JPWO2008041767A1 - ＡｕｒｏｒａＡ阻害剤の薬効を予測又は診断する遺伝子・タンパク質マーカー - Google Patents
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Abstract
【課題】Aurora A阻害剤を生体に投与した場合に、Aurora A特異的に当該阻害剤が作用したか否かを検出する遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを提供すること、及び、当該遺伝子マーカー又はタンパク質マーカーを用いたAurora A阻害剤の薬効の予測又は診断方法を提供することを目的とする。【解決手段】Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断する遺伝子・タンパク質マーカーであって、当該遺伝子が、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子又は該遺伝子と実質的に同等の機能を有する遺伝子である、遺伝子・タンパク質マーカー、及び、これを用いたAurora A阻害剤の薬効の予測又は診断方法。【選択図】なし
Description
本発明は、Aurora（オーロラ） A阻害剤の薬効を予測又は診断する遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーに関する。また、当該遺伝子マーカー又はタンパク質マーカーを用いたAurora A阻害剤の薬効の予測又は診断方法に関する。
近年、ヒトゲノム計画の進展により、薬物感受性の個人差を遺伝子レベルで理解し、医薬の開発に応用する薬理ゲノミクス（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）が急速に進展している。薬物感受性の個人差を遺伝子レベルで判断できるようになれば、投与する薬剤を真に薬効の期待できる患者だけに治療の初期から適切に投薬する、いわゆるオーダーメイド医療が可能となる。その結果、患者に無用の負担を強いることもなくなり、また、近年高騰する傾向にある医療費の削減にも寄与することとなる。中でも、抗癌剤は非常に強い副作用を有する場合が多く、オーダーメイド医療が強く望まれている。
また、個々人の疾患関連遺伝子の分子レベルでの解析が可能となることによって、同じ疾患であっても原因となるメカニズムが異なる場合に、そのメカニズムに応じた投薬をすべきであり、かかる投薬により、副作用を避け有効な治療や予防を行うことが可能となる。
一方、Aurora Aは、酵母からヒトに至るまで種を超えて存在し、細胞分裂の制御に不可欠な役割を担うキナーゼとして知られている。Aurora AはKimuraら（非特許文献１）、Senら（非特許文献２）及びZhouら（非特許文献３）によって単離された403アミノ酸のキナーゼで、Aik、STK15又はARK1等とも称される（NM_003600、NM_198433、NM_198434、NM_198435、NM_198436及びNM_198437）。Senらは、Aurora Aを、乳癌細胞において高頻度に増幅が生じており染色体の20q13に位置する遺伝子として同定し、また、Zhouらは、乳癌細胞のみならず、卵巣細胞、結腸細胞、前立腺細胞、神経芽細胞腫等にも強く発現していることを見出している。さらに、Zhouらは、Aurora Aを過剰発現させたNIH3T3細胞において、中心体の異常増幅や形質転換が生じることから、Aurora Aが癌遺伝子として機能していると考えている。従って、Aurora Aは、抗癌剤の標的遺伝子として研究が進められており、例えば、特許文献１には、Aurora（特にAurora A）キナーゼ阻害活性を有するキナゾリン誘導体が開示されている。
しかしながら、Aurora A阻害剤を生体に投与した場合に、Aurora A阻害剤の効果を検出するマーカーは未だ知られていないのが現状であった。
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、Aurora A阻害剤を生体に投与した場合に、Aurora A特異的に当該阻害剤が作用したか否かを検出する遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを提供することを目的とする。また、当該遺伝子マーカー又はタンパク質マーカーを用いたAurora A阻害剤の薬効の予測又は診断方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、Aurora A阻害剤の投与によって、組織におけるAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2遺伝子の発現量が変化することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の遺伝子マーカーは、Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断する遺伝子マーカーであって、当該遺伝子が、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子であることを特徴とする。かかる遺伝子マーカーにより、簡便且つ非侵襲的にAurora A阻害剤の薬効の予測又は診断を行うことが可能となる。
また、本発明の遺伝子マーカーは癌の治癒成績を判定する遺伝子マーカーであって、当該遺伝子が、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子であることを特徴とする。かかる遺伝子マーカーにより、簡便且つ非侵襲的にAurora A阻害剤による癌の治癒の結果や経過を評価することが可能となる。
また、本発明の癌診断キットは、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子を検出可能なPCRプライマーを含むことを特徴とする。かかる癌診断キットにより、簡便且つ非侵襲的にAurora A阻害剤による癌の診断や治癒経過の把握が可能となる。ここで、前記PCRプライマーとして、配列番号１及び２のPCRプライマーからなるプライマーセット、配列番号４及び５のPCRプライマーからなるプライマーセット、配列番号７及び８のPCRプライマーからなるプライマーセット、配列番号１０及び１１のPCRプライマーからなるプライマーセット又は配列番号１３及び１４のPCRプライマーからなるプライマーセットを用いることができる。
さらに、本発明のDNAマイクロアレイは、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子の部分ヌクレオチドを備え、Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断に用いることを特徴とする。かかるDNAマイクロアレイを用いることにより、本発明の遺伝子マーカーを含む複数の遺伝子について同時に評価を行うことが可能となり、迅速な薬効の予測や診断が可能となる。
また、本発明のタンパク質マーカーは、Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断するタンパク質マーカーであって、当該タンパク質が、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質であることを特徴とする。かかるタンパク質マーカーにより、タンパク質レベルでの発現量の評価が可能となり、遺伝子の単離をすることなく薬効の予測や診断が可能となる。
また、本発明のタンパク質マーカーは、癌の治癒成績を判定するタンパク質マーカーであって、当該遺伝子が、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質であることを特徴とする。かかるタンパク質マーカーにより、タンパク質レベルでの発現量の評価が可能となり、遺伝子の単離をすることなく癌の治癒成績を評価することが可能となる。
また、本発明の癌診断キットは、上述したタンパク質マーカーを検出可能な抗体を含むことを特徴とする。
さらに、本発明の抗体アレイは、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質の抗体を備え、Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断に用いることを特徴とする。かかる抗体アレイを用いることにより、本発明のタンパク質マーカーを含む複数のタンパク質について同時に評価を行うことが可能となり、迅速な薬効の予測や診断が可能となる。
また、本発明のAurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法は、Aurora A阻害剤を投与した被検体由来の組織におけるAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子を検出する検出工程と、Aurora A阻害剤投与前後の発現量を比較する比較工程を含むことを特徴とする。かかる方法により、簡便且つ非侵襲的にAurora A阻害剤の薬効の予測又は診断を行うことが可能となる。
また、本発明のAurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法は、前記検出に用いる検出手段がPCR又はDNAマイクロアレイであることを特徴とする。
さらに、本発明のAurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法は、Aurora A阻害剤を投与した被検体由来の組織におけるAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質を検出する検出工程と、Aurora A阻害剤投与前後の発現量を比較する比較工程を含むことを特徴とする。かかる方法により、簡便且つ非侵襲的にAurora A阻害剤の薬効の予測又は診断を行うことが可能となる。
ここで、本発明のAurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法は、前記検出に用いる検出手段が抗Aurora B抗体、抗Histone H3抗体、抗BIRC5抗体、抗PRC1抗体、抗DLG7抗体、抗TACC3抗体又は抗KNTC2抗体であることを特徴とする。
また、本発明のAurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法においては、前記組織が血液、皮膚、毛根、口腔粘膜、消化管、骨髄又は癌組織であることを特徴とする。これらの組織を用いることにより、比較的容易にサンプルの調製が可能となり、非侵襲的な薬効の予測又は診断が可能となる。
Aurora A阻害剤を生体に投与した際にAurora A特異的に当該阻害剤が作用したか否かを検出する遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを得ることが可能となり、これらのマーカーの発現を指標として、簡便且つ非侵襲的にAurora A阻害剤の薬効の予測又は診断を行うことが可能となる。
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本発明に係る「Aurora A遺伝子」には、Aurora A遺伝子と同等の生理機能を有し、且つキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものであれば１又は２以上の塩基の置換、欠失、付加又は挿入がある遺伝子も含まれる。ここで、当該遺伝子としては、かかるタンパク質をコードする遺伝子であればその配列は特に制限されないが、相同性が５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上（例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％以上）であることが特に好ましい。
また、本発明に係るAurora A遺伝子には、Aurora A遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、二つの核酸断片が、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー（1989）、9.47-9.62及び11.45-11.61に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。より具体的には、例えば、約45℃にて6.0×SSCでハイブリダイゼーションを行った後に、50℃にて2.0xSSCで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジェンシー選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約2.0xSSC、50℃から、高ストリンジェンシーとしての約0.2×SSC、50℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約22℃から、高ストリンジェンシー条件の約65℃まで上昇させることができる。
また、Aurora AはAik、Aurora-2、AIRK1、STK15、BTAK、ARK1、IAK1又はAyk1等と称されることがあるが、これらはいずれも本発明に係るAurora Aと同義である。
本発明における「Aurora A阻害剤」とは、Aurora Aキナーゼの活性を阻害する物質、分子をいう。かかる阻害剤はAurora Aの阻害剤として機能する分子であればその分子種は特に制限されず、具体的には、例えば、低分子化合物、タンパク質、ペプチドを挙げることができる。前記低分子化合物としてもその種類は特に制限されず、具体的には、例えば、天然化合物、有機化合物又は無機化合物が挙げられる。また、前記低分子化合物の具体例としては、例えば、MLN8054、ZM447439、6-((4-(2,3-diｆluorobenzoyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-thiazol-2-ylpyridin-2-amine、6-((4-(2-fluoro-3-(trifluoromethyl)benzoyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-1H-pyrazol-3-ylpyrazin-2-amine、6-((4-(3-chloro-2-fluorobenzoyl)piperazin-1-yl) methyl)-N-thiazol-2-ylpyridin-2-amineが挙げられる。また、前記ペプチドとしてもその種類は特に制限されず、任意のアミノ酸数を有していてもよい。
また、当該阻害剤は、Aurora AやAurora Aを介した細胞内情報伝達経路上の分子の機能異常によって生じる疾患であれば特にその対象疾患は限定されない。当該阻害剤の対象となる疾患として、例えば、脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎盂・尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、乳癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、悪性黒色腫、菌状息肉症、皮膚癌、軟部肉腫、悪性リンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫又は白血病が挙げられる。
また、本発明に係る「Aurora B（NM_004217）、Histone H3（NM_002107又はNM_005324）、BIRC5（NM_001012270、NM_001012271又はNM_001168）、PRC1（NM_003981、NM_199413又はNM_199414）、DLG7（NM_014750）、TACC3（NM_006342）及びKNTC2（NM_006101）からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子」には、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3又はKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子と同等の生理機能を有するタンパク質をコードするものであれば１又は２以上の塩基の置換、欠失、付加又は挿入がある遺伝子も含まれる。ここで、当該遺伝子としては、かかるタンパク質をコードする遺伝子であればその配列は特に制限されないが、相同性が５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上（例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％以上）であることが特に好ましい。
また、本発明に係るAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3又はKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子には、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3又はKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、当該遺伝子と同等の活性を有するタンパク質をコードする核酸も含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、二つの核酸断片が、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー（1989）、9.47-9.62及び11.45-11.61に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。より具体的には、例えば、約45℃にて6.0×SSCでハイブリダイゼーションを行った後に、50℃にて2.0xSSCで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジェンシー選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約2.0xSSC、50℃から、高ストリンジェンシーとしての約0.2×SSC、50℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約22℃から、高ストリンジェンシー条件の約65℃まで上昇させることができる。Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3又はKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の具体例としては、例えば、当該遺伝子の中にSNPやRFLPのような多型を有する核酸が挙げられる。
（１）遺伝子マーカー
本発明の遺伝子マーカーは、Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断する遺伝子マーカーであって、当該遺伝子が、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子又は該遺伝子と実質的に同等の機能を有する遺伝子であることを特徴とする。
本発明の遺伝子マーカーは、Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断する遺伝子マーカーであって、当該遺伝子が、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子又は該遺伝子と実質的に同等の機能を有する遺伝子であることを特徴とする。
本発明の「遺伝子マーカー」とは、評価対象となるAurora A阻害剤の薬効や生体に対する作用の指標となるものをいい、具体的には、Aurora A阻害剤の作用によって発現量や活性が変化する遺伝子又はこれらに関連する物質（例えば、DNA及びRNA並びにこれらの断片）をいう。
また、本発明の遺伝子マーカーには、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2の一部からなるポリヌクレオチドも含む。このようなポリヌクレオチドは、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2遺伝子から転写されたRNA、これから産生されるcDNA、ならびにこれらの遺伝子由来の配列を有する合成核酸であってもよい。
本発明者らは、本発明の遺伝子マーカーの発現がAurora A阻害剤の投与によって増加することを確認している。また、Aurora A及びAurora Bの発現を、siRNAを用いて抑制したところ、Aurora Aの発現が抑制された場合にのみ遺伝子マーカーとなる遺伝子の発現が上昇することが確認された。すなわち、本発明の遺伝子マーカーはAurora A阻害剤の選択的・特異的なマーカーとして機能することが確認されている。Aurora A阻害の細胞表現型は、細胞分裂チェックポイントの活性化により惹起される細胞分裂遅延と分裂期細胞死（mitotic catastrophe）の誘導である。一方、Aurora B阻害の細胞表現型は、細胞分裂チェックポイントの解除と細胞質分裂阻害による細胞核の多倍体化である。従って、Aurora B阻害はAurora A阻害の効果を打ち消す方向に作用する。また、Aurora AとAurora Bとは高い相同性を示し、多くのATP競争的Aurora阻害剤がAurora A及びAurora Bの両方を阻害する。すなわち、Aurora A選択的マーカーはAurora A選択的阻害剤の開発における候補化合物のスクリーニングや評価に重要なツールであると言え、また、臨床においては薬効予測又は診断のためのマーカーとして有用である。
本発明の遺伝子マーカーは、Aurora A阻害剤の投与により生体内組織中でその発現が増加する。Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断する場合には、遺伝子マーカーが発現している任意の組織における当該遺伝子マーカーの発現量を測定すればよいが、サンプルの入手が容易であるとの観点から血液又は皮膚組織における発現量を測定することが好ましい。
また、本発明の遺伝子マーカーの発現量の測定方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、ノーザンブロット法、定量的RT-PCR法、DNAマイクロアレイによってmRNA量を測定することによりその発現量を定量することができる。
ここで、前記ノーザンブロット法に使用するプローブとしては、本発明の遺伝子マーカーであるAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3又はKNTC2遺伝子を検出可能なプローブであればよく、具体的には、これらの遺伝子の塩基配列の部分配列又は全部を使用することができる。また、当該プローブの塩基数についても特に制限はないが、少なくとも連続する２０塩基の長さの核酸であることが好ましく、より好ましくは４０塩基、さらに好ましくは６０塩基、特に好ましくは８０塩基以上のものが使用される。また、当該プローブは、必要に応じて検出可能なように標識して用いてもよい。具体的には、例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、３５Ｓ等の放射性同位体で標識されていてもよく、ビオチン、蛍光色素、酵素、金コロイド等で標識されていてもよい。
また、前記定量的RT-PCR法に使用するプライマーとしては、本発明の遺伝子マーカーであるAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3又はKNTC2遺伝子を検出可能なプライマーであればよく、その塩基数は特に制限されず、プライマーの塩基配列や単離する遺伝子の塩基配列等によって適宜設定することができるが、一般に、連続した１０〜６０塩基であることが好ましく、１５〜３０塩基であることがより好ましい。また、その塩基配列は、検出の対象となるAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3又はKNTC2遺伝子の塩基配列に基づいて決定する。
また、前記DNAマイクロアレイによって本発明の遺伝子マーカーの発現量を測定する場合、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3又はKNTC2遺伝子のうちの少なくとも一つの遺伝子又は当該遺伝子の部分核酸がスポットされたDNAマイクロアレイを準備し、測定を行えばよい。
また、本発明の遺伝子マーカーは、Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断するために用いられる。すなわち、Aurora A阻害剤を生体に投与した後、当該遺伝子マーカーの発現量を測定し、投与前の発現量と比較して発現量が増加している場合に、当該阻害剤がAurora A特異的に作用し所定の薬効を発揮していると認定することができる。具体的には、Aurora A阻害剤を投与後、本発明の遺伝子マーカーの発現が増加していれば、仮にAurora A阻害剤の薬効が目に見える状態（例えば、癌症状の改善）に至っていない場合や、癌組織が非常に小さく、X線撮影のような従来の診断方法では診断が困難な場合であっても、阻害剤の薬効が発揮されるであろうと予測できる。また、Aurora A阻害剤を薬剤として開発する段階において健常人を対象に臨床試験を行う場合、本発明の遺伝子マーカーの発現量を指標にして当該薬剤の効果を評価することが可能となる。
また、本発明の遺伝子マーカーは、癌の治癒成績を判定する際にも使用できる。すなわち、Aurora A阻害剤を抗癌剤として生体に投与し癌治療を行った場合、抗癌剤が効いたかどうかを判定するには実際に癌組織が縮小したことや癌細胞が減少したことを確認する必要がある。このような確認作業には、X線断層撮影やX線造影撮影のような放射線を浴びるような検査や、内視鏡やバイオプシーのような患者の負担を伴う検査が必要となる。しかし、本発明の遺伝子マーカーによれば、血液や皮膚のような体組織の一部を極小量採取し、当該組織における遺伝子マーカーの発現を測定するだけで検査が完了する。従って、X線断層撮影、X線造影撮影、内視鏡又はバイオプシーのような検査に代えて又はこれらの検査の予備的な検査として、患者に苦痛や負担を与えることなくAurora A阻害剤の薬効を判定することが可能となる。
（２）タンパク質マーカー
本発明のタンパク質マーカーは、Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断するタンパク質マーカーであって、当該タンパク質が、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質又は実質的に同等の機能を有することを特徴とする。
本発明のタンパク質マーカーは、Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断するタンパク質マーカーであって、当該タンパク質が、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質又は実質的に同等の機能を有することを特徴とする。
本発明の「タンパク質マーカー」とは、評価対象となるAurora A阻害剤の薬効や生体に対する作用の指標となるものをいい、具体的には、Aurora A阻害剤の作用によって発現量や活性が変化するタンパク質又はこれらに関連する物質（例えば、部分ペプチド）をいう。
本発明者らは、これらのタンパク質をコードする遺伝子のみならずタンパク質の発現がAurora A阻害剤の投与によって増加することを確認している。また、Aurora A及びAurora Bの発現を、siRNAを用いて抑制したところ、Aurora Aの発現が抑制された場合にのみタンパク質マーカーとなるタンパク質の発現が上昇することが確認された。すなわち、本発明のタンパク質マーカーはAurora A阻害剤の選択的・特異的なマーカーとして機能する。
本発明のタンパク質マーカーは、Aurora A阻害剤の投与により生体内組織中でその発現が増加する。Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断する場合には、タンパク質マーカーが発現している任意の組織における当該タンパク質マーカーの発現量を測定すればよいが、サンプルの入手が容易であるとの観点から血液又は皮膚組織における発現量を測定することが好ましい。
ここで、本発明のタンパク質マーカーは、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質と実質的に同等の機能を有するタンパク質を含む。このようなタンパク質としては、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3又はKNTC2タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸に置換、付加、欠失又は挿入があり、且つ、同等の活性を有するものが挙げられる。同等の活性とは、Aurora Bと実質的に同等の機能を有するタンパク質であればAurora Bと同様のキナーゼ活性を有することをいい、Histone H3と実質的に同等の機能を有するタンパク質であればHistone H3活性を、BIRC5と実質的に同等の機能を有するタンパク質であればBIRC5活性を、PRC1と実質的に同等の機能を有するタンパク質であればPRC1活性を、DLG7と実質的に同等の機能を有するタンパク質であればDLG7活性を、TACC3と実質的に同等の機能を有するタンパク質であればTACC3活性を、KNTC2と実質的に同等の機能を有するタンパク質であればKNTC2活性を、それぞれ有することをいう。また、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3又はKNTC2タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸に置換、付加、欠失又は挿入があるタンパク質について、その配列は特に制限されないが、相同性が５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上（例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％以上）であることが特に好ましい。
また、本発明の遺伝子マーカーの発現量の測定方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、ウエスタンブロット法、ELISA法、プロテインチップによってタンパク質量を測定することによりその発現量を定量することができる。
ここで、前記ウエスタンブロット法は当業者に公知の方法で行うことができる。具体的には、例えば、Aurora A阻害剤を投与した生体から採取した組織の総タンパク質をSDS-PAGEにより展開し、ニトロセルロース膜やPVDF膜等へ転写する。その後、当該膜に本発明のタンパク質マーカーの抗体を添加、反応させ、さらに２次抗体を添加、反応させた後、当該２次抗体を検出することにより、当該タンパク質マーカーを検出すればよい。また、生体から採取した組織の総タンパク質をタンパク質マーカーの抗体で免疫沈降し、沈降物として得られたタンパク質をSDS-PAGEにより展開し、ウエスタンブロット法により検出してもよい。
前記ウエスタンブロット法に使用する抗体としては、本発明のプロテインマーカーであるAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2タンパク質を検出可能な抗体であればよく、ポリクローナル抗体であってもよくモノクローナル抗体であってもよい。かかるポリクローナル抗体は当業者に公知の方法で調製すればよく、例えば下記の方法に従って調製できる。すなわち、例えば、抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）とともに、マウス、ラット、ハムスター、モルモット又はウサギ等の哺乳動物に免疫し、当該免疫感作動物から得た血清から取得することができる。
また、前記モノクローナル抗体は、例えば、抗原を、必要に応じてフロイントアジュバントとともに、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギ等の哺乳動物に免疫する。次に、当該免疫感作動物から得た抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマ（融合細胞）を調製し、ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって調製することができる。さらに具体的には、抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント哺乳動物の皮下内、筋肉内、静脈内又は腹腔内等に１又は数回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通常、最初の免疫から１〜１４日毎に１〜４回程度免疫を行い、最終免疫より１〜５日程度後に免疫感作された哺乳動物から抗体産生細胞を取得する。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（融合細胞）の調製は、定法に従って行うことができる。すなわち、上述した方法により免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、マウス、ラット又はヒト等由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合させることにより調製する。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマをマイクロタイタープレート等を用いて培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の免疫抗原に対する反応性を、例えばＲＩＡやＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、又はマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の腹水中等でのインビボで培養した後、得られた培養上清、又は哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
さらに、上述の方法により得られたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いて抗体アレイを調製することも可能である。すなわち、上述の抗体をニトロセルロース膜やPVDF膜等の膜や、ニトロセルロースがコートされたスライドやガラス基盤に、マイクロアレイスポッターを用いて固定すればよい。
一方、本発明のタンパク質マーカーであるAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3又はKNTC2の少なくとも一つのタンパク質をニトロセルロース膜やPVDF膜等の膜や、ニトロセルロースがコートされた基盤やガラス基盤にマイクロアレイスポッターを用いて固定することによりプロテインアレイを調製することもできる。この場合、前記タンパク質を直接固定してもよく、タンパク質又は膜若しくは基盤との間にリンカーを介して固定してもよい。リンカーを介して固定することにより、タンパク質の立体構造を損なわず活性を維持した状態でプロテインアレイを調製することが可能となる。
本発明のタンパク質マーカーは、Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断するために用いられる。すなわち、Aurora A阻害剤を生体に投与した後、当該タンパク質マーカーの発現量を測定し、投与前の発現量と比較して発現量が増加している場合に、当該阻害剤がAurora A特異的に作用し所定の薬効を発揮していると認定することができる。具体的には、Aurora A阻害剤を投与後、本発明のタンパク質マーカーの発現が増加していれば、仮にAurora A阻害剤の薬効が目に見える状態（例えば、癌症状の改善）に至っていない場合や、癌組織が非常に小さく、X線撮影のような従来の診断方法では診断が困難な場合であっても、阻害剤の薬効が発揮されるであろうと予測できる。また、Aurora A阻害剤を薬剤として開発する段階において健常人を対象に臨床試験を行う場合、本発明のタンパク質マーカーの発現量を指標にして当該薬剤の効果を評価することが可能となる。
また、本発明のタンパク質マーカーは、癌の治癒成績を判定する際にも使用できる。すなわち、Aurora A阻害剤を抗癌剤として生体に投与し癌治療を行った場合、抗癌剤が効いたかどうかを判定するには実際に癌組織が縮小したことや癌細胞が減少したことを確認する必要がある。このような確認作業には、X線断層撮影やX線造影撮影のような放射線を浴びるような検査や、内視鏡やバイオプシーのような患者の負担を伴う検査が必要となる。しかし、本発明のタンパク質マーカーによれば、血液や皮膚のような体組織の一部を極小量採取し、当該組織におけるタンパク質マーカーの発現を測定するだけで検査が完了する。従って、X線断層撮影、X線造影撮影、内視鏡又はバイオプシーのような検査に代えて又はこれらの検査の予備的な検査として、患者に苦痛や負担を与えることなくAurora A阻害剤の薬効を判定することが可能となる。
（３）癌診断キット
本発明の癌診断キットは、本発明のタンパク質マーカーを検出可能の抗体を含むことを特徴とする。当該抗体は、上述したAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質又は実質的に同等の機能を有するタンパク質に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体をいう。
本発明の癌診断キットは、本発明のタンパク質マーカーを検出可能の抗体を含むことを特徴とする。当該抗体は、上述したAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質又は実質的に同等の機能を有するタンパク質に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体をいう。
本発明の癌診断キットには、本発明のタンパク質マーカーを検出可能な抗体の他、例えば、抗体検出用試薬、抗体検出用２次抗体、反応に用いるプレートを備えていてもよい。
本発明の癌診断キットを用いることにより、Aurora A阻害剤を投与した生体から採取した組織（例えば、血液又は皮膚）におけるタンパク質マーカーを迅速且つ簡便に検出することが可能となり、投与前後のタンパク質量を比較することにより、Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断することが可能となる。
（４）Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法
先ず、本発明の第１のAurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法について説明する。
先ず、本発明の第１のAurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法について説明する。
本発明の第１のAurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法は、Aurora A阻害剤を投与した被検体由来の組織におけるAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と実質的に同等の機能を有する遺伝子を検出する検出工程と、Aurora A阻害剤投与前後の発現量を比較する比較工程を含むことを特徴とする。
本発明に係る検出工程は、Aurora A阻害剤を投与した被検体由来の組織におけるAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と実質的に同等の機能を有する遺伝子（すなわち、本発明の遺伝子マーカー）を検出する工程である。
ここで、本発明に係る「組織」とは、Aurora A阻害剤を投与した被験体由来の組織であり、検出対象である遺伝子マーカーが発現している組織であればその組織種は限定されないが、採取が容易であるとの観点より血液又は皮膚組織であることが好ましい。
本工程においては、Aurora A阻害剤を投与した生体より前記組織を採取し、そこから遺伝子マーカー測定用のDNAを定法により抽出する。かかるDNAはゲノムDNAであってもよく、抽出したRNAから逆転写反応によって得られたcDNAであってもよい。次に、得られたDNAを用いてAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3又はKNTC2遺伝子の検出を行う。検出方法は定量的な手段であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、PCR法又はマイクロアレイが挙げられる。
検出工程でAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3又はKNTC2遺伝子の検出が完了した後、Aurora A阻害剤投与前後の発現量を比較する比較工程へと進む。比較工程では、検出工程で検出したAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3又はKNTC2遺伝子の発現量と、Aurora A阻害剤を投与する前の当該遺伝子の発現量とを比較することとなる。比較の結果、Aurora A阻害剤の投与によって当該遺伝子の発現量が増加している場合には、投与したAurora A阻害剤が投与対象である人体に当該阻害剤が適切な作用機序で作用し、投与効果を示していると判断することができる。これは癌組織が非常に小さい場合や、医薬開発の臨床試験段階のように、物理的な癌組織の大きさだけで薬効を測定することが困難な場合に、Aurora A阻害剤の薬効を測定する方法として非常に有益である。
次に、本発明の第２のAurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法について説明する。
本発明の第２のAurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法は、Aurora A阻害剤を投与した被検体由来の組織におけるAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質又は該タンパク質と実質的に同等の機能を有するタンパク質を検出する検出工程と、Aurora A阻害剤投与前後の発現量を比較する比較工程を含むことを特徴とする。
本発明に係る検出工程は、Aurora A阻害剤を投与した被検体由来の組織におけるAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質又は当該タンパク質と実質的に同等の機能を有する遺伝子（すなわち、本発明のタンパク質マーカー）を検出する工程である。
ここで、本発明に係る「組織」とは、Aurora A阻害剤を投与した被験体由来の組織であり、検出対象であるタンパク質マーカーが発現している組織であればその組織種は限定されないが、採取が容易であるとの観点より血液又は皮膚組織であることが好ましい。
本工程においては、Aurora A阻害剤を投与した生体より前記組織を採取し、そこからタンパク質マーカー測定用のタンパク質を定法により抽出するか、又は、当該タンパク質を含む総タンパク質を採取する。具体的には、例えば、ウエスタンブロット法による検出に供することができるよう、当該タンパク質を含む総タンパク質を可溶化サンプルとして調製し、本工程に係る抽出タンパク質とすることができる。また、総タンパク質をサンプルとして、検出対象となるタンパク質の抗体を用いて免疫沈降を行い、当該タンパク質のみを抽出してもよい。
次に、得られたタンパク質を用いてAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3又はKNTC2タンパク質の検出を行う。検出方法は定量的な手段であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、ウエスタンブロット法又はELISA法が挙げられる。ここで、ウエスタンブロット法又はELISA法による検出には抗Aurora B抗体、抗Histone H3抗体、抗BIRC5抗体、抗PRC1抗体、抗DLG7抗体、抗TACC3抗体又は抗KNTC2抗体を用いる必要がある。これらの抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。また、これらの抗体は定法により調製することができ、例えば、（２）タンパク質マーカーの項で述べた方法により調製することができる。
検出工程でAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3又はKNTC2タンパク質の検出が完了した後、Aurora A阻害剤投与前後の発現量を比較する比較工程へと進む。比較工程では、検出工程で検出したAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3又はKNTC2タンパク質の発現量と、Aurora A阻害剤を投与する前の当該タンパク質の発現量とを比較することとなる。比較の結果、Aurora A阻害剤の投与によって当該タンパク質の発現量が増加している場合には、投与したAurora A阻害剤が投与対象である人体に当該阻害剤が適切な作用機序で作用し、投与効果を示していると判断することができる。これは癌組織が非常に小さい場合や、医薬開発の臨床試験段階のように、物理的な癌組織の大きさだけで薬効を測定することが困難な場合に、Aurora A阻害剤の薬効を測定する方法として非常に有益である。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
試験例１〜１４
（遺伝子発現解析）
Aurora A阻害剤の効果を評価することができるPDマーカーを同定するために、Aurora A阻害剤またはAurora AのsiRNAによって特異的に発現変化する遺伝子群をマイクロアレイ解析により検索した。マイクロアレイ解析は、GeneChip array(U-133A：Affymetrix社)により、下記の試料を供して実施した。
（遺伝子発現解析）
Aurora A阻害剤の効果を評価することができるPDマーカーを同定するために、Aurora A阻害剤またはAurora AのsiRNAによって特異的に発現変化する遺伝子群をマイクロアレイ解析により検索した。マイクロアレイ解析は、GeneChip array(U-133A：Affymetrix社)により、下記の試料を供して実施した。
１．Aurora A又はAurora BのsiRNAを処置した場合のGeneChip解析
HeLa-S3細胞にAurora A、Aurora B又はルシフェラーゼ（Luciferase：コントロール)のsiRNAをリポフェクションにより導入し(濃度：12.5nM)、24時間後と48時間後に細胞を回収し、マイクロアレイ解析用にRNAを調製した。すなわち、下記６種の試料を得た。
HeLa-S3細胞にAurora A、Aurora B又はルシフェラーゼ（Luciferase：コントロール)のsiRNAをリポフェクションにより導入し(濃度：12.5nM)、24時間後と48時間後に細胞を回収し、マイクロアレイ解析用にRNAを調製した。すなわち、下記６種の試料を得た。
Aurora A siRNA 24hr（試験例１）
Aurora A siRNA 48hr（試験例２）
Aurora B siRNA 24hr（試験例３）
Aurora B siRNA 48hr（試験例４）
Luciferase siRNA 24hr（試験例５）
Luciferase siRNA 48h（試験例６）
２．Aurora-A阻害剤を処置した場合のGeneChip解析
HeLa-S3細胞にAurora A阻害剤である6-((4-(2,3-diｆluorobenzoyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-thiazol-2-ylpyridin-2-amineを各1, 3, 10 μM作用させ、24時間後と48時間後に細胞を回収し、マイクロアレイ解析用にRNAを調製した。コントロールとしてDMSOを用いた。すなわち、下記８種の試料を得た。
Aurora A siRNA 48hr（試験例２）
Aurora B siRNA 24hr（試験例３）
Aurora B siRNA 48hr（試験例４）
Luciferase siRNA 24hr（試験例５）
Luciferase siRNA 48h（試験例６）
２．Aurora-A阻害剤を処置した場合のGeneChip解析
HeLa-S3細胞にAurora A阻害剤である6-((4-(2,3-diｆluorobenzoyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-thiazol-2-ylpyridin-2-amineを各1, 3, 10 μM作用させ、24時間後と48時間後に細胞を回収し、マイクロアレイ解析用にRNAを調製した。コントロールとしてDMSOを用いた。すなわち、下記８種の試料を得た。
Aurora A阻害剤(1μM) 24hr（試験例７）
Aurora A阻害剤(1μM) 48hr（試験例８）
Aurora A阻害剤(3μM) 24hr（試験例９）
Aurora A阻害剤(3μM) 48hr（試験例１０）
Aurora A阻害剤(10μM) 24hr（試験例１１）
Aurora A阻害剤(10μM) 48hr（試験例１２）
DMSO 24hr（試験例１３）
DMSO 48h（試験例１４）
次に、Aurora A特異的なPD markerの候補遺伝子を抽出するため、以下の３つの条件を満たす遺伝子群を抽出した。すなわち、下記（１）〜（３）の条件を満たす遺伝子群を抽出した。
（１）上記２．においてDMSOをコントロールとした場合、試験例７〜１２として6-((4-(2,3-diｆluorobenzoyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-thiazol-2-ylpyridin-2-amineを作用させた試料のなかで、発現が1.5倍以上有意に変化しているもの。
（２）上記１．においてルシフェラーゼをコントロールとした場合、Aurora AのsiRNAを24時間または48時間処置した試料（試験例１及び２）のなかで、発現が1.5倍以上有意に変化しているもの。
（３）上記１．においてルシフェラーゼをコントロールとした場合、Aurora BのsiRNA処置した試料（試験例３及び４）のなかで、発現が変化していないもの（Aurora Aで特異的に発現変化しているもの）。
（４）上記１．から３．を満たし、かつAurora Aの基質または関連した機能を持つことが報告されている遺伝子。
Aurora A阻害剤(1μM) 48hr（試験例８）
Aurora A阻害剤(3μM) 24hr（試験例９）
Aurora A阻害剤(3μM) 48hr（試験例１０）
Aurora A阻害剤(10μM) 24hr（試験例１１）
Aurora A阻害剤(10μM) 48hr（試験例１２）
DMSO 24hr（試験例１３）
DMSO 48h（試験例１４）
次に、Aurora A特異的なPD markerの候補遺伝子を抽出するため、以下の３つの条件を満たす遺伝子群を抽出した。すなわち、下記（１）〜（３）の条件を満たす遺伝子群を抽出した。
（１）上記２．においてDMSOをコントロールとした場合、試験例７〜１２として6-((4-(2,3-diｆluorobenzoyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-thiazol-2-ylpyridin-2-amineを作用させた試料のなかで、発現が1.5倍以上有意に変化しているもの。
（２）上記１．においてルシフェラーゼをコントロールとした場合、Aurora AのsiRNAを24時間または48時間処置した試料（試験例１及び２）のなかで、発現が1.5倍以上有意に変化しているもの。
（３）上記１．においてルシフェラーゼをコントロールとした場合、Aurora BのsiRNA処置した試料（試験例３及び４）のなかで、発現が変化していないもの（Aurora Aで特異的に発現変化しているもの）。
（４）上記１．から３．を満たし、かつAurora Aの基質または関連した機能を持つことが報告されている遺伝子。
その結果、Aurora Aの阻害により発現が変化するが、Aurora Bの阻害によっては発現が変化しない遺伝子として、BIRC5、KNTC2、PRC1、TACC3及びDLG7が見出された。
実施例１
（Aurora A又はAurora Bの発現を抑制した場合のPDマーカー候補遺伝子の発現変化）
試験例１〜６の試料について、PDマーカー候補遺伝子の発現変化をreal-time PCRにて確認した。先ず、細胞より単離したtotal RNAから、逆転写酵素を用いてcDNAを調製した。得られたcDNAから、TaqMan試薬に添付される一般的プロトコールに従い、real-time PCRを行った。
（Aurora A又はAurora Bの発現を抑制した場合のPDマーカー候補遺伝子の発現変化）
試験例１〜６の試料について、PDマーカー候補遺伝子の発現変化をreal-time PCRにて確認した。先ず、細胞より単離したtotal RNAから、逆転写酵素を用いてcDNAを調製した。得られたcDNAから、TaqMan試薬に添付される一般的プロトコールに従い、real-time PCRを行った。
real-time PCRに用いたプライマーセットは、以下のとおりである。また、いずれのプライマー及びプローブもヒト遺伝子を鋳型とした。
図１〜５に示すとおり、Aurora AのsiRNAを作用させた場合には、作用時間が24時間、48時間ともに、候補遺伝子の発現が上昇していることが確認できた。一方、Aurora BのsiRNAを作用させた場合には、Aurora-Aに見られるような変化はなかった。
実施例２
（Aurora A阻害剤を作用させた場合のPDマーカー候補遺伝子の発現変化）
HeLa-S3細胞に6-((4-(2,3-diｆluorobenzoyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-thiazol-2-ylpyridin-2-amineを所定濃度作用させ、24時間後に細胞を採取し、total RNAを単離後cDNAとし、実施例１と同様の方法でreal-time PCRを行った。
（Aurora A阻害剤を作用させた場合のPDマーカー候補遺伝子の発現変化）
HeLa-S3細胞に6-((4-(2,3-diｆluorobenzoyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-thiazol-2-ylpyridin-2-amineを所定濃度作用させ、24時間後に細胞を採取し、total RNAを単離後cDNAとし、実施例１と同様の方法でreal-time PCRを行った。
図６〜１０に示すとおり、PDマーカー候補遺伝子はAurora A阻害剤の濃度依存的に発現上昇することが確認された。
実施例３
（Aurora A阻害剤をラットに持続投与した場合の移植ガンにおけるPDマーカー候補遺伝子の発現変化）
先ず、F344/N Jcl-rnu系統の雌ヌードラットの背側部皮下に子宮頸癌株HeLa-luc細胞を移植した。1週間後、胆癌ヌードラットの大腿静脈カニュレーション手術を行い、シリンジポンプを用いてAurora A阻害剤である6-((4-(2-fluoro-3-(trifluoromethyl)benzoyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-1H-pyrazol-3- ylpyrazin-2-amineを48時間静脈内点滴投与した。投与後、摘出した移植癌及び皮膚標本は液体窒素中にて凍結保存した。
（Aurora A阻害剤をラットに持続投与した場合の移植ガンにおけるPDマーカー候補遺伝子の発現変化）
先ず、F344/N Jcl-rnu系統の雌ヌードラットの背側部皮下に子宮頸癌株HeLa-luc細胞を移植した。1週間後、胆癌ヌードラットの大腿静脈カニュレーション手術を行い、シリンジポンプを用いてAurora A阻害剤である6-((4-(2-fluoro-3-(trifluoromethyl)benzoyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-1H-pyrazol-3- ylpyrazin-2-amineを48時間静脈内点滴投与した。投与後、摘出した移植癌及び皮膚標本は液体窒素中にて凍結保存した。
次に、摘出した移植ガンよりtotal RNAを単離しcDNAを作成し、PDマーカー候補遺伝子の発現変化をみた。また、培養細胞で同定した５遺伝子に加えAurora A(AurA)及びAurora B(AurB)も候補遺伝子として検討した。Aurora A及びBのプライマー・プローブセットは次のとおりである。また、いずれのプライマー及びプローブもヒト遺伝子を鋳型とした。
図１１及び１２に示すとおり、ラットに阻害剤を投与した場合においても、PDマーカー候補遺伝子の発現は上昇することが明らかになった。また、その発現変化は、1mpkをピークであることが確認された。また、BIRC5、DLG7の発現は有意に増加していることが確認された。従って、6-((4-(2-fluoro-3-(trifluoromethyl)benzoyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-1H-pyrazol-3-ylpyrazin-2-amineを薬剤として投与した場合、被検組織におけるPDマーカー候補遺伝子群の発現を調べることで、薬効の予測が可能となる。
実施例４
（Aurora A阻害剤をラットに持続投与した場合の皮膚におけるPDマーカー候補遺伝子の発現変化）
実施例３で使用したのと同じラットの皮膚について、real-time PCRにより、PDマーカー候補遺伝子の発現変化を調べた。ラットにおける候補遺伝子のプライマーは次に示すとおりである。また、いずれのプライマー及びプローブもラット遺伝子を鋳型とした。なお、プローブはFAM/TAMRA修飾をしたものを使用した。
（Aurora A阻害剤をラットに持続投与した場合の皮膚におけるPDマーカー候補遺伝子の発現変化）
実施例３で使用したのと同じラットの皮膚について、real-time PCRにより、PDマーカー候補遺伝子の発現変化を調べた。ラットにおける候補遺伝子のプライマーは次に示すとおりである。また、いずれのプライマー及びプローブもラット遺伝子を鋳型とした。なお、プローブはFAM/TAMRA修飾をしたものを使用した。
図１３〜１６に示すとおり、ラットの皮膚においても、trans-4-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-1-((6-(1,3-thiazol-2-ylamino)pyridin-2-yl)methyl)cyclohexanecarboxylic acidの投与に伴い候補遺伝子が有意に発現上昇することが明らかになった。よって、移植癌のみならず皮膚においても、Aurora-A阻害剤の効果を予測可能であることが確認できた。なお、図１３にはAuroraA及びAuroraBの発現量の変化を、図１４にはBIRC5、PRC1及びTACC3の発現量の変化を、図１５にはDLG7の発現量の変化を、図１６にはKNTC2の発現量の変化をそれぞれ示した。
以上の結果から、PDマーカー候補遺伝子群は、Aurora A特異的阻害剤の投与によって、培養細胞、癌移植モデル動物の癌組織及び皮膚のいずれにおいても発現が上昇しており、PDマーカーとして利用できることを確認できた。
実施例５
（siRNAによるAurora A欠失HeLaS3細胞特異的なAurora B (Thr232)リン酸化の上昇）
同調又は非同調のHeLaS3細胞におけるAurora A及びBをsiRNAによってノックダウンした場合の効果を調べることを目的として、下記の試験を行った。
（siRNAによるAurora A欠失HeLaS3細胞特異的なAurora B (Thr232)リン酸化の上昇）
同調又は非同調のHeLaS3細胞におけるAurora A及びBをsiRNAによってノックダウンした場合の効果を調べることを目的として、下記の試験を行った。
１．ダブルチミジンブロックによるG1/S期同調培養におけるphospho-Aurora Bの解析
先ず、HeLaS3細胞を6ウェル培養皿に2.5x105個／ウェルになるように播種して、一晩37℃、5％ CO2で培養した。次に、翌日18:00に200ｍＭチミジン溶液を終濃度が2mMになるように培地に添加して16時間培養した。さらに、翌日10:00に培地をPBSで3回リンスし、新しい培地に交換した。このとき各ウェルにルシフェラーゼコントロール(Luc)、Aurora A(A1、A2)、Aurora B(B1、B2) siRNAを終濃度50nMになるようにOligofectamine (Invitrogen社)を用いてトランスフェクトし、引き続き8時間培養した。次に、18:00に2回目のチミジンを2mMになるように加え、16時間培養し、翌日10:00に培地をPBSで3回リンスして新しい培地に交換した。これにより細胞は同調からリリースされた。
先ず、HeLaS3細胞を6ウェル培養皿に2.5x105個／ウェルになるように播種して、一晩37℃、5％ CO2で培養した。次に、翌日18:00に200ｍＭチミジン溶液を終濃度が2mMになるように培地に添加して16時間培養した。さらに、翌日10:00に培地をPBSで3回リンスし、新しい培地に交換した。このとき各ウェルにルシフェラーゼコントロール(Luc)、Aurora A(A1、A2)、Aurora B(B1、B2) siRNAを終濃度50nMになるようにOligofectamine (Invitrogen社)を用いてトランスフェクトし、引き続き8時間培養した。次に、18:00に2回目のチミジンを2mMになるように加え、16時間培養し、翌日10:00に培地をPBSで3回リンスして新しい培地に交換した。これにより細胞は同調からリリースされた。
同調からリリース後0、8、10、12、14及び16時間で経時的にサンプリングし、phospho-Aurora B抗体（Cell Signaling Technology社）を用いたWestern Blotによりリン酸化Aurora Bの発現を調べた。
２．非同調培養におけるAurora A及びBのノックダウン解析
先ず、HeLaS3細胞を6ウェル培養皿に5x105個／ウェルで播種して一晩37℃、5％ CO2で培養した。翌日、各ウェルにルシフェラーゼコントロール(Luc)、Aurora A(A2)、Aurora B(B2)siRNAを終濃度50nMになるようにOligofectamine (Invitrogen社)を用いてトランスフェクトした。次に、24時間後に細胞をトリプシンで剥がして回収し、半分をフローサイトメトリーによる細胞周期の解析、残り半分をWestern Blotによりmitosis特異的マーカー候補 （Aurora A、Aurora B、phospho-Aurora B、Survivin、cyclin B1、Plk1）の抗体を用いた解析を行なった。
先ず、HeLaS3細胞を6ウェル培養皿に5x105個／ウェルで播種して一晩37℃、5％ CO2で培養した。翌日、各ウェルにルシフェラーゼコントロール(Luc)、Aurora A(A2)、Aurora B(B2)siRNAを終濃度50nMになるようにOligofectamine (Invitrogen社)を用いてトランスフェクトした。次に、24時間後に細胞をトリプシンで剥がして回収し、半分をフローサイトメトリーによる細胞周期の解析、残り半分をWestern Blotによりmitosis特異的マーカー候補 （Aurora A、Aurora B、phospho-Aurora B、Survivin、cyclin B1、Plk1）の抗体を用いた解析を行なった。
図１７に示すとおり、同調HeLaS3細胞は通常リリース後9‐10時間後にM期を通過しそれに伴ってAurora Bの活性化(リン酸化)が検出される(mock及びLuc)。ところが、siRNAによりAurora Aをノックダウンさせた細胞ではAurora B (Thr232)のリン酸化の亢進と持続、すなわちmitotic delayが観察された（si-A1及びsi-A2）。一方、Aurora BのノックダウンではAurora Bリン酸化自体まったく起こらなかった（si-B1及びsi-B2）。
また、図１８に示すとおり、非同調のHeLaS3細胞では通常Aurora Bのリン酸化は観察されないが、Aurora A siRNA処理のときにのみphospho-Aurora Bが検出されることがわかった （phos-AurB）。また、図１９に示すとおり、このときの細胞は細胞周期解析でもM期細胞の割合が増大していることがわかった。
さらに、同じ細胞抽出液中の他のM期のマーカー候補のいくつかをWestern Blotで検出した。図１８に示すとおり、これらの遺伝子は非同調細胞でも検出され、M期での発現上昇との倍率があまり大きくないか（Survivin及びcyclin B1）、又はAurora A, Bいずれをノックダウンしても検出されAurora A阻害特異的なマーカーとしては利用できない（Plk1）ことがわかった。
以上より、siRNAでAurora Aを特異的に欠失させた細胞中でAurora B (Thr232)のリン酸化が上昇することが明らかとなり、Aurora A阻害に特異的なマーカーとしてphospho-Aurora B (Thr232)が使える可能性のあることが確認できた。
実施例６
（Aurora A選択性阻害剤のpharmacodynamicマーカーの探索）
Aurora A選択的阻害剤によるAurora B(Thr232)リン酸化の濃度依存的な誘導を確認するため、下記の試験を実施した。
（Aurora A選択性阻害剤のpharmacodynamicマーカーの探索）
Aurora A選択的阻害剤によるAurora B(Thr232)リン酸化の濃度依存的な誘導を確認するため、下記の試験を実施した。
先ず、非同調の培養HeLaS3細胞を1x106個播種して一晩37℃、5％ CO2下で培養した。翌日10:00に6-((4-(3-chloro-2-fluorobenzoyl)piperazin-1-yl) methyl)-N-thiazol-2-ylpyridin-2-amineを終濃度0、30、100、300、1000、3000、10000、又は30000nMになるように添加した培地に交換し、その後8時間及び24時間後に細胞をトリプシンで剥がして回収し、半分をWestern Blot用、残り1／4をフローサイトメトリーによる細胞周期の解析、残り1／4をhistoneH3 (Ser10)のリン酸化解析に使用した。また、同様に処理した細胞サンプルを用いてTaqMan-PCRによりexpression profilingも実施した。
図２０（８時間）及び図２１（２４時間）に示したとおり、Aurora A選択的阻害剤の効果として、300nM付近からM期の割合が増加し始め10μM付近まで見られた。
この場合、図２２に示すとおり、phospho-Aurora B (Thr232)の発現は、8時間、24時間いずれの暴露時間においてもAurora A選択的化合物の投与濃度に依存して増加することが観察された。なお、30μM以上でのリン酸化の減衰は化合物のAurora Bの阻害によるものと考えられる。一方、化合物投与によってAurora Bの発現量はあまり変動せず、phospho-Aurora B/Aurora B比は化合物濃度0nMのときを1とすると8時間暴露で最大16倍、24時間暴露で10倍まで上昇することが確認された。これに対してSurvivin、Plk1は化合物を加えないバックグランドで発現が認められ発現誘導によるウィンドウはphospho-Aurora Bと比べると最大で3.5倍と小さかった。また、図２３に示すとおり、HistoneH3(Ser10)リン酸化についてはフローサイトメトリーでも同様に大きくウィンドウが取れないことが明らかとなった。
以上より、siRNAによるAurora Aノックダウンした場合と同様にAurora A選択的化合物の投与によってもphospho-Aurora B (Thr232)が特異的に誘導されることが明らかとなった。さらにその誘導がAurora A阻害によるmitotic delayの薬効と相関して上昇していた。しかし、Aurora B阻害が始まる濃度域（>30μM）ではAurora Bのリン酸化は再び阻害されることからAurora A阻害のpharmacodynamic markerとして利用可能であることが確認できた。
実施例７
（Aurora B (Thr232)リン酸化のAurora A阻害特異性）
phospho-Aurora B (Thr232)がAurora A阻害特異的であることを確認するため、Aurora B阻害剤、pan-Aurora阻害剤 （A/B-dual inhibitor）を用いて下記の試験を行った。
（Aurora B (Thr232)リン酸化のAurora A阻害特異性）
phospho-Aurora B (Thr232)がAurora A阻害特異的であることを確認するため、Aurora B阻害剤、pan-Aurora阻害剤 （A/B-dual inhibitor）を用いて下記の試験を行った。
先ず、HeLaS3細胞を前述のダブルチミジンブロックによってG1/S境界に同調させ、リリース開始から4時間後にコントロール（DMSO、final 0.5%）、Aurora A選択的阻害剤である6-((4-(2,3-diｆluorobenzoyl) piperazin-1-yl) methyl) -N-thiazol-2-ylpyridin-2-amine（図２４中、「Aurora A阻害剤１」と示す。）、Aurora B阻害剤であるZM477439（J.Cell.Biol.、第161巻、267頁、2003年）又はpan-Aurora阻害剤であるVX-680を300 nM添加し、0〜24時間までの経時的なサンプリングを行った。次に、Western Blotによりtotal Aurora Bとphospho-Aurora B (Thr232)の発現を調べた。
図２４に示すとおり、Aurora Bの発現はM期にかけて緩やかに上昇するがあまり大きな変動はなかった。一方、phospho-Aurora BはM期を通過する9〜10時間頃にだけ一過性の上昇が観察された。また、細胞がM期通過後はAurora Bもphospho-Aurora Bも急速に減少した。それに対して、Aurora A選択的阻害剤で処理した細胞ではAurora Bが10時間以後も高発現しており、phospho-Aurora Bはさらに顕著な増加を示した。ところがAurora B阻害剤又はpan-Aurora阻害剤を処理した細胞ではAurora Bがコントロールとほぼ同等レベルの量が検出されるのに対して、phospho-Aurora Bはまったく検出されなかった。
以上より、pan-Aurora阻害剤、Aurora B阻害剤又はAurora B siRNA処理のいずれでもAurora B (Thr232)リン酸化はほぼ阻害され検出不可能であることが確認できた。従って、Aurora BはAurora A阻害に特異的なマーカーであることが明らかとなった。
実施例８
（非同調HeLaS3細胞におけるAurora A選択的阻害剤によるhistone H3 (Ser28)のリン酸化の増大）
histone H3 (Ser28)リン酸化がphospho-Aurora Bと同じくAurora A阻害特異的なPDマーカーとして利用可能かどうかを確認するため、下記の試験を行った。
（非同調HeLaS3細胞におけるAurora A選択的阻害剤によるhistone H3 (Ser28)のリン酸化の増大）
histone H3 (Ser28)リン酸化がphospho-Aurora Bと同じくAurora A阻害特異的なPDマーカーとして利用可能かどうかを確認するため、下記の試験を行った。
先ず、非同調の培養HeLaS3細胞を用いて、実施例５と同様にLuc、Aurora A(A2)又はAurora B(B2)siRNAをトランスフェクションし、Western blotによりhistone H3のSer28及びSer10のリン酸化を調べた。またAurora A選択的阻害剤の濃度依存的な誘導をphospho-Aurora B (Thr232)と比較し、同時にpan-Aurora阻害剤で検出されるかどうかについても確認した。
図２５に示すとおり、siRNAによるAurora Aノックダウンによるhistone H3 (Ser28)のリン酸化はSer10と同様に上昇することがわかった。しかしAurora BノックダウンではSer10リン酸化が依然として残っているのに対してSer28のリン酸化はほぼ消失した。このことからSer28のリン酸化はphospho-Aurora Bと同様にAurora A阻害特異的に誘導されるマーカーと考えられた。さらに、図２６に示すとおり、Aurora A選択的阻害剤の濃度依存的な誘導がphospho-Aurora Bとほぼ同じ濃度域で認められ、またpan-Aurora阻害剤では完全にリン酸化バンドが消失することからphospho-histone H3 (Ser28)はphospho-Aurora B （Thr232）同様にPDマーカーとして利用することが可能と考えられた。なお、図２６において、Compound Aは6-((4-(2,3-diｆluorobenzoyl) piperazin-1-yl) methyl) -N-thiazol-2-ylpyridin-2-amineを示し、Coumound BはVX-680を示す。
本発明によれば、Aurora A阻害剤を生体に投与した際にAurora A特異的に当該阻害剤が作用したか否かを検出する遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを得ることが可能となり、これらのマーカーの発現を指標として、簡便且つ非侵襲的にAurora A阻害剤の薬効の予測又は診断を行うことが可能となる。
従って、Aurora A阻害剤の投薬や臨床開発の際に、阻害剤の薬効を簡便且つ非侵襲的に測定することが可能となり、適切な投薬や迅速な創薬研究に有用となる。
Claims (18)
- Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断する遺伝子マーカーであって、
該遺伝子が、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子である、遺伝子マーカー。 - Aurora A阻害剤が抗癌剤である、請求項１に記載の遺伝子マーカー。
- 癌の治癒成績を判定する遺伝子マーカーであって、
該遺伝子が、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子である、遺伝子マーカー。 - 前記癌の治癒がAurora A阻害剤によるものである、請求項３に記載の遺伝子マーカー。
- Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子を検出可能なPCRプライマーを含む、癌診断キット。
- Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子の部分ヌクレオチドを備え、Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断に用いることを特徴とする、DNAマイクロアレイ。
- Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断するタンパク質マーカーであって、
該タンパク質が、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質である、タンパク質マーカー。 - Aurora A阻害剤が抗癌剤である、請求項７に記載のタンパク質マーカー。
- 癌の治癒成績を判定するタンパク質マーカーであって、
該遺伝子が、Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質である、タンパク質マーカー。 - 前記癌の治癒がAurora A阻害剤によるものである、請求項９に記載のタンパク質マーカー。
- 請求項７〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質マーカーを検出可能な抗体を含む、癌診断キット。
- Aurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質の抗体を備え、Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断に用いることを特徴とする、抗体アレイ。
- Aurora A阻害剤を投与した被検体由来の組織におけるAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子を検出する検出工程と、
Aurora A阻害剤投与前後の発現量を比較する比較工程を含む、Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法。 - 前記検出に用いる検出手段がPCR又はDNAマイクロアレイである、請求項１３に記載のAurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法。
- Aurora A阻害剤を投与した被検体由来の組織におけるAurora B、Histone H3、BIRC5、PRC1、DLG7、TACC3及びKNTC2からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質を検出する検出工程と、
Aurora A阻害剤投与前後の発現量を比較する比較工程を含む、Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法。 - 前記検出に用いる検出手段が抗Aurora B抗体、抗Histone H3抗体、抗BIRC5抗体、抗PRC1抗体、抗DLG7抗体、抗TACC3抗体又は抗KNTC2抗体である、請求項１５に記載のAurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法。
- Aurora A阻害剤が抗癌剤である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のAurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法。
- 前記組織が血液、皮膚、毛根、口腔粘膜、消化管、骨髄又は癌組織である、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載のAurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法。
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