CN114096256A - 用于预测bcl-2/bcl-xl抑制剂对癌症的功效的方法和组合物 - Google Patents

用于预测bcl-2/bcl-xl抑制剂对癌症的功效的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

提供了预测BCL‑2/BCL‑XL双重或选择性抑制剂治疗癌症患者的疗效的生物标志物。该生物标志物包含含有BCL‑2或BCL‑XL的复合物。还提供了用于评估生物标志物的水平的方法和组合物，例如试剂盒，以及使用此类水平预测癌症患者对BCL‑2/BCL‑XL双重抑制剂或BCL‑XL抑制剂或BCL‑2抑制剂的应答的方法。可以使用此类信息来确定癌症患者的预后和治疗选择。

Description

用于预测BCL-2/BCL-XL抑制剂对癌症的功效的方法和组合物
技术领域
本发明总体上涉及用于癌症治疗的生物标志物。
背景技术
逃避细胞凋亡是人类癌症的标志，并且是治疗抗性的常见原因(Hanahan D等人,Cell[细胞](2000)100:57-70；Delbridge AR等人,Cold Spring Harb Perspect Biol[冷泉港生物学展望](2012)4)。因此，在人类癌症中靶向关键的细胞凋亡促进因子是用于开发全新类型的抗癌疗法的有吸引力的策略。
BCL-2(B细胞淋巴瘤蛋白2)家族蛋白在线粒体介导的途径中是细胞凋亡的关键调节因子。BCL-2家族蛋白包括抗凋亡(促存活)成员，这些成员包括BCL-2、BCL-XL、BCL-w、MCL-1和A1；以及促凋亡(促死亡)成员。抗凋亡(促存活)和促凋亡(促死亡)蛋白之间的平衡决定了细胞存活或死亡的命运。促存活蛋白质(例如BCL-2和BCL-XL)的过表达与肿瘤发生有关，并且是抗癌疗法抗性的常见原因(Vaux DL等人,Nature[自然](1988)335:440-42；Delbridge AR等人,Cell Death Differ[细胞死亡与分化](2015)22:1071-80)。因此，被设计成靶向抗凋亡BCL-2蛋白的药剂(例如，小分子BH3模拟物)可以为癌症患者的治疗提供新的策略。然而，临床可用BCL-2抑制剂或BH3模拟物(包括正在进行临床评估的那些)在血液学癌症以及实体瘤中显示出有限的功效，这可能是由于复杂的信号传导途径和肿瘤微环境所致。
对抗癌疗法有临床反应通常仅限于一部分患者。为了最大化抗癌疗法的效率，已经提出了基于分子生物标志物的个性化化学疗法。然而，对能够预测对癌症化学疗法的应答的预测性生物标志物的鉴定仍然是一个挑战。因此，存在对开发生物标志物的持续需求，这些生物标志物用于预测BCL-XL/BCL-2双重抑制剂、BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂在癌症治疗中功效。
发明内容
在一方面，本披露提供了用于在有需要的受试者中治疗癌症的方法。在一个实施例中，该方法包括：(a)在包含获得自受试者的细胞的测试样品中，测量包含第一复合物的至少一种生物标志物的测试水平，该第一复合物包含BCL-XL或BCL-2蛋白；(b)并将该至少一种生物标志物的测试水平与该至少一种生物标志物的对应的参考水平进行比较，以确定差异；以及(c)当该差异达到阈值时，向该受试者施用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂。在另一个实施例中，该方法包括：(a)在包含获得自受试者的细胞的测试样品中，测量包含第一复合物的至少一种生物标志物的基线水平，该第一复合物包含BCL-XL或BCL-2蛋白；(b)用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂处理测试样品，(c)测量经处理的测试样品中至少一种生物标志物的治疗后水平；(d)将该治疗后水平与该至少一种生物标志物的基线水平进行比较，以确定该至少一种生物标志物的水平的治疗后变化；以及(e)当该治疗后变化达到阈值时，向该受试者施用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂。
在另一方面，本披露提供了用于鉴定和/或选择患有癌症的受试者进行用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL或BCL-2抑制剂的治疗的方法。在一个实施例中，该方法包括：(a)在包含获得自受试者的细胞的测试样品中，测量包含第一复合物的至少一种生物标志物的测试水平，该第一复合物包含BCL-XL或BCL-2蛋白；(b)并将该至少一种生物标志物的测试水平与该至少一种生物标志物的对应的参考水平进行比较，以确定差异；以及(c)当该差异达到阈值时，确定该受试者可能对用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂的治疗产生应答。在另一个实施例中，该方法包括：(a)在包含获得自受试者的细胞的测试样品中，测量包含第一复合物的至少一种生物标志物的基线水平，该第一复合物包含BCL-XL或BCL-2蛋白；(b)用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂处理测试样品，(c)测量经处理的测试样品中至少一种生物标志物的治疗后水平；(d)将该治疗后水平与该至少一种生物标志物的基线水平进行比较，以确定该至少一种生物标志物的水平的治疗后变化；以及(e)当该治疗后变化达到阈值时，确定该受试者可能对用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂的治疗产生应答。
在又另一方面，本披露提供了用于在受试者中监测治疗功效的方法，该受试者患有癌症，并在治疗期内已经用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL或BCL-2抑制剂进行了治疗。在一个实施例中，该方法包括：(a)在治疗期后获得包含来自该受试者的细胞的测试样品；(b)在该测试样品中测量包含第一复合物的至少一种生物标志物的水平，该第一复合物包含BCL-Xl或BCL-2，以获得该至少一种生物标志物的治疗后水平；(c)将该治疗后水平与对治疗期之前获得自该受试者的测试样品测量的该至少一种生物标志物的基线水平进行比较，以确定该至少一种生物标志物的水平的治疗后变化；以及(d)当该治疗后变化达到阈值时，向该受试者继续施用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL或BCL-2抑制剂，或当该治疗后变化未达到阈值时，增加对该受试者的BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂的剂量或给药频率，向该受试者施用与BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂组合的第二抗癌治疗剂，或停止向该受试者施用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂。
在某些实施例中，该至少一种生物标志物进一步包含第二复合物，所述第二复合物包含BCL-XL或BCL-2蛋白。
在某些实施例中，其中该第一和/或第二复合物包含与仅BH3蛋白复合的BCL-XL蛋白、与仅BH3蛋白复合的BCL-2蛋白、与含BH3蛋白复合的BCL-XL蛋白、或与含BH3蛋白复合的BCL-2蛋白。
在某些实施例中，该仅BH3蛋白选自下组，该组由以下组成：BIM、BID、BAD、BIK、HRK、BMF和PUMA。在某些实施例中，该含有蛋白的BH3结构域包含BAX或BAK。
在某些实施例中，该至少一种生物标志物包含选自下组的两种或更多种复合物，该组由以下组成：BCL-XL:BIM、BCL-XL:PUMA、BCL-2:BIM、BCL-2:PUMA、MCL-1:BIM、MCL-1:PUMA及其任何组合。
在某些实施例中，该至少一种生物标志物的水平包含第一复合物的水平和第二复合物的水平的组合。
在某些实施例中，通过使用蛋白质间相互作用测定来测量复合物的水平。在某些实施例中，该蛋白质间相互作用测定是基于免疫测定或邻近测定。在某些实施例中，该蛋白质间相互作用测定是介观尺度探索(Meso Scale Discovery(MSD))高级酶联免疫吸附测定(MSD-ELISA)、标准复合物ELSIA、邻位连接技术、共免疫沉淀、免疫印迹测定或交联测定。在某些实施例中，通过使用与复合物或与BCL-XL蛋白或与BCL-2蛋白特异性结合的抗体来测量第一复合物和/或第二复合物的水平。
在某些实施例中，该第一和/或第二复合物是样品中的优势复合物。在某些实施例中，该癌症是血液癌症，并且优势复合物包含BCL-2:BIM的复合物。在某些实施例中，该癌症是实体瘤，并且优势复合物包含BCl-xL:BIM、和/或BCl-xL:PUMA的复合物。
在某些实施例中，该至少一种生物标志物进一步包含MCL-1。
在某些实施例中，该至少一种生物标志物进一步包含BCL-2或BCL-XL。在某些实施例中，MCL-1、BCL-2或BCL-XL的水平是在mRNA水平、蛋白水平或DNA水平上测量的。
在某些实施例中，MCL-1、BCL-2或BCL-XL的水平是通过扩增测定、杂交测定、测序测定、免疫测定、光谱法、或邻近测定测量的。
在某些实施例中，该癌症是实体瘤。在某些实施例中，该实体瘤是肺癌、胃癌、食道癌、结肠癌、胆管癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、头颈癌或脑瘤。
在某些实施例中，该癌症是血液癌症。在某些实施例中，该血液癌症是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、华氏巨球蛋白血症(WM)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)或淋巴瘤。
在某些实施例中，该参考水平是相同类型癌症的代表性样品中至少一种生物标志物的平均水平。在某些实施例中，该至少一种生物标志物的参考水平是相同类型或某种类型的癌症(例如血液癌症)或一般癌症的肿瘤样品中生物标志物的经验水平。
在某些实施例中，该测试样品是体液样品或组织样品。
在某些实施例中，如本文所定义的，该BCL-2/BCL-XL双重抑制剂是具有式(I)、(II)、(III)或(IV)的结构的化合物。在某些实施例中，该BCL-2/BCL-XL双重抑制剂是如本文所提供的化合物A或化合物B。在某些实施例中，如本文所定义的，该BCL-2抑制剂是具有式(V)的结构的化合物。在某些实施例中，该BCL-2抑制剂是如本文所提供的化合物C。
在某些实施例中，该BCL-2/BCL-xL双重抑制剂是(R)-2-(1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯基氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌啶-4-羰基氧基)乙基膦酸或其药学上可接受的盐(在本文中还被称为“化合物A”)。
在某些实施例中，该BCL-2/BCL-xL双重抑制剂是(R)-1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯基氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌啶-4-甲酸或其药学上可接受的盐(在本文中还被称为“化合物B”)。
在某些实施例中，该BCL-xL抑制剂是(S)-N-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺或其药学上可接受的盐(在本文中还被称为“化合物C”)。
在又另一个方面，本披露提供了用于在本文所述的方法中使用的试剂盒。在一个实施例中，该试剂盒包含用于测量复合物水平的第一试剂。在某些实施例中，该第一试剂包含与复合物或与BCL-XL蛋白或与BCL-2蛋白特异性结合的第一抗体。在某些实施例中，至少一种试剂进一步包含第二试剂，该第二试剂包含与复合物中的仅BH3蛋白或含BH3结构域的蛋白特异性结合的第二抗体。
在某些实施例中，该第一抗体和/或第二抗体被可检测地标记。在某些实施例中，第一抗体和/或第二抗体中的一个被可检测地标记，并且另一个能够被捕获。在某些实施例中，该至少一种试剂进一步包含第三试剂，该第三试剂包含能够与MCL-1的多核苷酸杂交的第一寡核苷酸、或能够与MCL-1的蛋白特异性结合的第三抗体。
在某些实施例中，该至少一种试剂进一步包含第四试剂，该第四试剂包含能够与BCL-XL或BCL-2的多核苷酸杂交的第二寡核苷酸、或能够与BCL-XL或BCL-2的蛋白特异性结合的第四抗体。
在另一方面，本披露提供了用于测量包含复合物的至少一种生物标志物的水平的试剂在生产用于进行本文所述方法的诊断试剂盒中的用途，该复合物包含BCL-XL蛋白或BCL-2蛋白。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本披露的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个附图，结合本文中呈现的具体实施例的详细描述，可以更好地理解本披露。
图1A至1C说明了在11种实体瘤模型上进行PDX试验的总结(图1A)，用于药效学(PD)和生物标志物研究的PDX试验的程序(图1B)以及通过MSD测定在实体瘤PDX样品和血液学癌细胞系(Toledo)中的复合物(即BCL-2:BIM、BCL-xL:BIM、BCL-2:PUMA、BCL-xL:PUMA、MCL-1:BIM、MCL-1:PUMA)的基线水平(图1C)。“BCL-XLamp”是指样品具有与平均水平相当的BCL-XL基因扩增水平，“MCL-XLnor”是指样品具有MCL-1基因的正常水平。
图2A和2B说明了通过MSD测定溶媒对照组和化合物A组中BCL-xL:BIM复合物水平的变化。
图3A至3C说明了肿瘤生长抑制(TGI)与化合物A和以下蛋白质复合物的基线水平的相关性：BCL-XL:BIM和BCL-XL:PUMA(图3A)或BCL-2:BIM和BCL-2:PUMA(图3B)，或四个复合物：BCL-XL:BIM、BCL-XL:PUMA、BCL-2:BIM和BCL-2:PUMA这些基线的组合(图3C)。
图3D说明了TGI与BCL-XL:BIM、BCL-XL:PUMA、BCL-2:BIM和BCL-2:PUMA的组合水平的相关性，TGI和MCL-1蛋白基线水平与治疗后变化的相关性。
图4A和4B说明了通过蛋白质印迹测定在PDX样品中的凋亡蛋白表达水平(图4A中的图)和定量(4B)。
图4C和4D说明了通过WB测定在溶媒对照和化合物A组中凋亡(促死亡和抗死亡)蛋白表达的相对蛋白水平，以及示于图4E中的定量。
图5说明了TGI与BCL-xL:BIM和BCL-xL:PUMA，两种主要复合物的治疗后变化的相关性。
图6A和6B说明了用化合物B或ABT-737处理的Toledo(6A)和RS4；11(6B)细胞中BCL-2:BIM和BCL-XL:BIM复合物的MSD高级ELISA分析结果。
图7A和7B说明了用化合物B或ABT-263处理的Toledo(7A)和RS4；11(7B)细胞中BCL-2:BIM和BCL-XL:BIM复合物的MSD高级ELISA分析结果。
图8显示如本文提供的生物标志物的示例性序列。
具体实施方式
在更详细地描述本披露之前，应理解的是本披露不限于所描述的具体实施例，因此这些当然可以改变。还应当理解，本文使用的术语仅是为了描述具体实施例的目的，而并不意图是限制性的，因为本披露的范围将仅由所附权利要求书限定。
除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料也可以用于实施或测试本披露，但是现在描述优选的方法和材料。
在本说明书中引用的所有公开物和专利通过引用结合于此，就像每个单独公开物或专利被确切地并且单独地指示为通过引用被结合并且通过引用结合于此，以结合所引用的这些公开物来披露和描述这些方法和/或材料。任何公开物的引用内容是针对在提交日之前的披露，并且不能理解为承认因为先前披露而本披露不能获得比这些公开物更早的申请日。此外，所提供的公开日期可能与实际的公开日期不同，实际的公开日期可能需要单独地确认。
如将对于本领域技术人员清楚的是，在阅读本披露时，本文描述和展示的单独实施例的每一个具有离散的组分和特征，这些组分和特征可以在不偏离本披露的范围或精神的情况下易于与任何其他若干个实施例的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。
定义
提供以下定义来帮助读者。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他科学或医学术语或用辞旨在具有由化学和医学领域技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义了具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包括这些定义不应必须被解释为表示与本领域中通常理解的术语的定义之间的实质性差异。
如本文所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”以及“该(the)”包括复数指示物，除非上下文清楚地另外指明。
如本文所使用的，术语“生物标志物”是指作为一些生物学状态或状况的可测量的指示物的生物分子。本文使用的术语“生物标志物”旨在涵盖目的多核苷酸、多肽(例如由目的多核苷酸编码)，以及含有两个或多个生物标志物结合在一起的复合物。本文提供的生物标志物的实例可以是基因(例如，基因组DNA、cDNA)、或基因产物(例如，从基因转录的mRNA、由基因编码的蛋白质、和蛋白质复合物)。本文提供的生物标志物的一个具体实例包括包含BCL-XL蛋白或BCL-2蛋白的复合物。本文提供的生物标志物的另一个具体实例包括MCL-1、BCL-XL或BCL-2。
如本文所使用的，关于蛋白质或多肽的术语“复合物”是指一组两个或多个相关的多肽链。不同的多肽链可以具有不同的功能。通常，蛋白质复合物中的多肽链通过非共价相互作用连接。不同的蛋白质复合物可能具有不同程度的随着时间的推移的稳定性。
如本文所使用的，术语“BCL-XL”是指BCL-XL基因和BCL-XL基因产物(例如，BCL-XL基因的mRNA和由BCL-XL基因编码的蛋白质)。BCL-XL基因，也称为BCL-2样1(BCL2L1)基因，编码属于BCL-2蛋白家族的蛋白。该BCL-XL蛋白通过阻止线粒体内容物(例如细胞色素c)的释放而充当抗凋亡蛋白。人类BCL-XL基因在NCBI数据库中具有基因ID为598。人类BCL-XL基因的mRNA转录物具有NCBI参考序列为XM_0111528964.2和XM_017027993.1。人类BCL-XL基因编码的蛋白质具有NCBI参考序列为XP_011527266.1和XP_016883482.1。
如本文所使用的，术语“BCL-2”是指BCL-2基因和BCL-2基因产物(例如，BCL-2基因的mRNA和由BCL-2基因编码的蛋白质)。BCL-2基因编码完整的线粒体外膜蛋白，该蛋白可阻止某些细胞(如淋巴细胞)的凋亡性死亡。人类BCL-2基因在NCBI数据库中具有基因ID为596。人类BCL-2基因的mRNA转录物具有NCBI参考序列为XM_017025917.2和XM_011526135.3。人类BCL-2基因编码的蛋白质具有NCBI参考序列为XP_016881406.1和XP_011524437.1。
如本文所使用的，术语“MCL-1”是指MCL-1基因和MCL-1基因产物(例如，MCL-1基因的mRNA和由MCL-1基因编码的蛋白质)。MCL-1基因编码属于BCL-2家族的蛋白质。MCL-1基因的另一种剪接产生至少两种蛋白质，较长的蛋白质通过抑制细胞凋亡来增强细胞存活，而较短的蛋白质则促进细胞凋亡和细胞死亡。人类MCL-1基因在NCBI数据库中具有基因ID为4170。人类MCL-1基因的mRNA转录物具有NCBI参考序列为NM_021960.5、NM_182763.2和NM_001197320.1。人类MCL-1基因编码的蛋白质具有NCBI参考序列为NP_068779.1、NP_877495.1和NP_001184249.1。
如本文所使用的，术语“BIM”是指BIM基因和BIM基因产物(例如，BIM基因的mRNA和由BIM基因编码的蛋白质)。BIM，也称为BCL-2-样蛋白11，是促凋亡BCL-2家族成员，已显示与BCL-2、BCL-XL和MCL-1相互作用。人类BIM基因在NCBI数据库中具有基因ID为10018。人类BIM基因的mRNA转录物具有NCBI参考序列为NM_001204106、NM_001204107、NM_001204108、NM_001204109和NM_001204110。人类BIM基因编码的蛋白质具有NCBI参考序列为NP_001191035、NP_001191036、NP_001191037、NP_001191038和NP_001191039。
如本文所使用的，术语“PUMA”是指PUMA基因和PUMA基因产物(例如，PUMA基因的mRNA和由PUMA基因编码的蛋白质)。PUMA或p53凋亡的上调调节剂，也称为Bcl-2结合成分3(BBC3)，是BCL-2蛋白家族的促凋亡成员。PUMA的表达受肿瘤抑制因子p53调控。激活后，PUMA与抗凋亡BCL-2家族成员相互作用，从而释放促凋亡分子BAX和/或BAK，然后它们能够向线粒体发出凋亡信号。人类PUMA基因在NCBI数据库中具有基因ID为27113。人类PUMA基因的mRNA转录物具有NCBI参考序列为NM_001127240、NM_001127241、NM_001127242和NM_014417。人类PUMA基因编码的蛋白质具有NCBI参考序列为NP_001120712、NP_001120713、NP_001120714、NP_055232和NP_001120712.1。
如本文所使用的，术语“BID”是指BID基因和BID基因产物(例如，BID基因的mRNA和由BID基因编码的蛋白质)。BID，或BH3相互作用结构域死亡激动剂，是仅含有BH3结构域的BCL-2家族的促凋亡成员。响应凋亡信号传导，BID与另一种BCL-2家族蛋白BAX相互作用，导致活化的BAX插入线粒体外膜。抗凋亡的BCL-2家族成员(包括BCL-2本身)，可以结合BID并抑制BID激活BAX的能力。BID的表达被p53上调，并参与p53介导的细胞凋亡。人类BID基因在NCBI数据库中具有基因ID为637。人类BID基因的mRNA转录物具有NCBI参考序列为NM_001196、NM_001244567、NM_001244569、NM_001244570和NM_001244572。人类BID基因编码的蛋白质具有NCBI参考序列为NP_001187、NP_001231496、NP_001231498、NP_001231499和NP_001231501。
如本文所使用的，术语“BAD”是指BAD基因和BIAD基因产物(例如，BAD基因的mRNA和由BAD基因编码的蛋白质)。BAD或与BCL-2相关的死亡促进剂是BCL-2家族的促凋亡成员，其参与启动细胞凋亡。BAD是仅BH3家族的一个成员。脱磷酸的BAD与BCL-2和BCL-XL形成异源二聚体，使它们失活，从而允许BAX/BAK触发凋亡。当BAD被AKT磷酸化时，它会形成BAD-14-3-3蛋白异二聚体，而BCL-2则可以自由抑制BAX触发的凋亡。人类BAD基因在NCBI数据库中具有基因ID为572。人类BAD基因的mRNA转录物具有NCBI参考序列为NM_032989和NM_004322。人类BAD基因编码的蛋白质具有NCBI参考序列为NP_004313和NP_116784。
如本文所使用的，术语“BIK”是指BIK基因和BIK基因产物(例如，BIK基因的mRNA和由BIK基因编码的蛋白质)。BIK、或与BCL-2相互作用的杀手是BCL-2家族的促凋亡成员。BIK与BCL-2和BCL-XL相互作用。人类BIK基因在NCBI数据库中具有基因ID为638。人类BIK基因的mRNA转录物具有NCBI参考序列为NM_001197。人类BIK基因编码的蛋白质具有NCBI参考序列为NP_001188和NP_001188.1。
如本文所使用的，术语“HRK”是指HRK基因和HKR基因产物(例如，HRK基因的mRNA和由HRK基因编码的蛋白质)。HRK、或HARAKIRI是一种促凋亡蛋白，可与BCL-2和BCL-XL相互作用。HRK蛋白与其他BCL-2家族成员缺乏明显的同源性，除了与BIK的BH3结构域相似的8个氨基酸区域外。人类HRK基因在NCBI数据库中具有基因ID为8739。人类HRK基因的mRNA转录物具有NCBI参考序列为NM_003806。人类HRK基因编码的蛋白质具有NCBI参考序列为NP_003797。
如本文所使用的，术语“BMF”是指BMF基因和BMF基因产物(例如，BMF基因的mRNA和由BMF基因编码的蛋白质)。BMF、或BCL-2修饰因子是含有单个BH3结构域的BCL-2家族成员。已显示BMF结合BCL-2蛋白并充当凋亡激活剂。人类BMF基因在NCBI数据库中具有基因ID为90427。人类BMF基因的mRNA转录物具有NCBI参考序列为NM_001003940、NM_001003942、NM_001003943和NM_033503。人类BMF基因编码的蛋白质具有NCBI参考序列为NP_001003940、NP_001003942、NP_001003943和NP_277038。
如本文所使用的，术语“BAK”是指BAK基因和BAK基因产物(例如，BAK基因的mRNA和由BAK基因编码的蛋白质)。BAK，也称为BCL-2同源拮抗剂/杀手，是BCL-2家族的促凋亡成员。BAK蛋白与线粒体电压依赖性阴离子通道相互作用并加速其开放，这导致膜电位的损失和细胞色素c的释放。人类BAK基因在NCBI数据库中具有基因ID为578。人类BAK基因的mRNA转录物具有NCBI参考序列为NM_001188。人类BAK基因编码的蛋白质具有NCBI参考序列为NP_001179。
如本文所使用的，术语“BAX”是指BAX基因和BAX基因产物(例如，BAX基因的mRNA和由BAX基因编码的蛋白质)。BAX，也称为BCL样蛋白4，是BCL-2家族的促凋亡成员。BAX蛋白与BCL-2形成异源二聚体，并增加了线粒体电压依赖性阴离子通道的开放，这导致膜电位的损失和细胞色素c的释放。BAX基因的表达受p53调控，并且已显示与p53介导的细胞凋亡有关。人类BAX基因在NCBI数据库中具有基因ID为581。人类BAX基因的mRNA转录物具有NCBI参考序列为NM_001291428、NM_001291429、NM_001291430、NM_001291431和NM_004324。人类BAX基因编码的蛋白质具有NCBI参考序列为NP_001278357、NP_001278358、NP_001278359、NP_001278360和NP_004315。
关于生物标志物的术语“水平”是指样品中存在的目的生物标志物的量或数量。这样的量或数量可以用绝对术语(即，样品中生物标志物的总数量)、或相对术语(即，样品中生物标志物的浓度或百分比)表示。可以在DNA水平(例如，如由染色体区域中基因的量或数量或拷贝数表示)、RNA水平(例如，如mRNA量或数量表示)、或蛋白质水平(例如，如蛋白质或蛋白质复合物量或数量表示)上测量生物标志物的水平。
如本文所使用的，术语“癌症”是指涉及异常细胞生长的任何疾病，并且包括影响身体中任何组织、器官或细胞的疾病的所有阶段和所有形式。该术语包括所有已知的癌症和赘生性病症(无论被描述为恶性、良性、软组织的还是实体性的)，以及所有阶段和等级的癌症(包括转移前和转移后的癌症)。通常，可以根据癌症位于或起源于的组织或器官以及癌组织和细胞的形态对癌症进行分类。
如本文所使用的，术语“实体瘤”是指不包含囊肿或液体区域的任何癌症。实体瘤通常不包括白血病(即，血液癌症)。实体瘤可以是良性或恶性的。如本文所使用的，实体瘤的类型包括但不限于，肾上腺皮质癌、肛门癌、星形细胞瘤、儿童小脑或大脑癌、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨肿瘤、脑癌、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、宫颈癌、结肠癌、肺气肿、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因氏肉瘤、视网膜母细胞瘤、胃/胃部癌、胶质瘤、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺癌)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、肝癌、肺癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、视网膜母细胞瘤、尤因肿瘤家族、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、咽喉癌、甲状腺癌和阴道癌。
值得注意的是，在本披露中，例如“包括/包含/含有(comprises/comprised/comprising/contains/containing)”等术语旨在是包括性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的元素或方法步骤。
术语“测定”、“评估”、“测量”和“检测”可互换地使用，并且是指定量和半定量的测定。旨在进行定量和半定量测定的情况下，可以使用短语“确定目标多核苷酸或多肽的水平”或“检测目标多核苷酸或多肽的水平”。
术语“杂交”是指在严格条件下核酸分子优先与特定核苷酸序列结合、双链化或杂交。术语“严格条件”是指杂交和洗涤条件，在该条件下探针将优先与其靶序列杂交，并在较小程度上或根本不与混合群体中的其他序列(例如，来自组织活检的细胞裂解液或DNA制剂)杂交。在核酸杂交的上下文中的严格条件是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。对核酸杂交的大量指导可见于，例如，Tijssen Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Bio logy—Hybridization with Nucleic Acid Probes[生物化学和分子生物学实验室技术：与核酸探针杂交]第I部分,第2章,“Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays[杂交原理和核酸探针测定策略的综述],”(1993)爱思维尔公司(Elsevier),纽约州)。通常，高严格杂交和洗涤条件在一个定义的离子强度和pH下被选择为低于所述具体序列的热熔点(Tm)大约5℃。Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在定义的离子强度和pH下)。
术语“核酸”和“多核苷酸”可互换地使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物)。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、shRNA、单链短或长RNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、控制区、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。核酸分子可以是线性或环状的。
术语“互补性”是指通过传统的沃森-克里克(Watson-Crick)类型或其他非传统类型来与另一种核酸序列形成氢键的能力。百分比互补性表示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键的(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个中的5、6、7、8、9、10个是50％、60％>、70％>、80％>、90％和100％互补)。
如本文所使用的，术语“预后(prognose/prognosing)”是指疾病或病症的未来病程或结果的预测或预报。
通常，“蛋白质”是多肽(即，通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸的串)。蛋白质可以包括氨基酸以外的部分(例如，可以是糖蛋白)和/或还可以另外进行加工或修饰。本领域普通技术人员将理解，“蛋白质”可以是由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或者可以是其功能部分。本领域普通技术人员将进一步理解，蛋白质有时可包含多于一个的多肽链，例如通过一个或多个二硫键连接或通过其他方式缔合。
如在患者对癌症疗法的应答的上下文中使用的术语“应答的”或“应答性”可互换地使用，并且是指对治疗的有益患者应答，而不是不利应答(即不良事件)。在患者中，有益应答可以根据许多临床参数来表达，这些临床参数包括可检测到的肿瘤消失(完全应答)，肿瘤大小和/或癌细胞数减小(部分应答)，肿瘤生长停滞(稳定的疾病)，可能导致肿瘤消退或排斥的抗肿瘤免疫反应增强；与肿瘤有关的一种或多种症状在某种程度上的减轻；治疗后的存活期长度增加；和/或治疗后给定时间点处的死亡率降低。肿瘤大小和/或癌细胞数的持续增加、和/或肿瘤转移表明缺乏对治疗的有益应答，并因此降低了应答性。
如本文所使用的，术语“样品”是指获得自受试者的生物样品，并且包含一种或多种目的生物标志物。样品的实例包括但不限于体液，例如血液、血浆、血清、尿液、阴道液、子宫或阴道冲洗液、胸膜液、腹水液、脑脊液、唾液、汗液、眼泪、痰、细支气管肺泡灌洗液等；以及组织，例如活检组织(例如，活检的骨组织、骨髓、乳腺组织、胃肠道组织、肺组织、肝组织、前列腺组织、脑组织、神经组织、脑膜组织、肾组织、子宫内膜组织、宫颈组织、淋巴结组织、肌肉组织或皮肤组织)、石蜡包埋的组织。在某些实施例中，该样品可以是包含细胞(例如癌细胞或非癌细胞，例如外周血单核细胞(PBMC))的生物学样品。在一些实施例中，该样品是例如通过肿瘤活检或细针抽吸从肿瘤获得的新鲜或存档的样品。该样品也可以是任何含有癌细胞的生物流体。通常在医院或诊所之后，例如在活检期间，根据标准方案进行从受试者收集样品。
如本文所使用的，术语“测试样品”是指获得自需要癌症治疗的受试者的样品，并且代表该受试者的癌症病情。例如，测试样品可以包含癌细胞。
如本文所使用的，术语“受试者”是指人类或任何非人类动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。在许多实施例中，受试者是人类。受试者可以是患者，是指呈现给医疗提供者以诊断或治疗疾病的人。术语“受试者”在本文中与“个体”或“患者”互换地使用。受试者可以患有或易患疾病或障碍，但是可以显示或可以不显示该疾病或障碍的症状。
如本文所使用的，术语“治疗(“treatment”、“treat”或“treating”)”是指预防或缓解病症、减缓病症的发展的发作或速度、预防或延迟与病症相关的症状的发展、减轻或终止与病症相关的症状、产生病症的完全或部分消退、治愈病症或其某些组合。关于癌症，“治疗(“treating”或“treatment”)”是指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞的生长、增殖或转移，预防或延迟肿瘤的发展或恶性细胞的生长、增殖、转移或癌症症状或其某些组合。因此，在所公开的方法中，治疗可以指癌症或癌症症状严重程度降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。例如，与对照相比，如果受试者的一种或多种疾病症状降低了10％，则认为治疗该疾病的方法为治疗。因此，与原始或对照水平相比，降低可以为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或10％至100％之间的任何百分比降低。应当理解，治疗不一定是指疾病、病症或疾病或病症的症状的治愈或完全消融。
如本文所使用的，术语“可检测标记”是指允许检测的分子或部分。关于试剂的术语“可检测地标记”是指试剂包含可检测的标记或可以被可检测的标记结合。可检测标记可用于标记蛋白质(例如抗体)和核酸(例如探针和引物)。适合用于标记引物、探针和抗体的可检测标记的实例包括例如发色团、放射性同位素、荧光团、化学发光部分、颗粒(可见的或荧光的)、核酸、配体、或催化剂(例如酶)。
放射性同位素的实例包括但不限于，123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32P。
荧光团的实例包括但不限于，吖啶、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、BODIPY、瀑布蓝(Cascade Blue)、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、伊丹(Edans)、伊红(Eosin)、赤藓红、荧光素、6-FAM、TET、JOC、HEX、俄勒冈绿(Oregon Green)、罗丹明、罗丹绿(Rhodol Green)、Tamra、Rox和Texas Red TM(分子探针公司(Molecular Probes,Inc.)，尤金(Eugene)，俄勒冈州(Oreg.))。
酶的实例包括但不限于，碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和核糖核酸酶。
配体的实例包括但不限于，生物素、亲和素、核酸、寡核苷酸、抗体或抗原。
应理解的是，可检测标记不必产生可检测信号，例如，在一些实施例中，它可以与可检测配偶体反应或与一种或多种另外的化合物反应以产生可检测信号。例如，可检测标记可以是能够用作标记的配体的特异性结合配偶体的配体(例如，第二标记的抗体)。再例如，由于其催化导致可检测信号产生的发色、发荧光或发光底物的催化活性，酶可用作可检测标记。
预测BCL-2/BCL-XL抑制剂功效的生物标志物
本文所述的方法和组合物部分基于生物标志物的发现，该生物标志物的水平可预测BCL-2抑制剂、BCL-XL抑制剂、或BCL-2/BCL-XL双重抑制剂的抗癌功效。特别地，本文所述的生物标志物可用于预测BCL-2/BCL-XL双重抑制剂、BCL-XL抑制剂和/或BCL-2抑制剂的抗癌功效，特别是本文所提供的那些(例如，WO2014113413A1、US 9403856 B和WO 2018027097A1，将其全部并入本文)。
Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡的线粒体(也称为“内在”)途径的关键调节因子。它们的活性与淋巴样癌症和若干种实体瘤癌症的发作有关，并且据信在许多癌症中是化学疗法抗性的关键介质。BCL-2家族蛋白的特征在于结构性同源结构域BH1、BH2、BH3和BH4，并且可以根据每种蛋白质包含多少个同源结构域和根据其生物学活性(即，该蛋白质是否具有促凋亡或抗凋亡功能)被进一步分类为三个亚族。
BCL-2蛋白的第一亚组包含具有所有四个同源结构域(即，BH1、BH2、BH3和BH4)的蛋白质。它们的一般作用是抗-凋亡，即保护细胞免于启动细胞死亡过程。例如BCL-2、BCL-W、BCL-XL、MCL-1和BFL-1/A1等蛋白质是该第一亚组的成员。
属于Bcl-2蛋白的第二亚组的蛋白质包含三个同源结构域BH1、BH2和BH3，并具有促凋亡作用。该第二亚组的两种主要代表性蛋白质是BAX和BAK。在本披露中，该组也称为含有多结构域或BH3结构域的促死亡蛋白。
Bcl-2蛋白的第三亚组由仅包含BH3结构域的蛋白质组成，并且该亚组的成员通常被称为“仅BH3蛋白”。它们对细胞的生物学作用是促凋亡。BIM、BID、BAD、BIK、NOXA、HRK、BMF、和PUMA是该第三亚族蛋白质的实例。
凋亡途径的失调导致受影响细胞的存活，否则该细胞在正常条件下会经历凋亡。由于细胞凋亡途径中涉及过多的BCL-2家族蛋白，并且这些蛋白质的天然水平可以按不同细胞类型而变化，所以很少存在通常可应用于预测特定的BCL-2抑制剂、BCL-XL抑制剂或BCL-2/BCL-XL双重抑制剂的抗癌功效的生物标志物。
本披露的发明人惊奇地发现，包含含有BCL-XL或BCL-2的复合物的至少一种生物标志物的水平与BCL-2/BCL-XL双重抑制剂、BCL-XL抑制剂和/或BCL-2抑制剂的抗癌功效有关，特别是本文提供的抑制剂。
在某些实施例中，本文提供的至少一种生物标志物包含第一复合物，所述第一复合物包含BCL-XL或BCL-2蛋白。在某些实施例中，本文提供的至少一种生物标志物进一步包含第二复合物，所述第二复合物包含BCL-XL或BCL-2蛋白。在某些实施例中，该第一和/或第二复合物可以与仅BH3蛋白或与含BH3结构域蛋白复合。在某些实施例中，该第一和/或第二复合物包含与仅BH3蛋白复合的BCL-XL蛋白、与仅BH3蛋白复合的BCL-2蛋白、与含BH3蛋白复合的BCL-XL蛋白、或与含BH3蛋白复合的BCL-XL蛋白。
仅BH3蛋白根据其调节功能分为“激活剂”(例如BIM和BID)或“敏化剂”(例如BAD、BIK、NOXA、HRK、BMF和PUMA)。激活蛋白可以结合并激活促凋亡蛋白，但是这些激活蛋白也可以结合抗凋亡BCL-2家族蛋白(例如BCL-2或BCL-xL)并被隔离并阻止其发挥促凋亡活性。增敏蛋白可以取代抗凋亡BCL-2家族蛋白中的激活蛋白(例如BCL-2或BCL-xL)，从而阻断抗凋亡活性。在某些实施例中，该仅BH3蛋白选自下组，该组由以下组成：BIM、BID、BAD、BIK、HRK、BMF和PUMA。
含有BH3结构域的蛋白质包含三个同源结构域BH1、BH2和BH3，并具有促凋亡作用。含BH3结构域的蛋白可以选自BAX和BAK。在某些实施例中，该含有BH3结构域的蛋白质选自下组，该组由以下组成：BAK和BAX。
在某些实施例中，该至少一种生物标志物包含选自下组的两种或更多种复合物，该组由以下组成：BCL-XL:BIM、BCL-XL:PUMA、BCL-2:BIM、BCL-2:PUMA、MCL-1:BIM、MCL-1:PUMA及其任何组合。
在某些实施例中，BCL-2包含SEQ ID NO:1或13的氨基酸序列。在某些实施例中，BCL-XL包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在某些实施例中，BIM包含SEQ ID NO:5或15的氨基酸序列。在某些实施例中，BAD包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在某些实施例中，PUMA包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
在某些实施例中，本文提供的至少一种生物标志物进一步包含MCL-1。
在某些实施例中，MCL-1包含SEQ ID NO:12、18或20的基因序列，其编码具有SEQID NO:11、17或19的氨基酸序列的蛋白。用作本文生物标志物的MCL-1可以是MCL-1的多核苷酸或蛋白质，或包含MCL-1的复合物(例如蛋白质复合物)。
在某些实施例中，本文提供的至少一种生物标志物进一步包含BCL-2或BCL-XL。用作本文生物标志物的BCL-2或BCL-XL可以是BCL-2或BCL-XL的多核苷酸或蛋白质。
因此，基于本文提供的至少一种生物标志物的测量水平，本披露提供了用于测量本文提供的至少一种生物标志物的水平的至少一种检测试剂；和用于鉴定和/或选择患有或怀疑患有癌症的受试者进行用本文提供的BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂的治疗的方法；用于在有需要的受试者中治疗癌症的方法；以及用于在受试者中监测治疗功效的方法，该受试者患有癌症，并在治疗期内已经用本文提供的BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂进行了治疗。
测量生物标志物的水平的试剂
在一方面，本披露提供了用于检测或测量本文提供的至少一种的生物标志物的水平的至少一种试剂。
在某些实施例中，该至少一种试剂包含第一试剂，该第一试剂包含与复合物或与BCL-XL蛋白或与BCL-2蛋白特异性结合的第一抗体。在某些实施例中，本文提供的第一抗体包含能够与具有选自以下的序列的蛋白质或多肽内的表位特异性结合的抗原结合区：SEQID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、和19。
在某些实施例中，该至少一种试剂进一步包含第二试剂，该第二试剂包含与复合物中的仅BH3蛋白或含BH3结构域的蛋白特异性结合的第二抗体。第二抗体的实例包括但不限于抗BIM，抗BID，抗BAD，抗BIK，抗HRK，抗BMF，抗PUMA，抗MCL-1，抗BAX，抗BAK抗体。
如本文所使用的，术语“抗体”是指可以与靶蛋白抗原特异性结合的免疫球蛋白或其抗原结合片段。可以通过从噬菌体或类似载体中的重组抗体文库中选择抗体来鉴定和制备抗体，以及通过对动物(例如兔或小鼠)进行免疫来制备多克隆和单克隆抗体(参见，例如，Huse等人,Science[科学](1989)246:1275-1281；Ward等人，Nature[自然](1989)341:544-546)。
可以理解，在某些实施例中，将该抗体进行修饰或标记以适当地在多种检测测定中使用。在某些实施例中，该第一抗体和/或第二抗体被可检测地标记。
在某些实施例中，该第一抗体与第一可检测标记缀合，第二抗体与第二可检测标记缀合，其中当紧密靠近时，第一可检测标记和第二可检测标记可允许产生可检测信号。在某些实施例中，该第一可检测标记和第二可检测标记包含一对寡核苷酸。当第一抗体和第二抗体非常接近时，一对寡核苷酸能够相互作用以使得能够进行酶促连接以提供连接的产物，该产物可以通过例如扩增来检测。其他检测系统也是可用的，例如时间分辨荧光、内部反射荧光、扩增(例如，聚合酶链式反应)和拉曼光谱等。
在某些实施例中，第一抗体和/或第二抗体中的一个被可检测地标记，并且另一个能够被捕获。能够被捕获的抗体可以包含捕获部分，或者可以被固定。
捕获部分的实例可以包括例如结合配偶体或固体基质，例如多孔和无孔材料、胶乳颗粒、磁性颗粒、微粒、条带、珠、膜、微量滴定孔和塑料管。固相材料的选择和可检测地标记抗原或抗体试剂的方法是根据所需的测定形式性能特征确定的。在某些实施例中，该抗体可以被固定在固体基质上。固定化可以通过共价连接或非共价附接(例如涂覆)进行。
捕获部分可以导致捕获与复合物结合的抗体，从而捕获与抗体结合的复合物。通过检测捕获的复合物中是否存在与该复合物中的另一配偶体特异性结合并被可检测地标记(或能够与标记的配体特异性结合)的另一种抗体，本领域技术人员可以检测或确认复合物中的两个配偶体的存在，从而确定了复合物的水平。在某些实施例中，该标记的配体可以包含与可检测标记连接的第二抗体。例如，当用于MSD测定中时，该抗体与电化学发光试剂连接。
在某些实施例中，该至少一种试剂包含第三试剂，该第三试剂包含能够与MCL-1的多核苷酸杂交的第一寡核苷酸、或能够与MCL-1的蛋白特异性结合的第三抗体。在某些实施例中，该至少一种试剂进一步包含第四试剂，该第四试剂包含能够与BCL-XL或BCL-2的多核苷酸杂交的第二寡核苷酸、或能够与BCL-XL或BCL-2的蛋白特异性结合的第四抗体。
MCL1、BCL-XL、和/或BCL-2的水平的测量可以在RNA水平、DNA水平和/或蛋白质水平上。可以使用用于检测靶RNA、靶DNA或靶蛋白质的合适的试剂。在某些实施例中，该第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸包含可以与包含MCL-1、BCL-XL、和/或BCL-2的至少一种生物标志物的多核苷酸杂交的引物或探针。
如本文所使用的，术语“引物”是指由于靶多核苷酸序列的序列内的至少一部分引物的序列互补性，可以与靶多核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸。引物的长度可以是至少8个核苷酸，典型地为8至70个核苷酸，通常为18至26个核苷酸。为了与靶序列正确杂交，引物可以与靶多核苷酸序列的杂交部分具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％序列互补性。可用作引物的寡核苷酸可以根据最初由Beaucage和Caruthers,Tetrahedron Letts.[四面体通讯](1981)22:1859-1862所述的固相亚磷酰胺三酯方法，使用自动合成仪，如Needham-Van Devanter等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究](1984)12:6159-6168中所述进行化学合成。
引物可用于核酸扩增反应，其中引物被延伸以产生多核苷酸的新链。引物可以由技术人员使用本领域已知的常识容易地设计，使得它们可以与本文提供的至少一种生物标志物的靶核苷酸序列的核苷酸序列特异性退火。通常，将引物的3′核苷酸设计成与靶序列在相应的核苷酸位置处互补，以通过聚合酶提供最佳的引物延伸。
如本文所使用的，术语“探针”是指由于靶多核苷酸序列的序列内的至少一部分探针的序列互补性，可以与靶多核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸或其类似物。示例性探针可以是例如DNA探针、RNA探针或蛋白质核酸(PNA)探针。探针的长度可以是至少8个核苷酸，典型地为8至70个核苷酸，通常为18至26个核苷酸。为了与靶序列正确杂交，探针可以与靶多核苷酸序列的杂交部分具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列互补性。并且探针也可以根据如上所述的固相亚磷酰胺三酯方法化学合成。用于制备DNA和RNA探针的方法、以及用于将其与靶核苷酸序列杂交的条件描述于Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册],J.Sambrook等人编辑,第2版Cold SpringHarbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]，1989，第10和11章中。
在某些实施例中，本文提供的引物或探针包含可与SEQ ID NO:12、18、20、2、14、或4的序列内的一部分杂交的多核苷酸序列。在某些实施例中，本文提供的引物或探针包含与SEQ ID NO:12、14或16的序列内的一部分具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％互补性的多核苷酸序列。
在某些实施例中，本文提供的第三抗体包含能够与具有SEQ ID NO:11、17或19的序列的蛋白质或多肽内的表位特异性结合的抗原结合区。在某些实施例中，本文提供的第四抗体包含能够与具有SEQ ID NO:1、13或3的序列的蛋白质或多肽内的表位特异性结合的抗原结合区。
在某些实施例中，该至少一种试剂(例如，本文提供的引物、探针和抗体)是被可检测地标记的。在某些实施例中，该本文提供的引物、探针和抗体可以特异性结合被可检测地标记的配体。
在某些实施例中，本文提供的可检测地标记的引物、探针或抗体可以进一步包含淬灭剂物质。淬灭剂物质是指如下物质，当与荧光物质足够接近地存在时，由于例如荧光共振能量转移(FRET)，其可以淬灭由荧光物质发出的荧光。
淬灭剂物质的实例包括但不限于，Tamra、Dabcyl或黑洞淬灭剂(Black HoleQuencher)(BHQ，生物研究技术公司(Biosearch Technologies))、DDQ(优罗泰公司(Eurogentec))、Iowa Black FQ(集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies))、QSY-7(分子探针公司(Molecular Probes))和Eclipse淬灭剂(时代生物科学公司(EpochBiosciences))。
通过切口平移方法或通过随机引物方法，可以将引物和探针标记为具有高特异性活性。有用的探针标记技术描述在文献中(Fan,Y-S，Molecular cytogenetics:protocolsand applications[分子细胞遗传学：方案与应用],Humana Press[胡玛纳出版社],托托华(Totowa),新泽西州(N.J.)xiv,411(2002))。
本披露还提供了试剂盒，其包含至少一种用于测量至少一种如本文所提供的生物标志物的水平的试剂。
用于患者鉴定、治疗指导和预后的方法
在另一方面，本披露的一个方面提供了一种用于鉴定和/或选择患有或怀疑患有癌症的受试者进行用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL或BCL-2抑制剂的治疗的方法。在某些实施例中，该方法包括：在获得自该受试者的测试样品中测量包含第一复合物的至少一种生物标志物的测试水平，该第一复合物包含BCL-XL或BCL-2；将该至少一种生物标志物的水平与该至少一种生物标志物的对应的参考水平进行比较，以确定差异；以及当该差异达到阈值时，确定该受试者可能对用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂的治疗产生应答。
在另一方面，本披露提供了用于在有需要的受试者中治疗癌症的方法。在某些实施例中，该方法包括：在获得自该受试者的测试样品中测量包含第一复合物的至少一种生物标志物的测试水平，该第一复合物包含BCL-XL或BCL-2；将该至少一种生物标志物的测试水平与该至少一种生物标志物的对应的参考水平进行比较，以确定差异；以及当该差异达到阈值时，向该受试者施用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂。
在另一方面，本披露提供了用于在受试者中监测治疗功效的方法，该受试者患有癌症，并在治疗期内已经用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂进行了治疗。在某些实施例中，该方法包括：在治疗期后从该受试者获得测试样品；在该样品中测量包含第一复合物的至少一种生物标志物的水平，该第一复合物包含BCL-XL或BCL-2，以获得该至少一种生物标志物的治疗后水平；将该治疗后水平与对治疗期之前获得自该受试者的测试样品测量的该至少一种生物标志物的基线水平进行比较，以确定该至少一种生物标志物的水平的治疗后变化，并推荐治疗计划。例如，当该治疗后变化达到阈值时，治疗计划可以包括：向该受试者施用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL或BCL-2抑制剂。又例如，当该治疗后变化未达到阈值时，治疗计划可以包括：增加对该受试者的BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂的剂量或给药频率，向该受试者施用与BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂组合的第二抗癌治疗剂，或停止向该受试者施用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂。
在某些实施例中，该至少一种生物标志物进一步包含第二复合物，所述第二复合物包含BCL-XL或BCL-2蛋白。
在某些实施例中，该癌症是实体瘤。在某些实施例中，该实体瘤是肺癌、胃癌、食道癌、结肠癌、胆管癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、头颈癌或脑瘤。在某些实施例中，该实体瘤的至少一种生物标志物包含BCL-XL:BIM和BCL-XL:PUMA。
在某些实施例中，该癌症是血液癌症。在某些实施例中，该血液癌症是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、华氏巨球蛋白血症(WM)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)或淋巴瘤。在某些实施例中，该血液癌症的至少一种生物标志物包含BCL-2:BIM和BCL-2:PUMA。
样品制备
适用于实施本文提供的方法的任何生物样品可以获得自受试者。在某些实施例中，该样品含有细胞。在某些实施例中，该样品含有癌细胞。在某些实施例中，该样品含有非癌细胞，例如外周血单核细胞(PBMC)。在某些实施例中，该测试样品是体液样品或组织样品。
在某些实施例中，可以通过可取的方法对样品进一步处理，用于进行该至少一种生物标志物的水平的测量。
在某些实施例中，该方法进一步包括从获得自受试者的生物流体样品(例如，外周血样品)或组织样品中分离或提取癌细胞(例如，循环肿瘤细胞)或PBMC。癌细胞可以通过免疫磁分离技术来分离，例如可从易莫尼康公司(Immunicon)(亨廷顿谷(HuntingdonValley)，宾夕法尼亚州(Pa.))获得的技术。
在某些实施例中，该方法进一步包括从生物流体样品(例如外周血样品)分离或提取PBMC。
在某些实施例中，该方法进一步包括从样品中提取蛋白质。蛋白质提取可涉及裂解细胞并收集细胞裂解物。例如，该分离的细胞用蛋白酶磷酸酶抑制剂重悬于裂解缓冲液中并进行超声处理。离心超声处理的细胞，并收集上清液用于进一步分析，例如，用于检测一种或多种生物标志物的水平。
在某些实施例中，在要测量生物标志物的RNA或DNA水平的情况下，该方法进一步包括从样品中分离核酸。多种提取方法适用于从细胞或组织中分离DNA或RNA，例如苯酚和氯仿提取，并且多种其他方法描述于例如，Ausubel等人,Current Protocols ofMolecular Biology[当代分子生物学实验指南](1997)John Wiley&Sons[约翰·威利父子出版社]，以及Sambrook和Russell,Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆:实验室手册]第3版(2001)。
还可以使用可商购的试剂盒来分离RNA，包括例如，NucliSens提取试剂盒(生物梅里埃公司(Biomerieux)，玛西埃图瓦勒(Marcy l′Etoile)，法国)、QIAampTM微型血液试剂盒、Agencourt GenfindTM、
Figure BDA0003354234070000241
微型柱(凯杰公司(Qiagen))、
Figure BDA0003354234070000242
RNA微型试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))和Eppendorf Phase Lock GelsTM。技术人员可以按照制造商的方案容易地提取或分离RNA或DNA。
在某些实施例中，可以对细胞或组织样品进行处理以进行原位杂交。例如，可以在将组织样品固定在玻璃显微镜载玻片上之前进行石蜡包埋，然后用溶剂(典型地为二甲苯)脱蜡。
测量蛋白质复合物的水平的方法
本披露的方法包括在获得自患有癌症或怀疑患有癌症的受试者的样品中测量本文所述的至少一种生物标志物的水平，所述生物标志物包含第一复合物(和/或第二复合物)。
在某些实施例中，该第一和/或第二复合物包含与仅BH3蛋白复合的BCL-XL蛋白、与仅BH3蛋白复合的BCL-2蛋白、与含BH3蛋白复合的BCL-XL蛋白、或与含BH3蛋白复合的BCL-XL蛋白。在某些实施例中，该仅BH3蛋白选自下组，该组由以下组成：BIM、BID、BAD、BIK、HRK、BMF和PUMA。在某些实施例中，该含BH3蛋白是BAX或BAK。在某些实施例中，该至少一种生物标志物包含选自下组的两种或更多种复合物，该组由以下组成：BCL-XL:BIM、BCL-XL:PUMA、BCL-2:BIM、BCL-2:PUMA、MCL-1:BIM、MCL-1:PUMA及其任何组合。
复合物的水平可以通过本领域已知的用于测量蛋白质间相互作用的任何合适的测定来测量，一般参见，Protein-Protein Interactions:A Molecular Cloning Manual[蛋白质间相互作用：分子克隆手册]，第2版，Golemis和Adams编辑，Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社](2005))。在某些实施例中，该蛋白质间相互作用测定是基于免疫测定或邻近测定。合适的方法通常例如介观尺度探索(MSD)高级酶联免疫吸附测定(MSD-ELISA)、标准复合物ELSIA、邻位连接技术(PLA)、共免疫沉淀、免疫印迹测定或交联测定等。
免疫测定通常涉及使用特异性结合复合物中BCL-2或BCL-XL或仅BH3蛋白或含BH3结构域蛋白或复合物特有的表位的抗体来检测或测量复合物的存在或水平。此类抗体可以使用本领域已知的方法获得(参见，例如，Huse等人，Science[科学](1989)246:1275-1281；Ward等人，Nature[自然](1989)341:544-546)，或可以从商业来源获得。免疫测定的实例包括但不限于，蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀、夹心测定、竞争性测定、免疫荧光染色和成像、免疫组织化学和荧光激活细胞分选术(FACS)。关于免疫学和免疫测定程序的综述，参见Basic and ClinicalImmunology[基础和临床免疫学](Stites和Terr编辑，第7版1991)。此外，可以按多种构型中的任一种进行免疫测定，这些构型在酶免疫测定(Maggio编辑，1980)以及Harlow和Lane(同上)中被广泛综述。关于一般免疫测定的综述，还参见Methods in Cell Biology:Antibodies in Cell Biology[细胞生物学方法：细胞生物学中的抗体]，第37卷(Asai编辑1993)；Basic and Clinical Immunology[基础和临床免疫学](Stites和Terr编辑,第7版1991)。
免疫共沉淀是蛋白质间相互作用和蛋白质复合物检测的流行方法。通常，从裂解物中用特定抗体分离(沉淀)目的蛋白，以共沉淀直接或间接与目的蛋白结合并形成复合物的任何配偶体蛋白质。然后例如使用具有与配偶体蛋白特异性结合的抗体的蛋白质印迹法分析沉淀的复合物。
MSD高级ELISA与酶联免疫吸附测定(ELISA)相似，只是MSD使用电化学发光(ECL)作为检测技术，而ELISA使用比色反应。通常，将含有目的蛋白/复合物的溶液(例如细胞裂解物)添加到包被有特异性结合目的蛋白的捕获抗体的底物(例如板中的孔)中。洗涤后，添加特异性结合与目的蛋白结合的配偶体蛋白的第二抗体。第二抗体(或与第二抗体结合的抗体)与ECL剂(例如钌(Ru)金属离子)结合，并且底物含有电极。在配偶体蛋白质/蛋白质复合物存在的情况下，第二抗体与蛋白质复合物结合，并且钌离子将足够靠近电极，以触发氧化还原反应，产生可被CCD相机检测到的光。与传统的ELISA相比，MSD具有许多优势，例如更高的灵敏度、更好的动态范围、更少的基质效应、更少的样品需求以及更好的功效。结果，MSD可用于检测细胞裂解物中的蛋白质复合物。
邻位连接技术(PLA)是一种免疫组织化学方法，利用所谓的PLA探针检测蛋白质间相互作用或蛋白质复合物。每个PLA探针均附有一条独特的短DNA链，并与物种特异性一抗结合或由直接DNA标记的一抗组成。当PLA探针非常接近时，DNA链可以通过随后添加两个其他成环的DNA寡核苷酸进行相互作用。通过酶促连接将两个添加的寡核苷酸连接后，使用聚合酶通过滚环扩增将其扩增。该扩增反应产生DNA环的数百倍复制，这可以通过荧光团或酶标记的互补寡核苷酸探针来突出显示。当用荧光显微镜或标准明视野显微镜观察时，在每个单分子扩增产物中产生的高浓度荧光或显色信号作为一个明显的亮点很容易看到。
尽管大多数蛋白质间的相互作用是短暂的，并且在样品制备过程中可能会解离，但交联测定是一种稳定或永久邻接蛋白质复合物相互作用组分的方法。一旦蛋白质复合物的成分被共价交联，其他步骤(例如，细胞裂解，亲和纯化，电泳或质谱)可用于分析蛋白质间相互作用，同时保持原始的相互作用复合物。可以将同功能的，具有胺反应性的交联剂添加到细胞中，以将可能相互作用的蛋白质交联在一起，然后在裂解后通过蛋白质印迹进行分析。交联剂可以是膜渗透性的，例如双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)，或使细胞内蛋白质交联，也可以是非膜渗透性的，例如双磺酸琥珀酰亚胺辛二酸酯(BS3)，或使细胞表面蛋白质交联。此外，一些交联剂可以被还原剂裂解，例如二硫代双琥珀酰亚胺基丙酸酯(DSP)或3,3′-二硫代双琥珀酰亚胺基丙酸酯(DTSSP)，以使交联反向。备选地，含有光可活化基团的异双功能交联剂，例如(琥珀酰亚胺基4,4′-叠氮戊酸酯(SDA)产物或磺基-SDA)可用于捕获可能发生的瞬时相互作用，例如在特定刺激之后。在用光可活化氨基酸(例如L-光亮氨酸或L-光蛋氨酸)进行代谢标记后，也可以进行光活化。蛋白质之间的交联位点可以使用质谱法进行高精度定位，特别是如果使用MS可裂解的交联剂(例如DSSO或DSBU)。
在某些实施例中，该第一和/或第二复合物是样品中的优势复合物。如本文所使用的，“优势(dominant)”复合物是指其在样品中的水平在样品中显著的复合物。
为了确定特定复合物的优势，可以测量BCL-2家族蛋白质复合物组的水平。在一个实施例中，可以将BCL-2家族蛋白质复合物组的总体水平计算为例如总和或加权总和。在这样的实施例中，可以将特定复合物的测量水平与总体水平进行比较以获得例如总体水平的百分比或比率。如果特定复合物相对于总体水平的百分比或比例超过某个值(例如50％)，则将其视为主要复合物之一。在另一个实施例中，可以计算复合物组的平均水平，并且可以将特定复合物的测量水平与平均水平进行比较以确定其是否高于或低于平均水平，如果高于平均水平，则它可以被认为是样品中的主要复合物之一。
测量额外的生物标志物的水平的方法
在某些实施例中，该至少一种生物标志物进一步包含MCL-1。不希望受到任何理论的束缚，据信MCL-1的水平可以指示对该治疗的潜在抗性。MCL-1的高的基线水平，或治疗后MCL-1的水平明显升高，可以表明抗性。
在某些实施例中，该至少一种生物标志物进一步包含BCL-XL或BCL-2。BCL-XL或BCL-2基因或蛋白质的扩增可以指示反应。
在某些实施例中，本文提供的方法进一步包括测量生物标志物MCL-1、BCL-XL或BCL-2的水平。
本文提供的生物标志物MCL-1、BCL-XL或BCL-2旨在涵盖不同的形式，包括mRNA、蛋白质(及其复合物)以及DNA(例如基因组DNA)。因此，可以通过RNA水平(例如，mRNA水平)、蛋白质水平或DNA水平来测量该至少一种生物标志物的水平。mRNA水平和/或蛋白质水平还可以被称为该至少一种生物标志物的表达水平。
MCL-1、BCL-XL或BCL-2的生物标志物的RNA(例如，mRNA)水平或DNA水平可以通过本领域已知的任何合适的核酸测定(例如，核酸扩增测定、核酸杂交测定、核酸测序测定)以及其他方法(例如，高效液相色谱法(HPLC)片段分析、毛细管电泳等)来测量。MCL-1、BCL-XL或BCL-2的蛋白水平可以通过任何合适的测定(例如免疫测定法)进行测量。
扩增测定
核酸扩增测定涉及复制靶核酸(例如，DNA或RNA)，从而增加经扩增的核酸序列的拷贝数。扩增可以是指数的或线性的。示例性核酸扩增方法包括但不限于使用以下方法进行的扩增：聚合酶链式反应(“PCR”，参见美国专利4,683,195和4，683,202；PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications[PCR方案：方法和应用指南](Innis等人编辑,1990))、逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时定量PCR(qRT-PCR)、定量PCR(例如，
Figure BDA0003354234070000281
)、巢式PCR、连接酶链式反应(参见Abravaya,K.等人,Nucleic Acids Research[核酸研究],23:675-682,(1995))、分支DNA信号扩增(参见，Urdea,M.S.等人,AIDS,7(增刊2):S11-S14,(1993))、可扩增的RNA报告分子、Q-β复制(参见，Lizardi等人，Biotechnology[生物技术](1988)6:1197)、基于转录的扩增(参见，Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊](1989)86:1173-1177)、回旋DNA扩增、链置换激活、循环探针技术、自动维持序列扩增(Guatelli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊](1990)87:1874-1878)、滚环复制(美国专利号5,854,033)、基于核酸序列的等温扩增(NASBA)、以及基因表达的连续分析(SAGE)。
在某些实施例中，该核酸扩增测定是基于PCR的方法。
在一些实施例中，为测量MCL-1、BCL-XL或BCL-2的mRNA水平，在扩增之前将MCL-1、BCL-XL或BCL-2的靶RNA逆转录为cDNA。可以使用多种逆转录酶，包括但不限于MMLV RT、MMLV RT的RNase H突变体例如Superscript和Superscript II(生命技术公司(LifeTechnologies)，GIBCO BRL，盖瑟斯堡(Gaithersburg)，马里兰州(Md.))、AMV RT和来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的热稳定逆转录酶。例如，可以用于将RNA转化为cDNA的一种方法是改编自Superscript II预扩增系统(生命技术公司，GIBCO BRL，盖瑟斯堡，马里兰州；目录号18089-011)的方案，如由Rashtchian,A.，PCR Methods Applic.[PCR方法应用]，4:S83-S91，(1994)中所述。
在某些实施例中，在核酸扩增测定后，对MCL-1、BCL-XL或BCL-2的水平进行定量。在某些实施例中，在核酸扩增测定期间，对MCL-1、BCL-XL或BCL-2进行定量，这也被称为实时扩增或定量扩增。
定量扩增的方法披露在以下文献中：例如美国专利号6，180，349、6,033,854、和5,972,602，以及例如Gibson等人,Genome Research[基因组研究](1996)6:995-1001；DeGraves等人，Biotechniques[生物技术](2003)34(1):106-10，112-5；Deiman B等人，MolBiotechnol.[分子生物技术](2002)20(2):163-79。定量通常基于对可检测信号的监测，该可检测信号代表扩增(例如，PCR)反应循环中模板的拷贝。可通过嵌入剂或扩增过程中使用的标记引物或标记探针来产生可检测信号。示例性嵌入剂包括SYBR GREENTM和SYBRGOLDTM。
在某些实施例中，可以使用可检测地标记的引物或可检测地标记的探针，以允许检测或定量对应于该引物或探针的生物标志物。在某些实施例中，该标记的引物或标记的探针包含含有荧光团的可检测标记。在某些实施例中，该标记的引物或标记的探针可以进一步包含淬灭剂物质。在一种引物或探针中荧光团和淬灭剂物质的存在可以有助于提供自淬灭探针例如TaqMan(美国专利号5,210,015和5,538,848)或分子信标探针(美国专利号5,118,801和5,312,728)、或其他无分支或线性信标探针(Livak等人,1995,PCR MethodAppl.[PCR方法应用],4:357-362；Tyagi等人，1996,Nature Biotechnology[自然生物技术],14:303-308；Nazarenko等人,1997,Nucl.Acids Res.[核酸研究],25:2516-2521；美国专利号5,866,336和6,117,635)。在完整的引物或探针中，淬灭剂物质和荧光团非常接近，使得当荧光团被辐射激发时，荧光团会通过荧光共振能量转移(FRET)将能量转移至同一探针中的淬灭剂物质，从而不发出信号。此类探针可用于5’-3’核酸外切酶“水解”PCR测定(也称为
Figure BDA0003354234070000291
测定)(参见，美国专利号5,210,015和5,487,972；Holland等人,PNAS USA[美国国家科学院院刊](1991)88:7276-7280；Lee等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究](1993)21:3761-3766)。
在定量扩增测定(例如，实时PCR)中，可以使用本领域已知的方法对经检测的生物标志物的水平进行定量。例如，在扩增期间，可以在每个PCR循环期间监测和计算荧光信号。可以进一步计算阈值循环或Ct值。Ct值是在荧光与预先确定的值相交处的循环。可以使用标准曲线将Ct与核酸的初始量或起始细胞数相关。构建标准曲线以关联Ct值与所测量的生物标志物的对数水平之间的差异。
作为质量控制量度，可以测量内部对照生物标志物的水平。技术人员将理解，内部对照生物标志物可以固有地存在于样品中，并且可以将其水平用于归一化MCL-1、BCL-XL、或BCL-2的测量水平，以抵消样品绝对数中的任何差异。
杂交测定
核酸杂交测定使用探针与MCL-1、BCL-XL、或BCL-2的靶核酸杂交，从而允许检测靶核酸。
在某些实施例中，用于杂交测定的探针是被可检测地标记的。在某些实施例中，用于杂交测定的基于核酸的探针是未标记的。可以将此类未标记的探针固定在固体支持物(如微阵列)上，并且可以与可检测地标记的靶核酸分子杂交。
在某些实施例中，可以通过分离核酸(例如，RNA或DNA)，使核酸分开(例如，通过凝胶电泳)，然后将分开的核酸转移到合适的膜滤器(例如，硝化纤维素滤器)上来进行杂交测定，其中将探针与靶核酸杂交并允许检测。参见，例如，Molecular Cloning:A LaboratoryManual[分子克隆：实验室手册]，J.Sambrook等人编辑，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社],1989,第7章。探针和靶核酸的杂交可以通过本领域已知的方法检测或测量。例如，可以通过将杂交的滤器暴露于照相胶片来进行杂交的放射自显影检测。由杂交滤器曝光的照相胶片的光密度扫描提供了靶核酸水平的准确测量。计算机成像系统也可以用于量化生物标志物的水平。
在某些实施例中，杂交测定可以是原位杂交测定。原位杂交测定可用于检测目的生物标志物(例如，MCL-1、BCL-XL或BCL-2)的基因座上拷贝数变化(例如增加或扩增)的存在。可用于原位杂交测定的探针可以是基因座特异性探针，这些探针与染色体上的特异性基因座杂交以检测特定目的基因座(例如，MCL-1、BCL-XL或BCL-2)的存在或缺失。其他类型的探针也可能是有用的，例如，染色体计数探针(例如，可与目的染色体中的重复序列区杂交，以指示整个染色体的存在或缺失)和染色体臂探针(例如，可与染色体区域杂交，并指示特定染色体的臂的存在或缺失)。使用用于原位杂交的独特序列探针的方法在美国专利号5,447,841中进行了描述，将其通过引用并入本文。可以使用荧光显微镜和针对每个荧光团的合适的滤器，或通过使用双重或三重带通滤器组观察多个荧光团来查看探针。参见，例如Bittner等人的美国专利号5,776,688，将其通过引用并入本文。任何合适的显微成像方法(包括自动数字成像系统)都可用于使杂交的探针可视化。可替代地，可以使用例如流式细胞术等技术来检查探针的杂交模式。
测序方法
在测量目的生物标志物的水平中有用的测序方法涉及对靶核酸的测序和对经测序的靶核酸的计数。测序方法的实例包括但不限于，RNA测序、焦磷酸测序和高通量测序。
高通量测序涉及合成法测序(sequencing-by-synthesis)、连接法测序(sequencing-by-ligation)和超深度测序(ultra-deep sequencing)(例如，描述于Marguiles等人,Nature[自然]437(7057):376-80(2005)中)。合成法测序涉及通过在聚合酶扩增中掺入标记的核苷酸或核苷酸类似物来合成靶核酸的互补链。在成功掺入标记核苷酸之后或即刻开始，测量该标记的信号并记录核苷酸的身份。在掺入之前去除经掺入的核苷酸上的可检测标记，重复检测和鉴定步骤。合成法测序方法的实例是本领域已知的，并且描述于例如美国专利号7,056,676、美国专利号8,802,368和美国专利号7,169,560中，将其内容通过引用并入本文。以使用折返PCR和锚定引物能够在固体表面(或微阵列或芯片)上进行合成法测序。靶核酸片段可以通过与锚定引物杂交而附接至固体表面，并进行桥接扩增。该技术在例如
Figure BDA0003354234070000311
测序平台上使用。
焦磷酸测序涉及将靶核酸区域与引物杂交，并在聚合酶的存在下，通过顺序地掺入对应于碱基A、C、G和T(U)的脱氧核苷酸三磷酸来延伸新链。每次碱基的掺入都伴随着焦磷酸盐的释放，焦磷酸盐被硫酸化酶转化为ATP，从而驱动了氧化荧光素的合成和可见光的释放。由于焦磷酸盐的释放与掺入的碱基数等摩尔，因此发出的光与在任一步骤中添加的核苷酸数成正比。重复该过程，直到确定整个序列。
在某些实施例中，本文所述的生物标志物的水平通过全转录组鸟枪法测序(例如，RNA测序)来测量。已经描述了RNA测序的方法(参见Wang Z,Gerstein M和Snyder M,NatureReview Genetics[遗传学自然评论](2009)10:57-63；Maher CA等人,Nature[自然](2009)458:97-101；Kukurba K和Montgomery SB,Cold Spring Harbor Protocols[冷泉港实验方案](2015)2015(11):951-969)。
免疫测定
免疫测定通常涉及使用与生物标志物特异性结合的抗体。此类抗体可以使用本领域已知的方法获得(参见，例如，Huse等人,Science[科学](1989)246:1275-1281；Ward等人,Nature[自然](1989)341:544-546)，或可以从商业来源获得。免疫测定的实例包括但不限于，蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀、夹心测定、竞争性测定、免疫荧光染色和成像、免疫组织化学和荧光激活细胞分选术(FACS)。关于免疫学和免疫测定程序的综述，参见Basic and Clinical Immunology[基础和临床免疫学](Stites和Terr编辑,第7版1991)。此外，可以按多种构型中的任一种进行免疫测定，这些构型在酶免疫测定(Maggio编辑,1980)以及Harlow和Lane(同上)中被广泛综述。关于一般免疫测定的综述，还参见Methods in Cell Biology:Antibodies inCell Biology[细胞生物学方法：细胞生物学中的抗体],第37卷(Asai编辑1993)；Basicand Clinical Immunology[基础和临床免疫学](Stites和Terr编辑,第7版1991)。
本文提供的用于测量生物标志物的水平的任何测定和方法可以被改适或优化，以用于在自动化和半自动化系统或定点照护测定系统中使用。
可以使用本领域已知的何时方法将本文所述的每种生物标志物的水平归一化。例如，可以将生物标志物的水平归一化为标准标志物的标准水平，其可以是预先确定的，同时确定的或在从受试者获得的样品后确定的。标准标志物可以在同一测定中运行，或可以是来自先前测定的已知的标准标志物。又例如，可以将生物标志物的水平归一化为内部对照，该内部对照可以是内部标志物，或者是多个内部标志物的平均水平或总水平。
与相应的参考水平进行比较
可以将至少一种生物标志物测得的测试水平(例如任选地归一化)与相应生物标志物的相应参考水平进行比较以确定差异。
如本文所使用的，至少一种生物标志物(例如，本文提供的复合物)的术语“参考水平”是指代表平均癌症或肿瘤样品的生物标志物的水平。参考水平可以是通常在一种或多种样品中观察到的或有望在与平均癌症或肿瘤样品相当的样本中观察到的相应生物标志物水平的典型水平、测量水平、或范围。在某些实施例中，该参考水平是可比较的肿瘤样品(例如，相同肿瘤类型)中生物标志物水平的平均值。在某些实施例中，该参考水平是相同类型癌症的代表性样品中至少一种生物标志物的平均水平。在某些实施例中，该参考水平是平均肿瘤样品中至少一种生物标志物的代表性水平。例如，可以认为生物标志物的经验水平是可比较的癌症样品或一般癌症的代表性水平。在某些实施例中，该至少一种生物标志物的参考水平是使用与在测量测试样品中的生物标志物的水平中使用的相同或相当的测量方法或测定而获得的。
在某些实施例中，该参考水平可以是预先确定的。例如，可以基于对来自相同类型的肿瘤或血液癌症的一般癌症或肿瘤样品或组织的集合中生物标志物水平的测量来计算或概括参考水平。又例如，参考水平可以基于对来自一般癌症或肿瘤群体的平均癌症或肿瘤的样品中通常观察到的生物标志物水平的统计。在某些实施例中，该参考水平是通过考虑多个实际肿瘤样品和这些样品中生物标志物的实际测量水平的算法来计算或生成的。
在某些实施例中，本文所述的方法中的比较步骤是用算法进行的。在某些实施例中，该算法是分类算法。
分类算法的实例包括，例如偏最小二乘法(Wold S等人，PLS for MultivariateLinear Modeling[用于多元线性建模的PLS],In H van de Waterbeemd(编辑),Chemometric Methods in Molecular Design[分子设计中的化学计量学方法],第195-218页.VCH,Weinheim)、弹性网络(Zou H等人,Journal of the Royal Statistical Society[皇家统计学会杂志],B辑(2005)67(2):301-320)、支持向量回归机(Vapnik V)、随机森林(Breiman,L.(2001).Random Forests[随机森林],Machine Learning[机器学习]45(1),5-32.还参见Breiman,L(2002),"Manual On Setting Up,Using,And Understanding RandomForests[设置、使用和了解随机森林手册]V3.1.)、神经网络(Bishop C,Neural Networksfor Pattern Recognition[用于模式识别的神经网络](1995)Oxford University Press[牛津大学出版社]，牛津)和梯度推进机(Friedman J,Greedy Function Approximation:AGradient Boosting Machine[Greedy函数逼近：梯度推进机]，Annals of Statistics[统计学年报](2001)29(5),1189-1232)。分类算法允许计算机系统识别数据集的模式，并基于这种识别模式将数据集分组为数据集所属的具体类别。
在某些实施例中，用含有从多个样品获得的数据集的训练数据组训练分类算法，每个数据集已经被分类为对基于临床观察的BCL-2/BCL-Xl双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂的响应性或非响应性。每个数据集含有至少一种生物标志物的测量水平，该至少一种生物标志物包括从受试者获得的样品的至少一种生物标志物。通过将训练特定的数据集指定为已知类别，可以确定分类的判别式。对于尚未分类的新数据集，将其分配给判别式，从而可以预测新数据集分组的结果。
在某些实施例中，该分类算法可以将每个数据集的预测结果转换成分数。例如，分类算法可以将测试样品的数据集的预测结果转换为测试分数，而参考样品的数据集转换为参考分数。可以确定测试得分(代表测试水平)和参考得分(代表参考水平)之间的差异，并且其中测试得分和参考得分是由算法计算的。可以确定阈值以允许区分响应性受试者和非响应性受试者。如果差异达到阈值，则可以将该受试者分类为响应受试者。
在某些实施例中，本文提供的方法中的比较步骤涉及确定测试水平和参考水平之间的差异。与参考水平的差异可以是升高或降低。取决于特定的生物标志物，为了根据本文提供的方法预测对BCL-2/BCL-Xl双重抑制剂或BCL-Xl抑制剂产生应答性，可以在一种生物标志物中寻求增加，但在另一种生物标志物中寻求降低。如本文所使用的，术语“升高”是指如在测试样品中测量的生物标志物的水平高于该生物标志物的相应的参考水平。类似地，如本文所使用的“降低”是指如在样品中测量的生物标志物的水平低于该生物标志物的相应的参考水平。如本文所使用的，术语“维持”是指没有显著变化。
在某些实施例中，包含BCL-2或BCL-XL的第一和/或第二复合物的水平升高与本文提供的BCL-2/BCL-XL双重抑制剂的响应性有关。在某些实施例中，当测量两种或更多种复合物的水平时，将每种复合物的各自测量水平组合以获得至少一种生物标志物的水平。例如，将第一复合物的第一水平与第二复合物的第二水平组合以提供至少一种生物标志物的测量水平。
在某些实施例中，该至少一种生物标志物包含BCL-XL:BIM和BCL-XL:PUMA的组合；或BCL-2:BIM和BCL-2:PUMA的组合。在某些实施例中，该至少一种生物标志物包含BCL-2:BIM、BCL-2:PUMA、BCL-XL:BIM、和BCL-XL:PUMA的组合。
在某些实施例中，可以进一步考虑一种或多种另外的生物标志物(例如MCL-1、BCL-XL、BCL-2)的水平，例如以改善预后敏感性。
在某些实施例中，包含BCL-2或BCL-XL的复合物的水平升高，伴随着MCL-1水平的正常至降低，与对本文提供的BCL-2/BCL-XL双重抑制剂的响应性有关。在某些实施例中，BCL-XL蛋白和BCL-2蛋白的组合水平(即总和)的升高也可能与对本文提供的BCL-2/BCL-XL双重抑制剂的响应性有关。
在某些实施例中，包含BCL-2的复合物水平的升高，伴随着MCL-1水平的正常至降低，与对本文提供的BCL-2抑制剂的响应性有关。
在某些实施例中，包含BCL-XL的复合物水平的升高，伴随着MCL-1水平的正常至降低，与对本文提供的BCL-XL抑制剂的响应性有关。
在某些实施例中，将与参考水平的差异与阈值做进一步比较。在某些实施例中，可以通过统计方法设置阈值，使得如果与参考水平的差异达到阈值，则可以认为这种差异在统计学上是显著的。有用的统计分析方法描述于L.D.Fisher和G.vanBelle,Biostatistics:A Methodology for the Health Sciences[生物统计学：健康科学方法论](Wiley-Interscience[威利国际科学出版社],纽约州,1993)中。可以基于置信度(“p”)值确定统计学显著性，p值可以使用未配对的2尾t检验来计算。通常可以使用例如小于或等于0.1、0.05、0.025或0.01的p值来指示统计学显著性。置信区间和p值可以通过本领域熟知的方法来确定。参见，例如，Dowdy和Wearden,Statistics for Research[研究统计],JohnWiley&Sons[约翰·威利父子出版社],纽约,1983。
在某些实施例中，当BCL-2:BIM、BCL-2:PUMA、BCL-XL:BIM、和BCL-XL:PUMA的组合的测试水平比参考水平高至少2倍时，达到该阈值。
在某些实施例中，可以进一步确定另外的生物标志物如MCL-1、BCL-XL或BCL-2的水平的阈值。在某些实施例中，当MCL-1的测试水平不超过MCL-1的参考水平的100％时，达到阈值。
在某些实施例中，BCL-XL水平的阈值高于BCL-XL的参考水平至少50％、至少80％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少150％、至少200％或至少250％。例如，BCL-2水平的阈值高于BCL-2的参考水平至少50％、至少80％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少150％、至少200％、或至少250％。
预测反应性、指导治疗的方法
为了鉴定和/或选择患有或怀疑患有癌症的受试者用于用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂治疗，可以在治疗前测量包含含有BCL-2或BCL-XL的复合物的至少一种生物标志物的水平并将其与参考水平进行比较。如果该差异达到阈值，然后确定该受试者可能对用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-2抑制剂或BCL-XL抑制剂的治疗产生应答。在某些实施例中，向鉴定或选择的响应性受试者施用治疗有效量的本文提供的BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-2抑制剂或BCL-XL抑制剂。
在某些实施例中，如果该差异未达到阈值，那么该受试者被鉴定为不太可能对用BCL-2/BCL-xL双重抑制剂的治疗产生应答。可以建议这些经鉴定的受试者进行另外的测试以确认结论，或可替代地可以建议不用本文提供的BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-2抑制剂或BCL-XL抑制剂进行治疗。
在另一方面，本文提供的方法用于在受试者中监测治疗功效的方法，该受试者患有癌症，并在治疗期内已经用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂进行了治疗。在某些实施例中，可以在治疗期之前测量至少一种生物标志物的水平以建立生物标志物的基线水平。在一定的治疗期后，可以在治疗后从受试者新获得的测试样品中测量至少一种生物标志物的水平(“治疗后水平”)，以及确定与参考水平的差异(“治疗后差异”)。可以确定至少一种生物标志物的水平的治疗后变化。如果该治疗后变化达到阈值，那么该受试者被鉴定为仍对用BCL-2/BCL-xL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂的治疗产生应答。可替代地，如果该治疗后变化未达到阈值，那么该受试者被鉴定为对本文提供的BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂具有降低的应答性或不再产生应答。
在某些实施例中，用于治疗受试者的癌症的方法包括用BCL-2/BCL-xL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂处理从受试者获得的样品中的细胞，并确定样品中至少一种生物标志物的治疗后变化。这种治疗后变化对于鉴定和/或选择受试者进行治疗可能是有用的。在某些实施例中，一种用于鉴定和/或选择患有癌症的受试者进行用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL或BCL-2抑制剂的治疗的方法，该方法包括：(a)在包含获得自受试者的细胞的测试样品中，测量包含第一复合物的至少一种生物标志物的基线水平，该第一复合物包含BCL-XL或BCL-2蛋白；(b)用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂处理测试样品，(c)测量经处理的测试样品中至少一种生物标志物的治疗后水平；(d)将该治疗后水平与该至少一种生物标志物的基线水平进行比较，以确定该至少一种生物标志物的水平的治疗后变化；以及(e)当该治疗后变化达到阈值时，确定该受试者可能对用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂的治疗产生应答。
在某些实施例中，该用于在有需要的受试者中治疗癌症的方法包括：(a)在包含获得自受试者的细胞的测试样品中，测量包含第一复合物的至少一种生物标志物的基线水平，该第一复合物包含BCL-XL或BCL-2蛋白；(b)用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂处理测试样品，(c)测量经处理的测试样品中至少一种生物标志物的治疗后水平；(d)将该治疗后水平与该至少一种生物标志物的基线水平进行比较，以确定该至少一种生物标志物的水平的治疗后变化；以及(e)当该治疗后变化达到阈值时，向该受试者施用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂。
在某些实施例中，当治疗后变化是降低至少2倍时，达到阈值。
BCL-2/BCL-CL双重抑制剂或BCL-XL或BCL-2抑制剂
在某些实施例中，本文所述的BCL-2/BCL-xL双重抑制剂或BCL-XL或BCL-2抑制剂是具有结构式(I)、(II)或(III)的化合物：
Figure BDA0003354234070000381
其中A1环是
Figure BDA0003354234070000382
X11是取代的或未取代的，选自下组，该组由以下组成：亚烷基、亚烯基、环亚烷基、环亚烯基和杂环亚烷基；
Y11选自下组，该组由以下组成：(CH2)n-N(R11a)和
；
Figure BDA0003354234070000383
Q11选自下组，该组由以下组成：O、O(CH2)1-3、NR11c、NR11c(C1-3亚烷基)、OC(＝O)(C1-3亚烷基)、C(＝O)O、C(＝O)O(C1-3亚烷基)、NHC(＝O)(C1-3亚烷基)、C(＝O)NH和C(＝O)NH(C1-3亚烷基)；
Z11是O或NR11c
R11和R12独立地选自下组，该组由以下组成：H、CN、NO2、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环烷基、OR1′、SR1′、NR1′R1″、COR1′、CO2R1′、OCOR1′、CONR1′R1″、CONR1′SO2R1″、NR1″COR1″、NR1′CONR1″R1″′、NR1′C＝SNR1″R1″′、NR1′SO2R1″、SO2R1′、和SO2NR1′R1″；
R13选自下组，该组由以下组成：H、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环烷基、OR1′、NR1′R1″、OCOR1′、CO2R1′、COR1′、CONR1′R1″、CONR1′SO2R1″′、C1-3亚烷基CH(OH)CH2OH、SO2R1′、和SO2NR1′R1″；
R1′、R1″、和R1″′独立地是H、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、C1-3亚烷基杂环烷基、或杂环烷基；
R1′和R1″、或R1″和R1″′可以与它们所键合的原子一起形成3至7元环；
R14是氢、卤代、C1-3烷基、CF3或CN；
R15是氢、卤代、C1-3烷基、取代的C1-3烷基、羟基烷基、烷氧基或取代的烷氧基；
R16选自下组，该组由以下组成：H、CN、NO2、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环烷基、OR1′、SR1′、NR1′R1″、CO2R1′、OCOR1′、CONR1′R1″、CONR1″SO2R1″、NR1′COR1″、NR1′CONR1″R1″′、NR1′C＝SNR1″R1″′、NR1′SO2R1″、SO2R1′、和SO2NR1′R1″；
R17是取代的或未取代的，选自下组，该组由以下组成：氢、烷基、烯基、(CH2)0-3环烷基、(CH2)0-3环烯基、(CH2)0-3杂环烷基、(CH2)0-3芳基和(CH2)0-3杂芳基；
R18选自下组，该组由以下组成：氢、卤代、NO2、CN、CF3SO2和CF3；
R11a选自下组，该组由以下组成：氢、烷基、杂烷基、烯基、羟基烷基、烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、环烯基和杂环烷基；
R11b是氢或烷基；
R11c选自下组，该组由以下组成：氢、烷基、取代的烷基、羟基烷基、烷氧基和取代的烷氧基；并且
n1、r1、和s1独立地是1、2、3、4、5、或6；
或式(I)、(II)或(III)的药学上可接受的盐。
在某些实施例中，Y11是
Figure BDA0003354234070000401
n是1-3的整数，R11b是氢或C1-3烷基，Q是O、O(CH2)1-3、C(＝O)O(CH2)1-3、OC(＝O)(CH2)1-3或C(＝O)O(C3H7)1-3。
在某些实施例中，本文所述的具有结构式(I)、(II)或(III)的BCL-2/BCL-xL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂选自下组，该组由以下组成：
Figure BDA0003354234070000402
Figure BDA0003354234070000411
Figure BDA0003354234070000421
在某些实施例中，该BCL-2/BCL-xL双重抑制剂是(R)-2-(1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯基氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌啶-4-羰基氧基)乙基膦酸或其药学上可接受的盐(在本文中还被称为“化合物A”)。
化合物A是以非常高亲和力、以分别为1.6nM、4.4nM和9.3nM的IC50值与BCL-2、BCL-xL和BCL-w蛋白质结合的小分子化合物。化合物A对Mcl-1蛋白质具有弱亲和力。化合物A在癌细胞系的一个亚组中显示出具有纳摩尔效价的有效的体外细胞生长抑制活性。从机理上讲，化合物A有效诱导胱天蛋白酶-3和PARP(癌细胞和异种移植肿瘤组织中人类癌症的细胞凋亡的生化标志物)的切割。
在某些实施例中，本文所述的BCL-2/BCL-xL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂是具有结构式(IV)的化合物：
Figure BDA0003354234070000431
其中，
R21是SO2R2′；
R22是烷基，优选C1-C4烷基，更优选甲基、丙基或异丙基；
R23是烷基，优选C1-C4烷基，更优选甲基、丙基或异丙基；
R24是卤素，优选氟、氯；
R25是卤素，优选氟、氯；
R26选自H、卤素、烷基，优选氟、氯、C1-C4烷基，更优选甲基、丙基、异丙基；
R21b是H或烷基，优选C1-C4烷基，更优选甲基、丙基或异丙基；
n2、r2和s2独立地是1、2、3、4、5或6，更优选地r2和s2都是2，并且n2是3、4或5，更优选地，n2、r2和s2都是2；并且
R2’是烷基，优选C1-C4烷基，更优选甲基、丙基或异丙基。
在某些实施例中，本文所述的具有结构式(IV)的BCL-2/BCL-xL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂选自下组，该组由以下组成：
Figure BDA0003354234070000432
Figure BDA0003354234070000441
Figure BDA0003354234070000451
在某些实施例中，该BCL-2/BCL-xL双重抑制剂是(R)-1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯基氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌啶-4-甲酸或其药学上可接受的盐(在本文中还被称为“化合物B”)。
在某些实施例中，本文所述的BCL-2/BCL-xL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂具有结构式(V)：
Figure BDA0003354234070000452
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中：
A3选自下组，该组由以下组成：
Figure BDA0003354234070000461
E3是碳原子，并且
Figure BDA0003354234070000462
是双键；或
E3是-C(H)-，并且
Figure BDA0003354234070000463
是单键；或
E3是氮原子，并且
Figure BDA0003354234070000464
是单键；
X31、X32和X33各自独立地选自下组，该组由以下组成：-CR38＝和-N＝；
R31a和R31b与它们所附接的碳原子一起形成任选取代的3元、4元或5元环烷基；或
R31a和R31b与它们所附接的碳原子一起形成任选取代的4元或5元杂环；
R32选自下组，该组由以下组成：-NO2、-SO2CH3和-SO2CF3；
R32a选自下组，该组由以下组成：氢和卤素；
R33选自下组，该组由以下组成：氢、-CN、-C≡CH和-N(R34a)(R34b)；
R34a选自下组，该组由以下组成：任选取代的C1-6烷基、任选取代的C3-6环烷基、杂环、杂烷基、(环烷基)烷基和(杂环)烷基；
R34b选自下组，该组由以下组成：氢和C1-4烷基；
R35选自下组，该组由以下组成：任选取代的C1-6烷基、杂环、杂烷基、(环烷基)烷基和(杂环)烷基；
R36a、R36c、R36e、R36f和R36g各自独立地选自下组，该组由以下组成：氢、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C3-6环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、杂环、杂烷基、(环烷基)烷基和(杂环)烷基；
R36b和R36d各自独立地选自下组，该组由以下组成：氢、C1-4烷基和卤素；
R37选自下组，该组由以下组成：任选取代的C1-6烷基、杂环、杂烷基、(环烷基)烷基和(杂环)烷基；并且
R38选自下组，该组由以下组成：氢和卤素。
在某些实施例中，本文所述的具有结构式(V)的BCL-2/BCL-xL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂选自下组，该组由以下组成：
Figure BDA0003354234070000471
在某些实施例中，该BCL-xL抑制剂是(S)-N-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺或其药学上可接受的盐(在本文中还被称为“化合物C”)。
试剂盒
在另一方面，本披露进一步提供了在如本文所述的方法中使用的一种试剂盒，用于测量本文提供的该至少一种生物标志物的水平。在某些实施例中，该试剂盒包含本文提供的试剂，例如引物、探针和/或抗体或微阵列中的一种或多种。引物、探针和/或抗体可以被或不可以被可检测地标记。在某些实施例中，该试剂盒可以进一步包含进行本文所述的方法的其他试剂。在此类应用中，试剂盒可以包含以下的任一者或全部：合适的缓冲液、用于分离核酸的试剂、用于扩增核酸的试剂(例如，聚合酶、dNTP混合物)、用于杂交核酸的试剂、用于对核酸进行测序的试剂、用于定量核酸的试剂(例如，嵌入剂、检测探针)、用于分离蛋白质的试剂、以及用于检测蛋白质的试剂(例如，第二抗体)。典型地，在载体或分隔容器中含有可用于本文提供的任何方法中的试剂。载体可以是呈例如袋、盒、管、架子形式的容器或支持物，并且任选地是分隔的。
在一个实施例中，该试剂盒包含用于测量复合物水平的一种或多种试剂。在某些实施例中，该试剂包含可以特异性结合复合物中的BCL-XL或BCL-2蛋白的第一抗体，和可以特异性结合该复合物中的仅BH3蛋白或含BH3结构域蛋白的第二抗体。在某些实施例中，该第一抗体和/或第二抗体被可检测地标记。在某些实施例中，该第一抗体与第一可检测标记缀合，第二抗体与第二可检测标记缀合，其中当紧密靠近时，第一可检测标记和第二可检测标记可允许产生可检测信号。在某些实施例中，该第一可检测标记和第二可检测标记两者均包含寡核苷酸。
在某些实施例中，该第一抗体与第一可检测标记缀合，第二抗体与第二可检测标记缀合，其中当紧密靠近时，第一可检测标记和第二可检测标记可允许产生可检测信号。在某些实施例中，该第一可检测标记和第二可检测标记包含一对寡核苷酸。当第一抗体和第二抗体非常接近时，一对寡核苷酸能够相互作用以使得能够进行酶促连接以提供连接的产物，该产物可以被扩增以允许检测。
在某些实施例中，第一抗体和/或第二抗体中的一个被可检测地标记，并且另一个能够被捕获。
在某些实施例中，本文披露的试剂盒进一步包含用于测量MCL-1水平的第二试剂和/或用于测量BCL-XL或BCL-2水平的第三试剂。在某些实施例中，该第二试剂包含能够与MCL-1的多核苷酸杂交的寡核苷酸、或能够与MCL-1的蛋白特异性结合的抗体。在某些实施例中，该第三试剂包含能够与BCL-XL或BCL-2的多核苷酸杂交的寡核苷酸、或能够与BCL-XL或BCL-2的蛋白特异性结合的抗体。
在某些实施例中，该试剂盒可以进一步包含标准阴性对照和/或标准阳性对照。
另外，试剂盒可包括指导材料，这些指导材料包含用于实施本文提供的方法的指导(即方案)。虽然指导材料典型地包含书面材料或印刷材料，但它们不限于此。
在某些实施例中，该试剂盒可进一步包含存储在计算机可读介质上的计算机程序产品。当计算机程序产品由计算机执行时，它进行以下步骤：将该至少一种生物标志物的水平与该至少一种生物标志物的对应的参考水平进行比较，以确定与参考水平的差异。任何能够存储此类计算机可执行指令并将其传送给最终使用者的介质都被本说明所考虑。这样的介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、磁带盒(cartridge)、芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。此类介质可以包括提供此类指导材料的因特网网站的网址。
也可以使用载波信号对计算机程序进行编码和传输，这些载波信号被改适用于经由符合包括因特网的各种协议的有线网络、光学网络和/或无线网络进行传输。因此，可以使用此类程序编码的数据信号来创建根据本发明的实施例的计算机可读介质。可以将程序代码编码的计算机可读介质与兼容设备打包在一起，或者与其他设备分开提供(例如，通过因特网下载)。任何这样的计算机可读介质可以驻留在单个计算机产品(例如，硬盘驱动器、CD或整个计算机系统)上或内部，并且可以存在于系统或网络内的不同计算机产品上或内部。
在一些实施例中，本披露提供了附接到固体支持物(例如阵列载玻片或芯片)上的寡核苷酸探针，例如，如描述于Bowtell和Sambrook编辑的DNA Microarrays:A MolecularCloning Manual[DNA微阵列：分子克隆手册](2003)Cold Spring Harbor LaboratoryPress[冷泉港实验室出版社]中。此类装置的构建在本领域中是熟知的，例如如在以下美国专利和专利公开中所述：美国专利号5,837,832；PCT申请W0 95/11995；美国专利号5,807,522；美国专利号7,157,229、7,083,975、6,444,175、6,375,903、6,315,958、6,295,153和5,143,854、2007/0037274、2007/0140906、2004/0126757、2004/0110212、2004/0110211、2003/0143550、2003/0003032和2002/0041420。还在以下参考文献中综述了核酸阵列：Biotechnol Annu Rev[生物技术年鉴](2002)8:85-101；Sosnowski等人Psychiatr Genet[精神病遗传学](2002)12(4):181-92；Heller,Annu Rev Biomed Eng[生物医学工程年鉴](2002)4:129-53；Kolchinsky等人,Hum.Mutat[人类突变](2002)19(4):343-60；和McGail等人,Adv Biochem Eng Biotechnol[生物化学工程/生物技术进展](2002)77:21-42。
提供以下实例以更好地说明所要求保护的发明，并且不应将其解释为限制本发明的范围。下文描述的所有特定的组合物、材料和方法(全部或部分)均落入本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不旨在限制本发明，而仅仅是为了说明落入本发明的范围内的特定实施例。本领域技术人员可以开发等同的组合物、材料和方法，而无需使用创新能力，并且不脱离本发明的范围。应理解的是，可以在本文描述的程序中做出许多变化，同时仍然保持在本发明的范围内。发明人的意图是，此类变化包括在本发明的范围内。
实例1
此实例显示BCL-XL:BIM和BCL-XL:PUMA复合体在源自于患者的异种移植(PDX)模型中占主导地位，而BCL-XL:BIM和BCL-XL:PUMA复合体的减少表明靶活性，因此是BCL-2和BCL-XL双重抑制剂的药效学标志物和药物功效的指标。
BCL-2已被认为是癌症药物开发的前十大靶标之一。BCL-2和其他抗凋亡蛋白(包括BCL-XL)的抑制作用有助于恢复细胞凋亡途径并触发癌细胞死亡。针对靶向实体瘤中多种多样的BCL-2家族蛋白依赖性，本发明人开发了一种有效的BCL-2和BCL-XL双重抑制剂，称为化合物A，目前正处于针对实体瘤的1期试验中。为了促进临床发展，本发明人已经在来源于实体瘤患者的PDX模型中进行了试验，并进行了药效学(PD)和生物标志物研究。
选择PDX模型(包括8种胃癌和3种食道癌)用于BCL-2/BCL-XL双重抑制剂化合物A的试验。每周两次持续三周用100mg/kg的剂量方案治疗模型，然后收获肿瘤组织，用MSD方法进行复合物分析(在图中显示)。化合物A处理的药效学(PD)和生物标志物研究通过MSD和蛋白质印迹(WB)测定进行。具体地，用样品进行蛋白质提取，通过MSD方法测量蛋白质复合物的水平，并且通过蛋白质印迹法测量蛋白质的水平。计算每只动物的TGI。
图1A-1C说明了在胃癌和食道癌PDS模型中进行的化合物A的治疗功效的体内评估的概述。图1A和1B显示了PDX模型的摘要以及研究过程和结果。图1C显示了在使用化合物A治疗之前，PDX模型(实体瘤)和Toledo细胞系(血液学癌症)中不同复合物的基线水平。
图2A和2B显示了用化合物A处理后，PDX模型中BCL-XL:BIM复合物的水平下降，表明化合物A破坏了PDX模型中的BCL-XL:BIM复合物。
图3显示基线BCL-2/BCL-xL复合物水平与化合物A触发的肿瘤生长抑制相关，可用于指导患者选择。
图3A是包括BCL-XL:BIM和BCL-XL:PUMA的BCL-XL复合物。将基线复合物水平归一化为同一组的平均水平，并用肿瘤生长抑制(TGI)作图。图3B显示了包括BCL-2:BIM和BCL-2:PUMA在内的BCL-2复合物的基线水平与TGI的相关性。BCL-2复合物和BCL-XL复合物(包括BCL-XL:BIM和BCL-XL:PUMA、BCL-2:BIM和BCL-2:PUMA)的基线水平的相关性如图3C所示。虽然单独的BCL-XL或BCL-2基线复合物显示出与化合物A触发肿瘤生长抑制相关的趋势，但预测两种复合物的总和最佳，r＝0.775，P＝0.0051(图3C)。除BCL-XL/BCL-2复合物外，MCL-1水平也会影响肿瘤对化合物A的反应，如图3D和图4中的表所示。较高的MCL-1水平(在化合物A处理之前或之后)导致更多的抗性表型。
图4A(图像)和4B(定量)显示了在用化合物A处理之前和之后，PDX模型的细胞裂解液的蛋白质印迹结果。进一步的统计分析表明，化合物A会显著或呈趋势地增加BCL-2和MCL-1的抗死亡蛋白水平(图4C)，而不是增加促死亡蛋白BIM或PUMA(图4D)。图4E是显示处理后相对蛋白质表达水平变化的图。
图5显示BCL-2/BCL-xL复合物水平的变化与化合物A触发的肿瘤生长抑制相关，其可用于预测患者反应和预后。对PDX肿瘤样品进行不同复合物的MSD测定。分析了包括BCL-XL:BIM和BCL-XL:PUMA的BCL-XL复合物的基线水平和治疗后水平。将BCL-XL复合物的变化(即Δ，基线与治疗组之间的差异)归一化为同一组的平均Δ，并以肿瘤生长抑制(TGI)作图。图5中显示的是BCL-XL复合物的变化越大，TGI越好。但是，较高的MCL-1水平(蓝点，在图3D和图4的表中也有显示)也会影响对化合物A的总体敏感性。
实例2
诸位发明人进一步检查了用于细胞系测定的化合物A的活性代谢产物化合物B对BCL-2和BCL-XL的结合亲和力是否相似，以及化合物A(或化合物B)是否与ABT-737或者ABT-263(BCL-2/BCL-XL抑制剂的参考化合物)不同。
选择Toledo(弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系)和RS4；11(急性淋巴细胞性白血病细胞系)进行该研究。用图6A和7A(Toledo)和6B和7B(RS4；11；对每种细胞系使用相同浓度的化合物B和ABT-737以及ABT-263)中指定的化合物处理细胞24小时，并收获细胞以进行复合物分析。按照先前建立的MSD高级ELISA方法分析BCL-2:BIM和BCL-XL:BIM复合物两者。
如图6A和6B所示，在Toledo和RS4；11细胞系中，相比于BCL-2:BIM复合物，化合物B更有效地破坏BCL-XL:BIM。相比之下，ABT-737也是BCL-2/BCL-XL双重抑制剂(但在结构上与化合物B不同)，但在Toledo细胞中对BCL-XL:BIM复合物的破坏却比化合物B少得多(参见图6A)，并且在RS4细胞中几乎没有破坏BCL-xL:BIM复合物(见图6B)。
类似的，如图7A和7B所示，在Toledo和RS4；11细胞系中，相比于BCL-2:BIM复合物，化合物B更有效地破坏BCL-XL:BIM复合物。相比之下，ABT-263也是BCL-2/BCL-XL双重抑制剂(但在结构上与化合物B不同)，但在Toledo细胞和RS4；11细胞中对BCL-XL：BIM复合物的破坏却比化合物B少得多(参见图7A和图7B)。与之相反，ABT-263显示能够减少BCL-2：BIM复合物。
根据图1C的结果，其中实体瘤细胞的BCL-XL:BIM复合物水平要比血液癌症细胞(例如Toledo细胞)高得多，因此破坏BCL-XL:BIM复合物对于治疗实体肿瘤很重要。这些血细胞系结果与实例1中所示的胃/食道癌PDX试验的复合物分析一致，证实化合物A(PDX中)或化合物B(细胞系中)相较于BCL-2复合物更好地靶向BCL-XL，因此其不同于参考化合物ABT-737或者ABT-263。该结果还表明，BCL-XL:BIM复合物的水平可以作为预测对BCL-2/BCL-XL双重抑制剂(例如化合物A和化合物B)的反应性的生物标志物。
尽管已经参考特定的实施例(其中的一些是优选的实施例)具体示出并描述了本披露，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离如本文披露的本披露的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。
序列表
<110> 苏州亚盛药业有限公司
亚盛医药集团（香港）有限公司
<120> 用于预测BCL-2/BCL-XL抑制剂对癌症的功效的方法和组合物
<130> 1252-005
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 239
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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1 5 10 15
Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala
20 25 30
Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala
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225 230 235
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<212> DNA
<213> 智人
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gcccgtgccc agcgccccgg gggctctggc gggcggtccc acccaggcgg ccccgggagt 480
ccgcggggag gaggaacagt gggcccggga gatcggggcc cagctgcggc ggatggcgga 540
cgacctcaac gcacagtacg agcggcggag acaagaggag cagcagcggc accgcccctc 600
accctggagg gtcctgtaca atctcatcat gggactcctg cccttaccca ggggccacag 660
agcccccgag atggagccca attaggtgcc tgcacccgcc cggtggacgt cagggactcg 720
gggggcaggc ccctcccacc tcctgacacc ctggccagcg cgggggactt tctctgcacc 780
atgtag 786
<210> 11
<211> 197
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Met Phe Gly Leu Lys Arg Asn Ala Val Ile Gly Leu Asn Leu Tyr Cys
1 5 10 15
Gly Gly Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ser Gly Gly Ala Thr Arg Pro Gly
20 25 30
Gly Arg Leu Leu Ala Thr Gly Ala Lys Asp Thr Lys Pro Met Gly Arg
35 40 45
Ser Gly Ala Thr Ser Arg Lys Ala Leu Glu Thr Leu Arg Arg Val Gly
50 55 60
Asp Gly Val Gln Arg Asn His Glu Thr Ala Phe Gln Gly Met Leu Arg
65 70 75 80
Lys Leu Asp Ile Lys Asn Glu Asp Asp Val Lys Ser Leu Ser Arg Val
85 90 95
Met Ile His Val Phe Ser Asp Gly Val Thr Asn Trp Gly Arg Ile Val
100 105 110
Thr Leu Ile Ser Phe Gly Ala Phe Val Ala Lys His Leu Lys Thr Ile
115 120 125
Asn Gln Glu Ser Cys Ile Glu Pro Leu Ala Glu Ser Ile Thr Asp Val
130 135 140
Leu Val Arg Thr Lys Arg Asp Trp Leu Val Lys Gln Arg Gly Trp Asp
145 150 155 160
Gly Phe Val Glu Phe Phe His Val Glu Asp Leu Glu Gly Gly Ile Arg
165 170 175
Asn Val Leu Leu Ala Phe Ala Gly Val Ala Gly Val Gly Ala Gly Leu
180 185 190
Ala Tyr Leu Ile Arg
195
<210> 12
<211> 594
<212> DNA
<213> 智人
<400> 12
atgtttggcc tcaaaagaaa cgcggtaatc ggactcaacc tctactgtgg gggggccggc 60
ttgggggccg gcagcggcgg cgccacccgc ccgggagggc gacttttggc caccggcgcc 120
aaggacacaa agccaatggg caggtctggg gccaccagca ggaaggcgct ggagacctta 180
cgacgggttg gggatggcgt gcagcgcaac cacgagacgg ccttccaagg catgcttcgg 240
aaactggaca tcaaaaacga agacgatgtg aaatcgttgt ctcgagtgat gatccatgtt 300
ttcagcgacg gcgtaacaaa ctggggcagg attgtgactc tcatttcttt tggtgccttt 360
gtggctaaac acttgaagac cataaaccaa gaaagctgca tcgaaccatt agcagaaagt 420
atcacagacg ttctcgtaag gacaaaacgg gactggctag ttaaacaaag aggctgggat 480
gggtttgtgg agttcttcca tgtagaggac ctagaaggtg gcatcaggaa tgtgctgctg 540
gcttttgcag gtgttgctgg agtaggagct ggtttggcat atctaataag atag 594
<210> 13
<211> 205
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met
1 5 10 15
Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala
20 25 30
Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile
35 40 45
Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp
50 55 60
Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala
65 70 75 80
Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr
85 90 95
Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe
100 105 110
Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly
115 120 125
Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp
130 135 140
Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu
145 150 155 160
Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp
165 170 175
Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn
180 185 190
Gly Gly Trp Val Gly Ala Leu Gly Asp Val Ser Leu Gly
195 200 205
<210> 14
<211> 618
<212> DNA
<213> 智人
<400> 14
atggcgcacg ctgggagaac agggtacgat aaccgggaga tagtgatgaa gtacatccat 60
tataagctgt cgcagagggg ctacgagtgg gatgcgggag atgtgggcgc cgcgcccccg 120
ggggccgccc ccgcaccggg catcttctcc tcccagcccg ggcacacgcc ccatccagcc 180
gcatcccggg acccggtcgc caggacctcg ccgctgcaga ccccggctgc ccccggcgcc 240
gccgcggggc ctgcgctcag cccggtgcca cctgtggtcc acctgaccct ccgccaggcc 300
ggcgacgact tctcccgccg ctaccgccgc gacttcgccg agatgtccag ccagctgcac 360
ctgacgccct tcaccgcgcg gggacgcttt gccacggtgg tggaggagct cttcagggac 420
ggggtgaact gggggaggat tgtggccttc tttgagttcg gtggggtcat gtgtgtggag 480
agcgtcaacc gggagatgtc gcccctggtg gacaacatcg ccctgtggat gactgagtac 540
ctgaaccggc acctgcacac ctggatccag gataacggag gctgggtagg tgcacttggt 600
gatgtgagtc tgggctga 618
<210> 15
<211> 138
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Met Ala Lys Gln Pro Ser Asp Val Ser Ser Glu Cys Asp Arg Glu Gly
1 5 10 15
Arg Gln Leu Gln Pro Ala Glu Arg Pro Pro Gln Leu Arg Pro Gly Ala
20 25 30
Pro Thr Ser Leu Gln Thr Glu Pro Gln Asp Arg Ser Pro Ala Pro Met
35 40 45
Ser Cys Asp Lys Ser Thr Gln Thr Pro Ser Pro Pro Cys Gln Ala Phe
50 55 60
Asn His Tyr Leu Ser Ala Met Ala Ser Met Arg Gln Ala Glu Pro Ala
65 70 75 80
Asp Met Arg Pro Glu Ile Trp Ile Ala Gln Glu Leu Arg Arg Ile Gly
85 90 95
Asp Glu Phe Asn Ala Tyr Tyr Ala Arg Arg Val Phe Leu Asn Asn Tyr
100 105 110
Gln Ala Ala Glu Asp His Pro Arg Met Val Ile Leu Arg Leu Leu Arg
115 120 125
Tyr Ile Val Arg Leu Val Trp Arg Met His
130 135
<210> 16
<211> 417
<212> DNA
<213> 智人
<400> 16
atggcaaagc aaccttctga tgtaagttct gagtgtgacc gagaaggtag acaattgcag 60
cctgcggaga ggcctcccca gctcagacct ggggccccta cctccctaca gacagagcca 120
caagacagga gcccagcacc catgagttgt gacaaatcaa cacaaacccc aagtcctcct 180
tgccaggcct tcaaccacta tctcagtgca atggcttcca tgaggcaggc tgaacctgca 240
gatatgcgcc cagagatatg gatcgcccaa gagttgcggc gtattggaga cgagtttaac 300
gcttactatg caaggagggt atttttgaat aattaccaag cagccgaaga ccacccacga 360
atggttatct tacgactgtt acgttacatt gtccgcctgg tgtggagaat gcattga 417
<210> 17
<211> 350
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Met Phe Gly Leu Lys Arg Asn Ala Val Ile Gly Leu Asn Leu Tyr Cys
1 5 10 15
Gly Gly Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ser Gly Gly Ala Thr Arg Pro Gly
20 25 30
Gly Arg Leu Leu Ala Thr Glu Lys Glu Ala Ser Ala Arg Arg Glu Ile
35 40 45
Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ile Gly Gly Ser Ala Gly Ala Ser
50 55 60
Pro Pro Ser Thr Leu Thr Pro Asp Ser Arg Arg Val Ala Arg Pro Pro
65 70 75 80
Pro Ile Gly Ala Glu Val Pro Asp Val Thr Ala Thr Pro Ala Arg Leu
85 90 95
Leu Phe Phe Ala Pro Thr Arg Arg Ala Ala Pro Leu Glu Glu Met Glu
100 105 110
Ala Pro Ala Ala Asp Ala Ile Met Ser Pro Glu Glu Glu Leu Asp Gly
115 120 125
Tyr Glu Pro Glu Pro Leu Gly Lys Arg Pro Ala Val Leu Pro Leu Leu
130 135 140
Glu Leu Val Gly Glu Ser Gly Asn Asn Thr Ser Thr Asp Gly Ser Leu
145 150 155 160
Pro Ser Thr Pro Pro Pro Ala Glu Glu Glu Glu Asp Glu Leu Tyr Arg
165 170 175
Gln Ser Leu Glu Ile Ile Ser Arg Tyr Leu Arg Glu Gln Ala Thr Gly
180 185 190
Ala Lys Asp Thr Lys Pro Met Gly Arg Ser Gly Ala Thr Ser Arg Lys
195 200 205
Ala Leu Glu Thr Leu Arg Arg Val Gly Asp Gly Val Gln Arg Asn His
210 215 220
Glu Thr Ala Phe Gln Gly Met Leu Arg Lys Leu Asp Ile Lys Asn Glu
225 230 235 240
Asp Asp Val Lys Ser Leu Ser Arg Val Met Ile His Val Phe Ser Asp
245 250 255
Gly Val Thr Asn Trp Gly Arg Ile Val Thr Leu Ile Ser Phe Gly Ala
260 265 270
Phe Val Ala Lys His Leu Lys Thr Ile Asn Gln Glu Ser Cys Ile Glu
275 280 285
Pro Leu Ala Glu Ser Ile Thr Asp Val Leu Val Arg Thr Lys Arg Asp
290 295 300
Trp Leu Val Lys Gln Arg Gly Trp Asp Gly Phe Val Glu Phe Phe His
305 310 315 320
Val Glu Asp Leu Glu Gly Gly Ile Arg Asn Val Leu Leu Ala Phe Ala
325 330 335
Gly Val Ala Gly Val Gly Ala Gly Leu Ala Tyr Leu Ile Arg
340 345 350
<210> 18
<211> 1053
<212> DNA
<213> 智人
<400> 18
atgtttggcc tcaaaagaaa cgcggtaatc ggactcaacc tctactgtgg gggggccggc 60
ttgggggccg gcagcggcgg cgccacccgc ccgggagggc gacttttggc tacggagaag 120
gaggcctcgg cccggcgaga gataggggga ggggaggccg gcgcggtgat tggcggaagc 180
gccggcgcaa gccccccgtc caccctcacg ccagactccc ggagggtcgc gcggccgccg 240
cccattggcg ccgaggtccc cgacgtcacc gcgacccccg cgaggctgct tttcttcgcg 300
cccacccgcc gcgcggcgcc gcttgaggag atggaagccc cggccgctga cgccatcatg 360
tcgcccgaag aggagctgga cgggtacgag ccggagcctc tcgggaagcg gccggctgtc 420
ctgccgctgc tggagttggt cggggaatct ggtaataaca ccagtacgga cgggtcacta 480
ccctcgacgc cgccgccagc agaggaggag gaggacgagt tgtaccggca gtcgctggag 540
attatctctc ggtaccttcg ggagcaggcc accggcgcca aggacacaaa gccaatgggc 600
aggtctgggg ccaccagcag gaaggcgctg gagaccttac gacgggttgg ggatggcgtg 660
cagcgcaacc acgagacggc cttccaaggc atgcttcgga aactggacat caaaaacgaa 720
gacgatgtga aatcgttgtc tcgagtgatg atccatgttt tcagcgacgg cgtaacaaac 780
tggggcagga ttgtgactct catttctttt ggtgcctttg tggctaaaca cttgaagacc 840
ataaaccaag aaagctgcat cgaaccatta gcagaaagta tcacagacgt tctcgtaagg 900
acaaaacggg actggctagt taaacaaaga ggctgggatg ggtttgtgga gttcttccat 960
gtagaggacc tagaaggtgg catcaggaat gtgctgctgg cttttgcagg tgttgctgga 1020
gtaggagctg gtttggcata tctaataaga tag 1053
<210> 19
<211> 271
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Met Phe Gly Leu Lys Arg Asn Ala Val Ile Gly Leu Asn Leu Tyr Cys
1 5 10 15
Gly Gly Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ser Gly Gly Ala Thr Arg Pro Gly
20 25 30
Gly Arg Leu Leu Ala Thr Glu Lys Glu Ala Ser Ala Arg Arg Glu Ile
35 40 45
Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ile Gly Gly Ser Ala Gly Ala Ser
50 55 60
Pro Pro Ser Thr Leu Thr Pro Asp Ser Arg Arg Val Ala Arg Pro Pro
65 70 75 80
Pro Ile Gly Ala Glu Val Pro Asp Val Thr Ala Thr Pro Ala Arg Leu
85 90 95
Leu Phe Phe Ala Pro Thr Arg Arg Ala Ala Pro Leu Glu Glu Met Glu
100 105 110
Ala Pro Ala Ala Asp Ala Ile Met Ser Pro Glu Glu Glu Leu Asp Gly
115 120 125
Tyr Glu Pro Glu Pro Leu Gly Lys Arg Pro Ala Val Leu Pro Leu Leu
130 135 140
Glu Leu Val Gly Glu Ser Gly Asn Asn Thr Ser Thr Asp Gly Ser Leu
145 150 155 160
Pro Ser Thr Pro Pro Pro Ala Glu Glu Glu Glu Asp Glu Leu Tyr Arg
165 170 175
Gln Ser Leu Glu Ile Ile Ser Arg Tyr Leu Arg Glu Gln Ala Thr Gly
180 185 190
Ala Lys Asp Thr Lys Pro Met Gly Arg Ser Gly Ala Thr Ser Arg Lys
195 200 205
Ala Leu Glu Thr Leu Arg Arg Val Gly Asp Gly Val Gln Arg Asn His
210 215 220
Glu Thr Ala Phe Gln Gly Trp Val Cys Gly Val Leu Pro Cys Arg Gly
225 230 235 240
Pro Arg Arg Trp His Gln Glu Cys Ala Ala Gly Phe Cys Arg Cys Cys
245 250 255
Trp Ser Arg Ser Trp Phe Gly Ile Ser Asn Lys Ile Ala Leu Leu
260 265 270
<210> 20
<211> 816
<212> DNA
<213> 智人
<400> 20
atgtttggcc tcaaaagaaa cgcggtaatc ggactcaacc tctactgtgg gggggccggc 60
ttgggggccg gcagcggcgg cgccacccgc ccgggagggc gacttttggc tacggagaag 120
gaggcctcgg cccggcgaga gataggggga ggggaggccg gcgcggtgat tggcggaagc 180
gccggcgcaa gccccccgtc caccctcacg ccagactccc ggagggtcgc gcggccgccg 240
cccattggcg ccgaggtccc cgacgtcacc gcgacccccg cgaggctgct tttcttcgcg 300
cccacccgcc gcgcggcgcc gcttgaggag atggaagccc cggccgctga cgccatcatg 360
tcgcccgaag aggagctgga cgggtacgag ccggagcctc tcgggaagcg gccggctgtc 420
ctgccgctgc tggagttggt cggggaatct ggtaataaca ccagtacgga cgggtcacta 480
ccctcgacgc cgccgccagc agaggaggag gaggacgagt tgtaccggca gtcgctggag 540
attatctctc ggtaccttcg ggagcaggcc accggcgcca aggacacaaa gccaatgggc 600
aggtctgggg ccaccagcag gaaggcgctg gagaccttac gacgggttgg ggatggcgtg 660
cagcgcaacc acgagacggc cttccaagga tgggtttgtg gagttcttcc atgtagagga 720
cctagaaggt ggcatcagga atgtgctgct ggcttttgca ggtgttgctg gagtaggagc 780
tggtttggca tatctaataa gatagcctta ctgtaa 816

Claims (47)

1.一种用于在有需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括：
a)在包含获得自该受试者的细胞的测试样品中，测量包含第一复合物的至少一种生物标志物的测试水平，该第一复合物包含BCL-XL或BCL-2蛋白；
b)将该至少一种生物标志物的测试水平与该至少一种生物标志物的对应的参考水平进行比较，以确定差异；以及
c)当该差异达到阈值时，向该受试者施用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂。
2.一种用于鉴定和/或选择患有癌症的受试者进行用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL或BCL-2抑制剂的治疗的方法，该方法包括：
a)在包含获得自该受试者的细胞的测试样品中，测量包含第一复合物的至少一种生物标志物的测试水平，该第一复合物包含BCL-XL或BCL-2蛋白；
b)将该至少一种生物标志物的测试水平与该至少一种生物标志物的对应的参考水平进行比较，以确定差异；以及
c)当该差异达到阈值时，确定该受试者可能对用该BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或该BCL-XL抑制剂或该BCL-2抑制剂的治疗产生应答。
3.一种用于在受试者中监测治疗功效的方法，该受试者患有癌症并在治疗期内已经用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL或BCL-2抑制剂进行了治疗，该方法包括：
a)在该治疗期后获得包含来自该受试者的细胞的测试样品；
b)在该测试样品中测量包含第一复合物的至少一种生物标志物的水平，该第一复合物包含BCL-Xl或BCL-2，以获得该至少一种生物标志物的治疗后水平；
c)将该治疗后水平与对治疗期之前获得自该受试者的测试样品测量的该至少一种生物标志物的基线水平进行比较，以确定该至少一种生物标志物的水平的治疗后变化；以及
d)当该治疗后变化达到阈值时，向该受试者继续施用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL或BCL-2抑制剂，或当该治疗后变化未达到该阈值时，增加对该受试者的BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂的剂量或给药频率，向该受试者施用与BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂组合的第二抗癌治疗剂，或停止向该受试者施用BCL-2/BCL-XL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该至少一种生物标志物进一步包含第二复合物，该第二复合物包含BCL-XL或BCL-2蛋白。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该第一和/或第二复合物包含与仅BH3蛋白复合的BCL-XL蛋白、与仅BH3蛋白复合的BCL-2蛋白、与含BH3蛋白复合的BCL-XL蛋白、或与含BH3蛋白复合的BCL-2蛋白。
6.如权利要求5所述的方法，其中该仅BH3蛋白选自下组，该组由以下组成：BIM、BID、BAD、BIK、HRK、BMF和PUMA。
7.如权利要求5所述的方法，其中该含BH3蛋白是BAX或BAK。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该至少一种生物标志物包含选自下组的两种或更多种复合物，该组由以下组成：BCL-XL:BIM、BCL-XL:PUMA、BCL-2:BIM、BCL-2:PUMA、MCL-1:BIM、MCL-1:PUMA及其任何组合。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该至少一种生物标志物的水平包含该第一复合物的水平和该第二复合物的水平的组合。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中通过蛋白质间相互作用测定测量该第一和/或第二复合物的水平。
11.如权利要求9所述的方法，其中该蛋白质间相互作用测定是基于免疫测定或邻近测定。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中该蛋白质间相互作用测定是介观尺度探索(MSD)高级酶联免疫吸附测定(MSD-ELISA)、标准复合物ELSIA、邻位连接技术、共免疫沉淀、免疫印迹测定或交联测定。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中通过使用与该复合物或与该BCL-XL蛋白或与该BCL-2蛋白特异性结合的抗体来测量该第一和/或第二复合物的水平。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中该第一和/或第二复合物是该样品中的优势复合物。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中该至少一种生物标志物进一步包含MCL-1。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中该至少一种生物标志物进一步包含BCL-2或BCL-XL。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中MCL-1、BCL-2或BCL-XL的水平是在mRNA水平、蛋白水平或DNA水平上测量的。
18.如权利要求17所述的方法，其中MCL-1、BCL-2或BCL-XL的水平是通过扩增测定、杂交测定、测序测定、免疫测定、光谱法、或邻近测定测量的。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中该癌症是实体瘤。
20.如权利要求19所述的方法，其中该实体瘤是肺癌、胃癌、食道癌、结肠癌、胆管癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、头颈癌或脑瘤。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中该至少一种生物标志物包含BCL-XL:BIM和BCL-XL:PUMA。
22.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中该癌症是血液癌症。
23.如权利要求21所述的方法，其中该血液癌症是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、华氏巨球蛋白血症(WM)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)或淋巴瘤。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中该至少一种生物标志物包含BCL-2:BIM和BCL-2:PUMA。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中该参考水平是相同类型癌症的代表性样品中至少一种生物标志物的平均水平。
26.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中该参考水平是相同类型或某种类型的癌症(例如血液癌症)或一般癌症的肿瘤样品中生物标志物的经验水平。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中该比较是用算法进行的。
28.如权利要求27所述的方法，其中该算法是分类算法。
29.如权利要求28所述的方法，其中该差异包括该测试水平的测试得分和该参考水平的参考得分之间的差异，并且其中该测试得分和该参考得分是由该算法计算的。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中该至少一种生物标志物包含BCL-XL:BIM和BCL-XL:PUMA的组合；或BCL-2:BIM和BCL-2:PUMA的组合。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中该至少一种生物标志物包含BCL-2:BIM、BCL-2:PUMA、BCL-XL:BIM、和BCL-XL:PUMA的组合。
32.如权利要求31所述的方法，其中当BCL-2:BIM、BCL-2:PUMA、BCL-XL:BIM、和BCL-XL:PUMA的组合的测试水品比参考水平高至少2倍时，达到阈值，或其中当治疗后变化是降低至少2倍时，到达阈值。
33.如权利要求15-32中任一项所述的方法，其中当MCL-1的测试水平不超过MCL-1的参考水平的100％时，达到阈值。
34.如权利要求16-33中任一项所述的方法，其中当BCL-2或BCL-XL的测试水平是BCL-2或BCL-XL的参考水平的至少2倍时，达到阈值。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中该测试样品是体液样品或组织样品。
36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该BCL-2/BCL-XL双重抑制剂具有式(I)、式(II)、或式(III)的结构：
Figure FDA0003354234060000051
Figure FDA0003354234060000061
其中A1环是
Figure FDA0003354234060000062
X11是取代的或未取代的，选自下组，该组由以下组成：亚烷基、亚烯基、环亚烷基、环亚烯基和杂环亚烷基；
Y11选自下组，该组由以下组成：(CH2)n-N(R11a)和
Figure FDA0003354234060000063
Q11选自下组，该组由以下组成：O、O(CH2)1-3、NR11c、NR11c(C1-3亚烷基)、OC(＝O)(C1-3亚烷基)、C(＝O)O、C(＝O)O(C1-3亚烷基)、NHC(＝O)(C1-3亚烷基)、C(＝O)NH和C(＝O)NH(C1-3亚烷基)；
Z11是O或NR11c
R11和R12独立地选自下组，该组由以下组成：H、CN、NO2、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环烷基、OR1'、SR1'、NR1'R1”、COR1'、CO2R1'、OCOR1'、CONR1'R1”、CONR1'SO2R1”、NR1”COR1”、NR1'CONR1”R1”'、NR1'C＝SNR1”R1”'、NR1'SO2R1”、SO2R1'、和SO2NR1'R1”；
R13选自下组，该组由以下组成：H、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环烷基、OR1'、NR1'R1”、OCOR1'、CO2R1'、COR1'、CONR1'R1”、CONR1'SO2R1”'、C1-3亚烷基CH(OH)CH2OH、SO2R1'、和SO2NR1'R1”；
R1'、R1”、和R1”'独立地是H、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、C1-3亚烷基杂环烷基、或杂环烷基；
R1'和R1”、或R1”和R1”'可以与它们所键合的原子一起形成3至7元环；
R14是氢、卤代、C1-3烷基、CF3或CN；
R15是氢、卤代、C1-3烷基、取代的C1-3烷基、羟基烷基、烷氧基或取代的烷氧基；
R16选自下组，该组由以下组成：H、CN、NO2、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环烷基、OR1'、SR1'、NR1'R1”、CO2R1'、OCOR1'、CONR1'R1”、CONR1”SO2R1”、NR1'COR1”、NR1'CONR1”R1”'、NR1'C＝SNR1”R1”'、NR1'SO2R1”、SO2R1'、和SO2NR1'R1”；
R17是取代的或未取代的，选自下组，该组由以下组成：氢、烷基、烯基、(CH2)0-3环烷基、(CH2)0-3环烯基、(CH2)0-3杂环烷基、(CH2)0-3芳基和(CH2)0-3杂芳基；
R18选自下组，该组由以下组成：氢、卤代、NO2、CN、CF3SO2和CF3；
R11a选自下组，该组由以下组成：氢、烷基、杂烷基、烯基、羟基烷基、烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、环烯基和杂环烷基；
R11b是氢或烷基；
R11c选自下组，该组由以下组成：氢、烷基、取代的烷基、羟基烷基、烷氧基和取代的烷氧基；并且
n1、r1、和s1独立地是1、2、3、4、5、或6；
或式(I)、(II)或(III)的药学上可接受的盐。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该BCL-2/BCL-XL双重抑制剂具有式(IV)的结构：
Figure FDA0003354234060000081
其中，
R21是SO2R2'；
R22是烷基，优选C1-C4烷基，更优选甲基、丙基或异丙基；
R23是烷基，优选C1-C4烷基，更优选甲基、丙基或异丙基；
R24是卤素，优选氟、氯；
R25是卤素，优选氟、氯；
R26选自H、卤素、烷基，优选氟、氯、C1-C4烷基，更优选甲基、丙基、异丙基；
R21b是H或烷基，优选C1-C4烷基，更优选甲基、丙基或异丙基；
n2、r2和s2独立地是1、2、3、4、5或6，更优选地r2和s2都是2，并且n2是3、4或5，更优选地，n2、r2和s2都是2；并且
R2’是烷基，优选C1-C4烷基，更优选甲基、丙基或异丙基。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该BCL-2/BCL-XL双重抑制剂具有式(V)的结构：
Figure FDA0003354234060000091
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中：
A3选自下组，该组由以下组成：
Figure FDA0003354234060000092
Figure FDA0003354234060000093
以及
Figure FDA0003354234060000094
E3是碳原子，并且
Figure FDA0003354234060000095
是双键；或
E3是-C(H)-，并且
Figure FDA0003354234060000096
是单键；或
E3是氮原子，并且
Figure FDA0003354234060000097
是单键；
X31、X32和X33各自独立地选自下组，该组由以下组成：-CR38＝和-N＝；
R31a和R31b与它们所附接的碳原子一起形成任选取代的3元、4元或5元环烷基；或
R31a和R31b与它们所附接的碳原子一起形成任选取代的4元或5元杂环；
R32选自下组，该组由以下组成：-NO2、-SO2CH3和-SO2CF3；
R32a选自下组，该组由以下组成：氢和卤素；
R33选自下组，该组由以下组成：氢、-CN、-C≡CH和-N(R34a)(R34b)；
R34a选自下组，该组由以下组成：任选取代的C1-6烷基、任选取代的C3-6环烷基、杂环、杂烷基、(环烷基)烷基和(杂环)烷基；
R34b选自下组，该组由以下组成：氢和C1-4烷基；
R35选自下组，该组由以下组成：任选取代的C1-6烷基、杂环、杂烷基、(环烷基)烷基和(杂环)烷基；
R36a、R36c、R36e、R36f和R36g各自独立地选自下组，该组由以下组成：氢、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C3-6环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、杂环、杂烷基、(环烷基)烷基和(杂环)烷基；
R36b和R36d各自独立地选自下组，该组由以下组成：氢、C1-4烷基和卤素；
R37选自下组，该组由以下组成：任选取代的C1-6烷基、杂环、杂烷基、(环烷基)烷基和(杂环)烷基；并且
R38选自下组，该组由以下组成：氢和卤素。
39.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该BCL-2/BCL-xL双重抑制剂或BCL-XL抑制剂或BCL-2抑制剂选自下组，该组由以下组成：
Figure FDA0003354234060000101
Figure FDA0003354234060000111
Figure FDA0003354234060000121
Figure FDA0003354234060000131
40.一种用于在如权利要求1-39中任一项所述的方法中使用的试剂盒，该试剂盒包含用于测量该至少一种生物标志物的水平的至少一种试剂。
41.如权利要求40所述的试剂盒，其中该至少一种试剂包含第一试剂，该第一试剂包含与该复合物或与该BCL-XL蛋白或与该BCL-2蛋白特异性结合的第一抗体。
42.如权利要求41所述的试剂盒，其中该至少一种试剂进一步包含第二试剂，该第二试剂包含与该复合物中的仅BH3蛋白或含BH3结构域的蛋白特异性结合的第二抗体。
43.如权利要求41或42中任一项所述的试剂盒，其中该第一抗体和/或该第二抗体被可检测地标记。
44.如权利要求41或42中任一项所述的试剂盒，其中该第一抗体和/或该第二抗体中的一个被可检测地标记，并且另一个能够被捕获。
45.如权利要求40或44中任一项所述的试剂盒，其中该至少一种试剂进一步包含第三试剂，该第三试剂包含能够与MCL-1的多核苷酸杂交的第一寡核苷酸、或能够与MCL-1的蛋白特异性结合的第三抗体。
46.如权利要求40或45中任一项所述的试剂盒，其中该至少一种试剂进一步包含第四试剂，该第四试剂包含能够与BCL-XL或BCL-2的多核苷酸杂交的第二寡核苷酸、或能够与BCL-XL或BCL-2的蛋白特异性结合的第四抗体。
47.用于测量包含复合物的至少一种生物标志物的水平的至少一种试剂在生产用于进行如权利要求1-39中任一项所述的方法的试剂盒中的用途，该复合物包含BCL-XL蛋白或BCL-2蛋白。
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