JP2022517563A - タンパク質キナーゼバイオマーカーと組み合わせた、多標的キナーゼ阻害剤を使用したがんの処置 - Google Patents

Abstract

チロシンキナーゼ阻害剤を用いて、患者におけるがんを処置するための方法を、本明細書において提供する。本方法は、ａ）患者から得られた試料中のタンパク質キナーゼの発現レベルを測定することと、ｂ）タンパク質キナーゼの発現レベルを、対応する参照の発現レベルと比較することと、ｃ）患者がチロシンキナーゼ阻害剤に応答性である可能性を決定することと、ｄ）タンパク質キナーゼの発現レベルによって応答性であろうことが示された患者を、チロシンキナーゼ阻害剤を用いて処置することと、を含む。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１月２日出願のＰＣＴ／ＣＮ２０１９／０７００４１に基づく優先権を主張するものであり、その開示を本明細書に参考として組み込む。

配列表
２６ＫＢであり（マイクロソフト社のＷｉｎｄｏｗｓで測った場合）、２０２０年１月２日に作成された、「０７１０１７－８００６ＷＯ０２－ＳＬ－２０２００１０２＿ＳＴ２５」という名称のファイルに含まれる配列表は、本明細書に添付して電子提出によって提出し、かつ本明細書に参考として組み込む。

本発明は、全般的にがんの処置に関する。詳細には、本発明は、タンパク質キナーゼバイオマーカーと組み合わせた、多標的キナーゼ阻害剤を使用してがんを処置するための方法に関する。

多標的チロシンキナーゼ阻害剤は、がん、例えば非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（例えば、Ｍｏｋ ＴＳ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（２００９）３６１：９４７－５７を参照のこと）などの処置においてますます重要な役割を果たすようになってきた。多標的化されたチロシンキナーゼの抗腫瘍効果が有望であることは、通常、がんは不均一な悪性腫瘍であるため、単一標的薬の有効性は多くの場合不十分であるという理論に基づく。主要なシグナル伝達経路を遮断した場合、単一標的薬は腫瘍エスケープ機構を活性化させるおそれもある。その結果、他の経路を介して、腫瘍細胞増殖が再活性化されるおそれがある。したがって、可能な限り多くの腫瘍シグナル経路を阻害するように、薬物は最適化されなくてはならない。

理論上の利点にも関わらず、多標的チロシンキナーゼ阻害剤の臨床試験の多くは、満足のいく結果を示さなかった（Ｚｈｏｕ Ｃ，Ｔｒａｎｓｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１２）１：７２－７７を参照のこと）。したがって、多標的チロシンキナーゼ阻害剤を使用した処置の有効性を改善するための治療体制を考案し、開発する必要がある。

一態様では、本開示は、チロシンキナーゼ阻害剤を用いて、患者におけるがんを処置するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、ａ）患者から得られた試料中の第１のタンパク質キナーゼの発現レベルを測定することと、ｂ）第１のタンパク質キナーゼの発現レベルを、対応する参照の発現レベルと比較することと、ｃ）患者がチロシンキナーゼ阻害剤に応答性である可能性を決定することと、ｄ）第１のタンパク質キナーゼの発現レベルによって応答性であろうことが示された患者を、チロシンキナーゼ阻害剤を用いて処置することと、を含む。

ある種の実施形態では、第１のタンパク質キナーゼは、ＤＤＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤＫＬ２、ｃＫｉｔ、ｃ－ＲＡＦ、Ｆｌｔ１、Ｆｌｔ４、ＫＤＲ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＰＤＧＦＲα、ＰＴＫ５、Ｒｅｔ、ＳＡＰＫ２ｂおよびＺＡＫからなる群から選択される。ある種の実施形態では、第１のタンパク質キナーゼは変異を含有する。一実施形態では、変異は、ｃＫｉｔ（Ｖ５６０Ｇ）またはＰＤＧＦＲα（Ｖ５６１Ｄ）である。一実施形態では、第１のタンパク質キナーゼはＤＤＲ１またはＣＳＦ１Ｒである。

ある種の実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は多標的チロシンキナーゼ阻害剤である。一部の実施形態では、多標的チロシンキナーゼ阻害剤は、第１のタンパク質キナーゼとは異なる第２のタンパク質キナーゼを優先的に阻害する。さらに別の実施形態では、第２のタンパク質キナーゼはＫＤＲである。

ある種の実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは化合物である。一部の実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩である。

式中、
Ｒ_１は水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６ハロアルキル、ハロまたはシアノであり、
ＭはＣＨまたはＮであり、
ＬはＯ、ＮＨまたはＮ（ＣＨ_３）であり、
ＡはＣＲ_５またはＮであり、
ＷはＣＲ_６またはＮであり、
Ｒ_２、Ｒ_５およびＲ_６はそれぞれ独立に水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６ハロアルキル、ハロ、Ｃ_３～７シクロアルキルまたはシアノであり、
Ｘ、ＹおよびＺはそれぞれ独立にＣＨまたはＮであり、
Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ独立に水素、ハロ、シアノ、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６ハロアルキル、Ｃ_２～６アルケニル、ヒドロキシル－Ｃ_１～６アルキル、ジ－（Ｃ_１～６アルキルアミノ）－Ｃ_１～６アルキル、アミノ、Ｃ_１～６アルキルアミノ、Ｃ_３～７シクロアルキルアミノ、ジ－（Ｃ_１～６アルキル）アミノ、アミノ－Ｃ_１～６アルキルアミノ、Ｃ_１～６アルコキシ－Ｃ_１～６アルキルアミノ、Ｃ_１～６アルコキシカルボニル－Ｃ_１～６アルキルアミノ、ジ－（Ｃ_１～６アルコキシ－Ｃ_１～６アルキル）アミノ、アミノカルボニル、Ｃ_１～６アルキルアミノカルボニル、ジ－（Ｃ_１～６アルキル）アミノカルボニル、Ｃ_３～７シクロアルキルアミノカルボニル、Ｃ_１～６アルコキシ、Ｃ_３～７シクロアルコキシ、ヒドロキシル－Ｃ_１～６アルコキシ、Ｃ_１～６ハロアルコキシ、アミノ－Ｃ_１～６アルキル、アミノ－Ｃ_１～６アルコキシ、Ｃ_１～６アルキルスルホニル、Ｃ_２～６アルケニルスルホニル、Ｃ_３～７シクロアルキルスルホニル、場合によりＢで置換されているヘテロシクリル、場合によりＢで置換されているアリール、場合によりＢで置換されているヘテロアリール、Ｃ_１～６アルキルスルホニルアミノ、Ｃ_２～６アルケニルスルホニルアミノ、Ｃ_３～７シクロオアルキルスルホニルアミノ〔cyclooalkylsulfonylamino〕、アミド、Ｃ_１～６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_２～６アルケニルカルボニルアミノ、Ｃ_３～７シクロオアルキルカルボニルアミノ〔cyclooalkylcarbonylamino〕、Ｃ_１～６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_３～７シクロアルコキシカルボニルアミノ、ウレイド、Ｃ_３～７シクロアルキル、Ｃ_３～７ハロシクロアルキル、ヘテロシクリル－オキシ、ピペリジニルアミノ、Ｎ－メチル－ピペリジニル－４－カルボニル、ピペラジニル－Ｃ_１～６アルキル、ピロリルカルボニルアミノ、Ｎ－メチル－ピペリジニルカルボニルアミノ、もしくはヘテロシクリル－Ｃ_１～６アルコキシであるか、または
Ｒ_３およびＲ_４は共に、それらが結合する芳香環中の原子と３から８員環を形成しており、
Ｂは水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６ハロアルキル、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アミノ、Ｃ_１～６アルキルアミノ、Ｃ_３～７シクロアルキルアミノ、ジ－（Ｃ_１～６アルキル）アミノ、シアノ、またはＣ_３～７シクロアルキルである。

一実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤はＣＢＴ－１０２であり、以下の構造を有する。

ある種の実施形態では、発現レベルは、ＲＮＡレベル、タンパク質レベル、またはタンパク質活性化レベルである。ある種の実施形態では、タンパク質キナーゼの発現レベルは、増幅アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、シークエンシングアッセイもしくはアレイ、またはウエスタンブロット、免疫組織化学（ＩＨＣ）もしくはＥＬＩＳＡなどの抗体をベースにしたアッセイによって測定される。ある種の実施形態では、キナーゼのタンパク質活性化レベルは、タンパク質キナーゼのリン酸化を検出することによって測定される。

ある種の実施形態では、がんは、胃がん、肺がん、食道がん、黒色腫、腎臓がん、肝臓がん、骨髄腫、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、血液がん、白血病および非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。一部の実施形態では、がんは、胃がん、肺がん、結腸直腸がん、肝臓がん、食道がん、腎臓がんまたは乳がんである。

別の態様では、本開示は、患者におけるがん療法を継続するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、ａ）チロシンキナーゼ阻害剤を用いて患者を処置することと、ｂ）その患者から腫瘍試料を得ることと、ｃ）第１のタンパク質キナーゼの発現レベルを測定することと、ｄ）第１のタンパク質キナーゼの発現レベルを、対応する参照の発現レベルと比較することと、ｅ）患者がチロシンキナーゼ阻害剤に応答性である可能性を決定することと、ｆ）腫瘍試料中の第１のタンパク質キナーゼの発現レベルが応答性を明示した場合にがんの処置を継続することと、を含む。

さらに別の態様では、本開示は、患者がチロシンキナーゼ阻害剤を使用したがんの処置に応答性である可能性を決定するためのキットの製造における、第１のタンパク質キナーゼの発現レベルを測定する薬剤の使用を提供する。一実施形態では、第１のタンパク質キナーゼは、ＤＤＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤＫＬ２、ｃＫｉｔ、ｃ－ＲＡＦ、Ｆｌｔ１、Ｆｌｔ４、ＫＤＲ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＰＤＧＦＲα、ＰＴＫ５、Ｒｅｔ、ＳＡＰＫ２ｂおよびＺＡＫからなる群から選択される。ある種の実施形態では、薬剤はプライマーまたは抗体である。

さらに別の態様では、本開示は、患者がチロシンキナーゼ阻害剤を使用したがんの処置に応答性である可能性を決定するためのキットを提供する。ある種の実施形態では、キットは、患者から得られた試料中の第１のタンパク質キナーゼの発現レベルを測定する薬剤を含む。ある種の実施形態では、薬剤はプライマーまたは抗体である。ある種の実施形態では、第１のタンパク質キナーゼは、ＤＤＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤＫＬ２、ｃＫｉｔ、ｃ－ＲＡＦ、Ｆｌｔ１、Ｆｌｔ４、ＫＤＲ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＰＤＧＦＲα、ＰＴＫ５、Ｒｅｔ、ＳＡＰＫ２ｂおよびＺＡＫからなる群から選択される。一実施形態では、キットは第２の抗体をさらに含む。

図１は、ＰＤＸモデル群における、ＣＢＴ－１０２のインビボでの有効性を図示する。 図２Ａは、ＰＤＸ腫瘍における、ＤＤＲ１の発現に対するＣＢＴ－１０２の有効性を図示する。 図２Ｂは、ＰＤＸ腫瘍における、ＤＤＲ１の発現とＣＢＴ－１０２の有効性との間の関係についての統計結果を図示する。 図３Ａは、肺がんにおける、ＤＤＲ１の発現に対するＣＢＴ－１０２の有効性を図示する。 図３Ｂは、肺がんにおける、ＤＤＲ１の発現とＣＢＴ－１０２の有効性との間の関係についての統計結果を図示する。 図４Ａは、Ｍ－ＮＦＳ－６０細胞でのＩＣ５０の決定を図示する。図４Ｂは、ＲＡＷ２６４．７細胞でのＩＣ５０の決定を図示する。 図５は、ＭＣ３８モデルにおける、ＣＢＴ－１０２の有効性を図示する。 図６は、ＭＣ－３８腫瘍において、ＣＢＴ－１０２がＦ４－８０のＩＨＣスコアを低減させたことを図示する。 図７は、ＭＣ－３８腫瘍において、ＣＢＴ－１０２は、Ｔ細胞表面マーカーであるＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８に対しては顕著な影響を及ぼさなかったが、マクロファージ表面マーカーであるＦ４－８０に対しては影響を及ぼしたことを図示する。

本開示をより詳細に説明する前に、本開示は記載した特定の実施形態に限定されず、それ自体もちろん変化することができることを理解されたい。本明細書で使用した専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであって、限定を意味するものではなく、なぜならば、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるからであることも理解されたい。

他に規定しなければ、本明細書で使用した技術用語および科学用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で記載したものと類似の、または同等のいかなる方法および材料も本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。

本明細書で引用した刊行物および特許は全て、それぞれ個々の刊行物または特許が具体的かつ個々に参考として組み込まれることが指示されているように参考として本明細書に組み込まれており、刊行物が引用されたものに関連して方法および／または材料を開示して記載するために、参考として本明細書に組み込まれている。いかなる刊行物の引用も、その開示が本出願日より前であるためであり、本開示は先行開示によりこのような刊行物に先行する権利がないことの承認と解釈されるべきではない。さらに、提供された刊行物の日付は、個別に確認する必要があり得る実際の刊行日とは異なっていてもよい。

本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書で記載し例示した個々の実施形態のそれぞれは、本開示の範囲または精神を逸脱することなく、その他のいくつかの実施形態のいずれかの特性から容易に分離するか、または一緒にすることができる別個の構成成分および特性を有する。任意の引用した方法は、引用した事象の順番で、または論理的に可能な任意のその他の順番で実施することができる。

定義

以下の定義は読者を支援するために提供される。他に規定しなければ、本明細書で使用した技術用語、表記およびその他の科学的用語または医学用語または専門用語は全て、化学および医学技術分野の当業者によって通常理解される意味を有するものとする。場合によっては、通常理解される意味を有する用語は、明瞭になるように、および／または容易に参照できるように本明細書で定義されており、本明細書にこのような定義を含めることは、当技術分野で一般的に理解されるような用語の定義をめぐる実質的な違いを表すためのものと必ずしも解釈されるべきではない。

本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他のことを指示していない限り、複数の参照物を含む。

用語「量」または「レベル」は、試料中に存在する目的のポリヌクレオチドまたは目的のポリペプチドの量を意味する。このような量は、絶対的に、すなわち、試料中のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全量で表現されているか、あるいは相対的に、すなわち、試料中のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの濃度で表現されていてもよい。

本明細書で使用する場合、用語「投与〔administering〕」は、医薬剤または医薬組成物を対象に与えることを意味し、限定されるものではないが、医療従事者による投与および自己投与を含む。

本明細書で使用する場合、「抗体」には、例えば、単鎖抗体、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）および異種結合抗体〔heteroconjugate antibody〕（例えば、二重特異性抗体）を含めた、天然に存在する免疫グロブリンおよび天然に存在しない免疫グロブリンが包含される。抗体の断片には、抗原に結合するもの（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびｒＩｇＧ）が含まれる。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４－１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）も参照のこと。用語の抗体には、二価または二重特異性分子、ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディも含まれる。用語「抗体」にはさらに、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が含まれる。

本明細書で使用する場合、用語「がん」は、異常な細胞増殖が関与する任意の疾患を意味し、体内の任意の組織、器官または細胞に影響を及ぼす疾患の全病期および全形態を含む。この用語には、悪性、良性、軟組織または固形物として特徴づけられる公知のがんおよび新生物状態の全て、ならびに転移前および転移後のがんを含む全病期およびグレードのがんが含まれる。全般的に、がんは、がんが位置する、またはがんが発生した組織または器官ならびに癌性組織および細胞の形態によって分類することができる。本明細書で使用する場合、がんの種類には、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、肛門がん、星状細胞腫、小児小脳または大脳基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨腫瘍、脳がん、乳がん、バーキットリンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸がん〔colon cancer〕、肺気腫、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユーイングファミリーの腫瘍、ユーイング肉腫、胃〔gastric〕（胃〔stomach〕）がん、神経膠腫、頭部および頸部がん、心臓がん、ホジキンリンパ腫、膵島細胞癌（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓がん（腎細胞がん）、咽頭がん〔laryngeal cancer〕、白血病、肝臓がん、肺がん、髄芽腫、黒色腫、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、咽頭がん〔pharyngeal cancer〕、前立腺がん、直腸がん、腎細胞癌（腎臓がん）、網膜芽細胞腫、皮膚がん、胃〔stomach〕がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣がん、咽頭がん〔throat cancer〕、甲状腺がん、膣がん、視覚路および視床下部神経膠腫が含まれる。

用語「がん試料」には、１つまたは複数のがん細胞を含有する生物学的試料または生物源からの試料が含まれる。生物学的試料には、体液、例えば、血液、血漿、血清もしくは尿の試料、または、例えば生検によって、細胞、組織もしくは器官、好ましくは、がん細胞を含むかもしくは本質的にはがん細胞からなることが疑われる腫瘍組織から得られた試料が含まれる。

本明細書で使用する「細胞」は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。原核細胞には、例えば、細菌が含まれる。真核細胞には、例えば、真菌、植物細胞および動物細胞が含まれる。動物細胞（例えば、哺乳類細胞またはヒト細胞）の種類には、例えば、循環／免疫系または器官の細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞、顆粒球（例えば、好塩基性顆粒球、好酸性顆粒球、好中性顆粒球および過分葉好中球）、単核球またはマクロファージ、赤血球細胞（例えば、網状赤血球）、肥満細胞、血小板または巨核球、および樹状細胞、内分泌系または器官の細胞、例えば、甲状腺細胞（例えば、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞）、副甲状腺細胞（例えば、副甲状腺主細胞、好酸性細胞）、副腎細胞（例えば、クロム親和性細胞）および松果体の細胞（例えば、松果体細胞）；神経系または器官の細胞、例えば、神経膠芽細胞（例えば、星状膠細胞および乏突起膠細胞）、小膠細胞、巨細胞性神経分泌細胞、星状細胞、ベッチェル細胞および下垂体細胞（例えば、性腺刺激ホルモン分泌細胞、副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞、甲状腺刺激ホルモン分泌細胞、成長ホルモン分泌細胞および乳腺刺激ホルモン分泌細胞）；呼吸系または器官の細胞、例えば、肺胞細胞（Ｉ型肺胞細胞およびＩＩ型肺胞細胞）、クララ細胞、杯状細胞、肺胞マクロファージ；循環系または器官の細胞、例えば、心筋細胞および周辺細胞；消化系または器官の細胞、例えば、胃主細胞、壁細胞、杯状細胞、パネート細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、Ｉ細胞、Ｋ細胞、Ｓ細胞、腸内分泌細胞、腸クロム親和性細胞、ＡＰＵＤ細胞、肝臓の細胞（例えば、肝実質細胞およびクッパー細胞）；外被系または器官の細胞、例えば、骨の細胞（例えば、骨芽細胞、骨細胞および破骨細胞）、歯の細胞（例えば、セメント芽細胞およびエナメル芽細胞）、軟骨の細胞（例えば、軟骨芽細胞および軟骨細胞）、皮膚／髪の細胞（例えば、毛胞、角化細胞およびメラニン形成細胞（母斑細胞）、筋肉細胞（例えば、筋細胞）、脂肪細胞、線維芽細胞および腱細胞）、泌尿器系または器官の細胞（例えば、有足細胞、傍糸球体細胞、糸球体内メサンギウム細胞、糸球体外メサンギウム細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞および緻密斑細胞）ならびに生殖器系または器官の細胞（例えば、精子、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、卵子、卵母細胞）が含まれる。細胞は、正常で健康な細胞であるか、または病的で不健康な細胞（例えば、がん細胞）であってもよい。

用語「相補性」は、伝統的なワトソン－クリックまたはその他の非伝統的な方法のいずれかによって、別の核酸配列と水素結合を形成する核酸の能力を意味する。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対）を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを指し示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は５０％、６０％＞、７０％＞、８０％＞、９０％および１００％相補性である）。

本開示では、「含む〔comprises〕」、「含んだ〔comprised〕」、「含んでいる〔comprising〕」、「含有する〔contains〕」、「含有している〔containing〕」などの用語は、米国特許法にある意味を有し、これらは包括的またはオープンエンドであり、追加的な、引用されていない要素または方法ステップを排除しないことに注意されたい。「から本質的になっている〔consisting essentially of〕」および「から本質的になる〔consists essentially of〕」などの用語は、米国特許法にある意味を有し、これらは請求された発明の基本的で新規な特質に著しい影響を及ぼさない追加的な成分またはステップを含むことを許可する。用語「からなる〔consists of〕」および「からなっている〔consisting of〕」は米国特許法にあるものと見なされる意味を有し、すなわち、これらの用語はクローズエンドである。

用語「決定する」、「評価する」、「アッセイする」、「測定する」および「検出する」は同義に使用することができ、定量的および半定量的決定の両方を意味する。定量的および半定量的決定のいずれかを意味する場合、目的のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの「レベルを決定する」または目的のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを「検出する」という語句を使用することができる。

用語「ハイブリダイジング」は、ストリンジェント条件下で特定のヌクレオチド配列に対して優先的な核酸分子の結合、二本鎖形成またはハイブリダイジングを意味する。用語「ストリンジェント条件」は、混合した集団（例えば、組織生検からの細胞溶解物またはＤＮＡ調製物）中において、プローブがその標的部分配列に優先的にハイブリダイズし、その他の配列に対しては比較的少ない程度でハイブリダイズするか、または全くハイブリダイズしないハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を意味する。核酸ハイブリダイゼーションの場合におけるストリンジェント条件は、配列に依存し、異なる環境パラメータ下では異なる。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈ．２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ，”（１９９３）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に見いだされる。全般的に、高ストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列の融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（規定されたイオン強度およびｐＨで）標的配列の５０％が完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍに等しくなるように選択される。サザンまたはノーザンブロットにおいてアレイまたはフィルター上に１００個を上回る相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の一例は、標準的なハイブリダイゼーション溶液を使用して４２℃である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ ｅｄ．）Ｖｏｌ．１－３（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと）。高ストリンジェント洗浄条件の一例は、ＮａＣｌ ０．１５Ｍで７２℃で約１５分間である。ストリンジェント洗浄条件の一例は、０．２×ＳＳＣ洗浄で６５℃で約１５分間である。しばしば、バックグラウンドプローブシグナルを除去するために、高ストリンジェント洗浄に先行して低ストリンジェント洗浄を行う。例えば、１００ヌクレオチドを上回る二本鎖のための中程度ストリンジェント洗浄の一例は、１×ＳＳＣで４５℃で１５分間である。例えば、１００ヌクレオチドを上回る二本鎖のための低ストリンジェント洗浄の一例は、４×ＳＳＣから６×ＳＳＣで４０℃で１５分間である。

用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は同義に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドの多量体型、またはそれらの類似体を意味する。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、公知のまたは公知ではない任意の機能を果たすことができる。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｓｈＲＮＡ、一本鎖の短いかまたは長いＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、枝分かれポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、調節領域、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが含まれる。核酸分子は、直鎖状または環状であってもよい。

用語「患者由来異種移植（ＰＤＸ）」は、免疫不全マウスまたはヒト化マウスに、患者の腫瘍由来の組織または細胞を移植した、がんのモデルを意味する。ＰＤＸモデルは、がんの自然な増殖、そのモニタリング、および元の患者のための対応する処置の評価を可能にする環境を構築するために使用される。

本明細書で使用した「プライマー」は、７～４０ヌクレオチド、好ましくは１０～３８ヌクレオチド、好ましくは１５～３０ヌクレオチド、または１５～２５ヌクレオチド、または１７～２０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド分子を意味する。例えば、プライマーは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドであってもよい。プライマーは通常、当技術分野で周知のように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ配列の増幅において使用される。増幅されるＤＮＡ鋳型配列に対して、その５’上流および３’下流の配列における１対のプライマー、すなわち５’プライマーおよび３’プライマーを設計することができ、そのそれぞれが、ＤＮＡ二本鎖鋳型の分離した鎖に特異的にハイブリダイズすることができる。５’プライマーは、ＤＮＡ二本鎖鋳型のアンチセンス鎖に相補的であり、３’プライマーは、ＤＮＡ鋳型のセンス鎖に相補的である。当技術分野で公知のように、二本鎖ＤＮＡ鋳型の「センス鎖」は、ＤＮＡ鋳型から転写されたｍＲＮＡ配列に一致する配列（ＲＮＡにおける「Ｕ」がＤＮＡにおける「Ｔ」に対応することを除く）を含有する鎖であり、タンパク質産物をコードしている。センス鎖の相補的配列が、「アンチセンス鎖」である。本開示では、全ての配列番号はセンス鎖ＤＮＡであり、配列番号が相補的である配列がアンチセンス鎖ＤＮＡである。

がん療法に対する患者の応答の場合に使用したような用語「応答性の」、「臨床応答」、「陽性の臨床応答」などは同義に使用され、望ましくない応答、すなわち、有害事象とは対照的な、処置に対する望ましい患者の応答を意味する。患者において、有益な応答は、検出可能な腫瘍の消失（完全奏効、ＣＲ）、腫瘍サイズおよび／もしくはがん細胞数の減少（部分奏効、ＰＲ）、腫瘍増殖停止（安定、ＳＤ）、抗腫瘍免疫応答の増強、腫瘍の退縮もしくは排除を引き起こす可能性；腫瘍に関連した１つもしくは複数の症状のある程度までの軽減；処置後の生存の長さの延長；ならびに／または処置後の所与の時点での死亡率の減少を含む、いくつかの臨床パラメータを用いて表現することができる。腫瘍サイズおよび／またはがん細胞数および／または腫瘍転移の継続的な増加は、処置に対する有益な応答の欠如の指標である。集団において、薬物の臨床上の有益性、すなわち、その有効性は、１つまたは複数の評価項目に基づいて評価することができる。例えば、奏効率（ＯＲＲ）の分析は、応答者として薬物処置後にＣＲまたはＰＲを経験した患者を分類する。疾患制御（ＤＣ）の分析は、応答者として薬物処置後にＣＲ、ＰＲまたはＳＤを経験した患者を分類する。陽性の臨床応答は、任意の評価項目を使用して評価することができ、限定されるものではないが、（１）腫瘍増殖に対して減速および完全な増殖停止を含むある程度までの阻害、（２）腫瘍細胞数の低減、（３）腫瘍サイズの低減、（４）隣接する周辺器官および／もしくは組織への腫瘍細胞浸潤の阻害（すなわち、低減、減速または完全停止）、（５）転移の阻害、（６）腫瘍の退縮もしくは排除を引き起こす可能性がある抗腫瘍免疫応答の増強、（７）腫瘍に関連した１つもしくは複数の症状のある程度までの軽減、（８）処置後の生存の長さの延長、ならびに／または（９）処置後の所与の時点での死亡率の減少を含む有益性を患者に対して示す。陽性の臨床応答はまた、臨床成績の様々な測定を用いて表現することができる。陽性の臨床成績はまた、同程度の臨床診断を有する患者集団の成績に対して個々の成績について考慮することができ、無再発期間（ＲＦＩ）の延長、集団の全生存期間（ＯＳ）と比較した生存時間の延長、無病生存期間（ＤＦＳ）の延長、無遠隔再発期間（ＤＲＦＩ）の延長などの様々な評価項目を使用して評価することができる。追加の評価項目には、無イベント（ＡＥ）生存の可能性、無転移性再発（ＭＲ）生存（ＭＲＦＳ）の可能性、無病生存（ＤＦＳ）の可能性、無再発生存（ＲＦＳ）の可能性、初回増悪（ＦＰ）の可能性および無遠隔転移生存（ＤＭＦＳ）の可能性が含まれる。陽性の臨床応答の可能性の増加は、がん再発または再燃の可能性の減少に対応する。

本明細書で使用した用語「標準対照」または「参照レベル」は、確立された参照、例えば、正常組織試料、健康な非がん性組織試料、または二倍体であり形質転換されておらず非癌性でゲノム的に安定で健康なヒト細胞株中に存在する、予め決定された量または濃度のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を意味する。標準対照値または参照値は、試験試料中に存在する特定のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を比較するための基礎として役立てるために、本発明の方法で使用するのに適している。標準対照として役立つ確立された試料は、正常な組織試料中において典型的な特定のｍＲＮＡまたはタンパク質の平均量を提供する。標準対照値は、試料の性質ならびにこのような対照値を確立する基となった対象の性別、年齢、民族性などのその他の要素に応じて変化し得る。

本明細書で使用した用語「試料」は、目的の対象から得られた生物学的試料を意味する。試料の例には、限定されるものではないが、例えば、血液、血漿、血清、尿、膣液、子宮もしくは膣洗浄液、胸水〔plural fluid〕、腹水、脳脊髄液、唾液、汗、涙、痰、気管支肺胞上皮洗浄液などの体液、および例えば、生検組織（例えば、生検用に採取された骨組織、骨髄、乳房組織、消化管組織、肺組織、肝組織、前立腺組織、脳組織、神経組織、髄膜組織、腎組織、子宮内膜組織、子宮頸部組織〔cervical dittuse〕、リンパ節組織、筋肉組織または皮膚組織）、パラフィンで包埋された組織などの組織が含まれる。ある種の実施形態では、試料はがん細胞を含む生物学的試料であってもよい。一部の実施形態では、試料は、例えば、腫瘍生検または穿刺吸引によって腫瘍から得られた、新鮮なまたは保管された試料である。試料はまた、がん細胞を含有する任意の生体液であってもよい。対象からの試料の収集は、生検中などに、病院または診療所が一般的に従う標準プロトコルに従って実施される。

本明細書で使用する場合、用語「対象」は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類）を意味する。ヒトには、出生前および出生後の形態が含まれる。多くの実施形態では、対象は人間である。対象は患者であってもよく、これは疾患の診断または処置のために医療機関に来院した人を意味する。用語「対象」は、本明細書では「個体」または「患者」と同義に使用される。対象は、疾患または障害に罹っているか、または罹りやすくてもよいが、疾患または障害の症状を表していてもいなくてもよい。

用語「処置」、「処置する」または「処置すること」は、がん（例えば、乳がん、肺がん、卵巣がんなど）の影響またはがんの症状を低減する方法を意味する。したがって、開示した方法では、処置はがんの重症度またはがんの症状の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低減を意味することができる。例えば、疾患を処置する方法は、対照と比較して対象における疾患の１つまたは複数の症状の１０％低減があるならば、処置であると見なされる。したがって、低減は、天然または対照レベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％または１０と１００％の間の任意のパーセントの低減であってもよい。処置は、疾患、病気または疾患もしくは病気の症状の、治癒または完全な消失を必ずしも意味する必要はないと理解されたい。

用語「腫瘍試料」には、１つまたは複数の腫瘍細胞を含有する生物学的試料または生物源からの試料が含まれる。生物学的試料には、体液、例えば、血液、血漿、血清もしくは尿の試料、または、例えば生検によって、細胞、組織もしくは器官、好ましくは、がん細胞を含むかもしくは本質的にはがん細胞からなることが疑われる腫瘍組織から得られた試料が含まれる。

タンパク質キナーゼの発現レベル

本明細書で記載した方法および組成物は、がん試料中での発現レベルが、チロシンキナーゼ阻害剤に対するがん患者の応答性の指標になる、タンパク質キナーゼの発見に部分的に基づいている。

タンパク質キナーゼは、標的タンパク質にリン酸基を化学的に付加すること、すなわちリン酸化によって他のタンパク質を修飾する酵素群である。リン酸化は通常、酵素活性、細胞局在または他のタンパク質との会合を変化させることによって、標的タンパク質に機能変化をもたらす。キナーゼによるタンパク質のリン酸化は、細胞内部のシグナルの通信（シグナル伝達）および細胞分裂などの細胞活動の制御における、重要な機構である。結果的に、タンパク質キナーゼは、多くの細胞機能における「オン」または「オフ」スイッチとして機能する。タンパク質キナーゼは、変異を生じて「オン」の状態から抜け出せなくなり、制御されない細胞増殖をもたらす可能性があるが、これはがんの発症にとって必要なステップである。したがって、イマチニブのようなキナーゼ阻害剤がしばしば効果的ながんの処置となる。ヒトゲノムは、約５００のタンパク質キナーゼ遺伝子を含有する。ほとんどのタンパク質キナーゼは、サブクラスであるセリン／スレオニンキナーゼとチロシンキナーゼに分類することができる。

セリン／スレオニンキナーゼは、標的タンパク質中のセリンまたはスレオニン残基のＯＨ基をリン酸化する。セリン／スレオニンキナーゼの例には、ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫファミリー、ストレス活性化タンパク質キナーゼのＪＮＫおよびｐ３８が含まれる。

タンパク質キナーゼのサブクラスであるチロシンキナーゼは、細胞中でＡＴＰのリン酸基をタンパク質に転移することができる酵素群であり、そこではリン酸基は、タンパク質上のアミノ酸残基のチロシンに結合する。ほとんどのチロシンキナーゼには関連するタンパク質チロシンホスファターゼがあり、それがリン酸基を除去する。

ある種の実施形態では、キナーゼは、ＤＤＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤＫＬ２、ｃＫｉｔ、ｃ－ＲＡＦ、Ｆｌｔ１、Ｆｌｔ４、ＫＤＲ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＰＤＧＦＲα、ＰＴＫ５、Ｒｅｔ、ＳＡＰＫ２ｂおよびＺＡＫからなる群から選択される。ある種の実施形態では、キナーゼは変異を含有する。一実施形態では、変異は、ｃＫｉｔ（Ｖ５６０Ｇ）またはＰＤＧＦＲα（Ｖ５６１Ｄ）である。一実施形態では、タンパク質キナーゼはＤＤＲ１またはＣＳＦ１Ｒである。

本明細書で使用したＤＤＲ１は、ＣＤ１６７ａ（表面抗原分類１６７ａ）としても知られる、ヒト遺伝子ディスコイジンドメイン受容体ファミリーのメンバー１を意味する。ＤＤＲ１は、正常および形質転換した上皮細胞中に広く発現し、各種のコラーゲンによって活性化されるチロシンキナーゼをコードする。ＤＤＲ１タンパク質は、細胞外ドメインにＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのタンパク質であるディスコイジンＩとの相同領域を有する、チロシンキナーゼ受容体のサブファミリーに属する。その自己リン酸化は、これまでに試験を行った全てのコラーゲン（タイプＩからタイプＶＩ）によってもたらされる。近縁のファミリーのメンバーは、ＤＤＲ２タンパク質である（Ｆｕ ＨＬ ｅｔ ａｌ．（Ｍａｒ ２０１３）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８８（１１）：７４３０－７）。Ｉｎ ｓｉｔｕでの研究およびノーザンブロット分析によって、ＤＤＲの発現は、上皮細胞、特に腎臓、肺、消化管および脳に限定されることが明らかになった。さらに、ＤＤＲ１は、乳房、卵巣、食道および小児脳のいくつかのヒトの腫瘍において顕著に過剰発現している。ＤＤＲ１遺伝子は、染色体６ｐ２１．３上に、いくつかのＨＬＡクラスＩ遺伝子に近接して位置する。この遺伝子の選択的スプライシングは、複数の転写バリアントをもたらす（“Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：ＤＤＲ１ ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ １”）。ある種の実施形態では、ＤＤＲ１のｍＲＮＡは、配列番号１の配列を有し、ＤＤＲ１のタンパク質は配列番号２の配列を有する。

本明細書で使用したＣＳＦ１Ｒは、マクロファージコロニー刺激因子受容体（Ｍ－ＣＳＦＲ）およびＣＤ１１５（表面抗原分類１１５）としても知られるコロニー刺激因子１受容体を意味し、ヒトではＣＳＦ１Ｒ遺伝子（ｃ－ＦＭＳとしても知られる）（ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ １４３６；Ｇａｌｌａｎｄ Ｆ，Ｓｔｅｆａｎｏｖａ Ｍ， Ｌａｆａｇｅ Ｍ，Ｂｉｒｎｂａｕｍ Ｄ（１９９２）Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ ６０（２）：１１４－６）がコードする細胞表面タンパク質である。ＣＳＦ１Ｒタンパク質は９７２のアミノ酸を有し、予測分子量は１０８ｋＤａである。ＣＳＦ１Ｒタンパク質は、シングルパスＩ型膜タンパク質であり、マクロファージの産生、分化および機能を制御するサイトカインであるコロニー刺激因子１の受容体として働く。ＣＳＦ１Ｒは、全てではないが、ＣＳＦ１の生物学的効果のほとんどを媒介する。ＣＳＦ１Ｒは、チロシンキナーゼ型膜貫通受容体であり、チロシン－タンパク質キナーゼのＣＳＦ１／ＰＤＧＦ受容体ファミリーのメンバーである（Ｘｕ Ｑ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．８（４０５）：ｒｓ１３；Ｍｅｙｅｒｓ ＭＪ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２０（５）：１５４３－７．）。リガンドの結合により、ＣＳＦ１Ｒは、多量体化およびトランス－リン酸化のプロセスを経て活性化する。多くのがんにおいて、および腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）上でＣＳＦ１Ｒが過剰発現していることから、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤（およびＣＳＦ１阻害剤）が、がんまたは炎症性疾患の可能性のある処置として長年研究されてきた（Ｐａｔｅｌ Ｓ，Ｐｌａｙｅｒ ＭＲ（２００９）Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．９（７）：５９９－６１０；Ｃａｎｎａｒｉｌｅ ＭＡ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．５（１）：５３）。ある種の実施形態では、ＣＳＦ１ＲのｍＲＮＡは配列番号３の配列を有し、ＣＳＦ１Ｒのタンパク質は配列番号４の配列を有する。

本明細書で使用したＣＤＫＬ２は、サイクリン依存性キナーゼ様２を意味し、ヒトではＣＤＫＬ２遺伝子（Ｔａｇｌｉｅｎｔｉ ＣＡ，Ｗｙｓｋ Ｍ，Ｄａｖｉｓ ＲＪ（Ｆｅｂ １９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１３（１２）：２５６３－７４；“Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：ＣＤＫＬ２ ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ ２（ＣＤＣ２－ｒｅｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ）”）がコードする酵素である。ＣＤＫＬ２は、ＣＤＣ－２関連セリン／スレオニンタンパク質キナーゼの大きなファミリーのメンバーである。それは主に細胞質に蓄積し、核内でのレベルはより低い（“Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：ＣＤＫＬ２ ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ ２（ＣＤＣ２関連キナーゼ）”）。

本明細書で使用したｃＫｉｔは、チロシン－タンパク質キナーゼＫＩＴ、ＣＤ１１７（表面抗原分類１１７）または肥満／幹細胞成長因子受容体（ＳＣＦＲ）としても知られる、癌原遺伝子ｃ－ＫＩＴを意味し、ヒトではＫＩＴ遺伝子（Ａｎｄｒｅ Ｃ ｅｔ ａｌ．（Ｊａｎｕａｒｙ １９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．３９（２）：２１６－２６）がコードする受容体型チロシンキナーゼタンパク質である。異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントが、この遺伝子に対して見いだされている（“Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：ＫＩＴ ｖ－ｋｉｔ Ｈａｒｄｙ－Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ ４ ｆｅｌｉｎｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ”；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｅｒｍｓ．ｃ－ｋｉｔ．Ａｃｃｅｓｓｅｄ Ｏｃｔｏｂｅｒ １３，２０１４．）。ＫＩＴは、猫肉腫ウイルス癌遺伝子ｖ－ｋｉｔの細胞性ホモログとして、１９８７年に、ドイツの生化学者であるＡｘｅｌ Ｕｌｌｒｉｃｈによって最初に記載された（Ｙａｒｄｅｎ Ｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６（１１）：３３４１－５１）。

ｃＫｉｔは、造血幹細胞および他の細胞種の表面に発現するサイトカイン受容体である。この受容体の変化形態が、一部の種類のがんに関連している可能性がある（Ｅｄｌｉｎｇ ＣＥ， Ｈａｌｌｂｅｒｇ Ｂ（２００７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３９（１１）：１９９５－８）。ｃＫｉｔは、受容体型チロシンキナーゼＩＩＩ型であり、「造血幹細胞因子」〔steel factor〕または「ｃ－ｋｉｔリガンド」としても知られる幹細胞因子（ある特定の種類の細胞に成長をもたらす物質）に結合する。ｃＫｉｔ受容体が幹細胞因子（ＳＣＦ）に結合すると、ｃ－Ｋｉｔ受容体は二量体を形成することで内在性のチロシンキナーゼ活性を活性化し、次いで細胞内にシグナルを伝播するシグナル伝達分子をリン酸化して活性化する（Ｂｌｕｍｅ－Ｊｅｎｓｅｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．（１９９１－１２－１０）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ．１０（１３）：４１２１－４１２８）。活性化後、この受容体は、ユビキチン化されることによって、リソソームに輸送され最終的に分解されるための標識を付ける。ｃＫｉｔを介したシグナリングは、細胞の生存、増殖および分化における役割を担う。例えば、ｃＫｉｔシグナリングは、メラニン形成細胞の生存に必要であり、造血および配偶子形成にも関与する（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｓａｍａｎｔｈａ（２００６），Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ａｔ ｔｈｅ ＫＩＴ ｌｏｃｕｓ ａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｏｒｓｅ（Ｔｈｅｓｉｓ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋｅｎｔｕｃｋｙ Ｄｏｃｔｏｒａｌ Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｓ．ｐｐ．１３－１６）。ｃＫｉｔ遺伝子の活性化変異は、消化管間質腫瘍、精巣精上皮腫、肥満細胞症、黒色腫、急性骨髄性白血病に関連する一方、不活性化変異は、遺伝子欠陥型限局性白皮症に関連する（“Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：ＫＩＴ ｖ－ｋｉｔ Ｈａｒｄｙ－Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ ４ ｆｅｌｉｎｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ”）。

本明細書で使用したｃ－ＲＡＦは、癌原遺伝子ｃ－ＲＡＦまたは単にＲａｆ－１としても知られる、ＲＡＦ癌原遺伝子セリン／スレオニン－タンパク質キナーゼを意味し、ヒトではＲＡＦ１遺伝子（Ｒａｐｐ ＵＲ ｅｔ ａｌ．（１９８３）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０（１４）：４２１８－２２；Ｂｏｎｎｅｒ Ｔ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３（４６３１）：７１－４）がコードする酵素（Ｌｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ．６４（３）：４７９－８２．）である。ｃ－Ｒａｆタンパク質は、膜結合性ＧＴＰアーゼのＲａｓサブファミリーの下流で機能するＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰ３Ｋ）として、ＥＲＫ１／２経路の一部を構成する（“Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：ＲＡＦ１ ｖ－ｒａｆ－１ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １”）。

本明細書で使用したＦｌｔ１は、血管内皮成長因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）を意味し、ヒトではＦＬＴ１遺伝子（Ｓｈｉｂｕｙａ Ｍ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｒｉｌ １９９０）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５（４）：５１９－２４）がコードするタンパク質である。Ｆｌｔ１は、ｓｒｃ遺伝子ファミリーに属し、癌遺伝子ＲＯＳ（ＭＩＭ １６５０２０）に関連する。このファミリーの他のメンバーのように、Ｆｌｔ１は、細胞増殖および分化の制御に重要なチロシンタンパク質キナーゼ活性を示す。化学的および遺伝学的手段によってＦｌｔ１を消失させると、マウスにおいて、白色脂肪組織の褐色脂肪組織への変換を増加させるとともに、褐色脂肪の血管新生も増進させることが最近見いだされた（Ｓｅｋｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２１５（２）：６１１－６２６）。ＦＬＴ１の機能的遺伝的変異（ｒｓ９５８２０３６）は、非小細胞肺がん生存率に影響を及ぼすことが見いだされた（Ｇｌｕｂｂ ＤＭ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．１０（７）：１０６７－７５．）。

本明細書で使用したＦｌｔ４は、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ４を意味し、ヒトではＦＬＴ４遺伝子（“Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：ＦＬＴ４ ｆｍｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ４”；Ｇａｌｌａｎｄ Ｆ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３（２）：４７５－８．）がコードするタンパク質である。Ｆｌｔ４遺伝子は、血管内皮成長因子ＣおよびＤのチロシンキナーゼ受容体をコードする。Ｆｌｔ４タンパク質は、リンパ管内皮のリンパ管新生および維持に関与すると考えられている。Ｆｌｔ４遺伝子の変異は、遺伝性リンパ浮腫ＩＡ型（“Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ： ＦＬＴ４ ｆｍｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ４”）の原因となる。

本明細書で使用したＫＤＲは、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ－２）、ＣＤ３０９（表面抗原分類３０９）およびＦｌｋ１（胎児肝キナーゼ１〔Fetal Liver Kinase 1〕）としても知られる、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ、ＩＶ型受容体型チロシンキナーゼ）を意味する。Ｑ４７２Ｈの生殖系列ＫＤＲの遺伝学的バリアントは、ＶＥＧＦＲ－２のリン酸化に影響を及ぼしており、ＮＳＣＬＣ中の微小血管密度に関連することが見いだされた（Ｇｌｕｂｂ ＤＭ ｅｔ ａｌ．（Ａｕｇｕｓｔ ２０１１）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１７（１６）：５２５７－６７）。ＫＤＲは、ＳＨＣ２、アネキシンＡ５およびＳＨＣ１と相互作用することが示された（Ｗａｒｎｅｒ ＡＪ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｒｉｌ ２０００）Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３４７（Ｐｔ ２）：５０１－９；Ｗｅｎ Ｙ ｅｔ ａｌ．（Ｍａｙ １９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２５８（３）：７１３－２１；Ｚａｎｅｔｔｉ Ａ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｒｉｌ ２００２）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２（４）：６１７－２２；Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ Ｇ ｅｔ ａｌ．（Ｍａｙ １９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３（５）：６９２－７０４）。

本明細書で使用したＭＡＰ４Ｋは、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ５を意味し、ヒトではＭＡＰ４Ｋ５遺伝子（Ｔｕｎｇ ＲＭ，Ｂｌｅｎｉｓ Ｊ（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４（６）：６５３－９；Ｓｃｈｕｌｔｚ ＳＪ，Ｎｉｇｇ ＥＡ （１９９４）Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ４（１０）：８２１－３０；“Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：ＭＡＰ４Ｋ５ ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ５”）がコードする酵素である。ＭＡＰ４Ｋは、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼファミリーのメンバーであり、酵母のＳＰＳ１／ＳＴＥ２０キナーゼに高度に類似している。酵母のＳＰＳ１／ＳＴＥ２０は、酵母のフェロモン応答に必須のＭＡＰキナーゼシグナルカスケードの開始近傍で機能する。ＭＡＰ４Ｋは、哺乳類細胞においてＪｕｎキナーゼを活性化することが示され、ストレス応答における役割が示唆された。同じタンパク質をコードする、２つの選択的にスプライシングされた転写バリアントが、この遺伝子に対して記載されている（“Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：ＭＡＰ４Ｋ５ ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ５”）。ＭＡＰ４Ｋ５は、ＣＲＫＬおよびＴＲＡＦ２に相互作用することが示された（Ｓｈｉ，Ｃ Ｓ；Ｔｕｓｃａｎｏ Ｊ；Ｋｅｈｒｌ Ｊ Ｈ（２０００）Ｂｌｏｏｄ ９５（３）：７７６－８２；Ｓｈｉ，Ｃ Ｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３（６）：３２７９－８５）。

本明細書で使用したＰＤＧＦＲαは、血小板由来成長因子受容体αを意味し、様々な種類の細胞の表面に位置する受容体である。ＰＤＧＦＲαは、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）のある特定のアイソフォームに結合することによって、細胞増殖および分化などの応答を惹起する細胞シグナリング経路の刺激における活性をもつようになる。ＰＤＧＦＲαは、胚形成の間のある特定の組織および器官の発達、ならびにこれらの組織および器官、特に血液組織を、一生を通じて維持することにおいて極めて重要である。ＰＤＧＦＲαをコードする遺伝子、すなわちＰＤＧＦＲα遺伝子における変異は、多くの臨床的に重要な新生物と関連している。成熟した、グリコシル化されたＰＤＧＦＲαタンパク質の分子量は、約１７０ｋＤである。

本明細書で使用したＰＴＫ５は、ｆｙｎ関連キナーゼ（ＦＲＫ）としても知られる、チロシンタンパク質キナーゼ５を意味し、ＦＲＫ遺伝子がコードする（Ｌｅｅ Ｊ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｒｉｌ １９９４）Ｇｅｎｅ．１３８（１－２）：２４７－５１；“Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：ＦＲＫ ｆｙｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ”）。この遺伝子がコードするタンパク質は、タンパク質キナーゼのチロシンキナーゼファミリーに属する。このチロシンキナーゼは核タンパク質であり、細胞周期のＧ１およびＳ期の間に機能して増殖を抑制する可能性がある（“Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：ＦＲＫ ｆｙｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ”）。ＦＲＫは、網膜芽細胞腫タンパク質と相互作用することが示されている（ＲＪ Ｃｒａｖｅｎ，ＷＧ Ｃａｎｃｅ，ＥＴ Ｌｉｕ（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５（１８）：３９６９－７２）。

本明細書で使用したＲｅｔは、細胞外シグナリング分子のグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーのメンバーに対する受容体型チロシンキナーゼをコードする、ＲＥＴ癌原遺伝子を意味する（Ｋｎｏｗｌｅｓ ＰＰ，Ｍｕｒｒａｙ－Ｒｕｓｔ Ｊ，Ｋｊａｅｒ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（４４）：３３５７７－８７）。ＲＥＴ機能喪失型変異は、ヒルシュスプルング病の発症に関連する一方、機能獲得型変異は、甲状腺髄様癌、多発性内分泌腫瘍症２Ａ型および２Ｂ型、褐色細胞腫ならびに副甲状腺過形成を含む、各種のヒトがんの発症に関連している。

「ＭＡＰＫ１１」としても知られる、ＳＡＰＫ２ｂは、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ１１を意味し、ヒトではＭＡＰＫ１１遺伝子（Ｇｏｅｄｅｒｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．（Ａｕｇ １９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６（１２）：３５６３－７１；“Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：ＭＡＰＫ１１ ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ １１”）がコードする酵素である。ＳＡＰＫ２ｂタンパク質は、ＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーである。ＭＡＰキナーゼは、複数の生化学的シグナルの統合点〔integration point〕として働き、増殖、分化、転写制御および発達などの幅広い細胞プロセスに関与する。ＳＡＰＫ２ｂは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼに最も近縁であり、その両方が炎症性サイトカインおよび環境ストレスによって活性化され得る。このキナーゼは、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＫＫ）、好ましくはＭＫＫ６によるリン酸化を介して活性化される。転写因子ＡＴＦ２／ＣＲＥＢ２が、このキナーゼの基質であることが示された。（“Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：ＭＡＰＫ１１ ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ １１”）ＭＡＰＫ１１は、ＨＤＡＣ３および前骨髄球性白血病タンパク質と相互作用することが示された（Ｍａｈｌｋｎｅｃｈｔ Ｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３（６）：３９７９－９０；Ｓｈｉｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（３９）：４０９９４－１００３）。

本明細書で使用したＺＡＫは、ステライルαモチーフおよびロイシンジッパー含有キナーゼ〔sterile alpha motif and leucine zipper containing kinase〕ＡＺＫを意味し、シグナル伝達分子のＭＡＰＫＫＫファミリーのメンバーである。ＺＡＫタンパク質は、Ｎ末端にキナーゼ触媒ドメインを有し、ロイシンジッパーモチーフおよびステライル－αモチーフ（ＳＡＭ）がそれに続く。このマグネシウム結合タンパク質はホモ二量体を形成し、細胞質に位置する。ＺＡＫタンパク質は、細胞周期停止をもたらすガンマ線照射シグナリングを媒介し、このタンパク質の活性は、細胞内の細胞周期チェックポイント制御における役割を担う。ＺＡＫタンパク質はまた、アポトーシス促進活性も有する。異なるアイソフォームをコードする、選択的転写スプライスバリアントが特徴づけられた（“Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：ＺＡＫ ｓｔｅｒｉｌｅ ａｌｐｈａ ｍｏｔｉｆ ａｎｄ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ ＡＺＫ”；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２７４（３）：８１１－８１６．）。ＺＡＫは、ＺＮＦ３３Ａと相互作用することが示された（Ｙａｎｇ，Ｊａｗ－Ｊｉ（Ｊａｎ ２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０１（１）：７１－７）。

キナーゼ発現の検出試薬

一態様では、本開示は、本明細書で開示したキナーゼの発現を検出するための検出試薬を提供する。

ある種の実施形態では、検出試薬には、タンパク質キナーゼ遺伝子またはタンパク質キナーゼｍＲＮＡのポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能なプライマーまたはプローブが含まれる。

本明細書で使用した用語「プライマー」は、標的ポリヌクレオチド配列の配列内部に、そのプライマーの少なくとも一部の配列相補性があるために、その標的ポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、少なくとも８ヌクレオチド、典型的には８から７０ヌクレオチド、通常は１８から２６ヌクレオチドの長さを有することができる。標的配列への正確なハイブリダイゼーションのために、プライマーは、標的ポリヌクレオチド配列のハイブリダイズする部分に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列相補性を有することができる。プライマーとして有用なオリゴヌクレオチドは、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．（１９８１）２２：１８５９－１８６２によって最初に記載された固相ホスホロアミダイトトリエステル法によって、Ｎｅｅｄｈａｍ－Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８４）１２：６１５９－６１６８に記載されているように、自動合成機を使用して化学合成することができる。

プライマーは、プライマーを伸長させて新たなポリヌクレオチド鎖を生成する、核酸の増幅反応において有用である。プライマーは、本明細書で提供したタンパク質キナーゼ遺伝子の標的ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列に特異的にアニーリングすることができるように、当技術分野で公知の一般知識を使用して、当業者が容易に設計することができる。通常、プライマーの３’ヌクレオチドは、ポリメラーゼによって最適なプライマーの伸張がもたらされるように、対応するヌクレオチドの位置で標的配列に相補的であるように設計される。

本明細書で使用した用語「プローブ」は、標的ポリヌクレオチド配列の配列内部に、そのプローブの少なくとも一部の配列相補性があるために、その標的ポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドまたはその類似体を意味する。プローブの例には、例えば、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブまたはタンパク質核酸（ＰＮＡ）プローブがあり得る。プローブは、少なくとも８ヌクレオチド、典型的には８から７０ヌクレオチド、通常は１８から２６ヌクレオチドの長さを有することができる。標的配列への正確なハイブリダイゼーションのために、プローブは、標的ポリヌクレオチド配列のハイブリダイズする部分に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列相補性を有することができる。プローブはまた、前述の固相ホスホロアミダイトトリエステル法によって化学的に合成することができる。ＤＮＡおよびＲＮＡプローブの調製方法および標的ヌクレオチド配列へのそれらのハイブリダイゼーションの条件は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｃｈａｐｔｅｒｓ １０ ａｎｄ １１に記載されている。

ある種の実施形態では、本明細書で提供したプライマーおよびプローブは、検出可能なように標識される。プライマーおよびプローブを標識するのに適した検出可能な標識の例には、例えば、発色団、放射性同位元素、蛍光色素分子、化学発光部分、粒子（可視または蛍光性）、核酸、リガンド、または酵素などの触媒が含まれる。

ある種の実施形態では、検出試薬には、タンパク質キナーゼタンパク質に特異的に結合する抗体が含まれる。

本明細書で使用した用語「抗体」は、免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片を意味し、それは標的タンパク質抗原に特異的に結合することができる。抗体は、ファージまたは類似のベクター中の組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択、ならびにウサギまたはマウスなどの免疫した動物によるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製によって、同定および調製することができる（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４６：１２７５－１２８１；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１：５４４－５４６を参照のこと）。

ある種の実施形態では、抗体は、修飾または標識されることによって、様々な検出アッセイにおいて適切に使用されることを理解することができる。ある種の実施形態では、抗体は検出可能なように標識される。

試料調製

本明細書で提供した方法を実施するのに適したいかなる生物学的試料も、対象から得ることができる。ある種の実施形態では、タンパク質キナーゼ発現の検出を実施するための所望の方法によって、試料はさらに処理することができる。

ある種の実施形態では、その方法はさらに、対象から得られた生体液試料（末梢血試料など）または組織サンプルから、がん細胞（循環腫瘍細胞など）を単離または抽出することを含む。がん細胞は、Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ社（Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ Ｖａｌｌｅｙ，Ｐａ．）から入手可能であるような免疫磁気分離技術によって分離することができる。

ある種の実施形態では、組織試料は、インサイツハイブリダイゼーションを実施するために処理することができる。例えば、組織試料は、顕微鏡スライドガラス上に固定する前にパラフィンで包埋することができ、その後溶媒、典型的にはキシレンで脱パラフィン化することができる。

ある種の実施形態では、その方法はさらに、核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを、試料から単離することを含む。様々な抽出方法が、ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞または組織から単離するのに適しており、例えば、フェノールおよびクロロホルム抽出、ならびに例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．（２００１）に記載されているような他の様々な方法がある。

例えば、ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ抽出キット（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ社，Ｍａｒｃｙ ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＱＩＡａｍｐ（商標）ミニ血液キット、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｇｅｎｆｉｎｄ（商標）、Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）ミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ社）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡミニキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびＥｐｐｅｎｄｏｒｆ社のＰｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌｓ（商標）を含む市販のキットも、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを単離するために使用することができる。当業者は、メーカーのプロトコルに従って、ＲＮＡまたはＤＮＡを容易に抽出または単離することができる。

タンパク質キナーゼの発現レベルの検出方法

本開示の方法は、がんを有するまたはがんを有することが疑われる対象から得られた試料における、本明細書で記載したタンパク質キナーゼの発現レベルを検出することを含む。増幅アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、シークエンシングアッセイおよび免疫アッセイを含むがそれらに限定されない、当技術分野で公知の適切な方法を使用して、タンパク質キナーゼの発現レベルを、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）レベル、タンパク質レベルまたはタンパク質活性化レベルにおいて検出することができる。

増幅アッセイ

核酸増幅アッセイには、標的核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）のコピーが含まれ、それによって、増幅された核酸配列のコピーの数を増加させる。増幅は、指数関数的または線形であってもよい。核酸増幅法の例には、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”、米国特許第４，６８３，１９５号および４，６８３，２０２号、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９０）を参照のこと）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）などの定量的ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（Ａｂｒａｖａｙａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３：６７５－６８２，（１９９５）を参照のこと）、分岐ＤＮＡシグナル増幅（Ｕｒｄｅａ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＩＤＳ，７（ｓｕｐｐｌ ２）：Ｓ１１－Ｓ１４，（１９９３）を参照のこと）、増幅可能なＲＮＡリポーター〔amplifiable RNA reporter〕、Ｑ－ｂｅｔａ複製〔Q-beta replication〕（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：１１９７を参照のこと）、転写ベース増幅〔transcription-based amplification〕（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：１１７３－１１７７を参照のこと）、ブーメランＤＮＡ増幅〔boomerang DNA amplification〕、鎖置換活性化〔strand displacement activation〕、サイクリングプローブ技術、自家持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：１８７４－１８７８）、ローリングサークル複製（米国特許第５，８５４，０３３号）、等温核酸配列に基づく増幅〔isothermal nucleic acid sequence based amplification〕（ＮＡＳＢＡ）、および遺伝子発現の連続分析〔serial analysis of gene expression〕（ＳＡＧＥ）が含まれる。

ある種の実施形態では、核酸増幅アッセイは、ＰＣＲをベースにした方法である。増幅される標的核酸配列にハイブリダイズするプライマー対を用いてＰＣＲを開始した後、標的核酸配列を鋳型としてかつｄＮＴＰをビルディングブロックとして使用しながら新たな鎖を合成するポリメラーゼによって、プライマーが伸長する。次いで、新たな鎖および標的の鎖を変性させて、次の伸張および合成サイクルのために、プライマーが結合することを可能にする。複数回の増幅サイクルの後、標的核酸配列のコピーの総数は指数関数的に増加し得る。

ある種の実施形態では、二本鎖ＤＮＡに挿入されるとシグナルを生成する挿入剤を使用することができる。薬剤の例には、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ（商標）およびＳＹＢＲ ＧＯＬＤ（商標）が含まれる。これらの薬剤は鋳型特異的ではないので、シグナルは鋳型特異的増幅に基づいて生成されるものと考えられる。これは、鋳型配列の融点が全般的に、例えば、プライマー－ダイマーなどよりもずっと高いので、温度に応じてシグナルをモニターすることによって確認することができる。

ハイブリダイゼーションアッセイ

核酸ハイブリダイゼーションアッセイでは、標的核酸にハイブリダイズするプローブが使用され、それによって標的核酸の検出が可能になる。ハイブリダイゼーションアッセイの非限定的な例には、ノザンブロッティング、サザンブロッティング、インサイツハイブリダイゼーション、マイクロアレイ分析、および多重ハイブリダイゼーションをベースにしたアッセイが含まれる。

ある種の実施形態では、ハイブリダイゼーションアッセイのためのプローブは、検出可能なように標識される。ある種の実施形態では、ハイブリダイゼーションアッセイのための核酸をベースにしたプローブは非標識である。このような非標識のプローブは、マイクロアレイなどの固相支持体に固定することができ、検出可能なように標識された標的核酸分子にハイブリダイズすることができる。

ある種の実施形態では、ハイブリダイゼーションアッセイは、核酸（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）を単離し、（例えばゲル電気泳動によって）それらの核酸を分離した後、分離した核酸を適した膜フィルター（例えばニトロセルロースフィルター）上に移行させ、そこでプローブを標的核酸にハイブリダイズさせて検出を可能にすることによって実施することができる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｃｈａｐｔｅｒ ７を参照のこと。プローブと標的核酸のハイブリダイゼーションは、当技術分野で公知の方法によって検出または測定することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィー検出は、ハイブリダイズされたフィルターを写真フィルムに露光することによって実施することができる。

ある種の実施形態では、ハイブリダイゼーションアッセイはマイクロアレイ上で実施することができる。マイクロアレイは、多数の標的核酸分子のレベルを、同時測定するための方法を提供する。標的核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、または染色体ＤＮＡであってもよい。基材表面１平方センチメートル当たり、数百万プローブまでの密度で多数の固定された核酸プローブを配列させた基材を備えるマイクロアレイに、標的核酸をハイブリダイズさせることが可能である。試料中のＲＮＡまたはＤＮＡは、アレイ上の相補的プローブにハイブリダイズし、その後レーザースキャンによって検出される。アレイ上の各プローブについてハイブリダイゼーション強度が決定され、ＲＮＡまたはＤＮＡの相対的レベルを表す定量値に変換される。米国特許第６，０４０，１３８号、第５，８００，９９２号および第６，０２０，１３５号、第６，０３３，８６０号および第６，３４４，３１６号を参照のこと。

機械的合成法を使用したこれらのアレイの合成技術は、例えば、米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。平面アレイ表面が使用されることが多いが、アレイは実際にはいかなる形状の表面に製造されていてもよく、多重の表面に製造されてもよい。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、光ファイバーなどの繊維、ガラスまたは任意のその他の適切な基材上の、ペプチドまたは核酸であってもよく、米国特許第５，７７０，３５８号、第５，７８９，１６２号、第５，７０８，１５３号、第６，０４０，１９３号および第５，８００，９９２号を参照のこと。アレイは、診断法または包括的装置のその他の操作を可能にするような方法で包装されていてもよい。有用なマイクロアレイは市販もされており、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、Ｎａｎｏ Ｓｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のマイクロアレイ、Ｐａｎｏｍｉｃｓ社のＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙなどである。

シークエンシング法

チロシンの発現レベルの測定に有用なシークエンシング法には、標的核酸のシークエンシングが含まれる。当技術分野で公知のいかなるシークエンシングも、目的のタンパク質キナーゼの発現レベルを検出するのに使用することができる。全般的に、シークエンシング法は、伝統的すなわち古典的な方法と、ハイスループットシークエンシング（次世代シークエンシング）に分類することができる。伝統的なシークエンシング法には、マクサム－ギルバートシークエンシング（化学的シークエンシングとしても知られる）およびサンガーシークエンシング（鎖終結法としても知られる）が含まれる。

ハイスループットシークエンシング、すなわち次世代シークエンシングは、伝統的な方法、例えばサンガーシークエンシングなどとは区別される方法を使用することにより、非常に拡張性が高く、一度に全ゲノムまたは全トランスクリプトームを配列決定することが可能である。ハイスループットシークエンシングには、合成によるシークエンシング〔sequencing-by-synthesis〕、ライゲーションによるシークエンシング〔sequencing-by-ligation〕およびウルトラディープシークエンシング〔ultra-deep sequencing〕（Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３７（７０５７）：３７６－８０（２００５）に記載されているものなど）が含まれる。合成によるシークエンスには、ポリメラーゼ増幅の際に標識されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を取り込ませることによる、標識核酸の相補鎖の合成が含まれる。標識ヌクレオチドの取り込みに成功した直後に、または取り込みに成功すると同時に、標識のシグナルを測定し、ヌクレオチドの識別情報を記録する。取り込んだヌクレオチド上の検出可能な標識は、取り込み、検出および同定のステップを繰り返す前に除去される。合成によるシークエンス法の例は当技術分野で公知であって、例えば米国特許第７，０５６，６７６号、米国特許第８，８０２，３６８号および米国特許第７，１６９，５６０号に記載されており、その内容を本明細書に参考として組み込む。合成によるシークエンシングは、フォールドバックＰＣＲ〔fold-back PCR〕および固定されたプライマーを使用して、固相表面（またはマイクロアレイもしくはチップ）上で実施してもよい。標的核酸断片は、固定されたプライマーにハイブリダイズさせることによって固相表面に結合させ、ブリッジ増幅させることができる。この技術は、例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ社のシークエンシングプラットフォームにおいて使用されている。

パイロシークエンシングでは、標的核酸領域をプライマーにハイブリダイズし、ポリメラーゼ存在下で、塩基のＡ、Ｃ、ＧおよびＴ（Ｕ）に対応するデオキシヌクレオチド三リン酸を順次取り込ませることによって新たな鎖を伸張させることが含まれる。各塩基の取り込みはピロリン酸の放出を伴い、ピロリン酸はスルフリラーゼによってＡＴＰに変換され、そのＡＴＰがオキシルシフェリンの合成および可視光の放出を誘発する。ピロリン酸の放出は取り込まれた塩基の数と等モルであるため、発せられる光は、各１ステップにおいて加えられたたヌクレオチドの数と比例する。このプロセスは、全配列が決定されるまで繰り返される。

ある種の実施形態では、本明細書で記載したタンパク質キナーゼの発現レベルは、全トランスクリプトームショットガンシークエンシング（ＲＮＡシークエンシング）によって検出される。ＲＮＡシークエンシングの方法は記載されたことがある（Ｗａｎｇ Ｚ， Ｇｅｒｓｔｅｉｎ Ｍ ａｎｄ Ｓｎｙｄｅｒ Ｍ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００９）１０：５７－６３；Ｍａｈｅｒ ＣＡ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００９）４５８：９７－１０１；Ｋｕｋｕｒｂａ Ｋ ＆ Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ＳＢ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２０１５）２０１５（１１）：９５１－９６９を参照のこと）。

免疫アッセイ

本明細書で使用した免疫アッセイは、典型的にはタンパク質キナーゼタンパク質に特異的に結合する抗体を使用することを必要とする。このような抗体は、当技術分野で公知の方法（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４６：１２７５－１２８１；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１：５４４－５４６）を参照のこと）を使用して得ることができるか、または市販の供給元から得ることができる。免疫アッセイの例には、限定されるものではないが、ウェスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫沈降法、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、免疫蛍光染色およびイメージング、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ならびに蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が含まれる。免疫学的手法および免疫アッセイの手法の総括については、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ ｅｄｓ．，７ｔｈ ｅｄ．１９９１）を参照のこと。さらに、免疫アッセイはいくつかの形態のいずれかで実施することができ、それらはＥｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｍａｇｇｉｏ，ｅｄ．，１９８０）およびＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、上記において詳細に総括されている。全般的な免疫アッセイの総括については、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ３７（Ａｓａｉ，ｅｄ．１９９３）；Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ，ｅｄｓ．，７ｔｈ ｅｄ．１９９１）も参照のこと。

キナーゼの発現レベルの測定のための、本明細書で提供したいかなるアッセイおよび方法も、自動化および半自動化システム、またはポイントオブケアアッセイシステムにおける使用に適合または最適化することができる。

本明細書で記載したキナーゼの発現レベルは、当技術分野で公知の適切な方法を使用して正規化することができる。例えば、キナーゼの発現レベルは、標準マーカーの標準レベルに正規化することができ、それは予め決定するか、同時に決定するか、または対象から試料を得た後に決定することができる。標準マーカーは同じアレイで操作してもよく、または以前のアッセイの公知の標準マーカーであってもよい。別の例では、タンパク質キナーゼの発現レベルは、内部マーカーであってもよく、または複数の内部マーカーの平均レベルもしくは全レベルであってもよい、内部対照に正規化することができる。ハイスループットシークエンシングを使用して、ｍＲＮＡレベルによってタンパク質キナーゼの発現が測定されるさらに別の例では、タンパク質キナーゼの発現レベルを、シークエンシングアッセイの全ヒットに正規化することができる。

参照レベルとの比較

ある種の実施形態では、本明細書で開示した方法には、検出されたタンパク質キナーゼの発現レベルを、参照タンパク質キナーゼレベルと比較するステップが含まれる。

用語「参照タンパク質キナーゼレベル」は、参照試料の代表である、目的のタンパク質キナーゼの発現レベルを意味する。ある種の実施形態では、参照試料は、健康な対象または組織から得られる。ある種の実施形態では、参照試料はがんまたは腫瘍組織である。ある種の実施形態では、参照タンパク質キナーゼレベルは、試験試料中のタンパク質キナーゼの発現レベルの検出に使用したものと同じ測定法もしくはアッセイか、または比較可能な測定法もしくはアッセイを使用して得られる。

ある種の実施形態では、参照タンパク質キナーゼレベルは予め決定することができる。例えば、同種の腫瘍または血液がんからの、全般的ながんまたは腫瘍の試料またはそれらの組織の収集物中でのタンパク質キナーゼレベルの測定値に基づいて、参照タンパク質キナーゼレベルを計算または一般化することができる。別の例では、参照タンパク質キナーゼレベルは、全般的ながんまたは腫瘍集団からの、平均的ながんまたは腫瘍の試料中で一般に観察される、タンパク質キナーゼのレベルの統計値に基づかせることができる。

ある種の実施形態では、本明細書で提供した方法における比較ステップには、検出されたタンパク質キナーゼの発現レベルと参照タンパク質キナーゼレベルとの間の差を決定することが含まれる。参照タンパク質キナーゼレベルとの差は、増加または低減であり得る。

ある種の実施形態では、参照タンパク質キナーゼレベルとの差は、さらに閾値と比較される。ある種の実施形態では、参照タンパク質キナーゼレベルとの差が閾値に達すれば、このような差を統計学的に有意と見なすことができるように、統計学的方法によって閾値を設定することができる。有用な統計分析法は、Ｌ．Ｄ．Ｆｉｓｈｅｒ ＆ Ｇ．ｖａｎＢｅｌｌｅ，Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ：Ａ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９９３）に記載されている。統計学的な有意性は、信頼（「ｐ」）値に基づいて決定することができ、それは対応のない両側ｔ検定を使用して計算することができる。例えば、０．１、０．０５、０．０２５、または０．０１以下のｐ値を、通常、統計学的な有意性を示すのに使用することができる。信頼区間およびｐ値は、当技術分野で周知の方法によって決定することができる。例えば、Ｄｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３を参照のこと。

タンパク質キナーゼ阻害剤を用いた処理

一態様では、本開示は、チロシンキナーゼ阻害剤を用いて、患者におけるがんを処置するための方法を提供する。ある種の実施形態では、この方法は、ａ）患者から得られた試料中の第１のタンパク質キナーゼの発現レベルを測定することと、ｂ）第１のタンパク質キナーゼの発現レベルを、対応する参照の発現レベルと比較することと、ｃ）患者がチロシンキナーゼ阻害剤に応答性である可能性を決定することと、ｄ）第１のタンパク質キナーゼの発現レベルによって応答性であろうことが示された患者を、チロシンキナーゼ阻害剤を用いて処置することと、を含む。

ある種の実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は多標的チロシンキナーゼ阻害剤である。多標的チロシンキナーゼ阻害剤の例には、ポナチニブ、セジラニブ、スニチニブ、パゾパニブ、イマチニブ、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、アンロチニブ、リニファニブ、ドビチニブ、ボスチニブなどが含まれる。

一部の実施形態では、多標的チロシンキナーゼ阻害剤は、第１のチロシンキナーゼとは異なる第２のチロシンキナーゼを優先的に阻害する。さらに別の実施形態では、第２のタンパク質キナーゼはＫＤＲである。

ある種の実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは化合物である。一部の実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩である。

式中、
Ｒ_１は水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６ハロアルキル、ハロまたはシアノであり、
ＭはＣＨまたはＮであり、
ＬはＯ、ＮＨまたはＮ（ＣＨ_３）であり、
ＡはＣＲ_５またはＮであり、
ＷはＣＲ_６またはＮであり、
Ｒ_２、Ｒ_５およびＲ_６はそれぞれ独立に水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６ハロアルキル、ハロ、Ｃ_３～７シクロアルキルまたはシアノであり、
Ｘ、ＹおよびＺはそれぞれ独立にＣＨまたはＮであり、
Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ独立に水素、ハロ、シアノ、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６ハロアルキル、Ｃ_２～６アルケニル、ヒドロキシル－Ｃ_１～６アルキル、ジ－（Ｃ_１～６アルキルアミノ）－Ｃ_１～６アルキル、アミノ、Ｃ_１～６アルキルアミノ、Ｃ_３～７シクロアルキルアミノ、ジ－（Ｃ_１～６アルキル）アミノ、アミノ－Ｃ_１～６アルキルアミノ、Ｃ_１～６アルコキシ－Ｃ_１～６アルキルアミノ、Ｃ_１～６アルコキシカルボニル－Ｃ_１～６アルキルアミノ、ジ－（Ｃ_１～６アルコキシ－Ｃ_１～６アルキル）アミノ、アミノカルボニル、Ｃ_１～６アルキルアミノカルボニル、ジ－（Ｃ_１～６アルキル）アミノカルボニル、Ｃ_３～７シクロアルキルアミノカルボニル、Ｃ_１～６アルコキシ、Ｃ_３～７シクロアルコキシ、ヒドロキシル－Ｃ_１～６アルコキシ、Ｃ_１～６ハロアルコキシ、アミノ－Ｃ_１～６アルキル、アミノ－Ｃ_１～６アルコキシ、Ｃ_１～６アルキルスルホニル、Ｃ_２～６アルケニルスルホニル、Ｃ_３～７シクロアルキルスルホニル、場合によりＢで置換されているヘテロシクリル、場合によりＢで置換されているアリール、場合によりＢで置換されているヘテロアリール、Ｃ_１～６アルキルスルホニルアミノ、Ｃ_２～６アルケニルスルホニルアミノ、Ｃ_３～７シクロオアルキルスルホニルアミノ〔cyclooalkylsulfonylamino〕、アミド、Ｃ_１～６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_２～６アルケニルカルボニルアミノ、Ｃ_３～７シクロオアルキルカルボニルアミノ〔cyclooalkylcarbonylamino〕、Ｃ_１～６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_３～７シクロアルコキシカルボニルアミノ、ウレイド、Ｃ_３～７シクロアルキル、Ｃ_３～７ハロシクロアルキル、ヘテロシクリル－オキシ、ピペリジニルアミノ、Ｎ－メチル－ピペリジニル－４－カルボニル、ピペラジニル－Ｃ_１～６アルキル、ピロリルカルボニルアミノ、Ｎ－メチル－ピペリジニルカルボニルアミノ、もしくはヘテロシクリル－Ｃ_１～６アルコキシであるか、または
Ｒ_３およびＲ_４は共に、それらが結合する芳香環中の原子と３から８員環を形成しており、
Ｂは水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６ハロアルキル、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アミノ、Ｃ_１～６アルキルアミノ、Ｃ_３～７シクロアルキルアミノ、ジ－（Ｃ_１～６アルキル）アミノ、シアノ、またはＣ_３～７シクロアルキルである。

ある種の実施形態では、
Ｒ_１は水素であり、
ＭはＮであり、
ＬはＯであり、
ＡはＣＲ_５であり、
ＷはＣＲ_６であり、
Ｒ_２、Ｒ_５およびＲ_６はそれぞれ独立に水素、Ｃ_１～６アルキル、またはハロであり、
Ｘ、ＹおよびＺはＣＨであり、
Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ独立に水素、ハロ、Ｃ_１～６ハロアルキル、またはＣ_１～６ハロアルコキシである。

一実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、以下の群から選択される構造を有する。

一実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤はＣＢＴ－１０２であり、以下の構造を有する。

ある種の実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、薬学的に許容される担体を用いて製剤化されてもよい。担体が存在する場合、チロシンキナーゼ阻害剤および担体の総体積または総重量に対して、例えば５重量％から９５重量％の担体の量などの、任意の適した量で、担体をチロシンキナーゼ阻害剤と混合することができる。一部の実施形態では、担体の量は、５％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、２８％。３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または７５％のいずれかの下限値と、２０％、２２％、２５％、２８％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％および９５％のいずれかの、下限値よりも高い上限値とを有する範囲内であることができる。特定の実施形態における担体の量は、製剤技術分野の当業者には公知のように、特定の投与形態、チロシンキナーゼ阻害剤の相対量、担体を含めた組成物の総重量、担体の物理的および化学的性質、ならびに他の要素の検討に基づいて決定することができる。

チロシンキナーゼ阻害剤は、任意の所望の効果的な方法において投与することができ、それは、経口摂取のための方法、または眼球への局所投与のための軟膏剤もしくは点滴薬としての方法、または腹腔内、皮下、外用、皮内、吸入、肺内、直腸、膣、舌下、筋肉内、静脈内、動脈内、髄腔内もしくはリンパ内などの任意の適切な方法での非経口もしくはその他の投与のための方法である。さらに、チロシンキナーゼ阻害剤は、他の処置と併せて投与してもよい。チロシンキナーゼ阻害剤は、必要に応じて、カプセル化するかまたは別の方法で、胃またはその他の分泌物に対して保護することができる。

本明細書で開示したチロシンキナーゼ阻害剤の適した投与量の非限定的な例は、１日あたり約１ｍｇ／ｋｇから約２４００ｍｇ／ｋｇであり、例えば、１日あたり約１ｍｇ／ｋｇから約１２００ｍｇ／ｋｇ、１日あたり７５ｍｇ／ｋｇから１日あたり約３００ｍｇ／ｋｇなどであり、１日あたり約１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇを含む。このような薬剤の他の代表的な投与量には、１日あたり、約１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１１００ｍｇ／ｋｇ、１２００ｍｇ／ｋｇ、１３００ｍｇ／ｋｇ、１４００ｍｇ／ｋｇ、１５００ｍｇ／ｋｇ、１６００ｍｇ／ｋｇ、１７００ｍｇ／ｋｇ、１８００ｍｇ／ｋｇ、１９００ｍｇ／ｋｇ、２０００ｍｇ／ｋｇ、２１００ｍｇ／ｋｇ、２２００ｍｇ／ｋｇ、および２３００ｍｇ／ｋｇが含まれる。一部の実施形態では、ヒトにおけるチロシンキナーゼ阻害剤の投与量は約４００ｍｇ／日であり、１２時間ごとに与えられる。一部の実施形態では、ヒトにおけるチロシンキナーゼ阻害剤の投与量は、３００～５００ｍｇ／日、１００～６００ｍｇ／日または２５～１０００ｍｇ／日の範囲を有する。本明細書で開示したチロシンキナーゼ阻害剤の有効用量は、２回、３回、４回、５回、６回、またはより多くのサブ用量〔sub-dose〕として投与することができ、一日を通して適切な間隔で分けて投与することができる。

以下の実施例は、特許請求した発明をよりよく例示するために提供され、本発明の範囲を限定しないものと解釈される。以下に記載した特定の組成物、材料および方法は全て、全体または一部が本発明の範囲内にある。これらの特定の組成物、材料および方法は、本発明を限定するものではなく、本発明の範囲内にある特定の実施形態を例示するに過ぎない。当業者は、創作能力を発揮することなく、かつ本発明の範囲を逸脱することなく、同等の組成物、材料および方法を開発することができる。本発明の範囲内にありながら、記載した本明細書の手法において多くの変更を行うことができることを理解されたい。このような変更が本発明の範囲内に含まれることは、本発明者等の意図である。

［実施例１］
材料および方法

１．キナーゼプロファイリング

ほとんどのアッセイのために、キナーゼタグ付きＴ７ファージ株を、ＢＬ２１株由来の大腸菌〔E.coli〕宿主内で、２４ウェルブロックにおいて同時に増殖させた。大腸菌を対数期まで増殖させ、凍結ストックからのＴ７ファージに感染させ（感染多重度＝０．４）、溶菌するまで振とうしながら３２℃でインキュベートした（９０～１５０分）。溶菌液を遠心分離（６，０００×ｇ）し、フィルター（０．２μｍ）にかけて細胞片を除去した。別法として、いくつかのキナーゼをＨＥＫ－２９３細胞で産生した。ストレプトアビジンがコーティングされた磁気ビーズを、ビオチン化したキナーゼの低分子リガンドで、室温で３０分間処理し、キナーゼアッセイのためのアフィニティー樹脂を作製した。リガンドが結合したビーズを過剰のビオチンでブロックし、非結合リガンドを除去しかつ非特異的なファージの結合を低減するために、ブロッキングバッファー（ＳｅａＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄した。キナーゼ、リガンドが結合したアフィニティビーズおよび試験化合物を、１×結合バッファー（２０％ＳｅａＢｌｏｃｋ、０．１７×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、６ｍＭ ＤＴＴ）中に混合することによって、結合反応を組み立てた。試験化合物は、１００％ＤＭＳＯにおける４０×ストックとして調製し、アッセイに直接希釈した。全反応は、ポリプロピレンの３８４ウェルプレート中で、０．０４ｍｌの最終容量において実施した。アッセイプレートを、振とうしながら室温で１時間インキュベートし、アフィニティビーズを洗浄バッファー（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した。次いでビーズを溶出バッファー（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．５μＭ非ビオチン化アフィニティーリガンド）中に再懸濁し、振とうしながら室温で３０分間インキュベートした。溶出液中のキナーゼ濃度は、ｑＰＣＲによって測定した。

化合物は要求された濃度でスクリーニングした。１次スクリーニングの結合相互作用の結果をパーセント対照「％Ｃｔｒｌ」として報告する。その報告では、以下のページのマトリックス中で、より低い数値がより強いヒットを示す。

選択性のスコアすなわちＳ－スコアは、化合物の選択性の定量的な基準である。それは、化合物が結合するキナーゼの数を、試験した別個のキナーゼから変異体バリアント〔mutant variant〕を除いたものの総数で割ることによって計算される。

Ｓ＝ヒット数／アッセイ数

この値は、効力閾値（未満）として％Ｃｔｒｌを使用することによって計算することができ、異なる化合物との比較を容易にするための、化合物の選択性を説明する定量的な方法を提供する。

Ｓ（３５）＝（％Ｃｔｒｌ＜３５を有する非変異体キナーゼの数）／（試験した非変異体キナーゼの数）

Ｓ（１０）＝（％Ｃｔｒｌ＜１０を有する非変異体キナーゼの数）／（試験した非変異体キナーゼの数）

Ｓ（１）＝（％Ｃｔｒｌ＜１を有する非変異体キナーゼの数）／（試験した非変異体キナーゼの数）

２．ＣＢＴ－１０２のキナーゼＩＣ５０値

Ｅｕｒｏｆｉｎｓ社の標準的なＫｉｎａｓｅＰｒｏｆｉｌｅｒアッセイを使用し、かつ適切な標準操作手順に従って、選択した各キナーゼに対し、ＣＢＴ－１０２を試験した。酵素および基質を含有する反応混合物を添加する前に、試験化合物（ＣＢＴ－１０２）の５０×ストックの所要の容量をアッセイウェルに添加した。選択した濃度でＡＴＰを添加することによって、反応を開始した。ＡＴＰ添加前に、化合物と、酵素／基質混合物とのプレインキュベーションは行わなかった。

データは、特注の社内分析ソフトウェアを使用して処理する。結果は、ＤＭＳＯ対照のパーセンテージとして、残存キナーゼ活性として表す。これは、以下の式を使用して計算される。

ＩＣ５０の決定のために、データは、ＸＬＦｉｔバージョン５．３（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）を使用して分析する。

３．ＰＤＸモデルにおける、インビボでのＣＢＴ－１０２の有効性

腫瘍を発症させるために、ドナーのマウスから採取したＰＤＸ腫瘍断片を、雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右上背部側腹部〔upper right dorsal flank〕に皮下接種した。平均の腫瘍サイズが約１５０（１００～２００）ｍｍ^３に達した時点で、ランダム化を開始した。グループ分けの日を０日目と表すことにし、投薬開始を１日目とした。腫瘍体積は、ノギスを使用して二次元で週に２回測定し、式：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２（式中、Ｖは腫瘍の体積であり、Ｌは腫瘍の長さ（最長の腫瘍の寸法）であり、Ｗは腫瘍の幅（Ｌに垂直な最長の腫瘍の寸法）であった）を使用して、体積をｍｍ３で表した。ＰＤＸモデルには、胃がんモデル、肺がんモデル、結腸直腸がんモデル、肝臓がん、食道がん、乳がんなどが含まれた。

４．ＰＤＸ腫瘍中でのタンパク質キナーゼの発現

腫瘍をＰＤＸモデルから採取し、タンパク質キナーゼの発現レベルを、ＲＮＡｓｅｑによって検出した。

５．Ｍ－ＮＦＳ－６０およびＲＡＷ２６４．７同系細胞株ならびに操作されたＢａＦ３ ｈＣＳＦ１Ｒ細胞株の増殖における、ＣＢＴ－１０２の効果の評価

２つの同系細胞株Ｍ－ＮＦＳ－６０およびＲＡＷ２６４．７ならびに操作されたＢａＦ３ ｈＣＳＦ１Ｒ細胞株を飢餓にさせ、次いでＣＢＴ－１０２および他の試験物質を用いて、３７℃の温度、５％のＣＯ_２および９５％の湿度において３日間試験した。次いで、細胞の生存率を、ＣＴＧアッセイを使用して検出した。ソフトウェアのＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、ＩＣ５０を計算した。

６．皮下ＭＣ－３８マウス大腸がんモデルにおけるインビボでのＣＢＴ－１０２の有効性

ＭＣ－３８腫瘍細胞を、１０％のウシ胎仔血清を補ったＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、インビトロで、３７℃で、空気中に５％のＣＯ_２を含む環境において維持した。腫瘍を発症させるために、各マウスに、０．１ｍＬのＰＢＳ中のＭＣ－３８腫瘍細胞（１×１０ｅ６）を、剃毛後、右側腹部領域に皮下接種した。平均の腫瘍サイズが約１００ｍｍ^３に達した時点で、ランダム化を開始した。グループ１のマウスはビヒクルで処置し、グループ２のマウスは、最初の１１日間は２０ｍｇ／ｋｇのＣＢＴ－１０２で処置し、その後１０ｍｇ／ｋｇに減少した。

７．ＭＣ－３８腫瘍における、ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８／Ｆ４－８０のＩＨＣ試験

ＭＣ３８腫瘍組織を、インビボでの有効性試験の終わりに収集した。次いで、その腫瘍組織をパラフィンで包埋した。ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８／Ｆ４－８０の発現を、免疫組織化学染色によって試験した。

［実施例２］
本実施例は、ＣＢＴ－１０２によって効果的に阻害することができるタンパク質キナーゼのスクリーニングを例示する。

１．ＣＢＴ－１０２は独特なキナーゼプロファイラーを有する。

スクリーニングアッセイでは、４０３個の候補タンパク質キナーゼに対してＣＢＴ－１０２の阻害有効性を試験した。表１に示されるように、ＣＢＴ－１０２は、タンパク質キナーゼ群の阻害において様々な有効性（％対照として示される）を明示した。具体的には、表２に示されるように、試験した４０３個のタンパク質キナーゼの中で、ＣＢＴ－１０２は、１３個のタンパク質キナーゼに対して強い阻害を明示し（Ｓ（１）として示される）、３６個のタンパク質キナーゼに対して中等度の阻害を明示した（Ｓ（１０）として示される）。

２．ＣＢＴ－１０２のキナーゼＩＣ５０値

以下の表３に示されるように、以下のタンパク質キナーゼは、１００ｎＭより低いＣＢＴ－１０２のＩＣ５０を示した：ＣＤＫＬ２、ｃＫｉｔ、ｃ－ＲＡＦ、ＤＤＲ１、Ｆｌｔ１、Ｆｌｔ４、ＣＳＦ１Ｒ、ＫＤＲ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＰＤＧＦＲα、ＰＴＫ５、Ｒｅｔ、ＳＡＰＫ２ｂ、ＺＡＫ。

［実施例３］
本実施例は、ＤＤＲ１の発現レベルが、ＣＢＴ－１０２の有効性と相関することを例示する。

図１に示されるように、ＣＢＴ－１０２は、ＰＤＸモデル群において、異なるインビボでの有効性を明示した。次いで、ＤＤＲ１の発現レベルを、これらのＰＤＸモデルにおいて測定した。これらのＰＤＸモデルにおける、ＤＤＲ１の発現レベルとＣＢＴ－１０２の有効性との間の関係を分析した。図２Ａおよび２Ｂに示されるように、ＰＤＸモデルにおいて、ＤＤＲ１の発現レベルは、ＣＢＴ－１０２の有効性と有意な相関を有する。

全ＰＤＸモデルの中で、肺がんモデルにおけるＤＤＲ１の発現とＣＢＴ－１０２の有効性との間の関係も分析した。図３Ａおよび３Ｂに示されるように、肺がんＰＤＸモデルにおいて、ＤＤＲ１の発現レベルは、ＣＢＴ－１０２の有効性と有意な相関を有する。

［実施例４］
本実施例は、ＣＢＴ－１０２が、ＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ経路を介してがん細胞増殖を阻害することを例示する。

ＣＳＦ－１依存性マウス骨髄性Ｍ－ＮＦＳ－６０細胞を標的細胞として使用する一方で、ＣＳＦ－１非依存性細胞株Ｒａｗ２６４．７を陰性対照として使用した。ＣＢＴ－１０２に加えて、検討には３つのＣＳＦ－１Ｒ阻害剤、ＧＷ２５８０、ＢＬＺ９４５およびペキシダルチニブも含めた。表４ならびに図４Ａおよび４Ｂに示されるように、ＣＢＴ－１０２、ＧＷ２５８０、ＢＬＺ９４５およびペキシダルチニブは、Ｍ－ＮＦＳ－６０の増殖を効果的に阻害した。ＣＢＴ－１０２、ＧＷ２５８０、ＢＬＺ９４５およびペキシダルチニブは、それぞれ０．６３１／０．３４３、１．１４５、３．０１５および０．３４８μＭのＩＣ５０を有する。対照的に、ＣＳＦ－１非依存性ＲＡＷ２６４．７細胞は、２２．８５μＭのＩＣ５０でＣＢＴ－１０２に対して抵抗性を示し、同様に他の２化合物、ＢＬＣ９４５（ＩＣ５０＞３０μＭ）およびペキシダルチニブ（ＩＣ５０＝１６．３６μＭ）に対しても抵抗性を示した。操作されたＢａＦ３ ｈＣＳＦ１Ｒ細胞株においては、類似の多キナーゼ阻害剤であるスルファチニブの１．３３３μＭ、およびより特異的なＣＳＦ１Ｒキナーゼ阻害剤のＧＷ２５８０の０．２７９μＭに対して、ＣＢＴ－１０２のＩＣ５０値は０．５８８μＭであった。これらの結果は、ＣＢＴ－１０２が、ＣＳＦ１－ＣＳＦ１Ｒ経路を妨害することによって、がん細胞増殖アッセイを阻害することを示している。

２．ＣＢＴ－１０２は、ＭＣ－３８腫瘍の増殖を阻害した。

処置は１４日目に実施した。２０ｍｇ／ｋｇ（１０ｍｇ／ｋｇ）でのＣＢＴ－１０２を用いた処置は、抗腫瘍有効性をもたらし、腫瘍接種後の３４日目（ＰＧ－Ｄ２１）での腫瘍サイズは、４５４．６３ｍｍ^３であった（ビヒクル処置群に対して、ＴＧＩ：７９．９１％、ｐ＜０．００１）（図５）。

３．ＣＢＴ－１０２は、ＭＣ－３８腫瘍におけるＦ４－８０のＩＨＣスコアを低減した。

ＣＢＴ－１０２での処置後、ＭＣ－３８腫瘍組織におけるＦ４－８０のＩＨＣスコア（％）は顕著に減少した。Ｆ４－８０はマクロファージの表面マーカーである。この結果は、ＣＢＴ－１０２が腫瘍組織中のマクロファージに影響を及ぼすことを示した。ＣＢＴ－１０２は、ＭＣ－３８腫瘍中のＴ細胞表面マーカー、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８には、ビヒクル群と比べて顕著な影響を及ぼさなかった（図６および７）。

Claims (29)

1. チロシンキナーゼ阻害剤を用いて、患者におけるがんを処置するための方法であって、
   ａ）前記患者から得られた試料中の第１のキナーゼの発現レベルを測定することと、
   ｂ）前記第１のキナーゼの発現レベルを、対応する参照の発現レベルと比較することと、
   ｃ）前記患者が前記チロシンキナーゼ阻害剤に応答性である可能性を決定することと、
   ｄ）前記第１のキナーゼの発現レベルによって応答性であろうことが示された前記患者を、前記チロシンキナーゼ阻害剤を用いて処置することと、
   を含む方法。
2. 第１のキナーゼが、ＤＤＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤＫＬ２、ｃＫｉｔ、ｃ－ＲＡＦ、Ｆｌｔ１、Ｆｌｔ４、ＫＤＲ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＰＤＧＦＲα、ＰＴＫ５、Ｒｅｔ、ＳＡＰＫ２ｂおよびＺＡＫからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 第１のキナーゼが、ＤＤＲ１またはＣＳＦ１Ｒである、請求項１に記載の方法。
4. チロシンキナーゼ阻害剤が多標的チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
5. 多標的チロシンキナーゼ阻害剤が、第１のキナーゼとは異なる第２のキナーゼを優先的に阻害する、請求項４に記載の方法。
6. 第２のキナーゼがＫＤＲである、請求項５に記載の方法。
7. チロシンキナーゼ阻害剤が、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは化合物である、請求項１に記載の方法。
8. チロシンキナーゼ阻害剤が化合物である、請求項１に記載の方法。
9. チロシンキナーゼ阻害剤が、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。
   

   

   ［式中、
   Ｒ_１は水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６ハロアルキル、ハロまたはシアノであり、
   ＭはＣＨまたはＮであり、
   ＬはＯ、ＮＨまたはＮ（ＣＨ_３）であり、
   ＡはＣＲ_５またはＮであり、
   ＷはＣＲ_６またはＮであり、
   Ｒ_２、Ｒ_５およびＲ_６はそれぞれ独立に水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６ハロアルキル、ハロ、Ｃ_３～７シクロアルキルまたはシアノであり、
   Ｘ、ＹおよびＺはそれぞれ独立にＣＨまたはＮであり、
   Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ独立に水素、ハロ、シアノ、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６ハロアルキル、Ｃ_２～６アルケニル、ヒドロキシル－Ｃ_１～６アルキル、ジ－（Ｃ_１～６アルキルアミノ）－Ｃ_１～６アルキル、アミノ、Ｃ_１～６アルキルアミノ、Ｃ_３～７シクロアルキルアミノ、ジ－（Ｃ_１～６アルキル）アミノ、アミノ－Ｃ_１～６アルキルアミノ、Ｃ_１～６アルコキシ－Ｃ_１～６アルキルアミノ、Ｃ_１～６アルコキシカルボニル－Ｃ_１～６アルキルアミノ、ジ－（Ｃ_１～６アルコキシ－Ｃ_１～６アルキル）アミノ、アミノカルボニル、Ｃ_１～６アルキルアミノカルボニル、ジ－（Ｃ_１～６アルキル）アミノカルボニル、Ｃ_３～７シクロアルキルアミノカルボニル、Ｃ_１～６アルコキシ、Ｃ_３～７シクロアルコキシ、ヒドロキシル－Ｃ_１～６アルコキシ、Ｃ_１～６ハロアルコキシ、アミノ－Ｃ_１～６アルキル、アミノ－Ｃ_１～６アルコキシ、Ｃ_１～６アルキルスルホニル、Ｃ_２～６アルケニルスルホニル、Ｃ_３～７シクロアルキルスルホニル、場合によりＢで置換されているヘテロシクリル、場合によりＢで置換されているアリール、場合によりＢで置換されているヘテロアリール、Ｃ_１～６アルキルスルホニルアミノ、Ｃ_２～６アルケニルスルホニルアミノ、Ｃ_３～７シクロオアルキルスルホニルアミノ〔cyclooalkylsulfonylamino〕、アミド、Ｃ_１～６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_２～６アルケニルカルボニルアミノ、Ｃ_３～７シクロオアルキルカルボニルアミノ〔cyclooalkylcarbonylamino〕、Ｃ_１～６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_３～７シクロアルコキシカルボニルアミノ、ウレイド、Ｃ_３～７シクロアルキル、Ｃ_３～７ハロシクロアルキル、ヘテロシクリル－オキシ、ピペリジニルアミノ、Ｎ－メチル－ピペリジニル－４－カルボニル、ピペラジニル－Ｃ_１～６アルキル、ピロリルカルボニルアミノ、Ｎ－メチル－ピペリジニルカルボニルアミノ、もしくはヘテロシクリル－Ｃ_１～６アルコキシであるか、または
   Ｒ_３およびＲ_４は共に、それらが結合する芳香環中の原子と３から８員環を形成しており、
   Ｂは水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６ハロアルキル、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アミノ、Ｃ_１～６アルキルアミノ、Ｃ_３～７シクロアルキルアミノ、ジ－（Ｃ_１～６アルキル）アミノ、シアノ、またはＣ_３～７シクロアルキルである。］
10. チロシンキナーゼ阻害剤が以下の構造を有する、請求項１に記載の方法。
    

    
11. 第１のキナーゼの発現レベルが、ＲＮＡレベル、タンパク質レベルまたはタンパク質活性化レベルである、請求項１に記載の方法。
12. 第１のキナーゼの発現レベルが、増幅アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、シークエンシングアッセイ、アレイ、ウエスタンブロット、免疫組織化学またはＥＬＩＳＡによって測定される、請求項１に記載の方法。
13. がんが、胃がん、肺がん、食道がん、黒色腫、腎臓がん、肝臓がん、骨髄腫、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、血液がん、白血病および非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
14. がんが、胃がん、肺がん、結腸直腸がん、肝臓がん、食道がん、腎臓がんまたは乳がんである、請求項１に記載の方法。
15. 患者におけるがん療法を継続するための方法であって、
    ａ）チロシンキナーゼ阻害剤を用いて前記患者を処置することと、
    ｂ）前記患者から腫瘍試料を得ることと、
    ｃ）第１のキナーゼの発現レベルを測定することと、
    ｄ）前記第１のキナーゼの発現レベルを、対応する参照の発現レベルと比較することと、
    ｅ）前記患者が前記チロシンキナーゼ阻害剤に応答性である可能性を決定することと、
    ｆ）前記腫瘍試料中の前記第１のキナーゼの発現レベルが応答性を明示した場合に前記がんの処置を継続することと、
    を含む方法。
16. 第１のキナーゼが、ＤＤＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤＫＬ２、ｃＫｉｔ、ｃ－ＲＡＦ、Ｆｌｔ１、Ｆｌｔ４、ＫＤＲ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＰＤＧＦＲα、ＰＴＫ５、Ｒｅｔ、ＳＡＰＫ２ｂおよびＺＡＫからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
17. 第１のタンパク質キナーゼが、ＤＤＲ１またはＣＳＦ１Ｒである、請求項１５に記載の方法。
18. チロシンキナーゼ阻害剤が多標的チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１５に記載の方法。
19. 多標的チロシンキナーゼ阻害剤が、第１のキナーゼとは異なる第２のキナーゼを優先的に阻害する、請求項１８に記載の方法。
20. 第２のキナーゼがＫＤＲである、請求項１９に記載の方法。
21. チロシンキナーゼ阻害剤が、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは化合物である、請求項１５に記載の方法。
22. 第１のキナーゼの発現レベルが、ＲＮＡレベル、タンパク質レベルまたはタンパク質活性化レベルである、請求項１５に記載の方法。
23. 第１のキナーゼの発現レベルが、増幅アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、シークエンシングアッセイもしくはアレイ、ウエスタンブロット、免疫組織化学またはＥＬＩＳＡによって測定される、請求項１５に記載の方法。
24. がんが、胃がん、肺がん、食道がん、黒色腫、腎臓がん、肝臓がん、骨髄腫、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、血液がん、白血病および非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
25. 腫瘍試料が組織試料または血液試料である、請求項１５に記載の方法。
26. 患者がチロシンキナーゼ阻害剤を使用したがんの処置に応答性である可能性を決定するためのキットの製造における、第１のタンパク質キナーゼの発現レベルを測定する薬剤の使用であって、前記第１のタンパク質キナーゼが、ＤＤＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤＫＬ２、ｃＫｉｔ、ｃ－ＲＡＦ、Ｆｌｔ１、Ｆｌｔ４、ＫＤＲ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＰＤＧＦＲα、ＰＴＫ５、Ｒｅｔ、ＳＡＰＫ２ｂおよびＺＡＫからなる群から選択される、使用。
27. 薬剤がプライマーまたは抗体である、請求項２６に記載の使用。
28. キットが第２の抗体をさらに含む、請求項２６に記載の使用。
29. 患者がチロシンキナーゼ阻害剤を使用したがんの処置に応答性である可能性を決定するためのキットであって、前記患者から得られた試料中の第１のタンパク質キナーゼの発現レベルを測定する薬剤を含み、前記第１のタンパク質キナーゼが、ＤＤＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤＫＬ２、ｃＫｉｔ、ｃ－ＲＡＦ、Ｆｌｔ１、Ｆｌｔ４、ＫＤＲ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＰＤＧＦＲα、ＰＴＫ５、Ｒｅｔ、ＳＡＰＫ２ｂおよびＺＡＫからなる群から選択される、キット。

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