EA006648B1 - Способы модулирования киназных белков множественных линий и скрининга соединений, которые модулируют киназные белки множественных линий - Google Patents

Abstract

Предоставлены способы идентификации соединений, которые модулируют активность киназного белка множественных линий и повышают выживаемость клеток или гибель клеток, включающие в себя этапы контактирования клетки, содержащей киназный белок множественных линий с соединением, определения того, снижает ли соединение активность киназного белка множественных линий, и определения того, повышает ли соединение выживаемость клеток. Также предоставлены способы идентификации соединений, которые могут быть пригодны при лечении нейродегенеративных заболеваний и/или воспаления. Также предоставлены способы модулирования активности киназного белка множественных линий, включающие в себя контактирование белка или клетки, содержащей белок, с индено- или индолосоединением согласно изобретению.

Description

Направлением данного изобретения отчасти являются способы модулирования представителей семейства киназ множественных линий (МЬК), способы идентификации соединений, которые модулируют киназный белок множественных линий, и либо повышают выживаемость клеток, либо стимулируют гибель клеток, способы идентификации соединений, которые могут быть пригодны для лечения нейродегенеративных заболеваний и/или воспаления, и способы лечения нейродегенеративных заболеваний соединениями, которые ингибируют киназный белок множественных линий.

Семейство МЬК включает в себя группу белков, в которых белковые последовательности киназных доменов представителей семейства имеют близкое сходство с МАРККК, но обладают большим сходством друг с другом, чем с другими МАРККК. Представители семейства МЬК охватывают часть очень сложных киназных каскадов, таких, например, как каскад передачи сигнала при стрессе, в который вовлечено модулирование в числе других Ν-концевой киназы с-Лш (1ΝΒ), которая в свою очередь модулирует в числе других белков факторы транскрипции, включая с-Лш АТЕ2 и ЕЬК-1. Киназа ίΝΙ< описана в патентах США 5534426, 5593884, 5605808 и заявке АО 95/03324, каждый из этих документов включен здесь в виде ссылки в полном объеме.

Семейство МЬК включает в себя, в частности, следующие группы: 1) киназу множественных линий 1 (МЬК1); 2) киназу множественных линий 2 (МЬК2); 3) киназу множественных линий 3 (МЬК3); 4) киназу, несущую лейциновую молнию (Ь2К); 5) киназу, несущую двойную лейциновую молнию (ОЬК); и

6) киназу множественных линий 6 (МЬК6). МЬК1 имеет каталитический домен, сходный как с киназами, специфичными для Туг, так и с киназами, специфичными для 8ет/ТЬт. Όοτο^, е! а1., Еиг. 1. ШоеЛет., 1993, 213, 701-710. МЬК2 также имеет каталитический домен, сходный с обеими киназами, специфичными для Туг или 8ет/ТЬт. Όοτο^, е! а1., Еиг. I. ВюеЛет., 1993, 213, 701-710. МЬК2 известна также как М8Т. Ка1оЛ, е! а1., Оптодепе, 1995, 10, 1447-1451. МЬК3 включает в себя белок, который кроме киназного домена содержит две лейциновые молнии с примыкающим основным районом на карбоксильном конце и район, богатый пролином. 1пд, е! а1., Оп^дене, 1994, 9, 1745-1750. МЬК3 также известна как 8РВК (ΟηΚο, е! а1., I. Βίο1. СЛет., 1994, 269, 15092-15100) и РТК1 (Еζοе, е! а1., Оп^дете, 1994, 9, 935-938). Б-Ζ К является киназой, несущей лейциновую молнию. 8акита, е! а1., I. Βίο1. СЛет., 1997, 272, 28622-28629. ИБК имеет киназный домен и два предполагаемых мотива лейциновой молнии. Ηοΐ/тап, е! а1., 1. Βίο1. СЛет., 1994, 269, 30808-30817. ИБК также известна как 2РК (Веббу, е! а1., ВюеЛет. ВюрЛук. Век. Сотт., 1994, 202, 613-620) и МИК (Нищ, е! а1., Οηсοдеηе, 1996, 12, 641-650). Представители семейства МЬК также описаны, например, в патентах США 5676945, 5554523, АО 93/15201, патенте Канады 2148898, П1епет, е! а1., Ргос. Асаб. 8с1. И8А, 1997, 94, 9687-9692, ПеА17ритиа, е! а1., I Βΐο1. СЛет., 1997, 272, 16364-16373, Типд, е! а1., Опотдепе, 1997, 14, 653-659, 8е11к, е! а1., Тгепбк ίη Се11 Βίο1., 1997, 7, 161-167, Ма!а, е!. а1., I. Βΐο1. СЛет., 1996, 271, 16888-16896, Нпац е! а1., I Βίο1. СЛет., 1997, 272, 15167-15173, Еап, е! а1., I Βίο1. СЛет., 1996, 271, 24788-24793, Β^ώ, е! а1., ΌΝΑ апб Се11 Βίο1., 1996, 15, 631-642, РοтЬο, е! а1., №!иге, 1995, 377, 750-754, К1е£ет, е! а1., ЕМΒΟ I., 1996, 15, 7013-7025, Ни, е! а1., Оепек & Оеу., 1996, 10, 22512264, 8и, е! а1., ЕМΒΟ I., 1997, 16, 1279-1290, и Όοτο^, е! а1., Еиг. I. Β^οсЛет., 1995, 234, 492-500. Недавно в базе данных Е8Т была идентифицирована другая киназа, родственная МЬК. Последовательность ДНК этого клона, МЬК6, описывается семью перекрывающимися элементами. Идентификационные номера их клонов: 1007489, 1460085, 510915, 666323, Е5555, 482188 и 178522, последовательности каждого из которых включены здесь в виде ссылки в полном объеме. Каждая из ссылок, цитированных в данном параграфе, включена здесь в виде ссылки в полном объеме.

Недавно было показано, что стабильная экспрессия ΖΡΙ< снижает пролиферативную способность фибробластов ΝΙΗ 3Т3, что было измерено с помощью анализа образования колоний. Βе^де^οη, е! а1., ΒίοΟκιη. ΒίορΗνκ. Век. Сотт., 1997, 231, 153-155. Однако Βе^де^οη с соавторами не удалось представить каких-либо данных, указывающих на то, что ΖРК модулировал активность субстрата ΖРК или что ΖРК стимулировал гибель клеток.

Было показано, что экспрессия конструкции, кодирующей Мус-МЬК2, в клетках δ^ίκκ 3Т3 приводит к апоптозу примерно через 20 ч после инъекции. №да!а, е! а1., ЕМΒΟ I., 1998, 17, 149-158.

Заявители разработали многочисленные индоло- и инденосоединения, которые наряду с другими действиями ингибируют рост клеток, ассоциированный с состоянием гиперпролиферации, и ингибируют гибель в различных эмбриональных культурах, таких как культуры ганглия дорсального корешка, полосатого тела, верхних шейных ганглиев и мотонейронов. Патенты США 5475110, 5591855, 5594009, 5461146, 5621100, 5621101, 5705511 и 5756494, каждый из которых уступает место правопреемника данной заявке, включены здесь в виде ссылки в полном объеме. Соединения, перечисленные в патенте США 5705511, имеющие формулу О, указаны в данной заявке как соединения, имеющие формулу I. Заявители также показали, что апоптоз мотонейронов ингибируется производным К-252а, индолокарбазолом, который также модулирует каскад передачи сигнала при стрессе. Работа Магопеу е! а1., ί. №игоксБ, 1998, 18, 104-111 включена здесь в виде ссылки в полном объеме.

Вследствие неадекватности отбираемых соединений, которые модулируют представителей каскада передачи сигнала при стрессе и либо стимулируют гибель клеток, либо повышают выживаемость клеток, остается необходимость в новых избирательных способах скрининга соединений. Кроме того, остается необходимость в скрининговых исследованиях терапевтических средств, которые могут быть пригодны

- 1 006648 при лечении воспаления и нейродегенеративных заболеваний. Данное изобретение направлено на достижение этих, а также других важных целей.

Сущность изобретения

Данное изобретение предоставляет способы идентификации соединений, которые модулируют активность киназного белка множественных линий и повышают выживаемость клеток, включающие в себя этапы контактирования клетки, содержащей киназный белок множественных линий, с соединением, определения того, снижает ли соединение активность киназного белка множественных линий, и определения того, повышает ли соединение выживаемость клеток.

Данное изобретение также предоставляет способы идентификации соединений, которые модулируют активность киназного белка множественных линий и стимулируют гибель клеток, включающие в себя этапы контактирования клетки, содержащей киназный белок множественных линий, с соединением, определения того, увеличивает ли соединение активность киназного белка множественных линий, и определения того, стимулирует ли соединение гибель клеток.

Данное изобретение также предоставляет способы идентификации соединений, которые могут быть пригодны для лечения нейродегенеративных заболеваний, включающие в себя контактирование клетки или клеточного экстракта, содержащего киназный белок множественных линий, с соединением и определение того, снижает ли соединение активность киназного белка множественных линий.

Данное изобретение также предоставляет способы идентификации соединений, которые могут быть пригодны для лечения воспаления, включающие в себя контактирование клетки или клеточного экстракта, содержащего киназный белок множественных линий, с соединением и определение того, снижает ли соединение активность киназного белка множественных линий.

Предпочтительно, если указанный белок выбран из группы, состоящей из киназы множественных линий 1, киназы множественных линий 2, киназы множественных линий 3, киназы, несущей лейциновую молнию, киназы, несущей двойную лейциновую молнию, и киназы множественных линий 6. При этом указанная клетка может представлять собой нервную клетку, которую подвергают контакту ίη νίίτο или ίη νίνο, а указанная активность белка определяется с помощью анализа киназ ίη νίίτο или анализа связывания.

Предпочтительно указанную активность белка определяют путем измерения активности или уровня фосфорилирования субстрата указанного белка, а данный субстрат выбран из группы, состоящей из ЖК1, ΊΝΚ2, ΙΝΚ3, ЕВК1, ЕВК2, р38а, р38Ц, р38у, р388, МЕК1, МЕК2, МКК3, МКК4 (8ЕК1), МЕК5, МКК6, МКК7, _)ип, АТЕ2, ЕЬК1 и гомолога АЕХ-3 млекопитающих. Активность белка определяется путем измерения активности субстрата указанного белка, количества субстрата указанного белка или мРНК, кодирующей указанный субстрат указанного белка, или мРНК, кодирующей указанный белок.

В одном из вариантов осуществления изобретения повышение выживаемости или гибели клеток определяется путем использования клеток с повышенным риском гибели и сравнения количества живых клеток, которые подвергались контакту с указанным соединением, с количеством живых клеток, которые не контактировали с указанным соединением, а указанными клетками являются первичные эмбриональные клетки мотонейронов, которые сверхэкспрессируют указанный киназный белок множественных линий.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанная клетка вовлечена в нейродегенеративное заболевание или в воспаление, а повышение выживаемости клеток определяется путем наблюдения за уменьшением или за увеличением апоптоза.

Данное изобретение также включает способы модуляции активности киназного белка множественных линий, включающий контактирование указанного белка или клетки, содержащей указанный белок, с соединением, имеющим формулу

АП ί

X где Ζ₁ и Ζ₂ представляют собой Н, или Ζ₁ и Ζ₂, взятые вместе, представляют собой =0;

В представляет собой ОН или ОСН₃;

X представляет собой СО₂СН₃ или СО₂(СН₂)₄СН₃;

В! выбран из Н, СН₂8СН₂СН₃, Ν№ΟΝΗ^Η₅, СН₂ОСН₂ОСН₂СН₃, Вг и СН₂СН₂8СН₃;

В₂ выбран из Н, СН₂8СН₂СН₃, N 1С0\11С-1В СН₂СН₂(2-пиридил), СН₂ОСН₂ОСН₂СН₃, СН₂ОН, Вг, I и СН₂СН₂8СН₃.

- 2 006648

Кроме того, данное изобретение относится к способам модуляции активности киназного белка множественных линий, включающий контактирование указанного белка или клетки, содержащей указанный белок, с соединением, имеющим формулу где кольцо В и кольцо Р независимо и каждое вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, выбраны из группы, включающей:

а) ненасыщенное 6-членное карбоциклическое ароматическое кольцо, в котором от 1 до 3 атомов углерода могут быть заменены атомами азота;

А₁, А₂, К.₁, В₃. Я₅ и К,₆ являются Н;

В₁ и В₂ вместе представляют собой О;

Р₂ представляет собой СН₂СН₂ОАс;

Я-| представляет собой СН₂СН₂(2-пиридил) и

X представляет собой СН₂; или

А₁, А₂, К.₁, Я₃, Я₅ и К,₆ являются Н;

В1 и В2 вместе представляют собой О;

Я₂ представляет собой Н;

Я₄ представляет собой СН₂СН₂(2-пиримидинил) и

X означает СН₂; или

А₁, А₂, К.₁, Р₃ и Я₄ являются Н;

В₁ и В₂ вместе представляют собой О;

Я₂ представляет собой СН₂СН₂ОН;

Я₅ и Я₆ представляют собой ОСН₃ и

X означает СН₂; или

А₁, А₂, К.₁, Я₃, Я₅ и К,₆ являются Н;

В1 и В2 вместе представляют собой О;

Р₂ представляет собой СН₂СН₂ОАс;

Я₄ представляет собой Вг и

X означает СН₂; или

А₁, А₂, К.₁, Я₃, Я₅ и К,₆ являются Н;

В₁ и В₂ вместе представляют собой О;

Я₂ представляет собой СН₂СН₂ОАс;

Я₄ представляет собой СН₂СН₂(2-пиридил);

X означает СН₂; или

А₁, А₂, К.₁, Я₃, Я₄, Я₅ и Р₆ являются Н;

В1 и В2 вместе представляют собой О;

Р₂ представляет собой СН₂СН₂ОН и

X означает СН₂; или

А₁, А₂, К.₁, Я₃, Я₄, Я₅ и Р₆ являются Н;

В₁ и В₂ вместе представляют собой О;

Я₂ представляет собой СН₂СН₂СН₂ОН и

X означает СН₂; или

А!, А₂, К.₁, Я₂, Я₃, Р₄, Я₅ и К,₆ являются Н;

В₁ и В₂ вместе представляют собой О и

X означает 8; или

А₁, А₂, К.₁, Я₃, Я₄, Я₅ и Р₆ являются Н;

В1 и В2 вместе представляют собой О;

Р₂ представляет собой СН₂СН₂СН₂ИНСО(4-(ОН)Рй) и

X означает СН₂; или

А₁, А₂, К.₁, Я₃, Я₅ и Р₆ являются Н;

В1 и В2 вместе представляют собой О;

Р₂ представляет собой Н;

Р₄ представляет собой СН₂СН₂(2-пиримидинил) и

X означает СН₂; или

А!, А₂, К.₁, Я₂, Я₃, Я₅ и Р₆ являются Н;

В₁ и В₂ вместе представляют собой О;

- 3 006648

К₄ представляет собой СН₂СН₂(2-пиридазинил) и

X означает СН₂; или

А_ь А₂, Κι, К_з, К₅ и К₆ являются Н;

В! и В₂ вместе представляют собой О;

К₂ представляет собой Н;

К₄ представляет собой СН₂СН₂(2-пиридил) и

X означает СН₂; или

Αι, А₂, Κι, К_з, В₄, К₅ и К₆ являются Н;

В1 и В₂ вместе представляют собой О;

К₂ представляет собой (СН₂)₃-ЫН-С(=О)-3,5-дигидроксифенил и

X означает СН₂; или

А_ь А₂, К₁, К_з, В₄, К₅ и К₆ являются Н;

В₁ и В₂ вместе представляют собой О;

К₂ представляет собой бензоил и

X означает СН₂; или

Αμ А₂, К₁, В₂, К_з, К₅ и К₆ являются Н;

В₁ и В₂ вместе представляют собой О;

К₄ представляет собой ί.Ή=ί.Ή-ί.=Ν и

X означает СН₂.

Краткое описание чертежей

В целях иллюстрации вариантов данного изобретения некоторые детали показаны на чертежах. Однако следует понимать, что это изобретение не ограничено показанными определенными вариантами.

Фиг. 1 представляет собой схематичный чертеж, на котором показано общее получение инденопирролокарбазолов с мостиковой связью;

фиг. 2 - схематичный чертеж, на котором показано общее получение инденопирролокарбазолов с мостиковой связью;

фиг. з - схематичный чертеж, на котором показано получение связанных со смолой инденопирролокарбазолов;

фиг. 4 - схематичный чертеж, на котором показано получение защищенных, растворимых инденопирролокарбазолов;

фиг. 5 - схематичный чертеж, на котором показано получение промежуточного соединения V;

фиг. 6 - схематичный чертеж, на котором показано получение инденопирролокарбазолов с мостиковой связью с помощью метода А;

фиг. 7 - схематичный чертеж, на котором показано получение инденопирролокарбазолов с мостиковой связью с помощью метода В;

фиг. 8 - схематичный чертеж, на котором показано получение инденопирролокарбазолов с мостиковой связью, замещенных в В кольце;

фиг. 9 - схематичный чертеж, на котором показана дериватизация Е кольца инденопирролокарбазолов с мостиковой связью;

на фиг. 10 показана диаграмма двух отдельных экспериментов, представляющая количество жизнеспособных дифференцированных по нейронному пути клеток РС-12, которые остаются после 5 дней культивирования в отсутствие ΝΟΕ. Результаты выражены в виде процента от контроля в присутствии ΝΟΕ в каждой группе (векторный контроль в отсутствие ΝΟΕ, п=12; все другие группы, п=3). Различие между векторным контролем и стабильными пулами клеток, экспрессирующими доминантный негативный мутант МЬК-3, в отсутствие ΝΟΕ статистически значимо, что было определено по двухстороннему Т-критерию (р<0,05);

на фиг. 11А - фосфорилирование неработающей киназы («мертвой» киназы) 68Т-8ЕК-1, экспрессируемой бакуловирусами ЕЬАС-МЬК-3 (смесь полноразмерного белка и киназного домена) с использованием анализа, основанного на определении радиоактивности в геле;

на фиг. 11В - ³²Р-меченный продукт фосфорилирования основного белка миелина, образованный в результате киназной реакции, катализируемой экспрессированной бакуловирусами ЕЬАС-МЬК-3 (смесь полноразмерного белка и киназного домена) или киназным доменом С8Т-МЬК-3;

фиг. 12 представляет собой анализ иммуноблоттов, на котором показано фосфорилирование «мертвой» киназы С8Т-8ЕК-1. экспрессируемой бакуловирусами ЕЬАб-МЬК-3 (смесь полноразмерного белка и киназного домена), как было определено с помощью антител, специфичных для фосфорилированной 8ЕК;

на фиг. 1з показано фосфорилирование основного белка миелина киназным доменом экспрессируемой бакуловирусами С8Т-МЬК-3 с использованием (о) множественного скринингового анализа при осаждении трихлоруксусной кислотой, или (·) метода исследования на фосфоцеллюлозных мембранах;

на фиг. 14 показана кривая насыщения связывания [³Н]К252а, инкубированного с лизатом клеток насекомых, инфицированных МЬК-3 бакуловирусами;

- 4 006648 на фиг. 15А показано количество ³²Р-меченного с-)ип при иммунопреципитации/реакции с киназой, полученной из клеток, сверхэкспрессирующих МЬК-3, МЬК-2 или ИЬК и обработанных либо 0,025% ДМСО (контроль), либо 500 нМ К-252а;

на фиг. 15В показана диаграмма количественного определения процента активности, остающейся при иммунопреципитации/реакции с киназой в образцах, приведенных в описании к фиг. 15 А. Колонки представляют среднее для двух образцов, где величина ошибки показывает пределы средней;

на фиг. 15С показано количество ³²Р-меченного с-щп при иммунопреципитации/реакции с киназой, полученной из клеток, сверхэкспрессирующих одну только ΗΛ-1ΝΙ<1 или в сочетании с МЕКК1 при разных количествах кДНК, как показано, и обработанных либо 0,025% ДМСО (контроль), либо 500 нМ соединения ΙΙΙ-3 (см. табл. 3). Колонки представляют среднее для двух образцов, где величина ошибки показывает пределы средней;

на фиг. 16 показано, что соединение ΙΙΙ-3 повышает выживаемость нейронов зависимым от концентрации образом. Диссоциированные нейроны из симпатического ганглия (8С) (А), ганглия дорсального корешка (ΌΚ.Ο) (В), цилиарного ганглия (СО) (С) и мотонейроны (ΜΝ) (Ό) культивировали в присутствии или в отсутствие указанных трофических факторов. Через 48 ч после посева подсчитывали клетки, как описано в материалах и методах. Данные представлены в виде средней + стандартное отклонение из определений в трех или четырех повторах. Показан один из трех экспериментов;

на фиг. 17 показаны фазово-контрастные микроснимки культур Э12 ΌΚ.0 (А, Е), симпатических Э9 (В, Р), цилиарных Э8 (С, О) и мотонейронов Э5,5 (Ό, Н) после культивирования в течение 48 ч (24 ч для цилиарных нейронов) в присутствии соответствующего нейротрофического фактора (20 нг/мл ΝΟΡ для симпатических и чувствительных нейронов, 10 нг/мл ΟΝΤΕ для цилиарных нейронов, 30 мкг/мл мышечного экстракта (МЕХ) для мотонейронов (А-Ό) или в присутствии 1 мкМ соединения ΙΙΙ-3 (Е-Н). Полоска=200 мкм;

на фиг. 18 показан микрофотоснимок эксплантатов ганглиев дорсальных корешков ίη νίίτο. Эксплантаты ΌΚ.0 цыплят (Е9) высевали в 96-луночные планшеты в среду, содержащую 0,05% БСА. После 2 ч периода прикрепления делали добавки: (А) контроль ДМСО; (В) 20 нг/мл ΝΟΡ; (С) 250 нМ соединения ΙΙΙ-3. Спустя 48 ч среду удаляли и эксплантаты фиксировали 4% параформальдегидом в фосфатносолевом буфере;

на фиг. 19 показано количество люмбальных мотонейронов цыпленка, выживающих на Э10 после ежедневной обработки (Э5-9) определенными дозами соединения ΙΙΙ-3. Представленные данные являются средними ± стандартное отклонение для 5-6 животных/группу обработки. Изложенный эксперимент повторяли два раза. Данные являются данными одного типичного эксперимента и представляют одну сторону поясничного столба. *р<0,01, **р<0,001, по ί-критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони между группой, которой вводили соединение ΙΙΙ-3 и контрольной группой;

на фиг. 20 показано количество мотонейронов в спинномозговом ядре Ьи1Ьоеа\'Сгпо5и5 самок крыс (8ΝΒ), выживающих на ПН10 или ПН60 после ежедневной обработки (ПН1-5) соединением ΙΙΙ-3 или контрольным наполнителем (5% 8о1иЮ1™). На ПН10 (А, В) или ПН60 (В) крыс забивали и делали срезы района спинного мозга, содержащего 8ΝΒ и обрабатывали их для гистологии; затем подсчитывали мотонейроны, окрашенные крезиловым фиолетовым (Сгс5у1се111 νίοΙοί). в серийных срезах поясничного 5крестцового 1 района спинного мозга, как описано ранее (\М1пдПс10., с1 а1., δίβτοίάδ, 1975, 26, 311-327). Экспериментальные данные представляют собой средние ± стандартное отклонение для 4-8 животных/группу обработки;

на фиг. 21 показана потеря ХАТ-иммунореактивности после подъязычной аксотомии у взрослых крыс после обработки соединением ΙΙΙ-3. Микрофотографии подъязычного ядра после рассечения подъязычного нерва и обработки (А) раствором одного наполнителя (5% 8о1и№1™) и (В) 200 мкг соединения ΙΙΙ-3, нанесенными в место рассечения. (С) количество ХАТ-иммунореактивных подъязычных мотонейронов после обработок, описанных выше в пунктах (А) и (В). Результаты выражены в виде процентного содержания ХАТ-иммунореактивных мотонейронов при этом за 100% принимали количество ХАТиммунореактивных мотонейронов в расположенном на противоположной стороне неповрежденном подъязычном ядре;

на фиг. 22 показано ингибирование пути МЬК-3, которое происходит эффективно ίη νί\Ό и блокирует следующие далее этапы фосфорилирования. На фиг. 22А показано увеличение иммунореактивных при анализе на тирозингидроксилазу нейронов черной субстанции после повреждения МРТР при систематическом введении соединения ΙΙΙ-3. Фиг. 22В представляет собой типичный иммуноблот, показывающий индуцированное МРТР увеличение уровней фосфорилированной МКК4. На фиг. 22С изображен типичный иммуноблот и результаты ЕЫ8А, демонстрирующие ослабление индуцированного МРТР увеличения уровня фосфорилированного МКК4 в присутствии соединения ΙΙΙ-3;

на фиг. 23 показана индукция ГЬ-2 в клетках 1шкаБ На фиг. 23А показана временная кривая индукции ГЬ-2. На фиг. 23В показано ингибирование индукции ГЬ-2 соединением ΙΙΙ-3. На фиг. 23С показано ингибирование индукции №-2 соединением ΙΙΙ-3 и соединением 1-4.

Следующие термины, которые использованы выше и на протяжении всей заявки, если не оговорено

- 5 006648 особо, следует понимать как термины, имеющие следующие значения.

Термин «апоптоз» относится к особой морфологической форме гибели клеток, характеризующейся фрагментацией клеток и их ядер на мембрано-связанные частицы. Апоптоз может быть запущен, например, обработкой соединениями, индуцирующими апоптоз, такими как этопозид, стауроспорин, фактор некроза опухоли а, церамид и им подобными, или в таких условиях, как х-облучение.

Термин «гибель клеток» относится к гибели клеток путем апоптоза, некротическим или другим способом, широко известным специалистам в данной области. «Гибель клеток» может быть охарактеризована, например, в виде снижения общего количества клеток или снижения выживаемости клеток по сравнению с необработанными контрольными популяциями клеток. Соединения, которые «стимулируют гибель клеток», приводят в результате к снижению количества клеток или снижению выживаемости клеток по сравнению с контрольными популяциями. Напротив, соединения, которые «повышают выживаемость клеток», приводят в результате к увеличению количества клеток или выживаемости клеток, или эти соединения замедляют или снижают скорость гибели клеток.

Термин «избирательно реагирует» или «избирательно связывает» описывает соединения, которые непосредственно физически или химически взаимодействуют с белком МЬК. Напротив, соединения, которые «не избирательно реагируют» или «не избирательно связывают» могут влиять на белки ниже по течению или выше по течению белка МЬК, и таким образом могут влиять на активность белков МЬК, но не взаимодействовать непосредственно физически или химически с белком МЬК.

Термин «модулирует» относится к повышению или снижению активности конкретного белка или его субстрата.

Частичным направлением данного изобретения являются способы идентификации соединений, которые модулируют активность белка МЬК и либо повышают выживаемость клеток, либо стимулируют гибель клеток. Соединения, которые в результате приводят к увеличению активности белка МЬК, могут стимулировать гибель клеток, тогда как соединения, которые в результате приводят к снижению активности белка МЬК, могут повышать выживаемость клеток.

МЬК белком может быть любой белок, отнесенный при идентификации к МЬК классу белков. Предпочтительно МЬК белок выбирается из группы, состоящей из МЬК1, МЬК2, МЬК3 (8РКК, РТК1), Ь2К, ИЬК (ΖΡΙ<. МИК) и МЬКб, которые описаны выше. В предпочтительных вариантах изобретения эти способы идентифицируют соединения, которые непосредственно взаимодействуют или связываются с МЬК-белком, что определяется с помощью исследований связывания, исследований киназ или другими равноценными анализами.

Чтобы идентифицировать соединения, которые модулируют активность МЬК-белка и стимулируют либо выживаемость клеток, либо гибель клеток, клетку или клетки, содержащие МЬК белок, подвергают контакту с тестируемым соединением. Контактирование может происходить в буферах или средах, хорошо известных специалистам в данной области. В альтернативном случае контактирование может происходить ίη νίνο, при этом животное, такое, например, как мышь или другое подходящее животное, известное специалистам в данной области, подвергают контакту путем введения фармацевтической композиции, содержащей тестируемое соединение и фармацевтически приемлемую соль, носитель или разбавитель. Дополнительно могут быть использованы варьирующие количества клеток и концентрации тестируемых соединений. Определяют, увеличивает ли тестируемое соединение или уменьшает активность белка МЬК. Кроме того, также определяют, стимулирует ли тестируемое соединение выживаемость клеток или гибель клеток.

Клетками, которые подвергают контакту с тестируемыми соединениями, могут быть любые клетки млекопитающих. Предпочтительно клеткой является нервная клетка. Предпочтительно клетка вовлечена в нейродегенеративное заболевание. В целях данного изобретения термины «нейродегенеративное заболевание», «нейродегенеративное нарушение» и «нейродегенеративное состояние» взаимозаменяемы и используются, чтобы описать любое заболевание или состояние, в которое вовлекаются нервные клетки или клетки, связанные с нервной системой, включая, но не ограничиваясь этим, болезнь Альцгеймера, заболевание мотонейронов, боковой амиотрофический склероз, болезнь Паркинсона, цереброваскулярное заболевание, ишемические состояния, деменцию при СПИДе, эпилепсию, болезнь Гентингтона и повреждение при сотрясении или проникающее ранение головного или спинного мозга.

Активность МЬК белка может быть определена многими способами. Например, активность МЬК может быть определена путем измерения активности субстрата МЬК белка. Такие субстраты хорошо известны и без труда отличимы специалистами в данной области. Предпочтительно субстрат является представителем семейства киназ активируемых митогеном протеинкиназ или семейства активируемых митогеном протеинкиназ, или субстратов, продолжающих путь ниже, которые включают в себя, но не ограничены этим, белок, выбранный из группы, состоящей из 1ЫК1, 1ЫК2, 1ЫК3, ЕР К1, ЕКК2, р38а, р38в, р38у, р388, МЕК1, МЕК2, МКК3, МКК4 (8ЕК1), МЕК5, МККб, МКК7, щп, АТГ2, ЕЬК1 и гомолог АЕХ-3 млекопитающих, а также общие субстраты 8сг/Т11г протеинкиназ, такие как основной белок миелина (МВР). Реактивы и способы измерения активности субстратов также хорошо известны специалистам в данной области. Присутствие МЬК также может быть определено путем измерения количества

МЬК белка или мРНК, кодирующей МЬК белок. Реактивы, включая антитела и олигонуклеотидные зонды, а также способы измерения количества ДНК или белка, включая нозерн- и вестерн-блотты, хорошо известны специалистам в данной области. Активность МЬК белка также может быть определена путем анализа киназы ίη νίίτο. Анализы киназ ίη νίίτο хорошо известны специалистам в данной области. Другие способы измерения активности белка известны специалистам в данной области, и имеется в виду, что они включены в данное изобретение. Таким образом, специалист в данной области может определить, модулирует ли тестируемое соединение (т.е. увеличивает или снижает) активность МЬК-белка.

Стимулирует ли или не стимулирует тестируемое соединение выживание клеток или гибель клеток, может быть определено многими путями. Предпочтительно повышение выживаемости клеток или стимуляция гибели клеток определяется с использованием клеток, для которых существует риск гибели, и при сравнении количества клеток, которые подвергались контакту с тестируемым соединением и остались живыми, с количеством клеток, которые не подвергались контакту с тестируемым соединением и остались живы. Предпочтительно клетками являются первичные эмбриональные клетки мотонейронов, которые заранее запрограммированы на смерть. Первичные эмбриональные клетки мотонейронов описаны в работе Магопеу, с1 а1., Τ №иго8ст, 1998, 18, 104-111, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме. Первичные эмбриональные клетки мотонейронов погибнут, если не будут спасены с помощью тестируемого соединения. Таким образом, большее количество живых клеток мотонейронов в популяции клеток мотонейронов, обработанных тестируемым соединением, по сравнению с количеством клеток мотонейронов в популяции мотонейронных клеток, которые не были обработаны тестируемым соединением, является показателем тестируемого соединения, которое повышает выживаемость клеток. Напротив, меньшее количество живых клеток мотонейронов в популяции мотонейронных клеток, обработанных тестируемым соединением, по сравнению с количеством живых клеток мотонейронов в популяции мотонейронных клеток, которые не были обработаны тестируемым соединением, является показателем тестируемого соединения, которое стимулирует гибель клеток.

В другом варианте изобретения нормальные клетки, или клетки дикого типа, превращают в клетки, для которых существует риск гибели, путем сверхэкспрессии белка МЬК, как описано ниже в примерах, и затем подвергают контакту с тестируемым соединением. Клетки, сверхэкспрессирующие белки МЬК, могут погибнуть, если не будут спасены с помощью тестируемого соединения. Сверхэкспрессия белков МЬК может быть достигнута с помощью векторов, способных к экспрессии конкретного белка внутри клетки. Экспрессирующие векторы хорошо известны специалистам в данной области. Кроме того, способы подготовки экспрессирующих векторов также хорошо известны специалистам в данной области. Экспрессирующие векторы, которые экспрессируют какие-либо белки МЬК, могут быть получены способом, подобным тем, которые описаны в примерах. Большее количество живых клеток в популяции сверхэкспрессирующих клеток, обработанных тестируемым соединением, по сравнению с количеством живых клеток в популяции сверхэкспрессирующих клеток, которые не были обработаны тестируемым соединением, является показателем тестируемого соединения, которое повышает выживаемость клеток. Напротив, меньшее количество живых клеток в популяции сверхэкспрессирующих клеток, обработанных тестируемым соединением, по сравнению с количеством живых клеток в популяции сверхэкспрессирующих клеток, которые не были обработаны тестируемым соединением, является показателем тестируемого соединения, которое стимулирует гибель клеток.

В другом варианте изобретения повышение выживаемости клеток определяется путем наблюдения или измерения уменьшения апоптозов. С апоптозом ассоциировано сжатие цитоплазмы и конденсация ядер. Таким образом, специалист в данной области может измерить уменьшение апоптоза путем измерения или наблюдения за уменьшением сокращения цитоплазмы и/или конденсации ядер. Кроме того, специалист в данной области может измерить апоптоз с применением традиционных способов окрашивания.

В другом варианте изобретения для идентификации соединений, которые стимулируют гибель клеток, могут быть использованы нормальные нервные клетки дикого типа. Нормальные нервные клетки будут выживать, если они не будут индуцированы к смерти тестируемым соединением. Меньшее количество живых клеток в популяции нормальных клеток, обработанных тестируемым соединением, по сравнению с количеством живых клеток в популяции нормальных клеток, которые не были обработаны тестируемым соединением, является показателем тестируемого соединения, которое стимулирует гибель клеток. Напротив, большее или равное количество живых клеток в популяции нормальных клеток, обработанных тестируемым соединением, по сравнению с количеством живых клеток в популяции нормальных клеток, которые не были обработаны тестируемым соединением, не является показателем тестируемого соединения, которое стимулирует гибель клеток.

Частично данное изобретение направлено также на способы модулирования активности белка МЬК, которые включают в себя контактирование белка или клетки, содержащей белок, с соединением, имеющим формулу С (обозначена здесь как формула I), заявленную в патенте США № 5705511, правопреемником которого является данное изобретение и который включен здесь в виде ссылки в полном объеме.

Частично данное изобретение направлено также на способы модулирования активности белка

- 7 006648

МЬК, включающие в себя контактирование белка или клетки, содержащей белок, с соединением, имеющим формулу III, приведенную ниже

где Ζ₁ представляет собой Н, и Ζ₂ представляет собой Н или Ζ₁ и Ζ₂ вместе образуют =0;

К_| выбирается из группы, состоящей из Н, С1, СН₂8О₂С₂Н₅, Вг, ΟΗ₂8(ΟΗ₂)₂ΝΗ₂, СН₂8(СН₂)₂Ы(СНз)₂, СЩЗССЩЪИЩп-СдНэ, NΗСОNΗС6Η5, NΗСОNΗС2Η5, СН28С2Н5, СНУС.Н,. N(№3)2, СНз,

СН₂ОСО1МНС₂Н₅, NΗСО₂СΗ₃, СН₂ОС₂Н₅, СН^(СН₃)₂, ОН, О-н-пропила, СΗ=NNΗ-С(=NΗ)NΗ₂, СН=Н^СНзЦ СН28(СН2Ь:МН-п-С4Н₉, СН2ОСН2ОСН2СН3, СН28[3-(1,2,4-триазина)], СН2СН28СН3;

СН₂СН2СН2—N О /---\

СН=Ц— N

К₂ выбирается из группы, состоящей из Н, Вг, С1, I, СН₂8(СН₂)^(СН₃)₂, NΗСОNΗС₂Η₅, СН₂8С₂Н₅, СН2ОСН2ОСН2СН3, СН28[3-(1,2,4-триазина)], СН2СН28СН3 и СН2ОН;

X выбирается из группы, состоящей из Н, СН₂ОН, СН₂NН-серина, СО₂СН₃, СОNΗС6Η₅, СН₂:МНСО₂С₆Н₅, С11ЛНСС)_;С11_;. ί.Ή₂Ν₃. СО^МНС₂Н₅, СН₂1МН-глицина, СО^СН₃)₂, -СНЛ'НСО-. ΟΌΝ^. СО1МНС₃Н₇, СНЛ'Н-ссринз. СН₂8ОСН₃, СН=^Н, СН^Н-пролина, СН₂СН₂(2-пиридила), СΗ=NNΗС(=NΗ)NΗ₂, СО1МН(СН₂)₂ОН, С11 ΝΝΊΚΌΝΉ;. СН₂ОСОСН₃, -СН₂ОС(СН₃)₂О-, СН₂8С₆Н₅, СН₂8ОС₆Н₅, СО₂Н-гексила, ^ΝΉ^ и СО₂(СН₂)₄СН₃; или одной из следующих формул:

и Κ выбирается из группы, состоящей из ОН и ОСН₃.

В предпочтительных вариантах изобретения Ζ₁ и Ζ₂ являются Н, X представляет собой СО₂СН₃, Κ₁ означает NΗСОNΗС₂Η₅, К₂ означает СН₂СН₂(2-пиридил) и Κ означает ОН. В других предпочтительных вариантах изобретения Ζ₁ и Ζ₂ являются Н, X представляет собой СО₂СН₃, Κ₁ и К₂ представляют собой СН₂ОСН₂ОСН₂СН₃ и Κ означает ОН; или Ζ₁ и Ζ₂ являются Н, X представляет собой СО₂СН₃, Κ₁ и К₂ представляют собой СН₂8СН₂СН₃, и Κ означает ОН; или Ζ₁, Ζ₂, Κ₁ и Κ₂ являются Н, X означает СО₂СН₃, и Κ означает ОН; или Ζ₁, Ζ₂, Κ₁ и Κ₂ являются Н, X означает СО₂(СН₂)₄СН₃, и Κ означает ОН; или Ζ₁, Ζ₂ и Κ_| являются Н, К₂ представляет собой СН₂ОН, X означает СО₂СН₃, и Κ означает ОН; или Ζ₁ и Ζ₂ являются Н, К_| и Κ₂. представляют собой Н₂8[3-(1,2,4-триазин)], X означает СО₂СН₃, и Κ означает ОН; или Ζ₁ и Ζ₂ являются Н, К_| является Вг, К₂ является I, X означает СО₂СН₃, и Κ означает ОН; или Ζ₁ и Ζ₂ являются Н, К_| и К₂ представляют собой СН₂СН₂8СН₃, X означает СО₂СН₃, и Κ означает ОН; или Ζ₁, Ζ₂, Κ_| и Κ₂ являются Н, X означает СО₂СН₃, и Κ означает ОСН₃; или Ζ₁ и Ζ₂ вместе образуют =О, К_| и К₂ являются Вг, X означает СО₂СН₃, и Κ означает ОН.

Направлением части данного изобретения также являются способы модулирования активности белка МЬК, включающие в себя контактирование белка, или клетки, содержащей белок, с соединением, имеющим формулу II, приведенную ниже

- 8 006648

Π где кольцо В и кольцо Р независимо и каждое вместе с атомами углерода, с которыми они связаны, выбираются из группы, состоящей из:

a) ненасыщенного 6-членного карбоциклического ароматического кольца, в котором от 1 до 3 атомов углерода могут быть замещены атомами азота;

b) ненасыщенного 5-членного карбоциклического ароматического кольца и

c) ненасыщенного 5-членного карбоциклического ароматического кольца, в котором либо

1) один атом углерода замещен атомом кислорода, азота или серы;

2) два атома углерода замещены атомами серы и азота, атомами кислорода и азота или двумя атомами азота; либо

3) три атома углерода замещены тремя атомами азота;

В¹ выбирается из группы, состоящей из:

a) Н, замещенного или незамещенного алкила, имеющего от 1 до 4 углеродов, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного арилалкила, замещенного или незамещенного гетероарила или замещенного или незамещенного гетероарилалкила;

b) -С(=О)В⁹, где В⁹ выбирается из группы, состоящей из алкила, арила и гетероарила;

c) -ОВ¹⁰, где В¹⁰ выбирается из группы, состоящей из Н и алкила, имеющего от 1 до 4 углеродов;

й) -С(=О)1ЧН2, -ХВ В'². -(СН2)рХВ В'². -(СН2)рОВ¹⁰, -(СН2)рОВ¹⁰ и -О(СН)рХВ^ПВ¹², где р равно от 1 до 4; и где либо

1) каждый из радикалов В¹¹ и В¹² независимо выбирается из группы, состоящей из Н и алкила, имеющего от 1 до 4 углеродов; либо

2) В¹¹ и В¹² вместе образуют связанную группу формулы -(СН2)2-Х¹-(СН2)₂-, где X¹ выбирается из группы, состоящей из -О-, -8- и -СН₂-;

В² выбирается из группы, состоящей из Н, алкила, имеющего от 1 до 4 углеродов, -ОН, алкоксигруппы, имеющей от 1 до 4 углеродов, -ОС(=О)В⁹, -ОС(=О)ЫВ¹¹В¹², -О(СН2)рЫВ¹¹В¹², -О(СН2)_рОВ¹⁰, замещенного или незамещенного арилалкила, имеющего от 6 до 10 углеродов, и замещенного или незаме щенного гетероарилалкила;

каждый из радикалов В³, В⁴, В⁵ и В⁶ независимо выбирается из группы, состоящей из:

a) Н, арила, гетероарила, Р, С1, Вг, I, -СЫ, СР3, -ЫО2, -ОН, -ОВ⁹, -О(СИ-1.\ПК ², -ОС(=О)В⁹, -ОС(=О)Х1В²В⁷, -ОС(=О)ЫВ¹¹В¹², -О(СН2)рОВ¹⁰, -СН2ОВ¹⁰, -ЫВ¹¹В¹², -ЫВ¹⁰8(=О)₂В⁹, -ЫВ¹⁰С(=О)В⁹;

b) -СН2ОВ¹⁴, где В¹⁴ является остатком аминокислоты после удаления гидроксила карбоксильной группы;

с) -ЫВ¹⁰С(=О)ЫВ¹¹В¹², -СО2В², -С(=О)В², С(=О)ЫВ¹¹В¹², -СН ХОВ². -СН=ЫВ⁹, -(СН2)_рЫВ¹¹В¹², -(СН₂)_рЫНВ¹⁴ или -СН=ЫХВ²В^2А где В^2А означает то же, что и В²;

й) -8(О)_уВ² -(СН2)р8(О)уВ⁹, -СН28(О)_уВ¹⁴, где у равен 0, 1 или 2;

е) алкила, имеющего от 1 до 8 углеродов, алкенила, имеющего от 2 до 8 углеродов, и алкинила, имеющего от 2 до 8 углеродов, где

1) каждая из алкильной, алкенильной или алкинильной группы незамещена; или

2) каждая из алкильной, алкенильной или алкинильной группы замещена группами в количестве от до 3, выбранными из группы, состоящей из арила, имеющего от 6 до 10 углеродов, гетероарила, арилалкоксигруппы, гетероциклоалкоксигруппы, гидроксиалкоксигруппы, алкилоксиалкоксигруппы, гидроксиалкилтиогруппы, алкоксиалкилтиогруппы, Р, С1, Вг, I, -СЫ, -ХО₂, -ОН, -ОВ⁹, -Х²(СН₂)_рХВ^пВ¹², -Х²(СН2)рС(=О)ЫВ¹¹В¹², -Х²(СН2)рОС(=О)ЫВ¹¹В¹², -Х²(СН2)рСО2В⁹, -Х²(СН2)р8(О)уВ⁹,

Х²(СН2)рХВ¹⁰С(=О)ЫВ¹¹В¹², -ОС(=О)В⁹, -ОСОЫНВ², -О-тетрагидропиранила, -ХВ¹¹В¹², -ХВ¹⁰С(=О)В⁹, -ХВ¹⁰СО2В⁹, -ХВ¹⁰С(=О)ЫВ¹¹В¹², -ХНС(=ХН)ХН2, ЫВ¹⁰8(О)2В⁹, -8(О)уВ⁹, -СО2В², С(=О)ЫВ¹¹В¹², -С(=О)В², -СН2ОВ¹⁰, -СН=ХЫВ²В^2А, -СН ХОВ², -СН=ХВ⁹, -СН=ХХНСН(Х ХН)ХН, -8(=О)2ЫВ²В^2А, -Р(=О)(ОВ¹⁰)₂, -ОВ¹⁴ и моносахарида, имеющего от 5 до 7 углеродов, где каждая гидроксильная группа моносахарида независимо либо незамещена, либо замещена Н, алкилом, имеющим от 1 до 4 углеродов, алкилкарбонилоксигруппой, имеющей от 2 до 5 углеродов, или алкоксигруппой, имеющей от 1 до 4 уг

- 9 006648 леродов;

X² означает О, 8 или ΝΚ¹⁰ ;

каждый из радикалов К⁷ и К⁸ независимо выбирается из группы, состоящей из Н, алкила, имеющего от 1 до 4 углеродов, алкоксигруппы, имеющей от 1 до 4 углеродов, замещенного или незамещенного арилалкила, имеющего от 6 до 10 углеродов, замещенного или незамещенного гетероарилалкила, -(СН2)рОК¹⁰, -(СН2)_рОС(=О)ХК¹¹К¹² и -(ΟΗ2)ρΝΚ¹¹Κ¹²; или К⁷ и К⁸ вместе образуют связанную группу формулы -СН2-Х³-СН₂-, где X³ представляет собой X² или связь;

каждый из индексов т и η независимо равны 0, 1 или 2;

Υ выбирается из группы, состоящей из -О-, -8-, -Ν(Κ¹⁰)-, -Ν⁺(О^-)(К¹⁰)-, -Ν(ΟΚ¹⁰)- и -СН₂-;

Ζ выбирается из группы, состоящей из связи, -О-, -СН=СН-, -8-, -С(=О)-, -СН(ОК¹⁰)-, -Ν(Κ¹⁰)-, -Ν(ΟΚ¹⁰)-, СН(\К К'⁷)-. -С(=О)^К¹⁷)-, -Л(К¹⁷)С(=О)-, -Л(8(О)уК⁹)-, ^(8(О)^^ПК¹²)-, ^(С(=О)К¹⁷)-, -С(К¹⁵К¹⁶)-, -Щ(О^-)(К¹⁰)-, -СН(ОН)-СН(ОН)- и -СН(О(С=О)К⁹)СН(ОС(=О)К^9А)-, где К^9А представляет собой то же, что и К⁹;

К¹⁵ и К¹⁶ независимо выбираются из группы, состоящей из Н, -ОН, -С(=О)К¹⁰, -О(С=О)К⁹, гидроксиалкила и -СО₂К¹⁰;

К¹⁷ выбирается из группы, состоящей из Н, алкила, арила и гетероарила;

А¹ и А² выбираются из группы, состоящей из Н,Н; Н,ОК²; Н,-8К²; Н,-Л(К²)₂; и группы, в которой А¹ и А² вместе образуют фрагмент, выбранный из группы, состоящей из =О, =8 и =ΝΒ²;

В¹ и В² выбираются из группы, состоящей из Н,Н; Н,-ОК²; Н,-8К²; Н,-Л(К²)₂; и группы, в которой В¹ и В² вместе образуют фрагмент, выбранный из группы, состоящей из =О, =8 и =ΝΒ²; при условии, что по меньшей мере одна из пар А¹ и А² или В¹ и В² образует =О.

Частично данное изоберетение направлено также на способы модулирования активности белка МЬК, включающие в себя контактирование белка или клетки, содержащей белок, с соединением, имеющим формулу IV, приведенную ниже

где Ζ₁ означает Н и Ζ₂ означает Н или Ζ₁ и Ζ₂ вместе образуют =О;

К₁ означает Н или Вг;

К2 означает Н;

К₃ означает Н, СН₂СН=СН₂, СН₂СН₂СН₂ОН, или / \

СН2СН2СН2— N О

К4 означает Н, СН2СН=СН2 или СН2СН2СН2ОН.

В предпочтительных вариантах изобретения К₁, К₂, К₄, Ζ₁ и Ζ₂ являются Н, и К₃ означает СН₂СН=СН₂. В других предпочтительных вариантах изобретения К₁ является Вг и К₂, К₃, К₄, Ζ₁ и Ζ₂ являются Н; или К₁, К₂, Ζ₁ и Ζ₂ являются Н и К₃ и К₄ означают СН₂СН=СН₂; или К₁, К₂, К₃, Ζ₁ и Ζ₂ являются Н и К₄ означает СН₂СН=СН₂; или К₁, К₂, Ζ₁ и Ζ₂ являются Н, и К₃ и К₄ означают СН₂СН₂СН₂ОН; или

К₁, К₂, К₄, Ζ₁ и Ζ₂ являются Н и К₃ означает

Данное изобретение также предоставляет способы идентификации соединений, которые могут быть пригодны при лечении нейродегенеративных заболеваний, включающие в себя контактирование клетки или клеточного экстракта, содержащего киназный белок множественных линий, с соединением, и определении того, снижает ли соединение активность киназного белка множественных линий. Клетки и их экстракты включают в себя такие, которые описаны выше. Соединения, которые выявляются данными способами (т.е. те соединения, которые ингибируют или снижают активность киназного белка множественных линий) могут быть пригодны для лечения нейродегенеративных заболеваний. Белок предпочтительно выбирается из группы, состоящей из киназы множественных линий 1, киназы множественных линий 2, киназы множественных линий 3, киназы, несущей лейциновую молнию, киназы, несущей двойную лейциновую молнию, и киназы множественных линий 6. Клетку подвергают контакту ίη νίίτο или ίη νίνο. Предпочтительно активность белка определяют путем измерения активности или уровня фосфорилирования субстрата указанного белка. Предпочтительно субстрат выбирается из группы, состоящей из ΙΝΚ1, ΙΝΚ2, ΙΝΚ3, ЕКК1, ЕКК2, р38а, р38в, р38у, р388, МЕК1, МЕК2, МКК3, МКК4 (8ЕК1), МЕК5,

- 10 006648

МКК6, МКК7, _)ип, АТР2, ЕЬК1 и гомолога АЕХ-3 млекопитающих, а также общих 8ет/Тйт субстратов, таких, например, как основной белок миелина (МВР). Активность белка также может быть определена путем измерения активности субстрата белка, количества субстрата белка, или мРНК, кодирующей субстрат белка. Активность белка также может быть определена путем анализа киназы ίη νίίτο или анализа связывания. Клетками предпочтительно являются первичные эмбриональные клетки мотонейронов, клетки, которые сверхэкспрессируют киназный белок множественных линий, или нервная клетка, но может быть любая клетка или клеточный экстракт. Предпочтительно идентифицируются соединения, которые непосредственно связывают киназный белок множественных линий, как описано выше.

Данное изобретение также предоставляет способы идентификации соединений, которые могут быть пригодны при лечении воспаления, включающие в себя контактирование клетки или клеточного экстракта, содержащего киназный белок множественных линий, с соединением, и определении того, снижает ли соединение активность киназного белка множественных линий. Клетки и их экстракты включают в себя такие, которые описаны выше. Соединения, которые обнаруживаются данными способами (т.е. те соединения, которые ингибируют или снижают активность киназного белка множественных линий) могут быть пригодны для лечения воспаления. Белок предпочтительно выбирается из группы, состоящей из киназы множественных линий 1, киназы множественных линий 2, киназы множественных линий 3, киназы, несущей лейциновую молнию, киназы, несущей двойную лейциновую молнию, и киназы множественных линий 6. Клетку подвергают контакту ίη νίίτο или ίη νίνο. Предпочтительно активность белка определяют путем измерения активности или уровня фосфорилирования субстрата указанного белка. Предпочтительно субстрат выбирается из группы, состоящей из ΙΝΙ<1, ΙΝΧ2, ΙΝΧ3, ЕКК1, ЕКК2, р38а, р38в, р38у, р388, МЕК1, МЕК2, МКК3, МКК4 (8ЕК1), МЕК5, МКК6, МКК7, _щп, АТЕ2, ЕЬК1 и гомолога АЕХ-3 млекопитающих, а также общих 8ег/Т11г субстратов, таких, например, как основной белок миелина (МВР). Активность белка также может быть определена путем измерения активности субстрата белка, количества субстрата белка или мРНК, кодирующей субстрат белка. Активность белка также может быть определена путем анализа киназы ίη νίίτο или анализа связывания.

Клетками предпочтительно являются первичные эмбриональные клетки мотонейронов, клетки, которые сверхэкспрессируют киназный белок множественных линий, или нервная клетка, но может быть любая клетка или клеточный экстракт. Клетки также включают в себя, не ограничиваясь этим, клетки, участвующие в воспалении, такие, например, как лимфоциты, макрофаги и другие лейкоциты, хорошо известные специалистам в данной области. Предпочтительно идентифицируются соединения, которые непосредственно связывают киназный белок множественных линий.

Данное изобретение также предоставляет способы лечения млекопитающего, болеющего или предположительно болеющего нейродегенеративным заболеванием, включающие в себя введение млекопитающему соединения, которое ингибирует или снижает активность киназного белка множественных линий. Соединения, которые ингибируют или снижают активность киназного белка множественных линий, включают в себя, не ограничиваясь этим, соединения, имеющие формулы I, II, III и IV. Предпочтительные соединения включают в себя соединения, приведенные выше в описании, которые касаются способа скрининга соединений, которые модулируют активность киназного белка множественных линий, и либо повышают выживаемость клеток, либо стимулируют гибель клеток. Предпочтительным млекопитающим является человек. Можно предполагать, что у человека имеется нейродегенеративное заболевание, если у человека есть симптомы конкретного нейродегенеративного заболевания, он относится к группе повышенного риска, или имеется нейродегенеративное заболевание в истории семьи.

Данное изобретение также предоставляет способы лечения млекопитающего при воспалении, включающие в себя введение указанному млекопитающему соединения, которое ингибирует или снижает активность киназного белка множественных линий. Соединение, которое ингибирует или снижает активность киназного белка множественных линий, включает в себя, не ограничиваясь этим, соединения, имеющие формулы I, II, III и IV. Предпочтительные соединения включают в себя соединения, приведенные выше в описании, в связи со способом скрининга соединений, которые модулируют активность киназного белка множественных линий и либо повышают выживаемость клеток, либо стимулируют гибель клеток. Предпочтительным млекопитающим является человек.

Контактирование с соединениями, имеющими формулы Иу может происходить в буферах или средах, которые хорошо известны специалистам в данной области. В альтернативном случае контактирование может осуществляться путем введения фармакологической композиции, содержащей тестируемое соединение и фармацевтически приемлемую соль, носитель или разбавитель, подходящему животному или млекопитающему, такому, например, как мышь или другое пригодное животное, известное специалистам в данной области. Кроме того, могут быть использованы варьирующие количества клеток и концентраций соединений. Клетками, которые подвергаются контакту с тестируемыми соединениями, могут быть любые клетки млекопитающих. Предпочтительно клеткой является нервная клетка. Предпочтительно клетка вовлечена в такое нейродегенеративное заболевание, как, например, болезнь Альцгеймера, заболевание мотонейронов, боковой амиотрофический склероз, болезнь Паркинсона, цереброваскулярное заболевание, ишемические состояния, деменцию при СПИДе, эпилепсию, болезнь Гентингто

- 11 006648 на и повреждение при сотрясении или проникающее ранение головного или спинного мозга. Соединения, имеющие формулу I, и способы их получения описаны в патенте США 5705511, который включен здесь в виде ссылки в полном объеме. Соединения, имеющие формулу III, и способы их получения описаны в патентах США 57418098, 5621100, 5621101, 5461146 и 5756494 и \УО 97/46567, каждый из которых включен здесь в виде ссылки в полном объеме. Соединения, имеющие формулу IV, и способы их получения описаны в патентах США 57418098, 5621100, 5 621101, 5461146 и 5756494 и АО 97/46567, каждый из которых включен здесь в виде ссылки в полном объеме.

Соединения, имеющие формулу II, включают в себя диастереомеры и энантиомеры у атомов углерода, с которыми связаны заместители К², К⁷ и К⁸.

Предпочтительными инденопирролокарбазолами с мостиковой связью являются соединения, представленные формулой II

В некоторых предпочтительных вариантах соединений формулы II К¹ является Н. В дополнительных предпочтительных вариантах К² является Н, гидроксилом или замещенным или незамещенным алкилом.

В других предпочтительных вариантах К³, К⁴, К⁵ и К⁶ независимо представляют собой Н, замещенный или незамещенный алкил, галоген, замещенную или незамещенную алкоксигруппу, замещенную или незамещенную аминогруппу или замещенный или незамещенный арил. В следующих предпочтительных вариантах К⁷ и К⁸ независимо являются Н или замещенным или незамещенным алкилом.

В некоторых предпочтительных вариантах Υ означает О. В дополнительных предпочтительных вариантах Ζ означает связь, О, 8 или замещенный или незамещенный N. В других дополнительных предпочтительных вариантах т и η независимо равны 1 или 2. В некоторых особо предпочтительных вариантах Υ означает О, Ζ означает связь или О и т и η независимо равны 1 или 2.

В следующих предпочтительных вариантах А¹ А² и В¹ В² являются =О или Н,Н.

В некоторых особо предпочтительных вариантах каждый из К¹, К⁴, К⁶ и К⁷ является Н, Υ означает =О, η равно 1, А¹ А² и В¹ В² являются =О или Н,Н, К² является Н, ОН или низшим алкилом, К₃ является Н или замещенным алкилом, каждый из К⁵ и К⁸ является Н или алкоксигруппой, причем метоксигруппа является предпочтительной, Ζ означает связь или О, и т равно 1 или 2.

Некоторыми особенно предпочтительными вариантами соединений формулы II являются соединения П-1, П-2, П-3, П-4а, П-4Ь, П-5, П-6, П-7а, П-7Ь, П-8, П-9, П-10, П-11 и П-12, представленные ниже в табл. 1.

Соединения, представленные формулой II в дальнейшем называются соединениями (II).

В используемом здесь смысле термин «карбоциклическая» относится к циклическим группам, в которых циклическая часть состоит только из атомов углерода. Термины «гетероцикло» и «гетероциклическая» относятся к циклическим группам, в которых циклическая часть включает в себя по меньшей мере один гетероатом, такой как О, N или 8.

В используемом здесь смысле термин «алкил» означает алкильную группу с неразветвленной цепью, циклическую алкильную группу или алкильную группу с разветвленной цепью, имеющую от 1 до 8 атомов углерода, такую как метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, изоамил, неопентил, 1-этилпропил, гексил, октил, циклопропил и циклопентил. Алкильный фрагмент алкилсодержащих групп, таких как алкоксигруппы, алкоксикарбонильные группы и алкиламинокарбонильные группы, имеет такое же значение, как и алкил, определенный выше. Низшими алькильными группами, которые предпочтительны, являются алкильные группы, которым дано определение выше и которые содержат от 1 до 4 углеродов. Термин «алкенил» означает группы, включающие в себя неразветвленные или разветвленные углеводородные цепи, имеющие по меньшей мере одну двойную связь углерод-углерод. Примеры алкенильных групп включают в себя этенильную и пропенильную группы. В используемом здесь смысле термин «алкинил» означает группы, включающие в себя неразветвленные или разветвленные углеводородные цепи, имеющие по меньшей мере одну тройную связь углерод-углерод. Примеры алкинильных групп включают в себя этинильную и пропинильную группы.

- 12 006648

Ацильный фрагмент ацилсодержащих групп, таких как ацилоксигруппы означает группы, включающие в себя неразветвленную или разветвленную алканоильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, такие как формил, ацетил, пропаноил, бутирил, валерил, пивалоил или гексаноил.

В используемом здесь смысле термин «арил» означает группу, имеющую от 6 до 12 атомов углерода, такую как фенил, бифенил и нафтил. Предпочтительные арильные группы включают в себя незамещенные или замещенные фенильные и нафтильные группы. В используемом смысле термин «гетероарил» означает арильную группу, в которой один или большее количество атомов углерода кольца замещены гетероатомом (т.е. не углеродным атомом), таким как О, N или 8. Предпочтительные гетероарильные группы включают в себя группы пиридила, пиримидила, пирролила, фурила, тиенила, имидазолила, триазолила, тетразолила, хинолила, изохинолила, бензоимидазолила, тиазолила, пиразолила и бензотиазолила.

Термин «аралкил» (или «арилалкил») предназначен для обозначения группы, имеющей от 7 до 15 углеродов, состоящей из алкильной группы, которая несет арильную группу. Примеры аралкильных групп включают в себя бензильную, фенетильную, бензгидрильную и нафтилметильную группы.

Алкильные группы и алкильные фрагменты, находящиеся в замещающих группах, таких как аралкил, алкоксигруппа, арилалкоксигруппа, гидроксиалкоксигруппа, алкоксиалкоксигруппа, гидроксиалкилтиогруппа, алкоксиалкилтиогруппа, алкилкарбонилоксигруппа, гидроксиалкил и ацилоксигруппа могут быть замещенными или незамещенными. Замещенная алкильная группа имеет от 1 до 3 независимо выбранных заместителей, предпочтительно гидроксигруппу, низшую алкоксигруппу, низшую алкоксиалкоксигруппу, замещенную или незамещенную арилалкокси-низшую алкоксигруппу, замещенную или незамещенную гетероарилалкокси-низшую алкоксигруппу, замешенную или незамещенную арилалкоксигруппу, замещенную или незамещенную гетероциклоалкоксигруппу, галоген, карбоксил, низший алкоксикарбонил, нитрогруппу, аминогруппу, моно- или динизшую алкиламиногруппу, диоксолан, диоксан, дитиолан, дитион, фуран, лактон или лактам.

Каждая из замещенных арильных, замещенных гетероарильных и замещенных аралкильных групп имеет от 1 до 3 независимо выбранных заместителей, которыми предпочтительно являются низший алкил, гидроксигруппа, низшая алкоксигруппа, карбоксигруппа, низший алкоксикарбонил, нитрогруппа, аминогруппа, моно- или динизшая алкиламиногруппа и галоген.

Гетероциклические группы, образованные с участием атома азота, включают в себя пирролидинил, пиперидинил, пиперидиногруппу, морфолинил, морфолиногруппу, тиоморфолиногруппу, Νметилпиперазинил, индолил, изоиндолил, имидазол, имидазолин, оксазолин, оксазол, триазол, тиазолин, тиазол, пиразол, пиразолон и триазол. Гетероциклические группы, образованные с участием атома кислорода, включают в себя фурановую, тетрагидрофурановую, пирановую и тетрагидропирановую группы.

«Гидроксиалкильными» группами являются алкильные группы, которые имеют дополнительно присоединенную гидроксильную группу. Галогены включают в себя фтор, хлор, бром и иод.

В используемом здесь смысле «гетероарилалкил» означает арилалкильную группу, которая содержит гетероатом. Термин «окси» означает наличие атома кислорода. Таким образом, «алкокси» группами являются алкильные группы, которые присоединяются посредством атома кислорода, и «карбонилокси» группами являются карбонильные группы, которые присоединяются посредством атома кислорода.

Термин «гетероциклоалкокси» означает алкоксигруппу, которая имеет гетероциклическую группу, присоединенную к ее алкильному фрагменту, и термин «арилалкокси» означает алкоксигруппу, которая имеет арильную группу, присоединенную к ее алкильному фрагменту. Термин «алкилкарбонилокси» означает группу формулы -О-С(=О)-алкил.

В использованном здесь смысле термин «алкилоксиалкокси» означает алкоксигруппу, которая содержит алкилоксизаместитель, присоединенный к ее алкильному фрагменту. Термин «алкоксиалкилтио» означает алкилтиогруппу (т.е. группу формулы -8-алкил), которая содержит алкоксизаместитель, присоединенный к ее алкильному фрагменту. Термин «гидроксиалкилтио» означает алкилтиогруппу (т.е. группу формулы -8-алкил), которая содержит гидроксильный заместитель, присоединенный к ее алкильному фрагменту.

В используемом здесь смысле термин «моносахарид» имеет свое обычное значение, как простой сахар.

В используемом здесь смысле термин «аминокислота» означает молекулу, содержащую как аминогруппу, так и карбоксильную группу. Варианты аминокислот включают в себя α-аминокислоты, т.е. карбоновые кислоты общей формулы НООС-СН(NΗ₂) - (боковая цепь).

Боковые цепи аминокислот включают в себя фрагменты природного происхождения и неприродного происхождения. Боковые аминокислотные цепи неприродного происхождения (т.е. несвойственные) являются фрагментами, которые используются вместо боковых цепей аминокислот природного происхождения, например, в аналогах аминокислот. См., например, публикацию Ьейпшдег, ВюсйешЩту, 8есои! Εάίίίοη, \Уог111 РиЫЦйега, 1пс, 1975, радек 73-75, включенную здесь в виде ссылки.

Предпочтительные α-аминоксилоты включают в себя глицин, аланин, пролин, глутаминовую ки

- 13 006648 слоту и лизин, имеющие Ό конфигурацию, Ь-конфигурацию или представленные в виде рацемата. Боковые цепи следующих типичных α-аминоксилот показаны ниже в табл. 1.

Таблица 1

Н5-СН,НО₂С-СН(ЪШ₂)-СН₂-5-3-СН₂СН_Э-СН₂сн_гз-сн_гсн_г

СН,-СН_:-8-СН_гСН_г

НО-СН₂-СН₂СНз-СЩОНТ

НО₂С-СН₂-МНС(-О)-СН_г-

но₂ссн₂-сн,ЫН₂С(=О)-СН_ГСН_Г (СНэЬ-СН(СН₂)з-СН-СН₂сн₃-сн₂-сн₂Н₂М-СН_г-СН₂-СН₂Η_!Ν-Ο(=ΝΗ)·ΝΗ-ΟΗ_!-0Η₂-€Η₁Н₂И-С(=О}-НН-СН₂-СН₂-СН_!СНз-СН,-СН(СН₂)сн,-сн₂-сн₂-сн₂н,м-сн₂-сн_:-сн₂-сн₂В некоторых предпочтительных вариантах замещающие группы для соединений формулы II включают в себя остаток аминокислоты после удаления из нее гидроксильного фрагмента карбоксильной группы, т.е. группы формулы -С(=О)-СНЩН₂) - (боковая цепь).

Функциональные группы, присутствующие в соединениях формулы II, могут содержать защитные группы. Например, боковые цепи аминокислотных заместителей соединений формулы II могут быть замещены такими защитными группами, как бензилоксикарбонильная или трет-бутоксикарбонильная группы. Защитные группы по сути известны как функциональные химические группы, которые можно избирательно присоединять и отсоединять от функциональных групп, таких как гидроксильные группы и карбоксильные группы. Эти группы вводятся в химическое соединение, чтобы сделать такие функциональные группы инертными к условиям химических реакций, которым подвергается соединение. Одной из таких защитных групп является бензилоксикарбонильная (СЬх; Ζ) группа. Другие предпочтительные защитные группы согласно изобретению могут быть найдены в Сгсспс, Т.У. апб ХУиВ Р.С.М., Рго1ссНус Сгоирз ίη Огдашс 8упШез1з 2б. Еб., У11еу&8опз, 1991.

Соединения инденопирролокарбазолов с мостиковой связью обладают очевидными важными функциональными фармакологическими активностями, которые находят применение в различных сферах, включая как исследовательскую, так и терапевтическую область. Эти производные пригодны в качестве терапевтических средств. Активности соединений проявляют положительные воздействия на функционирование и/или выживаемость клеток, отвечающих на трофические факторы. Влияние на функционирование и/или выживаемость клеток, отвечающих на трофические факторы, например, клеток нейронной линии, показано с помощью каждого из следующих исследований: (1) анализа холинацетилтрансферазы (ХАТ) в культивируемых нейронах спинного мозга; или (2) анализа ХАТ активности культивируемых базальных нейронов переднего мозга.

В используемом здесь смысле термин «влияние», применяемый для случая модификации процессов, обозначаемых терминами «функционирование» и «выживаемость», означает позитивное или негативное изменение или перемену. Влияние, которое является позитивным, может называться «повышением» или «усилением», и влияние, которое является негативным, может называться «ингибированием» или «подавлением».

В используемом здесь смысле термины «повышать» или «повышение», применяемые для случая модификации процессов, обозначаемых терминами «функционирование» и «выживаемость», означают,

- 14 006648 что присутствие соединения инденопирролокарбазола с мостиковой связью оказывает позитивное воздействие на функционирование и/или выживаемость клетки, отвечающей на трофические факторы, по сравнению с клеткой в отсутствие соединения. Например, но не с целью ограничения, что касается выживаемости, например, холинэргического нейрона, то соединение будет способствовать повышению выживаемости популяции холинэргических нейронов при риске гибели (вследствие, например, травмы, болезненного состояния, дегенеративного состояния или естественного прогрессирования) по сравнению с популяцией холинэргических нейронов, не экспонированных с таким соединением, если обработанная популяция будет иметь сравнительно больший период функциональной активности, чем необработанная популяция.

В используемом здесь смысле «ингибировать» и «ингибирование» означает, что конкретный ответ намеченного для исследования материала (например, энзиматическая активность) сравнительно снижен в присутствии инденопирролокарбазолового соединения с мостиковой связью.

В используемом здесь смысле термин 1гк относится к семейству нейротрофических рецепторов с высоким сродством, в настоящее время включающему в себя 1гкА. 1гкВ и 1гкС и другие ассоциированные с мембраной белки, с которыми может связываться нейротрофин.

В используемом здесь смысле ингибирование УЕСРВ предполагает применение, например, при заболеваниях, в которых важную роль играет ангиогенез, таких как твердые раковые опухоли, эндометриоз, диабетическая ретинопатия, псориаз, гемангиобластома, а также другие глазные болезни и раковые заболевания.

Ингибирование 1гк предполагает, например, применение при заболеваниях простаты, таких как рак простаты и доброкачественная гиперплазия простаты, и для лечения боли при воспалении.

Ингибирование рецептора фактора роста, полученного из тромбоцитов (ΡΌΟΡΒ), предполагает применение, например, при различных формах неоплазии, ревматоидном артрите, фиброзе легких, миелофиброзе, аномальном заживлении ран, заболеваний, заканчивающихся сердечно-сосудистыми явлениями, таких как атеросклероз, рестеноз, рестеноз после пластической операции на сосудах и т.д.

В используемом здесь смысле термины «рак» и «канцерогенный» относится к любой злокачественной пролиферации клеток млекопитающих. Примеры включают в себя рак простаты, доброкачественную гиперплазию простаты, рак яичника, молочной железы, мозга, легкого, поджелудочной железы, толстой и прямой кишки, желудка, брюшной полости, твердые опухоли, рак головы и шеи, нейробластому, почечно-клеточный рак, лимфому, лейкоз, другие распознаваемые злокачественные процессы в гематопоэтических системах и другие распознаваемые раковые заболевания.

В используемом здесь смысле термины «нейрон», «клетка нейронной линии» и «нейронная клетка» включают в себя, не ограничиваясь этим, гетерогенную популяцию типов нейронов, имеющую единственный или множество медиаторов и/или единственную или множество функций; предпочтительно это холинэргические и чувствительные нейроны. В используемом здесь смысле фраза «холинэргический нейрон» означает нейроны центральной нервной системы (ЦНС) и периферической нервной системы (ПНС), нейромедиатором которых является ацетилхолин; типичными являются базальные нейроны переднего мозга, нейроны полосатого тела и спинного мозга. В используемом здесь смысле фраза «чувствительный нейрон» включает в себя нейроны, реагирующие на сигналы окружающей среды (например, температуру, движение), поступающие, например, от кожи, мышцы и суставов; типичным является нейрон ганглия дорсального корешка.

«Клетка, отвечающая на трофические факторы», определяется здесь как клетка, которая содержит рецептор, с которым может специфично связываться трофический фактор; примеры включают в себя нейроны (например, холинэргические и чувствительные нейроны) и не нейронные клетки (например, моноциты и неопластические клетки).

Описанные здесь соединения инденопирролокарбазолов с мостиковой связью находят применение как в исследовательской области, так и в области терапии, например, для ингибирования активности ферментов. Например, в области научных исследований соединения могут применяться для разработки методов анализа и моделей для дальнейшего углубления представления о тех ролях, которые играет ингибирование серин/треониновой или тирозиновой протеинкиназы (например, РКС, 1гк тирозинкиназы) в механистических аспектах ассоциированных расстройств и заболеваний. В области терапии соединения, которые ингибируют эти энзиматические активности, могут применяться для того, чтобы ингибировать опасные последствия действия этих ферментов, касающиеся таких заболеваний как рак.

В качестве примеров ниже показано, что ингибирование энзиматической активности с использованием соединений инденопирролокарбазолов с мостиковой связью можно определять, например, с помощью следующих анализов:

1. Анализ ингибирования активности тирозинкиназы 1гкА;

2. Ингибирование ΝΟΡ-стимулированного фосфорилирования 1гк в препарате целых клеток;

3. Анализ ингибирования киназы рецептора фактора эндотелиального роста сосудов (УЕСРВ);

4. Анализ ингибирования активности РКС;

5. Анализ ингибирования ΡΌΟΡΚ..

Заявленные соединения инденопирролокарбазолов с мостиковой связью могут быть использованы

- 15 006648 для усиления функционирования и/или выживаемости клеток нейронной линии млекопитающих, например, человека. В этом контексте соединения могут быть использованы отдельно или с другими конденсированными пирролокарбазолами и/или индолокарбазолами или в комбинации с другими молекулами целебного действия, которые также проявляют способность влиять на функционирование и/или выживаемость указанной клетки.

Многие неврологические расстройства характеризуются наличием нейронных клеток, которые представляют собой умирающие, поврежденные клетки, клетки с функциональными нарушениями, претерпевающие дегенерацию аксонов, с риском гибели и т. д. Эти расстройства включают в себя, не ограничиваясь этим болезнь Альцгеймера; нарушения мотонейронов (например, боковой амиотрофический склероз); болезнь Паркинсона, цереброваскулярные нарушения (например, инсульт, ишемия); болезнь Гентингтона; деменцию при СПИДе; эпилепсию; множественный склероз; периферические невропатии (например, затрагивающие ИКС нейроны при периферической невропатии, ассоциированной с химиотерапией), включая диабетическую невропатию; расстройства, индуцированные стимулирующими аминокислотами; и расстройства, ассоциированные с повреждениями при сотрясении или проникающими ранениями головного или спинного мозга.

ХАТ катализирует синтез нейромедиатора ацетилхолина, и он считается энзиматическим маркером функционального холинэргического нейрона. Функциональный нейрон также способен к выживанию. Выживание нейронов анализируется путем количественной оценки специфичного поглощения и ферментативного превращения красителя (например, кальцеина АМ) живыми нейронами.

Описанные здесь соединения, включая соединения, идентифицированные описанными здесь способами, благодаря своим разнообразным применениям находят использование в различных сферах. Соединения могут быть использованы для разработки ίη νίίτο моделей выживаемости, функционирования, идентификации нейронных клеток или для скрининга других синтетических соединений, которые обладают активностями, сходными с активностями описанных здесь соединений, или соединений, идентифицируемых описанными здесь способами. Описанные здесь соединения, а также соединения, идентифицированные с помощью описанных здесь способов, могут быть использованы в области научных исследований, чтобы изучить, охарактеризовать и определить молекулярные мишени, связанные с функциональными ответами. Например, путем радиоактивного мечения соединения инденопирролокарбазола с мостиковой связью или соединения, идентифицированного описанными здесь способами, связанного со специфичной клеточной функцией (например, митогенезом), может быть идентифицирована, выделена и очищена для характеристики мишень организма, с которой связывается производное.

Соединения, которые здесь описаны, а также соединения, идентифицированные с применением описанных здесь способов, между прочим, пригодны не только для усиления индуцированных трофическими факторами активностей клеток, отвечающих на трофические факторы, например, холинэргических нейронов, но также могут функционировать в качестве средств, повышающих выживаемость нейронных клеток других типов, например, допаминэргических или глутаматэргических. Фактор роста может регулировать выживаемость нейронов посредством каскадов передачи сигнала вниз по течению от малых ГТФ-связывающих белков, которые включают в себя, не ограничиваясь этим, так, гас и с4с42 (ИепЕагФ, ВюсНеш. Г, 1996, 318, 729). В частности, активация гак приводит к фосфорилированию и активации активируемой внеклеточным рецептором киназы (ЕКК), которая связана с процессами биологического роста и дифференцировки. Стимулирование тас/сбс42 приводит к увеличению активности ίΝΙ< и р38, ответы которых связаны со стрессом, апоптозом и воспалением. Хотя ответы на фактор роста в основном осуществляются посредством ЕКК пути, воздействие на эти последние процессы может приводить к альтернативным механизмам выживаемости нейронов, которые могут имитировать свойства фактора роста в повышении выживаемости (Хта е1 а1., 8степсе, 1995, 270, 1326). Соединения также могут функционировать как средства, повышающие выживаемость нейронных и не нейронных клеток посредством механизмов близких, но в то же время отличных от опосредованной фактором роста выживаемости, например, путем ингибирования путей ίΝΙ< и р38, которое может приводить к выживаемости за счет ингибирования процессов апоптотической гибели клеток.

Данные соединения пригодны для лечения расстройств, связанных с пониженной активностью ХАТ или гибелью, повреждением мотонейронов спинного мозга, а также применимы, например, при заболеваниях, связанных с апоптотической гибелью клеток центральной и периферической нервной системы, иммунной системы и при воспалительных заболеваниях.

Описанные здесь соединения также могут находить применение при лечении патологических состояний, в которые вовлечена злокачественная пролиферация клеток, таких как многие виды рака.

Фармацевтически приемлемые соли описанных здесь соединений, а также соединений, идентифицированных представленными способами, включают в себя фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот, соли металлов, соли аммония, соли присоединения органических аминов и соли присоединения аминокислот. Примерами солей присоединения кислот являются соли присоединения неорганических кислот, такие как гидрохлорид, сульфат и фосфат, и соли присоединения органических кислот, такие как ацетат, малеат, фумарат, тартрат, цитрат и лактат; примерами солей металлов являются соли щелочных металлов, такие как литиевая соль, натриевая соль и калиевая соль, соли щелочно-земельных

- 16 006648 металлов, такие как соль магния и соль кальция, соль алюминия и соль цинка; примерами солей аммония являются соль аммония и соль тетраметиламмония; примерами солей присоединения органических аминов являются соли с морфолином и пиперидином; и примерами солей присоединения аминокислот являются соли с глицином, фенилаланином, глутаминовой кислотой и лизином.

Предоставленные здесь соединения, включая соединения, идентифицируемые данными способами, могут быть включены в состав фармацевтических композиций путем смешивания с фармацевтически приемлемыми нетоксичными наполнителями и носителями. Такие композиции могут быть приготовлены для применения при парентеральном введении, в частности в виде жидких растворов или суспензий; или для перорального введения, в частности в форме таблеток или капсул; или интраназально, в частности в виде порошков, носовых капель или аэрозолей; или дермально, например, посредством трансдермальных пластырей.

Композицию можно удобно вводить в форме стандартных доз и можно приготовить любыми способами, хорошо известными в области фармации, например, как описано в Яешшдои'к Рйагшасеибса1 Заепсез (Маск РиЬ. Со., Еайои, РА, 1980). Композиции для парентерального введения могут содержать в качестве обычных наполнителей стерильную воду или раствор соли, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль, масла и имеющие растительное происхождение гидрогенизированные нафталины и им подобные. В частности, биосовместимый, биодеградируемый полимер лактида, сополимер лактида/гликолида или сополимеры полиоксиэтилена-полиоксипропилена могут быть пригодными наполнителями для того, чтобы контролировать высвобождение активных соединений. Другие потенциально пригодные системы парентеральной доставки этих активных соединений включают в себя частицы сополимера этилена-винилацетата, осмотические насосы, имплантируемые инфузионные системы и липосомы. Композиции для введения путем ингаляции в качестве наполнителей содержат, например, лактозу или могут представлять собой водные растворы, содержащие, например, эфир полиоксиэтилен-9лаурила, гликохолат и дезоксихолат или масляные растворы для введения в виде носовых капель, или в виде геля, применяемого интраназально. Композиции для парентерального введения также могут включать в себя гликохолат для буккального введения, салицилат для ректального введения или лимонную кислоту для вагинального введения. Композиции для трансдермальных пластырей предпочтительно представляют собой липофильные эмульсии.

Соединения данного изобретения могут применяться как единственное активное средство в фармацевтической композиции. В альтернативном случае они могут использоваться в комбинации с другими активными ингредиентами, например, другими факторами роста, которые способствуют выживаемости нейронов или регенерации аксонов при заболеваниях или расстройствах.

Соединения данного изобретения или фармацевтически приемлемые соли этих соединений могут вводиться перорально или не перорально, например, в виде мази или инъекции. Концентрации соединений данного изобретения в терапевтической композиции могут варьировать. Концентрация будет зависеть от таких факторов как суммарная доза вводимого лекарственного средства, химические характеристики (например, гидрофобность) применяемых соединений, путь введения, возраст, вес тела и симптомы у пациента и т.д. Обычно соединения данного изобретения предоставляются в виде водного раствора в физиологическом буфере, содержащего примерно от 0,1 до 10% соединения, вес/объем, для парентерального введения. Обычными являются пределы доз примерно от 1 мкг/кг до 1г/кг веса тела в сутки; предпочтителен предел доз примерно от 0,01 до 100 мг/кг веса тела в сутки и предпочтительно примерно от 0,1 до 20 мг/кг от одного до четырех раз в сутки. Предпочтительная доза вводимого лекарственного средства, вероятно, зависит от различных факторов, таких как тип и степень прогрессии болезни или расстройства, общий статус здоровья конкретного пациента, относительная биологическая эффективность выбранного соединения и введение в композицию наполнителя соединения, и путь его введения.

Соединения согласно изобретению, включая тестируемое соединение и соединения, идентифицируемые способами данного изобретения, и фармацевтически приемлемые соли этих соединений могут вводиться отдельно или в виде различных фармацевтических композиций, в соответствии с фармакологической активностью и целями введения. Согласно данному изобретению фармацевтические композиции могут быть получены путем смешивания до однородности эффективного количества соединения или фармацевтически приемлемой соли этого соединения в качестве активного ингредиента с фармацевтически приемлемым носителем. Носитель может иметь широкий диапазон форм в соответствии с формами композиции, пригодной для введения. Желательно, чтобы такая фармацевтическая композиция готовилась в виде стандартных лекарственных доз, пригодных для перорального и не перорального введения. Формы для не перорального введения включают в себя мазь и инъекционный препарат.

Таблетки могут быть приготовлены обычным способом с использованием таких наполнителей как лактоза, глюкоза, сахароза, маннит и метилцеллюлоза, дезинтегрирующих средств, таких как крахмал, альгинат натрия, кальций-карбоксиметилцеллюлоза и кристаллическая целлюлоза, смазывающих средств, таких как стеарат магния и тальк, связывающих веществ, таких как желатин, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, гидроксипропилцеллюлоза и метилцеллюлоза, поверхностно-активных веществ, таких как сложный эфир жирной кислоты и сахарозы и сложный эфир жирной кислоты и сорбита и подобных веществ. Предпочтительно, чтобы каждая таблетка содержала 15-300 мг активного ин

- 17 006648 гредиента.

Гранулы можно приготовить традиционным способом, используя наполнители, такие как лактоза и сахароза, дезинтегрирующие средства, такие как крахмал, связывающие вещества, такие как желатин и им подобные. Порошки можно приготовить традиционным способом, используя наполнители, такие как лактоза и маннит и им подобные. Капсулы можно приготовить традиционным способом, используя желатин, воду, сахарозу, аравийскую камедь, сорбит, глицерин, кристаллическую целлюлозу, стеарат магния, тальк и им подобные. Предпочтительно, чтобы каждая капсула содержала 15-300 мг активного ингредиента.

Препараты в виде сиропов можно приготовить обычным способом, используя сахара, такие как сахароза, воду, этанол и им подобные.

Мазь можно приготовить обычным способом, используя мазевую основу, такую как вазелин, жидкий парафин, ланолин и макроголь, эмульгаторы, такие как лауриллактат натрия, хлорид бензалкония, сложный моноэфир сорбитана и жирной кислоты, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы и аравийская камедь, и им подобные.

Инъекционные препараты можно приготовить традиционным способом, используя растворители, такие как вода, физиологический раствор соли, растительные масла (например, оливковое масло и арахисовое масло), этилолеат и пропиленгликоль, солюбилизирующие средства, такие как бензоат натрия, салицилат натрия и уретан, средства, обеспечивающие изотоничность, такие как хлорид натрия и глюкоза, консерванты, такие как фенол, крезол, сложный эфир парагидроксибензойной кислоты и хлоробутанол, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота и пиросульфат натрия, и им подобные.

Далее изобретение иллюстрируется путем следующих примеров, которые предназначены для разъяснения изобретения. Эти примеры не предназначены и не рассматриваются как примеры, лимитирующие рамки заявки.

Примеры

Пример 1. Общее описание процессов синтеза и примеры.

Общий путь синтеза, применяемый для получения инденопирролокарбазолов с мостиковой связью данного изобретения, имеющих формулу II, показан на фиг. 1 и 2. Общие процедуры синтеза инденопирролокарбазолов (ΙΙΙ)/(νΐΙΙ) могут быть выполнены, как описано в патенте США № 5705511, публикация которого включена таким образом в виде ссылки в полном объеме. В том случае, когда К¹ является Н, азот лактама инденопирролокарбазолов (ΙΙΙ)/(νΙΙΙ) защищают подходящей защитной группой, что приводит к (ΙνχΚ). Защищенные соединения обрабатывают соответствующим основанием в безводном органическом растворителе(лях), в результате чего образуется темно-красный раствор, который, повидимому, является карбанионом. Результатом реакции карбаниона с бифункциональным реагентом (ν) является электрофильное присоединение к С=У связи соединения (V), приводящее к первичному промежуточному соединению (У!)/^). Обработка промежуточного соединения(ий) (У!)^) и/или (УЩАЖ!) либо сульфокислотой, либо кислотой Льюиса, например, эфиратом трехфтористого бора, дает инденопирролокарбазолы с мостиковой связью (Ι)/(ΙΙ).

Стратегия защиты азота лактама (показанная на фиг. 3 и 4) может быть осуществлена с помощью процесса, катализируемого либо кислотой, либо основанием. Реакцию, катализируемую кислотой, можно проводить с реагентом, связанным со смолой, позволяющим иммобилизовать инденопирролокарбазол (Ш)/(УШ) на полимерном носителе, таком как основанная на полистироле кислая смола Ринка ^ΙΙ) (фиг.

3), получая при этом ^ΠΙ). В альтернативном случае катализируемая кислотой реакция может быть проведена с растворимым реагентом, чтобы получить соединение ^Ιν) (фиг. 4). В условиях основного катализа получают защищенное силилом соединение (XV) (фиг. 4).

На фиг. 5 описано несколько способов получения промежуточного соединения (ν). Процедура (а) описывает превращения различных ацеталей (ΚνΙ) в (ЯМП, Ζ = связь). Например, сложный эфирацеталь/кеталь (XVI Э=СООЯ) полностью восстанавливают до соответствующего спирта и затем окисляют (например, окисление по Сверну или Десс-Мартину) до альдегидацеталя/кеталя ^ΜΙ, К⁸=Н). В альтернативном случае сложный эфир-ацеталь/кеталь (XVI, Э=СООЯ) частично восстанавливают с помощью ЭШАЬ , чтобы непосредственно получить альдегид ^ΜΙ, К⁸=Н). Сходным образом восстановление нитрилацеталя (XVI Ό=ί.’Ν) с помощью ΌΙΒΑΓ дает альдегид ^УП, К⁸=Н). Кетоацетали/кеталь получают добавлением реактивов Гриньяра к амиду Вейнреба-ацеталю/кеталю (XVI Э=СО^ОМе)Ме).

Промежуточное соединение ^ΜΙ, Ζ=связь) также может быть получено с помощью двухстадийной процедуры, краткое содержание которой дано в описании процедуры (Ь). Добавление металлоорганического реагента ^£^) к ацеталю/кеталю ^ΜΉ) дает алкен (XX), который при озонолизе с последующей восстанавливающей обработкой дает кетоацеталь/кеталь ^ΜΙ). Получение промежуточного соединения ^ΜΙ, Ζ = гетероатом) с помощью двухстадийной обработки кратко описано в процедуре (с). Сочетание ацеталя (XXII) с алкеном (XX!) с последующим озонолизом (с восстанавливающей обработкой) полученного в результате алкена дает кетоацеталь/кеталь (XVII). В альтернативном случае промежуточное соединение ^УИ, Ζ=гетероатом) получают с помощью двухстадийной процедуры, кратко описанной в процедуре (й). Реакция соединения (XXIV) с ацеталем/кеталем ^УШ) дает (XXV), который превращают в кетоацеталь/кеталь ^ΜΙ) с помощью методов, описанных в процедуре (а). Конденсация

- 18 006648 кетоацетала/кеталя (XVII) с гидроксиламинами, гидразинами, №алкил-№алкоксиаминами и аминами дает промежуточное соединение (XXVI), обладающее электрофильной ί.'=Ν функциональностью.

Связанный со смолой инденопирролокарбазол (XIII) (фиг. 6, способ А) обрабатывают избытком реактива Гриньяра в качестве основания, результатом чего является образование темно-красного раствора карбаниона. Последующая реакция с (V) приводит к продуктам, полученным благодаря электрофильному присоединению к С=У группе.Обработка водой и отщепление продукта(тов) от смолы разбавленной кислотой (1% ТФУ в метиленхлориде) в результате приводит к выделению соединения(ий) (XXVII) и/или (XXVIII). Обработка промежуточного соединения(ий) (XXVII) и/или (XXVIII) либо сульфокислотой, либо кислотой Льюиса, например, эфиратом трехфтористого бора, дает инденопирролокарбазолы с мостиковой связью (II).

Сходная стратегия применяется для реакции растворимого промежуточного соединения с защищенным лактамом, например, (XV) (фиг. 7, способ В). Однако в этом случае промежуточное соединение (XV) обрабатывают тритоном В в пиридине в качестве основания, вместо реактива Гриньяра. Промежуточное соединение(ия) (XXIX) и/или (XXX) может быть выделено интактным с защитной группой лактама, которая поддается хроматографической очистке. Так же, как в способе А (фиг. 6), обработка кислотой Льюиса (такой как эфират трехфтористого бора) дает инденопирролокарбазолы с мостиковой связью (II), где К¹ = Н.

Введение групп К³, К⁴, К⁵ и К⁶ может быть выполнено, как описано в патентах США №№ 5705511 и 4923986, публикации которых включены в виде ссылки в полном объеме. Заместитель К³ иначе может быть введен после конструирования инденопирролокарбазолов с мостиковой связью, как показано на фиг. 8. Положение 3 В кольца бромируют ΝΒ8, получая соединение (XXXI). Затем вводят углеродный фрагмент, используя катализируемые палладием реакции Стилла, Сузуки, Хека, Кумады или КастроСтефенса, чтобы получить соединения типа (XXXII), (XXXIII) и т.д. Кроме того, соединение (XXXI) может предоставить доступ к соединениям, в которых группа брома замещена гетероатомом, например, основанной на амине группой с применением химии катализируемого палладием аминирования Бухвальда.

С помощью окислительного процесса связанная с кислородом группа может быть введена при углероде индена в Е кольце, как показано на фиг. 9, в соединении (XXXIV). Этот химический процесс также приводит в результате к окислению метиленовой группы лактама (А кольцо) давая, как показано, имидное производное.

Пример 2. Получение промежуточных соединений, связанных со смолой Ринка (XIII-Α), ^Π-Β) и (ЯШ-С), (фиг. 3).

Пример 2-А.

В три узкогорлых круглодонных сосуда, оснащенных верхней механической мешалкой и ловушкой Дина Старка последовательно загружали кислую смолу Ринка XII (10,00 г, 0,64 ммоль/г), 1-метил-2пирролидинон (80 мл), бензол (350 мл), УШ-А (А¹, А² = Н2, В¹, В² = О, К³ = К⁴ = К⁵ = К⁶ = Н)) (3,00 г) и паратолуолсульфокислоту (1,00 г). Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 20 ч и затем фильтровали. Полимер промывали ТГФ (5 х 175 мл) и фильтрат отставляли. Затем полимер последовательно промывали ДМСО (4 х 100 мл), 2% водным №НСО3 (4 х 100 мл), водой (4 х 100 мл), ДМСО (2 х 200 мл), ТГФ (4 х 100 мл) и этилацетатом (4 х 100 мл). Смолу сушили в вакууме (24 ч), получая 11,70 (0,47 ммоль/г) связанного со смолой VIII-А (XIII-А).

Первичные ТГФ промывки выпаривали, остаток разбавляли водой (750 мл) и полученный в результате осадок отфильтровывали и последовательно промывали водой, 2% водным NаНСО₃ (4 х 100 мл) и водой (4 х 100 мл). После сушки в вакууме получали УШ-А (1,28 г).

Пример 2-В.

Сходным образом Υ[Π-Β (А¹, А² = О, В¹, В² = Н₂, К³ = К⁴ = К⁵ = К⁶ = Н) (0,5 г) связывали с кислой смолой Ринка XII (1,52 г), получая 1,58 г связанного со смолой VIII-Β (XIII-Β).

Пример 2-С.

Сходным образом ¥Ш-С (А¹, А² = Н₂, В¹, В² = О, К³ = К⁴ = К⁵ = Н, К⁶ = 10-ОМе) (1,02 г) связывали с кислой смолой Ринка XII (3,12 г), получая 3,70 (0,46 ммоль/г) связанного со смолой соединения УШ-С (XIII-С), вместе с исходным соединением VIII-С (0,44 г).

Пример 3. Получение соединения (П-1), соединения (П-2), соединения (П-3), соединения (П-4а), соединения (П-4Ь), соединения (П-6) и соединения (П-8) (способ А, фиг. 6).

Пример 3-А.

К суспензии (XΠI-А) (1,25 г) в ТГФ (24 мл) добавляли 1,0 М раствор Е1МдВг (6,25 мл в ТГФ) и реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч перед добавлением НМРА (5,0 мл). После 10-минутного перемешивания добавляли диэтоксибутиральдегид (3,0 г) (который был получен в соответствии с описанной в литературе процедурой - Рациейе, с1 а1., 1. Ат. СНет. 8ос, 1997, 119, 9662-71) и реакционную смесь перемешивали в течение 20 ч. Реакцию гасили 10% водным ΝΗ₄Ο (5 мл) и фильтровали. Смолу последовательно промывали 10% водным ΝΗ-,Ο (3 х 10 мл), водой (3 х 10 мл), ТГФ (3 х 10 мл), ДМФ (3 х 10 мл), водой (3 х 10 мл) , ТГФ (3 х 10 мл) и эфиром (3 х 10 мл). Смолу сушили в вакууме, переносили в

- 19 006648 хлористый метилен (15 мл) и обрабатывали трифторуксусной кислотой (0,15 мл). После перемешивания в течение 1 ч реакционную смесь фильтровали и фильтрат выпаривали. Полученный в результате остаток переносили в хлористый метилен (20 мл) и обрабатывали тозилатом пиридиния (50 мг) и полученный в результате раствор перемешивали в течение 4 ч. В это время реакцию промывали насыщенным водным ЫаНСО₃ и раствором соли и сушили над Мд§О₄.

После фильтрования и выпаривания растворителя остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (2отЬах ВХ-8. 4 х 25 см, элюировали 60% МеСЫ/водой те/0,1% трифторуксусной кислотой). Соответствующие фракции нейтрализовали ЫаНСО₃ и экстрагировали хлористым метиленом (3 х 50 мл) и сушили над Мд§О₄. После фильтрования и выпаривания растворителя было получено 70,2 мг соединения ΙΙ-1 в виде белого порошка, которое имело следующие характеристики:

¹³С ЯМР (ДМСО-б₆) δ 171,8; 143,3; 142,4; 141,4; 140,1; 140,0; 136,6, 129,2; 127,9; 127,4; 127,1; 126,8; 124,1 (2С), 122,7; 121,6; 121,5; 118,3; 112,1; 88,1; 79,2; 56,6; 45,6; 33,4; 24,8;

Ή ЯМР (ДМСО-άβ) δ 9,21 (д, 1=7,5, 1Н), 8,62 (с, 1Н), 7,98 (д, 1=7,7, 1Н), 7,86 (д, 1=8,3, 1Н), 7,71 (д, 1=7,3, 1Н), 7,49 (дд, 1=7,9, 7,4, 1Н), 7,41 (дд, 1=7,5, 7,4, 1Н), 7,36-7,27 (м, 2Н), 6,86 (д, 1=6,0, 1Н), 5,63-5,58 (м, 1Н), 4,91 (с, 2Н), 4,53 (д, 1=3,3, 1Н), 2,23-2,14 (м, 1Н), 1,96-1,92 (м, 1Н), 0,96-0,88 (м, 1Н), 0,60-0,57 (м, 1Н);

Масс-спектр т/ζ (М+Н) вычислено 379, измерено 379.

С помощью препаративной ВЭЖХ этой смеси продуктов реакции также было выделено соединение ΙΙ-2 (0,5 мг), которое имело следующие характеристики:

Ή ЯМР (ДМСО-б₆) δ 9,17 (д, 1=8,1, 1Н), 8,62 (с, 1Н), 7,98 (д, 1=7,0, 1Н), 7,85 (д, 1=6,8, 1Н), 7,57 (д, 1=6,8, 1Н), 7,49 (дд, 1=7,9, 7,4, 1Н), 7,44-7,26 (м, 3Н), 6,81 (д, 1=6,0, 1Н), 5,43-5,33 (м, 1Н), 4,43 (с, 2Н), 2,23-2,14 (м, 1Н), 1,96-1,92 (м, 1Н), 1,45-1,55 (м, 2Н), 0,96-0,88 (м, 1Н), 0,60-0,57 (м, 1Н), 0,29 (т, 1=7,0, 3Н);

Масс-спектр т/ζ (М+Н) вычислено 407, измерено 407.

Пример 3-В.

Подобным образом, как описано выше для соединения ΙΙ-1, смолу (ΧΙΙΙ-Α) (70,3 мг) обрабатывали 1,1-диэтокси-2-пентаноном (0,75 мл) (который готовили в соответствии с описанной в литературе процедурой δ^οτίη, е! а1., 1. Огд. Сйет., 1988, 53, 4894-6), чтобы получить соединение ΙΙ-3 (3,5 мг), которое было выделено с помощью препаративной ТСХ (силикагель, элюировали 50% ЕЮАс/ толуолом) и имело следующие свойства:

Ή ЯМР (ДМСО-б₆) δ 9,42 (д, 1=8,2, 1Н), 8,58 (с, 1Н), 7,95 (д, 1=7,4, 1Н), 7,79 (д, 1=8,3, 1Н), 7,71 (д, 1=7,1), 7,50-7,20 (м, 4Н), 6,81 (д, 1=5,9, 1Н), 4,90 (с, 2Н), 4,46 (с, 1Н), 2,35-2,20 (м, 1Н), 1,98 (с, 3Н), 1,751,60 (м, 1Н), 1,25-1,00 (м, 1Н), 0,35-0,15 (м, 1Н);

Масс-спектр т/ζ (М+Н) вычислено 393, измерено 393.

Пример 3-С.

Подобным образом, (ΧΙΙΙ-Α) (74,3 мг) обрабатывали 1,1-диэтокси-2-гексаноном (который готовили в соответствии с описанной в литературе процедурой Вгеппег, 1. Огд. Сйет., 1961, 26, 22-7) (0,75 мл), чтобы получить соединение П-4а (2,10 мг) и соединение П-4Ь (1,06 мг), которые были выделено отдельно с помощью препаративной ВЭЖХ (2отЬах КХ-8, 4 х 25 см, элюировали 65% МеСЫ/водой те/0,1% трифторуксусной кислотой). Соединение П-4а имело следующие свойства:

Ή ЯМР (ДМСО-б₆) δ 9,30 (д, 1=8,3, 1Н), 8,55 (с, 1Н), 7,97 (д, 1=7,2, 1Н), 7,65 (д, 1=8,5, 1Н), 7,59 (д, 1=7,5), 7,48 (дд, 1=7,8, 7,2, 1Н), 7,39-7,15 (м, 3Н), 6,31 (дд, 1=5,9, 5,5, 1Н), 5,02 (с, 2Н), 4,88 (с, 2Н), 0,88 (с, 3 Н), другие алифатические сигналы терялись под пиками растворителя;

Масс-спектр т/ζ (М+Н) вычислено 407, измерено 407.

Соединение П-4Ь имело следующие свойства:

Ή ЯМР (ДМСО-άβ) δ 9,43 (д, 1=8,1, 1Н), 8,59 (с, 1Н), 7,99 (д, 1=7,3, 1Н), 7,75-7,65 (м, 2Н), 7,49 (дд, 1=7,0, 6,4, 1Н), 7,43 (дд, 1=8,2, 8,1, 1Н), 7,36-7,25 (м, 2Н), 6,75 (с, 1Н), 4,91 (с, 2Н), 4,50 (с, 1Н), 1,95 (с, 3 Н), другие алифатические сигналы терялись под пиками растворителя;

Масс-спектр т/ζ (М+Н) вычислено 407, измерено 407.

Пример 3-Ό.

Подобным образом (ΧΙΙΙ-С) (1,00 г) обрабатывали диэтоксибутиральдегидом (3,65 г), чтобы получить соединение ΙΙ-6 (87,8 мг), которое было выделено с помощью препаративной ВЭЖХ (2отЬах КХ-8, 2,5 х 25 см, 65% МеСЫ/вода те/0,1% трифторуксусная кислота) и имело следующие свойства:

Ή ЯМР (ДМСО-б₆) δ 9,09 (д, 1=8,6, 1Н), 8,60 (с, 1Н), 7,95 (д, 1=7,4, 1Н), 7,84 (д, 1=8,3, 1Н), 7,47 (дд, 1=7,2, 7,0, 1Н), 7,35 (с, 1Н), 7,29 (дд, 1=7,0, 7,0, 1Н), 6,98 (дд, 1=8,6, 1,9, 1Н), 6,83 (д, 1=6,0, 1Н), 5,65-5,55 (м, 1Н), 4,88 (с, 2Н), 4,48 (д, 1=3,9, 1Н), 3,82 (с, 3Н), 2,25-2,10 (м, 1Н), 2,08-1,85 (м, 1Н), 0,96-0,75 (м, 1Н), 0,65-0,50 (м, 1Н);

Масс-спектр т/ζ (М+Ыа) вычислено 431, измерено 431.

Пример 3-Е.

Подобным образом полимер (ΧΙΙΙ-В) (153,2 мг) обрабатывали диэтоксибутиральдегидом (1,5 мл), чтобы получить соединение ΙΙ-8 (3,6 мг), которое было выделено с помощью препаративной ВЭЖХ (Ζοτ

- 20 006648

Ьах КХ-8, 2,5 х 25 см, б5% МеСЫ/вода те/0,1% трифторуксусная кислота) и имело следующие свойства:

Ή ЯМР (ДМС'О-с1_б) δ 9,09 (д, 1=7,9, 1Н), 8,81 (с, 1Н), 7,81-7,73 (м, 3Н), 7,48-7,35 (м, 3Н), 7,24 (дд, 1=7,б, 7,5, 1Н), б,85 (д, 1=б,2, 1Н), 5,63-5,59 (м, 1Н), 4,8б (с, 2Н), 4,б1 (д, 1=3,б, 1Н), 3,82 (с, 3Н), 2,21-2,13 (м, 1Н), 1,9б-1,90 (м, 1Н), 0,87-0,79 (м, 1Н), 0,б1-0,5б (м, 1Н);

Масс-спектр т/ζ (М+Н) вычислено 379, измерено 379.

Пример 4. Получение соединения 11-7а и соединения 11-7Ь (способ А, фиг. б).

Пример 4-А. Получение (1,1-диэтоксиэтокси)ацетона.

К холодной (0°С) суспензии ЫаН (2,б8 г, б0%) в ТГФ (150 мл) добавляли раствор 1,1диэтоксиэтанола (который был получен в соответствии с описанной в литературе процедурой ΖίιΕΕ, е1 а1., 1. Огд. СНет., 19б1, 2б, 395-407) (9,00 г) в ТГФ (20 мл), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч перед добавлением хлористого метилаллила (8,0 мл). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи, охлаждали и фильтровали через прослойку целита. Растворитель удаляли выпариванием в роторном испарителе, и остаток очищали с помощью хроматографии на колонке (силикагель, 20% эфир/гексан), чтобы получить 1,1-диэтоксиэтилметилаллиловый эфир (11,5 г, 90%). Озонолиз охлажденного (-30°С) раствора этого эфира (б,00 г) в ЕЮАс (80 мл) проводили до тех пор, пока исходный материал уже не регистрировался с помощью ТСХ (1 ч). В это время реакционную смесь продували кислородом, обрабатывали Рб(ОН)₂ (150 мг) и перемешивали в атмосфере водорода в течение ночи. Катализатор отфильтровывали, и фильтрат концентрировали с помощью выпаривания в роторном испарителе. Полученный в результате остаток очищали хроматографией на колонке (силикагель, 20% ЕЮАс/гексан), получая указанное в заголовке соединение (4,53 г, 82%).

Пример 4-В.

Согласно способу А (фиг. б) смолу (ΧΙΙΙ-Α) (230,2 мг) обрабатывали Е1МдВг (1,25 мл), после чего (1,1-диэтоксиэтокси)ацетоном (пример 3-А) (1,2 мл). После обработки и отщепления от смолы часть грубой смеси реакционных продуктов (10,5 мг) переносили в хлористый метилен (20 мл) и обрабатывали эфиратом ВЕ₃ (20 мкл). После перемешивания в течение 2,5 ч раствор промывали насыщенным водным ЫаНСО₃ и раствором соли, затем сушили над Мд§О₄. После фильтрования и удаления растворителя полученный в результате остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (ΖοιΈιχ КХ-8, 4 х 25 см, б5% МеСЫ/вода \\70,1% трифторуксусная кислота), чтобы получить соединение 11-7а (2,34 мг) и соединение 11-7Ь (1,34 мг). Соединение (11-7а) обладало следующими свойствами:

Ή ЯМР (СЭС1₃) δ 9,35-9,20 (м, 1Н), 7,87 (д, 1=7,б, 1Н), 7,б2 (д, 1=7,0, 1Н), 7,б0-7,45 (м, 1Н), 7,49 (дд, 1=7,7, 7,5, 1Н), 7,40 (д, 1=8,1, 1Н), 7,37-7,2б (м, 3Н), б,22 (с, 1Н), 5,20-4,85 (м, 1Н), 4,47 (с, 1Н), 3,б7 (д, 1=12,7, 1Н), 3,52 (д, 1=11,8, 1Н), 3,40 (д, 1=12,7, 1Н), 3,38 (д, 1=11,8, 1Н), 1,91 (с, 3Н);

Масс-спектр т/ζ (М+Н) вычислено 409, измерено 409.

Соединение 11-7Ь обладало следующими свойствами:

'Н ЯМР (СЭС1₃) δ 9,58-9,22 (м, 1Н), 7,82 (д, 1=7,4, 1Н), 7,б0-7,40 (м, 3Н), 7,37-7,27 (м, 3Н), 7,21 (д, 1=8,1, 1Н), 5,81 (с, 1Н), 5,21 (с, 1Н), 5,10-4,80 (м, 1Н), 4,59 (д, 1=13,5, 1Н), 4,38 (дд, 1=13,5, 5,3, 1Н), 4,21 (д, 1=13,1, 1Н), 3,82 (д, 1=13,2, 1Н), 1,13 (с, 3Н);

Масс-спектр т/ζ (М+Н) вычислено 409, измерено 409.

Пример 5: Получение соединения ΙΙ-5 (фиг. 8)

К раствору соединения ΙΙ-1 (8,1 мг) в ТГФ (2 мл) добавляли ΝΒ8 (4,б мг) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Добавляли дополнительное количество ΝΒ8 (4,5 мг) и реакцию перемешивали в течение 2,5 ч. Нерастворимый материал отфильтровывали и фильтрат концентрировали в роторном испарителе. Полученный в результате остаток очищали хроматографией на колонке (С-18, б5% МеСЫ/вода те/0,1% трифторуксусная кислота). Соответствующие фракции нейтрализовали ЫаНСО₃ и экстрагировали хлористым метиленом (3 х 20 мл), и сушили над Мд§О₄. После фильтрования и выпаривания растворителя было получено соединение ΙΙ-5 (5,1 мг) в виде белого порошка, которое имело следующие характеристики:

'Н ЯМР (ДМСО-а_б) δ 9,22 (д, 1=7,4, 1Н), 8,б7 (с, 1Н), 8,14 (с, 1Н), 7,8б (д, 1=8,7, 1Н), 7,72 (д, 1=7,0, 1Н), 7,б3 (д, 1=7,8, 1Н), 7,42 (дд, 1=7,5, 7,3, 1Н), 7,35 (дд, 1=1,3, 7,2, 1Н), б,8б (д, 1=б,0, 1Н), 5,б3-5,58 (м, 1Н), 4,94 (с, 2Н), 4,54 (д, 1=3,1, 1Н), 2,30-2,14 (м, 1Н), 2,00-1,82 (м, 1Н), 0,9б-0,88 (м, 1Н), 0,б2-0,50 (м, 1Н);

Масс-спектр т/ζ (М+Н) вычислено 457/9 (1:1), измерено 457/9 (1:1).

Пример б. Получение промежуточного соединения XV (фиг. 4).

К раствору (ΧΙΙΙ-Α) [А¹, А² = Н2, В¹, В2 = О, К³ = К⁴ = К⁵ = К^б = Н)] (1,05 г) в ДМФ (25 мл) добавляли триэтиламин (0,75 мл) и трет-бутилдиметилсилилхлорид (ТВ8-С1) (0,б5 г). После перемешивания в течение 3 ч реакцию гасили насыщенным водным ЫаНСО₃ и экстрагировали ЕЮАс. Органический слой промывали водой и раствором соли и сушили над Мд§О₄. После фильтрования и выпаривания растворителя полученный в результате остаток растирали в эфире, получая соединение XV (84 8 мг). Промывки выпаривали, чтобы выделить остаток, который очищали хроматографией на колонке (кремнезем, 1% ЕЮАс/СН₂С1₂) и получали дополнительное количество продукта (502 мг, суммарный выход 94%), кото

- 21 006648 рый имел следующие спектральные свойства:

Ή ЯМР (ДМСО-б₆) δ 11,94 (с, 1Н), 9,32 (д, 1=7,6, 1Н), 8,03 (д, 1=7,7, 1Н), 7,64 (д, 1=7,2, 1Н), 7,58 (д, 1=8,1, 1Н), 7,44 (дд, 1=1,1, 7,6, 1Н), 7,39 (дд, 1=1,1, 7,6, 1Н), 7,32 (д, 1=1,3, 1Н), 7,25 (дд, 1=1,6, 7,3, 1Н), 5,00 (с, 2Н), 4,14 (с, 2Н), 0,99 (с, 9Н), 0,46 (с, 6Н);

Масс-спектр т/ζ (М+Н) вычислено 425, измерено 425.

Пример 7. Получение соединения П-1 с помощью способа В (фиг. 7).

Раствор тритона В в пиридине (0,45 М) готовили путем растворения 40% раствора тритона В в метаноле (10 мл) в пиридине (10 мл). Растворитель удаляли при пониженном давлении (20 мм Нд) до конечного объема ~8 мл. Остаток разводили пиридином до 50 мл, фильтровали и хранили в азоте. Раствор XV (20,3 мг) в пиридине (2,0 мл) вносили в струю аргона и обрабатывали 300 мкл тритона В (0,45 М в пиридине) и диэтоксибутиральдегидом (50 мкл). После 2-часового перемешивания реакционную смесь экстрагировали ЕЮАс, промывали 1Ν водным НС1, раствором соли и сушили над Мд8О₄. После фильтрования и выпаривания растворителя аддукт переносили в СН₂С1₂ (10 мл) и обрабатывали эфиратом ВТ₃ (10 мкл). После 2,0-часового перемешивания раствор промывали насыщенным водным NаНСО₃ и раствором соли, затем сушили над Мд8О₄. Удаление растворителя при выпаривании в роторе давало остаток, который очищали препаративной ВЭЖХ (ΖοιΤαχ КХ-8, 2,5 х 25 см, 65% МеС^вода те/0,1% трифторуксусная кислота). Соответствующие фракции нейтрализовали NаНСО₃ и экстрагировали хлористым метиленом (3 х 20 мл) и сушили над Мд8О₄. После фильтрования и выпаривания растворителя получали П-1 (11,8 мг, выход 65%), спектр ¹Н ЯМР и масс-спектр которого и время удержания которого при ВЭЖХ были идентичными материалу, полученному и выделенному способом А, описанным в примере 3-А.

Пример 8. Получение соединения П-9 (фиг. 8).

К суспензии бромосоединения П-5 (6,2 мг) в 1-пропаноле (4,0 мл) добавляли 3-аминофенилборную кислоту (3,8 мг). После перемешивания в течение 0,25 ч последовательно добавляли Рб(ОАс)₂ (2,0 мг), Р11₃Р (4,8 мг), №₂СО₃ (2,8 мг) и воду (2,0 мл). Смесь кипятили с обратным холодильником в течение 0,75 ч, охлаждали, экстрагировали СН2С12 и промывали водой и раствором соли. Органический слой сушили над Мд8О₄ и растворитель удаляли выпариванием в роторном испарителе, получая остаток, который очищали препаративной ВЭЖХ (ΖοιΤαχ КХ-8, 2,5 х 25 см, 50% МеС^/вода \\70,1% трифторуксусная кислота). Соответствующие фракции нейтрализовали NаНСО₃ и экстрагировали хлористым метиленом (3 х 20 мл) и сушили над Мд8О₄. После фильтрования и выпаривания растворителя получали соединение П-9 (3,1 мг, выход 49%), которое обладало следующими спектральными свойствами:

Ή ЯМР (ДМСО-б₆) δ 9,22 (д, 1=7,5, 1Н), 8,66 (с, 1Н), 8,00-7,25 (м, 8Н), 7,12 (дд, 1=7,1, 7,0, 1Н), 6,956,80 (м, 3Н), 6,53 (д, 1=6,0, 1Н), 5,63-5,58 (м, 1Н), 4,99 (с, 2Н), 4,55 (с, 1Н), 2,25-2,10 (м, 1Н), 1,95-1,90 (м, 1Н), 0,98-0,88 (м, 1Н), 0,65-0,57 (м, 1Н);

Масс-спектр т/ζ (М+Н) вычислено 470, измерено 470.

Пример 9. Получение соединения П-10 (фиг. 9).

К раствору соединения П-1 (5,0 мг) в ДМСО (1 мл) добавляли NаСN (4,3 мг) и смесь нагревали до 145°С в течение 1 ч. Смесь охлаждали, экстрагировали ЕЮАс и промывали водой (3 х 20 мл) и раствором соли. Органический слой сушили над Мд8О₄, фильтровали и выпаривали, получая остаток, который очищали препаративной ВЭЖХ (ΖοιΤαχ КХ-8, 2,5 х 25 см, 55% МеС^/вода \\70,1% трифторуксусная кислота). Соответствующие фракции нейтрализовали NаНСО₃ и экстрагировали хлористым метиленом (3 х 20 мл) и сушили над Мд8О₄. После фильтрования и выпаривания растворителя получали соединение II10 (2,7 мг, выход 50%), которое обладало следующими спектральными свойствами:

Ή ЯМР (ДМСО-б₆) δ 11,4 (с, 1Н), 8,86 (д, 1=7,9, 1Н), 8,79 (д, 1=7,6, 1Н), 7,90 (д, 1=8,3, 1Н), 7,62-7,55 (м, 2Н), 7,49 (дд, 1=7,6, 7,4, 3Н), 7,40 (дд, 1=7,4, 7,3, 1Н), 7,35 (дд, 1=7,5, 7,4, 1Н), 6,86 (д, 1=6,0, 1Н), 6,03 (с, 1Н), 5,40-5,30 (м, 1Н), 2,25-2,14 (м, 1Н), 2,03-1,90 (м, 1Н), 1,10-0,98 (м, 1Н), 0,82-0,77 (м, 1Н).

Пример 10. Получение соединения П-11 (способ А, фиг. 6).

Согласно способу А смолу (ХШа) (150,2 мг) подвергали реакции с Е1МдВг (1,00 мл), после чего - с этил 2,5-диоксопентаноатом (ЗсНтЮ, еί а1., 8уп1йе515, 1993, 809) (1,5 мл). После обработки и отщепления от смолы грубую смесь реакционных продуктов переносили в хлористый метилен (20 мл) и обрабатывали эфиратом ВР₃ (20 мкл). После перемешивания в течение 2,5 ч раствор промывали насыщенным водным NаНСО₃ и раствором соли, затем сушили над Мд8О₄. После фильтрования и удаления растворителя полученный в результате остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (ΖοιΠαχ КХ-8, 4 х 25 см, 55-75% градиент МеСНкода те/0,1% трифторуксусная кислота), чтобы получить соединение П-11 (6,4 мг), которое обладало следующими свойствами:

Ή ЯМР (ДМСО-б₆) δ 9,36 (д, 1=7,7, 1Н), 8,68 (с, 1Н), 8,00 (д, 1=7,7, 1Н), 7,83 (д, 1=8,3, 1Н), 7,53-7,15 (м, 5Н), 6,97 (д, 1=5,9, 1Н), 4,93 (с, 2Н), 4,82 (с, 1Н), 4,48 (д, 1=7,1, 2Н), 2,42-1,91 (м, 2Н), 1,37 (т, 3Н, 1=7,1), 1,25-0,63 (м, 2Н).

Пример 11. Получение соединения П-12.

Раствор соединения П-11 (3,4 мг) в ТГФ (2 мл) обрабатывали 2М раствором Ь1ВН₄ (1,0 мл в ТГФ) и реакцию перемешивали в течение 1,5 ч. Реакцию гасили добавлением 1Ν водного НС1 (4 мл). После пе

- 22 006648 ремешивания в течение 20 мин добавляли 10% водный ΝαΟΗ (15 мл) и смесь экстрагировали хлористым метиленом (3 х 10 мл). После высушивания над Мд80₄, смесь фильтровали и растворитель выпаривали, чтобы получить соединение ΙΙ-12 (0,32 мг), которое обладало следующими свойствами:

Ή ЯМР (ДМСО-а₆) δ 9,35 (д, 1=7,7, 1Н), 8,62 (с, 1Н), 7,98 (д, 1=7,7, 1Н), 7,83 (д, 1=8,2, 1Н), 7,75 (д, 1=8,2, 1Н), 7,50-7,25 (м, 4Н), 6,84 (д, 1= 7,7, 1Н), 6,11 (с, 1Н), 4,91 (с, 2Н), 4,71 (с, 1Н), 4,50-4,40 (м, 1Н), 4,30-4,20 (м, 1Н), 2,42-1,91 (м, 2Н), 1,25-0,63 (м, 2Н);

Масс-спектр т/ζ (М+Н) вычислено 409, измерено 409.

Пример 12. Повышение ХАТ-активности спинного мозга.

ХАТ является специфичным биохимическим маркером функциональных холинэргических нейронов. Холинэргические нейроны представляют собой основной холинэргический вход в формацию гиппокампа, обонятельное ядро, ядро, расположенное между ножками мозга, кору головного мозга, миндалевидное тело и части таламуса. Мотонейроны в спинном мозге являются холинэргическими нейронами, которые содержат ХАТ (РЬе1р8, с1 а1., 1. Сотр. №иго1., 1988, 273, 459-472). ХАТ активность была использована для изучения воздействий нейротрофинов (например, ΝΟΡ или ΝΤ-3) на выживаемость и/или функционирование холинэргических нейронов. Анализ ХАТ также служит для индикации регуляции уровней ХАТ в холинэргических нейронах.

Способы.

Клетки спинного мозга зародышей крыс диссоциировали и эксперименты выполняли, как описано (8тйЬ, е1 а1., 1. Се11 Вю1оду, 1985, 101, 1608-1621; ОИскзтап, е1 а1., 1. №игосйет., 1993, 61, 210-221). Диссоциированные клетки получали из спинного мозга вскрытых крыс (на 14-15 эмбриональный день) с помощью стандартной технологии диссоциации трипсином (8ιηί11ι, еί а1., выше). Клетки высевали при плотности 6 х 10⁵ клеток/см² в покрытые поли-Ь-орнитином лунки планшетов для культивирования тканей в бессывороточную среду N2 с добавлением 0,05% бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Во11еп51е1п, еί а1., Ргос. №111. Асай. 8ск И8А, 1979, 76, 514-517). Культуры инкубировали при 37°С во влажной атмосфере, состоящей из 5% СО2/95% воздуха, в течение 48 ч. ХАТ активность измеряли через 2 дня ίη νίίΐΌ, используя модификацию процедуры Роппит (Роппит, №игосйет., 1975, 24, 407-409) в соответствии с МсМапатап еί а1. и СИскктап, еί а1. (МсМапатап, еί а1., ^еνе1οр. Вю1., 1988, 125, 311-320; СНскктап, еί а1., 1. №игосйет., выше).

Соединения, имеющие формулу ΙΙ, описанные в примерах, приведены в списке в табл. 2. К¹, Я⁴, Я⁶ и Я⁷ означают Н; Υ означает О; и п равно 1.

Таблица 2

- 23 006648

Пример 13. ρΟΌΝΑ3-ΕΕ-ΜΕΚ3, рс1№А.3-ЕЕ-\1ЕК3 (К144В).

МЬК3 клонировали, как описано Ьее, е! а1. (Оисодеие, 1993, 8, 3403-3410; Ехое, е! а1., Оисодеие, 1994, 9, 935-938). кДНК получали из 200 нг полиаденилированной мРНК меланоцитов и 5% реакционной смеси использовали в качестве матрицы, чтобы амплифицировать набор кДНК РТК, используя смеси либо двух, либо четырех высоковырожденных олигонуклеотидных праймеров, полученных из консенсусных последовательностей консервативных субдоменов У1Ь и IX известных РТК: РТК1, 5'С6ОАТССАСМО1ОАУУТ-3' (8 ЕС) ГО ^: 1); РТК2, 5'-66ААТТССА№А66АССА8АСКТС-3' (8 ЕС) ГО ^: 2); РТК3, 5'-С6САТССКТ1САУМО1ОАУУ’ПОСЮС1МО1АА-3' (8 ЕС) ГО 3); РТК4, 5'6СААТПАУ16СА^А1С№ССА1АСКТС18^-3' (8 ЕС) ГО ^: 4). Было выполнено сорок циклов ПЦР с использованием ДНК полимеразы Тад (АтрН-Тад; Регкт-Е1тег/Се!и§) и автоматизированного термоциклера ДНК; каждый цикл состоял из 40 с при 94°С, 2 мин при 37°С и 3 мин при 63°С. Объединяли продукты восьми ПЦР, обрабатывали ДНК-полимеразой (Кленова), расщепляли ВатН1 плюс ЕсоК1 и подвергали электрофорезу в 5% полиакриламидном геле. При окрашивании бромидом этидия идентифицировали преобладающую полосу, соответствующую 200-230 п.н., которую вырезали, элюировали и клонировали в М13тр18. В одном эксперименте часть кДНК, амплифицированной с помощью ПЦР, не расщепляли, а вместо этого клонировали тупыми концами в М13тр18, расщепленный 8та1. Нуклеотидные последовательности определяли с помощью метода секвенирования с терминацией цепи.

Одна кДНК, идентифицированная как РТК1, была использована в качестве пробы для скрининга библиотек кДНК меланомы и меланоцитов человека. Клон, обозначенный РТК1-3.2, включал в себя полную открытую рамку считывания длиной 2541 н., кодирующую белок из 847 аминокислот. Эту кДНК разрезали №о1, затупляли концы ДНК-полимеразой (Кленова), снова разрезали ЕсоК1 и лигировали в вектор ρС^NΑ3-ΕΕ, который был разрезан ВатН1, концы которого были затуплены и который затем был разрезан ЕсоК1. Вектор ρС^NΑ3-ΕΕ был сконструирован путем встраивания в Нт1Ш/ВатН1-сайт олигонуклеотида, который кодирует стартовый кодон, после которого следует эпитоп ЕЕ, МЕЕЕЕУМРМЕ (8Еф ГО NО: 5) (Сгиккеитеуег, е! а1., Ргос. №И. Аса!. 8сЕ И8А, 1985, 82, 7952-7954). Неактивная в качестве киназы версия («мертвая» киназа) МЬК3 была получена путем создания мутации К144К с помощью ПЦР, с применением технологии, опубликованной ранее (СНеп, е! а1., Вю1есНшдие5, 1994, 17, 657-659). Первым мутагенным олигонуклеотидом был 5'-СПСССПСПССССССΑССПССССΑС-3' (8Еф ГО NО: 6) и вторым олигонуклеотидом был 5'-СΑСΑСССПССΑПСПСССССПП-3' (8Еф ГО NО: 7). Эти олигонуклеотиды были использованы в ПЦР, где в качестве матрицы использовали МЬК3, чтобы образовать фрагмент длиной 806 п.н., и применяли во второй ПЦР-реакции, используя праймер Т7 в качестве другого амплимера и МЬК3 в качестве матрицы, чтобы образовать фрагмент длиной 1285 п.н. Фрагмент отделяли путем электрофореза в агарозном геле, выделяли, клонировали в рСЕМ-5 (Рготеда) и секвенировали. Фрагмент разрезали ΗίηάΙΙΙ и Нра1, и встраивали в ρС^NΑ3-ΕΕ-Μ^Κ3, разрезанную ΗίηάΙΙΙ и НраЕ Была выявлена дополнительная точечная мутация в нуклеотиде 1342. Чтобы ее исправить, из МЬК3 дикого типа вырезали РЕ1М1 фрагмент (н. 1093-1418) и использовали, чтобы заменить идентичный фрагмент в МЬК3, имеющей мутацию К144Р.

Пример 14. рЕВ-ЕЬАС-МЬК3.

Чтобы получить белок МЬК3, кДНК была клонирована в бакуловирусный экспрессирующий вектор рЕВ-ЕЬАС. МЬК3 была вырезана из РТК1-3.2 путем переваривания №о1, затуплена ДНК полимеразой (Кленова), снова разрезана №11 и лигирована в рЕВ-ЕЬАС, переваренный 8!и1 и №!1. рЕВ-ЕЬАС получен из рЕВ (ЬИе ТесНио1од1е5) и имеет последовательность, кодирующую эпитоп ЕЬАС (Норр, е! а1., Вю1ес11по1оду, 1988, 6, 1205-1210) со стартовым кодом, МПУКОЭПЭК (8Еф ГО NО: 8), добавленным к полилинкеру в ВатН1 сайте.

Пример 15. рЕВ-С8Т-МЬК3(КО).

Бакуловирусная экспрессия киназного домена МЬК3 была достигнута путем вырезания фрагмента МЬК3 из рСЕХКС-МЬК3(КЭ) с использованием ЕсоК4 и ХНо1 и его лигирования в вектор рЕВ, разрезанный ЕсоК1 и ХНо1, в котором выше по течению была клонирована кодирующая последовательность глутатион-8-трансферазы (С8Т). Это было достигнуто благодаря получению последовательности, кодирующей С8Т, и полилинкера из вектора рСЕХКС с помощью ПЦР с использованием вектора в качестве матрицы (Сиап, е! а1., Апа1. ВюсН., 1991, 192, 262-267). 5'-олигонуклеотид для ПЦР создавал сайт рестрикции Вд12 на 5'-конце фрагмента. Этот выделенный фрагмент затем переваривали Вд12 и Н1иО3 и лигировали в рЕВ, переваренный ВатН1 и Н1иО3.

Пример 16. рСЕХКС-МЬК3(КЭ).

Фрагмент ДНК, который включал в себя как киназный домен МЬК3, так и часть лейциновой молнии (н. 736-1791), был получен ПЦР с использованием РТК1 кДНК. Выделенный фрагмент переваривали ферментами рестрикции ЕсоВ1 и ХНо1, сайты для которых были включены в олигонуклеотиды для ПЦР, и клонировали в рСЕХ-КС, переваренном ЕсоК4 и ХНо1. Затем этот фрагмент в рСЕХ-КС был укорочен с помощью ПЦР, чтобы он включал только киназный домен (н. 736-1638).

Пример 17. рКН3-МЬК2, рКН3-МЬК2(КА).

МЬК2 клонировали с использованием вырожденной ПЦР (Эоготе, е! а1., Еиг. I. ВюсНет., 1993, 213, 701-710; Эого\\·, е! а1., Еиг. I. ВюсНет., 1995, 234, 492-500). Сегменты кДНК, кодирующие каталитиче

- 24 006648 ские субдомены протеинкиназ в линии эпителиальных опухолевых клеток ί.'ο1ο 16, амплифицировали на РНК с помощью ПЦР с обратной транскриптазой. Вырожденные праймеры ПЦР были созданы на основании последовательностей, кодирующих консервативные мотивы в субдоменах У1Ь и VIII каталитических киназных доменов семейства рецепторов эпидермального фактора роста. Праймеры имели следующие последовательности: прямой праймер, 5'-СССАТСССТС(А)САСС(А)СТ(сО)С(А)АСС(Т)Т-3' (8ЕЦ ГО 9), обратный праймер, 5'-ССААТТСАССА(С)ТАА(С)СТССАС(С)АСАТС-3' (8 ЕС) ГО 10). Несколько продуктов ПЦР было клонировано в М13 и секвенировано с помощью набора для секвенирования Т7 8ире^-Βаκе ГОгек-иес). Один продукт ПЦР длиной 216 п.н. был использован в качестве пробы для скрининга λβ111 библиотеки кДНК толстого кишечника человека (С№п!есЛ, номер по каталогу НБ10346). Фрагмент метили со случайным праймером, гибридизацию проводили при 65°С и фильтры промывали в условиях жесткости 0,2 X №1С1/цитрат (150 мМ хлорид натрия, 15 мМ цитрат натрия, рН 7,0) и 0,5% 8Ό8 при 65°С. Авторадиографию фильтров проводили в течение 16 ч при -70°С на пленке Кцбак ХАВ-5. Были выделены четыре клона, и самый длинный из них, длиной 1,2 т. п.н., был использован в качестве повторного зонда для той же библиотеки при тех же самых условиях. Были отобраны еще четыре клона, и один из этих клонов представлял собой фрагмент МЬК2 длиной 1034 п.н. Этот клон был использован в качестве пробы для Хд!10-библиотеки мозга человека. Проверено примерно 500000 клонов, и выделен один клон длиной 3454 п.н., представляющий собой полный кодирующий район МЬК2.

МЬК2 была клонирована от АТС до полиА-хвоста в вектор рКН3 между сайтами ΒатΗ1 и ЕотВ1 в два этапа, так как в середине последовательности МЬК2 имеется ΒатΗ1 сайт. Вектор рКН3 был сконструирован путем встраивания трех копий НА эпитопа !ад и следующим далее ΒатΗ1 сайтом между сайтами ХЬа1 и ЕотВ1 полилинкера рВК7. Чтобы получить мутантную версию, К125А, 5' ΒатΗ1 фрагмент МЬК2 был клонирован в векторе Рготеда рА1!ег и подвергнут мутации, как рекомендовано изготовителем. Затем фрагмент был клонирован назад в вектор МЬК2 рКН3.

Пример 18. рсПт3-НА-ЖК1.

1ΝΗ1 кДНК была получена как описано ί.’οκο, е! а1. (Се11, 1995, 81, 1137-1146). кДНК была получена ПЦР с использованием в качестве матрицы кДНК скелетной мышцы человека Цпуйгодеп) и была клонирована в Β§12/8η11 сайты рс^NΑ3-ΗΑ, модифицированной рс^NΑ3 экспрессирующей плазмиды, кодирующей эпитоп НА (Αί1κοπ е! а1., Се11, 1984, 37, 767-778). Затем она была вырезана из рс^NΑ3, включая эпитоп НА, и лигирована в рСЕХ-4Т3 (РЛагташа). ίΝΙ<1 кДНК была вырезана из конструкции рСЕХ-4Т3 в виде Βд12/8а11 фрагмента и лигирована в рс^NΑ3-ΗΑ, вектор с эпитопом НА, добавленным в Η^η^3/ΒатΗ1 сайт рс^NΑ3.

Пример 19. рРЬАС-ОЬК.

ЭЬК была клонирована в экспрессирующий вектор рс^NΑ3 с эпитопом РЬАС, присоединенным как описано ЩИтат е! а1. (1. Βίο1. СЛет., 1994, 269, 30808-30817). Фрагмент кДНК для ЭЬК был выделен с помощью ПЦР клонирования, основанного на использовании вырожденных олигонуклеотидов. Суммарную РНК экстрагировали из почек (32 органа) на 13,5 эмбриональный день и из почек (16 органов) на 17,5 эмбриональный день, используя способ на основе серийно производимого фенол/гуанидинизотиоционатного реагента, в соответствии с инструкциями изготовителя (ТВIζο1 Веадеп!, ЫГе Тескго^д1ек, Ыс.). После переваривания свободной от РНКазы ДНКазой I РНК подвергали обратной транскрипции РНКазой Н - обратной транскриптазой (ЬирегкспрГ ЫГе ТесЬм^хе^ №с.) с синтетического олиго(бТ) олигонуклеотидного праймера до однонитевой кДНК. Вырожденные олигонуклеотидные праймеры, соответствующие каталитическим субдоменам νΦ и IX тирозиновой протеинкиназы, исходно разработанные АПкк (А11кк, Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А., 1989, 86, 1603-1607), были модифицированы для 5'ЕсοВI и НшбШ-сайтов, соответственно (5'-АТААТТС(СТ)СС(ТАСС)СССА(СА)СТС(ТАСС)СССТС-3' (8ЕС) ГО 11), 5'-АТААССТТСС(ТС)(АС)Т(СС)ААСТССА(ТС)(СС) СС(АСС)СС(СТ)СА-3' (8ЕС) ГО

NΟ: 12) . Проводили сорок циклов ПЦР в течение 1,5 мин при 94°С, 2 мин при 37°С и 3 мин при 63°С. Добавляли свежие реактивы и выполняли еще 40 циклов перед последней 10-минутной элонгацией при 72°С. Полученный в результате продукт амплификации ДНК длиной 200-210 п.н. выделяли в геле, субклонировали в готовую плазмиду рСЕМ7/Г(+) (Рготеда) и трансформировали в ЕксЛепсЫа отЕ. Плазмидная ДНК была получена из трансформированных бактерий с использованием набора М1шргер, и часть была переварена эндонуклеазами рестрикции ЕсοВI и НшбШ; клоны, содержащие вставки, были секвенированы.

Фрагмент кДНК ЭБК длиной 195 п.н., полученный с помощью вырожденной ПЦР, радиоактивно метили и использовали для скрининга примерно 1 х 10⁶ рекомбинантов Иш^АР II (8!га!адепе, Ьа ίοΕη, СА), библиотеки кДНК мозга взрослой мыши, полученной с помощью олиго(бТ)-праймеров (Ηο1ζтаη, е! а1., Мο1. Се11 Βίο1., 1990, 10, 5830-5838). Фильтры гибридизовали в буфере, состоящем из 50% формамида, 5 х 88С, 3 х раствора Денхардта, 0,25% 8Ό8, 1 мг/мл полиадениловой кислоты, и 200 мг/мл ДНК спермы лосося, при 42°С. Фильтры промывали один раз при комнатной температуре в 2 х 88С, 0,2% 8Ό8 и дважды - при 65°С в течение 30 мин. Было идентифицировано двадцать пять уникальных клонов; 10 клонов были очищены до гомогенности, проведена эксцизия ш νίνο в соответствии с протоколом изготовителя, и проведено рестрикционное картирование. Два самых длинных клона (3401 и 3397 п.н., соответ

- 25 006648 ственно, отличающиеся только своими 5' концами) были секвенированы вдоль обеих нитей по всей длине.

Фрагмент полноразмерной ΝοΗ-Ν^οΙ ИБК кДНК (3401 п.н.) субклонировали в эукариотический экспрессирующий вектор рсОЫАЗ с промотором цитомегаловируса (1иуйгодеи, Зап И1едо, СА) (конструкция названа рсПЫАЗ-ОЬК). Затем была создана меченая ЫН₄-Ме! РБАС эпитопом (ΌΥΚΌΌΌΌΚ) (8ЕЦ ΙΌ N0: 13) конструкция (рРБАС-ЭБК). Чтобы амплифицировать фрагменты кДНК, которые кодируют 5' НшбШ сайт, консенсусную последовательность Козака в ИБК, включающую кодон инициации АТС, эпитоп РБАС, и последовательность открытой рамки считывания кДНК ИБК, простирающуюся от нуклеотида 88 до внутреннего ЕсоК! сайта у нуклеотида 758, использовали ПЦР. (Очищенные с помощью ВЭЖХ синтетические олигонуклеотиды использовали в эквимолярных количествах: 5'АТАААССТТССАСАССССАТССАСТАСААССАССАССАТСАСААССССТСССТССАТСАААССССААСА-3' (8ЕЦ ΙΌ N0: 14) для смыслового праймера конструкции РБАС и 5'САСАСССССССССССТСТ-3' (8ЕЦ ΙΌ N0: 15) для антисмыслового праймера). Очищенные в геле, переваренные Н1ибШ и ЕсоК! амплифицированные фрагменты были субклонированы в НтбШ-ЕсоК1, чтобы получить плазмиду рсОХА3-ЭБ1<. Конструкции секвенировали вдоль обеих нитей, чтобы убедиться в точности Тас.| полимеразы и сохранении рамки считывания.

Пример 20. рсЭХА3-МБ1<1.

5' часть МБК1 была получена из баз данных Е8Т (инвентарный номер АА160611). Этот клон представлял собой слияние между МБК1 и другой кДНК неизвестной природы. Он содержал ранее не опубликованную 5' последовательность МБК1 вместе с частью ранее опубликованного киназного домена МБК1 (Эогслу, е! а1., Еиг. I. Вюйет., 1993, 213, 701-710). Последовательность кДНК МБК1 клона Е8Т представляет собой следующую последовательность:

;<ЗААТТС6ССА ССА6АС0АСТ

СССАООТСТС ССССОАСОАО СССТСОТ66А ССОСОСАССТ СААССА6С06

СТ666САТСТ ТССССА6САА СТАСОТОАСС ССССОСА6СО ССТТСТССАС ССССТСССАС ССС00СС6С0 А60АССССА0 ТТССТАСССС СССАТТСАСТ ТОТТАСАААТ ТСАТТТТОСа ОАССТСАССТ ТССААОАОАТ ТАТТСОСАТС ССССССТТТО ССААСОТСТА ТССТССТТТС ТСОАТАССОО АТСАОСТТСС ТОТСАААОСА (ЗСТССССАСС АСССТСАТСА ССАСАТСАСС САОАССАТАО АСААТОТТСО ССААОАООСС ААССТСТГСС ССАТОСТСАА ССАССССААС АТСАТТСССС ТААОАСОСЮТ АТОТСТСААО ОАССССААСС ТСТОСТТССТ САТОСАСТТТ ССТССТССАС САССТТТСАА ТАСАСТ6ТТА ТСТОООАААА ССАТТССССС АСАСАТССТО ОТОААТТОСС СТСТОСАОАТ ТСССАСАОСО АТСААСТАСТ ТАСАТСАТСА СССААТГСТТ СССАТСАТСС АСС6С0АССТ ТААСТССАОС ААС (5Е<2 ГО N0:16). '

Она транслируется

последовательность:

Ν5ΑΚΕΟ30Υ5

СОЕОЮТбЦЬ Ν0»νθΙΡΡ5Ν УУТРЯЗАГЗЗ КСОРСОЕОРЗ СУРРКЭБЬЕ! ΟΓΑΕΙ.ΤΙ.ΕΕΙ ЮЮОГОКУУ ЙАЕУ/ЮОЕУА νΚΑΑΚΗϋΡϋΕ ϋΙβΟΠΕΝνκ ΟΕΑΚΙΓΑΜΕΚ ΗΡΝΠΑΣΚΟν СБКЕРМБСЬУ ΜΕΡΑΚΟΟΡΕΝ КУЕЗСКШРР ϋΠ,νΝλνΑνΟΙ ΑΚΟΜΝΎΕΗϋΕ А1УРПНМ>Ь Κ83Ν (5Е<Э ГО N0:17).

3' часть МБК1 в начале была клонирована с помощью вырожденной ПЦР, как опубликовано ранее (Иоготе, е! а1., Еиг. I. Вюйет., 1993, 213, 701-710). Протокол клонирования 3' части МБК1 был таким, как описано выше для МБК2, со следующими исключениями. Из четырех клонов, полученных при повторном скрининге библиотеки с помощью клона длиной 1,2 т.п.н., три клона представляли собой МБК1. Ни один из клонов не содержал полного киназного домена, который был получен с помощью ПЦР.

Фаг из аликвотных проб амплифицированных библиотек (кДНК нормального эпителия толстой кишки человека и кДНК линии клеток карциномы толстой кишки человека Т84 в 1 Ба^АРКК (8!га!адеие, номер по каталогу 937204) объемом 1 мл лизировали путем суспендирования в 20 мл воды и мгновенно замораживали. Образец объемом 5 мл лизированного фага использовали в качестве ПЦР матрицы в двух реакциях для каждой библиотеки. Праймеры, представляющие векторы, были взяты из нуклеотидных последовательностей, фланкирующих сайты клонирования. В случае библиотеки линии клеток толстого кишечника Т84 были использованы праймеры для секвенирования Т3 и Т7 (Рготеда). В каждой реакции один праймер был из 3' - 5' нити гена МБК1, примерно 100 п.н. 5' конца известной последовательности. Вторым праймером был один из двух векторных праймеров. Реакционная смесь ПЦР содержала буфер для ПЦР, 2,5 мМ хлорид магния, 1 ед. полимеразы Тас.| (все реактивы из Вге§а!ес) , 0,2 мМ дНТФ и 0,4 мМ каждого праймера в общем объеме 50 мл. Условия реакций были следующими: 60 с при

- 26 006648

95°С, 90 с при 52°С, 90 с при 72°С в ходе 30 циклов, с 15-минутным временем элонгации в последнем цикле. Продукты ПЦР были клонированы и секвенированы как описано выше. Самый длинный клон из отобранных в библиотеке и фрагмент ПЦР, который включал в себя дополнительную последовательность МЬК1, были лигированы друг с другом, чтобы получить кДНК МЬК1 длиной 1,08 т.п.н. в рИС18.

Клон МЬК1 из базы данных Е8Т был представлен в векторе рВ1иексг1р1 (§1га1адепе). кДНК МЬК1 из библиотеки толстого кишечника была лигирована в клон Е8Т с помощью переваривания вышеупомянутой кДНК Β^οΕΙ, затупления концов фрагментом Кленова, затем разрезанием АДП. Этот выделенный фрагмент был клонирован в кДНК МЬК1 из базы данных Е8Т, которую разрезали ΧΗοΙ, концы которой затупляли фрагментом Кленова и разрезали ΑίΙΙΙ. Затем эта новая конструкция была вырезана из рВ1иексг1р1 путем переваривания Νοΐ1 и Ара1 и лигирована в рсПМА3-ЕЕ, также разрезанный Νοΐ1 и Ара1. Последовательности всех соединений при клонировании проверялись.

Пример 21. Экспрессия С8Т-МЬК3_КП в Е. сο1^.

Е. сο1^ линии ВЬ21 трансформировали рСЕХКС-МЬК3(КО) путем электропорации. Бактерии, содержащие плазмиду, инокулировали в 15-литровый ферментер Арр^Щи в 10 л следующей богатой среды: 1,95 г/л К₂НРО₄, 0,9 г/л КН₂РО₄, 0,1 г/л ампициллина, 0,3 г/л (ΝΗ₄)₂8Θ₄, 0,92 г/л Мд8О₄-7Н₂О, 42,7 мг/л цитрата Ыа, 21,8 мг/л Ее8О₄-7Н₂О, 0,5 мл микроэлементов металлов Р1сЫа (Ηί§§ίηκ, е1 а1., МеίЬοάκ Мο1еси1а^ Вю^ду, 1998, 103, 149-177), 20 г/л казаминовых кислот, 40 г/л глицерина, 25,5 мг/л СаС1₂. Бактерии выращивали в течение ночи при 800 об./мин/68% растворенного кислорода/30°С до тех пор, пока культура не достигнет ОЭ₆₀₀ = 4,4. Продукцию рекомбинантного белка индуцировали добавлением 1 мМ изопропил-З-Э-тиогалактозида, при непрерывной ферментации при 25°С продолжительностью до 6 ч. Затем бактерии извлекали центрифугированием, и клеточную пасту хранили в замороженном виде при -20°С до очистки.

Пример 22. Очистка бактериальной С8Т-МЬК3_Кп.

Частично очищенную С8Т-МЬК3_КО получали путем озвучивания 100 г пасты бактериальных клеток в 100 мМ трис-НС1, 150 мМ №1С1, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитола (ОТТ), рН 7,5 (буфер А). В раствор добавляли тритон Х-100 до 1%, затем раствор перемешивали на льду в течение 1 ч. Надосадочный раствор после центрифугирования в течение 45 мин при 20 000 х д перемешивали в течение 1 ч на льду с 10 мл смолы глутатионсефарозы 4В (РЕагтааа), уравновешенной буфером А. Осевшую смолу дважды промывали 12,5 х объемом буфера А, затем элюировали 20 мл 100мМ трис-НС1, 150 мМ №1С1, 5 мМ ДТТ (буфер В), содержащим 20 мМ глутатиона, рН 7,5. Белок диализовали в течение ночи против буфера В и хранили в аликвотных пробах при -80°С.

Пример 23. Бакуловирусная экспрессия ЕЕАС-МЬК3 и С8Т-МЬК3_КП.

Рекомбинантные бакуловирусы, экспрессирующие ЕЕАС-МЬК3 и С8Т-МЬК3_КС были получены из соответствующих векторов переноса, рЕВ-ЕЕАС-МЬК3 и рЕВ-С8Т-МЬК3_КП, используя систему ВАСТО-ВАС (Ше Тесйиο1οд^еκ), в соответствии с инструкцией изготовителя. Суспензионные культуры клеток 8ί21 (Уаидйи, е1 а1., Ιη Уйго, 1977, 13, 213-217) выращивали при 27°С/120 об./мин в дополненной среде Грейса (Нтк, Шипе, 1970, 226, 466-467) с 10% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка (ЕВС). Для получения рекомбинантной ЕЬАС-МЬК3 клетки 8ί21 при плотности 1,5 х 10⁶ клеток/мл дополненной среды Грейса, содержащей 5% ЕВ8, инфицировали многократными заражениями (МО1) 3,1 и собирали через 39 ч после заражения. Для получения рекомбинантной С8Т-МЬК3_КО клетки 8ί21 при плотности 1,5 х 10⁶ клеток/мл дополненной среды Грейса, содержащей 5% ЕВ8, инфицировали МО1 2 и собирали через 41 ч после заражения. В обоих случаях осадок клеток ресуспендировали в буфере, содержащем 10 мМ НЕРЕ8, 50 мМ №1С1, 0,5 мМ РеίаЫοс 8С, 5 мкМ пепстатина, 10 мкг/мл апротинина, 10 мкг/мл лейпептина, рН 7,4. Надосадочный раствор, полученный после центрифугирования в течение 1 ч при 147000 х д, повторно доводили до рН 7,4 с помощью 3М основного триса и затем перед очисткой хранили при -70°С.

Пример 24. Очистка бакуловирусной С8Т-МЬК3_КП.

Частично очищенную бакуловирусную С8Т-МЬК3_КС получали с помощью глутатион-специфичной аффинной хроматографии. К 10 мл экстракта клеток (26,6 мг суммарного белка) добавляли 1 мл смолы глутатионсефарозы 4В (РЕагташа), уравновешенной в 10 мМ НЕРЕ8, 150 мМ №С1, рН 7,4 (буфер С), и белку давали возможность связаться в течение 45 мин при 4°С. Затем смолу промывали в колонке буфером С объемом, равным 30 объемам колонки, затем элюировали буфером С, содержащим 20 мМ глутатиона, объемом, равным 5 объемам колонки. Объединенный конечный продукт диализовали в течение ночи против буфера С и хранили в аликвотных пробах при -70°С.

Пример 25. Очистка бакуловирусной ЕЕАС-МЬК3.

Частично очищенную бакуловирусную ЕЕАС-МЬК3 получали с помощью антитело-специфичной аффинной хроматографии. Белок из 15 мл экстракта (19,5 мг суммарного белка) с добавлением 0,1 М №С1 связывали на 0,25 мл колонке с моноклональным антителом М2 против пептида ЕЬАС, связанным с агарозной смолой (81дта), в результате многократных загрузок (всего три раза). Перед хроматографией смолу предварительно уравновешивали промывкой 5 колоночными объемами 50 мМ трис-НС1, 150 мМ №С1, рН 7,4 (ТВ8), промывкой 3 колоночными объемами 0,1 М глицина, рН 3,5, после чего еще одной

- 27 006648 промывкой 5 колоночными объемами ТВ8. Рекомбинантный белок сначала элюировали 5 колоночными объемами 0,2 мМ РЬАС пептида Щ-Акр-Туг-Ьук-Акр-Акр-Акр-Акр-Ьук-С) (8ЕЦ ΙΌ N0: 18) в ТВ8. Белок хранили в аликвотных пробах при -80°С до анализа.

Пример 26. Доминантный негативный мутант: доминантный негативный мутант семейства МЬК блокирует гибель дифференцированных клеток РС12, вызванную удалением фактора роста нервов.

Линию клеток РС-12, полученную из опухоли феохромоцитомы крыс, широко использовали в качестве модели нервных клеток для изучения молекулярных событий, приводящих к гибели нейронов (для обзора, см. Тгоу, с1 а1., Айу. ΝοΗΓοΙοβ.ν, 1937, 103-111). Фактор роста нервов (ΝΟΡ) индуцирует клетки РС-12 к дифференцировке в клетки с фенотипом симпатических нейронов (Сгееие, Се11 Вю1., 1978, 78, 747-755). Выживаемость дифференцированных под действием NСΡ клеток РС-12 зависит от NСΡ, и они подвергаются морфологически описанной апоптозной гибели при удалении NСΡ из культуральной среды. Была разработана клеточная система для определения влияния представителей семейства киназ смешанных линий на гибель клеток РС-12 вследствие удаления NСΡ. Клетки РС-12 трансфецировали кДНК, кодирующей доминантный негативный (ΌΝ) мутант МЬК-3, используя систему переноса на основе липидов РГх, как рекомендовано изготовителем (йпуйгодеп, СагкЬай, СА). Стабильный пул трансфектантов, экспрессирующих ΌΝ-ΜΕΙ<-3 отбирали, используя сульфат С418 (МеФа1есН 1пс., Негпйоп, УА). Примерно 30% клеток в этих пулах экспрессируют ΌΝ-ΜΕ-ΙΟ, как было определено с помощью иммуногистохимии. Пулы клеток, стабильно экспрессирующих мутантную киназу, высевали на покрытые полиорнитином/ламинином (10 мкг/мл каждого в фосфатно-солевом буфере) планшеты 96-луночной формы для культур тканей при плотности 2 х 10⁴ клеток/лунку и обрабатывали 100 нг/мл NСΡ в течение 7 дней. Среду, содержащую NСΡ, удаляли, монослой клеток промывали фосфатно-солевым буфером и на 1-5 дней вносили среду, содержащую антитела, нейтрализующие NСΡ (номер по каталогу 6655; 81дта, 81. Ьошк, МО) в конечном разведении 1:1000. Выживаемость клеток определяли количественно с помощью анализа выживаемости клеток на основе превращения соли тетразолия, МТ8, в окрашенный формазан, который регистрировали по поглощению при 570 нм на Су1оР1иог 2350 (М1Шроге, ВейГогй, МА) как рекомендовано изготовителем (Рготеда, Майкоп, XVI). Пулы стабильно экспрессирующие О№МЬК-3 частично были спасены от гибели клеток, вызванной удалением NСΡ (фиг. 10).

Пример 27. Анализ энзиматической активности рекомбинантного МЬК белка.

Чтобы показать, что МЬК белок, экспрессированный либо в бакуловирусной, либо в бактериальной системе экспрессии, является энзиматически активным белком, может быть использовано несколько видов анализа. МЬК белок может быть полноразмерной конструкцией или киназным доменом, экспрессированными либо в бакуловирусной, либо в бактериальной системе экспрессии. Анализ может быть основан на антителах, например твердофазный иммуно-ферментный анализ (ЕЫ8А), флюоресценция с временным разрешением (ТКР), или поляризация флюоресценции (РР). Антителом может быть моноклональное или поликлональное антитело, реактивное против фосфосерина, фосфотреонина или фосфорилированного специфичного субстрата. В альтернативном случае может быть использован метод, не основанный на антителах, такой как анализ радиоактивности в геле (см. фиг. 11), множественный скрининговый анализ на основе преципитации трихлоруксусной кислотой (ТХУ) (фиг. 13), выявление сходства при сцинтилляционном анализе (8РА), способ скрининга с использованием Г1а811р1а1е, или разновидность анализа на нитроцеллюлозных фильтрах (фиг. 13).

Целью анализа может быть контроль непосредственного фосфорилирования субстрата или связанной анализируемой системы, использующей киназы сигнального пути ниже по течению. Субстратом может быть специфичный субстрат, такой как 8ЕК-1, или относительно неспецифичный субстрат, такой как основной белок миелина (МВР).

Пример 28. Анализ киназ.

(1) Анализ киназ на основе измерения радиоактивности в геле.

Киназную активность МЬК-3 исследовали, контролируя включение ³²Р из [у-³²Р]-АТФ в субстрат МЬК (например, «мертвую» киназу 8ЕК-1; основной белок миелина). 50 мкл смеси для анализа содержали буфер А (20 мМ М0Р8, рН 7,2, 25 мМ β-глицеринфосфата, 5 мМ ЭГТА, 1 мМ ортованадата натрия, 1 мМ дитиотреитола), 15 мМ МдС1₂, 100 мкМ АТФ, 10 мккюри [у-³²Р]-АТФ, и 0,1 мкг субстрата - «мертвой» киназы 8ЕК-1 (81ге88§еп, 1пс; связанную с глутатион-8-трансферазой 8ЕК-1 (С8Т-8ЕК-1) высвобождали из глутатионагарозных шариков с помощью 10 мМ глутатиона, рН 8,0) или 25 мкг МВР (8щта

С.'11е1шса1 Со.). Реакцию инициировали добавлением МЬК белка (киназный домен или препарат, содержащий как полноразмерный белок, так и киназный домен) или контрольного белка. Смесь инкубировали в течение 30 мин при 30°С. В конце реакции добавляли 2х восстанавливающего буфера для образца. Смесь кипятили в течение 5 мин, наносили либо на 12% 8Э8-ПААГ гель (при использовании в качестве субстрата МВР) или на 8% гель (при использовании в качестве субстрата 8ЕК-1). После электрофореза гель сушили. Количественное определение включения фосфата в субстрат, 8ЕК-1, выполняли на приборе для регистрации динамики молекулярного фосфорилирования (Мо1еси1аг Оупатюз Рйозроптадег, 8иппууа1е, СА). Результаты экспериментов, предназначенных для того, чтобы показать энзиматические активности экспрессируемой бакуловирусами МЬК-3 (меченная РЬАС полноразмерная или меченный

- 28 006648

С8Т киназный домен) с использованием в качестве субстрата «мертвой» киназы С8Т-8ЕК-1 или МБР, показаны на фиг. НА и 11В.

(2) Вестерн-блот анализ.

Киназную активность экспрессируемой бакуловирусами МЬК-3 оценивали с помощью иммуноблот анализа. Смесь для анализа объемом 20 мкл содержала буфер А, 15 мМ МдС1₂, 100 мкМ АТФ, и 0,1 мкг субстрата - «мертвой» киназы 8ЕК-1. Реакции позволяли продолжаться в течение 30 мин при 30°С, затем гасили 10 мкл 4х восстанавливающего буфера для образцов. Белки разделяли в 8% трис-глициновом геле, и с помощью электрофореза переносили на мембрану 1ттоЫ1оп ΡνΌΡ. Мембрану инкубировали с антителом, специфичным для фосфорилированного 8ЕК-1 (ТЬг223) (Νονν Епд1апб Вю1аЬк, 1пс.), после чего с меченым пероксидазой хрена антикроличьим 1дС козы (Вю-Каф. Регистрацию иммунореактивных полос выполняли посредством усиленной хемилюминисценции (Атегкйат). Фосфорилирование «мертвой» киназы С8Т-8ЕК-1 белком РЬАС-МЬК-3 (бакуловирусный препарат, содержащий как полноразмерный белок, так и киназный домен) показано на фиг. 12.

(3) Множественный скрининговый анализ на основе преципитации трихлоруксусной кислотой (ТХУ).

Киназную активность киназного домена С8Т-МЬК-3, экспрессируемого бактериями, оценивали с использованием множественного скринингового анализа «в планшетах» М1Шроге с трихлоруксусной кислотой (ТХУ), который описан Ρίίί, еί а1., 1. Вюто1. 8сгеешпд, 1996, 1, 47-51). Анализы выполняли в 96-луночных планшетах Эигароге для множественного скрининга (М1Шроге). Каждая смесь для анализа, объемом 50 мкл, содержала 20 мМ Нерек, рН 7,4, 20 мМ МдС1₂, 20 мМ МпС1₂, 2 мМ ДТТ, 0,1 мМ NазVΟ₄, 1 мккюри [γ-Р³²] АТФ и 30 мкг МВР субстрата. Реакцию инициировали добавлением МЬК белка и позволяли продолжаться в течение 15 мин при 37°С. Реакцию останавливали 25 мкл 50% ТХУ. Планшеты оставляли для установления равновесия на 30 мин при 4°С, затем промывали ледяной 25% ТХУ. В планшеты добавляли сцинтилляционную смесь и радиоактивность определяли, используя сцинтилляционный счетчик Аа11ас М|сгоВе1а 1450 РЬи8. Зависимость образования ³²Р-меченного МВР от дозы белка показана на фиг. 13.

(4) Анализ на фосфоцеллюлозных фильтрах.

Анализ киназы выполняли в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 20 мМ Нерек, рН 7,4, 20 мМ МдС1₂, 20 мМ МпС1₂, 2 мМ ДТТ, 0,1 мМ NазVΟ₄, 1 мккюри |γ-^|,3’²| АТФ и 30 мкг МВР. Реакцию инициировали добавлением МЬК белка и позволяли продолжаться в течение 15 мин при 37°С. Реакцию останавливали 75 мкл 75 мМ фосфорной кислоты. Аликвоты погашенного раствора наносили непосредственно на фосфоцеллюлозную мембрану (Р1егсе). В альтернативном случае могут быть использованы 96луночные фосфоцеллюлозные планшеты для множественного скрининга (МгШроге). Мембраны промывали 75 мМ Н3РО4. Связанный ³²Р-меченный фосфорилированный МВР элюировали в пробирки для сбора добавлением 1М гидроокиси натрия. Радиоактивность определяли методом счета Черенкова в сцинтилляционном счетчике Весктап (ЪотегкеЕ Ν1). Образование фосфорилированного МВР с увеличением концентрации экспрессируемого бактериями киназного домена С8Т-МЬК-3 показано на фиг. 13.

Пример 29. Анализ с целью определения связывания соединений с рекомбинантными белками семейства МЬК.

К-252а (соединение ΙΙΙ-3; см. табл. 4), метаболит индолокарбазола видов ХосагФа, связывается с различными серин/треониновыми и тирозиновыми киназами (Апде1ек, еί а1., Апа1. Вюс11ет., 1996, 236, 49-55; КшдЫ, еί а1., Апа1. Вюсйет., 1997, 247, 376-381). Меченый тритием К-252а лиганд был использован для оценки связывания с полноразмерной рекомбинантной МЬК-3 человека из неочищенного препарата инфицированных бакуловирусами клеток. [³Н]К-252а специфично метили тритием в 3 и 9 положениях, благодаря контракту с ΝΉΝ Кекеагсй ргоФюЬ (ВШепса, МА), и он имел удельную активность 40 кюри/ммоль. Реакцию связывания проводили в 1 мл в 96-луночном планшете. Реакционная смесь содержала 50 мМ буфер МОР8, рН 7, 150 мМ №С1, 5 мМ МпС1₂, 1 мг/мл БСА, 1% ДМСО и 0,25 нМ [³Н]К252а. Образцы готовили в трех повторах при концентрации 5 мкг/мл неочищенной полученной на основе бакуловирусов МЬК-3. Неспецифическое связывание определяли по связыванию в присутствии не меченного 1,2 мкМ К-252а, и вычитали из суммарного связывания, чтобы получить специфичное связывание. При таком разведении 12-15% общего количества импульсов было неспецифично связано с белком, и 75-85% этих импульсов были специфично связаны с МЬК-3 (фиг. 14). Все эксперименты выполняли в течение 2 ч при 4°С. Комплексы [³Н]К-252а/МЬК-3 собирали на фильтры А11а1тап 6Р/С, используя сборщик Вгапбе1, промывали холодным МОР8/№1С1 буфером и считали в бета-счетчике Аа11ас Мюго. Проводили эксперимент по насыщению связывания, чтобы получить К,| для К-252а. Показан примерный результат одного из таких экспериментов (фиг. 14). Было получено значение К,| равное 0,89 нМ (границы доверительного интервала: от 0,2 до 1,5 нМ).

Пример 30. Анализ интактных клеток.

(А) Система сверхэкспрессии Сок7.

Материалы.

К-252а и производные этого соединения были предоставлены Куоча-Накко Кодуо Со. Ь1Ф (Токуо,

- 29 006648 .Гараи) (Капеко е! а1., 1997). Соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) по уровню качества, предназначенного для культур клеток, и хранили в темноте при 4°С. Все разведения соединений делали в среде Игла модификации Дульбекко (ИМЕМ), содержащей 1% бычьего сывороточного альбумина. Гемагглютининовые (НА) антитела были приобретены в ВаЬСО (Вюйтопй, СА). АР-1 (с-щп) субстрат был приобретен в Рготеда (Май1коп, XVI). [у-³²Р]АТФ (6000 кюри/ммоль) приобретали в Атегкйат (Аг1шд1оп Не1дй1к, 1Ь).

Культура клеток СОк7.

Клетки почки зеленой мартышки Сок7 получали из АТСС, ВоскуШе, Магу1апй (СВЬ 1651) и поддерживали в ИМЕМ, содержащей 10% бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата, 50 ед/мл пенициллина/стрептомицина при 37°С в атмосфере из 10% СО₂, 90% воздуха. Клетки Сок7 отделяли для пересева добавлением 0,25% трипсина.

(1) Сверхэкспрессия представителей МЬК семейства и РХК1 в клетках Сок7.

Клетки Сок7 пассировали при 80% конфлюентности, и трансфецировали 2 мкг каждой из конструкций кДНК, используя липофектамин, как рекомендовано поставщиком (С1Ьсо ВВЬ, СаййегкЬигд, МИ). Полноразмерная кДНК МЬК-3, МЬК-2 человека или ИЬК мыши, или неполная кДНК МЬК-1 человека, которые описаны выше, и полноразмерная кДНК меченной гемагглютинином А 1ΝΙΧ1 человека, любезно предоставленная 1. 8Пую 6и1кшй (Ы1Н, Ве!йекйа, МИ), были субклонированы в векторе рсИЫА3 (1пуйгодепе, 8ап И1едо, СА). Через 48 ч после трансфекции клетки обрабатывали 0,025% ДМСО или 500 нМ указанных соединений в течение 2 ч, после чего лизировали в 0,4 мл буфера с тритоном (1% тритон Х100, 50 мМ хлорид натрия, 10 мМ трис (рН 7,6), 0,1% бычий сывороточный альбумин, 30 мкМ пирофосфат натрия, 50 мМ фторид натрия, 20 мкг/мл апротинина, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, 1 мМ ванадат натрия). Активность 1ΝΙΧ лизата анализировали с помощью иммунопреципитации/киназного анализа, как описано ниже.

(2) Иммунопреципитация и киназный анализ на целых клетках.

В лизате клеток Сок7 измеряли концентрацию белка, используя набор М1сго ВСА Р1егсе (Восккогй, 1Ь), и равные количества белка подвергали иммунопреципитации с НА антителами в течение 1 ч при 4°С. Иммунопреципитаты осаждали путем центрифугирования в микроцентрифуге в течение 20 с, ресуспендировали в тритоновом буфере, промывали центрифугированием еще 2 раза, после чего делали последнюю промывку в киназном буфере (20 мМ Нерек, рН 7,4, 20 мМ МдС1₂, 2 мМ дитиотреитол, 0,1 мМ ванадат натрия). Иммунопреципитат ресуспендировали в киназном буфере, содержащем 1 мкМ АТФ и 5 мккюри [у-³²Р]АТФ и субстрат (1 мкг/образец АР-1) и инкубировали в течение 15 мин при 30°С. Киназную реакцию останавливали добавлением восстанавливающего буфера для образца (ЬаеттИ, Ыа1иге 1970: 227; 680-685). Образцы нагревали до 80°С в течение 5 мин и наносили на 10% 8И8полиакриламидные гели. Белки разделяли с помощью электрофореза. Гель сушили, и количественное определение радиоактивности в АР-1 субстрате проводили на приборе для регистрации динамики молекулярного фосфорилирования (8ипиууа1е, СА). Результаты экспериментов, в которых МЬК-3, МЬК-2 и ИЬК экспрессировались совместно с НА-1ЫК1 и были инкубированы в отсутствии или в присутствии соединения К-252а показаны на фиг. 15А и 15В. Напротив, производное исходного соединения К-252а, названное соединением ΙΙΙ-3 (см. табл. 4), которое является более избирательным ингибитором киназы, не влияло на 1ΝΙΧ путь, активируемый другой МАРККК выше по течению, чем 1ΝΒ, МЕКК1 (фиг. 15 С).

(В) Анализ РХК, активированной МЬК, в целых клетках с использованием репортера.

Попытки получения клонов, конститутивно экспрессирующих семейство МЬК, оказались неудачными, что свидетельствует о том, что сверхэкспрессия МЬК может влиять на выживаемость клеток (Вегдегоп е! а1., Вюсйет. ВюрЫк. Век. Соттип., 1997, 231, 153-155; Ыада!а, е! а1., ЕМВО 1., 1998, 17, 149158). Поэтому при разработке анализа на целых клетках для слежения за биохимическими событиями, индуцируемыми МЬК, может быть необходима линия клеток, содержащая полученную генноинженерным путем индуцируемую систему экспрессии интересуемой киназы. Например, линия клеток РС-12, трансфицированная регулируемым тетрациклином трансактиватором. В том случае, когда в дальнейшем клетки трансфецируют интересующим геном, управляемым индуцируемым промотором !е!О, экспрессия этого гена непосредственно контролируется тетрациклином в среде (8йоскей, е! а1., Ргос. Ыа!1. Асай. 8ск И8А, 1995, 92, 6522).

Чтобы количественно оценить активацию МЬК, можно измерить фосфорилирование расположенных ниже по течению субстратов, таких как МЕК4, 1ЫК или с-щп с помощью многих видов анализа, которые описаны выше. Другим подходом к количественной оценке активации МЬК в целых клетках является использование активности репортерного фермента, такого как с-щп - люциферазная репортерная система, доступная для приобретения благодаря Ра1й-Ие1ес1™ системе (81га1адепе, Ьа1о11а, СА). В этой системе индуцируемая тетрациклином линия клеток трансфецируется двумя плазмидами. Одна плазмида конститутивно экспрессирует ЫН₂-концевой трансактивирующий домен с1ип, слитый с ДНКсвязывающим доменом САЬ4 дрожжей (с1ип-ИВИ гибридный белок). Другая плазмида несет кодирующие последовательности люциферазы светляка, управляемые пятью тандемными повторами сайта связывания САЬ4. При активации МЬК расположенный ниже по течению субстрат РХК, с1ип-ИВИ гибрид

- 30 006648 ный белок, фосфорилируется, связывается с сайтами связывания СЛЬ4 и индуцирует транскрипцию гена люциферазы. Люциферазу легко анализировать в лизатах клеток путем добавления ее субстрата (Рготеда, Майкоп, VI) и измерения хемилюминисценции.

Пример 31. Связь ингибирования представителей семейства МЬК и выживаемости мотонейронов и кортикальных нейронов.

Выживаемость культур спинного мозга крыс, обогащенных мотонейронами.

Вскрывали спинной мозг эмбрионов крыс 8ргадие-ОаМеу (Сйаг1е5 К1уег ЬаЬога1опе8, νί^η^ΐοη, МА) в эмбриональном возрасте (Э) 14,5-15. Клетки только из вентральной части спинного мозга диссоциировали и затем обогащали мотонейронами путем центрифугирования на 6,5% ступенчатом градиенте метризамида, как описано ранее (Непйегаоп, е1 а1., 1993), и анализировали их чистоту путем окрашивания антителом против рецептора нейротрофина с низким сродством (Iд6-192, Воейгшдег-Маипйет) (данные не показаны). Клетки высевали в 96-луночные планшеты, предварительно покрытые поли-1-орнитином и ламинином (5 мкг/мл каждого) при плотности 6 х 10⁴ клеток/см² в химически определенной бессывороточной среде N2 (Воиепйет, е1 а1., 1979, выше). Чтобы разделить влияние на прикрепление и выживаемость, добавление соединений к культурам производили после начального периода прикрепления длительностью 1-3 ч. Выживаемость нейронов определяли через 4 дня, используя кальцеин АМ (Мо1еси1аг РгоЬек, Еидепе, ОК) при флюорометрическом анализе выживаемости (Бохусхко-Соупе, е1 а1., 1993, выше). Подсчет нейронов с помощью микроскопа прямо коррелировал с относительными значениями флюоресценции. Коротко, культуральную среду серийно разводили в ΌΡΒ8 (фосфатно-солевой буфер Дульбекко) и затем в каждую из 96 лунок добавляли маточный раствор кальцеина АМ до конечной концентрации 6 мкМ. Планшеты инкубировали в течение 30 мин при 37°С, с последующими промывками серийного разведения в ΌΡΒ8. Сигнал флюоресценции регистрировали, используя считывающий планшеты флюориметр М1Шроге (С'уЮПног 2350) при длине волны возбуждении = 485 нм и эмиссии = 538 нм. Для каждого планшета среднее фоновое значение, полученное для лунок, в которые вводили кальцеин АМ, но в которых не было клеток, вычитали из всех значений. В этих экспериментах контролировали линейность сигнала флюоресценции для концентрации и время инкубации для определенных пределов плотности клеток. Пример выживаемости мотонейронов, выраженной в процентах от контроля, в присутствии 250 нМ тестируемых соединений показан в табл. 3.

Выживаемость кортикальных нейронов.

Кору головного мозга плода крыс рассекали на 18 эмбриональный день и переваривали ферментом, чтобы получить суспензию отдельных клеток. Клетки высевали при плотности 1,56 х 10⁵/см² в покрытые полиорнитином/ламинином 96-луночные планшеты для культур тканей в бессывороточную основную среду для нейронов (№ига1 Ва§а1 Мейшт), содержащую В27 добавки. Планшеты покрывали раствором полиорнитина/ламинина (8 мкг/мл каждого), приготовленного в ΡΒ8, в течение по меньшей мере 2 ч при 37°С. На 5-7 день культивирования ш уйго кортикальные нейроны подвергали воздействию АЬ25-35 (20 мкМ) либо в присутствии, либо в отсутствии тестируемых соединений. Маточные растворы АЬ25-35 (81дта, 8ΐ. Ьошк, МО) (1 мМ) готовили в деионизованной дистиллированной стерильной Н₂О. Относительную выживаемость нейронов определяли через 48 ч после добавления пептида, используя высвобождение лактатдегидрогеназы (ЬОН) в качестве показателя целостности плазматической мембраны/выживаемости клеток. ЬОН измеряли, используя набор для регистрации цитотоксичности (Воейгшдег-Маппйе1т, Iηά^аηарο1^8, ΓΝ) в соответствии с инструкциями изготовителя. Данные выражали в виде процента ингибирования высвобождения БЭН относительно культур, обработанных только одним АЬ5-35.

- 31 006648

Таблица 3

	Кортикальные нейроны	Мотонейроны	Соя-7 клетки	Соя-7 клетки	Соя-7 клетки	Соя-7 клетки
Форму-	Выживае-	Выжи-	%ΛΪΚ	ϋΙ,Κ	МЬК-3	МЬК-2	МЬК-1
ла	мость % от	вае-	ин-	%лж		% ДЫК
	контроля	ьлость	гиб.	ингиб.в	ингиб.@	ингиб,@	ингиб.@
	при 250 нМ	% от контроля при 250 нМ	При 500 нМ	500 нМ	500 нМ	500 нМ	500 нМ
III1	46,56	3001	65%	ез, 73	99,98	89, 67	97,96
III2	47,80	315%	80%	36,22, 42	94, 94	69, 44	92, 64
I3	22, 54	177%	88%	20,25	94,93	0	79, 29
I4	29,39	165%	97%	58,13, 52,8	84,92, 90	0	63,38

¹ Соединение имеет формулу ΙΙΙ, где Ζμ Ζ₂, Κι и К₂ представляют собой Н; X означает СО₂СН₃ и К означает ОН.

²Соединение имеет формулу ΙΙΙ, где Ζι и Ζ₂ являются Н; X означает СО₂СН₃; Κι и К₂ означают СН₂8СН₂СН_з и К означает оН.

³Соединение имеет формулу Ι, где Αμ А₂, Κι, К_з, К₅ и К₆ являются Н; Βι и В₂ вместе представляют собой О; К₂ является СН₂СН₂ОАС; означает СН₂СН₂(2-пиридил) и X означает СН₂.

⁴Соединение имеет формулу Ι, где Αμ А₂, К_ь К₃, К₅ и К₆ являются Н; В! и В₂ вместе представляют собой О; К₂ является Н; К₄ означает СН₂СН₂(2-пиримидинил) и X означает СН₂.

Пример 32. Иммунопреципитация эндогенной активности £ЫК культур мотонейронов в отсутствии или в присутствии индолокарбазолов или конденсированных пирролокарбазолов.

Очищенные мотонейроны высевали при плотности 6 х 10⁴ клеток/см² в лунки диаметром 16 мм. Клеткам перед обработкой давали возможность прикрепиться в течение 2 ч. Клетки обрабатывали либо 0,0125% ДМСО, либо 500 нМ соединения в течение 2 ч в определенной среде Ν2. Затем клетки промывали ледяным фосфатно-солевым буфером, после чего лизировали в 0,4 мл буфера с тритоном, как описано выше в примере 30. Лизат культур мотонейронов нормировали по количеству клеток и иммунопреципитировали с помощью антитела ΙΝΙ<1 (номер по каталогу 50-474). приобретенного от 8ап1а Сгих Βίο1сс11по1оду (8ап1а Сгих, СА). 1ЫК активность иммунопреципитатов анализировали в присутствии ³²Р-АТФ и субстрата с-_)ип, как описано выше. Профиль ингибирующей активности 4 тестируемых соединений сравнивали в мотонейронах и клетках Со§7, сверхэкспрессирующих либо ОЬК, МЬК-1, МЬК-2, либо МЬК-3 (табл. 3).

Пример 33. Корреляция между ингибированием МЬК3-индуцированной активности 1ЫК в клетках Со57 и холинацетилтрансферазной активностью в первичных эмбриональных культурах.

Чтобы определить, существует ли корреляция между ингибированием ΙΝΙ< пути, регулируемого этими киназами, с нейротрофическими соединениями, авторы оценили влияние соединений на активность ΙΝΙ< в клетках Со§7, сверхэкспрессирующих НА-ΙΝΧ и МЬК3. После 48 часового периода трансфекции клетки инкубировали с соединениями в концентрации 500 нМ в течение 2 ч, после чего клетки лизировали. Лизат иммунопреципитировали, и измеряли киназную активность как описано ранее. Результаты представлены в виде процента ингибирования относительно контрольного образца, причем контролем является активность ΙΝΙ< в присутствии ДМСО. Как можно увидеть в табл. 4, большинство соединений, которые были активными в отношении ХАТ активности в спинном мозге и/или базальных отделах переднего мозга, являлись потенциальными ингибиторами активации ΙΝΙ< посредством МЬК-3.

- 32 006648

Таблица 4

Влияние индоло- и инденокарбазолов на активность 1ΝΙ< в клетках Со§7, сверхэкспрессирующих МЬК3

	Активность холинацетилтрансферазы	% Ингибирования активности (среднее значение)
Соединение	Спинной мозг	Базальные отделы переднего мозга	МЬКЗ в клетках Соз7
ΙΙΙ-11	+	+	84
ΙΙΙ-22	+	+	96
ΙΙΪ-Ρ	+	+	94
Ι-14	+	+	93
Ι-25	+	+	85
	+	+	93, 5
Ι-47	-	+	95
Ι-5Θ	-	+	97
1-6*	-	+	58
1-71®	-	+	85,5
ΙΙΙ-411	-	+	66
111-512	-	+	96
111-713	—	+	54
Ι-814		-	89
ΙΙΙ-815	+	-	94
Ш-916	+	+	98,5
ΙΙΙ-1017	+	-	78
Ι-913		-	88
Ι-1019 .	+	-	94
ΙΙΙ-1120	-	-	92,5
Ι-1121	-	+	33
Ι-1222	-	—	11
Ι-1323	—	-	1

¹ Соединение, имеющее формулу ΙΙΙ, где Ζ₁ и Ζ₂ являются Н, X означает СО₂СН₃; Я! означает NНСΟNНС₂Н5; Я₂ означает СН₂СН₂(2-пиридил) и Я означает ОН.

²Соединение, имеющее формулу ΙΙΙ, где Ζ₁ и Ζ₂ являются Н, X означает СО₂СН₃; Я! и Я₂ означают СН2ОСН2ОСН2СН3 и Я означает ОН.

³Соединение, имеющее формулу ΙΙΙ, где Ζ₁ и Ζ₂ являются Н, X означает СО₂СН₃; Я! и Я₂ означают СН₂8СН₂СН₃ и Я означает ОН.

⁴Соединение, имеющее формулу Ι, где А₁, А₂, Я₁, Я₃ и Я₄ являются Н; В₁ и В₂ вместе представляют

- 33 006648 собой О; К₂ означает СН₂СН₂ОН; К₅ и Кв означают ОСН₃ и X означает СН₂.

⁵Соединение, имеющее формулу Ι, где А!, А₂, К!, К₃, К₅ и К₆ являются Н; В! и В₂ вместе представляют собой О; К₂ означает СН₂СН₂ОАс; Кд является Вг и X означает СН₂.

⁶Соединение, имеющее формулу Ι, где А!, А₂, К!, К₃, К₅ и К₆ являются Н; В! и В₂ вместе представляют собой О; К₂ означает СН₂СН₂ОАс; К₄ означает СН₂СН₂(2-пиридил) и X означает СН₂.

⁷Соединение, имеющее формулу Ι, где А!, А₂, К!, К₃, К₄, К₅ и Кв являются Н; В! и В₂ вместе представляют собой О; К₂ означает СН₂СН₂ОН и X означает СН₂.

⁸Соединение, имеющее формулу Ι, где А_;, А₂, К_;, К₃, К₄, К₅ и К5 являются Н; В; и В₂ вместе представляют собой О; К₂ означает СН₂СН₂СН₂ОН и X означает СН₂.

⁹Соединение, имеющее формулу Ι, где А_;, А₂, К_;, К₂, К₃, К₄, К₅ и К₆ являются Н; В; и В₂ вместе представляют собой О и X означает 8.

¹⁰Соединение, имеющее формулу Ι, где А_;, А₂, К_;, К₃, Кд, К₅ и К₆ являются Н; В; и В₂ вместе представляют собой О; К₂ означает СН₂Сн₂СН₂ЫНСО(4-(ОН)Рй) и X означает СН₂.

¹¹ Соединение, имеющее формулу ΙΙΙ, где Ζ_;, Ζ₂, К!, и К₂ являются Н; X означает СО₂(СН₂) ₄СН₃ и К означает ОН.

^!2Соединение, имеющее формулу ΙΙΙ, где Ζ_;, Ζ₂ и К_; являются Н; К₂ означает СН₂ОН; X означает СО2СН3 и К означает ОН.

^!3Соединение, имеющее формулу ΙΙΙ, где Ζ_; и Ζ₂ вместе образуют =О; К_; и К₂ являются Вг; X означает СО2СН3 и К означает ОН.

^!4Соединение, имеющее формулу Ι, где А_;, А₂, К_;, К₃, К₅ и К₆ являются Н; В_; и В₂ вместе представляют собой О; К₂ означает Н; К₄ означает СН₂СН₂(2-пиримидинил) и X означает СН₂.

^!5Соединение, имеющее формулу ΙΙΙ, где Ζ_; и Ζ₂ являются Н; К_; является Вг; К₂ является Ι; X означает СО2СН3 и К означает ОН.

^!6Соединение, имеющее формулу ΙΙΙ, где Ζ_;, Ζ₂, К_; и К₂ являются Н; X означает СО₂СН₃ и К означает ОН.

^!7Соединение, имеющее формулу ΙΙΙ, где Ζ_; и Ζ₂ являются Н; К_; и К₂ означают СН₂СН₂8СН₃; X означает СО2СН3 и К означает ОН.

^!8Соединение, имеющее формулу Ι, где А_;, А₂, К_;, К₂, К₃, К₅ и К₆ являются Н; В_; и В₂ вместе представляют собой О; Кд означает СН₂СН₂(2-пиридазинил) и X означает СН₂.

^!9Соединение, имеющее формулу Ι, где А_;, А₂, К_;, К₃, К₅ и К₆ являются Н; В_; и В₂ вместе представляют собой О; К₂ означает Н; К₄ означает СН₂СН₂(2-пиридил) и X означает СН₂.

²⁰Соединение, имеющее формулу ΙΙΙ, где Ζ_;, Ζ₂, К_; и К₂ являются Н; X означает СО₂СН₃ и К означает ОСН3.

^2! Соединение, имеющее формулу Ι, где А_;, А₂, К_;, К₃, Кд, К₅ и К₆ являются Н; В_; и В₂ вместе представляют собой О; К₂ означает (СН₂)_3-ЫН-С(=О)-3,5-дигидроксифенил и X означает СН₂.

²²Соединение, имеющее формулу Ι, где А_;, А₂, К_;, К₃, Кд, К₅ и К₆ являются Н; В_; и В₂ вместе представляют собой О; К₂ является бензоилом и X означает СН₂.

²³Соединение, имеющее формулу Ι, где А_;, А₂, К_;, К₂, К₃, К₅ и К₆ являются Н; В_; и В₂ вместе представляют собой О; Кд означает СН=СН-С=Ы и X означает СН₂.

Пример 34. Анализ активации МЬК по изменению подвижности в геле.

Активация МЬК может приводить к индукции транскрипции с-)ип, и в результате к увеличению количества белка с-Л1п. Увеличенное количество белка с-1ип может быть измерено с помощью стандартного анализа, известного как анализ изменения подвижности в геле. Работа Сагпег, е! а1., Ыис1е1с Асйк Кек., 1981, 9, 3047-3060, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме. Радиоактивно меченые олигомеры двунитевой ДНК, которые кодируют ДНК-связывающий сайт с-1ип, инкубируют с экстрактом клеточных ядер, после чего проводят электрофорез в акриламидном геле и количественно оценивают радиоактивно меченую ДНК, полосы которой сдвинуты в сторону более медленной подвижности. Эта ДНК представляет собой часть ДНК, которая связана с белком с-1ип, и ее количество прямо пропорционально количеству белка с-1ип в экстракте.

Активация МЬК также может индуцировать фосфорилирование с-1ип. Это можно выявить, используя антитела, которые специфично узнают фосфорилированную форму белка в таких системах детекции, как, например, Вестерн блот или ЕЫ8А.

Пример 35. Выживаемость нейронов эмбрионов цыплят.

Материалы.

Среды Лейбовица Ь15, глюкоза, бикарбонат натрия, трипсин и антибиотики были от С1Ьсо. Мышечный экстракт был приготовлен как описано (Непбегкоп, е! а1., Ыа!иге, 1983, 302, 609-611, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме). Все другие реактивы были фирмы 81дта, если не оговорено особо.

Культура клеток.

Мотонейроны (5,5 эмбриональный день) были выделены иммунологическим методом, в соответствии с процедурой, представленной в работе В1осй-6а11едо, е! а1., Оеуе1ортеп!, 1991, 111, 221-232, которая

- 34 006648 включена здесь в виде ссылки в полном объеме, с модификациями, описанными в работе \Успд. с1 а1., №игоКероп, 1996, 7, 1077-1081, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме. Очищенные мотонейроны высевали в чашки для культур тканей диаметром 35 мм (№1пс), предварительно покрытые поли-ЭЬ-орнитином и ламинином (1 мкг/мл, ир51а1е Вю1ес11). Была использована культуральная среда Ь15 с бикарбонатом натрия (22,5 мМ), глюкозой (20 мМ), прогестероном (2 х 10^-8 М), селенитом натрия (3 х 10^-8 М), кональбумином (0,1 мг/мл), инсулином (5 мкг/мл), пенициллином-стрептомицином, и 10% инактивированной нагреванием сыворотки лошади. Мышечный экстракт добавляли до концентрации 30 мкг/мл. Соединение Ш-3 готовили в виде 4 мМ маточного раствора в ДМСО и хранили в защищенном от света месте при 4°С. Конечная концентрация ДМСО в обрабатываемых и контрольных культурах составляла 0,125%.

Паравертебральные симпатические ганглии (86; 12 эмбриональный день (Э12)), ганглии дорсальных корешков (ΌΚ6; Э9) и цилиарные ганглии (СО; Э8) вырезали из эмбрионов крыс в указанные дни эмбрионального развития, как описано в работе Ьупйкеу, е1 а1.,Эеу. В1о1., 1985, 112, 319-328, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме. После обработки трипсином и диссоциации суспензии нервных клеток высевали в покрытые полиорнитином-ламинином чашки для культивирования в культуральную среду Хама Б14 с добавлением 10% сыворотки лошади. Сразу же после посева добавляли факторы выживания в следующих концентрациях: фактор роста нервов (Ν6Ε), 20 нг/мл; цилиарный нейротрофический фактор (6ΝΤΕ), 10 нг/мл. Культуры содержали при 37°С и 5% СО₂ в увлажненной окружающей среде.

Подсчет клеток.

Нейроны высевали в чашки для культивирования диаметром 35 мм с нанесенной сеткой (Νιιπο). Выбранные площади каждой чашки, составляющие примерно 10% поверхности, сканировали с целью выявления присутствия ярких при фазово-контрастной микроскопии клеток сразу после посева и еще раз спустя 48 ч, чтобы оценить выживаемость в процентах. Выживаемость клеток подтверждали витальным окрашиванием трипановым синим (не показано).

Интактные ИКС.

Ганглии высевали в 96-луночные планшеты, предварительно покрытые поли-Ь-орнитином и ламинином (5 мкг каждого/мл фосфатно-солевого буфера) в бессывороточной среде Ν2 (Войеп-Деш, е1 а1., Ргос. №111. Асай. 8с1. И8А, 1979, 76, 514-517, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме), содержащей 0,05% бычьего сывороточного альбумина (БСА), и поддерживали в течение 48 ч при 37°С и 5% СО₂ в увлажненной окружающей среде. Обрабатываемые ганглии получали воздействием либо 250 нМ соединения Ш-3, либо 20 нг/мл Ν6Ε через 2 ч после посева.

Соединение Ш-3 способствует выживаемости периферических нейронов эмбрионов цыплят зависимым от концентрации образом.

Удаление Ν6Ε из культур диссоциированных чувствительных нейронов ганглиев дорсальных корешков Э9 (ИКС) и нейронов симпатических ганглиев Э12 (86) приводило к тому, что они подвергались РСИ (запрограммированная гибель клеток) в течение 48 ч. Это предотвращали добавлением соединения Ш-3 в культуральную среду во время удаления Ν6Ε. При концентрации 1 мкМ соединение Ш-3 сохраняло 94% живых 86 нейронов и 89% живых ΌΚ6 нейронов через 48 ч (в обработанном Ν6Ε контроле: 86 65%; ΌΚ6 66%). Сходным образом соединение Ш-3 способствовало выживанию 76% зависимых от 6ΝΤΕ нейронов цилиарных ганглиев (С6) через 24 ч (в 6№ГГ-обработанном контроле 67%). В присутствии 10% сыворотки влияние соединения Ш-3 на выживаемость зависело от концентрации, при этом плато достигалось примерно при 1 мкМ для всех трех популяций нейронов (фиг. 16А-С). У выживших нейронов выявляли широкое разрастание нейритов, при этом нейриты были более толстыми и изогнутыми, по сравнению с контрольными культурами (фиг. 17Е-Н). Спустя четыре дня стимулирующая выживаемость активность еще сохранялась без изменения: ΌΚ6: соединение Ш-3 52%, обработанный фактором роста контроль 41%; 86: соединение Ш-3 83%, N6Ε-обработанный контроль 55%; С6: соединение Ш-3 58%, 6№ГР-обработанный контроль 50%). При оптимальных условиях культуры могут поддерживаться с соединением Ш-3 в течение одной недели и дольше (не показано).

Соединение Ш-3 способствует выживаемости эмбриональных мотонейронов цыплят зависимым от концентрации образом.

Культивируемые мотонейроны цыплят могут сохраняться и продолжать развиваться в присутствии мышечного экстракта, тогда как в отсутствии экстракта они быстро погибают. В экспериментах авторов через 48 ч в присутствии мышечного экстракта выживало 65% мотонейронов, против 14% в необработанном контроле. В условиях отсутствия сыворотки максимальный эффект соединения Ш-3 был при 300 нМ, и он был несколько выше (79%), чем эффект, индуцируемый мышечным экстрактом. Концентрационная зависимость влияния соединения Ш-3 на выживаемость в этой системе отличается от таковой для периферических нейронов, так как концентрации соединения Ш-3 выше 300 нМ оказывали постепенное понижающее действие (фиг. 16А). Это могло свидетельствовать об особой чувствительности мотонейронов к одной из сторон активности соединения Ш-3. Морфологически мотонейроны, спасенные с помощью соединения Ш-3, выглядели яркими клеточными тельцами при фазовом контрасте, и были способ

- 35 006648 ны распространять длинные нейриты, которые выглядели немного толще, чем нейриты, индуцированные мышечным экстрактом (фиг. 17). После четырех дней культивирования 56% мотонейронов выживали в присутствии соединения Ш-3 по сравнению с 42% в присутствии мышечного экстракта. При 300 нМ обработанные соединением III нейроны выживали ίη νίίΓο, по меньшей мере, неделю (не показано).

Соединение Ш-3 стимулирует отрастание нейритов от интактных ганглиев дорсальных корешков.

Результаты описанных выше экспериментов свидетельствуют о том, что соединение Ш-3 не только повышает выживаемость эмбриональных нейронов периферической и центральной нервных систем, но также приводит к мощному отрастанию нейритов. Многие из этих отростков выглядят более толстыми, чем отростки, выявляемые в присутствии факторов роста (сравни фиг. 17А-Э с фиг. 17Е-Н). Этот эффект также наблюдался при отрастании нейритов, выявляемом в интактных эмбриональных ганглиях дорсальных корешков, культивируемых в присутствии 250 нМ соединения Ш-3 (фиг. 18С). Нейриты отрастали как в ответ на ΝΟΕ (фиг. 18В), так и в ответ на соединение Ш-3; нейриты, вытягивающиеся при действии ΝΟΕ, были намного тоньше и более разветвленными, чем нейриты, отрастающие в присутствии соединения Ш-3, которые выглядели толстыми и могли быть в виде пучка.

Пример 36. Обработка ίη νίνο.

Регулируемая в ходе развития гибель мотонейронов в эмбрионах цыплят.

Данный эксперимент детально описан в работе 61юк8тащ еί а1., ί. №игоЬю1., 1998, 35, 361-370, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме. На Э6 делали окно в скорлупе куриных яиц (Зракам, ΡϊΌδΙοη, СТ) и непосредственно в оболочку хориоаллантоиса, пронизанную кровеносными сосудами, вводили либо наполнитель (5% 8ο1ιιΙο1'™ Н8 15, полиэтиленгликоль 660 гидроксистеарат; ВА8Е Ак^1^^11^1136, ^ибν^дкйаίеη, Сегтаиу (в фосфатно-солевом буфере, рН 7,2), либо определенную дозу соединения Ш-3 в наполнителе один раз в сутки с Э6 по Э9, как описано в работе ОрреηΗе^т, еί а1., 8с1еисе, 1991, 251, 1616-1617, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме. Эмбрионы умерщвляли на Э10 и извлекали их спинной мозг, фиксировали в растворе Сатоу (10% ледяная уксусная кислота, 60% абсолютный этанол, 30% хлороформ), обрабатывали для получения серийных парафиновых срезов и красили тионином. В каждом 20-м срезе поясничных сегментов 1-8 проводили подсчет в соответствии с ранее описанными критериями (С1агке, еί а1., Мебюбк Ση Се11 Вюкду: Се11 Оеа1к 1995, 8с11\уаг1 & О^те, Ебк., Асабетю Ргекк, №\ν ΥογΕ, рр. 277-321, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме).

Регулируемая в ходе развития гибель мотонейронов у крыс в неонатальном периоде.

Крыс 8ргадие-Оа^1еу с разным сроком беременности получали от Наг1аи Ьа^гакпек

ΕΝ). Крысят женского пола ежедневно инъецировали подкожно (8С) над перинеальными мышцами, являющимися мишенью, соединением Ш-3 в 5% 8ο1υίο1™ Н8 15 или одним наполнителем, начиная со дня рождения (П1) и продолжая в течение 5 дней (П5). На П10 или П60 крысят декапитировали, собирали кровь в капиллярные пробирки с гепарином, и после перфузии животных раствором соли/формалином вырезали область спинного мозга, содержащую спинальные ядра Ьи1Ьοсаνетοкик (8ΝΉ), по которым наблюдается половой диморфизм, и перинеальную область, содержащую мышцы Ьи1Ьοсаνетοкик (ВС) и куа-кг аш (ЬА). Район спинного мозга, содержащий 8ΝΕ, вторично фиксировали, заливали в парапласт, делали срезы толщиной 10 мкм, и красили крезиловым фиолетовым (Сгеку1есЫ νίοΚί) (Шгбееи, еί а1., 8с1е1'1се, 1985, 229, 671-673, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме). Мотонейроны подсчитывали при х500 увеличении в серийных срезах спинного мозга от поясничного района 5 до крестцового района 1, как описано ранее (Шгбееи, еί а1., выше). Подсчет под микроскопом исследователь делал на закодированных срезах вслепую, не зная обработанные группы. Подсчет мотонейронов корректировали с учетом размера клеток и толщины срезов (работа Кοη^кдкта^к, Сοηίетрο^а^у Кекеагсй Мебюбк ίη Nеи^οаηаίοту, №ш1а & ЕЬЬектощ Ебк., 1970, 8ргшдег-Уег1ад, №\ν ΥογΕ, рр. 315-340, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме) и статистический анализ проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа (АЫОУА). Перинеальную мускулатуру повторно фиксировали, декальцинировали, заливали в парапласт, нарезали на секции по 10 мкм, и красили трихромом по Миллигану. Используя светло-польную микроскопию (Х250) с уверенностью идентифицировали мышцы ВС и ЬА нормальных самок и самок, обработанных соединением Ш-3 (405 животных/группу), как по их положению, так и по наличию полосатых волокон. Очерчивали контур мышечной ткани, отделяя от смежных секций, используя проекционный микроскоп (62,5), и площадь поперечного сечения измеряли, используя планшетный цифратор и компьютеризированную морфометрическую систему ^дтакса^ 1аибе1 8с1еЩ1Пс). Объем мышцы рассчитывали, определяя общую площадь поперечного сечения и умножая ее на толщину среза, и корректируя по процентной доле структуры, отобранной в качестве образца.

Собранную кровь центрифугировали в течение 5 мин при комнатной температуре; затем извлекали плазму и хранили при -20°С. Уровни тестостерона в сыворотке (6-7 животных/группу) измеряли с помощью радиоиммуноанализа, следуя процедуре, представленной в работе \УтдПе1б, еί а1., 8ίе^ο^бк, 1975, 26, 311-327, включенной здесь в виде ссылки в полном объеме.

Индуцированная аксотомией дифференцировка мотонейронов у взрослых крыс.

Левый подъязычный нерв был перерезан в шее взрослых самок крыс 8ргадие-Эает1еу (120-180 г) при анестезии неймбутолом (№итЬиЮ1), и 50 мкл соединения Ш-3 или его наполнителя (5% 8ο1υίο1™

- 36 006648

Н8 15) наносили на кусочек 6е1£оат™ (А1 Виск, О\утд5 МШ§, МО), затем обматывали вокруг проксимального конца перерезанного нерва. Через 7 дней животных анестезировали и перфузировали 4% параформальдегидом в буфере Соренсона, 0,07 М фосфат, рН 7,2. Ствол мозга извлекали и в криостате нарезали коронарные срезы толщиной 40 мкм (работа СЫи, е1 а1., ЫеигоКерой, 1994, 5, б93-б9б, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме). Каждый пятый срез обрабатывали для иммуногистохимического анализа ХАТ, как описано ранее (работа СЫи, е1 а1., 1. Сотр. Ыеиго1., 1993, 328, 351-3б3, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме), используя анти-ХАТ моноклональное антитело, полученное от С11е тисов, в разведении 1:350. Подсчитывали клетки, которые были окрашены явно интенсивнее фона на окрашенных срезах; количество подсчитанных клеток выражали в виде отношения количества ХАТ-иммунореактивных клеток на стороне подъязычного ядра, где проводили аксотомию, к количеству иммунореактивных клеток на контрольной (неповрежденной) стороне.

Соединение ΙΙΙ-3 спасало мотонейроны эмбрионов крыс от гибели в результате апоптоза ίη νίίΐΌ, и ингибировало сигнальный путь, приводящий к активации ίΝΙ<1 в этих клетках (работа Магопеу, е1 а1., ί. Ыеиго8с1, 1998, 18, 104-111, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме). Для определения потенциальной активности ίη νί\Ό соединение ΙΙΙ-3 оценивали в двух моделях регулируемой в ходе развития запрограммированной гибели мотонейронов и в модели индуцируемой аксотомией дедифференцировки мотонейронов взрослого организма. У цыплят примерно 50% спинномозговых мотонейронов подвергается Ρί,Ό в течение Э5-10 (НатЬигдег, е1 а1., ί. Ыеигокск, 1982, 1 38-55; Риггех, е1 а1., Вобу апб Вгат: А ТгорЫс Тйеогу о£ Ыеига1 СоппесБопк, 1988, Нагтагб иштегДу Рге§8, СашЬпбде, МА, обе работы включены здесь в виде ссылок в полном объеме). Внесение соединения ΙΙΙ-3 в оболочку хориоаллантоиса во время этого периода предотвращало гибель мотонейронов дозозависимым образом (фиг. 19). Сорок процентов мотонейронов, которые в обычных условиях погибли бы, были спасены при двух самых высоких тестированных дозах (2,3 и 7 мкг/сутки), в то время как при более низких дозах (1,2 и 1,8 мкг/сутки) было спасено 25% мотонейронов (фиг. 19).

Во время раннего перинатального периода жизни самок крыс (от поздней эмбриональной стадии до 4 дня постнатального развития (ПН)), более 50% мотонейронов в 8ЫВ элиминируют в результате РСЭ (работа Вгееб1оуе, ί. ЫеигоЫок, 198б, 17, 157-17б, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме). У самцов мотонейроны в этом ядре иннервируют поперечно-полосатые мышцы полового органа, вовлеченные в копулятивные рефлексы. Секреция андрогенных стероидов семенниками снижает гибель мотонейронов 8ЫВ у самцов и предотвращает обширную атрофию ВС и ЬА мышц, иннервированных нейронами. Введение тестостерона крысятам женского пола приводило к полностью сходному с мужскими особями количеству мотонейронов 8ЫВ (Ыогбееп, е1 а1., выше) и предотвращало атрофию ВС и ЬА мышц (работа ХУаипап, е1 а1., Епбосгто1оду, 1941, 29, 955-978, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме). Ежедневное подкожное введение соединения ΙΙΙ-3 (ПН 1-5) самкам крыс значительно ослабляло гибель мотонейронов (фиг. 20 А). Спасение мотонейронов 8ЫВ от гибели с помощью соединения ΙΙΙ-3 происходило при двух дозах (0,5 и 1 мг/кг в сутки). При максимально эффективных дозах 0,5 и 1 мг/кг в сутки введение соединения ΙΙΙ-3 приводило к повышению выживаемости мотонейронов на 70%, что эквивалентно действию тестостерона (фиг. 20А). Соединение ΙΙΙ-3 не изменяло уровни тестостерона в плазме обработанных самок. Радиоиммунологическое измерение уровней тестостерона в плазме в группе животных, которым вводили 1 мг/кг в сутки, не давало значительной разницы по сравнению с контрольной группой, которой вводили наполнитель (0,01б ± 0,008 нг/мл и 0,029 ± 0,015 нг/мл стандартная ошибка средней (8.Е.М) соответственно).

Чтобы определить, эффективна ли обработка соединением ΙΙΙ-3 для долговременного поддержания выживаемости мотонейронов, самок обрабатывали соединением ΙΙΙ-3 (0,5 и 1 мг/ кг в сутки) в течение того же периода времени ПН (1-5). Половину животных, которым вводили наполнитель, и половину животных из обеих обработанных групп забивали на ПН 10. Оставшихся животных поддерживали затем без дополнительной обработки соединением ΙΙΙ-3 до забоя на ПНб0. Как отмечено ранее (фиг. 20А) обработка соединением ΙΙΙ-3 приводила к повышению выживаемости мотонейронов на 70% (фиг. 20В). Более того, 100% этих спасенных мотонейронов можно было идентифицировать морфологически через 55 дней после последней обработки соединением ΙΙΙ-3 (фиг. 20В). Ингибирование гибели мотонейронов соединением ΙΙΙ-3 во время неонатального периода давало возможность мотонейронам дожить до взрослого состояния.

Несмотря на четко обнаруживаемые и разрушительные воздействия потери мотонейронов при заболеваниях у взрослых людей, таких как боковой амиотрофический склероз, мотонейроны взрослого организма в большинстве моделей повреждения мотонейронов у животных резистентны к гибели. Однако повреждение аксонов приводит к морфологическим (ОррепЪеш, е1 а1., выше), а также биохимическим изменениям (работы Оррепйет, е1 а1., выше; Кепбе е1. а1., ί. Сотр. Ыеигок, 1992, 319, 285-298, которые включены здесь в виде ссылок в полном объеме; работа СЫе, е1 а1., 1. Сотр. Ыеигок, 1993, 328, 351-3б3, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме) в мотонейронах взрослого организма, которые могут имитировать дегенеративное изменение, предшествующее гибели дегенерированных мотонейронов у больных. Один из примеров такого типа изменений является следствием аксотомии подъязычного нерва, который иннервирует язык. Одностороннее перерезание этого нерва у взрослой крысы приводило

- 37 006648 через 7 дней к потере 95% ХАТ-иммунореактивных подъязычных мотонейронов с той же стороны ядра (работа Οιίιι, е1 а1., №игоКероп, 1994, 5, 693-696, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме). Потеря ХАТ-иммунореактивности не была постоянной. Через четыре недели после аксотомии 100% мотонейронов восстанавливали контрольные уровни ХАТ-иммунореактивности (работа Вогке, е1 а1., 1. №игосу1о1., 1993, 22, 141-153, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме). ХАТиммунореактивность подъязычных мотонейронов на противоположной стороне не подвергалась воздействию (Οιίιι, е1 а1., выше) (фиг. 21 и табл. 5).

В том случае, когда накладывали Сейоат™ на проксимальный конец подъязычного нерва, соединение Ш-3 дозозависимым образом ослабляло снижение ХАТ-иммунореактивности в мотонейронах на той же стороне, анализируемых через 7 дней после аксотомии. Максимальная эффективная доза (50 мкг) приводила к увеличению на 40% количества ХАТ-иммунореактивных мотонейронов по сравнению с необработанным контролем, где проводилась аксотомия (фиг. 21В и табл. 5). Имелась колоколообразная дозовая зависимость как при более низких, так и при более высоких дозах, приводящая в результате к более высокой выживаемости, чем в необработанном контроле, но более низкой, чем достигалась при 50 мкг. Как подтверждено в модели 8ΝΒ, у этих животных ни при каких тестируемых дозах не было связанной с ними потери веса, смертности, или грубого повреждения ткани.

Соединение Ш-3 проявляло нейропротекторную активность в трех отдельных моделях дегенерации мотонейронов ш у1уо: регулируемой в ходе развития РСИ мотонейронов поясничного отдела спинного мозга у эмбрионов (фиг. 19), чувствительная к андрогенам гибель постнатальных мотонейронов 8ΝΒ (фиг. 20) и индуцируемая аксотомией потеря функционального маркера, ХАТ, в подъязычных мотонейронах взрослого организма (фиг. 21 и табл. 5). Соединение Ш-3 было эффективным при периферическом введении с помощью подкожной инъекции, при локальном нанесении на разрезанный конец нерва или при непосредственном нанесении на хориоаллантоисную оболочку эмбрионов цыплят. В противоположность исходной молекуле К-252а, соединение Ш-3 было примерно в пять раз более сильнодействующим в опосредовании выживаемости культур, обогащенных мотонейронами (данные не показаны) и не проявляло ингибирующей активности, направленной против тирозинкиназы 1гкА и нескольких серинтреониновых киназ (Магопеу е1 а1., выше; Капеко, е1 а1., 1. Мей. СНет., 1997, 40, 1863-1869, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме).

Таблица 5

Влияние соединения Ш-3 на холинацетилтрансферазную иммунореактивность подъязычных мотонейронов после аксотомии

		ХАТ-позитивные мотонейроны
Обработка	η	Эксперементальное/ Контрольное	%	Среднее/ Группа
наполнитель	2	20/544	3, 68	4,01
		19/437	4,35
3,6 мкг ΙΙΙ-3	2	55/420	13,10	12,84*
		72/572	12,59
25 мкг ΙΙΙ-3	2	95/597	15,91	19, 01’
		142/642	22,12
50 мкг Ш-3	2	188/484	38,84	41,34'
		278/637	43,85
100 мкг ΙΙΙ-3	4	465/920	50,54	32,61’
		235/784	29, 98
		178/770	23,12
		182/679	26,80
200 мкг ΙΙΙ-3	2	99/461	21,48	24,96*
		159/559	28,44
имитация операции	2	350/335	104,48	101,24
		292/298	98,00

- 38 006648

Соединение ΙΙΙ-3 или наполнитель добавляли в гелеобразной пене к проксимальному концу подъязычного нерва сразу же после его перерезания. Через 7 дней животных забивали и делали серийные срезы подъязычного ядра, и каждый пятый срез подвергали иммунному окрашиванию анти-ХАТ антителами. Подсчет ХАТ-позитивных нейронов проводили на той же стороне (экспериментальной) и на противоположной (контрольной) стороне ядра.

*р<0,05, статистически значимо по сравнению с контрольными обработанными наполнителем животными.

Ингибитор МЬК-3 пути проявляет эффективность ш у1уо и блокирует события фосфорилирования ниже по течению МЬК-3 в МРТР модели.

МРТР вводили в дозе (40 мг/мл), которая приводит к утрате допаминэргических окончаний полосатого тела и клеточных тел в черной субстанции. В качестве маркера допаминэргических нервных окончаний в черной субстанции использовали тирозингидроксилазу. Соединение ΙΙΙ-3 при систематическом введении снижало потерю иммунореактивных по тирозингидроксилазе нейронов черной субстанции после повреждения МРТР (фиг. 22А; 8ароп1о е1 а1., 1999). Так как соединение ΙΙΙ-3 известно как ингибитор МЬК3, измеряли активацию расположенного ниже по течению субстрата МЬК3 у обработанных МРТР мышей. Уровни фосфорилированного МКК4 измеряли с использованием специфичного для фосфоМКК4 антитела (№\ν Епд1апй Вю1аЬ§, Веуег1у, МА), которое узнает монофосфорилированную форму МКК4, либо с помощью иммуноблота (фиг. 22В), либо методом ЕЫ8А (фиг. 22С). Введение МРТР повышало уровни фосфорилированного МКК4 в черной субстанции более чем 5 раз по сравнению с уровнями в контроле (фиг. 22В). Пики повышения имели место через 4 ч после введения МРТР и совпадали по времени с пиками уровней МРР⁺ в ЦНС. Опосредованное МРТР фосфорилирование МКК4 снижалось в результате предварительной обработки 1-депренилом, что свидетельствует о том, что эти процессы фосфорилирования были опосредованы МРР⁺ (фиг. 22С). Более того, фосфорилирование МКК4 частично подавлялось предварительной обработкой соединением ΙΙΙ-3 в дозе (1 мг/кг), которая обеспечивает защиту от индуцированной МРТР потери допаминэргического звена черной субстанции полосатого тела (фиг. 22С). Эти данные служат доказательством того, что МРТР (МРР⁺) активирует МКК4, расположенный ниже по течению субстрат МЬК3. Более того, эти данные свидетельствуют о том, что известный ингибитор МЬК3 ингибирует активацию этого киназного пути ш у1уо.

Пример 37. Воспаление.

Индукция 1Ь-1 и Т№-а при действии ЛПС в клетках ТНР-1 и влияние индолокарбазолов и пирролокарбазолов на индукцию этих факторов.

Были выбраны клетки иммунной системы, так как многие киназы вовлечены в регуляцию многочисленных иммунологических функций, например индукцию синтеза цитокинов и индукцию биологического ответа цитокинов. В недавнем сообщении (НатЬ1е1оп, е1 а1., Ргос. N311. Асай. 8сЕ И8А, 1996, 93, 2774-2778, которое включено здесь в виде ссылки в полном объеме) показано, что обработка ЛПС, полученной на основе моноцитов линии клеток, вызывает быструю активацию 1ΝΧ активности. Когда моноциты вступают в контакт с бактериальными эндотоксинами, такими как липополисахарид (ЛПС), они продуцируют цитокины воспаления, 1Ь-1 и ΈΝΕ-α. Ингибирование продукции этих двух цитокинов может быть полезным при лечении некоторых воспалительных заболеваний иммунной системы. Эти цитокины можно легко измерить с помощью коммерческих наборов для ЕЫ8А. Авторы разработали эксперименты, чтобы определить (1) могут ли индоло- и конденсированные пирролокарбазолы ингибировать синтез 1Ь-1 и ТК’Р-а в имеющейся у авторов линии клеток моноцитов ТНР-1, (2) активируется ли 1ΝΧ при действии ЛПС в клетках ТНР-1 и (3) можно ли ингибировать активацию ЖК при действии ЛПС с помощью индоло- и конденсированных пирролокарбазолов.

Экспериментальные процедуры.

Клетки ТНР-1 выращивали в среде КРМ1 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. ЛПС (Е. сой серотип 0111.В4, экстрагированный ТХУ) приобретали от 8щта и растворяли в РВ8. Наборы ЕЫ8А для анализа 1Ь-1 и ТКЕ-а приобретали от ВоегЫпдег-МаппЬет, и анализы в культуральной среде ТНР-1 выполняли согласно указаниям изготовителя. В соответствии с указаниями при каждом анализе получали стандартные кривые.

Эксперименты проводили в 12-луночных планшетах для культивирования либо с 1, либо с 2 мл клеток ТНР-1 при плотности 4 х 10⁵ клеток/мл. 1Ь-1 и ТЕЕ-а индуцировали добавлением ЛПС в культуральную среду и после этого среду собирали в разные интервалы времени для анализа цитокинов. Клетки удаляли центрифугированием и надосадки замораживали при -70°С до проведения анализа. Чтобы минимизировать расходы, эксперименты выполняли в двух повторах культур и супернатанты из двух повторов объединяли после центрифугирования. Каждый объединенный надосадок анализировали дважды. Маточные растворы индоло- и конденсированных пирролокарбазолов в 100% ДМСО разбавляли до нужных концентраций либо средой, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, либо средой, содержащей 0,5 мг/мл БСА. Если не оговорено особо, соединения добавляли к клеткам ТНР-1 за 1 ч перед добавлением ЛПС.

Анализы активности Ж К проводили после иммунопреципитации белка Ж К из экстракта лизиро

- 39 006648 ванных клеток ТНР-1. Осажденные ТНР-1 клетки лизировали на льду в течение 15 мин в 500 мкл буфера Ргас (10 мМ трис-НС1, рН 7,5, 50 мМ №С1, 30 мкМ пирофосфата натрия, 1 мг/мл БСА, 1% тритон-Х100). Экстракт центрифугировали в течение 10 мин при 14 К и к надосадку добавляли 5 мкл ЖК антитела (8айа ί,'πιζ). Экстракт центрифугировали в роторной центрифуге в течение 60 мин при 4°С, добавляли 75 мкл промытой белок А-сефарозы (20% вес/объем в буфере Ргас) и экстракт центрифугировали еще 30 мин, чтобы связать комплекс, образованный антителом с белок А-сефарозой. Белок А-сефарозу дважды промывали буфером Ргас, один раз 20 мМ Нерек, рН 7,6, 20 мМ МдС1₂, 2 мМ ДТТ, затем инкубировали в течение 15 мин при 30°С в 30 мкл буфера для киназ (20 мМ Нерек, 20 мМ МдС1₂, 2 мМ ДТТ, 1 мкг рекомбинантного с-)ип, и 2 мкМ АТФ-у-³²Р, 2 мккюри). Реакцию останавливали добавлением 10 мкл 4 х δΌδ буфера для нанесения на гель, нагревали в течение 3 мин при 80°С и белки анализировали в 10% δΌδ-геле. Гель сушили, экспонировали с пластиной для прибора, регистрирующего радиоактивный фосфор (РНокрНоптадег), и радиоактивные полосы анализировали с помощью РНокрНоптадег.

Результаты первичных экспериментов показали, что ЛПС при концентрации 2 мкг/мл дает максимальный выход ΙΌ-1, и эта концентрация ЛПС была использована во всех последующих экспериментах. Минимальное время после добавления ЛПС для максимального выхода цитокинов определяли путем отбора аликвот среды для анализа в различные интервалы времени после добавления ЛПС. Первый эксперимент показал, что максимальный выход и ΙΌ-1 и ΤΝΕ-α достигается мене чем через 5 ч после добавления ЛПС. Так как самое раннее время сбора в первом эксперименте составляло 2,4 ч, второй эксперимент проводили, начиная отборы среды через 15 мин после добавления ЛПС. Результаты этого эксперимента, в котором анализировали только ΤΝΓ-α, показали, что его максимальный выход достигается через 3 ч после добавления ЛПС. Не обнаружено существенных количеств ΤΝΓ-α в среде до 90 мин после добавления ЛПС.

Быстрое достижение максимального выхода свидетельствовало об очень тесной регуляции синтеза 2 цитокинов - быстрого синтеза и быстрой понижающей регуляции. За 30 мин перед добавлением ЛПС культуры клеток обрабатывали либо актиномицином Д, ингибитором синтеза РНК, либо циклогексимидом, ингибитором синтеза белка. Среду собирали через 3 ч после добавления ЛПС и анализировали ΤΝΓα. Для индукции ΤΝΕ-α требуется и синтез новой РНК, и синтез нового белка, так как в среде клеток, обработанных и тем и другим ингибитором, не обнаружено ΤΝΕ-α.. Следующие эксперименты были выполнены для того, чтобы определить, будет ли соединение ΙΙΙ-3 ингибировать индукцию ΙΌ-1 и ΤΝΕ-α.. Соединение ΙΙΙ-3 ингибировало индукцию и Ш-1, и ΤΝΓ-α, при этом значения ИК₅₀ (ΙΟ₅₀) составляли 267 нМ и 139 нМ соответственно. Результаты этих экспериментов были получены на клетках в среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Так как анализы нейротрофической активности соединений в ткани спинного мозга и ткани базального отдела переднего мозга были выполнены в бессывороточной среде (500 мкг/мл БСА), было интересно определить значения Ιί.'₅₀ для ингибирования Ш-1 и ΤΝΕ-α. в бессывороточной среде. Когда клетки ТНР-1 обрабатывали соединением ΙΙΙ-3 в бессывороточной среде (500 мкг/мл БСА) Ш₅₀ было снижено в 10 раз с 269 нМ до 23 нМ. Если не оговорено особо, все эксперименты, выполненные далее, проводили в бессывороточной среде. Ингибирование индукции ΙΌ-1 и ΤΝΓ-α в клетках ТНР-1 соединением ΙΙΙ-3 свидетельствует о том, что соединение ΙΙΙ-3 может быть пригодно в качестве терапевтического средства при лечении патологических состояний, вызванных превышающей норму продукцией этих цитокинов. Таким состоянием является септический шок. Септический шок вызван ростом грамотрицательных бактерий в циркулирующей крови, которые последовательно высвобождают большие количества эндотоксина, ЛПС. Затем ЛПС сначала стимулирует моноциты и макрофаги для продукции больших количеств Ш-1 и ΤΝΓ-α, которые затем вызывают тяжелое повреждение ткани и во многих случая смерть.

Тестировали несколько соединений по их способности ингибировать ΤΝΓ-α и сравнивали со способностью ингибировать ЖК. Результаты показаны в табл. 6.

- 40 006648

Таблица 6

	ТНР-1 клетки	МЪКЗ, сверхэкспрессируемая в клетках Соз 7
Соединение	ΤΝΓ-α 1С50 нМ	ΤΝΚ % ингиб. 500 нМ	7ΝΚ % ингиб. 500 нМ
ΙΙΙ-1	49,5	93,5	83,8
ΙΙΙ-3	29	93	94
1-2	>5000	78, 5	85
1-3	366	80,5	93,7
1-4	75,5	79,5	95
1-5	514	89	97,2
1-6	817,5	77,5	57,8
1-7	1009	74	85,5
ΙΙΙ-4	4 62,5	81	66
ΙΙΙ-5	4	84, 5	96
ΙΙΙ-7	590,5	11,5	54
ΙΙΙ-8	11,5	51	94
ΙΙΙ-10	4298	48	78
1-10	4500	62	94
ΙΙΙ-11	686	51	92,5

Влияние соединения Ш-3 на индукцию Ш-2 в клетках 1игка1.

Были проведены эксперименты, чтобы определить, ингибирует ли соединение Ш-3 индукцию Гк-2 в клетках 1шкаЕ

Экспериментальные процедуры.

Клетки .Еигка! выращивали в среде ВРМI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. ΤΝΕ-α получали от Рготеда, и анти СЭ3 и анти СЭ28 антитела от РНашидем. Эксперименты с клетками 1игка1 проводили в 200 мкл в 96-луночном планшете. Гк-2 измеряли с помощью набора для ЕЬЕЗА, приобретенного в Воейгшдег Μαηπίκίιη. Антителам к СЭ3 и СЭ28 давали возможность связаться с пластиком 96-луночного планшета (18 ч в РВ8) перед добавлением клеток 1шкаЕ Клетки обрабатывали соединениями за 1 ч до добавления в покрытый антителами планшет. Чтобы активировать рецептор Т-клеток и индуцировать ΣΕ-2 использовали антитела к СЭ3 и СЭ28. ГЕ-2 высвобождался клетками 1игка1 между 6 и 24 ч после инициации индукции (фиг. 23А). Не было конститутивной продукции ^-2 (фиг. 23А, интактный контроль (ί,'ΝΤ)). Затем оценивали влияние соединения Ш-3 (1 часовая обработка соединением Ш-3 перед индукцией) на индукцию ΣΕ-2 (фиг. 23В). Соединение Ш-3 в концентрации 500 нМ ингибировало индукцию ΣΕ-2 более чем на 80% (фиг. 23В). Более широкий эксперимент по определению дозовой зависимости был выполнен с использованием соединения Ш-3 и соединения Ш, которые давали значения Κ.’₅₀ 1 39 нм для соединения Ш-3 и 207 нМ для соединения Е4 (фиг. 23С).

Подразумевается, что каждый из патентов, заявок и опубликованных изданий, упоминаемых в данном патентном документе, является, таким образом, включенным в виде ссылки в полном объеме.

Как будет понятно специалистам в данной области, могут быть сделаны многочисленные изменения и модификации предпочтительных вариантов изобретения без отступления от сущности изобретения. Подразумевается, что все такие вариации входят в рамки изобретения.

- 41 006648

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Магопеу, Аппа

УУаКоп, Κβνίη ΚηίςΜ,

Етез1 ОПскзтап,

Магае Οίοπηβ. Сга1д №Я, Ыюо1а <120> Способы модулирования киназных белков множественных линий и скрининга соединений, которые модулируют киназные белки множественных линий <130> СЕРН0431 <140>

<141>

<160>18 <170> Патент, версия 2.0 <210>1 <211>17 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: новая последовательность <400> 1 Суз О1у 61у А1а ТЬг Суз Суз А1а Суз Мя О1у Пе С1у А1а Туг Туг

5 10 15

ТЬг

- 42 006648 <210>2 <211>23 <212>Белок <213>Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: новая последовательность <400 2

О!у С1у А1а А1а ТЬг ТЬг Су® Су® А1а Тгр А1а О1у О1у А1а Су® Су® 15 10 15

А1а$егА1а Су® Αη$ ТЬг Су® <2103 <211>33 <212>Белок <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: новая последовательность <400 3

Су® 01у О1у А1а ТЬг Су® Су® Агв ТЬг Не Су® А1а Туг Мес С1у Пе 15 10 15

О1у А1а Туг Туг ТЬг Пе О1у Су5 Пе 01у Су® Пе Мес 01у Пе А1а 20 25 30

А1а

- 43 006648 <2104 <211>30 <212>Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: новая последовательность <400>4

О1у О1у А1а А1а Тйг ТЬг Пе А1а Туг Не 01у 01у А1а Тгр А1а Не 1 5 10 15

61у Тгр Суз Суз А1а Не А1а Суз Агд ТЬг Суз Не 5ег Тгр ' 25 30 <210>5 <211>10 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: новая последовательность <400> 5

Мс!01и (Ии С1и С1и Туг Ме( Рго Ме! 61и

5 10 <2106 <211>24

- 44 006648 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: новая последовательность <400 6

8188С*818С ЗВвсацсод ссав 24 <210>7 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: новая последовательность <400> 7

Зздасссгвв { 21 <210>8 <211>9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: новая последовательность <400 8

- 45 006648

Ме» Азр Туг Ьуз Азр Азр Азр Азр ίνβ

5 ' <210*9 <211*27 <212*ДНК <213* Искусственная последовательность <220* <223* Описание искусственной последовательности: новая последовательность <400* 9 сгдассДО асассадов даассп 27 <210*10 <211*28 <212>ДНК <213* Искусственная последовательность <220* <223* Описание искусственной последовательности: новая последовательность <400*

<210*11 <211*33 <212* ДНК

- 46 006648 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности; новая последовательность <400> 11 а£ааиср£ схавсвссад а§1с1авсс§ 33 <210>12 <211>39 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: новая последовательность <400 12

<210 13 <211>8 <212>Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: новая последовательность <400> 13

- 47 006648

Азр Туг Ьу5 Азр Азр Азр Азр Ьуз

I 5 ' <21014 <211>69 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: новая последовательность <400 14 агааадспс сададдсса! здасгасаав васвасвмв асаадосод ссгссаг^аа 60 асссвааса 69 <210> 15 <211>18 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: новая последовательность <400> 15

Засавздсдо содсш 18 <210> 16 <211>583

- 48 006648 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: новая последовательность <400> 16 ваапсввса сдававвзсх с$саод№ сздсзасдо 88^с18Р88а ссееесавст 60 ваассавсвв ЗДздсаит тссссавсаа сшсодасс ссвсвсавсв сспсксав 120 ссвс<всса8 ^ссс88^с88^с8 здассссав т^стасссв сссапса^т Доадоаи 180 (ВаППвсв вазосаса едаавадос 1апввсахс ΒΒΒδί⁰¹^ Шаавдеста 240 кювете ^а18^а88^п8^с одааа&са всшвссасв ассодадо 300

Всассссаас акапвссс (аааавхМ ацпесрав {вдсссаасс 1с1всГ1££1420 саодаДО засодвд васстдаа (ававТрта шщаааа вваиссссс 480 аваса*сств доааПздв «досада1В^сса8^а888 я1в»аняс1 тасагдадо 540

583 <210> 17 <211>194 <212>Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: новая последовательность

- 49 006648 <400> 17

Азп Зег А1а Аг₈ С1и Азр Зег С1п Уа1 Зег 01у Азр 01и СНу Тгр Тгр

10 15

ТЬг О1у О1п Ьеи Азп О1п Аг® Уа! О1у Пе РЬе Рго Зег Азп Туг Уа! 20 2530 '

ТЬг Рго Аге Зег А1а РЬе Зег Зег Агв Суз О1п Рго О1у О1у С1и Азр 35 4045

Рго Зег Су5 Туг Рго Рго Пе СНп Ьеи Ьеи СНи Пе Азр РЬе А1а 01« 50 5560

Ьеи ТЬг Ьеи СНи О1и Пе Пе СНу Пе О1у О1у РЬе О1у Ьуз Уа1 Туг

70 758(?

Аге А1а РЬе Тгр Пе О1у Азр О1и Уа! А1а Уа1 Ьуз А!а А1а Аге Н1з «5 9095

Азр Рго Азр О1и Азр Пе Зег О1п ТЬг Пе СНи Азп Уа1 Аг? С1п СНи 100 105110

А1а Ьуз Ьеи РЬе А1а Мег Ьеи Ьуз Шз Рго Азп Пе Пе А1а Ьеи Агв 115 120125

СИу Уа1 Суз Ьеи Ьуз О1и Рго Азп Ьеи Суз Ьеи Уа1 Мег О1и РЬе А1а 130 135140

Ατ^ΟΙν О1у Рго Ьеи Азп Агв Уа1Ьеи5етО1у Ьуз Агв Пе Рго Рго 145 150 155160

Азр Пе Ьеи Уа! Азп Тгр А1а Уа! С1п Пе А1а Аг® О1у Мег Азп Туг 165 170175

Ьеи Н1з Азр СНи А1а Пе Уа1 Рго Пе Пе Нгз Агв Азр Ьеи Ьуз Зег 180 185190

Зет Азп <210>18 <211>8 <212>Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

новая последовательность <400> 18

Азр Туг Ьуз Азр Азр Азр Азр Ьуз

I 5

Claims (26)

1. Способ идентификации соединения, которое модулирует активность киназного белка множественных линий и повышает выживаемость клеток, включающий в себя следующие этапы:

- 50 006648 (a) контактирование указанной клетки, содержащей указанный киназный белок множественных линий, с указанным соединением;

(b) определение того, снижает ли указанное соединение активность указанного киназного белка множественных линий; и (c) определение того, повышает ли указанное соединение выживаемость клеток.

2. Способ идентификации соединения, которое модулирует активность киназного белка множественных линий и повышает гибель клеток, включающий в себя следующие этапы:

(a) контактирование указанной клетки, содержащей указанный киназный белок множественных линий, с указанным соединением;

(b) определение того, повышает ли указанное соединение активность указанного киназного белка множественных линий; и (c) определение того, повышает ли указанное соединение гибель клеток.

3. Способ идентификации соединения, которое может быть пригодно для лечения нейродегенеративного состояния, включающий в себя осуществление контакта клетки или клеточного экстракта, содержащего киназный белок множественных линий, с соединением, и определение того, снижает ли указанное соединение активность указанного киназного белка множественных линий.

4. Способ идентификации соединения, которое может быть пригодно для лечения воспаления, включающий в себя осуществление контакта клетки или клеточного экстракта, содержащего киназный белок множественных линий, с соединением и определение того, снижает ли указанное соединение активность указанного киназного белка множественных линий.

5. Способ по п.1, при котором указанный белок выбран из группы, состоящей из киназы множественных линий 1, киназы множественных линий 2, киназы множественных линий 3, киназы, несущей лейциновую молнию, киназы, несущей двойную лейциновую молнию, и киназы множественных линий 6.

6. Способ по п.2, при котором указанный белок выбран из группы, состоящей из киназы множественных линий 1, киназы множественных линий 2, киназы множественных линий 3, киназы, несущей лейциновую молнию, киназы, несущей двойную лейциновую молнию, и киназы множественных линий 6.

7. Способ по п.3, при котором указанный белок выбран из группы, состоящей из киназы множественных линий 1, киназы множественных линий 2, киназы множественных линий 3, киназы, несущей лейциновую молнию, киназы, несущей двойную лейциновую молнию, и киназы множественных линий 6.

8. Способ по п.4, при котором указанный белок выбран из группы, состоящей из киназы множественных линий 1, киназы множественных линий 2, киназы множественных линий 3, киназы, несущей лейциновую молнию, киназы, несущей двойную лейциновую молнию, и киназы множественных линий 6.

9. Способ по любому из пп.5-8, при котором указанную клетку подвергают контакту ίη νίίτο.

10. Способ по любому из пп.5-8, при котором указанную клетку подвергают контакту ίη νίνο.

11. Способ по любому из пп.5-8, при котором указанная активность белка определяется с помощью анализа киназ ίη νίίτο или анализа связывания.

12. Способ по любому из пп.5-8, при котором указанной клеткой является нервная клетка.

13. Способ по любому из пп.5, 7 или 8, при котором указанную активность белка определяют путем измерения активности или уровня фосфорилирования субстрата указанного белка.

14. Способ по п.6, при котором указанную активность белка определяют путем измерения активности субстрата указанного белка.

15. Способ по п.13 или 14, при: котором указанный субстрат выбран из группы, состоящей из ίΝΙ<Ε Л\1К2, 1МК3, ЕКК1, ЕКК2, р38а, р38в, р38у, р38З, МЕК1, МЕК2, МКК3, МКК4 (8ЕК1), МЕК5, МКК6, МКК7, _)ип, АТЕ2, ЕЬК1 и гомолога АЕХ-3 млекопитающих.

16. Способ по любому из пп.5, 7 или 8, при котором указанная активность белка определяется путем измерения активности субстрата указанного белка, количества субстрата указанного белка или мРНК, кодирующей указанный субстрат указанного белка.

17. Способ по п.6, при котором указанная активность белка определяется путем измерения активности субстрата указанного белка, количества указанного белка или мРНК, кодирующей указанный белок.

18. Способ по п.5 или 6, где указанное повышение выживаемости или гибели клеток определяется путем использования клеток с повышенным риском гибели и сравнения количества живых клеток, которые подвергались контакту с указанным соединением, с количеством живых клеток, которые не контактировали с указанным соединением.

19. Способ по любому из пп.7, 8 или 18, при котором указанными клетками являются первичные эмбриональные клетки мотонейронов.

20. Способ по любому из пп.7, 8 или 18, при котором указанные клетки сверхэкспрессируют указанный киназный белок множественных линий.

21. Способ по п.5, при котором указанное повышение выживаемости клеток определяется путем

- 51 006648 наблюдения за уменьшением апоптоза.

22. Способ по п.6, где указанное повышение гибели клеток определяется путем наблюдения за увеличением апоптоза.

23. Способ по любому из пп.5, 6 или 7, при котором указанная клетка вовлечена в нейродегенеративное заболевание.

24. Способ по п.8, при котором указанная клетка вовлечена в воспаление.

25. Способ модуляции активности киназного белка множественных линий, включающий контактирование указанного белка или клетки, содержащей указанный белок, с соединением, имеющим формулу где Ζ₁ и Ζ₂ представляют собой Н или Ζ₁ и Ζ₂, взятые вместе, представляют собой =О;

К представляет собой ОН или ОСН₃;

Х представляет собой СО2СН3 или СО2(СН2) 4СН3;

К! выбран из Н, СН₂8СН₂СН₃, МНСОМНС₂Н₅, СН₂ОСН₂ОСН₂СН₃, Вг и СН₂СН₂8СН₃;

К₂ выбран из Н, СН₂8СН₂СН₃, МНСОМНС₂Н₅, СН₂СН₂(2-пиридил), СН₂ОСН₂ОСН₂СН₃, СН₂ОН, Вг, Ι и СН₂СН₂8СН₃.

26. Способ модуляции активности киназного белка множественных линий, включающий контактирование указанного белка или клетки, содержащей указанный белок, с соединением, имеющим формулу где кольцо В и кольцо Е, независимо и каждое вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, выбраны из группы, включающей:

а) ненасыщенное 6-членное карбоциклическое ароматическое кольцо, в котором от 1 до 3 атомов углерода могут быть заменены атомами азота;

А1, А₂, К₁, К₃, К₅ и К₆ являются Н;

В₁ и В₂ вместе представляют собой О;

К₂ представляет собой СН₂СН₂ОАс;

К₄ представляет собой СН₂СН₂ (2-пиридил) и

Х представляет собой СН₂, или

А!, А₂, К₁, К₃, К₅ и К₆ являются Н;

В₁ и В₂ вместе представляют собой О;

К₂ представляет собой Н;

К₄ представляет собой СН₂СН₂ (2-пиримидинил) и

Х означает СН₂, или

А1, А₂, К₁, К₃ и К4 являются Н;

В1 и В2 вместе представляют собой О;

К₂ представляет собой СН₂СН₂ОН;

К₅ и К₆ представляют собой ОСН₃ и

Х означает СН₂, или

А!, А₂, К₁, К₃, К₅ и К₆ являются Н;

В₁ и В₂ вместе представляют собой О;

К₂ представляет собой СН₂СН₂ОАс;

К₄ представляет собой Вг и

Х означает СН₂; или

А1, А₂, К₁, К₃, К₅ и К₆ являются Н;

В1 и В2 вместе представляют собой О;

К₂ представляет собой СН₂СН₂ОАс;

К₄ представляет собой СН₂СН₂(2-пиридил);

- 52 006648

X означает СН₂, или

А₁, А₂, К₁, К₃, К₄, К₅ и К₆ являются Н;

В1 и В2 вместе представляют собой О;

К2 представляет собой СН2СН2ОН и

X означает СН₂, или

А₁₅ А₂, Кд, К₃, К_д, К₅ и К₆ являются Н;

В1 и В2 вместе представляют собой О;

К2 представляет собой СН2СН2СН2ОН и

X означает СН₂, или

А₁, А₂, К₁, К₂, К₃, Кд, К₅ и К₆ являются Н;

В1 и В2 вместе представляют собой О и

X означает 8, или

А!, А₂, К!, К₃, Кд, К₅ и К₆ являются Н;

В₁ и В₂ вместе представляют собой О;

К₂ представляет собой СН₂СН₂СН₂ХНСО(4-(ОН)РК) и

X означает СН₂, или

А₁, А₂, К₁, К₃, К₅ и К₆ являются Н;

В1 и В2 вместе представляют собой О;

К2 представляет собой Н;

К4 представляет собой СН2СН2(2-пиримидинил) и

X означает СН₂, или

А₁, А₂, К₁, К₂, К₃, К₅ и К₆ являются Н;

В1 и В2 вместе представляют собой О;

К4 представляет собой СН2СН2(2-пиридазинил) и

X означает СН₂, или

А₁, А₂, К₁, К₃, К₅ и К₆ являются Н;

В₁ и В₂ вместе представляют собой О;

К₂ представляет собой Н;

К4 представляет собой СН2СН2(2-пиридил) и

X означает СН₂, или

А₁, А₂, К₁, К₃, Кд, К₅ и К₆ являются Н;

В1 и В2 вместе представляют собой О;

К₂ представляет собой (СН₂)₃NΗ-С(=Ο)-3,5-дигидроксифенил и X означает СН₂, или

А₁, А₂, К₁, К₃, К_д, К₅ и К₆ являются Н;

В₁ и В₂ вместе представляют собой О;

К2 представляет собой бензоил и

X означает СН₂, или

А₁, А₂, К₁, К₂, К₃, К₅ и К₆ являются Н;

В₁ и В₂ вместе представляют собой О;

К₄ представляет собой СН=СН-С^ и

X означает СН₂.