, такій, наприклад, як миша або інша придатна тварина, відома фахівцям в даній області. Крім того, можуть бути використані варіюючі кількості клітин і концентрації сполук. Клітинами, які зазнають контакту із сполуками, що тестуються, можуть бути будь-які клітини ссавців.
Переважно клітиною є нервова клітина. Переважно клітина залучена до такого нейродегенеративного захворювання, як, наприклад, хвороба Альцгеймера, захворювання мотонейронів, бічний аміотрофічний склероз, хвороба Паркінсона, цереброваскулярне захворювання, ішемічні стани, деменція при СНІДІ, епілепсія, хвороба Гентінггона і пошкодження при струсі або проникаюче поранення головного або спинного мозку.
Сполуки, що мають формулу І, і способи їх одержання описані в |(патенті США 57055111), який включений тут у вигляді посилання в повному об'ємі. Сполуки, що мають формулу ІП, і способи їх одержання описані в (патентах
США 57418098, 5621100, 5621101, 5461146 і 5756 494 і МО 97/46567|, кожний з яких включений тут у вигляді 7/0 посилання в повному об'ємі. Сполуки, що мають формулу ІМ, і способи їх одержання описані в |патентах США 57418098, 5621100, 5621101, 5461146 і 5 756 494 і МО 97/46567)|, кожний з яких включений тут у вигляді посилання в повному об'ємі.
Сполуки, що мають формулу ІЇ, включають в себе діастереомери і енантюмери у атомів вуглецю, з якими зв'язані заступники В2, В і В8.
Переважними інденопіролокарбазолами з місточковим зв'язком є сполуки, представлені формулою ІІ:
ЕІ і
М І й ді В (б) / (о) ово) м. тк? ї- ча ді 78 « - (СНо)т
М СН
Ж « 2 - с :» і
У деяких переважних варіантах сполук формули ІП БК є Н. В додаткових переважних варіантах Р. є Н, -І гідроксилом або заміщеним або незаміщеним алкілом.
У інших переважних варіантах КУ, В", 2? і 25 незалежно являють собою Н, заміщений або незаміщений е алкіл, галоген, заміщену або незаміщену алкоксигрупу, заміщену або незаміщену аміногрупу або заміщений або -і незаміщений арил. У наступних переважних варіантах К' і КУ незалежно є Н або заміщеним або незаміщеним - 50 алкілом.
У деяких переважних варіантах У означає 0. В додаткових переважних варіантах 7 означає зв'язок, О, З або що) заміщений або незаміщений М. В інших додаткових переважних варіантах т і п незалежно рівні 1 або 2. В деяких особливо переважних варіантах У означає 0, 7 означає зв'язок або 0, і т і п незалежно рівні 1 або 2.
У наступних переважних варіантах А'А? і В'В2 є -О або Н, Н.
У деяких особливо переважних варіантах кожний з В", К7, Вб і В є Н, У означає 750. п дорівнює 1, А'А? і
ГФ) В'в2 є -0 або Н, Н, В? є Н, ОН або нижчим алкілом, ВЗ є Н або заміщеним алкілом, кожний з ВЗ і 8 є Н або т алкоксигрупою, причому метоксигрупа є переважною, 7 означає зв'язок або 0, і т дорівнює 1 або 2.
Деякими особливо переважними варіантами сполук формули ІІ є сполука 1І-1, 1І-2, 1-3, 1І-4а, 11-46, 1-5, 1-6, 1І-7а, 11-76, 11-8, 1І-9, 11-10, 11-11 ії 1-12, представлені нижче в таблиці 1. 60 Сполуки, представлені формулою ІЇ надалі називаються сполукамиці!).
Використаний термін "карбоциклічна" стосується циклічних груп, в яких циклічна частина складається тільки з атомів вуглецю. Терміни "гетероцикло" і "гетероциклічна" стосуються циклічних груп, в яких циклічна частина включає в себе, щонайменше, один гетероатом, такий як о, М або 5.
Використаний термін "алкіл" означає алкільну групу з нерозгалуженим ланцюгом, циклічну алкільну групу або бо алкільну групу з розгалуженим ланцюгом, що має від 1 до 8 атомів вуглецю, таку як метил, етил, пропіл,
ізопропіл, бутил, ізобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, ізоаміл, неопентил, 1-етилпропіл, гексил, октил, циклопропіл і циклопентил. Алкільний фрагмент алкіл-утримуючих груп, таких як алкоксигрупи, алкоксикарбонільні групи і алкіламінокарбонільні групи, має таке ж значення, як і алкіл, визначений вище.
Нижчими алкільними групами, які переважні, є алкільні групи, яким дане визначення вище і які містять від 1 до 4 вуглеців. Термін "алкеніл" означає групи, що включають в себе нерозгалужені або розгалужені вуглеводневі ланцюги, що мають, щонайменше, один подвійний зв'язок вуглець-вуглець. Приклади алкенільних груп включають в себе етенільну і пропенільну групи. Використаний термін "алкініл" означає групи, що включають в себе нерозгалужені або розгалужені вуглеводневі ланцюги, що мають, щонайменше, один потрійний зв'язок /о Вуглець-вуглець. Приклади алкінільних груп включають в себе етинільну і пропінільну групи.
Ацильний фрагмент ацил-утримуючих груп, таких як ацилоксигрупи означає групи. що включають в себе нерозгалужену або розгалужену алканоїльну групу, що має від 1 до б атомів вуглецю, такі як форміл, ацетил, пропаноїл, бутирил, валерил, півалоїл або гексаноїл.
Використаний термін "арил" означає групу, що має від б до 12 атомів вуглецю, таку як феніл, біфеніл і /5 нафтил. Переважні арильні групи включають в себе незаміщені або заміщені фенільні і нафтильні групи.
Використаний термін "гетероарил" означає арильну групу, в якій один або більша кількість атомів вуглецю кільця заміщені гетероатомом (тобто не вуглецевим атомом), таким як О, М або 5. Переважні гетероарильні групи включають в себе групи піридилу, піримідилу, піролілу, фурилу, тієнілу, імідазолілу, триазолілу, тетразолілу, хінолілу, ізохінолілу, бензоімідазолілу, тіазолілу, піразолілу і бензотіазолілу.
Термін "аралкіл" (або "арилалкіл") призначений для позначення групи, що має від 7 до 15 вуглеців, що складається з алкільної групи, несучої арильну групу. Приклади аралкільних груп включають в себе бензильну, фенетильну, бензгідрильну і нафтилметильну групи.
Алкільні групи і алкільні фрагменти, що знаходяться в заміняючих групах, таких як аралкіл, алкоксигрупа, арилалкоксигрупа, гідроксиалкоксигрупа, алкокси-алкоксигрупа, гідрокси-алкілтіогрупа, алкокси-алкілтіогрупа, с алкілкарбонілоксигрупа, гідроксиалкіл і ацилоксигрупа можуть бути заміщеними або незаміщеними. Заміщена алкільна група має від 1 до З незалежно вибраних заступників, переважно гідрокси-групу, нижчу алкоксигрупу, і) нижчу алкокси-алкоксигрупу, заміщену або незаміщену арилалкокси-нижчу алкоксигрупу, заміщену або незаміщену гетероарилалкокси-нижчу алкоксигрупу, заміщену або незаміщену арилалкоксигрупу, заміщену або незаміщену гетероциклоалкоксигрупу, галоген, карбоксил, нижчий алкоксикарбоніл, нітрогрупу, аміногрупу, моно- су зо або ди-нижчу алкіламіногрупу, діоксолан, діоксан, дитіолан, дитіон, фуран, лактон або лактам.
Кожна із заміщених арильних, заміщених гетероарильних і заміщених аралкільних груп має від 1 до З - незалежно вибраних заступників, якими переважно є нижчий алкіл, гідроксигрупа, нижча алкоксигрупа, ї- карбоксигрупа, нижчий алкоксикарбоніл, нітрогрупа, аміногрупа, моно-або ди-нижча алкіламіногрупа і галоген.
Гетероциклічні групи, утворені з участю атома азоту, включають в себе піролідиніл, піперидиніл, « піперидиногрупу, морфолініл, морфоліногрупу, тіоморфоліногрупу, М-метилпіперазиніл, індоліл, ізоіндоліл, ї- імідазол, імідазолін, оксазолін, оксазол, триазол, тіазолін, тіазол, піразол, піразолон і триазол.
Гетероциклічні групи, утворені з участю атома кисню, включають в себе фуранову, тетрагідрофуранову, піранову і тетрагідропіранову групи. "Гідроксиалкільними" групами є алкільні групи, які мають додатково приєднану гідроксильну групу. Галогени «
Включають в себе фтор, хлор, бром і йод. в с Використаний термін "гетероарилалкіл" означає арилалкільну групу, яка містить гетероатом. Термін "окси" означає наявність атома кисню. Таким чином, "алкокси" групами є алкільні групи, які приєднуються за допомогою ;» атома кисню, і "карбонілокси" групами є карбонільні групи, які приєднуються за допомогою атома кисню.
Термін "гетероциклоалкокси" означає алкоксигрупу, яка має гетероциклічну групу, приєднану до її алкільного фрагмента, і термін "арилалкокси" означає алкоксигрупу, яка має арильну групу, приєднану до її -І алкільного фрагмента. Термін "алкілкарбонілокси" означає групу формули -0О-С(-0)-алкіл.
Використаний термін "алкілокси-алкокси" означає алкоксигрупу, яка містить алкілокси заступник, приєднаний ве до її алкільного фрагмента. Термін "алкокси-алкілтіо" означає алкілтіогрупу (тобто групу формули -5-алкіл), -І яка містить алкокси заступник, приєднаний до її шпального фрагмента. Термін "гідрокси-алкілтіо" означає 5о алкілтіогрупу (тобто групу формули -5-алкіл), яка містить гідроксильний заступник, приєднаний до її
Ш- алкільного фрагмента.
Ге Використаний термін "моносахарид" має своє звичайне значення, як простий цукор.
Використаний термін "амінокислота" означає молекулу, що містить як аміногрупу, так і карбоксильну групу.
Варіанти амінокислот включають в себе о-амінокислоти тобто карбонові кислоти загальної формули НООС-СН(МН»)-(бічний ланцюг).
Бічні ланцюги амінокислот включають в себе фрагменти природного походження і неприродного походження. іФ) Бічні амінокислотні ланцюги неприродного походження (тобто невластиві) є фрагментами, які використовуються ко замість бічних ланцюгів амінокислот природного походження, наприклад, в аналогах амінокислот. Дивись, наприклад, |публікацію Іеппіпдег, Віоспетівзігу, Зесопа Еайоп, МУогій Рибіїзпеге, Іпс, 1975, радез 73-75), бо Включену тут у вигляді посилання.
Переважні од-аміноксилоти включають в себе гліцин, аланін, пролін, глутамінову кислоту і лізин, що мають
О конфігурацію, І -конфігурацію або представлені у вигляді рацемату.
Бічні ланцюги наступних типових о-аміноксилот показані нижче в таблиці 1.
Таблиця 1 б5 сн н5-сН.- пОо-сн. нОо-С(чНІИсСН,-5-5- СН, - с, сН.- сн.сн, 5 нОо-сСН. СН сн,.З-Ссн,АСН,- спеисНнеА-СснН.сСН,». н сна- нОо-сСн.СН.- но сн,сщ(оН)- но,К-сн,МнНоееО-сн.- » -
Сна-
Ма о н но, -снН.СН»- сч зо Мн (е0)снНесСнН, м (сно сн- - снсН-сн М с З 7 хм М
М сн.сн,Ссн, т ру " нАМ-СН,.СНАСН.- « н 2 с 40 ни-С(-МНІУМНАСНе.сСН.СН,- хз» НИМ-СТ-О3-МН-АСН.АСНУ СН, в | снеснАСТ(СН)- -І і ік сниеснАСНАСНь є (8) ш СОЮ нНІМ-СниСсниСНиСН, й й й -і У деяких переважних варіантах заміняючі групи для сполук формули І включають в себе залишок
Кз амінокислоти після видалення з неї гідроксильного фрагмента карбоксильної групи тобто групи формули -Ф(50)-СН(МН»)-(бічний ланцюг).
Функціональні групи, присутні в сполуких формули ІІ, можуть містити захисні групи. Наприклад, бічні ланцюги амінокислотних заступників сполук формули І можуть бути заміщені такими захисними групами, як бензилоксикарбонільна або трет-бутоксикарбонільна групи. Захисні групи по суті відомі як функціональні
ГФ) хімічні групи, які можна виборче приєднувати і від'єднувати від функціональних груп, таких як гідроксильні з групи і карбоксильні групи. Ці групи вводяться в хімічну сполуку, щоб зробити такі функціональні групи інертними до умов хімічних реакцій, яких зазнає сполука. Однією з таких захисних груп є бензилоксикарбонільна во (СЬБ7; 7) група. Інші переважні захисні групи згідно з винаходом можуть бути знайдені в |(ОСгеепе, Т.М. апа
УУців, Р.О.М., "Ргоїесіїме Сгошрз іп Огдапіс Зупіпевів" 24. Ед., У/іеуєЗопв, 19911.
Сполуки інденопіролокарбазолів з містечковим зв'язком мають очевидну важливу функціональну фармакологічну активність, яка знаходить застосування в різних сферах, включаючи як дослідницьку, так і терапевтичну області. Ці похідні придатні як терапевтичні засоби. Активність сполук виявляє позитивні впливи б на функціонування і/або виживаність клітин, що відповідають на трофічні фактори. Вплив на функціонування іабо виживаність клітин, що відповідають на трофічні фактори, наприклад, клітин нейронної лінії, показаний за допомогою кожного з наступних досліджень: (1) аналізу холінацетилтрансферази (ХАТМН) в нейронах спинного мозку, що культивуються; або (2) аналізу ХАТМН активності базальних нейронів переднього мозку, що культивуються.
Використаний термін "вплив", що застосовується для випадку модифікації процесів, що позначаються термінами "функціонування" і "виживаність", означає позитивну або негативну зміну. Вплив, який є позитивним, може називатися "підвищенням" або "посиленням", і вплив, який є негативним, може називатися "Інгібуванням" або "пригніченням".
Використані терміни "підвищувати" або "підвищення", модифікації процесів, що застосовуються для випадку, /0 що позначаються термінами "функціонування" і "виживаність, означають, що присутність сполуки інденопіролокарбазолу з місточковим зв'язком надає позитивний вплив на функціонування і/або виживаність клітини, що відповідає на трофічні фактори, в порівнянні з клітиною при відсутності сполуки. Наприклад, але не з метою обмеження, що стосується виживаності, наприклад, холінергічного нейрона, то сполука буде сприяти підвищенню виживаності популяції холінергічних нейронів при ризику загибелі (внаслідок, наприклад, травми, /5 хворобливого стану, дегенеративного стану або природного прогресування) в порівнянні з популяцією холінергічних нейронів, не експонованих з такою сполукою, якщо оброблена популяція буде мати порівняно більший період функціональної активності, чим необроблена популяція.
Використані терміни "інгібувати" і "інгібування" означають, що конкретна відповідь наміченого для дослідження матеріалу (наприклад, ензиматична активність) порівняно знижена в присутності інденопіролокарбазолової сполуки з місточковим зв'язком.
Використаний термін "Кк" стосується сімейства нейротрофічних рецепторів з високою спорідненістю, нині включає в себе ІгКА, ІгКВ ікс, і інші асоційовані з мембраною білки, з якими може зв'язуватися нейротрофін.
Використаний термін інгібування МЕСЕК передбачає застосування, наприклад, при захворюваннях, в яких важливу роль відіграє ангіогенез, таких як тверді ракові пухлини, ендометріоз, діабетична ретинопатія, сч ов псоріаз, гемангіобластома, а також інші очні хвороби і ракові захворювання.
Інгібування їїК передбачає, наприклад, застосування при захворюваннях простати, таких як рак простати і і) доброякісна гіперплазія простати, і для лікування болю при запаленні.
Інгібування рецептора фактора росту, одержаного з тромбоцитів (РОСЕК), передбачає застосування, наприклад, при різних формах неоплазії, ревматоїдному артриті, фіброзі легень, мієлофіброзі, аномальному с зо загоєнні ран, захворювань, що закінчуються серцево-судинними станами, такими як атеросклероз, рестеноз, рестеноз після пластичної операції на судинах і т.д. -
Використані терміни "рак" і "канцерогенний" стосується будь-якої злоякісної проліферації клітин ссавців. М
Приклади включають в себе рак простати, доброякісну гіперплазію простати, рак яєчника, молочної залози, мозку, легень, підшлункової залози, товстої і прямої кишки, шлунка, черевної порожнини, твердої пухлини, рак «
Зв ГОЛОВИ і шиї, нейробластому, ниркоподібно-клітинний рак, лімфому, лейкоз, інші розпізнавані злоякісні процеси ї- в гематопоетичних системах і інші розпізнавані ракові захворювання.
Використані терміни "нейрон", "клітина нейронної лінії і "нейронна клітина" включають в себе, не обмежуючись цим, гетерогенну популяцію типів нейронів, що має єдиний або безліч медіаторів і/або єдину або безліч функцій; переважно це холінергічні і чутливі нейрони. Використана фраза "холінергічний нейрон" означає « нейрони центральної нервової системи (ЦНС) і периферичної нервової системи (ПНО), нейромедіатором яких є пл») с ацетилхолін; типовими є базальні нейрони середнього мозку, нейрони смугастого тіла і спинного мозку. . Використана фраза "чутливий нейрон" включає в себе нейрони, реагуючі на сигнали навколишнього середовища и?» (наприклад, температуру, рух), що поступають, наприклад, від шкіри, м'яза і суглобів; типовим є нейрон ганглія дорсального корінця. "Клітина, що відповідає на трофічні фактори" визначається тут як клітина, яка містить рецептор, з яким -І може специфічно зв'язуватися трофічний фактор; приклади включають в себе нейрони (наприклад, холінергічні і чутливі нейрони) і не нейронні клітини (наприклад, моноцити і неопластичні клітини). ве Описані тут сполуки інденопіролокарбазолів з місточковим зв'язком знаходять застосування як в -І дослідницькій області, так і в області терапії, наприклад, для інгібування активності ферментів. Наприклад, в області наукових досліджень сполуки можуть застосовуватися для розробки методів аналізу і моделей для
Ш- подальшого поглиблення уявлення про ті ролі, які відіграє інгібування серин/греонінової або тирозинової
Ге протеїнкінази (наприклад, РКС, ії тирозинкінази) в механістичних аспектах асоційованих розладів і захворювань. У області терапії сполуки, які інгібують ці ензиматичні активності, можуть застосовуватися для того, щоб інгібувати небезпечні наслідки дії цих ферментів, що стосуються таких захворювань як рак.
Як приклади нижче показано, що інгібування ензиматичної активності з використанням сполук інденопіролокарбазолів з місточковим зв'язком можна визначати, наприклад, за допомогою наступних аналізів:
Ф) 1. Аналіз інгібування активності тирозинкінази ІгКА; ка 2. Інгібування МОБ-стимульованого фосфорилування їїК в препараті цілих клітин; 3. Аналіз інгібування кінази рецептора фактора ендотеліального росту судин (МЕСЕК); во 4. Аналіз інгібування активності РКС; 5. Аналіз інгібування РОСЕК.
Заявлені сполуки інденопіролокарбазолів з місточковим зв'язком можуть бути використані для посилення функціонування і/або виживаності клітин нейронної лінії ссавців, наприклад, людини. У цьому контексті сполуки можуть бути використані окремо або з іншими конденсованими піролокарбазолами і/або індолокарбазолами, або 65 В комбінації з іншими молекулами цілющої дії, які також виявляють здатність впливати на функціонування і/або виживаність вказаної клітини.
Численні неврологічні розлади характеризуються наявністю нейронних клітин, які являють собою вмираючі, пошкоджені клітини, клітини з функціональними порушеннями, що зазнають дегенерації аксонів, з ризиком загибелі, і т.д. Ці розлади включають в себе, не обмежуючись цим хворобу Альцгеймера; порушення мотонейронів (наприклад, бічний аміотрофічний склероз); хворобу Паркінсона, цереброваскулярні порушення (наприклад, інсульт, ішемія); хворобу Гентінггона;х деменцію при СНІДІі; епілепсію; множинний склероз; периферичні невропатії (наприклад, що зачіпають ОКО нейрони при периферичній невропатії, асоційованій з хіміотерапією), включаючи діабетичну невропатію; розлади, індуковані стимулюючими амінокислотами; і розлади, асоційовані з пошкодженнями при струсі або проникаючому пораненні головного або спинного мозку. 70 ХАТМН каталізує синтез нейромедіатора ацетилхоліну, і він вважається ензиматичним маркером функціонального холінергічного нейрона. Функціональний нейрон також здатний до виживання. Виживання нейронів аналізується шляхом кількісної оцінки специфічного поглинання і ферментативного перетворення барвника (наприклад, кальцеїну АМ) живими нейронами.
Описані тут сполуки, включаючи сполуки, ідентифіковані описаними тут способами, завдяки своїм 7/5 різноманітним застосуванням знаходять використання в різних сферах. Сполуки можуть бути використані для розробки іп мйго моделей виживаності, функціонування, ідентифікації нейронних клітин, або для скринінгу інших синтетичних сполук, які мають активність, схожу з активністю описаних тут сполук, або сполук, що ідентифікуються описаними тут способами. Описані тут сполуки, а також сполуки, ідентифіковані за допомогою описаних тут способів, можуть бути використані в області наукових досліджень, щоб вивчити, охарактеризувати і 2о визначити молекулярні мішені, зв'язані з функціональними відповідями. Наприклад, шляхом радіоактивного мічення сполуки інденопіролокарбазолу з місточковим зв'язком, або сполуки, ідентифікованої описаними тут способами, зв'язаної зі специфічною клітинною функцією (наприклад. мітогенезом), може бути ідентифікована, виділена і очищена для характеристики мішені організму, з якою зв'язується похідне.
Сполуки, які тут описані, а також сполуки, ідентифіковані із застосуванням описаних тут способів, між сч іншим, придатні не тільки для посилення індукованої трофічними факторами активності клітин, що відповідає на трофічні фактори, наприклад, холінергічних нейронів, але також можуть функціонувати як засоби, що і) підвищують виживаність нейронних клітин інших типів, наприклад, допамінергічних або глутаматергічних. Фактор росту може регулювати виживаність нейронів за допомогою каскадів передавання сигналу вниз за течією від малих ГТФ-зв'язуючих білків, які включають в себе, не обмежуючись цим, гав, гас і сас42 (Оеппагаї, Віоспет. с зо 3» 1996, 318, 729). Зокрема, активація газ приводить до фосфорилування і активації, що активується позаклітинним рецептором кінази (ЕКК), яка пов'язана з процесами біологічного росту і диференціювання. -
Стимулювання гас/сас42 приводить до збільшення активність МК і р38, відповіді яких пов'язані зі стресом, М апоптозом і запаленням. Хоча відповіді на фактор росту, в основному здійснюються за допомогою ЕКК шляху, вплив на ці останні процеси може приводити до альтернативних механізмів виживаності нейронів, які можуть « імітувати властивості фактора росту в підвищенні виживаності |Хіа еї аЇ., Зсіепсе, 1995, 270, 1326). Сполуки ї- також можуть функціонувати як засоби, що підвищують виживаність нейронних і не нейронних клітин за допомогою механізмів близьких, але в той же час, що відрізняються від опосередкованої фактором росту виживаності, наприклад, шляхом інгібування шляхів УМК і р38, який може приводити до виживаності за рахунок інгібування процесів апоптотичної загибелі клітин. «
Дані сполуки придатні для лікування розладів, пов'язаних із зниженою активністю ХАТМН або загибеллю, з с пошкодженням мотонейронів спинного мозку, а також застосовні, наприклад, при захворюваннях, пов'язаних з апоптотичною загибеллю клітин центральної і периферичної нервової системи, імунної системи і при запальних ; » захворюваннях.
Описані тут сполуки також можуть знаходити застосування при лікуванні патологічних станів, в які залучена
Злоякісна проліферація клітин, численних видів раку. -І Фармацевтично прийнятні солі описаних тут сполук, а також сполук, ідентифікованих представленими способами, включають в себе фармацевтично прийнятні солі приєднання кислот, солі металів, солі амонію, солі ве приєднання органічних амінів і солей приєднання амінокислот. Прикладами солей приєднання кислот є солі -І приєднання неорганічних кислот, таких як гідрохлорид, сульфат і фосфат, і солі приєднання органічних кислот, 5р таких як ацетат, малеат, фумарат, тартрат, цитрат і лактат; прикладами солей металів є солі лужних металів, - такі як літієва сіль, натрієва сіль і калієва сіль, солі лужноземельних металів, така як сіль магнію і сіль
Ге кальцію, сіль алюмінію і сіль цинку; прикладами солей амонію є сіль амонію і сіль тетраметиламонію; прикладами солей приєднання органічних амінів є солі з морфоліном і піперидином; і прикладами солей приєднання амінокислот є солі з гліцином, фенілаланіном, глутаміновою кислотою і лізином.
Надані тут сполуки, включаючи сполуки, що ідентифікуються даними способами, можуть бути включені до складу фармацевтичних композицій шляхом змішування з фармацевтично прийнятними нетоксичними
Ф) наповнювачами і носіями. Такі композиції можуть бути приготовані для застосування при парентеральному ка введенні, зокрема у вигляді рідких розчинів або суспензій; або для перорального введення, зокрема, в формі таблеток або капсул; або інтраназально, зокрема, у вигляді порошків, носових крапель або аерозолів; або бор дермально, наприклад, за допомогою трансдермальних пластирів.
Композицію можна зручно вводити в формі стандартних доз і можна приготувати будь-якими способами, добре відомими в області фармації, наприклад, як описано в (Кетіпдіоп'з Рпагтасеціїса! Зсіепсез (Маск Риб.
Со., Еазіоп, РА, 1980)). Композиції для парентерального введення можуть містити як звичайні наповнювачі стерильну воду або розчин солі, поліалкіленгліколі, такі як поліетиленгліколь, олії що мають рослинне 65 походження, гідрогенізовані нафталіни і їм подібні. Зокрема, біосумісний, біодеградований полімер лактиду, співполімер лактиду/гліколіду або співполімери поліоксиетилену-поліоксипропілену можуть бути придатними наповнювачами для того, щоб контролювати вивільнення активних сполук. Інші потенційно придатні системи парентеральної доставки цих активних сполук включають в себе частинки співполімера етилену-вінілацетату, осмотичні насоси, що імплантуються, інфузійні системи і ліпосоми. Композиції для введення шляхом інгаляції як наповнювачі містять, наприклад, лактозу або можуть являти собою водні розчини, що містять, наприклад, ефір поліоксиетилен-9-лаурилу, глікохолат і дезоксихолат або масляні розчини для введення у вигляді носових крапель, або у вигляді гелю, що застосовується інтраназально. Композиції для парентерального введення також можуть включати в себе глікохолат для букального введення, саліцилат для ректального введення або лимонну кислоту для вагінального введення. Композиції для трансдермальних пластирів переважно являють собою 7/0 Лліпофільні емульсії.
Сполуки даного винаходу можуть застосовуватися як єдиний активний засіб в фармацевтичній композиції. У альтернативному випадку вони можуть використовуватися в комбінації з іншими активними інгредієнтами, наприклад, іншими факторами росту, які сприяють виживаності нейронів або регенерації аксонів при захворюваннях або розладах.
Сполуки даного винаходу або фармацевтично прийнятні солі цих сполук можуть вводитися перорально або не перорально, наприклад, у вигляді мазі або ін'єкції. Концентрації сполук даного винаходу в терапевтичній композиції можуть варіювати. Концентрація буде залежати від таких факторів, як сумарна доза лікарського засобу, що вводиться, хімічні характеристики (наприклад, гідрофобність) сполук, що застосовуються, шлях введення, вік, вага тіла і симптоми у пацієнта і т.д. Звичайно сполуки даного винаходу надаються у вигляді го Водного розчину в фізіологічному буфері, що містить приблизно від 0,1 до 1095 сполуки, вага/об'єм, для парентерального введення. Звичайними є межі доз приблизно від мкг/кг до г/кг ваги тіла на добу; переважна межа доз приблизно від 0,01мг/кг до 1О0Омг/кг ваги тіла на добу, і переважно приблизно від 0,1 до 2Омг/кг від одного до чотирьох разів на добу. Переважна доза лікарського засобу, що вводиться, ймовірно, залежить від різних факторів, таких як тип і міра прогресії хвороби або розладу, загальний статус здоров'я конкретного сч ов пацієнта, відносна біологічна ефективність вибраної сполуки і введення в композицію наповнювача сполуки, і о шлях його введення.
Сполуки згідно з винаходом, включаючи сполуку, що тестується і сполуку, що ідентифікується способами даного винаходу, і фармацевтично прийнятні солі цих сполук можуть вводитися окремо або у вигляді різних фармацевтичних композицій, відповідно до фармакологічної активності і цілей введення. Згідно з даним с зо винаходом, фармацевтичні композиції можуть бути одержані шляхом змішування до однорідності ефективної кількості сполуки або фармацевтично прийнятної солі цієї сполуки як активного інгредієнта з фармацевтично - прийнятним носієм. Носій може мати широкий діапазон форм, відповідно до форм композиції, придатної для М введення. Бажано, щоб така фармацевтична композиція готувалася у вигляді стандартних лікарських доз, придатних для перорального і не перорального введення. Форми для не перорального введення включають в - себе мазь і ін'єкційний препарат. ча
Таблетки можуть бути приготовані звичайним способом з використанням таких наповнювачів як лактоза, глюкоза, сахароза, маніт і метилцелюлоза, дезінтегруючих засобів, таких як крохмаль, альгінат натрію, кальцій-карбоксиметилцелюлоза і кристалічна целюлоза, мастячих засобів, таких як стеарат магнію і тальк, зв'язуючих речовин, таких як желатин, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, гідроксипропілцелюлоза і « Метилцелюлоза, поверхнево-активних речовин, таких як складний ефір жирної кислоти і сахарози і складний /-- с ефір жирної кислоти і сорбіту, і подібних речовин. Переважно, щоб кожна таблетка містила 15-300мг активного інгредієнта. ;» Гранули можна приготувати традиційним способом, використовуючи наповнювачі, такі як лактоза і сахароза, дезинтегруючі засоби, такі як крохмаль, зв'язуючі речовини, такі як желатин, і їм подібні. Порошки можна приготувати традиційним способом, використовуючи наповнювачі, такі як лактоза і маніт і їм подібні. Капсули -І можна приготувати традиційним способом, використовуючи желатин, воду, сахарозу, аравійську камедь, сорбіт, гліцерин, кристалічну целюлозу, стеарат магнію, тальк і їм подібні. Переважно щоб кожна капсула містила пи 15-30Омг активного інгредієнта. -І Препарати у вигляді сиропів можна приготувати звичайним способом. використовуючи цукор, такий як 5ор сахароза, воду, етанол і їм подібні. ш- Мазь можна приготувати звичайним способом, використовуючи мазеву основу, таку як вазелін, рідкий
Ге парафін, ланолін і макроголь, емульгатори, такий як лаурилактат натрію, хлорид бензалконію, складний моноефір сорбітану і жирної кислоти, натрієва сіль карбоксиметилцелюлози і аравійська камедь, і їм подібні.
Ін'єкційні препарати можна приготувати традиційним способом, використовуючи розчинники, такі як вода, фізіологічний розчин солі, рослинні олії (наприклад, оливкова олія і арахісова олія), етилолеат і пропіленгліколь, солюбілізуючі засоби, такі як бензоат натрію, саліцилат натрію і уретан, засоби, що (Ф) забезпечують ізотонічність, такі як хлорид натрію і глюкоза, консерванти, такі як фенол, крезол, складний ка ефір парагідроксибензойної кислоти і хлоробутанол, антіоксиданти, такі як аскорбінова кислота і ггіросульфат натрію, і їм подібні. во Далі винахід ілюструється шляхом наступних прикладів, які призначені для роз'яснення винаходу. Ці приклади не призначені, і не розглядаються, як приклади, лімітуючі рамки заявки.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1: Загальний опис процесів синтезу і приклади
Загальний шлях синтезу, що застосовується для одержання інденопіролокарбазолів з місточковим зв'язком 65 даного винаходу, що мають формулу ІІ, показаний на фігурах 1 і 2. Загальні процедури синтезу інденопіролокарбазолів (ПАМ) можуть бути виконані, як описано в (патенті США Мо. 5705511), публікація якого включена таким чином у вигляді посилання в повному об'ємі. У тому випадку, коли Б є Н, азот лактаму інденопіролокарбазолів (ПАМ) захищають відповідною захисною групою, що приводить до (ІМ)МЇХ).
Захищені сполуки обробляють відповідною основою в безводному органічному розчиннику (ах), внаслідок чого утвориться темно-червоний розчин, який, мабуть, є карбаніоном. Результатом реакції карбаніону з біфункціональним реагентом (М) є електрофільне приєднання до С-У зв'язку сполуки (М), що приводить до первинної проміжної сполуки (МІХ). Обробка проміжної сполуки(ую (МІ) (Х) і/або (МІ)ЖХІ) або сульфокислотою, або кислотою Льюїса, наприклад, ефіратом трьохфтористого бору, дає інденопіролокарбазоли з місточковим зв'язком (1)Н). 70 Стратегія захисту азоту лактаму (показана на Фігурах З і 4) може бути здійснена за допомогою процесу, каталізованого або кислотою, або основою. Реакцію, каталізовану кислотою, можна провести з реагентом, зв'язаним з смолою, що дозволяє імобілізувати інденопіролокарбазол (ПМ) на полімерному носії, такому як, заснована на полістиролі, кисла смола Рінка (Хі) (Фігура З) одержуючи при цьому (ХІІ). У альтернативному випадку каталізована кислотою реакція може бути проведена з розчинним реагентом, щоб 75 одержати сполуку (ХІМ) (Фігура 4). В умовах основного каталізу одержують захищену сілілом сполуку (ХМ) (Фігура 4).
На Фігурі 5 описано декілька способів одержання проміжної сполуки (М). Процедура (а) описує перетворення різних ацеталей (ХМІ) в (ХМІІ, 2-зв'язок). Наприклад, складний ефір-ацеталь/кеталь (ХМТ, 0-СООК) повністю відновлюють до відповідного спирту і потім окисляють (наприклад, окислення за Сверном або Дессо-Мартіном) до альдегід-ацеталю/кеталю (ХМІІ, КЗ-Н). У альтернативному випадку складний ефір-ацеталь/кеталь (ХМІ, р-сСОоОК) частково відновлюють за допомогою ОІВАЇ, щоб безпосередньо одержати альдегід (ХМІЇ, 8-Нн).
Схожим чином відновлення нітрил-ацеталю (ХМІ, 0-СМ) за допомогою ОІВАЇ дає альдегід (ХМІІ, К 8-Н).
Кето-ацеталі/кеталь одержують доданням реактивів Гріньяра до аміду Вейнреба-ацеталю/кеталю (ХМІ, р-сом(ОМе)Ме). с
Проміжна сполука (ХМІЇ, 7-зв'язок) також може бути одержана за допомогою двостадійної процедури, г) короткий зміст якої даний в описі процедури (Б). Додання металоорганічного реагенту (ХІХ) до ацеталю/кеталю (ХМІІ) дає алкен (ХХ), який при озонолізі з подальшою поновлюючою обробкою дає кетоацеталь/кеталь (ХМІЇ).
Одержання проміжної сполуки (ХМІЇ, 7-гетероатом) за допомогою двостадійного оброблення стисло описано в процедурі (с). Поєднання ацеталю (ХХІЇ) з алкеном (ХХІ) з подальшим озонолізом (з поновлюючою обробкою) с одержаного в результаті алкену дає кето-ацеталь/кеталь (ХМІЇ). У альтернативному випадку проміжну сполуку М (ХМІІ, 7-гетероатом) одержують за допомогою двостадійної процедури, стисло описаної в процедурі (4). Реакція сполуки (ХХІМ) з ацеталем/кеталем (ХМІІЇ) дає (ХХМ), яку перетворюють в кето-ацеталь/кеталь (ХМІЇ) за ї- допомогою методів, описаних в процедурі (а). Конденсація кето-ацеталю/кеталю (ХМІЇ) з гідроксиламінами, «г гідразинами, М-алкіл-М-алкоксиамінами і амінами дає проміжну сполуку (ХХМІ), що має електрофільну САМ функціональність. ї-
Зв'язаний зі смолою інденопіролокарбазол (ХІІ) (Фігура 6, спосіб А) обробляють надлишком реактиву
Гріньяра як основи, результатом чого є утворення темно-червоного розчину карбаніону. Подальша реакція з (М) приводить до продуктів, одержаних завдяки електрофільному приєднанню до С-У групи. Обробка водою і « відщеплення продукту(тів) від смоли розбавленою кислотою (195 ТФУ в метиленхлориді) в результаті приводить до виділення сполуки(укю) (ХХМІЇ) і/або (ХХМІІ). Обробка проміжної сполуки(ую) (ХХМІЇ) або (ХХМІІ!) або З с сульфокислотою, або кислотою Льюїса, наприклад, ефіратом трьеохфтористого бору, дає інденопіролокарбазоли "» з місточковим зв'язком (ІІ). " Схожа стратегія застосовується для реакції розчинної проміжної сполуки із захищеним лактамом, наприклад, (ХМ) (Фігура 7, спосіб В). Однак в цьому випадку проміжну сполуку (ХМ) обробляють тритоном В в піридині як основи, замість реактиву Гріньяра. Проміжна сполука(ки) (ХХІХ) і/або (ХХХ) може бути виділена інтактно із ш- захисною групою лактаму, яка піддається хроматографічному очищенню. Так само, як в способі А (Фігура 6), їх обробка кислотою Льюїса (такої як ефірат трьохфтористого бору) дає інденопіролокарбазоли з місточковим зв'язком (ІІ), де В'-Н. ї Введення груп В, 27, 25 і КЗ може бути виконано, як описано в |патентах США Мо. 5705511 і 4923986), - 7о публікації яких включені у вигляді посилання в повному об'ємі. Заступник Б З інакше може бути введений після
Кз конструювання інденопіролокарбазолів з місточковим зв'язком, як показано на Фігурі 8. Положення З В кільця бромують МВ5, одержуючи сполуку (ХХХІ). Потім вводять вуглецевий фрагмент, використовуючи каталізовані паладієм реакції Стілла, Сузукі, Хека, Кумали або Кастро-Стефенса, щоб одержати сполуки типу (ХХХІЇ), (ХХХІ) і т.д. Крім того, сполука (ХХХІ) може надати доступ до сполук, в яких група брому заміщена гетероатомом, наприклад, заснованої на аміні групою із застосуванням хімії каталізованого паладієм амінування (Ф; Бухвальда. г За допомогою окислювального процесу зв'язана з киснем група може бути введена при вуглеці індену в Е кільці, як показано на Фігурі 9, в сполуці (ХХХІМ). Цей хімічний процес також приводить в результаті до бр окислення метиленової групи лактаму (А кільце) даючи, як показано, імідне похідне.
Приклад 2: Одержання проміжних сполук, зв'язаних зі смолою Рінка: (ХПІ-А), (ХПІ-В) і (ХПІ-С), (Фігура З)
Приклад 2-А
У три вузькогорлих круглодонних посудини, оснащених верхньою механічною мішалкою і пасткою Діна
Старка послідовно завантажували кислу смолу Рінка ХІЇ (10,00г, О,б4ммоль/г), 1-метил-2-піролідинон (8Омл), б бензол (ЗБбмл), МІ-А (АТАЙ-Но», В'В-О, вЗ-ви'-К-В-Н) (3,00г) і пара-толуолсульфокислоту (1,00Гг).
Реакційну суміш нагрівали із зворотним холодильником протягом 20 годин, і потім фільтрували. Полімер промивали ТГФ (5х175мл) і фільтрат відставляли. Потім полімер послідовно промивали ДМСО (4х100мл), 290 водним Мансо» (4Хх10Омл), водою (4х100мл), ДМСО (2х200Омл), ТГФ (4х100мл) і етилацетатом (4х10О0мл). Смолу сушили у вакуумі (24 години), одержуючи 11,70 (0,47ммоль/г) зв'язаного зі смолою МПІ-А, (ХПІ-А).
Первинне ТГФ промивання випаровували, залишок розбавляли водою (75Омл), і одержаний в результаті осад відфільтровували і послідовно промивали водою, 295 водним Мансо» (4х10Омл) і водою (4х10Омл). Після сушіння у вакуумі одержували МПІ-А (1,28Г).
Приклад 2-8
Схожим чином МІП-В (АТА2-О, В вВ2-Но, 3-7 -5-в5-Н), (0,5г) зв'язували з кислою смолою Рінка ХІЇ 7170. (1,52г), одержуючи 1,58г зв'язаного зі смолою МПІ-В, (ХПІ-В).
Приклад 2-С
Схожим чином МІІ-С (АТ А2-Н», В, в2-О, 3-7 -в5-Н, Т9-110-ОМе), (1,02г) зв'язували з кислою смолою
Рінка ХІІ (3,12г), одержуючи 3,70 (0,4бммоль/г) зв'язаної зі смолою сполуки МІ-С, (ХПІ-С3) разом з початковою сполукою МІІ-С (0,44Гг).
Приклад З: Одержання сполуки (1-1), сполуки (1-2), сполуки (1-3), сполуки (1І-4а), сполуки (11-45), сполуки (ІІ-6) і сполуки (1І1-8) (спосіб А, Фігура 6)
Приклад 3-А
До суспензії (ХПЇІ-А) (1,25г) в ТГФ (24мл) додавали 1,0М розчин ЕЇМмМОоВг (6,25мл в ТГФ), і реакційну суміш перемішували протягом 1 години перед доданням НМРА (5,Омл). Після 10-хвилинного перемішування додавали діетоксибутиральдегід (3,0г) |який був одержаний відповідно до описаної в літературі процедури - Радцейце, еї аІ.,, У. Ат. Спет. ос, 1997, 119, 9662-71), і реакційну суміш перемішували протягом 20 годин. Реакцію гасили 1095 водним МІ-ОСІ (мл) і фільтрували. Смолу послідовно промивали 1095 водним МІ-ОСІ (Зх1Омл), водою (Зх1Омл), ТГФ (Зх1О0мл), ДМФ (Зх1Омл), водою (Зх1Омл), ТГФ (Зх1Омл) і ефіром (Зх1Омл). Смолу сушили у вакуумі, переносили в хлористий метилен (15мл) і обробляли трифтороцтовою кислотою (0,15мл). Після с перемішування протягом 1 години реакційну суміш фільтрували, і фільтрат випаровували. Одержаний в Ге) результаті залишок переносили в хлористий метилен (20мл) і обробляли тозилатом піридинію (5ОмгГ), і одержаний в результаті розчин перемішували протягом 4 годин. У цей час реакцію промивали насиченим водним Мансо» і розчином солі, і сушили над МазоО,.
Після фільтрування і випаровування розчинника залишок очищали з допомогою препаративної ВЕРХ (7ограх с х-8, 4х225см, елюювали 6095 МесСмМ/вода м/0,196 трифтороцтовою кислотою). Відповідні фракції нейтралізували
МансСоОз і екстрагували хлористим метиленом (Зх5Омл), і сушили над Ма5зО). Після фільтрування і випаровування розчинника було одержано 70,2мг сполуки 1І-ї4 у вигляді білого порошку, які мали наступні ге характеристики: С ЯМР (ДМСО-йв) 5 171,8; 143,3; 142,4; 141,4; 140,1; 140,0; 136,6, 129,2; 127,9; 1274; Ж 127,1; 126,8; 124,1 (22), 122,7; 121,6; 121,5; 118,3; 112,1; 88,1; 79,2; 56,6; 45,6; 33,4; 24,8; "ІН ЯМР (ДМСО-ав).. а ї- 9,21 (д, 9У-7,5, 1Н), 8,62 (с, 1), 7,98 (д, 9У-7,7, 1Н), 7,86 (д, 9У-8,3, 1), 7,71 (д, 9У-7,3, 1Н), 7,49 (дд, 9У7,9, 7,4, 1), 7,41 (дд, 9У-7,5, 7,4, 1), 7,36-7,27 (м, 2Н), 6,86 (д, 9У-6,0, 1Н), 5,63-5,58 (м, 1Н), 4,91 (с, 2Н), 4,53 (д, 9У-3,3, 1Н), 2,23-2,14 (м, 71Н), 1,96-1,92 (м, 1Н), 0,96-0,88 (м, 1Н), 0,60-0,57 (м, 1);
Мас-спектр т/2 (М.Н) обчислено 379, виміряно 379. «
За допомогою препаративної ВЕРХ цієї суміші продуктів реакції також було виділено сполуку ІІ-2 (0,5мг), щ- с яка мала наступні характеристики: ІН яЯМР (ДМСО-ав) 5 9,17 (д, 9-81, 1Н), 8,62 (с, 1Н), 7,98 (д, 9-70, а 1Н), 7,85 (д, 9-68, 1Н), 7,57 (д, 9У-6,8, 1Н), 7,49 (дд, 9У-7,9, 7,4, 1Н), 7,44-7,26 (м, ЗН), 6,81 (д, У-6,0. ,» 1Н), 5,43-5,33 (м, 1Н) 443 (с, 2Н), 2,23-2,14 (м, 71Н), 1,96-1,92 (м, 1Н), 1,45-1,55 (м, 2Н), 0,96-0,88 (м, 1Н), 0,60-0,57 (м, 1Н), 0,29 (т, 9-7,0, ЗН); Мас-спектр т/2 (МАН) обчислено 407, виміряно 407.
Приклад 3-В -і Подібним чином, як описано вище для сполуки І-ї, смолу (ХІЇШ-А) (70,3мг) обробляли їх 1,1-дієтокси-2-пентаноном (0,75мл) |який готували відповідно до описаної в літературі процедури Бмогіп, еї аім.,, У. Огд. Спет., 1988, 53, 4894-6ї щоб одержати сполуку ІІ-3 (3,5мг), яка була виділена за допомогою - препаративної ТШХ (силікагель, елюювали 50956 ЕОАс/ толуолом) і мала наступні властивості: "Н ЯМР -І 20 (ДМСО-ав) 5 942 (д, 9У-8,2, 1Н), 8,58 (с, 1Н), 7,95 (д, 5-74, 1), 7,79 (д, 9У-8,3, 1Н), 7,71 (д, 9-71), 7,50-7,20 (м, 4Н), 6,81 (д, 9У-5,9, 1Н), 4,90 (с, 2Н), 446 (с, 1), 2,35-220 (м, 1Н), 1,98 (с, ЗН), г» 1,75-1,60 (м, 1Н), 1,25-1,00 (м, 1Н), 0,35-0,15 (м, 1Н); Мас-спектр т/2 (М.Н) обчислено 393, виміряно 393.
Приклад 3-С
Подібним чином, (ХІП-А) (74,3мг) обробляли 1,1-діетокси-2-гексаноном |який готували відповідно до 29 описаної в літературі процедури Вгеппег, У. Огуд. Спет., 1961, 26, 22-7| (0,75мл), щоб одержати сполуку 1І-4а
ГФ) (2,10мг) і сполуку 1І-465 (1,0бмг), які були виділені окремо за допомогою препаративної ВЕРХ (72ограх КХ-8, юю 4х25см, елюювали 6595 МесСМ/вода м/0, 195 трифтороцтовою кислотою). Сполука ІІ-4а мала наступні властивості: "НН ЯМР (ДМСО-ав) 5 9,30 (д, 9У-8,3, 1Н), 8,55 (с, 1Н), 7,97 (д, 9У-7,2, 1Н), 7,65 (д, 9У-8,5, во 1), 7,59 (д, 9-7,5), 7,48 (дд, 9У-7,8, 7,2, 1Н), 7,39-7,15 (м, ЗН), 6,31 (дд, 9У-5,9, 5,5, 1Н), 5,02 (с, 2Н), 4,88 (с, 2Н), 0,88 (с, ЗН), інші аліфатичні сигнали втрачалися під піками розчинника; Мас-спектр т/2 (МАН) обчислено 407, виміряно 407. Сполука ІІ-4б мала наступні властивості: "Н ЯМР (ДМСО-ав) а 9,43 (д, 9-81, 1Н), 8,59 (с, 1Н), 7,99 (д, 9у-7,3, 1Н), 7,75-7,65 (м, 2Н), 7,49 (дд, 9У-7,0, 6,4, 1), 7,43 (дд, 9У-8,2, 81, 1Н), 7. 36-7,25 (м. 2Н), 6,75 (с, 1Н), 4,91 (с, 2Н), 4,50 (с, 1Н), 1,95 (с, ЗН), інші аліфатичні сигнали 65 Втрачалися під піками розчинника; Мас-спектр т/7 (М--Н) обчислено 407, виміряно 407.
Приклад 3-О
Подібним чином (ХІЇІ-С) (1,00г) обробляли диетоксибутиральдегідом (3,65г), щоб одержати сполуку 1І-6 (87,вмг), яка було виділена з допомогою препаративної ВЕРХ (72ограх Х-8, 2,5х25см, 6595 МеСмМ/вода м/0, 190 трифтороцтова кислота) і мала наступні властивості: "Н ЯМР (ДМСО-ав) 5 9,09 (д, У-8,6, 1Н), 8,60 (с, 1Н), 7,95 (д, 9-7,4, 1Н), 7,84 (д, 9-83, 1Н), 7,47 (дд, 97,2, 7,0, 1Н), 7,35 (с, 1Н) 7, 29 (дд, 9У-7,0, 7,0, 1Н), 6,98 (дд, 9У-8,6, 1,9, 1Н), 6,83 (д, 9У-6,0, 1Н), 5,65-5,55 (м, 71Н), 4,88 (с, 2Н), 4,48 (д, 9-3, 9, 1Н), 3,82 (с, ЗН), 2,25-2,10 (м, 71Н), 2,08-1,85 (м, 71Н), 0,96-0,75 (м, 1Н), 0,65-0,50 (м, 1Н); Мас-спектр т/2 (Мама) обчислено 431, виміряно 431.
Приклад 3-Е
Подібним чином полімер (ХІЇІІ-В) (153,2мг) обробляли діетоксибутиральдегідом (1,5мл), щоб одержати сполуку
І-8 (3,бмг), яка була виділена за допомогою препаративної ВЕРХ (7ограх КХ-8, 2,5 х25см, 6595 Месм/вода м/0,195 трифтороцтова кислота) і мала наступні властивості: "Н ЯМР (ДМСО-йв) 5 9,09 (д, 9У-7,9, 1Н), 8,81 (с, 1Н), 7,81-7,73 (м, ЗН), 7,48-7,35 (м, ЗН), 7,24 (дд, 9У-7,6, 7,5, 1Н), 6,85 (д, 9У-6,2, 1Н), 5,63-5,59 (м. 1Н), 4,86 (с, 2Н), 4,61 (д, 9У-3,6, 1), 3,82 (с, ЗН), 2,21-2,13 (м, 1Н), 1,96-1,90 (м, 1Н), 0,87-0,79 (м, 75 1Н), 0,61-0,56 (м, 1Н); Мас-спектр т/2 (МАН) обчислено 379, виміряно 379.
Приклад 4: Одержання сполуки 1І-7а і сполуки 1І-75 (спосіб А, Фігура 6)
Приклад 4-А Одержання (1,3-діетоксиетокси) ацетону
До холодної (02) суспензії Ман (2,68г, 6095) в ТГФ (15Омл) додавали розчин 1,1-діетоксиетанолу (який був одержаний відповідно до описаної в літературі процедури 2ігКіІе, еї аіІ., У. Огд. Спет., 1961, 26, 395-407) (9,00г) в ТГФ (20мл), і реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 1 години перед доданням хлористого метилалілу (8,Омл): Реакційну суміш кип'ятили із зворотним холодильником протягом ночі, охолоджували і фільтрували через прошарок целіту. Розчинник видаляли випаровуванням в роторному випарнику, і залишок очищали за допомогою хроматографії на колонці (силікагель, 2095 ефір/гексан), щоб одержати 1,1-діетоксиетилметилаліловий ефір (11,5г, 9095). Озоноліз охолодженого (-302С) розчину цього ефіру с (6,00г) в ЕЮАс (8Омл) проводили доти, поки початковий матеріал вже не реєструвався з допомогою ТШХ (1 Ге) година). У цей час реакційну суміш продували киснем, обробляли РЯ(ОН)» (15Омг) і перемішували в атмосфері водню протягом ночі. Каталізатор відфільтровували, і фільтрат концентрували за допомогою випаровування в роторному випарнику. Одержаний в результаті залишок очищали хроматографією на колонці (силікагель, 2090
ЕЮдАс/гексан), одержуючи вказану в заголовку сполуку (4,53г, 8290). см
Приклад 4-В че
Згідно з способом А (фігура 6), смолу (ХП-А) (230,2мг) обробляли Е(МоВг (1,25мл), після чого (1,1-діетоксиетокси)ацетоном (приклад 3-А) (1,2мл). Після обробки і відщеплення від смоли частину грубої - суміші реакційних продуктів (10,5мг) переносили в хлористий метилен (20мл) і обробляли ефіратом ВЕ з ч;Е (20Омкл). Після перемішування протягом 2,5 годин розчин промивали насиченим водним Мансо »з і розчином
Зо солі, потім сушили над М9505. Після фільтрування і видалення розчинника одержаний в результаті залишок - очищали за допомогою препаративної ВЕРХ (7ограх КХ-8, 4х25см, 6596 МесСМ/вода м/0, 190 трифтороцтова кислота), щоб одержати сполуку ІІ-7а (2,34мг) і сполуку 1І-75 (1,34мг). Сполука (ІІ-7а) мала наступні властивості: "Н ЯМР (СОСІз) 5 9,35-9920 (м, 1 Н), 7,87 (д, 9У-7,6, 1), 7,62 (д, 9-7,0, 1Н), 7,60-7,45 (м, « 400 1Н), 7,49, (1Н), 7,40 (д, 9-81, 1Н), 7,37-7,26 (м, ЗН), 6,22 (с, 1Н), 5,20-4,85 (м, 1Н), 4,47 (с, їн), 367 З с (д, 9У-12,7, 1Н), 3,52 (д, 9У-11,8, 1Н), 3,40 (д, 9-12,7, 1Н), 3,38 (д, 9У-11,8, 1Н), 1,91 (с, ЗН); Мас-спектр й т/2 (МН) обчислено 409, виміряно 409. Сполука ІІ-75 мала наступні властивості: "Н ЯМР (СОСІ5) 5 9,58-9,22 ,» (м, 71), 7,82 (д, 9-74, 1Н), 7,60-7,40 (м, ЗН), 7,37-7,27 (м, ЗН), 7,21 (д, 9-81, 1Н), 5,81 (с, 1Н), 5,21 (с, 1Н), 5,10-4,80 (м, 1Н), 4,59 (д, 9-13,5, 1Н), 4,38 (дд, 9-13,5, 5,3, 1Н), 4,21 (д, 9У-13,1, 1Н), 3,82 (д, 13,2, 1Н), 1,13 (с, ЗН); Мас-спектр т/2 (М.Н) обчислено 409, виміряно 409. -І Приклад 5: Одержання сполуки 1І-5 (Фігура 8)
До розчину сполуки 1І-1 (8,1мг) в ТГФ (2мл) додавали МВ5 (4,бмг) і реакційну суміш перемішували протягом т ночі. Додавали додаткову кількість МВ (4,5мг) і реакцію перемішували протягом 2,5 годин. Нерозчинний -І матеріал відфільтровували, і фільтрат концентрували в роторному випарнику. Одержаний в результаті залишок очищали хроматографією на колонці (С-18, 6590 МесСмМ/вода м/0,19отрифтороцтова кислота). Відповідні фракції нейтралізували МанНсСоО»з і екстрагували хлористим метиленом (Зх2Омл), і сушили над Мо5О,. Після що) фільтрування і випаровування розчинника було одержана сполука 1І-5 (5,1мг) у вигляді білого порошку, яка мала наступні характеристики: ІН яЯМР (ДМСО-ав) 5 9,22 (д, 9У-7,4, 1Н), 8,67 (с, 1Н), 8,14 (с, 1Н), 7,86 (д, у8,7, 1Н), 7,72 (д, 97,0, 1Н), 7,63 (д, 9У-7,8, 1), 7,42 (дд, 9У-7,5, 7,3, 1), 7,35 (дд, 9У-7,3, 7,2, 1Н), оо 6,86 (д, 9У-6,0, 1), 5,63-5,58 (м, 1Н), 4,94 (с, 2Н), 4,54 (д, 9-31, 1Н), 2,30-2,14 (м, 1Н), 2,00-1,82 (м,
ГФ! 1Н), 0,96-0,88 (м, 1Н), 0,62-0,50 (м, 1Н); Мас-спектр т/2 (МАН) обчислено 457/9 (1:1), виміряно 457/9(1:1).
Приклад 6: Одержання проміжної сполуки ХМ (Фігура 4) о До розчину (ХП-А) ІАТА2-Но, В В2-О, вЗ-в7-в5-в5-НІ (1,05г) в ДМФ (25мл) додавали триетиламін (0,75мл) і трет-бутилдиметилсілілхлорид (ТВ5-СІ) (0,65г). Після перемішування протягом З годин реакцію гасили 60 насиченим водним Мансо» і екстрагували ЕІЮАс. Органічний шар промивали водою і розчином солі і сушили над Мо5О». Після фільтрування і випаровування розчинника одержаний в результаті залишок розтирали в ефірі, одержуючи сполуку ХМ (848мг). Промивку випаровували, щоб виділити залишок, який очищали хроматографією на колонці (кремнезем, 1956 ЕЮАс/СНьЬСІ») і одержували додаткову кількість продукту (502мг, сумарний вихід 9495), який мав наступні спектральні властивості: ІН ЯМР (ДМСО-ав) 5 11,94 (с, 1Н), 9,32 (д, 9У-7,6, 1Н), 65 8,03 (д, 9-7,7, 1Н), 7,64 (д, 9-7,2, 1Н), 7,58 (д, 9У-8,1, 1), 7,44 (дд, 9-7,7, 7,6, 1Н), 7,39 (дд, 9-77,
7,6, 1), 7,32 (д, 97,3, 1), 7,25 (дд, 9У-7,6, 7,3, 1Н), 5,00 (с, 2Н), 4,14 (с, 2Н), 0,99 (с, 9Н), 0,46 (с, 6Н); Мас-спектр т/2 (МАН) обчислено 425, виміряно 425.
Приклад 7: Одержання сполуки 1І-1 за допомогою способу В (Фігура 7)
Розчин тритону В в піридині (0,45М) готували шляхом розчинення 4095 розчину тритону В в метанолі (1Омл) в піридині (ЛОмл). Розчинник видаляли при зниженому тиску (20мм На) до кінцевого об'єму «мл. Залишок розводили піридином до 5Омл, фільтрували і зберігали в азоті. Розчин ХМ (20,Змг) в піридині (2,О0мл) вносили в струмінь аргону і обробляли ЗООмкл тритону В (0,45М в піридині) і діетоксибутиральдегідом (5Омкл). Після 2 годинного перемішування реакційну суміш екстрагували Е(ОАс, промивали 1М водним НОЇ, розчином солі і 7/0 бушили над МазО»). Після фільтрування і випаровування розчинника адукт переносили в СН 2Сі» (1Омл) і обробляли ефіратом ВЕ з (1О0мкл). Після 2,0-годинного перемішування розчин промивали насиченим водним
Мансо» і розчином солі, потім сушили над МаоЗО). Видалення розчинника при випаровуванні в роторі давало залишок, який очищали препаративною ВЕРХ (7ограх КХ-8, 2,5х25см, 6596 МесСм/вода м/0,195 трифтороцтова кислота). Відповідні фракції нейтралізували Мансо)» і екстрагували хлористим метилен (Зх20мл) і сушили над 75 Мазо,. Після фільтрування і випаровування розчинника одержували 11-1 (11,8мг, вихід 65905), спектр ІН ЯМР і мас-спектр якого і час утримання якого при ВЕРХ були ідентичними матеріалу, одержаному і виділеному способом А, описаним в прикладі 3-А.
Приклад 8: Одержання сполуки 1І-9 (Фігура 8)
До суспензії бромосполуки 1І-5 (6б,2мг) в 1-пропанолі (4,0мл) додавали З-амінофенілборну кислоту (3,8мгГг).
Після перемішування протягом 0,25 години послідовно додавали РЯА(ОАс) 5» (2,0мг), РизР (4,8мг), Ма»СО»з (2,8мг) і воду (2,О0мл). Суміш кип'ятили із зворотним холодильником протягом 0,75 години, охолоджували, екстрагували СНьЬСІ» і промивали водою і розчином солі. Органічний шар сушили над Мо5О»,, і розчинник видаляли випаровуванням в роторному випарнику, одержуючи залишок, який очищали препаративною ВЕРХ (7ограх КХ-8, 2,5х25см, 5096 МесСм/вода м/0,195 трифтороцтова кислота). Відповідні фракції нейтралізували «М Мансо», і екстрагували хлористим метилен (Зх2Омл) і сушили над МазО». Після фільтрування і випаровування о розчинника одержували сполуку 1І-9 (3,1мг, вихід 4995), яка мала наступні спектральні властивості: "НН ЯМР (ДМСО-4в) 5 9,22 (д, 9-7,5, 1Н), 8,66 (с, 1Н), 8,00-7,25 (м, 8Н), 7,12 (дд, 9У-7,1, 7,0, 1Н), 6,95-6,80 (м,
ЗН), 6,53 (д, 9-6,0, 1Н), 5,63-5,58 (м, 1Н), 4,99 (с, 2Н), 4.55 (с. 1Н). 2.25-2,10 (м, 71Н), 1,95-1,90 (м, 1Н), 0,98-0,88 (м, 1Н), 0,65-0,57 (м, 1Н); Мас-спектр т/2 (М.Н) обчислено 470, виміряно 470. сч
Приклад 9: Одержання сполуки 11-10 (Фігура 9) рч-
До розчину сполуки 1І-1 (5,О0мг) в ДМСО (мл) додавали Маскм (4,Змг), і суміш нагрівали до 14592 протягом 1 години. Суміш охолоджували, екстрагували ЕЮдАс і промивали водою (Зх2Омл) і розчином солі. Органічний шар - сушили над Мао», фільтрували і випаровували, одержуючи залишок, який очищали препаративною ВЕРХ «І (7ограх КХ-8, 2,5х25см, 5596 МесСм/вода м/0,195 трифтороцтова кислота). Відповідні фракції нейтралізували | , ! | ! в.
Мансо » і екстрагували хлористим метилен (Зх2Омл), і сушили над МазО». Після фільтрування і випаровування розчинника одержували сполуку 1І-10 (2,7мг, вихід 5096), яка мала наступні спектральні властивості: "НН ЯМР (ДМСО-йав) 5 11,4 (с, 1), 8,86 (д, 9-7,9, 1Н), 8,79 (д, 1-1,6, 1), 7,90 (д, 9У-8,3, 1Н), 7,62-7,55 (м, 2Н), 7,49 (дд, 9-7,6, 7,4, ЗН), 7,40 (дд, 9У-7,4, 7,3, 1), 7,35 (дд, 9У-7,5, 7,4, 1), 6,86 (д, 9У-6,0, 1Н), 6,03 « 70. (с, 1Н), 5,40-5,30 (м, 1Н), 2,25-2,14 (м, 1Н), 2,03-1,90 (м, 1Н), 1,10-0,98 (м, 1Н), 0,82-0, 77 (м, 1Н). - с Приклад 10. Одержання сполуки 11-11 (спосіб А, Фігура 6) ц Згідно з способом А, смолу (ХШа) (150,2мг) піддавали реакції з ЕЇМОоВг (1,00мл), після чого - з и"? етил-2,5-діоксопентаноатом |Зсптіді, еї аї., Зупіпезіз, 1993, 809) (1,5мл). Після обробки і відщеплення від смоли грубу суміш реакційних продуктів переносили в хлористий метилен (20мл) і обробляли ефіратом ВЕЗ (2Омкл). Після перемішування протягом 2,5 годин розчин промивали насиченим водним Мансо »з і розчином -І солі, потім сушили над М9505. Після фільтрування і видалення розчинника одержаний в результаті залишок очищали за допомогою препаративної ВЕРХ (ограх КХ-8, 4х25см, 5595-7595 градієнт МеСМ/вода м/0,190 т- : 1 трифтороцтова кислота), щоб одержати сполуку 1І-141 (б,4мг), яка мала наступні властивості: НЯМР -і (ДМСО-а,) 6 9,36 (д, У-7,7, 1Н), 8,68 (с, 1Н), 8,00 (д, 9У-7,7, 1Н), 7,83 (д, 9-83, 1Н), 7,58-7,15 (м, 5Н), -1 20 6,97 (д, 9-5,9, 1Н), 4,93 (с, 2Н), 4,82 (с, 1Н), 448 (д, 9-71, 2Н), 2,42-1,91 (м, 2Н), 1,37 (т, ЗН, 9-71), 1,25-0,63 (м, 2Н). г» Приклад 11: Одержання сполуки 1І-12
Розчин сполуки 1І-11 (3,4мг) в ТГФ (2мл) обробляли 2М розчином ГІВН ; (1,0мл в ТГФ), і реакцію перемішували протягом 1,5 годин. Реакцію гасили доданням 1М водного НСІ (4мл). Після перемішування 29 протягом 20 хвилин додавали 1095 водний Маон (15мл), і суміш екстрагували хлористим метиленом (3х10мл).
ГФ) Після висушування над Мо5О у, суміш фільтрували і розчинник випаровували, щоб одержати сполуку 1І-12 юю (0,32мг), яка мала наступні властивості: ІН яЯМР (ДМСО-ав) 5 9,35 (д, 9У-7,7, 1Н), 8,62 (с, 1Н), 7,98 (д, 9-7,7, Л1Н), 7,83 (д, 9-82, 1Н), 7,75 (д, 9У-8,2, 1Н), 7,50-7,25 (м, 4Н), 6,84 (д, 9- 7,7, 1Н), 6,11 (с, МН), 4,91 (с, 2Н), 4,71 (с, 1Н), 4,50-4,40 (м, тн), 4,30-420 (м, 1), 2,42-1,91 (м, 2Н), 1,25-0,63 (м, 2Н); бо Мас-спектр т/2 (М.Н) обчислено 409, виміряно 409.
Приклад 12: Підвищення ХАТМН-активності спинного мозку
ХАТМН є специфічним біохімічним маркером функціональних холінергічних нейронів. Холинергічні нейрони являють собою основний холінергічний вхід в формацію гіпокампу, нюхове ядро, ядро, розташоване між ніжками мозку, кору головного мозку, мигдалевидне тіло і частину таламусу. Мотонейрони в спинному мозку є бо холінергічними нейронами, які містять ХАТМН (РНеїрз, еї аї., У. Сотр. Меийгої., 1988, 273, 459-472). ХАТМН активність була використана для вивчення впливів нейротрофінів (наприклад, МОРЕ або МТ-3) на виживаність і/або функціонування холінергічних нейронів. Аналіз ХАТМН також служить для індикації регуляції рівнів ХАТМН в холінергічних нейронах.
Способи: Клітини спинного мозку зародків пацюків дисоціювали, і експерименти виконували, як описано
ІЗтій, еї аї., У. Се! Віоіоду, 1985, 101, 1608-1621; СіісКветап, еї аїЇ.,, У. Мецйгоспет., 1993, 61, 210-221.
Дисоційовані клітини одержували з спинного мозку розтятих пацюків (на 14-15 ембріональний день) за допомогою стандартної технології дисоціації трипсином |(Зтіїй еї аіЇ., вище). Клітини висівали при щільності бх1Оклітин/см? в покриту полі-І-орнітіном лунку планшетів для культивування тканин в безсировоточне 70 середовище Мо з доданням 0,0595 бичачого сировоточного альбуміну (БСА) |ВобКепзвієвїп, еї аіІ., Ргос. Май).
Асай. Зсі. ОБА, 1979, 76, 514-517). Культури інкубували при 372С у вологій атмосфері, що складається з 590
СО2/9595 повітря. протягом 48 годин. ХАТМН активність вимірювали через 2 дні іп міго, використовуючи модифікацію процедури Боппит |(Боппит, Меигоспет., 1975, 24, 407-409) у відповідності з ІМесМапатангп еї а). і
Сіїскетанп, еї аІ. (Месомапатан, еї аі!., Оемеіор. Віо!., 1988, 125, 311-320; Сііскетап, еї аї., У. Мепгоспет., вище).
Сполуки, що мають формулу ІЇ, описані в прикладах, приведені в списку в таблиці 2. В", 7, 9 в означають Н; У означає 0; і Н дорівнює 1. сіло те | 5 | 57 0т 2 ие ння новяюкт ее ння нове во нн 0 Но0мезвяюкт ме он нон ме рвяюєг, мо нн Но меоенжк сч 2 во нн 0 НО0мезвяюкт, о во нн но бом Нозеяюкї ма о ння ном птоо нн ножі воно ні 0 новяюкт см » оо нннелни но ноток, к- мо о о юні но но но (звязок ча патрон ояо10н0ббен вяюкіт мг іо вннІ нон сно овявк - 35 і -
Приклад 13: РСОМАЗ-ЕЕ-МІ КЗ, реОМАЗ-ЕЕ-МІ КЗ (К144К)
МІ КЗ клонували, як описано ЦІ ее, еї аЇ., (Опсодепе, 1993, 8, 3403-3410; Егое, еї аЇ., Опсодепе, 1994, 9, 935-938)). КДНК одержували з 200нг поліаденілованої мРНК меланоцитів, і 595 реакційної суміші використали як матрицю, щоб ампліфікувати набір КДНК РТК, використовуючи суміші або двох, або чотирьох високо вироджених « олігонуклеотидних праймерів, одержаних з консенсусних послідовностей консервативних субдоменів МІБ і ІХ -о відомих РТК: РТК1Т, 9-СОБАТССАСМОІБАМУТ-3 (5ЕО ІЮО МО: 1); РТКО, У-ВБААТТССАМАСОСАССАБАСКТО-3 с (ЗБЕО 10 МО: 2); РТКЗ, 5-СОБАТССКТІСАУМОІСАУМТІОСІЗСІМОСІАА-3 (5ЕБО 10 МО: 3); РТКА4, :з» 5-СБААТТПАХІССАМАІСМССАІАСКТСІЗМУ-3 (ЗЕ ІЮО МО: 4). Було виконано сорок циклів ПЛР з використанням
ДНК полімерази Тад (Атрії-Тад; Регкіп-ЕІтег/Сей5) і автоматизованого термоциклера ДНК; кожний цикл бкладався з 4Осек. при 942, 2хв. при 372С і Зхв. при 632С. Об'єднували продукти восьми ПЛР, обробляли -1 ДНК-полімеразою (Кленова) розщеплювали Ватні плюс ЕсоК! і піддавали електрофорезу в 5905 поліакриламідному гелі. При фарбуванні бромідом етидію ідентифікували переважаючу смугу, відповідну ве 200-230Оп.н., яку вирізали, елюювали і клонували в М'Зтр18. У одному експерименті частину кДНК, -1 ампліфікованої за допомогою ПЛР, не розщеплювали, а замість цього клонували тупими кінцями в МіЗтрі18, 20 розщеплений Зтаї!. Нуклеотидні послідовності визначали за допомогою методу секвенування з термінацією - ланцюга. кз Одна кДНК, ідентифікована як РТКІ, була використана як проба для скринінгу бібліотек КДНК меланоми і меланоцитів людини. Клон, позначений РТК 1-3.2, включав в себе повну відкриту рамку зчитування довжиною 2541н., що кодує білок з 847 амінокислот. Цю кКДНК розрізали Месої, затупляли кінці ДНК-полімеразою (Кленова), вв ЗНОВУ розрізали Есокі і лігували у вектор РСОМАЗ-ЕЕ, який був розрізаний Ватні, кінці якого були затуплені і який потім був розрізаний ЕсоКІ. Вектор рСОМАЗ-ЕЄЕ був сконструйований шляхом вбудування в (Ф; Ніпап/Ватні-сайт олігонуклеотиду, який кодує стартовий кодон, після якого слідує епітоп ЕЕ, МЕЕЕЕУМРМЕ ко (5ЕБЕО ІЮ МО: 5) |ОСгиззептеуег, еї аіІ., Ргос. Май. Асад. Зеї. ОБА, 1985, 82, 7952-7954). Неактивна, як кіназа, версія ("мертва" кіназа) МІ КЗ була одержана шляхом створення мутації К1І44К за допомогою ПЛР, із во застосуванням технології, опублікованої раніше |Спеп, еї аї., Віоїесппідцез, 1994, 17, 657-659). Першим мутагенним оолігонуклеотидом був 5-зЗТооСТТОСОООСАСсСТСОССАс-3 (5БО 10 МО: 6) і другим олігонуклеотидом був 5-САСАСССТОБАТСТСОСОСТТ-3 (ЗЕО ІЮ МО: 7). Ці олігонуклеотиди були використані в
ПЛР, де як матриці використали МІ КЗ, щоб утворити фрагмент довжиною 806бп.н., і застосовували у другій
ПЛР-реакції, використовуючи праймер Т7 як іншого амплімеру і МІ КЗ як матриці, щоб утворити фрагмент дб довжиною 1285п.н. Фрагмент відділлли шляхом електрофорезу в агарозному гелі, виділяли, клонували в рОЕМ-5 (Рготеда) і секвенували. Фрагмент розрізали Ніпайі! і Нраї, і вбудовували в РСОМАЗ-ЕЕ-МІ КЗ, розрізану
Ніпай ї Нраї. Була виявлена додаткова крапкова мутація в нуклеотиді 1342. Щоб її виправити, з МІ КЗ дикого типу вирізали РИМІ фрагмент (н. 1093-1418) і використали, щоб замінити ідентичний фрагмент в МІ КЗ, що має мутацію К144К.
Приклад 14: рЕВ-РІГ АО-МІ КЗ
Щоб одержати білок МІ КЗ, кКДНК була клонована в бакуловірусний експресуючий вектор рЕВ-РГ АС. МІ КЗ була вирізана з РТК1-3.2 шляхом переварення Мсої, затуплена ДНК полімеразою (Кленова), знову розрізана
Мой і лігована в рЕВ-гЇ АС, переварений 5іш! і Мой. рЕВ-гРГАС одержаний з рЕВ (Ше Тесппоіодієв) і має послідовність, що кодує епітоп РАС ГНорр, еї аї.. ВіоФесппоіоду, 1988, 6, 1205-1210) зі стартовим кодом,. 70 МОУКОООК (ЗЕО ІЮ МО: 8), доданим до полілінкера в Ватні сайті.
Приклад 15: рЕВ-55Т-МІ КУ(КО)
Бакуловірусна експресія кіназного домену МІ КЗ була досягнута шляхом вирізання фрагмента МІ КЗ з рРОЕХКО-МІ КЗУ(КО) з використанням Есокі і Хпої, і його лігування у вектор рЕВ, розрізаний Есокі і Хпої, в якому вище за течією була клонована кодуюча послідовність глутатіон-З-трансферази (551). Це було досягнуто /5 завдяки одержанню послідовності, що кодує 51, і полілінкера з вектора рОЕХКО за допомогою ПЛР з використанням вектора як матриці ІСпцап, еї аї., Апаї. Віосп., 1991, 192, 262-267). 5''олігонуклеотид для ПЛР створював сайт рестрикції В912 на 5-кінці фрагмента. Цей виділений фрагмент потім переварювали Ва12 і
НіпОЗ і лігували в рЕВ, переварений Ватні І НіпО3.
Приклад 16: РОЕХКО-МІ КЗ (КО)
Фрагмент ДНК, який включав в себе як кіназний домен МІ КЗ, так і частину лейцинового "зіппера" (н. 736-1791), був одержаний ПЛР з використанням РТК!1 кКДНК. Виділений фрагмент переварювали ферментами рестрикції ЕсоКіІ і Хпої, сайти для яких були включені в олігонуклеотиди для ПЛР, і клонували в рОЕХ-КО, перевареному ЕсокіІ і Хпої. Потім цей фрагмент в РОЕХКО був укорочений за допомогою ПЛР, щоб він включав тільки кіназний домен (н. 736-1638). сч
Приклад 17: рКНЗ-МІ К2, рКНЗ-МІ КА(КА)
МІ К2 клонували з використанням виродженої ПЛР |Оогому, еї аї., Еиг. У. Віоспет . 1993, 213, 701-710; (8)
Оогому, еї аїІ.,, Ецг. 9. Віоспет., 1995, 234, 492-500). Сегменти кДНК, що кодують каталітичні субдомени протеїнкіназ в лінії епітеліальних пухлинних клітин Соіо 16, ампліфікували на РНК за допомогою ПЛР із зворотною транскриптазою. Вироджені праймери ПЛР були створені на основі послідовностей, що кодують с зо Консервативні мотиви в субдоменах МІБ і Мі каталітичних кіназних доменів сімейства рецепторів епідермального фактора росту. Праймери мали наступні послідовності: прямий праймер, - 5-СОбАТССОТО(А)САСС(АТ(СО)С(АЗАСС(ТТ-3 (ЗЕО ІО МО: 9), зворотний праймер, Кк. 5-СбААТТСАССА(О)ТАА(О)СТССАС(СІАСАТО-3 (ЗЕО І МО: 10). Декілька продуктів ПЛР було клоновано в
М13 і секвеновано за допомогою набору для секвенування Т7 Зирег-Вазе (Вгезайїес). Один продукт ПЛР «
Зб ДОВЖИНОЮ 216п.н. був використаний як проба-для скринінгу. Х9111 бібліотеки КДНК товстого кишечника людини ї- (Сіопіесі, номер за каталогом НІ 10346). Фрагмент мітили з випадковим праймером, гібридизацію проводили при 652С, і фільтри промивали в умовах жорсткості 0,2 Х МасСі/цитрат (150мММ хлорид натрію, 15мМ цитрат натрію, рН 7,0) і 0,596 505 при 6590. Авторадіографію фільтрів проводили протягом 16 годин при -702С на плівці Кодак «
ХАБК-5. Були виділені чотири клони, і самий довгий з них, довжиною 1,2т.п. н., був використаний як повторний 70 зонд для тієї ж бібліотеки при тих же самих умовах. Були відібрані ще чотири клони, і один з цих клонів являв - с собою фрагмент МІ К2 довжиною 1034п.н. Цей клон був використаний як проба для 7Ха4ай10-бібліотеки мозку и людини. Перевірено приблизно 500000 клонів, і виділений один клон довжиною 3454п.н., що являє собою повний є» кодуючий район МІ К2.
МІК2 була клонована від АТО до поліА-хвоста у вектор РКНЗ між сайтами Ватні і ЕсоКіІ в два етапи, оскільки в середині послідовності МІ К2 є Ватні сайт. Вектор рРКНЗ був сконструйований шляхом вбудування -і трьох піків НА епітопа (ад і наступним далі ВатНі сайтом між сайтами Хбваї і ЕсоКіІ полілінкера рКК7. Щоб їх одержати мутантну версію, К125А, 5 Ватні фрагмент МІ К2 був клонований у векторі Рготеда рАГег і підданий мутації, як рекомендовано виготовлювачем. Потім фрагмент був клонований назад у вектор МІ К2 ркн3. -і Приклад 18: рсоОМАЗ-НА-ЮМК1 -1 50 УМК1 кДНК була одержана як описано (Сово, еї аї. (СеїІЇ, 1995, 81, 1137-1146)). КДНК була одержана ПЛР з використанням як матриці кКДНК скелетного м'яза людини (Іпийгодеп), і була клонована в Ваді2/ЗаїЇ сайти до) рсОМАЗ-НА, модифікованої рсОМАЗ експресуюючої плазміди, що кодує епітоп НА Г|Міїзоп еї аї., СеїЇ, 1984, 37, 767-778). Потім вона була вирізана з рсОМАЗ, включаючи епітоп НА, і лігована в рОЕХ-41Т3 (РНагтасіа). УМК1
КДНК була вирізана з конструкції РОЕХ-4Т3 у вигляді Во12/За!1 фрагмента і лігована в рсОМАЗ-НА, вектор з епітопом НА, доданим в НіпОзЗ/Ватні сайт рсрМАЗ. о Приклад 19: рЕГАС-ПІ Кк
ОК була клонована в експресуючий вектор рсрМАЗ з епітопом РІГ Ас, приєднаним як описано |Ноі2танп, еї аї. іме) (9. Віої. Спет., 1994, 269, 30808-30817))Ї. Фрагмент кКДНК для 01 К був виділений з допомогою ПЛР клонування, заснованого на використанні вироджених олігонуклеотидів. Сумарну РНК екстрагували з нирок (32 органи) на бо 13,5 ембріональний день і з нирок (16 органів) на 17,5 ембріональний день, використовуючи спосіб на основі фенол/гуанідин-ізотіоціонатного реагенту, що серійно проводиться, відповідно до інструкцій виготовлювача
ІТКІ20! Кеадепі, Ше Тесппоіодіеєв, Іпс.Її. Після переварення вільною від РНКази ДНКазою | РНК піддавали зворотній транскрипції РНКазою Н - зворотною транскриптазою (|Зирегзсгірі, І Ме Тесппоіодіев, Іпс.| з синтетичного оліго(аТ) олігонуклеотидного праймера до однониткової кКДНК. Вироджені олігонуклеотидні 65 праймери, що відповідають каталітичним субдоменам Мів і ЇХ тирозинової протеїнкінази, початково розроблені
МУК (МУйК5, Ргос. Май. Асад. Зеї. ИБА., 1989, 86, 1603-1607), були модифіковані для 5-ЕсокКі і
Ніпапі-сайтів, відповідно (5-АТААТТО(ОТ)ОС(ТАОС)ВССА(СА)ХТС(ТАСОСОоСТОо-3 (5БО ОО МО: 11), 5-АТААОСТТСС(ТОХАС) ПОСІЛА ТОА(ТСОС) СС(АСОСОСС(СТ)БА-37 (5ЕБО ІЮО МО: 12). Проводили сорок циклів ПЛР протягом 1,5хв. при 942С, 2хв. при 372С і Зхв. при 6320. Додавали свіжі реактиви, і виконували ще 40 циклів перед останньою 10-хвилинною елонгацією при 7222. Одержаний в результаті продукт ампліфікації ДНК довжиною 200-210п.н. виділяли в гелі, субклонували в готову плазміду РОЕМ72К кю (Рготеда) і трансформували в Ев-сНегіснпіа соїї. Плазмідна ДНК була одержана з трансформованих бактерій з використанням набору Міпіргер, і частина була переварена ендонуклеазами рестрикції Есокі! і Ніпаїй; клони, що містять вставки, були секвеновані.
Фрагмент кКДНК СІК довжиною 195п.н., одержаний за допомогою виродженої ПЛР, радіоактивно мітили і використали для скринінгу приблизно 1 х109 рекомбінантів Опі-ЛАР ІІ (Зігаїадепе, Га доїа, СА), бібліотеки
КДНК мозку дорослої миші, одержаної з допомогою Ольго(ат)-праймерів |(Ноі2гтап, еї аї!., Мої. Сеї! Віої!., 1990, 10, 5830-5838). Фільтри гібридизували в буфері, що складається з 5095 формаміду, 5 х З5С, 3 х розчину
Денхардта, 0,2596 ЗО, мг/мл поліаденілової кислоти, і 200мг/мл ДНК сперми лосося, при 4290. Фільтри 75 промивали один раз при кімнатній температурі в 2 х З5С, 0,295 ЗО5 і двічі - при 659С протягом ЗОхв. Було ідентифіковано двадцять п'ять унікальних клонів; 10 клонів були очищені до гомогенності, проведена ексцизія іп мімо відповідно до протоколу виготовлювача, і проведене рестрикційне картирування. Два самих довгих клони (3401 і 3397п.н., відповідно, відрізняються тільки своїми 5' кінцями) були секвеновані вздовж обох ниток по всій довжині.
Фрагмент повнорозмірної Мой-Хпо! БІК кДдНК (3401п.н.) субклонували в еукаріотичний експресуючий вектор рсОМАЗ з промотором цитомегаловіруса (Іпийгодеп, зап Оіедо, С А) (конструкція названа рсоОМАЗ-ОІ К). Потім була створена мічена МНА-Меї РАС епітопом (ОУКООООК) (ЗЕО ІО МО: 13) конструкція (рЕГАС-0ОІ К). Щоб ампліфікувати фрагменти кДНК, які кодують 5' Ніпаїї сайт, консенсусну послідовність Козака в 0 К, що включає кодон ініціації АТО, епітоп РГАС, і послідовність відкритої рамки зчитування кКДНК ОК, що тягнеться від с нуклеотиду 88 до внутрішнього ЕсокКі сайта біля нуклеотиду 758, використали ПЛР. (Очищені з допомогою ВЕРХ о синтетичні олігонуклеотиди використали в еквімолярних кількостях: 5-АТАААОСТТССАСАСОССАТОСАСТАСААООСАСОАСОАТОАСААСОССТОССТСОСА / Т-САДАСССОАДАСА-З! (ЗЕО ІЮО МО: 14) для смислового праймера конструкції РІГ АС і У-САСАсооСсооСсСоостТоСтТ-3 (ЗЕО ІЮ МО: 15) для антисмислового праймера). Очищені в гелі, переварені НіпайШ і ЕсоК!І ампліфіковані фрагменти були с субклоновані в Ніп-4ПІ-ЕсоКІ, щоб одержати плазміду рсОМАЗ-ОІ К. Конструкції секвенували вздовж обох ниток, їм щоб пересвідчитися в точності Тад полімерази і збереженні рамки зчитування.
Приклад 20: рсоОМАЗ-МІ КІ в. 5 частина МІ К1 була одержана з баз даних ЕЗТ (інвентарний номер АА160611). Цей клон являв собою «т злиття між МІК ї іншою кКДНК невідомої природи. Він містив раніше не опубліковану 5' послідовність МІ К1 разом з частиною раніше опублікованого кіназного домену МІК! хОогому, еї а!І., Еиг. У. Віспет., 1993, 213, в. 701-710ї. Послідовність КДНК МІ К1 клону Е5ЗТ являє собою наступну послідовність:
СААТІСООСА СОАСАСОАСТ
« лю СОСАОСТОТС СОССбАСОАО ОССТОСТОбА СССОССАССТ ПААССАССОС 3 - СТОСОСАТСТ ТОСССАССАА СТАСОТОАСС ССОСОСАОСО ССТІСТОСАС . » п
ССОСТОССАС СССОбССОСоО АДОСАССССАС ТТОСТАСССО СССАТІСАСТ 45 . - ТОТТАСАААТ ТОАТІТТОСО САССТСАССТ ТОСААСАСАТ ТАТТСОСАТС щ» щ СОСООСТО ОСААСОТСТА ТОСТОСТІТС ТОСАТАСОСОо АТОАОСсТТОС -002 0 ТОТАААССА ССТСОССАСО АСССТСАТСА ОСАСАТСАСС САСАССАТАС
Із АСВААТОТІСО ССААСАСОСС ААОСТОТІСО ССАТОСТОАА ССАССССААС зв АТСАТТОССС ТААСАбООССТ АТОТСТОААб САССССААСС ТСТОСТІСОТ о САТОСАСТІТ ОСТСОТОСАО САССТІТОАА ТАОАСТОТТА ТСТООССАААА іме)
СОСАТІССССС АСАСАТОСТО СТОААТТОСО СТОТОСАСАТ ТОССАСАпОС 60
АТОСААСТАСТ ТАСАТСАТСА СОСААТІСТІ СССАТСАТОС АССОССАССТ
С
ТААСТССАСС АС (ЗО 10 МО. в Вона транслюється в послідовність:
МЗАКЕрЗОМ5
СОЕОСУМТООЇ, МОВУСІЕРОМ ЖУУТРЕЗАКЕВЗ КСОРОССЕОРО СУРРМІОТТ ТІ , .
РЕАЕМТОЕКІ ІССЕСКМУТУ ВАБУЮОЕМА УКААКНОРОЕ РІЗОПЕМУВ.
ОБАКІКАМІК ОНРМПАТВСУ СІКЕРМІСІМ МЕВАКСОРЬМ ВУТ5СКАТРР тю ВП ММЖАМОЇ АКОММУ НОВЕ АТМ РІНКОЇ, КУМ (520 10 МО:17), 3 частина МІ К1 на початку була клонована з допомогою виродженої ПЛР, як опубліковано раніше |Оогому, еї а!І., Ешиг. У. Віспет., 1993, 213, 701-710). Протокол клонування 3' частини МІ К1 був таким, як описано вище для
МІК2, з наступними виключеннями. З чотирьох клонів, одержаних при повторному скринінгу бібліотеки за допомогою клону довжиною 1,2т.п. н., три клони являли собою МІ К1. Жоден з клонів не містив повного кіназного домену, який був одержаний з допомогою ПЛР.
Фаг з аліквотких проб ампліфікованих бібліотек (КДНК нормального епітелію товстої кишки людини і кКДНК лінії клітин карциноми товстої кишки людини Т84 в 1 Опі-7АРХК (Зігаїадепе, номер за каталогом 937204) об'ємом 1мл лізували шляхом суспендування в 20мл води і вмить заморожували. Зразок об'ємом 5мл лізованого фага ор Використали як ПЛР матриці в двох реакціях для кожної бібліотеки. Праймери, що представляють вектори, були взяті з нуклеотидних послідовностей, фланкуючих сайти клонування. У разі бібліотеки лінії клітин товстого кишечника Т 84 були використані праймери для секвенування ТЗ і 17 (Рготеда). В кожній реакції один праймер був з 3-5 нитки гена МІ КТ, приблизно 1ООп.н. 5' кінці відомої послідовності. Другим праймером був один з двох векторних праймерів. Реакційна суміш ПЛР містила ЇХ буфер для ПЛР, 2,5мММ хлорид магнію, Тед. сч полімерази Тад (всі реактиви з Вгезай(ес), 002ММ дНтТФ і 04мММ кожного праймера в загальному об'ємі 50мл.
Умови реакцій були наступними: бОсек. при 959С, УОсек. при 522С, 9УОсек. при 722С в ході ЗО циклів, з 15 (о) хвилинним часом елонгації в останньому циклі. Продукти ПЛР були клоновані і секвеновані як описано вище.
Самий довгий клон з відібраних в бібліотеці і фрагмент ПЛР, який включав в себе додаткову послідовність МІ К1, були ліговані один з одним, щоб одержати кКДНК МІ К1 довжиною 1,08т.п.н. в РОС18. с зо Клон МІ К1 з бази даних Е5Т був представлений у векторі рВішезсгірі (Зігаїадепе). КДНК МІ КІ з бібліотеки товстого кишечнику була лігована в клон Е5Т за допомогою переварення вищезазначеної кКДНК Есокі, в. затуплення кінців фрагментом Кленова, потім розрізанням АТІЇ. Цей виділений фрагмент був клонований в кКДНК їм-
МІК з бази даних ЕЗТ, яку розрізали Хпої, кінці якої затупляли фрагментом Кленова і розрізали АТІЇ. Потім ця нова конструкція була вирізана з рВішезсгірі шляхом переварення Мо! і Араї, і лігована в рсОМАЗ-ЕЕ, також « розрізаний Мо і Ара1. Послідовності всіх сполук при клонуванні перевірялися. їм-
Приклад 21: Експресія О5Т-МІ КЗкор в Е. сої
Е. соїї лінії ВГ 21 трансформували рРОЕХКО-МІ КУ(КО) шляхом електропорації. Бактерії, що містять плазміду, інокулювали в 15 літровий ферментер Арріїкоп в 10 літрів наступного багатого середовища: 1,95г/л КоНРО,,
О,Ог/л КНЬРО»Х, 0О,1г/л ампіциліну, О0,Зг/л (МН.л)»зОХ, 0,92г/л Ма5зО,).7НьЬО, 42,7мг/л цитрату Ма, 21,8мг/л «
РебО,.7НьЬО, О,5мл мікроелементів металів Ріспіа |Ніддіп5, еї аї,, Меїфйоавз Моїіесціаг Віоіоду, 1998, 103, е-) с 149-177), 20г/л казамінових кислот, 40г/л гліцерину, 25,5мг/л Сад». Бактерії вирощували протягом ночі при ц 800боб/хв/6895 розчиненого кисню/302С доти, поки культура не досягне ОО 600-4,4. Продукцію рекомбінантного "» білка індукували доданням 1мМ ізопропіл- р-О-тіогалактозиду, при безперервній ферментації при 2590 тривалістю до 6 годин. Потім бактерії витягували центрифугуванням, і клітинну пасту зберігали в замороженому вигляді при -202С; до очищення. -і Приклад 22: Очищення бактерійної ЗЗТ-МІ КЗко ї» Частково очищену З5Т-МІ КЗко одержували шляхом озвучення 100г пасти бактерійних клітин в 100мМ трис-НСІ, 150мММ НОСІ, 1мММ ЕДТА, 5мМ дитіотреїтолу (ОТ), рН 7,5 (буфер А). У розчин додавали тритон Х-100 до -і 195, потім розчин перемішували на льоду протягом 1 години. Надосадовий розчин після центрифугування -1 50 протягом 45хв. при 20000 х д перемішували протягом 1 години на льоду з 1Омл смоли глутатіон-сефарози 48 (Рпагтасіа), урівноваженої буфером А. Осаджену смолу двічі промивали 12,5 х об'ємом буфера А, потім
Ко) елюювали 20мл 10ММ трис-НСІ, 150мМ Маї, 5мМ ДТТ (буфер В), що містить 20мММ глутатіону, рН 7,5. Білок діалізували протягом ночі проти буфера В, і зберігали в аліквотних пробах при -8020.
Приклад 23: Бакуловірусна експресія РІ АС-МІ КЗ ії 5Т-МІ КЗкКо оо Рекобинантні бакуловіруси, експресуючі РГАС-МІ КЗ ії З5Т-МІ КЗКО були одержані з відповідних векторів о перенесення, рЕВ-гГ АО-МІ КЗ ї рЕВ-о551-МІ КЗ Ко використовуючи систему ВАС-ТО-ВАС (І Ше Тесппоіодіев), відповідно з інструкцією виготовлювача. Суспензійні культури клітин 5121 |Мацопп, еї аї., іп Міо, 1977, 13, ю 213-217) вирощували при 272С/120 об/хв в доповненому середовищі Грейса (Ніпк, Майшге. 1970, 226, 466-467) з 10965 інактивованою нагріванням фетальної сироватки теляти (ЕВС). Дпя одержання рекомбінантної РІ АС-МІ КЗ 60 клітини 5121 при щільності 1,5х1Оклітин/мл доповненого середовища Грейса, що містить 595 ЕВ5, інфікували багаторазовими зараженнями (МОЇ) 3,1 і збирали через 39 годин після зараження. Для одержання рекомбінантної З5Т-МІ КЗКО клітини 5221 при щільності 1,5х10Уклітин/мл доповненого середовища Грейса, що містить 5956 ЕВ5, інфікували МОЇ 2 і збирали через 41 годину після зараження. У обох випадках осад клітин ресуспендували в буфері, що містить 10ММ НЕРЕ5, 50мММ Масі, 0,5мМ Регаріос ЗС, 5мкМ пепстатину, 1Омкг/мл бо апротиніну, ТОмкг/мл лейпептину, рН 7,4. Надосадовий розчин, одержаний після центрифугування протягом 1 години при 147000 х д, повторно доводили до рН 7,4 за допомогою ЗМ основного трису і потім перед очищенням зберігали при -709С.
Приклад 24: Очищення бакуловірусної ЗЗТ-МІ КЗко
Частково очищену бакуловірусну З5Т-МІ КЗКро одержували з допомогою глуіатіон-специфічної афінної хроматографії. До 1Омл екстракту клітин (26,6мг сумарного білка) додавали їмл смоли глутатіон-сефарози 48 (Рпатасіа) урівноваженої в 10ММ НЕРЕЗ, 150мМ Масі, рн 7,4 (буфер С), і білку давали можливість зв'язатися протягом 45хв. при 42С. Потім смолу промивали в колонці буфером С, об'ємом, рівним З0 об'ємам колонки, потім елюювали буфером С, що містить 20мМ глутатіону, об'ємом, рівним 5 об'ємам колонки. Об'єднаний кінцевий 70 продукт діалізували протягом ночі проти буфера С і зберігали в аліквотних пробах при -70260.
Приклад 25: Очищення бакуловірусної РІ АС-МІ КЗ
Частково очищену бакуловірусну РГАС-МІ КЗ одержували за допомогою антитіло-специфічної афінної хроматографії. Білок з 15мл екстракту (19,5мг сумарного білка) з доданням 0,1М Масі зв'язували на 0,25мл колонці з моноклональним антитілом М2 проти пептиду ЕГ Ас, зв'язаним з агарозною смолою (5Зідта), внаслідок 75 багаторазових завантажень (усього три рази). Перед хроматографією смолу заздалегідь врівноважували промиванням 5 колонковими об'ємами 50мМ трис-НСІ, 150мМ Масі, рН 7,4 (ТВ5), промиванням З колонковими об'ємами 0,1М гліцину, рН 3,5, після чого ще одним промиванням 5 колонковими об'ємами ТВ5. Рекомбінантний білок спочатку елюювали 5 колонковими об'ємами 0,2мММ РАС пептиду (М-Авр-Туг-І уз-Азр-Азр-Авр-Азр-ї ув-С) (ЗЕО ІО МО:18) в ТВ5. Білок зберігали в аліквотних пробах при -802С до аналізу.
Приклад 26: Домінантний негативний мутант: домінантний негативний мутант сімейства МІ К блокує загибель диференційованих клітин РС12, викликану видаленням фактора росту нервів
Лінію клітин РО-12, одержану з пухлини феохромоцитоми пацюків, широко використали як моделі нервових клітин для вивчення молекулярних подій, що приводять до загибелі нейронів |для огляду, дивись Тгоу, еї аї.,
Аду. Мешгоіоду, 1997, 103-111). Фактор росту нервів (МОБ) індукує клітини РО-12 до диференціювання в клітини Ге з фенотипом симпатичних нейронів |(Сгеепе, Сеї! Віо!., 1978, 78, 747-755). Виживаність диференційованих під (5) дією МОРЕ клітин РО-12 залежить від МОР, і вони зазнають морфологічно описаної апоптозної загибелі при видаленні МОРЕ з культурального середовища. Була розроблена клітинна система для визначення впливу представників сімейства кіназ змішаних ліній на загибель клітин РО-12 внаслідок видалення МОР. Клітини РО-12 трансфекували кДНК, що кодує домінантний негативний (ОМ) мутант МІіК-3, використовуючи систему С перенесення на основі ліпідів Ріх, як рекомендовано виготовлювачем |(Іпмігодеп, Сагізрад, СА). Стабільний пул м трансфектантів, експресуючих ЮМ-МІ К-3 відбирали, використовуючи сульфат (418 |Меадіа(есй Іпс., Нетаоп,
МА). Приблизно 3095 клітин в цих пулах експресують ОМ-МІ КЗ, як було визначено з допомогою імуногістохімії. -
Пули клітин, стабільно експресуючих мутантну кіназу, висівали на покриті поліорнітином/ламініном (1Омкг/мл « кожного в фосфатно-сольовому буфері) планшети 9б-лункової форми для культур тканин при щільності
Зо 2х10"клітин/лунка, і обробляли 1ООнг/мл МОРЕ протягом 7 днів. Середовище, що містить МОРЕ, видаляли, в. моношари клітин промивали фосфатно-сольовим буфером, і на 1-5 днів вносили в середовище, що містить антитіла, нейтралізуючі МОРЕ (номер за каталогом 6655; Зідта, 5. І оці, МО) в кінцевому розведенні 1:1000.
Виживаність клітин визначали кількісно за допомогою аналізу виживаності клітин на основі перетворення солі « тетразолію, МТ5, в забарвлений формазан, який реєстрували за поглинанням при 57О0нм на СуюБіцог 2350
ІМіПіроге, Веатога, МА) як рекомендовано виготовлювачем |Рготеда, Мадізоп, М/І). Пули стабільно експресуючі не) с ОМ-МІ К-3 частково були врятовані від загибелі клітин, викликаної видаленням МОБ (Фігура 10). "» Приклад 27: Аналіз ензиматичної активності рекомбінантного МІ К білка " Щоб показати, що МІК білок, експресрований або в бакуловірусний, або в бактерійній системі експресії, є ензиматично активним білком, може бути використано декілька видів аналізу. МІК білок може бути повнорозмірною конструкцією або кіназним доменом, експресованими або в бакуловірусній, або в бактерійній
Ше системі експресії. Аналіз може бути заснований на антитілах, наприклад твердофазний імуноферментний аналіз ї» (ЕПІЗА), флюоресценція з тимчасовим дозволом (ТКЕ), або поляризація флюоресценції (ЕР). Антитілом може бути моноклональне або поліклональне антитіло, реактивне проти фосфосерину, фосфотреоніну або і фосфорилованого специфічного субстрату. У альтернативному випадку може бути використаний метод, не -І 20 заснований на антитілах, такий як аналіз радіоактивності в гелі (дивись Фігуру 11), множинний скринінговий аналіз на основі преципітації трихлороцтовою кислотою (ТХО) (Фігура 13), виявлення схожості при і» сцинтиляційному аналізі (5РА), спосіб скринінгу з використанням ПазПпріаїе, або різновид аналізу на нітроцелюлозних фільтрах (Фігура 13).
Метою аналізу може бути контроль безпосереднього фосфорилування субстрату або зв'язаної системи, що 22 аналізується, що використовує кінази сигнального шляху нижче за течією. Субстрат може бути специфічним (ФІ субстратом, таким як ЗЕК-1, або відносно неспецифічним субстратом, таким як основний білок мієліну (МБР).
Приклад 28: Аналіз кіназ: о (1) Аналіз кіназ на основі вимірювання радіоактивності в гелі.
Кіназну активність МІ К-3 досліджували, контролюючи включення ЗР з Іу-2гРІАТФ в субстрат МІК бо (наприклад, "мертву" кіназу БЕК-1; основний білок мієліну). 5ХОмкл суміші для аналізу містили буфер А (20ММ
МОРБ, рН 7,2, 25мМ Д-гліцеринфосфату, 5мМ ЕГТА, 1мММ ортованадату натрію, ММ дитіотреїтолу), 15мММ
МасСІ», 100мкМ АТФ, 1Омккюрі Іу-гРІ-АТФ, і Оїмкг субстрату - "мертвої" кінази 5ЕК-1 (Зігезздеп, Іпе; зв'язану з глутатіон-5-трансферазою ЗЕК-1 (551Т-5ЕК-1) вивільняли з глутатіон-агарозних кульок з допомогою 65 10мММ глутатіону, рН 8,0 або 25мкг МВР (Зідта Спетіса! Со.). Реакцію ініціювали доданням МІ К білка (кіназний домен або препарат, що містить як повнорозмірний білок, так і кіназний домен) або контрольного білка. Суміш інкубували протягом ЗОхв. при 3020. У кінці реакції додавали 2х поновлюючих буфери для зразка. Суміш кип'ятили протягом 5хв., наносили або на 1295 ЗО5-ПААГ гель (при використанні як субстрату МВР) або на 890 гель (при використанні як субстрату ЗЕК-1). Після електрофорезу гель сушили. Кількісне визначення включення фосфату в субстрат, ЗЕК-1, виконували на приладі для реєстрації динаміки молекулярного фосфорилування (Моїесшаг Рупатісв РПозрогітадег, З!иппумаіе, СА). Результати експериментів, призначених для того, щоб показати ензиматичні активності, експресованої бакуловірусами МІ К-3 (мічена РАС повнорозмірна, або мічений 5 кіназний домен) з використанням як субстрату "мертвої" кінази ЗЗТ-5ЕК-1 або МВР, показані на
Фігурах 11А і 118. 70 (2) Вестерн-блот аналіз.
Кіназну активність експресованої бакуловірусами МІ К-3 оцінювали за допомогою імуноблот аналізу. Суміш для аналізу об'ємом 20мкл містила буфер А, 15ММ МаосСіІ», 100мкМ АТФ, і 0,1мкг субстрату - "мертвої" кінази
ЗЕК-1. Реакції дозволяли продовжуватися протягом ЗОхв. при ЗО С, потім гасили 1Омкл 4х поновлюючого буферу для зразків. Білки розділяли в 895 трисгліциновому гелі, і з допомогою електрофорезу переносили на 75 мембрану ІттоБріоп РМОБ. Мембрану інкубували з антитілом, специфічним, для фосфорилованого 5ЕК-1 (Тиг223) (Мем Епдіапа Віоіарв, Іпс.), після чого з міченим пероксидазою хріну антикролячим |дс кози (Віо-Кад). Реєстрацію імунореактивних смуг виконували за допомогою посиленої хемілюмінісценції (Атетепат).
Фосфорилування "мертвої" кінази З5Т1-5ЕК-1 білком РІГ АС-МІ К-3 (бакуловірусний препарат, що містить як повнорозмірний білок, так і кіназний домен) показано на Фігурі 12. (3) Множинний скринінговий аналіз на основі преципітації трихлороцтовою кислотою (ТХО).
Кіназну активність кіназного домену О5Т-МІ К-3, експресованого бактеріями, оцінювали з використанням множинного скринінгового аналізу "в планшетах" МійПроге з трихлороцтовою кислотою (ТХО), який описаний
ІРІН, еї аї., 9У. Віотої. Зсгеепіпуд, 1996, 1, 47-51). Аналізи виконували в 9б-лункових планшетах Юигароге для множинного скринінгу (МіПроге). Кожна суміш для аналізу, об'ємом 5Омкл, містила 20мМ Нерез, рН 7,4, 20мММ Га
Масі», 20мММ Мпсі», 2мМ ДТТ, 0,1мММ МазМо,;, Імккюри РУ АТФ і ЗОмкг МБР субстрату. Реакцію ініціювали (5) доданням МІ К білка і дозволяли продовжуватися протягом 15хв. при 37 «С. Реакцію зупиняли 25мкл 5095 ТХО.
Планшети залишали для встановлення рівноваги на ЗОхв. при 4 «С, потім промивали крижаною 2595 ТХО. У планшети додавали сцинтиляційну суміш, і радіоактивність визначали, використовуючи сцинтиляційний лічильник У/аіїас МісгоВеба 1450 РІ 05. Залежність утворення З2р-міченого МБР від дози білка показана на с
Фігурі 13. їч- (4) Аналіз на фосфоцелюлозних фільтрах.
Аналіз кінази виконували в 5Омкл реакційній суміші, що містить 20мМ Нерез, рН 7,4, 20мМ Мосі», 20мММ -
МпсіІ», 2мМ ДТТ, 0,1мММ МазмМоО,, 1 мккюри Г-Рг) АТФ і ЗОмкг МБР. Реакцію ініціювали доданням МІК білка і чЕ дозволяли продовжуватися протягом 15хв. при 37 9С. Реакцію зупиняли 75мкл 75мММ фосфорної кислоти.
Аліквоти погашеного розчину наносили безпосередньо на фосфоцелюлозну мембрану (Ріегсе). У - альтернативному випадку можуть бути використані 9б-лункові фосфоцелюлозні планшети для множинного скринінгу (Міїйроге). Мембрани промивали 75мММ НзРО». Зв'язаний З2Р-мічений фосфорилований МБР елюювали в пробірки для збору доданням 1М гідроокису натрію. Радіоактивність визначали методом рахунку Чоренкова в « 20 сцинтиляційному лічильнику ВесКктап (Зотегвеї, МУ). Утворення фосфорилованого МВР із збільшенням ш-в концентрації, експресованого бактеріями кіназного домену СЗТ-МІ К-3 показано на Фігурі 13. с Приклад 29: Аналіз з метою визначення скріплення сполук з рекомбінантними білками сімейства МІ К :з» К-252а (сполуки ІПІ-3; дивись таблицю 4), метаболіт індолокарбазолу видів Мосагаїа, зв'язується з різними серин/треоніновими і тирозиновими кіназами (|Апдеїез, еї аіЇ., Апаі). Віоспет., 1996, 236, 49-55; Кпідні еї аІ,, АпаЇ. Віоспет., 1997, 247, 376-381). Мічений тритієм К-252а ліганд був використаний для оцінки - скріплення з повнорозмірною рекомбінантною МІ К-З людини з неочищеного препарату інфікованих бакуловірусами клітин. (-НІК-252а специфічно мітили тритієм в З і 9 положеннях, завдяки контракту з МЕМ ве Кезеагсі ргодисів (ВіІПегіса, МА), і він мав питому активність 4Окюрі/ммоль. Реакцію скріплення проводили в -І 1мл в 9б-лунковому планшеті. Реакційна суміш містила 5ОММ буфера МОРЗБ, рН 7, 150мМ Масі, 5мМ Мпсі», мг/мл БСА, 199 ДМСО ії 025М І'НІК252а. Зразки готували в трьох повторах при концентрації Бмкг/мл 7 неочищеної одержаної на основі бакуловірусів МІ К-3. Неспецифічне скріплення визначали за скріпленням в
Кз присутності не міченого 1,2мкМ К252а, і віднімали з сумарного скріплення, щоб одержати специфічне скріплення.
При такому розведенні 12-1595 загальної кількості імпульсів було неспецифічно зв'язані з білком, і 75-8595 ЦИХ імпульсів були специфічно зв'язані з МІ К-3 (Фігура 14). Всі експерименти виконували протягом 2 годин при 426.
Комплекси ІНІК252а/МІК-3 збирали на фільтри УУпайтап СБ/С, використовуючи складальник Вгапаеїі, о промивали холодним МОРЗ/Масі буфером і рахували в бета - лічильнику УМаїЇас Місго. Проводили експеримент за насиченням скріплення, щоб одержати К д для К252а. Показаний зразковий результат одного з таких ко експериментів (Фігура 14). Було отримане значення Ку рівне 0,89нМ (кордону довірливого інтервалу: від 0,2 до 1,5НМ). бо Приклад З0: Аналіз інтактних клітин (А) Система понадекспресії Сов 7.
Матеріали.
К-252а і похідні цієї сполуки були надані (Кусжа-Накко Кодуо Со. (ЦЯ. (Токуо, дарап) (Капеко еї аї., 1997)). Сполуки розчиняли в диметилсульфоксиді (ДМСО), за рівнем якості, призначеної для культур клітин, і 65 зберігали в темряві при 42С. Всі розведення сполук проводили в середовищі Ігла модифікації Дульбекко (ОМЕМ), що містить 195 бичачого сировоточного альбуміну. Гемаглютининові (НА) антитіла були придбані в Варсо
(Кісптопа, СА). АР-1 (с-їп) субстрат був придбаний в Рготеда (Мадізоп, УМ). Іу-гРІДТФ (600Окюрі/ммоль) придбали в Атегзпат (Агіїпдіоп Неїднів, І).
Культура клітин Сов7.
Клітини нирки зеленої мавпи Соз7 одержували з АТСС, КосКмйШе, Магуїапа (СК 1651) і підтримували в
ОМЕМ, що містить 1095 бичачої сироватки, 2мММ глутаміну, 1мММ ттірувату. 5бод/мл пеніциліну/стрептоміцину при 372 в атмосфері з 1095 СО», 9095 повітря. Клітини Соз7 відділяли для пересівання доданням 0,2595 трипсину. (1) Понадекспресія представників МІ К сімейства і МК в клітинах Совз7.
Клітини Совз7 пасирували при 8095 конфлюентності, і трансфекували 2мкг кожної з конструкцій кДНК, 70 використовуючи ліпофектамін, як рекомендовано постачальником |Сібсо ВК, СайПпегериго, МО). Повнорозмірна
КДНК МІ К-3, МІ К-2 людини або 01 К миші, або неповна кКДНК МІ К-1 людини, які описані вище, і повнорозмірна
КДНК міченої гемаглютиніном А )МКІ людини, люб'язно надана у. Зіміо шКкіпа (МІН, Ве-(пезда, МО), були субклоновані в векторі рсеОМАЗ (Іпийгодепе, Зап Оіедо, СА). Через 48 годин після трансфекції клітини обробляли 0,02596 ДМСО або 500нНМ вказаних сполук протягом 2 годин, після чого лізували в О4мл буфера з 75 тритоном (1956 тритон Х-100, 50ММ хлорид натрію, 10ММ трис (рН 7,6), 0,195 бичачий сиовоточний альбумін,
ЗОмМмкМ пірофосфат натрію, 50ММ фторид натрію, 20мкг/мл апротиніну, мМ фенілметилсульфонілфторид, 1МмМ ванадат натрію). Активність УМК лізату аналізували за допомогою імунопреципітації/кіназного аналізу, як описано нижче. (2) Імунопреципітація і кіназний аналіз на цілих клітинах.
У лізаті клітин Соз7 вимірювали концентрацію білка, використовуючи набір Місто ВСА Ріегсе (КоскКога, І), і рівні кількості білка піддавали імунопреципітації з НА антитілами протягом 1 години при 42С. Імунопреципітати осаджали шляхом центрифугування в мікроцентрифузі протягом 20сек. або ресуспендували в тритоновому буфері, промивали центрифугуванням ще 2 рази, після чого робили останнє промивання в кіназному буфері (20мМ Нерез, рН 7,4, 20мМ Маосі», 2мМ дитіотреїтол, О0,1мМ ванадат натрію). Імунопреципітат ресуспендувалив 8 «М кіназному буфері, що містить їмкМ АТФ і 5 мккюри Іу-гРІДТФ і субстрату (Імкг/зразок АР-1) і інкубували о протягом 15хв. при 302С. Кіназну реакцію зупиняли доданням поновлюючого буфера для зразка (І аеттії, Майге 1970: 227; 680-685). Зразки нагрівали до 802С протягом 5хв. і наносили на 1095 БЮО5-поліакриламідні гелі. Білки розділяли за допомогою електрофорезу. Гель сушили, і кількісне визначення радіоактивності в АР-1 субстраті проводили на приладі для реєстрації динаміки молекулярного фосфорилування (З!иппумаіе, СА). Результати с експериментів, в яких МІ К-3, МІ К-2 і 0І К експресувалися спільно з НА-/МКІ1 і були інкубовані при відсутності че або в присутності сполуки К-252а показані на Фігурах 15А і 158. Навпаки, похідне початкової сполуки К-252а, назване сполукою 1ІІ-3 (дивись таблицю 4), яка є більш виборчим інгибітором кінази, не впливала на МК шлях, - що активується іншим, ніж МК, МЕККТ МАРККК вище за течією, (Фігура 153). « (В) Аналіз МК, активованої МІ К, в цілих клітинах з використанням, репортера.
Зо Спроби одержання клонів, конститутивно експресуючих сімейство МІ К, виявилися невдалими, що свідчить ї- про те, що понадекспресія МІК може впливати на виживаність клітин (Вегдегоп еї а!., Віоспет. Віорпів. Кев.
Соттип., 1997, 231, 153-155; Мадаїйа, еї аіІ., ЕМВО )., 1998, 17, 149-158). Тому при розробці аналізу на цілих клітинах для стеження за біохімічними подіями, що індукуються МІК, може бути необхідна лінія клітин, що « містить одержану генно-інженерним шляхом систему експресії, яка індукується, цікавлячої кінази. Наприклад, лінія клітин РО-12, трансфікована регульованим тетрацикліном трансактиватором. У тому випадку, коли надалі но) с клітини трансфікують цікавлячим геном, керованим промотором, що індукується іео, експресія цього гена "» безпосередньо контролюється тетрацикліном в середовищі |Зпоскеїї, еї аіІ., Ргос. Май). Асад. Зеї. ОБА, 1995, " 92, 65221.
Щоб кількісно оцінити активацію МІК, можна виміряти фосфорилування розташованих нижче за течією субстратів, таких як МЕК4, МК або с-п за допомогою багатьох видів аналізу, які описані вище. Іншим це. підходом до кількісної оцінки активації МІ К в цілих клітинах є використання активності репортерного ферменту, ї» такого як с-їмп - люциферазна репортерна система, доступна для придбання завдяки Раїй-ЮОейесі тм системі (Зігабадепе, ГадоМйа, СА). У цій системі лінія клітин, що індукується тетрацикліном трансфікується двома 7 плазмідами. Одна плазміда конститутивно експресує МН»о-кінцевий трансактивуючий домен с)цп, злитий з -І 20 ДНК-зв'язуючим доменом САГ4 дріжджів (сдип-ОВО гібридний білок). Інша плазміда несе кодуючі послідовності люциферази світляка, керовані п'ятьма тандємними повторами сайта скріплення ЗА14. При активації М К о розташований нижче за течією субстрат МК, сдип-ОВО гібридний білок, фосфорилується, зв'язується з сайтами скріплення СА14 і індукує транскрипцію гена люциферази. Люциферазу легко аналізувати в лізатах клітин шляхом додання її субстрату (Рготеда, Мадізоп, М/І) і вимірювання хемілюмінісценції.
Приклад 31: Зв'язок інгібування представників сімейства МІК і виживаності мотонейронів і кортикальних
ГФ) нейронів
Виживаність культур спинного мозку пацюків, збагачених мотонейронами. о Розкривали спинний мозок ембріонів пацюків Зргадое-Оаулеу (Спапез Кімег І арогайогіев, ММіІтіпдіоп, МА) в ембріональному віці (Е) 14,5-15. Клітини тільки з вентральної частини спинного мозку дисоціювали, і потім 60 збагачували мотонейронами шляхом центрифугування на 6,595 ступінчастому градієнті метризаміду, як описано раніше |Непаегзоп, еї аї!., 1993), і аналізували їх чистоту шляхом фарбування антитілом проти рецептора нейротрофіну з низькою спорідненістю (Ідо-192, Воепгіпдег-Мапппеїт) (дані не показані). Клітини висівали в 9б-лункові планшети, заздалегідь покриті полі-1-орнітином і ламініном (бмкг/мл кожного) при щільності в5 бх10"клітин/см? в хімічно певному безсировоточному середовищі Мо |Войепвієїп, еї. аі., 1979, вище). Щоб розділити вплив на прикріплення і виживаність, додання сполук до культур проводили після початкового періоду прикріплення тривалістю 1-3 години. Виживаність нейронів визначали через 4 дні, використовуючи кальцеїн АМ (МоїІесшаг Ргорез, Едепе, ОК) при флюорометричному аналізі виживаності |Вогус2ко-Соупе, еї аї., 1993, вище).
Підраховування нейронів за допомогою мікроскопа прямо корелював з відносними значеннями флюоресценції.
Коротко, культуральне середовище серійно розводили в ОРВ5 (фосфатно-сольовий буфер Дульбекко) і потім в кожну з 96 лунок додавали маточний розчин кальцеїну АМ до кінцевої концентрації бмкМ. Планшети інкубували протягом ЗОхв. при 372С, з подальшими промиваннями серійного розведення в ОРВ5. Сигнал флюоресценції реєстрували, використовуючи зчитуючий планшети флюориметр Міїїроге (Суїойчог 2350) при довжині хвилі збудження -485нм і емісії -538нм. Для кожного планшета середнє фонове значення, одержане для лунки, в яку 7/0 вводили кальцеїн АМ, але в яких не було клітин, віднімали від усіх значень. У цих експериментах контролювали лінійність сигналу флюоресценції для концентрації і час інкубації для певних меж щільності клітин. Приклад виживаності мотонейронів, вираженої в відсотках від контролю, в присутності 25О0НМ сполук, що тестуються показаний в таблиці 3. Виживаність кортикальних нейронів.
Кору головного мозку плоду пацюків розтинали на 18 ембріональний день і переварювали ферментом, щоб 75 одержати суспензію окремих клітин. Клітини висівали при щільності 1,56х105/см? в покриті полі-орнітином/ламініном 9б-лункові планшети для культур тканин в безсировоточному основному середовищі для нейронів (Меган! Ваза! Медішт), що містить 827 добавки. Планшети покривали розчином полі-орнітину/ламініну (мкг/мл кожного), приготованого в РВ5, протягом, щонайменше, 2 годин при 372С. На 5-7 день культивування іп міго кортикальні нейрони піддавали впливу АБ25-35 (20мМкМ) або в присутності, або у відсутності сполук, що тестуються. Маточні розчини АБ25-35 (Зідта, 5ї. Іоціз, МО) (і мМ) готували в деіонізованній дистильованій стерильній Н-20. Відносну виживаність нейронів визначали через 48 годин після додання пептиду, використовуючи вивільнення лактатдегідрогенази (І ОН) як показника цілісності плазматичної мембрани/виживаності клітин. ОН вимірювали, використовуючи набір для реєстрації цитотоксичності (Военгіпдег-МагтНеїт, Іпаіапароїїв, ІМ) відповідно до інструкцій виготовлювача. Дані виражали у вигляді Ге відсотка інгібування вивільнення І ОН відносно культур, оброблених тільки одним АБ25-35. (5) 0000 Кортикальні нейгони| Мотонейгони 0 Сов клітини | Сов-7 клітини | Сов-7 клітини | Сов-? клітини й зо контролю при 250 нМ | контролю при 25ОНМ | при 5ХО0нМ інгіб.Ф0 БООНМ | інгіб.Ф0 БООНМ | інгіб.Ф0 БООНМ | інгіб.«ю 500нМ в - 00000100
ПОН ПОЕТ ЗИ НО ЗАЯВОЮ ННЯ ПОН УНН НОННОСЯ НОН я НИ НА зов 000100 6ж00010ет00вих00веа 00000000» вх «
З с Х означає СН». означає СНо.
Приклад 32: Імунопреципітація ендогенної активності /МК культур мотонейронів при відсутності або в це. присутності індолокарбазолів або конденсованих піролокарбазолів т» Очищені мотонейрони висівали при щільності бх1О"клітин/см2 на лунку діаметром 1бмм. Клітинам перед обробкою давали можливість прикріпитися протягом 2 годин. Клітини обробляли або 0,012595 ДМСО, або 500НМ - сполуки протягом 2 годин в певному середовищі М». Потім клітини промивали крижаним фосфатно-сольовим -І 50 буфером, після чого лізували в О4мл буфера з тритоном, як описано вище в прикладі 30. Лізат культур мотонейронів нормували за кількістю клітин і імунопреципітували за допомогою антитіла УМК1 (номер за їз каталогом зс-474), придбаного від Запіа Сги?2 Віоїесппоіоду (Запіа Сги7, СА). УМК активність імунопреципітатів аналізували в присутності З2Р-АТФ і субстрату с-ічп, як описано вище. Профіль інгібуючої активності 4 сполук, що тестуються порівнювали в мотонейронах і клітинах Со57, понадекспресуючих або ОІК, МІ К-1, МІ К-2, або
МІ-К-3 (таблиця 3).
ГФ) Приклад 33: Кореляція між інгібуванням Мі КЗ-індукованої активності ОМК в клітинах Со57 і з холінацетил-трансферазною активністю в первинних ембріональних культурах
Щоб визначити, чи існує кореляція між інгібуванням .МК шляху, регульованого цими кіназами, з во нейротрофічними сполуками, автори оцінили вплив сполук на активність ІМК в клітинах Сов7, понадекспресуючих НА-)МК і МІ КЗ. Після 48 годинного періоду трансфекції клітини інкубували із сполуками в концентрації БООНМ протягом 2 годин, після чого клітини лізували. Лізат імунопреципітували, і вимірювали кіназну активність як описано раніше. Результати представлені у вигляді відсотка інгібування відносно контрольного зразка, причому контролем є активність УМК в присутності ДМСО. Як можна побачити в таблиці 4, більшість сполук, які були активними відносно ХАТМН активності в спинному мозку і/або базальних відділах 65 переднього мозку, були потенційними інгібіторами активації УМК за допомогою МІ К-3.
Таблиця 4
Вплив індоло- і інденокарбазолів на активність МК в клітинах Со57, понадекспресуючих МІ КЗ і Активність холінацетилтрансферази Уо Інгібування активності ./МК (середнє значення) ти
ПЕНЯ ПИ ПО ННЯ КОС
ЩЕ то
ПОР ДИ ПИЛ ПО ЗОНИ ПО ав
Пил ПО ПОЛО ООН ПО ТО
ПИ с о ПО ПОЛ з Ос зн
ТТН ПИ ПО ЗОНИ КО НО
ТЕЗЕННИ ПИ Я НО ОНИ НО вир
ПЕСНИ НИК ЗИ ПОН НО З с отр
ЩШ-10 х 78 о в Гр
ЕЕ: ТИ ПОВЕ ЗОЛЯ ПОН КО
ТАКЕ ВЙ ПИ ПОН НО У
ПОН: НО ПО ПО КУ,
НИ ПО ЕС ЗИ ПО Я ОН НО НО
ВИХ ЕТО ПО ПОН КОН у
Сполука, що має формулу І, де 71 і 72 є Н, Х означає СОоСН»З; Ві означає МНСОМНС»НБ; Ко означає СНоСН»(2-піридил); і В означає ОН. чІ 2Сполука, що має формулу І, де 714 і 72 є Н, Х означає СОоСН»У; Ву і Бо означають СНОСНоОСНОоСН 3; і В означає ОН. М
ЗСполука, що має формулу І, де 714 і 72 є Н, Х означає СОоСН»У; Ву і Бо означають СНоОЗСНоСН; і В означає ОН. 4Сполука, що має формулу І, де Ач, Аг, Вл, Вз і Ву є Н; Ву і Во разом являють собою О; Во означає СНоСНоОН; Кб і Бб означають ОСН»; і Х означає СН». «
ЗСполука, що має формулу І, де Ач, Аз, Кі, Кз, Кв і Кв є Н; В. і Во разом являють собою 0; Ко означає СНоСН2ОАс; Б, і є Вг;, і Х означає СНо. бСполука, що має формулу І, де Ач, Аз, Р, Рз, ВБ і Ве є Н; Ву і Во разом являють собою О; Во означає СНоСНоОАС; Вуд означає СНоСНо в с (2-піридил); і Х означає СНО». з тСполука, що Має формулу І, де Ал, Аз, КІ, Кз, Ка, Кб і Кв є Н; В/ і Во разом являють собою 0; Ко означає СНоСНоОН; і Х означає СНо. 8Сполука, що має формулу І, де Ач, Аз, Кл, Кз, КА, Кв і Кв є Н; В/ і Во разом являють собою 0; Кз означає СНоСНоСНоОН; і Х означає СНо.
ЗсСполука, що має формулу І, де Ал, Аз, Кі, Ко, КЗ, КА, Кб і Кв є Н; В. і Во разом являють собою 0; і Х означає 5. -і 1осСполука, що має формулу І, де Ач, Аг, В, Ко, Кз, Ва, Б5 і Рв є Н; В / і Во разом являють собою 0; Ко означає СНЯСНнНоСНоМНСО(А-(ОНРИ),; і
Х означає СНо. пи п ! !
Сполука, що має формулу ІП, де 271, 72, КІ, і Ко є Н; Х означає СОЗ(СНо2г)д СН»; і К означає ОН. - 12Сполука, що має формулу ЇЇ, де 271, 72 і Кі є Н; Ко означає СНоОН; Х означає СОСНУ»; і К означає ОН. -І 50 1ЗСполука, що має формулу І, де 214 і 72 разом утворять 0; К/ і Ко є Вг; Х означає СОСНУ»; і К означає ОН. з 14Сполука, що має формулу І, де Ач, Аз, Ві, Вз, В5 і Ве є Н; В. і Во разом являють собою О; Ко означає Н; Ву, означає СНоСНо (2-пирімідиніл); і Х означає СНо. 15Сполука, що має формулу ЇЇ, де 74 і 72 є Н; Ку є Вг, Ко є І; Х означає СОСНУ»; і К означає ОН. 16 Сполука, що має формулу ІП, де 21, 72, Ку і Ко є Н; Х означає СОСНУ; і К означає ОН.
ГФ) 17Сполука, що має формулу ІЇЇ, де 214 і 72 є Н; Ку і Ко означає СНоСНоЗзСН»З; Х означає СОСНУ»; і К означає ОН. 18Сполука, що має формулу І, де Ач, Аз, Кі, Ко, Кз, Кв і Кв є Н; В/ і Во разом являють собою 0; К4 означає СНосСН»2 (2-піридазиніл); і Х іме) означає СНо. 19Сполука, що має формулу І, де Ач, Аз, Ві, Вз, ВБі Вв є Н; В. і Во разом являють собою О; Б» означає Н; Ва означає СНоСН»з (2-піридил); бо ї Х означає СН». 20Сполука, що має формулу ІІ, де 71, 72, В4 і Во є Н; Х означає СОСНУ»; і В означає ОСНУ. 21Сполука, що має формулу І, де Ач, Аз, Вл, Рз, Бі Бе є Н; В. і Во разом являють собою 0; Во означає (СНе)з-НН-С(:0)-3,5-дигідроксифеніл; і Х означає СНо. 65 22Сполука, що має формулу І, де Ач, Аз, Кі, Кз, Кві Кв є Н; В/ і Во разом являють собою 0; Ко є бензоілом; і Х означає СНо. 23Сполука, що має формулу І, де Ач, Аз, Кі, Кз, Кв і Кв є Н; В/ і Во разом являють собою 0; К4 означає СНАСН-С-М; і Х означає СНо.
Приклад 34: Аналіз активації МІ К за зміною рухливості в гелі:
Активація МІ К може приводити до індукції транскрипції с-їшп, і в результаті до збільшення кількості білка с-Уип. Збільшена кількість білка с-У0п може бути виміряна за допомогою стандартного аналізу, відомого як аналіз зміни рухливості в гелі. Робота |Сагпег, еї а!., Мисівіс Асідз Кез., 1981, 9, 3047-3060), яка включена тут у вигляді посилання в повному об'ємі. Радіоактивно мічені олігомери двониткової ДНК. які кодують
ДНК-зв'язуючий сайт с-дип, інкубують з екстрактом клітинних ядер, після чого проводять електрофорез в акриламідному гелі, і кількісно оцінюють радіоактивно мічену ДНК, смуги якої зсунені у бік більш повільної / рухливості. Ця ДНК являє собою частину ДНК, яка зв'язана з білком с-Уцп, і її кількість прямо пропорційна кількості білка с-)цп в екстракті.
Активація МІ К також може індукувати фосфориловані с-Уип. Це можна виявити, використовуючи антитіла, які специфічно пізнають фосфориловану форму білка в таких системах детекції, як, наприклад. Вестерн блот або
ЕПЗА.
Приклад 35: Виживаність нейронів ембріонів курчат т5 Матеріали
Середовища Лейбовіца І 15, глюкоза, бікарбонат натрію, трипсин і антибіотики були від (ірсо. М'язовий екстракт був приготований як описано |Непадегзоп, еї аїЇ.. Майшге, 1983, 302, 609-611, яка включена тут у вигляді посилання в повному об'ємі). Всі інші реактиви були від фірми Зідта, якщо не обумовлено особливо.
Культура клітин
Мотонейрони (5,5 ембріональний день) були виділені імунологічним метолом відповідно до процедури, представленої в роботі (Віосп-СайПедо, еї аІ., Оемеіюортепі, 1991, 111, 221-232), яка включена тут у вигляді посилання в повному об'ємі, з модифікаціями, описаними в роботі (МУепо, еї аїЇ., МешигоКерогії, 1996, 1, 1077-1081), яка включена тут у вигляді посилання в повному об'ємі. Очищені мотонейрони висівали в чашки для культур тканин діаметром Зб5мм (Мипс), заздалегідь покриті полі-ОЇ -орнітином і ламініном (мкг/мл. Орвзіайе см
Віоїесп). Була використана культуральне середовище І 15 з бікарбонатом натрію (22,5мММ), глюкозою (20ММ), (о) прогестероном (2х109М), селенітом натрію (З3хХ109М), кональбаміном (0,1мг/мл), інсуліном (бмкг/мл), пеніциліном-стрептоміцином, і 10905 інактивованої нагріванням сироватки коня. М'язовий екстракт додавали до концентрації ЗОмкг/мл. Сполуку ПІ-3 готували у вигляді 4мМ маточного розчину в ДМСО і зберігали в захищеному с зо від світла місці при 42С. Кінцева концентрація ДМСО в культурах, що обробляються і контрольних культурах становила 0,125905. в.
Паравертебральні симпатичні ганглії (50; 12 ембріональний день (ЕЇ2)), ганглії дорсальних корінців (ОКО; ї-
Е9) і циліарні ганглії (Со; Е8) вирізали з ембріонів пацюків у вказані дні ембріонального розвитку, як описано в роботі | упазеу, еї аІ., Оем. В ІОЇ., 1985, 112, 319-328), яка включена тут у вигляді посилання в « з5 повному об'ємі. Після обробки трипсином і дисоциації суспензії нервових клітин висівали в покриті ча поліорнітином-ламініном чашки для культивування в культуральне середовище Хама Е14 з доданням 10905 сироватки коня. Відразу ж після посіву додавали фактори виживання в наступних концентраціях: фактор росту нервів (МОР), 20нг/мл; циліарний нейротрофічний фактор (СМТРЕ), 1Онг/мл. Культури зберігали при 372С і 595 СО» в зволоженому навколишньому середовищі. «
Підрахунок клітин шщ с Нейрони висівали в чашки для культивування діаметром Зб5мм з нанесеною сіткою (Мипс). Вибрані площі й кожної чашки, що складають приблизно 1095 поверхні, сканували з метою виявлення присутності яскравих при «» фазово-контрастній мікроскопії клітин відразу після посіву і ще раз через 48 годин, щоб оцінити виживаність в відсотках. Виживаність клітин підтверджували вітальним фарбуванням трипановим синім (не показано).
Інтактні ОКО -І Ганглії висівали в 9б-лункові планшети, заздалегідь покриті полі-Б-орнітином і ламініном (5мкг кожних/мл фосфатно-сольового буфера) в безсировоточному середовищі М2 |Воцепзіевїп, еї а!., Ргос. Майї). Асайд. Зеї. ОА, о 1979, 76, 514-517, яка включена тут у вигляді посилання в повному об'ємі!), що містить 0,0595 бичачого -І сиоровоточного атіьбуміну (БСА). і підтримували протягом 48 годин при 37 2С і 596 СО в зволоженому навколишньому середовищі. Ганглії що обробляються одержували впливом або 250нМ сполуки ПІП-3, або 7 2Онг/мл МОБ через 2 години після посіву.
Кз Сполука ІІ-3 сприяє виживаності периферичних нейронів ембріонів курчат залежно від концентрації.
Видалення МОБ з культур дисоційованих чутливих нейронів гангліїв дорсальних корінців Е9 (ОКО) і нейронів симпатичних гангліїв ЕІ2 (50) приводило до того, що вони зазнавали РСО (запрограмована загибель клітин) протягом 48 годин. Цього запобігали доданням сполуки ІІ-3 в культуральне середовище під час видалення МОР.
При концентрації. їмкМ сполука 1-3 зберігала 9495 живих 50 нейронів і 8995 живих ОКО нейронів через 48 годин о (в обробленому МОР контролі: ЗО 6590; ОКО 6695). Схожим чином сполука ПІ-3 сприяла виживанню 7690 ко залежних від СМТЕ нейронів циліарних гангліїв (СО) через 24 годин (в СМТЕ-обробленому контролі 6790). При присутності 1095 сироватки вплив сполуки ІЇ-3 на виживаність залежав від концентрації, при цьому плато бо досягалося приблизно при 1мкМ для всіх трьох популяцій нейронів (Фіг.16А-С). У нейронів, що вижили виявляли широке розростання нейритів, при цьому нейрити були більш товстими і зігненими, в порівнянні з контрольними культурами (Фіг.17Е-Н). Через чотири дні стимулююча виживаність активність ще зберігалася без зміни: ОКО: сполука 1-3 5295, оброблена фактором росту контроль 4195; 50: сполука ІПІ-3 8396, МОБ-оброблений контроль 5590; Со: сполука ПІ-3 5895, СМТЕР-оброблений контроль 5095. При оптимальних умовах культури можуть 65 Підтримуватися із сполукою 1-3 протягом одного тижня і довше (не показано).
Сполука ІІ-3 сприяє виживаності ембріональних мотонейронів курчат залежно від концентрації.
Мотонейрони курчат, що культивуються можуть зберігатися і продовжувати розвиватися в присутності м'язового екстракту, тоді як при відсутності екстракту вони швидко гинуть. У експериментах авторів через 48 годин в присутності м'язового екстракту виживало 6595 мотонейронів, проти 14956 в необробленому контролі. У умовах відсутності сироватки максимальний ефект сполуки 1-3 був при ЗООНМ, і він був трохи вищим за (79905), ніж ефект, що індукується м'язовим екстрактом. Концентраційна залежність впливу сполуки ІІІ-3 на виживаність в цій системі відрізняється від такої для периферичних нейронів, оскільки концентрації сполуки ПІ-3 вищі за
ЗООНМ надавали поступову понижувальну дію (Фіг.1бА). Це могло свідчити про особливу чутливість мотонейронів до однієї з сторін активності сполуки ІПІ-3. Морфологічно мотонейрони, врятовані за допомогою 7/0 бполуки 1-3, виглядали яскравими клітинними тільцями при фачотюму контрасті, і були платні розповсюджувати довгі нейрити, які виглядали трохи товстішими, ніж нейрити, індуковані м'язовим екстрактом (Фіг.17). Після чотирьох днів культивування 5695 мотонейронів виживали в присутності сполуки ІПІ-3, в порівнянні з 4295 в присутності м'язового екстракту. При ЗООНМ оброблені сполукою І нейрони виживали іп міго, щонайменше, тиждень (не показано).
Сполука ІПІ-3 стимулює відростання нейритів від інтактних гангліїв дорсальних корінців.
Результати описаних вище експериментів свідчать про те, що сполука ІПІ-3 не тільки підвищує виживаність ембріональних нейронів периферичної і центральної нервових систем, але також приводить до могутнього відростання нейритів. Численні з цих паростків виглядають більш товстими, ніж ті паростки, що виявляються в присутності факторів росту (порівняй Фіг.17А-О з Фіг.17Е-Н). Цей ефект також спостерігався при відростанні 2о Нейритів, що виявляється в інтактних ембріональних гангліях дорсальних корінців, що культивуються в присутності 25О0НМ сполуки ПІ-3 (Фіг.18С). Нейрити відростали як у відповідь на МОРЕ (Фіг.18У), так і у відповідь на сполуки 1-3; нейрити, що витягуються при дії МОН, були набагато тоншими і більш розгалуженими, ніж нейрити, що відростають в присутності сполуки 1-3, які виглядали товстими і могли бути у вигляді пучка.
Приклад 36: Обробка іп мімо с
Регульована в ході розвитку загибелі мотонейронів в ембріонах курчат.
Даний експеримент детально описаний в роботі |СіІїсКетап, еї аїЇ., У. Меийгобіо!., 1998, 35, 361-370, яка (8) включена тут у вигляді посилання в повному об'ємі)Ї. На Еб робили вікно в шкаралупі курячих яєць (Зраїав,
Ргевіоп, СТ), і безпосередньо в оболонку хоріоалантоїсу, пронизану кровоносними судинами, вводили або наповнювач (595 Зо|цшіоїтм Не 15, ополіетиленгліколь 6бО гідроксистеарат; ВАБЕ АКіепдезеїзснаїй, с зо Гидмж/ідзнагеп, Септапу (в фосфатно-сольовому буфері, рН 7,2), або певну дозу сполуки 1-3 в наповнювачі один раз на добу з Еб по 39, як описано в роботі |Орреппеїт, еї аі., Зсіепсе, 1991, 251, 1616-1617, яка включена - тут у вигляді посилання в повному об'ємі|ї. Ембріони умертвляли на Е10 і витягували їх спинний мозок, ї- фіксували в розчині Сагпоу (1095 крижана оцтова кислота, 6095 абсолютний етанол, 3095 хлороформ), обробляли для одержання серійних парафінових зрізів, і фарбували тіоніном. У кожному 20-му зрізі поперекових в сегментів 1-8 проводили підрахунок відповідно до раніше описаних критеріїв |Сіагке, еї а)., Меїодз Іп Сеї ї-
Віоіоду: СеїЇ Оеакй, 1995, Зспугапі 5 Оврогпе, Едв., Асадетіс Ргезв, Мем МогКк, рр. 277-321, яка включена тут у вигляді посилання в повному об'ємії.
Регульована в ході розвитку загибель мотонейронів у пацюків в неонатальному періоді.
Пацюків Зргадцие-Оаумлеу з різним терміном вагітності одержували від Нагіап Іарогайгієвз (Іпаіапароїів, «
ІМ). Крисят жіночої статі щодня ін'єкували підшкірно (ЗС) над перинеальними м'язами, що є мішенню, сполукою шщ с ПІ-3 в 595 БоЇшіоїтм Н5 15 або одним наповнювачем, починаючи з дня народження (П1) і продовжуючи протягом 5 ц днів (П5). На ПТО або ПбО крисят декапітували, збирали кров в капілярні пробірки з гепарином, і після "» перфузії тварин розчином солі/формаліну вирізали область спинного мозку, що містить спинальні ядра риїЇросамегпозив (ЗМВ), за якими спостерігається статевий диморфізм, і перинеальну область, що містить м'язи
Бицросамегповиз (ВС) і Іемаюг ап і (ГА). Район спинного мозку, що містить ЗМВ, повторно фіксували, заливали -І в параплаеєт, робили зрізи товщиною 1Омкм, і фарбували крезиловим фіолетовим (Стгезуїеснї міоїе) (Могаееп, еї аІ,, Зсіепсе, 1985, 229, 671-673, яка включена тут у вигляді посилання в повному об'ємі). Мотонейрони е підраховували при х500 збільшенні в серійних зрізах спинного мозку від поперекового району 5 до крижового -І району 1, як описано раніше |Могдееп, еї аї,, вище). Підрахунок під мікроскопом дослідник робив на закодованих зрізах наосліп, не знаючи оброблені групи. Підрахунок мотонейронів коректували з урахуванням і розміру клітин і товщини зрізів (робота Копіздзтагк, Сопіетрогагу Кезеагсп Меїподз іп Меигоапаїоту, Маша 8
ІЗ Ерреззоп, Едв., 1970, Зргіпдег-Мегіад, Мем ХогК, рр.315-340, яка включена тут у вигляді посилання в повному об'ємі! і статистичний аналіз проводили за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу (АМОМА).
Перинеальну мускулатуру повторно фіксували, декальцинували, заливали в парапласт, нарізали на секції по
Омкм, і фарбували трихромом за Мілліганом. Використовуючи світло-польну мікроскопію (Х250) з упевненістю ідентифікували м'язи ВР і ГА нормальних самиць і самиць, оброблених сполукою ІІІ-3, (405 тварин/групи), як за
Ф, їх положенням, так і за наявністю смугастих волокон. Обкреслювали контур м'язової тканини, відділяючи від ко суміжних секцій, використовуючи проекційний мікроскоп (62,5), і площу поперечного перетину вимірювали, використовуючи планшетний цифратор і комп'ютеризовану морфометричну систему (Зідтазсап, дап-ае! бо Зсіепійіс). Об'єм м'яза розраховували, визначаючи загальну площу поперечного перетину помножену на товщину зрізу, і коректуючи за відсотковою часткою структури, відібраної як зразок.
Зібрану кров центрифугували протягом 5хв. при кімнатній температурі; потім витягували плазму і зберігали при -202С. Рівні тестостерону в сироватці (6-7 тварин/групу) вимірювали з допомогою радіоімуноаналізу, слідуючи процедурі, представленій в роботі (Муіпойеїд, еї аїЇ., б(егоїдз, 1975, 26, 311-327, включеної тут у 65 вигляді посилання в повному об'ємії.
Індуковане аксотомієго диференціювання мотонейронів у дорослих пацюків.
Лівий під'язичний нерв був перерізаний в шиї дорослих самиць пацюків Зргадое-баміеу (120-180г) при анестезії неймбутолом (Меитрціої), і БОмкл сполуки 1-3 або його наповнювача (595 боіціоїтм Н5 15) наносили на шматочок (зейоаттм (А.І ВисК, Омжміпдоз Міїз, МО), потім обмотували навколо проксимального кінця перерізаного нерва. Через 7 днів тварин анестезували і перфузували 495 параформальдегідом в буфері Соренсона, 0,07М фосфат, рН 7,2. Стовбур мозку витягували і в кріостаті нарізували коронарні зрізи товщиною 4Омкм Іробота
Спін, еї аіІ., МешгоКерогі, 1994, 5, 693-696, яка включена тут у вигляді посилання в повному об'ємі). Кожний п'ятий зріз обробляли для імуногістохімічного аналізу ХАТМН, як описано раніше робота Спін, еї аї., 9. Сотр.
Месцгої., 1993, 328, 351-363, яка включена тут у вигляді посилання в повному об'ємі)Ї, використовуючи 70 анти-ХАТМН моноклональне антитіло, одержане від Спетісоп, в розведенні 1:350. Підраховували клітини, які були забарвлені явно інтенсивніше за фон на забарвлених зрізах; кількість підрахованих клітин виражали у вигляді відношення кількості ХАТ-імунореактивних клітин з боку під'язичного ядра, де проводили аксотомію, до кількості імунореактивних клітин на контрольному (непошкодженому) боці.
Сполука І-3 спасала мотонейрони ембріонів пацюків від загибелі в результаті апоптозу іп міо, і 75 інгібувала сигнальний шлях, що приводить до активації МК! в цих клітинах (робота Магопеу, еї аї., у.
Месшгозсі, 1998, 18, 104-111, яка включена тут у вигляді посилання в повному об'ємі!ї. Для визначення потенційної активності іп мімо сполуку П-3 оцінювали в двох моделях регульованої в ході розвитку запрограмованої загибелі мотонейронів і в моделі індукованого аксотомією дедиференціювання мотонейронів дорослого організму. У курчат приблизно 50956 спинномозкових мотонейронів зазнає РСЮ протягом 35-10
І|Натбвигодег, еї аї., 9). Мецговсі.,, 1982, 1 38-55; Ригмев5, еї аіЇ. Воду апа Вгаіїп: А Тгторпіс Теогу ої Мега!
Соппесііопз, 1988, Нагмага Опімегзйу Ргезв, Сатрбгідде, МА, обидві роботи включені тут у вигляді посилань в повному об'ємі). Внесення сполуки ІІ-3 в оболонку хоріоалантоїсу під час цього періоду запобігало загибелі мотонейронів дозозалежним чином (Фіг.19). Сорок відсотків мотонейронів, які в звичайних умовах загинули б, були врятовані при двох самих високих тестованих дозах (2,3 і 7мкг/доба), в тої час як при більш низьких Га дозах (1,2 і 1,8мкг/доба) було врятовано 2595 мотонейронів (Фіг.19).
Під час раннього перинатального періоду життя самиць пацюків (від пізньої ембріональної стадії до 4 дня і) постнатального розвитку (ПН)), більше за 5095 мотонейронів в ЗМВ елімінують в результаті РСО (робота
Вгеедіоме, У). Меигобіо!., 1986, 17, 157-176, яка включена тут у вигляді посилання в повному об'ємі). У самців мотонейрони в цьому ядрі інервують поперечно-смугасті м'язи статевого органу, залучені до копулятивних Ге рефлексів. Секреція андрогенних стероїдів сім'яниками знижує загибель мотонейронів ЗМВ у самців і запобігає обширній атрофії ВР і ГА м'язів, інервованих нейронами. Введення тестостерону у крисят жіночої статі т приводило до повної схожості з чоловічими особинами кількості мотонейронів ЗМВ (Могдееп, еї аіЇ., вище|і |ч- запобігало атрофії ВР і ГА м'язів робота МУаїтап, еї аї., ЕпдосгіпоІоду, 1941, 29, 955-978, яка включена тут у вигляді посилання в повному об'ємі|Ї. Щоденне підшкірне введення сполуки 1-3 (ПН 1-5) самицям пацюків З з5 значно ослабляло загибель мотонейронів (Фіг.20А). Порятунок мотонейронів ЗМВ від загибелі за допомогою ч- сполуки ІІ-3 відбувався при двох дозах (0,5 і їмг/кг на добу). При максимально ефективних дозах 0,5 і мг/кг на добу введення сполуки ІІ-3 приводило до підвищення виживаності мотонейронів на 7095, що еквівалентне дії тестостерону (Фіг.20А). Сполука І-3 не змінювала рівні тестостерону в плазмі оброблених самиць. «
Радіоімунологічне вимірювання рівнів тестостерону в плазмі в групі тварин, яким вводили мг/кг на добу, не давало значної різниці в порівнянні з контрольною групою, якій вводили наповнювач (0,016 -0,008нг/м.л і /-й с 0,029-0,015нг/мл стандартна помилка середньої (5.Р.М). відповідно). и Щоб визначити, чи ефективна обробка сполукою 11І1-3 для довготривалої підтримки виживаності мотонейронів, є» самиць обробляли сполукою ІІ-3 (0,5 і їмг/ кг на добу) протягом того ж періоду часу ПН (1-5). Половину тварин, яким вводили наповнювач, і половину тварин з обох оброблених груп забивали на ПНІ10О. Тварин, що залишилися підтримували потім без додаткової обробки сполукою ІПІ-3 до забою на ПНбО. Як відмічено раніше -і (Фіг.20А) обробка сполукою 1-3 приводила до підвищення виживаності мотонейронів на 7090 (Фіг.208). Більш їх того 10095 цих врятованих мотонейронів можна було ідентифікувати морфологічно через 55 днів після останньої обробки сполукою /І-3 (Фіг.208). Ігібування загибелі мотонейронів сполукою ІШ-3З під час неонатального -і періоду давало можливість мотонейронам дожити до дорослого стану. -1 50 Незважаючи на чітко виявлені і руйнівні впливи втрат мотонейронів при захворюваннях у дорослих людей, таких як бічний аміотрофічний склероз, мотонейрони дорослого організму в більшості моделей пошкодження що) мотонейронів у тварин резистентні до загибелі. Однак пошкодження аксонів приводить до морфологічних (ІОрреппеїт, еї аї., вище), а також біохімічних змін (роботи Орреппеїт, еї аіЇ., вище; Кепае еї. аї!., У. Сотр.
Месшгої., 1992, 319, 285-298, які включені тут у вигляді посилань в повному об'ємі; робота Спіє, еї аї., .. Сотр. Меийгої.,, 1993, 328, 351-363, яка включена тут у вигляді посилання в повному об'ємі| в мотонейронах о дорослого організму, які можуть імітувати дегенеративну зміну, що передує загибель дегенерованих мотонейронів у хворих. Один з прикладів такого типу змін є слідством аксотомії під'язичного нерва, яка їмо) інервує язик. Одностороннє перерізання цього нерва у дорослого пацюка приводило через 7 днів до втрати 9590
ХАТ-імунореактивних під'язикових мотонейронів з того ж боку ядра |робота Спіи, еї аіІ., МеигоКерогі, 1994, 5, бо 693-696, яка включена тут у вигляді посилання в повному об'єміЇ. Втрата ХАТ-імунореактивності не була постійною. Через чотири тижні після аксотомії 10095 мотонейронів відновлювали контрольні рівні ХАТМН імунореактивності (робота Вогке, еї аї., у. Меигосуїоі., 1993, 22, 141-153, яка включена тут у вигляді посилання в повному об'ємі|Ї. ХАТ-імунореактивність під'язикових мотонейронів на протилежному боці не зазнавала впливу |СНіни, еї а!., вище) (Фіг.21 і таблиця 5). 65 У тому випадку, коли накладали СеМКоаттм на проксимальний кінець під'язичного нерва, сполука ПІ-3 дозозалежним чином ослабляла зниження ХАТ-імунореактивності в мотонейронах на тому ж боці, що аналізуються через 7 днів після аксотомії. Максимальна ефективна доза (50мкг) приводила до збільшення на 4090 кількості ХАТ-імунореактивних мотонейронів, в порівнянні з необробленим контролем, де проводилася аксотомія (Фіг.21В і таблиця 5). Малася колоколоподібна дозова залежність як при більш низьких, так і при більш високих дозах, що приводить в результаті до більш високої виживаності, ніж в необробленому контролі, але більш низької, ніж досягалася при Б5Омкг. Як підтверджено в моделі ЗМВ, у цих тварин, що тестуються ні при яких дозах не було пов'язаної з ними втрати ваги, смертності, або грубого пошкодження тканини.
Сполука ІІ-3 виявляла нейропротекторну активність в трьох окремих моделях дегенерації мотонейронів іп мімо: регульованої в ході розвитку РСЮО мотонейронів поперекового відділу спинного мозку у ембріонів (Фіг.19), 7/0 Чутлива до андрогенів загибель постнатальних мотонейронів ЗМВ (Фіг.20) і індукована аксотомією втрата функціонального маркера, ХАТМН, в під'язичних мотонейронах дорослого організму (Фіг.21 і таблиця 5). Сполука
ПІ-3 була ефективною при периферичному введенні за допомогою підшкірної ін'єкції, при локальному нанесенні на розрізаний кінець нерва, або при безпосередньому нанесенні на хоріоалантоїсну оболонку ембріонів курчат. У протилежність початковій молекулі К-252а, сполука ІПП-3 була приблизно в п'ять разів більш сильнодіючою в опосередкованій виживаності культур, збагачених мотонейронами (дані не показані), і не виявляла інгібуючої активності, направленої проти тирозин-кінази КА і декількох серин-треонінових кіназ |Магопеу еї аї., вище;
Капеко, еї а/., У. Мед. Спет., 1997, 40, 1863-1869, яка включена тут у вигляді посилання в повному об'ємії. 111 тоном 1111800 сч го пн нн п ин НС о нн нн а нн хо сч зо яв
Як пи Я ПО я ПОЕТ По м пн нн т; нн ох вв з зв м ви ватою «
Сполуку ІП-3 або наповнювач додавали в гелеподібній піні до проксимального кінця під'язичного нерва - с відразу ж після його перерізання. Через 7 днів тварин забивали і робили серійні зрізи під'язичного ядра, і ц кожний п'ятий зріз піддавали імунному фарбуванню анти-ХАТМН антитілами. Підрахунок ХАТМН-позитивних "» нейронів проводили на тому ж боці (експериментальному) і на протилежному (контрольному) боці ядра. "р«0,05, статистично значуще в порівнянні з контрольним обробленим наповнювачем тваринами.
Інгібітор МІ К-3 шляху виявляє ефективність іп мімо і блокує події фосфорилування нижче за течією МІ К-3 в -І МРТР моделі.
МРТР вводили в дозі (4Омг/мл), яка приводить до втрати допамінергічних закінчень смугастого тіла і е клітинних тіл в чорній субстанції. Як маркер допамінергічних нервових закінчень в чорній субстанції -І використали тирозингідроксилазу. Сполука ПІ-3 при систематичному введенні знижувала втрату імунореактивних за тирозингідроксилазою нейронів чорної субстанції після пошкодження МРТР (Фіг.22а; Зарогпію еї аї., 1999). і Оскільки сполука 1ПІ-3 відома як інгібітор МІ КЗ, вимірювали активацію розташованого нижче за течією субстрату
ІЗ МІ КЗ у оброблених МРТР мишей. Рівні фосфорилованого МККА вимірювали з використанням специфічного для фосфо-МККА антитіла (Мемжм/ Епдіапа Віоіарв, Вемепу, МА), яке пізнає монофосфориловану форму МККА, або іл допомогою імуноблота (Фіг.225), або методом БЕ! ІЗА (Фіг.22с). Введення МРТР підвищувало рівні фосфорилованого МККА в чорній субстанції більш ніж 5 разів в порівнянні з рівнями в контролі (Фіг.225). Піки о підвищення мали місце через 4 години після введення МРТР і співпадали за часом з списами рівнів МРР " в
ЦНОС. Опосередковане МРТР фосфорилування МККА4 знижувалося внаслідок попередньої обробки ю 1-депренілом, що свідчить про те, що ці процеси фосфорилування були опосередковані МРР " (Фіг.22с). Більш того фосфорилування МККА частково пригнічувалося попередньою обробкою сполуки ІІПІ-3 в дозі (мг/кг), яка 60 забезпечує захист від індукованої МРТР втрати допамінергічної ланки чорної субстанції смугастого тіла (Фіг.22с). Ці дані служать доказом того, що МРТР (МРР") активує МККА, розташований нижче за течією субстрат
МІ КЗ. Більш того ці дані свідчать про те, що відомий інгібітор МІ КЗ інгібує активацію цього кіназного шляху іп мімо.
Приклад 37: Запалення б5 Індукція 1-1 Її ТМЕ-о, при дії ЛПС в клітинах ТНР-1 і вплив індолокарбазолів і піролокарбазолів на індукцію цих факторів.
Були вибрані клітини імунної системи, оскільки численні кінази залучені до регуляції численних імунологічний функцій, наприклад, індукції синтезу цитокінів і індукції біологічної відповіді цитокінів. У недавньому повідомленні (Натрбіеюп, еї аі., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА, 1996, 93, 2774-2778, яке включене тут у вигляді посилання в повному об'ємі| показано, що обробка ЛПС одержаної на основі моноцитів лінії клітин викликає швидку активацію УМК активності. Коли моноцити вступають в контакт з бактерійними ендотоксинами, такими як ліпополісахарид (ЛПС), вони продукують цитокіни запалення, 1-1 і ТМЕ- с. Інгібування продукції цих двох цитокінів може бути корисним при лікуванні деяких запальних захворювань імунної системи. Ці цитокіни 7/0 Можна легко виміряти за допомогою комерційних наборів для ЕГІЗА. Автори розробили експерименти, щоб визначити (1) чи можуть індоло- і конденсовані піролокарбазоли інгібувати синтез І/-1 і ТМЕ-у в лінії клітин моноцитів ТНР-1, (2) чи активується УМК при дії ЛПС в клітинах ТНР-1, і (3) чи можна інгібувати активацію УМК при дії ЛПС за допомогою індоло- і конденсованих піролокарбазолів.
Експериментальні процедури
Клітини ТНР-1 вирощували в середовищі КРМІ 1640 з доданням 1095 фетальної бичачої сироватки. ЛПС (Е. соїї серотип 0111.84, екстрагований ТХО) придбали у Зідта і розчиняли в РВ5. Набори ЕГІЗА для аналізу 1І--1 і
ТМЕ-а придбали у Воегпіпдег-Мапппеїт, і аналізи в культуральному середовищі ТНР-1 виконували згідно з вказівками виготовлювача. Відповідно до вказівок при кожному аналізі одержували стандартні криві.
Експерименти проводили в 12-лункових планшетах для культивування або з 1, або з 2 мл клітин ТНР-1 при щільності 4Х10Уклітин/мл. І/-1 ії ТМЕ-у індукували доданням ЛІС в культуральне середовище, і після цього середовище збирали в різні інтервали часу для аналізу цитокінів. Клітини видаляли центрифугуванням, і надосади заморожували при -702С до проведення аналізу. Щоб мінімізувати витрати, експерименти виконували в двох повторах культур і супернатанти з двох повторів об'єднували після центрифугування. Кожний об'єднаний надосад аналізували двічі. Маточні розчини індоло- і конденсованих піролокарбазолів в 10095 ДМСО розбавляли с до потрібних концентрацій або середовищем, що містить 1095 фетальної бичачої сироватки, або середовищем, Ге) що містить О,5мг/мл БСА. Якщо не обумовлено особливо, сполуки додавали до клітин ТНР-1 за 1 годину перед доданням ЛПС.
Аналізи активності /МК проводили після імунопреципітації білка /МК з екстракту лізованих клітин ТНР-1.
Осаджені ТНР-1 клітини лізували на льоду протягом 15хв. в 5Х0О0мкл буфера Егас (10мМ трис-НСЇ, рН 7,5, 50мММ с Масі, зомкМ пірофосфату натрію, 1мг/мл БСА, 195 Х-100). Екстракт центрифугували протягом 1Охв. при 14К, і до ч- надосаду додавали 5мкл МК антитіла (Запіа Сги7). Екстракт центрифугували в роторній центрифузі протягом бОхв. при 49С, додавали 7бмкл промитої білок А-сефарози (2095 вага/об'єм в буфері Егас), і екстракт - центрифугували ще ЗОхв., щоб зв'язати комплекс, утворений антитілом з білок А-сефарозою. Білок А-сефарозу «ж двічі промивали буфером Егас, один раз 20мМ Нерез, рН 7,6, 20мМ Масі», 2мМ ДТТ, потім інкубували протягом 15Хв. при 302 в ЗОмкл буфера для кіназ (20мМ Нерез, 20мМ МаосСіІ», 2мММ ДТТ, мкг рекомбінантного с-|чп, і - 2МКМ АТФ-у-32рР, 2мккюри). Реакцію зупиняли доданням 1Омкл 4 х 505 буфера для нанесення на гель, нагрівали протягом Зхв. при 802, і білки аналізували в 1095 ЗЮОЗ-гелі. Гель сушили, експонували з пластиною для приладу, реєструючого радіоактивний фосфор (РІіозрпогітадег), і радіоактивні смуги аналізували з допомогою « 20 РіпозрПогітадег. -о
Результати первинних експериментів показали, що ЛПС при концентрації 2мкг/мл дає максимальний вихід с І--1, ї ця концентрація ЛІПС була використана у всіх подальших експериментах. Мінімальний час після додання :з» ЛПС для максимального виходу цитокінів визначали шляхом відбору аліквот середовища для аналізу в різні інтервали часу після додання ЛПС. Перший експеримент показав, що максимальний вихід і І/-1 ії ТМЕ- Ф досягається менш ніж чим, через 5 годин після додання ЛПС. Оскільки саме ранній час збору в першому -1 експерименті становив 2,4 години, другий експеримент проводили, починаючи відбір середовища через 15хв. після додання ЛПС. Результати цього експериметтта, в якому аналізували тільки ТМЕ- од. показали, що його пи максимальний вихід досягається через З години після додання ЛПС. Не виявлено істотних кількостей ТМЕ- ж; в -І середовищі до З9Охв. після додання ЛПС.
Швидке досягнення максимального виходу свідчило про дуже тісну регуляцію синтезу 2 цитокінів - швидкого
Ше синтезу і швидкої понижувальної регуляції. За ЗОхв. перед доданням ЛПС культури клітин обробляли або з актиноміцином Д, інгібітором синтезу РНК, або циклогексімідом, інгібітором синтезу білка. Середовище збирали через З години після додання ЛПС, і аналізували ТМЕ- у. Для індукції ТМЕ- у потрібно і синтез нової РНК, і синтез нового білка, оскільки в середовищі клітин, оброблених і тим і іншим інгібітором, не виявлено ТМЕ- о.
Наступні експерименти були виконані для того, щоб визначити, чи буде сполука 11І-3 інгібувати індукцію ІІ -1 і о ТМЕ-оа. Сполука 1-3 інгібувала індукцію і 1-1, і ТМЕ-у, при цьому значення ІЧБбо (ІСво) становили 267нНМ і 139нМ, відповідно. Результати цих експериментів були одержані на клітинах в середовищі, що містить 1095 фетальної їмо) бичачої сироватки. Оскільки аналізи нейротрофічної активності сполук в тканині спинного мозку і тканині базального відділу переднього мозку були виконані в безсировоточному середовищі (50О0мкг/мл БСА), було бо цікаво визначити значення ІС 5) для інгібування 1-1 і ТМЕ-о, в безсировоточному середовищі. Коли клітини ТНР-1 обробляли сполукою 1-3 в безсировоточному середовищі (500мкг/мл БСА) ІСво було знижено в 10 раз з 2698М до 23НМ. Якщо не обумовлено особливо, всі експерименти, виконані далі, проводили в безсировоточному середовищі. Ігібовані індукції П/-1 ії ТМЕ-у в клітинах ТНР-1 сполукою ІШ-3 свідчить про те, що сполука 1-3 може бути придатна як терапевтичний засіб при лікуванні патологічних станів, викликаних перевищуючою норму бо продукцією цих цитокінів. Таким станом є септичний шок. Септичний шок викликаний ростом грам-негативних бактерій в циркулюючій крові, які послідовно вивільняють великі кількості ендотоксину, ЛПС. Потім ЛПС спочатку стимулює моноцити і макрофаги для продукції великих кількостей ІЇ-1 і ТМЕ-о, які потім викликають важке пошкодження тканини і у багатьох випадках смерть.
Тестували декілька сполук за їх здатністю інгібувати ТМЕ-о, і порівнювали зі здатністю інгібувати ЖК.
Результати показані в таблиці 6. таки 000 міка, попадекопресована в клітинах совт о і вм 01181139
ПИ нт с ПО аю 18011116 вв вн 18016 сч о
Вплив сполуки 1ІІ-3 на індукцію 1І--2 в клітинах Уигкаї
Були проведені експерименти, щоб визначити, чи інгібує сполука 1-3 індукцію 1-2 в клітинах Уигкаї.
Експериментальні процедури
Клітини дигкаї вирощували в середовищі ЕРМІ 1640 з доданням 1095 фетальної бичачої сироватки. ТМЕ-о М одержували від Рготеда, і анти СОЗ і анти СО28 антитіла від Ріпагтідеп. Експерименти з клітинами игкаї їм проводили в 200мкл в 96б-лунковому планшеті. ІЇ-2 вимірювали за допомогою набору для ЕЇГІЗА, придбаного в
Воепгіпдег Мапппеійт. Антитілам до СОЗ і СО28 давали можливість зв'язатися з пластиком 96б-лункового в. планшета (18 годин в РВ5) перед доданням клітин игКкаї. Клітини обробляли сполуками за 1 годину до додання « в покритий антитілами планшет. Щоб активувати рецептор Т-клітин і індукувати 1-2 використали антитіла до сСО3 і СО28. 1-2 вивільнявся клітинами Зигкаї між б годиною і 24 годиною після ініціації індукції (Фіг.23А). в.
Не було конститутивної продукції І/-2 (Фіг.23А, інтактний контроль (СМТ)). Потім оцінювали вплив сполуки
ПІ-3 (1 годинна обробка сполукою ПІ-3 перед індукцією) на індукцію 1-2 (Фіг238). Сполука -3 в концентрації 5О0НМ інгібувала індукцію 1//-2 більш ніж на 80905 (Фіг23В). Більш широкий експеримент за « визначенням лозової залежності був виконаний з використанням сполуки ІІІ-3 і сполуки 1-4, які давали значення
ІСво 139нм для сполуки 1І-3 і 207НМ для сполуки 1-4 (Фіг.23С). З с Мається на увазі, що кожний з патентів, заявок і опублікованих видань, що згадуються в даному патентному "» документі, є, таким чином, включеним у вигляді посилання в повному об'ємі. " Як буде зрозуміло фахівцям в даній області, можуть бути зроблені численні зміни і модифікації переважних варіантів винаходу без відступу від суті винаходу. Мається на увазі, що всі такі варіації входять в рамки винаходу. - Список послідовностей їх «110» Магопеу, Аппа
Ууагюп, Кеміп Кпідні, - Егпеві СіісКкетап, - 50 Магсіе Оіоппе. Стаіїд
Мей, Місоїа о) «120» Способи модулювання кіназних білків множинних ліній і скринінгу сполук, які модулюють кіназні білки множинних ліній «130» СЕРНО431 «140» о «141» «160» 18 ю «170» Патент, версія 2.0 «2105» 1 60 «2112 17 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: нова послідовність бо «400» 1
Суз СІу О1у Ліз Ти: Суз Су Аія Сух Ме: Су Пе Оу Аа Тут Тут ше 5 їх І5
Ти ю «210252 «211223 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» 75 «223» Опис штучної послідовності: нова послідовність «400» 2
СПУ Сіу Ага Аз Ті Тнг Суз Су Аз Тгр Аа Сіу Сіу Айа Су Су ! 5 І 15
Ада ех Ада Суз Атр іх Су 70 см 7 «210» 3 о «211» 33 «212» Білок «213» Штучна послідовність с зо «220» «223» Опис штучної послідовності: нова послідовність ї- «400» 3 ї-
Суз Сіу Сну Аа Тіш Суз Суз Агр Пи Пе Суб Аа Тут Ме СЛу Це оз 35 | 5 10 15 де ;» Фпу лів Туг Тут Тік Пе Сіу Суз Пе Сну Суз Це Ме Су Пе Аіа їх с 20 25 3 з 45 Ав - і «21054 000 пу відо; -| «213» Штучна послідовність їв. " 223» Опис штучної послідовності: нова послідовність ще) «400» 4 слу Спу Ада Аза ТП Пе Не Аа Тут Це Сіу Су АЗа Тер Аа Ле 55 І 5 ІО 15 (Ф, ко й слу Тір Су Суз Айіа Пе Аа Сух Атр Те Су Пе Зет Тгр «210» 5 «211» 10 в «212» Білок «213» Штучна послідовність -А1-
«223» Опис штучної послідовності: нова послідовність «400» 5
Ме Он Сі Сі Спи Тут Меї Рго Ме! Ов «210» 6 «911» 24 то «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності:нова послідовність /5 «400» 6 ріресірірс рресарсіср ссар 24 «21027 «211» 21 «2122 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: нова послідовність «400» 7 Ге рарасесіве афсісрсрсі 4 21 о «210» 8 «21129 «212» Білок см «213» Штучна послідовність - «220» м «223» Опис штучної послідовності: нова послідовність «400» 8 . чІ з Меї Азр Тут Му Ар Ар Ар Ар І. ув Як «21059 « «2112 27 «2122 ДНК в) с «213» Штучна послідовність п з» «220» " «223» Опис штучної послідовності: нова послідовність «400» 9 - свраїссрів асассаріср раассії 27 т» «210» 10 «2112» 28 - «2122 ДНК -І 20 «213» Штучна послідовність
Кз «220» «223» Опис штучної послідовності: нова послідовність «400» 10 з» рраайсасс аріаарсісс арсасаїс 28 (Ф. «2105 11
ГІ «211» 33 «2122 ДНК во «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: нова послідовність «400» 11 а(гацнсвірй сбарсресау авіссгаврсся РЕ 33 б5 «210» 12
«211» 39 «2122 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: нова послідовність «400» 12 ааарсісс ісарірсаар іреагесвсрс арссесіра 39 2105 13 «2112 8 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: нова послідовність «400» 13
Авр Тут Гуз Авр Азр Ар Авр у | в «210» 14 «211» 69 «2122 ДНК «213» Штучна послідовність с «220» «223» Опис штучної послідовності: нова послідовність (о) «400» 14 абазарсне сарареоссаї ррасіасаар гасврасрасо асааресстр ссіссаттаа 60 се зо ассседаса 69 М «210» 15 - «211» 18 «212» ДНК « «213» Штучна послідовність чн «220» «223» Опис штучної послідовності: нова послідовність «400» 15 8 « расаррисро ссерсісі 1 - с «210» 16 ц «211» 583 "» «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» -І «223» Опис штучної послідовності: нова послідовність «400» 16 т» -І - 50 ще) (Ф) ко бо б5 раапсевеса сврараввасі срсарріріс сенсвасрар рестцріда ссеррсарсї 60 " дазссавсре ЯтЕресасі іссссарсад сгасрідасс ссрсесарсе сспсіссар 120 о бсвсідссад сесресрвся вирассссар пестасссе сессацсарі давала 180 рапирсе вагсісассі грразрзваі априусаіс рррррсту грааоріста 240 7 іспіистс ррааррер аграрепос миразарса реїсросась ассстраєра 300 ло ВНасзісарс сарассліло арзайтиісь ссзарадесе зарсісисе сеаїдсітрааз 360 рсассесазс агсапросс ізараророї агрістуаар дарсссласе Істрепррі 420 с о саиррарій рсісрірнар рассціраа (арадівна стррузаза ррайсессс 480 с зо адасаіссір рідзанряр стрірсараєідссарарре зіразстасісасатаєа40 ча ресааприї сссагсаїсс ассясрассі їзадтссаре зас 583 - «9105 в. сла «212» Білок «213» Штучна послідовність « 223» Опис штучної послідовності: нова послідовність не) с «400» 17 з щ 45
Сг» -І - 50 що) (Ф) ко -ДА-
Аза 5ег Аа Аге Ой Ар бет Сів Маї бет СЛУ Авр ОЇ СТУ Тер Тер і З 10 І5
Тис лу Сів Цен Ап бій Аго Ма! Слу Пе Ріє Рго бег Авп Туг Уа 73 30
Тиг Рто Ате Бет Аа Ре бет Зет Атр Сув Сп Рго Слу СЛУ Ом Ар й 35 40 45
Рго Зек Суз Туг Рго Рго Пе Спо І.еи ев Си Пе Ар Ре Аа Си ю 50 55 бо цей Ти Сем Ох Сім Пе Пе Сіу Це СпЛу Сіу Ріє Сіу Цуз Маї Тут з» 5 ' 7 75 80 см о
Аге Аїа Ре Тгр Пе Оу Ар Оїн Ма) Аа Уа! 1 ух Аа Аза Агро Ніє » 85 90 95 см че
Ар Рго Ар Сі Ар Пе бет Сів Тнг Це Оїм Ал Уаї Ате Сто Сію й з 100 (05 о й
Аа уз Гео РБе Аа Мет Гео Туз Ні Рго Авт Пе Не Аза Ї и Аге « с 2» сйу Узі Су їси Цуз ОЇв Рго Азо Ї.єз Суз Гез Уа) Ме Спи Ре Аза 130 ІЗ) 140 - з Атв Су Сіу Рто їси Азп Ага Уа) 1.25 Бет Су Її уз Ат Це Ро Рто лою 145 І50 155 160
Ко)
Авр Це беч Маї Ап Тр Аз Ма! Сіп Не Ада Агр біу Меї Авп Тут 185 1 175 г з тен Ніз Азр Сім Аа Пе Уа! Ріо Пе Пе Ні Агр Ар Тез Гуз бет 7 180 185 190 сет АБ бо «210» 18
«212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: нова послідовність

Claims (39)

«400» 18 Формула винаходу
1. Спосіб ідентифікації сполуки, яка модулює активність кіназного білка множинних ліній і підвищує виживаність клітин або загибель клітин, що включає наступні етапи: (а) контактування вказаної клітини або клітинного екстракту, що містить вказаний кіназний білок множинних ліній, з вказаною сполукою; (Б) визначення того, чи впливає вказана сполука на активність вказаного кіназного білка множинних ліній; і (с) визначення того, чи підвищує вказана сполука виживаність клітин або загибель клітин.
2. Спосіб за п.1ї7, де вказана сполука підвищує активність кіназного білка множинних ліній і підвищує виживаність клітин.
З. Спосіб за п.1, де вказана сполука знижує активність кіназного білка множинних ліній і підвищує загибель клітин.
4. Спосіб за п.1, де вказана сполука, що знижує активність кіназного білка множинних ліній, може бути використана для лікування нейродегенеративного стану.
5. Спосіб за п. 1, де вказана сполука, що знижує активність кіназного білка множинних ліній, може бути сч ов Використана для лікування запалення.
6. Спосіб за будь-яким з пп.2-5, де вказаний білок вибраний з групи, що складається з кінази множинних (о) ліній 1, кінази множинних ліній 2, кінази множинних ліній З, кінази, що несе лейцинову ,блискавку", кінази, що несе подвійну лейцинову ,блискавку", і кінази множинних ліній 6.
7. Спосіб за п. 6, де вказану клітину піддають контакту іп міїго. с зо
8. Спосіб за п. 6, де вказану клітину піддають контакту іп мімо.
9. Спосіб за п. б, при якому вказана активність білка визначається за допомогою аналізу кіназ іп мйго о або аналізу зв'язування. чн
10. Спосіб за п. 6, де вказаною клітиною є нервова клітина.
11. Спосіб за п. б, де вказану активність білка визначають шляхом вимірювання активності або рівня « фосфорилювання субстрату вказаного білка. чн
12. Спосіб за п. б, де вказану активність білюьа визначають шляхом вимірювання активності субстрату вказаного білка.
13. Спосіб за п. 11 або 12, при якому вказаний субстрат вибраний з групи, що складається з МК, МК, УМКЗ, ЕКК!Т, ЕКК2, рз8:, рЗавро, рів, рів, МЕК!, МЕК2, МККЗ, МККА (ЗЕКТ), МЕК5, МКК, МКК?, |шп, АТЕ2, «
40. ЕК ї гомолога АЕХ-3 ссавців. - с
14. Спосіб за п. б, де вказана активність білка визначається шляхом вимірювання активності субстрату а вказаного білка, кількості субстрату вказаного білка або мРНК, що кодує вказаний субстрат вказаного білка. ,»
15. Спосіб за п. 6, де вказана активність білка визначається шляхом вимірювання активності субстрату вказаного білка, кількості вказаного білка або мРНК, що кодує вказаний білок.
16. Спосіб за п. б, при якому вказане підвищення виживаності клітин або загибелі клітин визначається -і шляхом використання клітин підвищеного ризику загибелі і порівнянням кількості живих клітин, які зазнавали 1» контакту з вказаною сполукою, з кількістю живих клітин, які не контактували з вказаною сполукою.
17. Спосіб за п. 6, де вказаними клітинами є первинні ембріональні клітини мотонейронів. -|
18. Спосіб за п. 6, де вказані клітини надекспресують вказаний кіназний білок множинних ліній. -1 50
19. Спосіб за п. 2, де вказане підвищення виживаності клітин визначається шляхом спостереження за зменшенням апоптозу. до)
20. Спосіб за п. 3, де вказане підвищення загибелі клітин визначається шляхом спостереження за збільшенням апоптозу.
21. Спосіб за п. 6, де вказана клітина залучена до нейродегенеративного захворювання.
22. Спосіб за п. 6, де вказана клітина залучена до запалення. о
23. Сполука формули: іме) 60 б5
К, й " В,
А. А ва туги ут ща РУ З х Бе ге де: В і Е, кожний, незалежно, утворюють з атомами вуглецю, з якими вони зв'язані, або ненасичене б-ч-ленне карбоциклічне ароматичне кільце, в якому від одного до трьох атомів вуглецю можуть бути заміщені атомами азоту; або ненасичене 5--ленне карбоциклічне ароматичне кільце, в якому або один атом вуглецю замінений на 2о атом кисню, азоту або сірки; або два атоми вуглецю замінені на атоми сірки і азоту, або атоми кисню і азоту; Ку являє собою Н, алкіл, що містить 1-4 атоми вуглецю, арил, арилалкіл, гетероарил і гетероарилалкіл; СОН, де ВЗ є алкілом, що містить 1-4 атоми вуглецю, або арилом, переважно фенілом або нафтилом; -О8 79, де КО є Н або алкілом, що містить 1-4 атоми вуглецю; -СОМН», -МЕ 88, СНО) Ме Ве, де п є цілим числом від 1 до 4; або -О(СНО)МВ В; ії або с В і 28 незалежно є Н або алкілом, що містить 1-4 атоми вуглецю; або В' і КЗ об'єднані разом, утворюючи Ге) зв'язану групу загальної формули -снНа»-Х14(СНо)о-, дех! є 0, 5 або СН»; РеєНн, -50589, -с02в, -СОВЗ, алкілом, що містить 1-8 атомів вуглецю, переважно алкілом, що містить 1-4 атоми вуглецю, алкенілом, що містить 1-8 атомів вуглецю, переважно алкенілом, що містить 1-4 атоми вуглецю, сч або алкінілом, що містить 1-3 атомів вуглецю, переважно алкінілом, що містить 1-4 атоми вуглецю; або моносахаридом, що містить 5-7 атомів вуглецю, де кожна гідроксильна група моносахариду незалежно є або /ї- незаміщеною, або заміщена Н, алкілом, що містить 1-4 атоми вуглецю, алкілкарбонілоксигрупою, що містить 2-5 їч- атомів вуглецю або алкоксигрупою, що містить 1-4 атоми вуглецю; і або кожний алкіл, що містить 1-8 атомів вуглецю, алкеніл, що містить 1-8 атомів вуглецю, або алкініл, що містить 1-8 атомів вуглецю є незаміщеним; або кожний алкіл, що містить 1-3 атомів вуглецю, алкеніл, що містить 1-8 атомів вуглецю, або алкініл, що їч- містить 1-8 атомів вуглецю, незалежно заміщений 1-3 арилом, що містить 6-10 атомів вуглецю, переважно фенілом, або нафтилом; гетероарилом, Е, СІ, Ве, І, -СМ, -МО», ОН, «ОКУ, -д(СсНо)Мв 8, -осСОове, -ОсСОоМНни, -О-тетрагідропіранілом, МН», -МВ'/В8, -Мме сов, -Мме 9со5в9, -МА осОоМме "8, «-«МНеТ(-МН)МН», Ме 98058, « -(О)ув", де В!!! є Н або алкілом, що містить 1-4 атоми вуглецю, арилом, що містить 6-10 атомів вуглецю, переважно фенілом або нафтилом, або гетероарилом, і у дорівнює 1 або 2; -587!!, -СО289, -«СОМА ВВ, -СНО, - с сов, -сСноОвВ", -СН-ММе в!2, «сСН-МОвВ"!, -СН-МеЯ, «СН-ММнНенН(М-МНМН», -802Мв 283, -РО(ОВК 1)», з» або -оО87Я, де ВУ є залишком амінокислоти після видалення гідроксилу карбоксильної групи; і або 8283 незалежно є Н або алкілом, що містить 1-4 атоми вуглецю, арилом, що містить 6-10 атомів вуглецю, -1 15 переважно фенілом або нафтилом, або гетероарилом; або В2 ії ВЗ об'єднані разом, утворюючи зв'язуючу групу, переважно -(СН»)»-Х 1-(СНа)»; - кожний з радикалів Кз, Ку, Кв і Кв незалежно вибраний з Н, арилу, переважно арилу, що містить 6-10 атомів - вуглецю, більш переважно фенілу або нафтилу; гетероарилу; Е, СІ, Вг, І, -СМ, СЕз, -МО», ОН, -ОВ9, -Ф(СНо) МА ВВ, -осСОокУ, «ОСОоМНе, МН», -СНоОН, 7 -сн,ов"", «МеВ, «МАСОВУ, «МА сом ВВ, «8, -В(ОУ6А", де у дорівнює 1 або 2; -СО289, -СОРУ, ще -СОМК7в8, сно, -сн-МОВ"!, -сСнН-МеУ, «сСН-ММА В? (СНо)ДЗВУ, де п є цілим числом від 1 до 4, - (сно) 8(0)у8", «СНАУ, де КЗ є алкілом, що містить 1-4 атоми вуглецю; -СНоВ(О)УА"", «СНо)іМА "Ве, «сНОМНА я, алкілу, що містить 1-8 атомів вуглецю, переважно алкілу, що містить 1-4 атоми вуглецю; алкенілу, що містить 1-8 атомів вуглецю, переважно алкенілу, що містить 1-4 атоми вуглецю; алкінілу, що (Ф) містить 1-8 атомів вуглецю, переважно алкінілу, що містить 1-4 атоми вуглецю; і або кожний алкіл, що містить ка 1-8 атомів вуглецю, алкеніл, що містить 1-3 атомів вуглецю або алкініл, що містить 1-8 атомів вуглецю, незаміщений; або кожний алкіл, що містить 1-8 атомів вуглецю, алкеніл, що містить 1-8 атомів вуглецю, або 60 алкініл, що містить 1-8 атомів вуглецю, заміщений; Х є або незаміщеним алкіленом, що містить 1-3 атомів вуглецю; або Х є алкіленом, що містить 1-3 атомів вуглецю, заміщеним однією Б» групою, переважно ОВО, -58710, В», де В "5 є алкілом, що містить 1-4 атоми вуглецю; фенілом, нафтилом, арилалкілом, що містить 7-14 атомів вуглецю, переважно бензилом; або 65 Х являє собою -СНАСН-, -СН(ОН)-СН(ОН)-, -О-, -5-, -5(50)-, -5(:0) 5-, -С(К10)2-, -Ф(50)-, -ФЩ-МОК.4)-, -Ф«О11ХК11)-, -(О)СНЕ. 5-, -СНА 5С(0)-, -С(-МОМК.1)СНЕ 15-, -«СНКЧ5С(МОК 11)-, -СН»2-, -2-СН»-, -СНЬЯСН»-,
де 7 являє собою СО) (В), О, 8, С(50), С(-МОВ), або МВ; або
А. і А» разом і при цьому кожний незалежно є Н, Н; Н, -ОК; Н, -5877; Н, -МАЕ 812; або разом являють собою -5 або -МВ/!; Ву ії В» разом являють собою 0; і кожний з радикалів К 4, Ко, Кз, Ка, К5, Кв і Х мають значення, визначені вище; або А, і А» разом являють собою 0, і В 1 і Во разом і при цьому кожний незалежно є Н, Н; Н, -ОВ!; Н,-8877; Н, -МВ "872; або разом являють собою -5 або -МЕ "1; і кожний з радикалів Кі, Бо, Кз, Кл, К5, Кв і Х мають 70 значення, визначені вище.
24. Сполука за п. 23, де Аз, А», Ку, Кз і Ка є Н; В; і В» разом являють собою 0; Е» є СНЬСНоОН; Кб і Кб являють собою ОСН»; і Х являє собою СН».
25. Сполука за п. 23, де Аз, А», Кл, Кз, Кв і Ке є Н; В; і В» разом являють собою О; Ко є СНоСНЬОАс; Ку, С є Вг; і Х являє собою СН».
26. Сполука за п. 23, де Аз, А», Кл, Кз, Кв і Ке є Н; В; і В» разом являють собою О; Ко є СНоСНЬОАс; Ку, С є СснНьсСНаІ(2-Руг); і Х являє собою СН».
27. Сполука за п. 23, де А;, А», Кі, Кз, Кв і Ке є Н; В; і В» разом являють собою О; Ко» є Н; К; означає СНьСНо(2-піримідиніл); і Х являє собою СН».
28. Сполука за п. 23, де Аз, А», Кі, Кз, Кв і Кв є Н; Ві і В» разом являють собою ОО; КК» є Н; КК; є СснНьСнНІ(2-Руг); і Х являє собою СН».
29. Сполука за п. 23, де Ач, А», Кі, Ко, Кз, Кв і Кв є Н; В. і В» разом являють собою О; К у означає СНьСНо(2-піридазиніл); і Х являє собою СН».
30. Сполука за п. 23, де А, А», Ку, Кз, Ка, Кв і Кв є Н; В; і В» разом являють собою 0; Ко означає СН»СНоОН; і Х являє собою СН». с 29
31. Сполука за п. 23, де Аз, А», Ку, Кз, Ку, Кв і Кв є Н; Ві і В» разом являють собою О; К о» означає (3 СНЬСНЬСНООН; і Х являє собою СН».
32. Сполука за п. 23, де А, А», Ку, Ко, Кз, Ка, Кб і Ке є Н; В. і В» разом являють собою 0; і Х являє собою 5.
33. Сполука за п. 23, в якій Ач, А», Кі, Кз, Ку, Кв і Ке є Н; Ву; і В» разом являють собою О; К 5» означає СснНьСНОСНьМНОСО(4-ОНРН); і Х являє собою СН». с
34. Сполука за п.23, де вказана сполука має формулу: рч- Й | ї- г МІ о « 7, в. я й їх в, « нив а 5 - ;з» Кз Кк, де: 74 являє собою Н і 7» являє собою Н, або 7. і 7», взяті разом, утворюють 5-0; -| Ку являє собою Н або В"; їз ЕК» являє собою Н; Кз являє собою Н, СНОСНАСН», СНОСНЬСНОоОН, або
В. ' . -І 20 снснсСНА --М /й І» і К4 являє собою Н, СНЬСНАСН» або СНОСНЬСНоОН.
35. Сполука за п. 34, де Ку, Ко, Ку, 231 і 2» є Н, і Кз являє собою СНОСНАСН».
36. Сполука за п. 34, де К. є ВГ, а Ко, Кз, Кл, 213 і 22 є Н.
37. Сполука за п. 34, де Ку, Ко, 234 і 2» є Н, а Кз і ЕК. являють собою СНЬСНАСН». Ф)
38. Сполука за п. 34, де К., Ко, КЗ, 274 і 7» є Н, а К; являє собою СНЬСНАСН». ка
39. Сполука за п. 34, в якій К4, Ко, 24 і 22 є Н, і Кз і К. являють собою СНЬСНЬСНоОН; або КУ, Ку», 24 і 2» є Н, і Ез являє собою снесн.сСн.--мМ /й
40. Сполука за п. 23 формули б5
К., , й й В, в оулутв з ру йут 70 і С Е І Кк, М ТЯ Ж Кк, в 75 (сно сно, де: кільце В і кільце ЕР, незалежно, і кожне разом з атомами вуглецю, з якими вони зв'язані, вибрані з групи, що складається з: а) ненасиченого 6б-ч-ленного карбоциклічного ароматичного кільця, в якому від 1 до З атомів вуглецю можуть бути заміщені атомами азоту; р) ненасиченого 5--ленного карбоциклічного ароматичного кільця і с) ненасиченого 5--ленного карбоциклічного ароматичного кільця, в якому або 1) один атом вуглецю заміщений атомом кисню, азоту або сірки; с 2) два атоми вуглецю заміщені атомами сірки і азоту, атомами кисню і азоту, або двома атомами азоту; або о З) три атоми вуглецю заміщені трьома атомами азоту; Ку вибраний з групи, що складається з: а) Н, заміщеного або незаміщеного алкілу, що має від 1 до 4 атомів вуглецю, заміщеного або незаміщеного арилу, заміщеного або незаміщеного арилалкілу, заміщеного або незаміщеного гетероарилу, або заміщеного ЄМ або незаміщеного гетероарилалкілу; їч- в) -С(хО В, де 2? вибраний з групи, що складається з алкілу, арилу і гетероарилу; с) -ОВ 9, де КЕ !9 вибраний з групи, що складається з Н і алкілу, що має від 1 до 4 атомів вуглецю; - а) -с(-о)МН», - МА" в», - (СНа)рМА В 12, «СНо)рОВ Я, -Ф(СНо)рОВ о ї «Ф(СНо)рМА В2, де р дорівнює від /«ф 1 до 4; і де або м 1) кожний з радикалів КЕ! і К!2 незалежно вибраний з групи, що складається з Н і алкілу, що має від 1 до 4 атомів вуглецю; або 2) 2" їв, взяті разом, утворюють зв'язуючу групу формули -(СН 2)5-Х1-(СНа)»-, де Х! вибраний з групи, що складається з -О-, -5 - і-СНе-; « Ко вибраний з групи, що складається з Н, алкілу, що має від 1 до 4 атомів вуглецю, -ОН, алкоксигрупи, що ств) с має від 1 до 4 атомів вуглецю, -ОС(-О)ВУ, -ОС(-О)МА в, «О(СНо)рМв В И2, «О(СНо)рОВ о, заміщеного або ц незаміщеного арилалкілу, що має від 6 до 10 атомів вуглецю, і заміщеного або незаміщеного гетероарилалкілу; и"? кожний з радикалів Кз, Ка, Кв і Ко незалежно вибраний з групи, що складається з: а) Н, арилу, гетероарилу, Е, СІ, Ві, І, -СМ, СЕз, -МО», «ОН, -ОВ?, -Ф(СнНо)Мв В, -ос(-ОУ, -осб(омв2вВ;, -ОС(- ОМА В», «О(СНорОв Я, «СНоОвя, «МА В, «МА 98(-0)289, -МВ'оС(-Ов8; ш- Б) -сНоОВ, де ВЕ "7 є залишком амінокислоти після видалення гідроксилу карбоксильної групи; ї» с) -МА'сс(хо)МА в'я, -с0582, -б(-0)87, с(-ОМв' в"? -сн-МОоВ?, -СН-МАУ, «сСНорМв вия, - «СНО)РМНА "Я, або -«СНММА? ВА де В2А являє собою те ж, що і К2; а) «(Оу (СНо)рВ(ОуВУ, -СНоВ(О)уВ , де у дорівнює 0, 1 або 2; і е) алкілу, що має від 1 до 8 атомів вуглецю, алкенілу, що має від 2 до 8 атомів вуглецю, і алкінілу, що кз має від 2 до 8 атомів вуглецю, де 1) кожна з алкільної, алкенільної або алкінільної груп незаміщена; або 2) кожна з алкільної, алкенільної або алкінільної групи заміщена групами в кількості від 1 до 3, вибраними з групи, що складається з арилу, що має від 6 до 10 атомів вуглецю, гетероарилу, арилалкоксигрупи, гетероциклоалкоксигрупи, гідроксіалкоксигрупи, алкоксіалкоксигрупи, гідроксіалкілтіогрупи, Ф) алкоксіалкілтіогрупи, Р, СІ, Вг, І, -СМ, -МО», «ОН, «ОКУ, -Х(СНорМВ Вл? -ХУ(СНорс(ЗОМА Вя,- о ХУ(СНо)рос(ЗОо)МА ВЛ? - Х?(СНо)рСО»В, -Х7(СНо)рВ(ОуВ, - хХ"(СНо)рМв ос(-оМв в, ос(хОве, -ОСОМНЕ?, -0- тетрагідропіранілу, -МВ'В!2, -Мв'Ос(-О)У, -Мв'сОовУ, 0 -МА'ос(:оМе Ве, бо -Мне(-мнумн., Мме'о8(0)289 -8(0О)уУ8У, -СО28», С(-ОМА В, -0(-0)В;, -СНоОВ'Я, «сНАММРовХ, -сн-Мов,, «СН-МАУ, «СНАММНоН(М-МНІМН», -8(50)2МвовА, -Р(ІХОХОВ У)», «ОВ ї моносахариду, що має від 5 до 7 атомів вуглецю, де кожна гідроксильна група моносахариду незалежно або незаміщена, або заміщена Н, алкілом, що має від 1 до 4 атомів вуглецю, алкілкарбонілоксигрупою, що має від 2 до 5 атомів вуглецю, або б алкоксигрупою, що має від 1 до 4 атомів вуглецю; Х2 являє собою О, 5 або МЕ 70;
кожний з радикалів К; і Ка незалежно вибраний з групи, що складається з Н, алкілу, що має від 1 до 4 атомів вуглецю, алкоксигрупи, що має від 1 до 4 атомів вуглецю, заміщеного або незаміщеного арилалкілу, що має від б до 10 атомів вуглецю, заміщеного або незаміщеного гетероарилалкілу, «(СНо)рОВ У, (СНурос(хоОМА В? ї (СНо)рМАв В; або В, і Кв, взяті разом, утворюють зв'язуючу групу формули -снхЗсно-, де Х? являє собою Х? або зв'язок; кожний з т і п незалежно дорівнює 0, 1 або 2; Х вибраний з групи, що складається з -О-, -5-, М(К19)3-, -М'(О(219)3-, -ЩОВ 19) -і -«СН»-; 0 7 вибраний з групи, що складається із зв'язку, -О-, -СН-СН-, -5-, -С(х0)-, -СН(ОВ 793-, -Щ(В7193-, -ЩОВ9)-, сн(мА' ви?) «(еоВ, - МАО) «М(В(ОуВУУ, «М(В(ОУуМА В). «М(о(еовт 3, «(В'ЯВИ., -мМ'єо(279-, СН(ОН)-СН(ОН)-, і -С(О(С-ОВУснН(ОС(-ОВ9А)-, де ЕРА являє собою те ж, що і КУ; ВЗ ї в'5 незалежно вибрані з групи, що складається з Н, -ОН, -С(-О)2 79, -Ф(С-О, гідроксіалкілу і -СО»В 19; В" вибраний з групи, що складається з Н, алкілу, арилу і гетероарилу;
А. і А» вибрані з групи, що складається з Н, Н; Н, ОВ 2; Н, -582; Н, -М(Е2)»; і групи, в якій А. і А», взяті разом, утворюють радикал, вибраний з групи, що складається з -О0, -5 і -МВ2; Ву і В» вибрані з групи, що складається з Н, Н; Н, -о8 2; Н, -582; Н, -ЩА2)» і групи, в якій В 4 і В», взяті разом, утворюють радикал, вибраний з групи, що складається з 50, -5 і «МВ; за умови, що щонайменше одна з пар А»; і А» або В. і Во утворюють 50.
41. Сполука за п. 23 формули н , М М а сч
7. о я й їх в, 3о І! МІ - а і - СНУ па « й : і - Кк де: « 714 являє собою Н і 75» являє собою Н, або 7. і 25, взяті разом, утворюють 50; -о 70 Кі вибраний з групи, що складається з Н, СІ, СН 5505СоНв, Вг, СНЬВ(СНО)»МН»о, СНь(СНО)»М(СНЗ)», с СсНньВ(СНО»МН» н-СаНо, МНСОМНС»оН5, МНСОМНОС»Нвь, СНЬЗСоНвь, СНоЗСеНв, М(СНУЗ)», СНз, СНООСОМНС Нв, з МНОСО»СН», СНЬОСЬН Б, СНоМ(СНЗ)», Он, О-н-пропілу, СнНАММН-С(-МН)МН», СНАМ-Ж(СН»З)», СсНньВБ(СНОІ»МН-н-СаНо, СНОСНоОСН»оСН», СН» 51|3-(1,2,4-триазину)), СНЬСНЬЗСН з, і В я У щ» СЕН зу у н- (У) і М М М Н - 50 І Н Із х ІЧ ех снувсо»-с , Сн, / ств х МІ МІ й -4 о Й х СНнЕМ-- о сн,всн, сеЕММН 9 Мі- 60 М-- ; у лем я - МН Сс"ЕМ-м Ї сНМ--М в: сте М М Ки б5 -БО0-
сні М- М'ЄН, сн.снасн.-- М о ки кл Ко вибраний з групи, що складається з Н, Вг, СІ, І, СН 55(СНО»М(СНзі)», МНСОМНС»НЬв, СН»ЗС»Нв, СснНОоСснНоосНноснН», СН»ЗІЗ-(1,2,4-триазину)), СНОСНоЬЗСН з і СНоОН; Х вибраний з групи, що складається з Н, СНООН, СНЬОМН-серину, СООСНз, СОМНС»Нь, СНЬМНСО»СьнНв, СН»МНОСО»СНУ, СНЬМз3, СОМНСоНь, СНоМН-гліцину, СОМ(СН3)», -СНо.МНСО»- СОМН», СОМНезН»;,
70. СнНоМН-серину, СН»ОЗОСНУЗ, СНАМОН, СНЬМН-проліну, СНЬСН»(2-піридилу), СНАММНОС(-МН)МН», СОМН(СН»), -ОН, СНА-ММНСОМН», СНОоСОСсН», -СН»ОС(СН3І)»2О-, СНоЗСеНь5, СНоЗОСеНь, СО»оН-гексилу, СОМНОН», СОХСН2ІМСН »; я я" СНЕМУН в ен Ки І МІ Н і К вибраний з групи, що складається з ОН і ОСНЗ.
42. Сполука за п. 41, де 7.4 і 7» є Н; Х являє собою СО2СН»; Кі являє собою МНСОМНОС»НБ; Ко являє собою СнНьСНно(2-піридил); і К являє собою ОН.
43. Сполука за п. 41, де 73 і 75 є Н; Х являє собою СОоСН»; Ку і Ко являють собою СНЬОСНоОСНоСН»; і К сч ов ЯВЛЯЄ собою ОН.
44. Сполука за п. 41, де 754 і 75» є Н; Х являє собою СОСНУ»; Ку і Ко являють собою СНЬЗСНоСН»; і К являє о собою ОН.
45. Сполука за п. 41, де 74, 2», Ку і К» є Н; Х являє собою СО2СН»; і К являє собою ОН.
46. Сполука за п. 41, де 2.,і 75, Ку і Ко є Н; Х являє собою СОЗ(СНо) СН»; і К являє собою ОН. сч
47. Сполука за п. 41, де 274, 22, і Кі є Н; Ко» являє собою СНоОН; Х являє собою СО2СН»; і К являє собою ОН.
48. Сполука за п. 41, де 714 і 7» є Н; Ву і Бо являють собою Н 25(3-(11,2,4-триазині); Х являє собою СОоСНУу;і 0 ї- К являє собою ОН. їм
49. Сполука за п. 41, де 7. і 7» є Н; Ку є Вг; К» є І; Х являє собою СО2СН»; і К являє собою ОН.
50. Сполука за п. 41, де 75 і 7» є Н; Ку і Ко являють собою СНЬСНоОЗСН»; Х являє собою СОоСН»; і К являє « собою ОН. їм
51. Сполука за п. 41, де 21, 272, Ку і К» є Н; Х являє собою СО2СН»; і ЮК являє собою ОСН».
52. Сполука за п. 41, де 2. і 27», взяті разом, утворюють 0; Ку і К» є Вг; Х являє собою СО»оСН»; і К являє собою ОН.
53. Спосіб модулювання активності кіназного білка множинних ліній, що включає контактування вказаного « 20 білка або клітини, що містить вказаний білок, із сполукою, що має формулу -о н ,
- . и? га М а 2; ї Бе Ех в, щ» - о й М - 50 Ко) Ез Кк, де: 714 являє собою Н і 75 являє собою Н, або 7. і 2», взяті разом, утворюють 50; 99 Ві являє собою Н або ВГ; Ф! ЕК» являє собою Н; юю Кз являє собою Н, СНОСНАСН», СНОСНЬСНОоОН, або - ю6 6 М о во сн.СснаА.сСна / і Ку являє собою Н, СНЬСНАСН» або СНОСНЬСНЬОН.
54. Спосіб модулювання активності кіназного білка множинних ліній, що включає контактування вказаного 65 білка або клітини, що містить вказаний білок, із сполукою, що має формулу
Кк, , й " В,
А. А в. з миру опа Е ІЧ і в, Ре Е уд ! в 18 (СНода сня, де: кільце В і кільце Е, кожне, незалежно, разом з атомами вуглецю, з якими вони зв'язані, вибрані з групи, що складається з: а) ненасиченого 6б-ч-ленного карбоциклічного ароматичного кільця, в якому від 1 до З атомів вуглецю можуть бути заміщені атомами азоту; р) ненасиченого 5--ленного карбоциклічного ароматичного кільця; і с) ненасиченого 5--ленного карбоциклічного ароматичного кільця, в якому або 1) один атом вуглецю заміщений атомом кисню, азоту або сірки; с 2) два атоми вуглецю заміщені атомами сірки і азоту, атомами кисню і азоту, або двома атомами азоту; або о З) три атоми вуглецю заміщені трьома атомами азоту; Ку вибраний з групи, що складається з: а) Н, заміщеного або незаміщеного алкілу, що має від 1 до 4 атомів вуглецю, заміщеного або незаміщеного арилу, заміщеного або незаміщеного арилалкілу, заміщеного або незаміщеного гетероарилу, або заміщеного ЄМ або незаміщеного гетероарилалкілу; їч- в) -С(хО В, де 2? вибраний з групи, що складається з алкілу, арилу і гетероарилу; с) -ОВ 9, де КЕ !9 вибраний з групи, що складається з Н і алкілу, що має від 1 до 4 атомів вуглецю; - а) «с(хоуМно, «МА в, «СНо)рМАе ве, «СНо)рОВ Я, «ФО(СНо)рОв о ї «О(СНо)рМА В ?, де р дорівнює від 1 «ф до 4; і де або м 1) кожний з радикалів КЕ! і К!2 незалежно вибраний з групи, що складається з Н і алкілу, що має від 1 до 4 атомів вуглецю; або 2) 2" їв, взяті разом, утворюють зв'язуючу групу формули -(СН 2)»-Х1-(СНао)»-і де Х! вибраний з групи, що складається з -О-, -5 - і -СНо-; « 22 вибраний з групи, що складається з Н, алкілу, що має від 1 до 4 атомів вуглецю, -ОН, алкоксигрупи, що ШЕ с має від 1 до 4 атомів вуглецю, -ОС(-О)ВУ, -ОС(-О)МА в, «О(СНо)рМв В И2, «О(СНо)рОВ о, заміщеного або а незаміщеного арилалкілу, що має від 6 до 10 атомів вуглецю, і заміщеного або незаміщеного гетероарилалкілу; ,» кожний з радикалів Кз, Ка, Кв і Ко незалежно вибраний з групи, що складається з: а) Н, арилу, гетероарилу, Е, СІ, Ві, І, -СМ, СЕз, -МО», «ОН, -ОВ?, -Ф(СнНо)Мв В, -ос(-ОУ, -об(оМмвОв", -ос(- ОМА в», «(СНорОв Я, «СНО, «МА В, «МА 98(-0)289, -МВ'оС(-Ов8; їм Б) -СН»ОК "У, де КВ" є залишком амінокислоти після видалення гідроксилу карбоксильної групи; - с) -Мв'єс(оОмМА в? -с0282, -с(-0)82, с(-О)Мв" В"? -сН-МОвВо, -СН-МАУ, «сном в, - «СНО)РМНА "Я, або -«СНММА? ВА де В2А являє собою те ж, що і К2; -1 20 4) «Коув(снара(оув, «сноВ(Оут , де у дорівнює 0, 1 або 2; | | шо е) алкілу, що має від 1 до 8 атомів вуглецю, алкенілу, що має від 2 до 8 атомів вуглецю, і алкінілу, що ІЗ має від 2 до 8 атомів вуглецю, де 1) кожна з алкільної, алкенільної або алкінільної груп незаміщена; або 2) кожна з алкільної, алкенільної або алкінільної групи заміщена групами в кількості від 1 до 3, вибраними з групи, що складається з арилу, що має від 6 до 10 атомів вуглецю, гетероарилу, арилалкоксигрупи, гетероциклоалкоксигрупи, гідроксіалкоксигрупи, алкоксіалкоксигрупи, гідроксіалкілтіогрупи, о алкокси-алкілтіогрупи, Е, СІ, Вг, І, -СМ, -МО», -ОН, «ОВУ, -Х"(СНо)рМВ в?, -ХУ(СНо)рс(оОМв Во, - о ХУ(СНо)рос(ЗОо)МА ВЛ? - Х?(СНо)рСО»В, -Х7(СНо)рВ(ОуВ, - хХ"(СНо)рМв ос(-оМв в, ос(хОве, -ОСОМНЕ», -О- тетрагідропіранілу, -МВ' "2, -Мв'бс(-о)вУ, -Мв'єсОовУ, 0 -Мв'ос(хоОМА В, 60 -Ммне(-МнІМнН.О, МА'В(0)»в? -8(008?, -СО587, -С(-О)МАВ?, -0(-0)К», -СНоОВ', «сНАММовХ, -сн-Мов,, «СН-МАУ, «СНАММНоН(М-МНІМН», -8(50)2МвовА, -Р(ІХОХОВ У)», «ОВ ї моносахариду, що має від 5 до 7 атомів вуглецю, де кожна гідроксильна група моносахариду незалежно або незаміщена, або заміщена Н, алкілом, що має від 1 до 4 атомів вуглецю, алкілкарбонілоксигрупою, що має від 2 до 5 атомів вуглецю, або б5 алкоксигрупою, що має від 1 до 4 атомів вуглецю; Х2 являє собою О, 5 або МЕ 70;
кожний з радикалів К; і Ка незалежно вибраний з групи, що складається з Н, алкілу, що має від 1 до 4 атомів вуглецю, алкоксигрупи, що має від 1 до 4 атомів вуглецю, заміщеного або незаміщеного арилалкілу, що має від б до 10 атомів вуглецю, заміщеного або незаміщеного гетероарилалкілу, «(СНо)рОВ У, (СНурос(хоОМА В? ї (СНо)рМАв В; або В, і Кв, взяті разом, утворюють зв'язуючу групу формули
-СН.-ХЗ-СНо-, де Х? являє собою Х? або зв'язок; кожний з т і п незалежно дорівнює 0, 1 або 2; Х вибраний з групи, що складається з -О-, -5-, МЩ(К19)-, -«М'(О(2К19)3-, -ЩОВ 9), і -«СН»-; 0 7 вибраний з групи, що складається із зв'язку, -О-, -СН-СН-, -5-, -С(х0)-, -СН(ОВ 793-, -Щ(В7193-, -ЩОВ9)-, сн(мв тв'2), «(о - М(В')с(0)- «М(В(ОУМмА "В 2), -М(С(ОВ)- «о(В'яВ). «МЧОЗВИ). сНн(Оон-СсН(ОН)-, і -СН(ІД(С-ОВУсСН(ОоС(хОВА)-, де ЕРА являє собою те ж, що і КУ; В" ї 75 незалежно вибрані з групи, що складається з Н, -ОН, -С(-О)В 79, -Ф(С-О)в, гідроксіалкілу і -с0,815; 12 В" вибраний з групи, що складається з Н, алкілу, арилу і гетероарилу;
А. і А» вибрані з групи, що складається з Н, Н; Н, ОВ 2; Н, -582; Н, -М(Е2)»; і групи, в якій А. і А», взяті разом, утворюють радикал, вибраний з групи, що складається з 50, -5 і -МВ2;
В. їі Во вибрані з групи, що складається з Н, Н; Н, -ОВ 2; Н, -982; Н, -Щ22)»; і групи, в якій В. і Во, взяті разом, утворюють радикал, вибраний з групи, що складається з 50, -5 і -Мв2; при умові, що щонайменше одна з пар А; і А» , або В. і Во утворюють 50.
55. Спосіб модулювання активності кіназного білка множинних ліній, що включає в себе контактування вказаного білка або клітини, що містить вказаний білок, із сполукою, що має формулу Н , с г о о З Не й їх Р, В ї- - - з) й « о Сну пе - КЕ - : « Кк ші с де: 714 являє собою Н і 75 являє собою Н, або 7. і 2», взяті разом, утворюють 50; з Кі вибраний з групи, що складається з Н, СІ, СН 5505СоНв, Вг, СНЬВ(СНО)»МН»о, СНьЯ(СНО»М(СНЗ)», СсНньВ(СНО»МН» н-СаНо, МНСОМНС»оН5, МНСОМНОС»Нвь, СНЬЗСоНвь, СНоЗСеНв, М(СНУЗ)», СНз, СНООСОМНС Нв, МНСО»СН», СНоОСЬН Б, СНоМ(СН З)», ОН, О-н-пропілу, СнНАММН-С(-МН)МН», СНАМ-МЖ(СН»)», -І сноВ(СНО»МН-н-САНо, СНОСНоОСНьЬСН», СН» 5І3-(1,2,4-триазину)), СНЬСНЬЗСН з, і щ» -І І ІЧ т я зе) ен ен) ї -/ ) М ї М І нн т І -е Сн,(0-- сНн.В(о ств ІМ-- М'---- х Ф) М ук іме) 60 СНЕМ-- М ше У няня) 9 мі б5
У тем ит ; - НН СсЕМА- М і снМ--М (в) ; сн, М -т Ки сне М-3 Мен, снеснасн-- М (8) и кл то Ко вибраний з групи, що складається з Н, Вг, СІ, І, СН 55(СНО»М(СНзі)», МНСОМНС»НЬв, СН»ЗС»Нв, СнНОоСнНоОоСсНньсН», СН ЗІЗ-(1,2,4-триазину)), СНСНоЗзСН з і СНоООН;
Х вибраний з групи, що складається з Н, СНООН, СНЬОМН-серину, СООСНз, СОМНС»Нь, СНЬМНСО»СьнНв, СН»МНоСОосСНУ, СНоМз3, СОМНОСоНь, СНоМН-гліцину, СОМ(СНз)», -СН»МНОСО»- СОМН», СОМНезН», СНоМН-серину, СНЬБОСН», СснН-МОнН, СНОМН-проліну, СНьЬСНІ(2-піридилу), СНАММНОТ(-МН)МН»,
т5 СОоМН(СНО»ОН, СНАММНСОМНо, СНоОСОСНУЗ, -СН»ОС(СН3з)»О-, СНоЗСеНь, СНьЗОСеНь, СО»Н-гексилу, СОМНеН», СОХ(СНо) СН»; -- я сом о НМ й снво--40) Н і К вибраний з групи, що складається з ОН і ОСН». с о с їч- ї- - ч- « т с ;з»
-І т» -І - 50 І»
(Ф, ко 60 б5
UA2001031963A 1998-08-26 1999-08-18 Compound for simulating activity of multiple lineage protein kinase and a method for identifying the compound; method for simulating activity of multiple lineage protein kinase (variants) UA74772C2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9798098P 1998-08-26 1998-08-26
PCT/US1999/018864 WO2000013015A1 (en) 1998-08-26 1999-08-18 Modulating multiple lineage kinase proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA74772C2 true UA74772C2 (en) 2006-02-15

Family

ID=22266038

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA2001031963A UA74772C2 (en) 1998-08-26 1999-08-18 Compound for simulating activity of multiple lineage protein kinase and a method for identifying the compound; method for simulating activity of multiple lineage protein kinase (variants)

Country Status (25)

Country Link
EP (1) EP1105728B1 (uk)
JP (1) JP2002523780A (uk)
KR (1) KR100700028B1 (uk)
CN (3) CN1206535C (uk)
AT (1) ATE293254T1 (uk)
AU (1) AU765637B2 (uk)
BG (1) BG105360A (uk)
BR (1) BR9913190A (uk)
CA (1) CA2339539A1 (uk)
CZ (1) CZ2001701A3 (uk)
DE (1) DE69924738T2 (uk)
DK (1) DK1105728T3 (uk)
EA (2) EA200500934A1 (uk)
ES (1) ES2241316T3 (uk)
HK (1) HK1037722A1 (uk)
HU (1) HUP0103079A3 (uk)
NO (1) NO20010389L (uk)
NZ (1) NZ509612A (uk)
PL (1) PL346246A1 (uk)
PT (1) PT1105728E (uk)
SK (1) SK2542001A3 (uk)
TR (2) TR200400635T2 (uk)
UA (1) UA74772C2 (uk)
WO (1) WO2000013015A1 (uk)
ZA (1) ZA200100835B (uk)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6811992B1 (en) 1998-05-14 2004-11-02 Ya Fang Liu Method for identifying MLK inhibitors for the treatment of neurological conditions
US6841567B1 (en) 1999-02-12 2005-01-11 Cephalon, Inc. Cyclic substituted fused pyrrolocarbazoles and isoindolones
US7122679B2 (en) * 2000-05-09 2006-10-17 Cephalon, Inc. Multicyclic compounds and the use thereof
CZ2003680A3 (cs) * 2000-08-11 2003-11-12 Cephalon, Inc. Způsob modulace kinasových proteinů s vícenásobnou vazbou a vyhledávání sloučenin modulujících kinasové proteiny s vícenásobnou vazbou
US7018999B2 (en) 2001-05-16 2006-03-28 Cephalon, Inc. Methods for the treatment and prevention of pain
FR2826653B1 (fr) * 2001-06-29 2005-10-14 Servier Lab Nouveaux derives de pyrido-pyrido-pyrrolo[3,2-g]pyrrolo [3,4-e]-indole et pyrido-pyrrolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c] carbazole, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
JP2003052395A (ja) * 2001-08-09 2003-02-25 Japan Tissue Engineering:Kk 移植適正判定方法
AR069501A1 (es) 2007-11-30 2010-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti- vegf (factor de crecimiento endotelial vascular)
JP2011517339A (ja) * 2008-02-04 2011-06-02 ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 神経変性疾患の治療に有用な分子標的及び化合物並びにこれらの同定方法
US20100056609A1 (en) * 2008-08-26 2010-03-04 Washington University Methods and compositions for inhibition of axonal degeneration by modulation of the dlk/jnk pathway
AU2015202365B2 (en) * 2008-10-22 2016-11-24 Genentech, Inc. Modulation of axon degeneration
US9101645B2 (en) 2008-10-22 2015-08-11 Genentech, Inc. Modulation of axon degeneration
MX2012004638A (es) * 2009-10-22 2012-07-04 Genentech Inc Modulacion de degeneracion de axones.
ES2385157B1 (es) * 2010-02-25 2013-07-08 Universidad Del País Vasco Compuestos para el tratamiento de alzheimer.
EP2852388A4 (en) 2012-05-23 2016-01-13 Univ Johns Hopkins COMPOUNDS AND METHOD FOR USE THEREOF FOR THE TREATMENT OF NEURODEEGENERATIVE DISEASES
CN109060472A (zh) * 2018-07-20 2018-12-21 上海市农业科学院 一种适于荧光染色的草菇菌褶组织切片的制备方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5756494A (en) * 1992-07-24 1998-05-26 Cephalon, Inc. Protein kinase inhibitors for treatment of neurological disorders
US5475110A (en) * 1994-10-14 1995-12-12 Cephalon, Inc. Fused Pyrrolocarbazoles
US5705511A (en) * 1994-10-14 1998-01-06 Cephalon, Inc. Fused pyrrolocarbazoles
US6811992B1 (en) * 1998-05-14 2004-11-02 Ya Fang Liu Method for identifying MLK inhibitors for the treatment of neurological conditions

Also Published As

Publication number Publication date
AU765637B2 (en) 2003-09-25
DK1105728T3 (da) 2005-08-08
KR100700028B1 (ko) 2007-03-27
CZ2001701A3 (cs) 2002-04-17
AU5679399A (en) 2000-03-21
PT1105728E (pt) 2005-07-29
BR9913190A (pt) 2001-12-11
EA200100278A1 (ru) 2002-06-27
WO2000013015A1 (en) 2000-03-09
CA2339539A1 (en) 2000-03-09
DE69924738D1 (de) 2005-05-19
HUP0103079A3 (en) 2004-03-01
EA200500934A1 (ru) 2006-04-28
JP2002523780A (ja) 2002-07-30
DE69924738T2 (de) 2006-03-02
EP1105728B1 (en) 2005-04-13
HUP0103079A2 (hu) 2001-12-28
TR200400635T2 (tr) 2005-10-21
PL346246A1 (en) 2002-01-28
WO2000013015A8 (en) 2000-05-11
NO20010389D0 (no) 2001-01-23
ES2241316T3 (es) 2005-10-16
ATE293254T1 (de) 2005-04-15
NO20010389L (no) 2001-04-02
NZ509612A (en) 2003-10-31
CN1314999A (zh) 2001-09-26
HK1037722A1 (en) 2002-02-15
KR20010103573A (ko) 2001-11-23
SK2542001A3 (en) 2002-06-04
CN1206535C (zh) 2005-06-15
ZA200100835B (en) 2002-06-26
EP1105728A1 (en) 2001-06-13
CN1589788A (zh) 2005-03-09
EA006648B1 (ru) 2006-02-24
TR200100589T2 (tr) 2001-07-23
BG105360A (bg) 2001-10-31
CN1879617A (zh) 2006-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA74772C2 (en) Compound for simulating activity of multiple lineage protein kinase and a method for identifying the compound; method for simulating activity of multiple lineage protein kinase (variants)
CA2574150C (en) Flt3 inhibitors for immune suppression
JP6478908B2 (ja) 熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）９０−βを調節することによる代謝症候群の治療方法
Boneva et al. Major pathogenic effects of anti-MuSK antibodies in myasthenia gravis
WO2011019737A1 (en) Pyrimido-pyrrolo-quinoxalinedione inhibitors of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and uses therefor
AU2001283179B2 (en) Modulating multiple lineage kinase proteins
CN103520703A (zh) eIF6用于检测、预防或治疗运动性疲劳或记忆力减退的用途
JP7185226B2 (ja) １，５－アンヒドロフルクトース誘導体を含むａｍｐｋ活性化剤
AU2001283179A1 (en) Modulating multiple lineage kinase proteins
Wu et al. Up-regulation of CCT8 related to neuronal apoptosis after traumatic brain injury in adult rats
CN111253492B (zh) 一种透脑性多肽及其在制备防治老年痴呆药物中应用
JP2002532554A (ja) Ｔ細胞活性を調節するためのサイクリックアデノシンニリン酸リボース類似体
KR20170017519A (ko) miR 218-2를 유효성분으로 함유하는 염증성 뼈 질환 예방 또는 치료용 약학조성물
MXPA01002020A (en) Modulating multiple lineage kinase proteins
CN117653632A (zh) 粉防己碱作为线粒体sirt5靶向抑制剂在制备抗肿瘤药物的应用
Qi et al. Discovery of Briarane-Type Diterpenoids as the Inhibitors of Osteoclast Formation by Interrupting Keap1-Nrf2 Interaction and Activating Nrf2 Pathway
O'Malley The role of sodium channel α and β subunits in myelinating glia and demyelinating disorders