TWI770503B - 用於預測bcl-2/bcl-xl抑制劑對癌症的功效的方法和組合物 - Google Patents
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Abstract
提供了預測BCL-2/BCL-XL雙重或選擇性抑制劑治療癌症患者的療效的生物標記。該生物標記包含含有BCL-2或BCL-XL的複合體。還提供了用於評估生物標記的表現量的方法和組合物，例如試劑盒，以及使用此類表現量預測癌症患者對BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑的反應的方法。可以使用此類訊息來確定癌症患者的預後和治療選擇。
Description
本發明總體上涉及用於癌症治療的生物標記。
逃避細胞凋亡是人類癌症的標誌，並且是治療抗性的常見原因（Hanahan D等人, Cell [細胞](2000) 100:57-70；Delbridge AR等人, Cold Spring Harb Perspect Biol [冷泉港生物學展望](2012) 4）。因此，在人類癌症中標靶關鍵的細胞凋亡促進因子是用於開發全新類型的抗癌療法的有吸引力的策略。
BCL-2（B細胞淋巴瘤蛋白2）家族蛋白在粒線體介導的途徑中是細胞凋亡的關鍵調節因子。BCL-2家族蛋白包括抗凋亡（促存活）成員，這些成員包括BCL-2、BCL-XL、BCL-w、MCL-1和A1；以及促凋亡（促死亡）成員。抗凋亡（促存活）和促凋亡（促死亡）蛋白之間的平衡決定了細胞存活或死亡的命運。促存活蛋白質（例如BCL-2和BCL-XL）的過表達與腫瘤發生有關，並且是抗癌療法抗性的常見原因（Vaux DL等人, Nature [自然](1988) 335:440-42；Delbridge AR等人, Cell Death Differ[細胞死亡與分化](2015) 22:1071-80）。因此，被設計成標靶抗凋亡BCL-2蛋白的藥劑（例如，小分子BH3模擬物）可以為癌症患者的治療提供新的策略。然而，臨床可用BCL-2抑制劑或BH3模擬物（包括正在進行臨床評估的那些）在血液學癌症以及實體瘤中顯示出有限的功效，這可能是由於複雜的訊號傳遞途徑和腫瘤微環境所致。
對抗癌療法有臨床反應通常僅限於一部分患者。為了最大化抗癌療法的效率，已經提出了基於分子生物標記的個人化化學療法。然而，對能夠預測對癌症化學療法的反應的預測性生物標記的鑒定仍然是一個挑戰。因此，存在對開發生物標記的持續需求，這些生物標記用於預測BCL-XL/BCL-2雙重抑制劑、BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑在癌症治療中功效。
在一方面，本揭露提供了用於在有需要的受試者中治療癌症的方法。在一個實施例中，該方法包括：(a) 在包含獲得自受試者的細胞的測試樣品中，測量包含第一複合體的至少一種生物標記的測試表現量，該第一複合體包含BCL-XL或BCL-2蛋白；(b) 並將該至少一種生物標記的測試表現量與該至少一種生物標記的對應的參考表現量進行比較，以確定差異；以及 (c) 當該差異達到閾值時，向該受試者施用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑。在另一個實施例中，該方法包括：(a) 在包含獲得自受試者的細胞的測試樣品中，測量包含第一複合體的至少一種生物標記的基線表現量，該第一複合體包含BCL-XL或BCL-2蛋白；(b) 用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑處理測試樣品，(c) 測量經處理的測試樣品中至少一種生物標記的治療後表現量；(d) 將該治療後表現量與該至少一種生物標記的基線表現量進行比較，以確定該至少一種生物標記的表現量的治療後變化；以及 (e) 當該治療後變化達到閾值時，向該受試者施用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑。
在另一方面，本揭露提供了用於鑒定及/或選擇患有癌症的受試者進行用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL或BCL-2抑制劑的治療的方法。在一個實施例中，該方法包括：(a) 在包含獲得自受試者的細胞的測試樣品中，測量包含第一複合體的至少一種生物標記的測試表現量，該第一複合體包含BCL-XL或BCL-2蛋白；(b) 並將該至少一種生物標記的測試表現量與該至少一種生物標記的對應的參考表現量進行比較，以確定差異；以及 (c) 當該差異達到閾值時，確定該受試者可能對用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑的治療產生反應。在另一個實施例中，該方法包括：(a) 在包含獲得自受試者的細胞的測試樣品中，測量包含第一複合體的至少一種生物標記的基線表現量，該第一複合體包含BCL-XL或BCL-2蛋白；(b) 用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑處理測試樣品，(c) 測量經處理的測試樣品中至少一種生物標記的治療後表現量；(d) 將該治療後表現量與該至少一種生物標記的基線表現量進行比較，以確定該至少一種生物標記的表現量的治療後變化；以及 (e) 當該治療後變化達到閾值時，確定該受試者可能對用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑的治療產生反應。
在又另一方面，本揭露提供了用於在受試者中監測治療功效的方法，該受試者患有癌症，並在治療期內已經用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL或BCL-2抑制劑進行了治療。在一個實施例中，該方法包括：(a) 在治療期後獲得包含來自該受試者的細胞的測試樣品；(b) 在該測試樣品中測量包含第一複合體的至少一種生物標記的表現量，該第一複合體包含BCL-Xl或BCL-2，以獲得該至少一種生物標記的治療後表現量；(c) 將該治療後表現量與對治療期之前獲得自該受試者的測試樣品測量的該至少一種生物標記的基線表現量進行比較，以確定該至少一種生物標記的表現量的治療後變化；以及 (d) 當該治療後變化達到閾值時，向該受試者繼續施用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL或BCL-2抑制劑，或當該治療後變化未達到閾值時，增加對該受試者的BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑的劑量或給藥頻率，向該受試者施用與BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑組合的第二抗癌治療劑，或停止向該受試者施用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑。
在某些實施例中，該至少一種生物標記進一步包含第二複合體，所述第二複合體包含BCL-XL或BCL-2蛋白。
在某些實施例中，其中該第一及/或第二複合體包含與僅BH3蛋白複合的BCL-XL蛋白、與僅BH3蛋白複合的BCL-2蛋白、與含BH3蛋白複合的BCL-XL蛋白、或與含BH3蛋白複合的BCL-2蛋白。
在某些實施例中，該僅BH3蛋白選自下組，該組由以下組成：BIM、BID、BAD、BIK、HRK、BMF和PUMA。在某些實施例中，該含有蛋白的BH3結構域包含BAX或BAK。
在某些實施例中，該至少一種生物標記包含選自下組的兩種或更多種複合體，該組由以下組成：BCL-XL: BIM、BCL-XL: PUMA、BCL-2: BIM、BCL-2: PUMA、MCL-1: BIM、MCL-1: PUMA及其任何組合。
在某些實施例中，該至少一種生物標記的表現量包含第一複合體的表現量和第二複合體的表現量的組合。
在某些實施例中，通過使用蛋白質間相互作用測定來測量複合體的表現量。在某些實施例中，該蛋白質間相互作用測定是基於免疫測定或鄰近測定。在某些實施例中，該蛋白質間相互作用測定是介觀尺度探索（Meso Scale Discovery（MSD））高級酶聯免疫吸附測定（MSD-ELISA）、標準複合體ELSIA、鄰位連接技術、共免疫沉澱、免疫墨點測定或交聯測定。在某些實施例中，通過使用與複合體或與BCL-XL蛋白或與BCL-2蛋白特異性結合的抗體來測量第一複合體及/或第二複合體的表現量。
在某些實施例中，該第一及/或第二複合體是樣品中的優勢複合體。在某些實施例中，該癌症是血液癌症，並且優勢複合體包含BCL-2:BIM的複合體。在某些實施例中，該癌症是實體瘤，並且優勢複合體包含BCl-xL:BIM、及/或BCl-xL:PUMA的複合體。
在某些實施例中，該至少一種生物標記進一步包含MCL-1。
在某些實施例中，該至少一種生物標記進一步包含BCL-2或BCL-XL。在某些實施例中，MCL-1、BCL-2或BCL-XL的表現量是在mRNA表現量、蛋白表現量或DNA表現量上測量的。
在某些實施例中，MCL-1、BCL-2或BCL-XL的表現量是通過擴增測定、雜交測定、定序測定、免疫測定、光譜法、或鄰近測定測量的。
在某些實施例中，該癌症是實體瘤。在某些實施例中，該實體瘤是肺癌、胃癌、食道癌、結腸癌、膽管癌、肝癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌、頭頸癌或腦瘤。
在某些實施例中，該癌症是血液癌症。在某些實施例中，該血液癌症是慢性淋巴細胞性白血病（CLL）、急性髓性白血病（AML）、多發性骨髓瘤（MM）、華氏巨球蛋白血症（WM）、急性淋巴母細胞性白血病（ALL）或淋巴瘤。
在某些實施例中，該參考表現量是相同類型癌症的代表性樣品中至少一種生物標記的平均表現量。在某些實施例中，該至少一種生物標記的參考表現量是相同類型或某種類型的癌症（例如血液癌症）或一般癌症的腫瘤樣品中生物標記的經驗表現量。
在某些實施例中，該測試樣品是體液樣品或組織樣品。
在某些實施例中，如本文所定義的，該BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑是具有式 (I)、(II)、(III) 或 (IV) 的結構的化合物。在某些實施例中，該BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑是如本文所提供的化合物A或化合物B。在某些實施例中，如本文所定義的，該BCL-2抑制劑是具有式 (V) 的結構的化合物。在某些實施例中，該BCL-2抑制劑是如本文所提供的化合物C。
在某些實施例中，該BCL-2/BCL-xL雙重抑制劑是(R)-2-(1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-異丙基-5-甲基-4-(甲基磺醯基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)呱嗪-1-基)苯基) 胺磺醯基)-2-(三氟甲基磺醯基)苯基胺基)-4-(苯硫基)丁基)呱啶-4-羰基氧基)乙基膦酸或其藥學上可接受的鹽（在本文中還被稱為「化合物A」）。
在某些實施例中，該BCL-2/BCL-xL雙重抑制劑是(R)-1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-異丙基-5-甲基-4-(甲基磺醯基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)呱嗪-1-基)苯基) 胺磺醯基)-2-(三氟甲基磺醯基)苯基胺基)-4-(苯硫基)丁基)呱啶-4-甲酸或其藥學上可接受的鹽（在本文中還被稱為「化合物B」）。
在某些實施例中，該BCL-xL抑制劑是(S)-N-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基) 胺基)-3-硝基苯基)磺醯基)-2-((1H-吡咯並[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)呱嗪-1-基)苯甲醯胺或其藥學上可接受的鹽（在本文中還被稱為「化合物C」）。
在又另一個方面，本揭露提供了用於在本文所述的方法中使用的試劑盒。在一個實施例中，該試劑盒包含用於測量複合體表現量的第一試劑。在某些實施例中，該第一試劑包含與複合體或與BCL-XL蛋白或與BCL-2蛋白特異性結合的第一抗體。在某些實施例中，至少一種試劑進一步包含第二試劑，該第二試劑包含與複合體中的僅BH3蛋白或含BH3結構域的蛋白特異性結合的第二抗體。
在某些實施例中，該第一抗體及/或第二抗體被可檢測地標記。在某些實施例中，第一抗體及/或第二抗體中的一個被可檢測地標記，並且另一個能夠被捕獲。在某些實施例中，該至少一種試劑進一步包含第三試劑，該第三試劑包含能夠與MCL-1的多核苷酸雜交的第一寡核苷酸、或能夠與MCL-1的蛋白特異性結合的第三抗體。
在某些實施例中，該至少一種試劑進一步包含第四試劑，該第四試劑包含能夠與BCL-XL或BCL-2的多核苷酸雜交的第二寡核苷酸、或能夠與BCL-XL或BCL-2的蛋白特異性結合的第四抗體。
在另一方面，本揭露提供了用於測量包含複合體的至少一種生物標記的表現量的試劑在生產用於進行本文所述方法的診斷試劑盒中的用途，該複合體包含BCL-XL蛋白或BCL-2蛋白。
在更詳細地描述本揭露之前，應理解的是本揭露不限於所描述的具體實施例，因此這些當然可以改變。還應當理解，本文使用的術語僅是為了描述具體實施例的目的，而並不意圖是限制性的，因為本揭露的範圍將僅由所附申請專利範圍限定。
除非另外定義，本文所用的全部技術術語和科學術語具有與本揭露所屬領域的通常知識者通常所理解的相同意義。雖然與本文所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料也可以用於實施或測試本揭露，但是現在描述較佳的方法和材料。
在本說明書中引用的所有公開物和專利通過引用結合於此，就像每個單獨公開物或專利被確切地並且單獨地指示為通過引用被結合並且通過引用結合於此，以結合所引用的這些公開物來揭露和描述這些方法及/或材料。任何公開物的引用內容是針對在提交日之前的揭露，並且不能理解為承認因為先前揭露而本揭露不能獲得比這些公開物更早的申請日。此外，所提供的公開日期可能與實際的公開日期不同，實際的公開日期可能需要單獨地確認。
如將對於本領域通常知識者清楚的是，在閱讀本揭露時，本文描述和展示的單獨實施例的每一個具有離散的成分和特徵，這些成分和特徵可以在不偏離本揭露的範圍或精神的情況下易於與任何其他若干個實施例的特徵分離或組合。可以按照所敘述的事件的順序或按照邏輯上可行的任何其他順序來進行任何敘述的方法。
定義
提供以下定義來幫助讀者。除非另有定義，否則本文使用的所有技術術語、符號和其他科學或醫學術語或用詞旨在具有由化學和醫學領域通常知識者通常理解的涵義。在一些情況下，為了清楚及/或為了便於參考而在本文中定義了具有通常理解的涵義的術語，並且在本文中包括這些定義不應必須被解釋為表示與本領域中通常理解的術語的定義之間的實質性差異。
如本文所使用的，單數形式「一個/種（a/an）」以及「該（the）」包括複數指示物，除非上下文清楚地另外指明。
如本文所使用的，術語「生物標記」是指作為一些生物學狀態或狀況的可測量的指示物的生物分子。本文使用的術語「生物標記」旨在涵蓋目的多核苷酸、多肽（例如由目的多核苷酸編碼），以及含有兩個或多個生物標記結合在一起的複合體。本文提供的生物標記的實例可以是基因（例如，基因組DNA、cDNA）、或基因產物（例如，從基因轉錄的mRNA、由基因編碼的蛋白質、和蛋白質複合體）。本文提供的生物標記的一個具體實例包括包含BCL-XL蛋白或BCL-2蛋白的複合體。本文提供的生物標記的另一個具體實例包括MCL-1、BCL-XL或BCL-2。
如本文所使用的，關於蛋白質或多肽的術語「複合體」是指一組兩個或多個相關的多肽鏈。不同的多肽鏈可以具有不同的功能。通常，蛋白質複合體中的多肽鏈通過非共價相互作用連接。不同的蛋白質複合體可能具有不同程度的隨著時間的推移的穩定性。
如本文所使用的，術語「BCL-XL」是指BCL-XL基因和BCL-XL基因產物（例如，BCL-XL基因的mRNA和由BCL-XL基因編碼的蛋白質）。BCL-XL基因，也稱為BCL-2樣1（BCL2L1）基因，編碼屬BCL-2蛋白家族的蛋白。該BCL-XL蛋白通過阻止粒線體內容物（例如細胞色素c）的釋放而充當抗凋亡蛋白。人類BCL-XL基因在NCBI資料庫中具有基因ID為598。人類BCL-XL基因的mRNA轉錄物具有NCBI參考序列為XM_0111528964.2和XM_017027993.1。人類BCL-XL基因編碼的蛋白質具有NCBI參考序列為XP_011527266.1和XP_016883482.1。
如本文所使用的，術語「BCL-2」是指BCL-2基因和BCL-2基因產物（例如，BCL-2基因的mRNA和由BCL-2基因編碼的蛋白質）。BCL-2基因編碼完整的粒線體外膜蛋白，該蛋白可阻止某些細胞（如淋巴細胞）的凋亡性死亡。人類BCL-2基因在NCBI資料庫中具有基因ID為596。人類BCL-2基因的mRNA轉錄物具有NCBI參考序列為XM_017025917.2和XM_011526135.3。人類BCL-2基因編碼的蛋白質具有NCBI參考序列為XP_016881406.1和XP_011524437.1。
如本文所使用的，術語「MCL-1」是指MCL-1基因和MCL-1基因產物（例如，MCL-1基因的mRNA和由MCL-1基因編碼的蛋白質）。MCL-1基因編碼屬BCL-2家族的蛋白質。MCL-1基因的另一種剪接產生至少兩種蛋白質，較長的蛋白質通過抑制細胞凋亡來增強細胞存活，而較短的蛋白質則促進細胞凋亡和細胞死亡。人類MCL-1基因在NCBI資料庫中具有基因ID為4170。人類MCL-1基因的mRNA轉錄物具有NCBI參考序列為NM_021960.5、NM_182763.2和NM_001197320.1。人類MCL-1基因編碼的蛋白質具有NCBI參考序列為NP_068779.1、NP_877495.1和NP_001184249.1。
如本文所使用的，術語「BIM」是指BIM基因和BIM基因產物（例如，BIM基因的mRNA和由BIM基因編碼的蛋白質）。BIM，也稱為BCL-2-樣蛋白11，是促凋亡BCL-2家族成員，已顯示與BCL-2、BCL-XL和MCL-1相互作用。人類BIM基因在NCBI資料庫中具有基因ID為10018。人類BIM基因的mRNA轉錄物具有NCBI參考序列為NM_001204106、NM_001204107、NM_001204108、NM_001204109和NM_001204110。人類BIM基因編碼的蛋白質具有NCBI參考序列為NP_001191035、NP_001191036、NP_001191037、NP_001191038和NP_001191039。
如本文所使用的，術語「PUMA」是指PUMA基因和PUMA基因產物（例如，PUMA基因的mRNA和由PUMA基因編碼的蛋白質）。PUMA或p53凋亡的上調調節劑，也稱為Bcl-2結合成分3（BBC3），是BCL-2蛋白家族的促凋亡成員。PUMA的表達受腫瘤抑制因子p53調控。活化後，PUMA與抗凋亡BCL-2家族成員相互作用，從而釋放促凋亡分子BAX及/或BAK，然後它們能夠向粒線體發出凋亡信號。人類PUMA基因在NCBI資料庫中具有基因ID為27113。人類PUMA基因的mRNA轉錄物具有NCBI參考序列為NM_001127240、NM_001127241、NM_001127242和NM_014417。人類PUMA基因編碼的蛋白質具有NCBI參考序列為NP_001120712、NP_001120713、NP_001120714、NP_055232和NP_001120712.1。
如本文所使用的，術語「BID」是指BID基因和BID基因產物（例如，BID基因的mRNA和由BID基因編碼的蛋白質）。BID，或BH3相互作用結構域死亡刺激劑，是僅含有BH3結構域的BCL-2家族的促凋亡成員。反應凋亡訊號傳遞，BID與另一種BCL-2家族蛋白BAX相互作用，導致活化的BAX插入粒線體外膜。抗凋亡的BCL-2家族成員（包括BCL-2本身），可以結合BID並抑制BID活化BAX的能力。BID的表達被p53上調，並參與p53介導的細胞凋亡。人類BID基因在NCBI資料庫中具有基因ID為637。人類BID基因的mRNA轉錄物具有NCBI參考序列為NM_001196、NM_001244567、NM_001244569、NM_001244570和NM_001244572。人類BID基因編碼的蛋白質具有NCBI參考序列為NP_001187、NP_001231496、NP_001231498、NP_001231499和NP_001231501。
如本文所使用的，術語「BAD」是指BAD基因和BIAD基因產物（例如，BAD基因的mRNA和由BAD基因編碼的蛋白質）。BAD或與BCL-2相關的死亡促進劑是BCL-2家族的促凋亡成員，其參與啟動細胞凋亡。BAD是僅BH3家族的一個成員。脫磷酸的BAD與BCL-2和BCL-XL形成異源二聚體，使它們去活化，從而允許BAX/BAK觸發凋亡。當BAD被AKT磷酸化時，它會形成BAD-14-3-3蛋白異二聚體，而BCL-2則可以自由抑制BAX觸發的凋亡。人類BAD基因在NCBI資料庫中具有基因ID為572。人類BAD基因的mRNA轉錄物具有NCBI參考序列為NM_032989和NM_004322。人類BAD基因編碼的蛋白質具有NCBI參考序列為NP_004313和NP_116784。
如本文所使用的，術語「BIK」是指BIK基因和BIK基因產物（例如，BIK基因的mRNA和由BIK基因編碼的蛋白質）。BIK、或與BCL-2相互作用的殺手是BCL-2家族的促凋亡成員。BIK與BCL-2和BCL-XL相互作用。人類BIK基因在NCBI資料庫中具有基因ID為638。人類BIK基因的mRNA轉錄物具有NCBI參考序列為NM_001197。人類BIK基因編碼的蛋白質具有NCBI參考序列為NP_001188和NP_001188.1。
如本文所使用的，術語「HRK」是指HRK基因和HKR基因產物（例如，HRK基因的mRNA和由HRK基因編碼的蛋白質）。HRK、或HARAKIRI是一種促凋亡蛋白，可與BCL-2和BCL-XL相互作用。HRK蛋白與其他BCL-2家族成員缺乏明顯的同源性，除了與BIK的BH3結構域相似的8個胺基酸區域外。人類HRK基因在NCBI資料庫中具有基因ID為8739。人類HRK基因的mRNA轉錄物具有NCBI參考序列為NM_003806。人類HRK基因編碼的蛋白質具有NCBI參考序列為NP_003797。
如本文所使用的，術語「BMF」是指BMF基因和BMF基因產物（例如，BMF基因的mRNA和由BMF基因編碼的蛋白質）。BMF、或BCL-2修飾因子是含有單個BH3結構域的BCL-2家族成員。已顯示BMF結合BCL-2蛋白並充當凋亡活化劑。人類BMF基因在NCBI資料庫中具有基因ID為90427。人類BMF基因的mRNA轉錄物具有NCBI參考序列為NM_001003940、NM_001003942、NM_001003943和NM_033503。人類BMF基因編碼的蛋白質具有NCBI參考序列為NP_001003940、NP_001003942、NP_001003943和NP_277038。
如本文所使用的，術語「BAK」是指BAK基因和BAK基因產物（例如，BAK基因的mRNA和由BAK基因編碼的蛋白質）。BAK，也稱為BCL-2同源拮抗劑/殺手，是BCL-2家族的促凋亡成員。BAK蛋白與粒線體電壓依賴性陰離子通道相互作用並加速其開放，這導致膜電位的損失和細胞色素c的釋放。人類BAK基因在NCBI資料庫中具有基因ID為578。人類BAK基因的mRNA轉錄物具有NCBI參考序列為NM_001188。人類BAK基因編碼的蛋白質具有NCBI參考序列為NP_001179。
如本文所使用的，術語「BAX」是指BAX基因和BAX基因產物（例如，BAX基因的mRNA和由BAX基因編碼的蛋白質）。BAX，也稱為BCL樣蛋白4，是BCL-2家族的促凋亡成員。BAX蛋白與BCL-2形成異源二聚體，並增加了粒線體電壓依賴性陰離子通道的開放，這導致膜電位的損失和細胞色素c的釋放。BAX基因的表達受p53調控，並且已顯示與p53介導的細胞凋亡有關。人類BAX基因在NCBI資料庫中具有基因ID為581。人類BAX基因的mRNA轉錄物具有NCBI參考序列為NM_001291428、NM_001291429、NM_001291430、NM_001291431和NM_004324。人類BAX基因編碼的蛋白質具有NCBI參考序列為NP_001278357、NP_001278358、NP_001278359、NP_001278360和NP_004315。
關於生物標記的術語「表現量」是指樣品中存在的目的生物標記的量或數量。這樣的量或數量可以用絕對術語（即，樣品中生物標記的總數量）、或相對術語（即，樣品中生物標記的濃度或百分比）表示。可以在DNA表現量（例如，如由染色體區域中基因的量或數量或拷貝數表示）、RNA表現量（例如，如mRNA量或數量表示）、或蛋白質表現量（例如，如蛋白質或蛋白質複合體量或數量表示）上測量生物標記的表現量。
如本文所使用的，術語「癌症」是指涉及異常細胞生長的任何疾病，並且包括影響身體中任何組織、器官或細胞的疾病的所有階段和所有形式。該術語包括所有已知的癌症和贅生性病症（無論被描述為惡性、良性、軟組織的還是實體性的），以及所有階段和等級的癌症（包括轉移前和轉移後的癌症）。通常，可以根據癌症位於或起源於的組織或器官以及癌組織和細胞的形態對癌症進行分類。
如本文所使用的，術語「實體瘤」是指不包含囊腫或液體區域的任何癌症。實體瘤通常不包括白血病（即，血液癌症）。實體瘤可以是良性或惡性的。如本文所使用的，實體瘤的類型包括但不限於，腎上腺皮質癌、肛門癌、星形細胞瘤、兒童小腦或大腦癌、基底細胞癌、膽道癌、膀胱癌、骨腫瘤、腦癌、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性膠質瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、幕上原始神經外胚層瘤、視覺通路和下丘腦膠質瘤、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、子宮頸癌、結腸癌、肺氣腫、子宮內膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏肉瘤、視網膜母細胞瘤、胃/胃部癌、膠質瘤、頭頸癌、心臟癌症、霍奇金淋巴瘤、胰島細胞癌（內分泌胰腺癌）、卡波西肉瘤、腎癌（腎細胞癌）、喉癌、肝癌、肺癌、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎癌）、視網膜母細胞瘤、尤因腫瘤家族、皮膚癌、胃癌、睾丸癌、咽喉癌、甲狀腺癌和陰道癌。
值得注意的是，在本揭露中，例如「包括/包含/含有（comprises/comprised/comprising/contains/containing）」等術語旨在是包括性的或開放式的，並且不排除另外的、未列舉的元素或方法步驟。
術語「測定」、「評估」、「測量」和「檢測」可互換地使用，並且是指定量和半定量的測定。旨在進行定量和半定量測定的情況下，可以使用短語「確定目標多核苷酸或多肽的表現量」或「檢測目標多核苷酸或多肽的表現量」。
術語「雜交」是指在嚴格條件下核酸分子優先與特定核苷酸序列結合、雙鏈化或雜交。術語「嚴格條件」是指雜交和洗滌條件，在該條件下探針將優先與其標的序列雜交，並在較小程度上或根本不與混合群體中的其他序列（例如，來自活體組織檢查的細胞裂解液或DNA製劑）雜交。在核酸雜交的上下文中的嚴格條件是序列依賴性的，並且在不同的環境參數下是不同的。對核酸雜交的大量指導可見於，例如，TijssenLaboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Bio logy—Hybridization with Nucleic Acid Probes
[生物化學和分子生物學實驗室技術：與核酸探針雜交]第I部分, 第2章,
「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays
[雜交原理和核酸探針測定策略的綜述],
」(1993) 愛思維爾公司（Elsevier）, 紐約州）。通常，高嚴格雜交和洗滌條件在一個定義的離子強度和pH下被選擇為低於所述具體序列的熱熔點（Tm）大約5°C。Tm是50%的標的序列與完全匹配的探針雜交時的溫度（在定義的離子強度和pH下）。
術語「核酸」和「多核苷酸」可互換地使用，並且是指任何長度的核苷酸的聚合形式（脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物）。多核苷酸可以具有任何三維結構並且可以執行任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性實例包括基因、基因片段、外顯子、內含子、信使RNA（mRNA）、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、shRNA、單鏈短或長RNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質體、載體、任何序列的分離的DNA、控制區、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引子。核酸分子可以是線性或環狀的。
術語「互補性」是指通過傳統的沃森-克裡克（Watson-Crick）類型或其他非傳統類型來與另一種核酸序列形成氫鍵的能力。百分比互補性表示核酸分子中可與第二核酸序列形成氫鍵的（例如，沃森-克裡克鹼基配對）的殘基的百分比（例如，10個中的5、6、7、8、9、10個是50%、60% ＞、70% ＞、80% ＞、90%和100%互補）。
如本文所使用的，術語「預後（prognose/prognosing）」是指疾病或病症的未來病程或結果的預測或預報。
通常，「蛋白質」是多肽（即，通過肽鍵彼此連接的至少兩個胺基酸的串）。蛋白質可以包括胺基酸以外的部分（例如，可以是糖蛋白）及/或還可以另外進行加工或修飾。本領域通常知識者將理解，「蛋白質」可以是由細胞產生的完整多肽鏈（具有或不具有訊號序列），或者可以是其功能部分。本領域通常知識者將進一步理解，蛋白質有時可包含多於一個的多肽鏈，例如通過一個或多個二硫鍵連接或通過其他方式締合。
如在患者對癌症療法的反應的上下文中使用的術語「反應的」或「反應性」可互換地使用，並且是指對治療的有益患者反應，而不是不利反應（即不良事件）。在患者中，有益反應可以根據許多臨床參數來表達，這些臨床參數包括可檢測到的腫瘤消失（完全反應），腫瘤大小及/或癌細胞數減小（部分反應），腫瘤生長停滯（穩定的疾病），可能導致腫瘤消退或排斥的抗腫瘤免疫反應增強；與腫瘤有關的一種或多種症狀在某種程度上的減輕；治療後的存活期長度增加；及/或治療後給定時間點處的死亡率降低。腫瘤大小及/或癌細胞數的持續增加、及/或腫瘤轉移表明缺乏對治療的有益反應，並因此降低了反應性。
如本文所使用的，術語「樣品」是指獲得自受試者的生物樣品，並且包含一種或多種目的生物標記。樣品的實例包括但不限於體液，例如血液、血漿、血清、尿液、陰道液、子宮或陰道沖洗液、胸膜液、腹水液、腦脊液、唾液、汗液、眼淚、痰、細支氣管肺泡灌洗液等；以及組織，例如活體檢查組織（例如，活體檢查的骨組織、骨髓、乳腺組織、胃腸道組織、肺組織、肝組織、前列腺組織、腦組織、神經組織、腦膜組織、腎組織、子宮內膜組織、子宮頸組織、淋巴結組織、肌肉組織或皮膚組織）、石蠟包埋的組織。在某些實施例中，該樣品可以是包含細胞（例如癌細胞或非癌細胞，例如周邊血單核細胞（PBMC））的生物學樣品。在一些實施例中，該樣品是例如通過腫瘤活體檢查或細針抽吸從腫瘤獲得的新鮮或存檔的樣品。該樣品也可以是任何含有癌細胞的生物流體。通常在醫院或診所之後，例如在活體檢查期間，根據標準作業程序進行從受試者收集樣品。
如本文所使用的，術語「測試樣品」是指獲得自需要癌症治療的受試者的樣品，並且代表該受試者的癌症病情。例如，測試樣品可以包含癌細胞。
如本文所使用的，術語「受試者」是指人類或任何非人類動物（例如，小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、豬、綿羊、馬或靈長類動物）。在許多實施例中，受試者是人類。受試者可以是患者，是指呈現給醫療提供者以診斷或治療疾病的人。術語「受試者」在本文中與「個體」或「患者」互換地使用。受試者可以患有或易患疾病或障礙，但是可以顯示或可以不顯示該疾病或障礙的症狀。
如本文所使用的，術語「治療（「treatment」、「treat」或「treating」）」是指預防或緩解病症、減緩病症的發展的發作或速度、預防或延遲與病症相關的症狀的發展、減輕或終止與病症相關的症狀、產生病症的完全或部分消退、治癒病症或其某些組合。關於癌症，「治療（「treating」或「treatment」）」是指抑制或減緩腫瘤或惡性細胞的生長、增殖或轉移，預防或延遲腫瘤的發展或惡性細胞的生長、增殖、轉移或癌症症狀或其某些組合。因此，在所公開的方法中，治療可以指癌症或癌症症狀嚴重程度降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或100%。例如，與對照相比，如果受試者的一種或多種疾病症狀降低了10%，則認為治療該疾病的方法為治療。因此，與原始或對照表現量相比，降低可以為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或10%至100%之間的任何百分比降低。應當理解，治療不一定是指疾病、病症或疾病或病症的症狀的治癒或完全消融。
如本文所使用的，術語「可檢測標記」是指允許檢測的分子或部分。關於試劑的術語「可檢測地標記」是指試劑包含可檢測的標記或可以被可檢測的標記結合。可檢測標記可用於標記蛋白質（例如抗體）和核酸（例如探針和引子）。適合用於標記引子、探針和抗體的可檢測標記的實例包括例如發色團、放射性同位素、螢光團、化學發光部分、顆粒（可見的或螢光的）、核酸、配體、或催化劑（例如酶）。
放射性同位素的實例包括但不限於，123
I、124
I、125
I、131
I、35
S、3
H、111
In、112
In、14
C、64
Cu、67
Cu、86
Y、88
Y、90
Y、177
Lu、211
At、186
Re、188
Re、153
Sm、212
Bi和32
P。
螢光團的實例包括但不限於，吖啶、7-胺基-4-甲基香豆素-3-乙酸（AMCA）、BODIPY、瀑布藍（Cascade Blue）、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、伊丹（Edans）、伊紅（Eosin）、赤蘚紅、螢光素、6-FAM、TET、JOC、HEX、俄勒岡綠（Oregon Green）、羅丹明、羅丹綠（Rhodol Green）、Tamra、Rox和Texas RedTM
（分子探針公司（Molecular Probes, Inc.），尤金（Eugene），俄勒岡州（Oreg.））。
酶的實例包括但不限於，鹼性磷酸酶、酸性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶和核糖核酸酶。
配體的實例包括但不限於，生物素、親和素、核酸、寡核苷酸、抗體或抗原。
應理解的是，可檢測標記不必產生可檢測訊號，例如，在一些實施例中，它可以與可檢測配偶體反應或與一種或多種另外的化合物反應以產生可檢測訊號。例如，可檢測標記可以是能夠用作標記的配體的特異性結合配偶體的配體（例如，第二標記的抗體）。再例如，由於其催化導致可檢測訊號產生的發色、發螢光或發光基質的催化活性，酶可用作可檢測標記。
預測
BCL-2/BCL-XL
抑制劑功效的生物標記
本文所述的方法和組合物部分基於生物標記的發現，該生物標記的表現量可預測BCL-2抑制劑、BCL-XL抑制劑、或BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑的抗癌功效。特別地，本文所述的生物標記可用於預測BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑、BCL-XL抑制劑及/或BCL-2抑制劑的抗癌功效，特別是本文所提供的那些（例如，WO 2014113413 A1、US 9403856 B和WO 2018027097 A1，將其全部併入本文）。
Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡的粒線體（也稱為「內在」）途徑的關鍵調節因子。它們的活性與淋巴樣癌症和若干種實體瘤癌症的發作有關，並且據信在許多癌症中是化學療法抗性的關鍵介質。BCL-2家族蛋白的特徵在於結構性同源結構域BH1、BH2、BH3和BH4，並且可以根據每種蛋白質包含多少個同源結構域和根據其生物學活性（即，該蛋白質是否具有促凋亡或抗凋亡功能）被進一步分類為三個亞族。
BCL-2蛋白的第一亞族包含具有所有四個同源結構域（即，BH1、BH2、BH3和BH4）的蛋白質。它們的一般作用是抗-凋亡，即保護細胞免於啟動細胞死亡過程。例如BCL-2、BCL-W、BCL-XL、MCL-1和BFL-1/A1等蛋白質是該第一亞族的成員。
屬Bcl-2蛋白的第二亞族的蛋白質包含三個同源結構域BH1、BH2和BH3，並具有促凋亡作用。該第二亞族的兩種主要代表性蛋白質是BAX和BAK。在本揭露中，該族也稱為含有多結構域或BH3結構域的促死亡蛋白。
Bcl-2蛋白的第三亞族由僅包含BH3結構域的蛋白質組成，並且該亞族的成員通常被稱為「僅BH3蛋白」。它們對細胞的生物學作用是促凋亡。BIM、BID、BAD、BIK、NOXA、HRK、BMF、和PUMA是該第三亞族蛋白質的實例。
凋亡途徑的失調導致受影響細胞的存活，否則該細胞在正常條件下會經歷凋亡。由於細胞凋亡途徑中涉及過多的BCL-2家族蛋白，並且這些蛋白質的天然表現量可以按不同細胞類型而變化，所以很少存在通常可應用於預測特定的BCL-2抑制劑、BCL-XL抑制劑或BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑的抗癌功效的生物標記。
本揭露的發明人驚奇地發現，包含含有BCL-XL或BCL-2的複合體的至少一種生物標記的表現量與BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑、BCL-XL抑制劑及/或BCL-2抑制劑的抗癌功效有關，特別是本文提供的抑制劑。
在某些實施例中，本文提供的至少一種生物標記包含第一複合體，所述第一複合體包含BCL-XL或BCL-2蛋白。在某些實施例中，本文提供的至少一種生物標記進一步包含第二複合體，所述第二複合體包含BCL-XL或BCL-2蛋白。在某些實施例中，該第一及/或第二複合體可以與僅BH3蛋白或與含BH3結構域蛋白複合。在某些實施例中，該第一及/或第二複合體包含與僅BH3蛋白複合的BCL-XL蛋白、與僅BH3蛋白複合的BCL-2蛋白、與含BH3蛋白複合的BCL-XL蛋白、或與含BH3蛋白複合的BCL-XL蛋白。
僅BH3蛋白根據其調節功能分為「活化劑」（例如BIM和BID）或「敏化劑」（例如BAD、BIK、NOXA、HRK、BMF和PUMA）。活化蛋白可以結合並活化促凋亡蛋白，但是這些活化蛋白也可以結合抗凋亡BCL-2家族蛋白（例如BCL-2或BCL-xL）並被隔離並阻止其發揮促凋亡活性。增敏蛋白可以取代抗凋亡BCL-2家族蛋白中的活化蛋白（例如BCL-2或BCL-xL），從而阻斷抗凋亡活性。在某些實施例中，該僅BH3蛋白選自下組，該組由以下組成：BIM、BID、BAD、BIK、HRK、BMF和PUMA。
含有BH3結構域的蛋白質包含三個同源結構域BH1、BH2和BH3，並具有促凋亡作用。含BH3結構域的蛋白可以選自BAX和BAK。在某些實施例中，該含有BH3結構域的蛋白質選自下組，該組由以下組成：BAK和BAX。
在某些實施例中，該至少一種生物標記包含選自下組的兩種或更多種複合體，該組由以下組成：BCL-XL: BIM、BCL-XL: PUMA、BCL-2: BIM、BCL-2: PUMA、MCL-1: BIM、MCL-1: PUMA及其任何組合。
在某些實施例中，BCL-2包含SEQ ID NO: 1或13的胺基酸序列。在某些實施例中，BCL-XL包含SEQ ID NO: 3的胺基酸序列。在某些實施例中，BIM包含SEQ ID NO: 5或15的胺基酸序列。在某些實施例中，BAD包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列。在某些實施例中，PUMA包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列。
在某些實施例中，本文提供的至少一種生物標記進一步包含MCL-1。
在某些實施例中，MCL-1包含SEQ ID NO: 12、18或20的基因序列，其編碼具有SEQ ID NO: 11、17或19的胺基酸序列的蛋白。用作本文生物標記的MCL-1可以是MCL-1的多核苷酸或蛋白質，或包含MCL-1的複合體（例如蛋白質複合體）。
在某些實施例中，本文提供的至少一種生物標記進一步包含BCL-2或BCL-XL。用作本文生物標記的BCL-2或BCL-XL可以是BCL-2或BCL-XL的多核苷酸或蛋白質。
因此，基於本文提供的至少一種生物標記的測量表現量，本揭露提供了用於測量本文提供的至少一種生物標記的表現量的至少一種檢測試劑；和用於鑒定及/或選擇患有或懷疑患有癌症的受試者進行用本文提供的BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑的治療的方法；用於在有需要的受試者中治療癌症的方法；以及用於在受試者中監測治療功效的方法，該受試者患有癌症，並在治療期內已經用本文提供的BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑進行了治療。
測量生物標記的表現量的試劑
在一方面，本揭露提供了用於檢測或測量本文提供的至少一種的生物標記的表現量的至少一種試劑。
在某些實施例中，該至少一種試劑包含第一試劑，該第一試劑包含與複合體或與BCL-XL蛋白或與BCL-2蛋白特異性結合的第一抗體。在某些實施例中，本文提供的第一抗體包含能夠與具有選自以下的序列的蛋白質或多肽內的表位特異性結合的抗原結合區：SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、和19。
在某些實施例中，該至少一種試劑進一步包含第二試劑，該第二試劑包含與複合體中的僅BH3蛋白或含BH3結構域的蛋白特異性結合的第二抗體。第二抗體的實例包括但不限於抗BIM，抗BID，抗BAD，抗BIK，抗HRK，抗BMF，抗PUMA，抗MCL-1，抗BAX，抗BAK抗體。
如本文所使用的，術語「抗體」是指可以與標的蛋白抗原特異性結合的免疫球蛋白或其抗原結合片段。可以通過從噬菌體或類似載體中的重組抗體庫中選擇抗體來鑒定和製備抗體，以及通過對動物（例如兔或小鼠）進行免疫來製備多株和單株抗體（參見，例如，Huse等人,Science
[科學](1989) 246:1275-1281；Ward等人,Nature
[自然](1989) 341 :544-546）。
可以理解，在某些實施例中，將該抗體進行修飾或標記以適當地在多種檢測測定中使用。在某些實施例中，該第一抗體及/或第二抗體被可檢測地標記。
在某些實施例中，該第一抗體與第一可檢測標記綴合，第二抗體與第二可檢測標記綴合，其中當緊密靠近時，第一可檢測標記和第二可檢測標記可允許產生可檢測訊號。在某些實施例中，該第一可檢測標記和第二可檢測標記包含一對寡核苷酸。當第一抗體和第二抗體非常接近時，一對寡核苷酸能夠相互作用以使得能夠進行酶促連接以提供連接的產物，該產物可以通過例如擴增來檢測。其他檢測系統也是可用的，例如時間分辨螢光、內部反射螢光、擴增（例如，聚合酶鏈式反應）和拉曼光譜等。
在某些實施例中，第一抗體及/或第二抗體中的一個被可檢測地標記，並且另一個能夠被捕獲。能夠被捕獲的抗體可以包含捕獲部分，或者可以被固定。
捕獲部分的實例可以包括例如結合配偶體或固體基板，例如多孔和無孔材料、乳膠顆粒、磁性顆粒、微粒、條帶、珠、膜、微量滴定孔和塑料管。固相材料的選擇和可檢測地標記抗原或抗體試劑的方法是根據所需的測定形式性能特徵確定的。在某些實施例中，該抗體可以被固定在固體基質上。固定化可以通過共價連接或非共價附接（例如塗覆）進行。
捕獲部分可以導致捕獲與複合體結合的抗體，從而捕獲與抗體結合的複合體。通過檢測捕獲的複合體中是否存在與該複合體中的另一配偶體特異性結合並被可檢測地標記（或能夠與標記的配體特異性結合）的另一種抗體，本領域通常知識者可以檢測或確認複合體中的兩個配偶體的存在，從而確定了複合體的表現量。在某些實施例中，該標記的配體可以包含與可檢測標記連接的第二抗體。例如，當用於MSD測定中時，該抗體與電化學發光試劑連接。
在某些實施例中，該至少一種試劑包含第三試劑，該第三試劑包含能夠與MCL-1的多核苷酸雜交的第一寡核苷酸、或能夠與MCL-1的蛋白特異性結合的第三抗體。在某些實施例中，該至少一種試劑進一步包含第四試劑，該第四試劑包含能夠與BCL-XL或BCL-2的多核苷酸雜交的第二寡核苷酸、或能夠與BCL-XL或BCL-2的蛋白特異性結合的第四抗體。
MCL1、BCL-XL、及/或BCL-2的表現量的測量可以在RNA表現量、DNA表現量及/或蛋白質表現量上。可以使用用於檢測標的RNA、標的DNA或標的蛋白質的合適的試劑。在某些實施例中，該第一寡核苷酸及/或第二寡核苷酸包含可以與包含MCL-1、BCL-XL、及/或BCL-2的至少一種生物標記的多核苷酸雜交的引子或探針。
如本文所使用的，術語「引子」是指由於標的多核苷酸序列的序列內的至少一部分引子的序列互補性，可以與標的多核苷酸序列特異性雜交的寡核苷酸。引子的長度可以是至少8個核苷酸，典型地為8至70個核苷酸，通常為18至26個核苷酸。為了與標的序列正確雜交，引子可以與標的多核苷酸序列的雜交部分具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%序列互補性。可用作引子的寡核苷酸可以根據最初由Beaucage和Caruthers,Tetrahedron Letts.
[四面體通訊](1981) 22: 1859-1862所述的固相亞磷醯胺三酯方法，使用自動合成儀，如Needham-Van Devanter等人, Nucleic Acids Res.[核酸研究] (1984) 12:6159-6168中所述進行化學合成。
引子可用於核酸擴增反應，其中引子被延伸以產生多核苷酸的新鏈。引子可以由通常知識者使用本領域已知的常識容易地設計，使得它們可以與本文提供的至少一種生物標記的標的核苷酸序列的核苷酸序列特異性退火。通常，將引子的3'核苷酸設計成與標的序列在相應的核苷酸位置處互補，以通過聚合酶提供最佳的引子延伸。
如本文所使用的，術語「探針」是指由於標的多核苷酸序列的序列內的至少一部分探針的序列互補性，可以與標的多核苷酸序列特異性雜交的寡核苷酸或其類似物。示例性探針可以是例如DNA探針、RNA探針或蛋白質核酸（PNA）探針。探針的長度可以是至少8個核苷酸，典型地為8至70個核苷酸，通常為18至26個核苷酸。為了與標的序列正確雜交，探針可以與標的多核苷酸序列的雜交部分具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列互補性。並且探針也可以根據如上所述的固相亞磷醯胺三酯方法化學合成。用於製備DNA和RNA探針的方法、以及用於將其與標的核苷酸序列雜交的條件描述於Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子複製：實驗室手冊], J. Sambrook等人編輯, 第2版 Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港實驗室出版社], 1989, 第10和11章中。
在某些實施例中，本文提供的引子或探針包含可與SEQ ID NO: 12、18、20、2、14、或4的序列內的一部分雜交的多核苷酸序列。在某些實施例中，本文提供的引子或探針包含與SEQ ID NO: 12、14或16的序列內的一部分具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%互補性的多核苷酸序列。
在某些實施例中，本文提供的第三抗體包含能夠與具有SEQ ID NO: 11、17或19的序列的蛋白質或多肽內的表位特異性結合的抗原結合區。在某些實施例中，本文提供的第四抗體包含能夠與具有SEQ ID NO: 1、13或3的序列的蛋白質或多肽內的表位特異性結合的抗原結合區。
在某些實施例中，該至少一種試劑（例如，本文提供的引子、探針和抗體）是被可檢測地標記的。在某些實施例中，該本文提供的引子、探針和抗體可以特異性結合被可檢測地標記的配體。
在某些實施例中，本文提供的可檢測地標記的引子、探針或抗體可以進一步包含淬滅劑物質。淬滅劑物質是指如下物質，當與螢光物質足夠接近地存在時，由於例如螢光共振能量轉移（FRET），其可以淬滅由螢光物質發出的螢光。
淬滅劑物質的實例包括但不限於，Tamra、Dabcyl或黑洞淬滅劑（Black Hole Quencher）（BHQ，生物研究技術公司（Biosearch Technologies））、DDQ（優羅泰公司（Eurogentec））、Iowa Black FQ（集成DNA技術公司（Integrated DNA Technologies））、QSY-7（分子探針公司（Molecular Probes））和Eclipse淬滅劑（時代生物科學公司（Epoch Biosciences））。
通過切口平移方法或通過隨機引子方法，可以將引子和探針標記為具有高特異性活性。有用的探針標記技術描述在文獻中（Fan, Y-S, Molecular cytogenetics: protocols and applications [分子細胞遺傳學：方案與應用], Humana Press [胡瑪納出版社], 托托華（Totowa）, 新澤西州（N.J.） xiv, 411 (2002)）。
本揭露還提供了試劑盒，其包含至少一種用於測量至少一種如本文所提供的生物標記的表現量的試劑。
用於患者鑒定、治療指導和預後的方法
在另一方面，本揭露的一個方面提供了一種用於鑒定及/或選擇患有或懷疑患有癌症的受試者進行用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL或BCL-2抑制劑的治療的方法。在某些實施例中，該方法包括：在獲得自該受試者的測試樣品中測量包含第一複合體的至少一種生物標記的測試表現量，該第一複合體包含BCL-XL或BCL-2；將該至少一種生物標記的表現量與該至少一種生物標記的對應的參考表現量進行比較，以確定差異；以及當該差異達到閾值時，確定該受試者可能對用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑的治療產生反應。
在另一方面，本揭露提供了用於在有需要的受試者中治療癌症的方法。在某些實施例中，該方法包括：在獲得自該受試者的測試樣品中測量包含第一複合體的至少一種生物標記的測試表現量，該第一複合體包含BCL-XL或BCL-2；將該至少一種生物標記的測試表現量與該至少一種生物標記的對應的參考表現量進行比較，以確定差異；以及當該差異達到閾值時，向該受試者施用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑。
在另一方面，本揭露提供了用於在受試者中監測治療功效的方法，該受試者患有癌症，並在治療期內已經用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑進行了治療。在某些實施例中，該方法包括：在治療期後從該受試者獲得測試樣品；在該樣品中測量包含第一複合體的至少一種生物標記的表現量，該第一複合體包含BCL-XL或BCL-2，以獲得該至少一種生物標記的治療後表現量；將該治療後表現量與對治療期之前獲得自該受試者的測試樣品測量的該至少一種生物標記的基線表現量進行比較，以確定該至少一種生物標記的表現量的治療後變化，並推薦治療計劃。例如，當該治療後變化達到閾值時，治療計劃可以包括：向該受試者施用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL或BCL-2抑制劑。又例如，當該治療後變化未達到閾值時，治療計劃可以包括：增加對該受試者的BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑的劑量或給藥頻率，向該受試者施用與BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑組合的第二抗癌治療劑，或停止向該受試者施用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑。
在某些實施例中，該至少一種生物標記進一步包含第二複合體，所述第二複合體包含BCL-XL或BCL-2蛋白。
在某些實施例中，該癌症是實體瘤。在某些實施例中，該實體瘤是肺癌、胃癌、食道癌、結腸癌、膽管癌、肝癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌、頭頸癌或腦瘤。在某些實施例中，該實體瘤的至少一種生物標記包含BCL-XL: BIM和BCL-XL: PUMA。
在某些實施例中，該癌症是血液癌症。在某些實施例中，該血液癌症是慢性淋巴細胞性白血病（CLL）、急性髓性白血病（AML）、多發性骨髓瘤（MM）、華氏巨球蛋白血症（WM）、急性淋巴母細胞性白血病（ALL）或淋巴瘤。在某些實施例中，該血液癌症的至少一種生物標記包含BCL-2: BIM和BCL-2: PUMA。
樣品製備
適用於實施本文提供的方法的任何生物樣品可以獲得自受試者。在某些實施例中，該樣品含有細胞。在某些實施例中，該樣品含有癌細胞。在某些實施例中，該樣品含有非癌細胞，例如周邊血單核細胞（PBMC）。在某些實施例中，該測試樣品是體液樣品或組織樣品。
在某些實施例中，可以通過可取的方法對樣品進一步處理，用於進行該至少一種生物標記的表現量的測量。
在某些實施例中，該方法進一步包括從獲得自受試者的生物流體樣品（例如，周邊血樣品）或組織樣品中分離或提取癌細胞（例如，循環腫瘤細胞）或PBMC。癌細胞可以通過免疫磁分離技術來分離，例如可從易莫尼康公司（Immunicon）（亨廷頓穀（Huntingdon Valley），賓夕法尼亞州（Pa.））獲得的技術。
在某些實施例中，該方法進一步包括從生物流體樣品（例如周邊血樣品）分離或提取PBMC。
在某些實施例中，該方法進一步包括從樣品中提取蛋白質。蛋白質提取可涉及裂解細胞並收集細胞裂解物。例如，該分離的細胞用蛋白酶磷酸酶抑制劑重懸於裂解緩衝液中並進行超音波處理。離心超音波處理的細胞，並收集上清液用於進一步分析，例如，用於檢測一種或多種生物標記的表現量。
在某些實施例中，在要測量生物標記的RNA或DNA表現量的情況下，該方法進一步包括從樣品中分離核酸。多種提取方法適用於從細胞或組織中分離DNA或RNA，例如苯酚和氯仿提取，並且多種其他方法描述於例如，Ausubel等人,Current Protocols of Molecular Biology [ 當代分子生物學實驗指南 ]
(1997) John Wiley & Sons[約翰·威利父子出版社]，以及Sambrook和Russell,Molecular Cloning: A Laboratory Manual [ 分子複製 : 實驗室手冊 ]
第3版 (2001)。
還可以使用可商購的試劑盒來分離RNA，包括例如，NucliSens提取試劑盒（生物梅裡埃公司（Biomerieux），瑪西埃圖瓦勒（Marcy l'Etoile），法國）、QIAampTM
微型血液試劑盒、Agencourt GenfindTM
、Rneasy®微型柱（凱傑公司（Qiagen））、PureLink® RNA微型試劑盒（賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific））和Eppendorf Phase Lock GelsTM
。通常知識者可以按照製造商的方案容易地提取或分離RNA或DNA。
在某些實施例中，可以對細胞或組織樣品進行處理以進行原位雜交。例如，可以在將組織樣品固定在玻璃顯微鏡載玻片上之前進行石蠟包埋，然後用溶劑（典型地為二甲苯）脫蠟。
測量蛋白質複合體的表現量的方法
本揭露的方法包括在獲得自患有癌症或懷疑患有癌症的受試者的樣品中測量本文所述的至少一種生物標記的表現量，所述生物標記包含第一複合體（及/或第二複合體）。
在某些實施例中，該第一及/或第二複合體包含與僅BH3蛋白複合的BCL-XL蛋白、與僅BH3蛋白複合的BCL-2蛋白、與含BH3蛋白複合的BCL-XL蛋白、或與含BH3蛋白複合的BCL-XL蛋白。在某些實施例中，該僅BH3蛋白選自下組，該組由以下組成：BIM、BID、BAD、BIK、HRK、BMF和PUMA。在某些實施例中，該含BH3蛋白是BAX或BAK。在某些實施例中，該至少一種生物標記包含選自下組的兩種或更多種複合體，該組由以下組成：BCL-XL: BIM、BCL-XL: PUMA、BCL-2: BIM、BCL-2: PUMA、MCL-1: BIM、MCL-1: PUMA及其任何組合。
複合體的表現量可以通過本領域已知的用於測量蛋白質間相互作用的任何合適的測定來測量，一般參見，Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual [蛋白質間相互作用：分子複製手冊], 第2版, Golemis和Adams編輯, Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社](2005)）。在某些實施例中，該蛋白質間相互作用測定是基於免疫測定或鄰近測定。合適的方法通常例如介觀尺度探索（MSD）高級酶聯免疫吸附測定（MSD-ELISA）、標準複合體ELSIA、鄰位連接技術（PLA）、共免疫沉澱、免疫墨點測定或交聯測定等。
免疫測定通常涉及使用特異性結合複合體中BCL-2或BCL-XL或僅BH3蛋白或含BH3結構域蛋白或複合體特有的表位的抗體來檢測或測量複合體的存在或表現量。此類抗體可以使用本領域已知的方法獲得（參見，例如，Huse等人,Science
[科學](1989) 246:1275-1281；Ward等人,Nature [ 自然 ]
(1989) 341 :544-546），或可以從商業來源獲得。免疫測定的實例包括但不限於，蛋白質墨點法、酶聯免疫吸附測定（ELISA）、酶免疫測定（EIA）、放射免疫測定（RIA）、免疫沉澱、夾心測定、競爭性測定、免疫螢光染色和成像、免疫組織化學和螢光活化細胞分選術（FACS）。關於免疫學和免疫測定程序的綜述，參見Basic and Clinical Immunology [基礎和臨床免疫學]（Stites和Terr編輯, 第7版 1991）。此外，可以按多種構型中的任一種進行免疫測定，這些構型在酶免疫測定（Maggio編輯, 1980）以及Harlow和Lane（同上）中被廣泛綜述。關於一般免疫測定的綜述，還參見Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology [細胞生物學方法：細胞生物學中的抗體], 第37卷（Asai編輯 1993）；Basic and Clinical Immunology [基礎和臨床免疫學]（Stites和Terr編輯, 第7版 1991）。
免疫共沉澱是蛋白質間相互作用和蛋白質複合體檢測的流行方法。通常，從裂解物中用特定抗體分離（沉澱）目的蛋白，以共沉澱直接或間接與目的蛋白結合並形成複合體的任何配偶體蛋白質。然後例如使用具有與配偶體蛋白特異性結合的抗體的蛋白質墨點法分析沉澱的複合體。
MSD高級ELISA與酶聯免疫吸附測定（ELISA）相似，只是MSD使用電化學發光（ECL）作為檢測技術，而ELISA使用比色反應。通常，將含有目的蛋白/複合體的溶液（例如細胞裂解物）添加到包被有特異性結合目的蛋白的捕獲抗體的基板（例如板中的孔）中。洗滌後，添加特異性結合與目的蛋白結合的配偶體蛋白的第二抗體。第二抗體（或與第二抗體結合的抗體）與ECL劑（例如釕（Ru）金屬離子）結合，並且基板含有電極。在配偶體蛋白質/蛋白質複合體存在的情況下，第二抗體與蛋白質複合體結合，並且釕離子將足夠靠近電極，以觸發氧化還原反應，產生可被CCD相機檢測到的光。與傳統的ELISA相比，MSD具有許多優勢，例如更高的靈敏度、更好的動態範圍、更少的基質效應、更少的樣品需求以及更好的功效。結果，MSD可用於檢測細胞裂解物中的蛋白質複合體。
鄰位連接技術（PLA）是一種免疫組織化學方法，利用所謂的PLA探針檢測蛋白質間相互作用或蛋白質複合體。每個PLA探針均附有一條獨特的短DNA鏈，並與物種特異性一級抗體結合或由直接DNA標記的一級抗體組成。當PLA探針非常接近時，DNA鏈可以通過隨後添加兩個其他成環的DNA寡核苷酸進行相互作用。通過酶促連接將兩個添加的寡核苷酸連接後，使用聚合酶通過滾環擴增將其擴增。該擴增反應產生DNA環的數百倍複製，這可以通過螢光團或酶標記的互補寡核苷酸探針來突出顯示。當用螢光顯微鏡或標準明視野顯微鏡觀察時，在每個單分子擴增產物中產生的高濃度螢光或顯色訊號作為一個明顯的亮點很容易看到。
儘管大多數蛋白質間的相互作用是短暫的，並且在樣品製備過程中可能會解離，但交聯測定是一種穩定或永久鄰接蛋白質複合體相互作用成分的方法。一旦蛋白質複合體的成分被共價交聯，其他步驟（例如，細胞裂解，親和純化，電泳或質譜）可用於分析蛋白質間相互作用，同時保持原始的相互作用複合體。可以將同功能的，具有胺反應性的交聯劑添加到細胞中，以將可能相互作用的蛋白質交聯在一起，然後在裂解後通過蛋白質墨點進行分析。交聯劑可以是膜滲透性的，例如雙琥珀醯亞胺辛二酸酯（DSS），或使細胞內蛋白質交聯，也可以是非膜滲透性的，例如雙磺酸琥珀醯亞胺辛二酸酯（BS3），或使細胞表面蛋白質交聯。此外，一些交聯劑可以被還原劑裂解，例如二硫代雙琥珀醯亞胺基丙酸酯（DSP）或3,3'-二硫代雙琥珀醯亞胺基丙酸酯（DTSSP），以使交聯反向。備選地，含有光可活化基團的異雙功能交聯劑，例如（琥珀醯亞胺基4,4'-疊氮戊酸酯（SDA）產物或磺基-SDA）可用於捕獲可能發生的瞬時相互作用，例如在特定刺激之後。在用光可活化胺基酸（例如L-光亮胺酸或L-光蛋胺酸）進行代謝標記後，也可以進行光活化。蛋白質之間的交聯位點可以使用質譜法進行高精度定位，特別是如果使用MS可裂解的交聯劑（例如DSSO或DSBU）。
在某些實施例中，該第一及/或第二複合體是樣品中的優勢複合體。如本文所使用的，「優勢（dominant）」複合體是指其在樣品中的表現量在樣品中顯著的複合體。
為了確定特定複合體的優勢，可以測量BCL-2家族蛋白質複合體組的表現量。在一個實施例中，可以將BCL-2家族蛋白質複合體組的總體表現量計算為例如總和或加權總和。在這樣的實施例中，可以將特定複合體的測量表現量與總體表現量進行比較以獲得例如總體表現量的百分比或比率。如果特定複合體相對於總體表現量的百分比或比例超過某個值（例如50%），則將其視為主要複合體之一。在另一個實施例中，可以計算複合體組的平均表現量，並且可以將特定複合體的測量表現量與平均表現量進行比較以確定其是否高於或低於平均表現量，如果高於平均表現量，則它可以被認為是樣品中的主要複合體之一。
測量額外的生物標記的表現量的方法
在某些實施例中，該至少一種生物標記進一步包含MCL-1。不希望受到任何理論的束縛，據信MCL-1的表現量可以指示對該治療的潛在抗性。MCL-1的高的基線表現量，或治療後MCL-1的表現量明顯升高，可以表明抗性。
在某些實施例中，該至少一種生物標記進一步包含BCL-XL或BCL-2。BCL-XL或BCL-2基因或蛋白質的擴增可以指示反應。
在某些實施例中，本文提供的方法進一步包括測量生物標記MCL-1、BCL-XL或BCL-2的表現量。
本文提供的生物標記MCL-1、BCL-XL或BCL-2旨在涵蓋不同的形式，包括mRNA、蛋白質（及其複合體）以及DNA（例如基因組DNA）。因此，可以通過RNA表現量（例如，mRNA表現量）、蛋白質表現量或DNA表現量來測量該至少一種生物標記的表現量。mRNA表現量及/或蛋白質表現量還可以被稱為該至少一種生物標記的表達表現量。
MCL-1、BCL-XL或BCL-2的生物標記的RNA（例如，mRNA）表現量或DNA表現量可以通過本領域已知的任何合適的核酸測定（例如，核酸擴增測定、核酸雜交測定、核酸定序測定）以及其他方法（例如，高效液相色譜法（HPLC）片段分析、毛細管電泳等）來測量。MCL-1、BCL-XL或BCL-2的蛋白表現量可以通過任何合適的測定（例如免疫測定法）進行測量。
擴增測定
核酸擴增測定涉及複製標的核酸（例如，DNA或RNA），從而增加經擴增的核酸序列的拷貝數。擴增可以是指數的或線性的。示例性核酸擴增方法包括但不限於使用以下方法進行的擴增：聚合酶鏈式反應（「PCR」，參見美國專利4,683,195和4,683,202；PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications [PCR方案：方法和應用指南]（Innis等人編輯, 1990））、逆轉錄酶聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、實時定量PCR（qRT-PCR）、定量PCR（例如，TaqMan®）、巢式PCR、連接酶鏈式反應（參見Abravaya, K.等人, Nucleic Acids Research [核酸研究], 23:675-682, (1995)）、分支DNA訊號擴增（參見，Urdea, M. S.等人, AIDS, 7（增刊2）: S11-S14, (1993)）、可擴增的RNA報告分子、Q-β複製（參見，Lizardi等人,Biotechnology
[生物技術](1988) 6: 1197）、基於轉錄的擴增（參見，Kwoh等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
[美國國家科學院院刊](1989) 86: 1173-1177）、回旋DNA擴增、鏈置換活化、循環探針技術、自動維持序列擴增（Guatelli等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
[美國國家科學院院刊](1990) 87:1874-1878）、滾環複製（美國專利號5,854,033）、基於核酸序列的等溫擴增（NASBA）、以及基因表達的連續分析（SAGE）。
在某些實施例中，該核酸擴增測定是基於PCR的方法。
在一些實施例中，為測量MCL-1、BCL-XL或BCL-2的mRNA表現量，在擴增之前將MCL-1、BCL-XL或BCL-2的標的RNA逆轉錄為cDNA。可以使用多種逆轉錄酶，包括但不限於MMLV RT、MMLV RT的RNase H突變體例如Superscript和Superscript II（生命技術公司（Life Technologies），GIBCO BRL，蓋瑟斯堡（Gaithersburg），馬里蘭州（Md.））、AMV RT和來自嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus）的熱穩定逆轉錄酶。例如，可以用於將RNA轉化為cDNA的一種方法是改編自Superscript II預擴增系統（生命技術公司，GIBCO BRL，蓋瑟斯堡，馬裡蘭州；目錄號18089-011）的方案，如由Rashtchian, A., PCR Methods Applic.[PCR方法應用], 4:S83-S91, (1994)中所述。
在某些實施例中，在核酸擴增測定後，對MCL-1、BCL-XL或BCL-2的表現量進行定量。在某些實施例中，在核酸擴增測定期間，對MCL-1、BCL-XL或BCL-2進行定量，這也被稱為實時擴增或定量擴增。
定量擴增的方法揭露在以下文獻中：例如美國專利號6,180,349、6,033,854、和5,972,602，以及例如Gibson等人,Genome Research
[基因組研究](1996) 6:995-1001；DeGraves等人,Biotechniques
[生物技術](2003) 34(1): 106-10, 112-5；Deiman B等人,Mol Biotechnol
. [分子生物技術](2002) 20(2): 163-79。定量通常基於對可檢測訊號的監測，該可檢測訊號代表擴增（例如，PCR）反應循環中模板的拷貝。可通過嵌入劑或擴增過程中使用的標記引子或標記探針來產生可檢測訊號。示例性嵌入劑包括SYBR GREEN™和SYBR GOLD™。
在某些實施例中，可以使用可檢測地標記的引子或可檢測地標記的探針，以允許檢測或定量對應於該引子或探針的生物標記。在某些實施例中，該標記的引子或標記的探針包含含有螢光團的可檢測標記。在某些實施例中，該標記的引子或標記的探針可以進一步包含淬滅劑物質。在一種引子或探針中螢光團和淬滅劑物質的存在可以有助於提供自淬滅探針例如TaqMan（美國專利號5,210,015和5,538,848）或分子信標探針（美國專利號5,118,801和5,312,728）、或其他無分支或線性信標探針（Livak等人, 1995, PCR Method Appl.[PCR方法應用], 4:357-362；Tyagi等人, 1996, Nature Biotechnology [自然生物技術], 14:303-308；Nazarenko等人, 1997, Nucl. Acids Res. [核酸研究], 25:2516-2521；美國專利號5,866,336和6,117,635）。在完整的引子或探針中，淬滅劑物質和螢光團非常接近，使得當螢光團被輻射激發時，螢光團會通過螢光共振能量轉移（FRET）將能量轉移至同一探針中的淬滅劑物質，從而不發出訊號。此類探針可用於5’-3’核酸外切酶「水解」PCR測定（也稱為TaqMan®測定）（參見，美國專利號5,210,015和5,487,972；Holland等人,PNAS USA
[美國國家科學院院刊] (1991) 88: 7276-7280；Lee等人,Nucleic Acids Res.
[核酸研究] (1993) 21 : 3761-3766）。
在定量擴增測定（例如，實時PCR）中，可以使用本領域已知的方法對經檢測的生物標記的表現量進行定量。例如，在擴增期間，可以在每個PCR循環期間監測和計算螢光訊號。可以進一步計算閾值循環或Ct值。Ct值是在螢光與預先確定的值相交處的循環。可以使用標準曲線將Ct與核酸的初始量或起始細胞數相關。構建標準曲線以關聯Ct值與所測量的生物標記的對數表現量之間的差異。
作為品質控制量度，可以測量內部對照生物標記的表現量。通常知識者將理解，內部對照生物標記可以固有地存在於樣品中，並且可以將其表現量用於歸一化MCL-1、BCL-XL、或BCL-2的測量表現量，以抵消樣品絕對數中的任何差異。
雜交測定
核酸雜交測定使用探針與MCL-1、BCL-XL、或BCL-2的標的核酸雜交，從而允許檢測標的核酸。
在某些實施例中，用於雜交測定的探針是被可檢測地標記的。在某些實施例中，用於雜交測定的基於核酸的探針是未標記的。可以將此類未標記的探針固定在固體支持物（如微陣列）上，並且可以與可檢測地標記的標的核酸分子雜交。
在某些實施例中，可以通過分離核酸（例如，RNA或DNA），使核酸分開（例如，通過凝膠電泳），然後將分開的核酸轉移到合適的膜濾紙（例如，硝化纖維素濾紙）上來進行雜交測定，其中將探針與標的核酸雜交並允許檢測。參見，例如，Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子克隆：實驗室手冊], J. Sambrook等人編輯, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社], 1989, 第7章。探針和標的核酸的雜交可以通過本領域已知的方法檢測或測量。例如，可以通過將雜交的濾紙暴露於照相膠片來進行雜交的放射自顯影檢測。由雜交濾紙曝光的照相膠片的光密度掃描提供了標的核酸表現量的準確測量。電腦成像系統也可以用於量化生物標記的表現量。
在某些實施例中，雜交測定可以是原位雜交測定。原位雜交測定可用於檢測目的生物標記（例如，MCL-1、BCL-XL或BCL-2）的基因座上拷貝數變化（例如增加或擴增）的存在。可用於原位雜交測定的探針可以是基因座特異性探針，這些探針與染色體上的特異性基因座雜交以檢測特定目的基因座（例如，MCL-1、BCL-XL或BCL-2）的存在或缺失。其他類型的探針也可能是有用的，例如，染色體計數探針（例如，可與目的染色體中的重複序列區雜交，以指示整個染色體的存在或缺失）和染色體臂探針（例如，可與染色體區域雜交，並指示特定染色體的臂的存在或缺失）。使用用於原位雜交的獨特序列探針的方法在美國專利號5,447,841中進行了描述，將其通過引用併入本文。可以使用螢光顯微鏡和針對每個螢光團的合適的濾鏡，或通過使用雙重或三重帶濾鏡組觀察多個螢光團來查看探針。參見，例如Bittner等人的美國專利號5,776,688，將其通過引用併入本文。任何合適的顯微成像方法（包括自動數字成像系統）都可用於使雜交的探針可視化。可替代地，可以使用例如流式細胞術等技術來檢查探針的雜交模式。
定序方法
在測量目的生物標記的表現量中有用的定序方法涉及對標的核酸的定序和對經定序的標的核酸的計數。定序方法的實例包括但不限於，RNA定序、焦磷酸定序和高通量定序。
高通量定序涉及合成法定序（sequencing-by-synthesis）、連接法定序（sequencing-by-ligation）和超深度定序（ultra-deep sequencing）（例如，描述於Marguiles等人, Nature [自然]437 (7057): 376-80 (2005)中）。合成法定序涉及通過在聚合酶擴增中摻入標記的核苷酸或核苷酸類似物來合成標的核酸的互補鏈。在成功摻入標記核苷酸之後或即刻開始，測量該標記的訊號並記錄核苷酸的身份。在摻入之前去除經摻入的核苷酸上的可檢測標記，重複檢測和鑒定步驟。合成法定序方法的實例是本領域已知的，並且描述於例如美國專利號7,056,676、美國專利號8,802,368和美國專利號7,169,560中，將其內容通過引用併入本文。以使用折返PCR和錨定引子能夠在固體表面（或微陣列或晶片）上進行合成法定序。標的核酸片段可以通過與錨定引子雜交而附接至固體表面，並進行橋接擴增。該技術在例如Illumina®
定序平臺上使用。
焦磷酸定序涉及將標的核酸區域與引子雜交，並在聚合酶的存在下，通過順序地摻入對應於鹼基A、C、G和T（U）的脫氧核苷酸三磷酸來延伸新鏈。每次鹼基的摻入都伴隨著焦磷酸鹽的釋放，焦磷酸鹽被硫酸化酶轉化為ATP，從而驅動了氧化螢光素的合成和可見光的釋放。由於焦磷酸鹽的釋放與摻入的鹼基數等莫耳(mol)，因此發出的光與在任一步驟中添加的核苷酸數成正比。重複該過程，直到確定整個序列。
在某些實施例中，本文所述的生物標記的表現量通過全轉錄組散彈槍槍法定序（例如，RNA定序）來測量。已經描述了RNA定序的方法（參見Wang Z, Gerstein M和Snyder M,Nature Review Genetics
[遺傳學自然評論](2009) 10:57-63；Maher CA等人,Nature
[自然](2009) 458:97-101；Kukurba K和Montgomery SB, Cold Spring Harbor Protocols [冷泉港實驗方案](2015) 2015(11): 951-969）。
免疫測定
免疫測定通常涉及使用與生物標記特異性結合的抗體。此類抗體可以使用本領域已知的方法獲得（參見，例如，Huse等人,Science
[科學](1989) 246:1275-1281；Ward等人,Nature [ 自然 ]
(1989) 341 :544-546），或可以從商業來源獲得。免疫測定的實例包括但不限於，蛋白質墨點法、酶聯免疫吸附測定（ELISA）、酶免疫測定（EIA）、放射免疫測定（RIA）、免疫沉澱、夾心測定、競爭性測定、免疫螢光染色和成像、免疫組織化學和螢光活化細胞分選術（FACS）。關於免疫學和免疫測定程序的綜述，參見Basic and Clinical Immunology [基礎和臨床免疫學]（Stites和Terr編輯, 第7版 1991）。此外，可以按多種構型中的任一種進行免疫測定，這些構型在酶免疫測定（Maggio編輯, 1980）以及Harlow和Lane（同上）中被廣泛綜述。關於一般免疫測定的綜述，還參見Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology [細胞生物學方法：細胞生物學中的抗體], 第37卷（Asai編輯 1993）；Basic and Clinical Immunology [基礎和臨床免疫學]（Stites和Terr編輯, 第7版 1991）。
本文提供的用於測量生物標記的表現量的任何測定和方法可以被改適或優化，以用於在自動化和半自動化系統或定點照護測定系統中使用。
可以使用本領域已知的何時方法將本文所述的每種生物標記的表現量歸一化。例如，可以將生物標記的表現量歸一化為標準標誌物的標準表現量，其可以是預先確定的，同時確定的或在從受試者獲得的樣品後確定的。標準標誌物可以在同一測定中運行，或可以是來自先前測定的已知的標準標誌物。又例如，可以將生物標記的表現量歸一化為內部對照，該內部對照可以是內部標誌物，或者是多個內部標誌物的平均表現量或總表現量。
與相應的參考表現量進行比較
可以將至少一種生物標記測得的測試表現量（例如任選地歸一化）與相應生物標記的相應參考表現量進行比較以確定差異。
如本文所使用的，至少一種生物標記（例如，本文提供的複合體）的術語「參考表現量」是指代表平均癌症或腫瘤樣品的生物標記的表現量。參考表現量可以是通常在一種或多種樣品中觀察到的或有望在與平均癌症或腫瘤樣品相當的樣本中觀察到的相應生物標記表現量的典型表現量、測量表現量、或範圍。在某些實施例中，該參考表現量是可比較的腫瘤樣品（例如，相同腫瘤類型）中生物標記表現量的平均值。在某些實施例中，該參考表現量是相同類型癌症的代表性樣品中至少一種生物標記的平均表現量。在某些實施例中，該參考表現量是平均腫瘤樣品中至少一種生物標記的代表性表現量。例如，可以認為生物標記的經驗表現量是可比較的癌症樣品或一般癌症的代表性表現量。在某些實施例中，該至少一種生物標記的參考表現量是使用與在測量測試樣品中的生物標記的表現量中使用的相同或相當的測量方法或測定而獲得的。
在某些實施例中，該參考表現量可以是預先確定的。例如，可以基於對來自相同類型的腫瘤或血液癌症的一般癌症或腫瘤樣品或組織的集合中生物標記表現量的測量來計算或概括參考表現量。又例如，參考表現量可以基於對來自一般癌症或腫瘤群體的平均癌症或腫瘤的樣品中通常觀察到的生物標記表現量的統計。在某些實施例中，該參考表現量是通過考慮多個實際腫瘤樣品和這些樣品中生物標記的實際測量表現量的算法來計算或生成的。
在某些實施例中，本文所述的方法中的比較步驟是用算法進行的。在某些實施例中，該算法是分類算法。
分類算法的實例包括，例如偏最小二乘法（Wold S等人, PLS for Multivariate Linear Modeling[用於多元線性建模的PLS], In H van de Waterbeemd (編輯), Chemometric Methods in Molecular Design[分子設計中的化學計量學方法], 第195-218頁. VCH, Weinheim）、彈性網路（Zou H等人,Journal of the Royal Statistical
Society[皇家統計學會雜誌], B輯 (2005) 67(2): 301-320）、支持向量回歸機（Vapnik V）、隨機森林（Breiman, L. (2001). Random Forests[隨機森林],Machine Learning
[機器學習] 45(1), 5-32. 還參見Breiman, L (2002), "Manual On Setting Up, Using, And Understanding Random Forests[設置、使用和瞭解隨機森林手冊] V3.1.）、神經網路（Bishop C, Neural Networks for Pattern Recognition[用於模式識別的神經網路] (1995) Oxford University Press[牛津大學出版社], 牛津）和梯度推進機（Friedman J, Greedy Function Approximation: A Gradient Boosting Machine[Greedy函數逼近：梯度推進機],Annals of Statistics
[統計學年報] (2001) 29(5), 1189-1232）。分類算法允許電腦系統識別資料集的模式，並基於這種識別模式將資料集分組為資料集所屬的具體類別。
在某些實施例中，用含有從多個樣品獲得的資料集的訓練資料組訓練分類算法，每個資料集已經被分類為對基於臨床觀察的BCL-2/BCL-Xl雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑的反應性或非反應性。每個資料集含有至少一種生物標記的測量表現量，該至少一種生物標記包括從受試者獲得的樣品的至少一種生物標記。通過將訓練特定的資料集指定為已知類別，可以確定分類的判別式。對於尚未分類的新資料集，將其分配給判別式，從而可以預測新資料集分組的結果。
在某些實施例中，該分類算法可以將每個資料集的預測結果轉換成分數。例如，分類算法可以將測試樣品的資料集的預測結果轉換為測試分數，而參考樣品的資料集轉換為參考分數。可以確定測試得分（代表測試表現量）和參考得分（代表參考表現量）之間的差異，並且其中測試得分和參考得分是由算法計算的。可以確定閾值以允許區分反應性受試者和非反應性受試者。如果差異達到閾值，則可以將該受試者分類為反應受試者。
在某些實施例中，本文提供的方法中的比較步驟涉及確定測試表現量和參考表現量之間的差異。與參考表現量的差異可以是升高或降低。取決於特定的生物標記，為了根據本文提供的方法預測對BCL-2/BCL-Xl雙重抑制劑或BCL-Xl抑制劑產生反應性，可以在一種生物標記中尋求增加，但在另一種生物標記中尋求降低。如本文所使用的，術語「升高」是指如在測試樣品中測量的生物標記的表現量高於該生物標記的相應的參考表現量。類似地，如本文所使用的「降低」是指如在樣品中測量的生物標記的表現量低於該生物標記的相應的參考表現量。如本文所使用的，術語「維持」是指沒有顯著變化。
在某些實施例中，包含BCL-2或BCL-XL的第一及/或第二複合體的表現量升高與本文提供的BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑的反應性有關。在某些實施例中，當測量兩種或更多種複合體的表現量時，將每種複合體的各自測量表現量組合以獲得至少一種生物標記的表現量。例如，將第一複合體的第一表現量與第二複合體的第二表現量組合以提供至少一種生物標記的測量表現量。
在某些實施例中，該至少一種生物標記包含BCL-XL: BIM和BCL-XL: PUMA的組合；或BCL-2: BIM和BCL-2: PUMA的組合。在某些實施例中，該至少一種生物標記包含BCL-2: BIM、BCL-2: PUMA、BCL-XL: BIM、和BCL-XL: PUMA的組合。
在某些實施例中，可以進一步考慮一種或多種另外的生物標記（例如MCL-1、BCL-XL、BCL-2）的表現量，例如以改善預後敏感性。
在某些實施例中，包含BCL-2或BCL-XL的複合體的表現量升高，伴隨著MCL-1表現量的正常至降低，與對本文提供的BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑的反應性有關。在某些實施例中，BCL-XL蛋白和BCL-2蛋白的組合表現量（即總和）的升高也可能與對本文提供的BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑的反應性有關。
在某些實施例中，包含BCL-2的複合體表現量的升高，伴隨著MCL-1表現量的正常至降低，與對本文提供的BCL-2抑制劑的反應性有關。
在某些實施例中，包含BCL-XL的複合體表現量的升高，伴隨著MCL-1表現量的正常至降低，與對本文提供的BCL-XL抑制劑的反應性有關。
在某些實施例中，將與參考表現量的差異與閾值做進一步比較。在某些實施例中，可以通過統計方法設置閾值，使得如果與參考表現量的差異達到閾值，則可以認為這種差異在統計學上是顯著的。有用的統計分析方法描述於L. D. Fisher和G. vanBelle, Biostatistics: A Methodology for the Health Sciences [生物統計學：健康科學方法論]（Wiley-Interscience[威利國際科學出版社], 紐約州, 1993）中。可以基於信賴度（「p」）值確定統計學顯著性，p值可以使用未配對的2尾t檢驗來計算。通常可以使用例如小於或等於0.1、0.05、0.025或0.01的p值來指示統計學顯著性。信賴區間和p值可以通過本領域熟知的方法來確定。參見，例如，Dowdy和Wearden, Statistics for Research [研究統計], John Wiley & Sons[約翰·威利父子出版社], 紐約, 1983。
在某些實施例中，當BCL-2: BIM、BCL-2: PUMA、BCL-XL: BIM、和BCL-XL: PUMA的組合的測試表現量比參考表現量高至少2倍時，達到該閾值。
在某些實施例中，可以進一步確定另外的生物標記如MCL-1、BCL-XL或BCL-2的表現量的閾值。在某些實施例中，當MCL-1的測試表現量不超過MCL-1的參考表現量的100%時，達到閾值。
在某些實施例中，BCL-XL表現量的閾值高於BCL-XL的參考表現量至少50%、至少80%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少150%、至少200%或至少250%。例如，BCL-2表現量的閾值高於BCL-2的參考表現量至少50%、至少80%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少150%、至少200%、或至少250%。
預測反應性、指導治療的方法
為了鑒定及/或選擇患有或懷疑患有癌症的受試者用於用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑治療，可以在治療前測量包含含有BCL-2或BCL-XL的複合體的至少一種生物標記的表現量並將其與參考表現量進行比較。如果該差異達到閾值，然後確定該受試者可能對用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-2抑制劑或BCL-XL抑制劑的治療產生反應。在某些實施例中，向鑒定或選擇的反應性受試者施用治療有效量的本文提供的BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-2抑制劑或BCL-XL抑制劑。
在某些實施例中，如果該差異未達到閾值，那麼該受試者被鑒定為不太可能對用BCL-2/BCL-xL雙重抑制劑的治療產生反應。可以建議這些經鑒定的受試者進行另外的測試以確認結論，或可替代地可以建議不用本文提供的BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-2抑制劑或BCL-XL抑制劑進行治療。
在另一方面，本文提供的方法用於在受試者中監測治療功效的方法，該受試者患有癌症，並在治療期內已經用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑進行了治療。在某些實施例中，可以在治療期之前測量至少一種生物標記的表現量以建立生物標記的基線表現量。在一定的治療期後，可以在治療後從受試者新獲得的測試樣品中測量至少一種生物標記的表現量（「治療後表現量」），以及確定與參考表現量的差異（「治療後差異」）。可以確定至少一種生物標記的表現量的治療後變化。如果該治療後變化達到閾值，那麼該受試者被鑒定為仍對用BCL-2/BCL-xL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑的治療產生反應。可替代地，如果該治療後變化未達到閾值，那麼該受試者被鑒定為對本文提供的BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑具有降低的反應性或不再產生反應。
在某些實施例中，用於治療受試者的癌症的方法包括用BCL-2/BCL-xL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑處理從受試者獲得的樣品中的細胞，並確定樣品中至少一種生物標記的治療後變化。這種治療後變化對於鑒定及/或選擇受試者進行治療可能是有用的。在某些實施例中，一種用於鑒定及/或選擇患有癌症的受試者進行用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL或BCL-2抑制劑的治療的方法，該方法包括：(a) 在包含獲得自受試者的細胞的測試樣品中，測量包含第一複合體的至少一種生物標記的基線表現量，該第一複合體包含BCL-XL或BCL-2蛋白；(b) 用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑處理測試樣品，(c) 測量經處理的測試樣品中至少一種生物標記的治療後表現量；(d) 將該治療後表現量與該至少一種生物標記的基線表現量進行比較，以確定該至少一種生物標記的表現量的治療後變化；以及 (e) 當該治療後變化達到閾值時，確定該受試者可能對用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑的治療產生反應。
在某些實施例中，該用於在有需要的受試者中治療癌症的方法包括：(a) 在包含獲得自受試者的細胞的測試樣品中，測量包含第一複合體的至少一種生物標記的基線表現量，該第一複合體包含BCL-XL或BCL-2蛋白；(b) 用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑處理測試樣品，(c) 測量經處理的測試樣品中至少一種生物標記的治療後表現量；(d) 將該治療後表現量與該至少一種生物標記的基線表現量進行比較，以確定該至少一種生物標記的表現量的治療後變化；以及 (e) 當該治療後變化達到閾值時，向該受試者施用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑。
在某些實施例中，當治療後變化是降低至少2倍時，達到閾值。
BCL-2/BCL-CL
雙重抑制劑或
BCL-XL
或
BCL-2
抑制劑
在某些實施例中，本文所述的BCL-2/BCL-xL雙重抑制劑或BCL-XL或BCL-2抑制劑是具有結構式 (I)、(II) 或 (III)的化合物：
其中A1
環是
或
；
X11
是取代的或未取代的，選自下組，該組由以下組成：亞烷基、亞烯基、環亞烷基、環亞烯基和雜環亞烷基；
Y11
選自下組，該組由以下組成：(CH2
)n
-N(R11a
)和
；
Q11
選自下組，該組由以下組成：O、O(CH2
)1-3
、NR11c
、NR11c
(C1-3
亞烷基)、OC(=O)(C1 - 3
亞烷基)、C(=O)O、C(=O)O(C1-3
亞烷基)、NHC(=O)(C1-3
亞烷基)、C(=O)NH和C(=O)NH(C1-3
亞烷基)；
Z11
是O或NR11c
R11
和R12
獨立地選自下組，該組由以下組成：H、CN、NO2
、鹵素、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環烷基、OR1
'、SR1
'、NR1
'R1
''、COR1
'、CO2
R1
'、OCOR1
'、CONR1
'R1
''、CONR1
'SO2
R1
''、NR1
''COR1
''、NR1
'CONR1
''R1
'''、NR1
'C=SNR1
''R1
'''、NR1
'SO2
R1
''、SO2
R1
'、和SO2
NR1
'R1
''；
R13
選自下組，該組由以下組成：H、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環烷基、OR1
'、NR1
'R1
''、OCOR1
'、CO2
R1
'、COR1
'、CONR1
'R1
''、CONR1
'SO2
R1
'''、C1-3
亞烷基CH(OH)CH2
OH、SO2
R1
'、和SO2
NR1
'R1
''；
R1
'、R1
''、和R1
'''獨立地是H、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基、C1-3亞烷基雜環烷基、或雜環烷基；
R1
'和R1
''、或R1
''和R1
'''可以與它們所鍵合的原子一起形成3至7元環；
R14
是氫、鹵代、C1-3
烷基、CF3
或CN；
R15
是氫、鹵代、C1-3
烷基、取代的C1-3
烷基、羥基烷基、烷氧基或取代的烷氧基；
R16
選自下組，該組由以下組成：H、CN、NO2
、鹵素、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環烷基、OR1
'、SR1
'、NR1
'R1
''、CO2
R1
'、OCOR1
'、CONR1
'R1
''、CONR1
''SO2
R1
''、NR1
'COR1
''、NR1
'CONR1
''R1
'''、NR1
'C=SNR1
''R1
'''、NR1
'SO2
R1
''、SO2
R1
'、和SO2
NR1
'R1
''；
R17
是取代的或未取代的，選自下組，該組由以下組成：氫、烷基、烯基、(CH2
)0-3
環烷基、(CH2
)0-3
環烯基、(CH2
)0-3
雜環烷基、(CH2
)0-3
芳基和(CH2
)0-3
雜芳基；
R18
選自下組，該組由以下組成：氫、鹵代、NO2
、CN、CF3
SO2
和CF3
；
R11a
選自下組，該組由以下組成：氫、烷基、雜烷基、烯基、羥基烷基、烷氧基、取代的烷氧基、環烷基、環烯基和雜環烷基；
R11b
是氫或烷基；
R11c
選自下組，該組由以下組成：氫、烷基、取代的烷基、羥基烷基、烷氧基和取代的烷氧基；並且
n1
、r1
、和s1
獨立地是1、2、3、4、5、或6；
或式(I)、(II) 或 (III)的藥學上可接受的鹽。
在某些實施例中，Y11是
，n是1-3的整數，R11b
是氫或C1-3
烷基，Q是O、O(CH2
)1-3
、C(=O)O(CH2
)1-3
、OC(=O)(CH2
)1-3
或C(=O)O(C3
H7
)1-3
。
在某些實施例中，本文所述的具有結構式 (I)、(II) 或 (III) 的BCL-2/BCL-xL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑選自下組，該組由以下組成：
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
和
。
在某些實施例中，該BCL-2/BCL-xL雙重抑制劑是(R)-2-(1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-異丙基-5-甲基-4-(甲基磺醯基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)呱嗪-1-基)苯基) 胺磺醯基)-2-(三氟甲基磺醯基)苯基胺基)-4-(苯硫基)丁基)呱啶-4-羰基氧基)乙基膦酸 或其藥學上可接受的鹽（在本文中還被稱為「化合物A」）。
化合物A是以非常高親和力、以分別為1.6 nM、4.4 nM和9.3 nM的IC50
值與BCL-2、BCL-xL和BCL-w蛋白質結合的小分子化合物。化合物A對Mcl-1蛋白質具有弱親和力。化合物A在癌細胞系的一個亞組中顯示出具有奈莫耳(nmol)效價的有效的體外細胞生長抑制活性。從機理上講，化合物A有效誘導胱天蛋白酶-3和PARP（癌細胞和異種移植腫瘤組織中人類癌症的細胞凋亡的生化標誌物）的切割。
在某些實施例中，本文所述的BCL-2/BCL-xL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑是具有結構式 (IV) 的化合物：
其中，
R21
是SO2
R2
'；
R22
是烷基，較佳為C1-C4烷基，更佳為甲基、丙基或異丙基；
R23
是烷基，較佳為C1-C4烷基，更佳為甲基、丙基或異丙基；
R24
是鹵素，較佳為氟、氯；
R25
是鹵素，較佳為氟、氯；
R26
選自H、鹵素、烷基，較佳為氟、氯、C1-C4烷基，更佳為甲基、丙基、異丙基；
R21b
是H或烷基，較佳為C1-C4烷基，更佳為甲基、丙基或異丙基；
n2
、r2
和s2
獨立地是1、2、3、4、5或6，更佳地r2
和s2
都是2，並且n2
是3、4或5，更佳地，n2
、r2
和s2
都是2；並且
R2
’是烷基，較佳為C1-C4烷基，更佳為甲基、丙基或異丙基。
在某些實施例中，本文所述的具有結構式 (IV) 的BCL-2/BCL-xL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑選自下組，該組由以下組成：
、
、和
。
在某些實施例中，該BCL-2/BCL-xL雙重抑制劑是(R)-1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-異丙基-5-甲基-4-(甲基磺醯基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)呱嗪-1-基)苯基) 胺磺醯基)-2-(三氟甲基磺醯基)苯基胺基)-4-(苯硫基)丁基)呱啶-4-甲酸或其藥學上可接受的鹽（在本文中還被稱為「化合物B」）。
在某些實施例中，本文所述的BCL-2/BCL-xL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑具有結構式 (V)：
V
，
或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中：
A3
選自下組，該組由以下組成：
E3
是碳原子，並且
是雙鍵；或
E3
是-C(H)-，並且是單鍵；或
E3
是氮原子，並且是單鍵；
X31
、X32
和X33
各自獨立地選自下組，該組由以下組成：-CR38
= 和-N=；
R31a
和R31b
與它們所附接的碳原子一起形成任選取代的3元、4元或5元環烷基；或
R31a
和R31b
與它們所附接的碳原子一起形成任選取代的4元或5元雜環；
R32
選自下組，該組由以下組成：-NO2
、-SO2
CH3
和-SO2
CF3
；
R32a
選自下組，該組由以下組成：氫和鹵素；
R33
選自下組，該組由以下組成：氫、-CN、-C≡CH和-N(R34a
)(R34b
)；
R34a
選自下組，該組由以下組成：任選取代的C1-6
烷基、任選取代的C3-6
環烷基、雜環、雜烷基、(環烷基)烷基和(雜環)烷基；
R34b
選自下組，該組由以下組成：氫和C1-4
烷基；
R35
選自下組，該組由以下組成：任選取代的C1-6
烷基、雜環、雜烷基、(環烷基)烷基和(雜環)烷基；
R36a
、R36c
、R36e
、R36f
和R36g
各自獨立地選自下組，該組由以下組成：氫、任選取代的C1-6
烷基、任選取代的C3 - 6
環烷基、任選取代的芳基、任選取代的雜芳基、雜環、雜烷基、(環烷基)烷基和(雜環)烷基；
R36b
和R36d
各自獨立地選自下組，該組由以下組成：氫、C1-4
烷基和鹵素；
R37
選自下組，該組由以下組成：任選取代的C1-6
烷基、雜環、雜烷基、(環烷基)烷基和(雜環)烷基；並且
R38
選自下組，該組由以下組成：氫和鹵素。
在某些實施例中，本文所述的具有結構式 (V) 的BCL-2/BCL-xL雙重抑制劑或BCL-XL抑制劑或BCL-2抑制劑選自下組，該組由以下組成：
。
在某些實施例中，該BCL-xL抑制劑是(S)-N-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基) 胺基)-3-硝基苯基)磺醯基)-2-((1H-吡咯並[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)呱嗪-1-基)苯甲醯胺或其藥學上可接受的鹽（在本文中還被稱為「化合物C」）。
試劑盒
在另一方面，本揭露進一步提供了在如本文所述的方法中使用的一種試劑盒，用於測量本文提供的該至少一種生物標記的表現量。在某些實施例中，該試劑盒包含本文提供的試劑，例如引子、探針及/或抗體或微陣列中的一種或多種。引子、探針及/或抗體可以被或不可以被可檢測地標記。在某些實施例中，該試劑盒可以進一步包含進行本文所述的方法的其他試劑。在此類應用中，試劑盒可以包含以下的任一者或全部：合適的緩衝液、用於分離核酸的試劑、用於擴增核酸的試劑（例如，聚合酶、dNTP混合物）、用於雜交核酸的試劑、用於對核酸進行定序的試劑、用於定量核酸的試劑（例如，嵌入劑、檢測探針）、用於分離蛋白質的試劑、以及用於檢測蛋白質的試劑（例如，第二抗體）。典型地，在載體或分隔容器中含有可用於本文提供的任何方法中的試劑。載體可以是呈例如袋、盒、管、架子形式的容器或支持物，並且任選地是分隔的。
在一個實施例中，該試劑盒包含用於測量複合體表現量的一種或多種試劑。在某些實施例中，該試劑包含可以特異性結合複合體中的BCL-XL或BCL-2蛋白的第一抗體，和可以特異性結合該複合體中的僅BH3蛋白或含BH3結構域蛋白的第二抗體。在某些實施例中，該第一抗體及/或第二抗體被可檢測地標記。在某些實施例中，該第一抗體與第一可檢測標記綴合，第二抗體與第二可檢測標記綴合，其中當緊密靠近時，第一可檢測標記和第二可檢測標記可允許產生可檢測訊號。在某些實施例中，該第一可檢測標記和第二可檢測標記兩者均包含寡核苷酸。
在某些實施例中，該第一抗體與第一可檢測標記綴合，第二抗體與第二可檢測標記綴合，其中當緊密靠近時，第一可檢測標記和第二可檢測標記可允許產生可檢測訊號。在某些實施例中，該第一可檢測標記和第二可檢測標記包含一對寡核苷酸。當第一抗體和第二抗體非常接近時，一對寡核苷酸能夠相互作用以使得能夠進行酶促連接以提供連接的產物，該產物可以被擴增以允許檢測。
在某些實施例中，第一抗體及/或第二抗體中的一個被可檢測地標記，並且另一個能夠被捕獲。
在某些實施例中，本文揭露的試劑盒進一步包含用於測量MCL-1表現量的第二試劑及/或用於測量BCL-XL或BCL-2表現量的第三試劑。在某些實施例中，該第二試劑包含能夠與MCL-1的多核苷酸雜交的寡核苷酸、或能夠與MCL-1的蛋白特異性結合的抗體。在某些實施例中，該第三試劑包含能夠與BCL-XL或BCL-2的多核苷酸雜交的寡核苷酸、或能夠與BCL-XL或BCL-2的蛋白特異性結合的抗體。
在某些實施例中，該試劑盒可以進一步包含標準陰性對照及/或標準陽性對照。
另外，試劑盒可包括指導材料，這些指導材料包含用於實施本文提供的方法的指導（即方案）。雖然指導材料典型地包含書面材料或印刷材料，但它們不限於此。
在某些實施例中，該試劑盒可進一步包含儲存在電腦可讀介質上的電腦程式產品。當電腦程式產品由電腦執行時，它進行以下步驟：將該至少一種生物標記的表現量與該至少一種生物標記的對應的參考表現量進行比較，以確定與參考表現量的差異。任何能夠儲存此類電腦可執行指令並將其傳送給最終使用者的介質都被本說明所考慮。這樣的介質包括但不限於電子儲存介質（例如，磁碟、磁帶、磁帶盒（cartridge）、晶片）、光學介質（例如，CD ROM）等。此類介質可以包括提供此類指導材料的網際網路網站的網址。
也可以使用載波訊號對電腦程式進行編碼和傳輸，這些載波訊號被改適用於經由符合包括網際網路的各種協議的有線網路、光學網路及/或無線網路進行傳輸。因此，可以使用此類程式編碼的資料訊號來創建根據本發明的實施例的電腦可讀介質。可以將程式代碼編碼的電腦可讀介質與兼容設備打包在一起，或者與其他設備分開提供（例如，通過網際網路下載）。任何這樣的電腦可讀介質可以駐留在單個電腦產品（例如，硬碟驅動器、CD或整個電腦系統）上或內部，並且可以存在於系統或網路內的不同電腦產品上或內部。
在一些實施例中，本揭露提供了附接到固體支持物（例如陣列載玻片或晶片）上的寡核苷酸探針，例如，如描述於Bowtell和Sambrook編輯的DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual
[DNA微陣列：分子克隆手冊](2003) Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港實驗室出版社]中。此類裝置的構建在本領域中是熟知的，例如如在以下美國專利和專利公開中所述：美國專利號5,837,832；PCT申請W0 95/11995；美國專利號5,807,522；美國專利號7,157,229、7,083,975、6,444,175、6,375,903、6,315,958、6,295,153和5,143,854、2007/0037274、2007/0140906、2004/0126757、2004/0110212、2004/0110211、2003/0143550、2003/0003032和2002/0041420。還在以下參考文獻中綜述了核酸陣列：Biotechnol Annu Rev
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[生物化學工程/生物技術進展](2002) 77:21-42。
提供以下實例以更好地說明所要求保護的發明，並且不應將其解釋為限制本發明的範圍。下文描述的所有特定的組合物、材料和方法（全部或部分）均落入本發明的範圍內。這些特定的組合物、材料和方法不旨在限制本發明，而僅僅是為了說明落入本發明的範圍內的特定實施例。本領域通常知識者可以開發等同的組合物、材料和方法，而無需使用創新能力，並且不脫離本發明的範圍。應理解的是，可以在本文描述的程序中做出許多變化，同時仍然保持在本發明的範圍內。發明人的意圖是，此類變化包括在本發明的範圍內。
實例1
此實例顯示BCL-XL:BIM和BCL-XL:PUMA複合體在源自於患者的異種移植（PDX）模型中占主導地位，而BCL-XL:BIM和BCL-XL: PUMA複合體的減少表明標的活性，因此是BCL-2和BCL-XL雙重抑制劑的藥效學標記和藥物功效的指標。
BCL-2已被認為是癌症藥物開發的前十大標靶之一。BCL-2和其他抗凋亡蛋白（包括BCL-XL）的抑制作用有助於恢復細胞凋亡途徑並觸發癌細胞死亡。針對標靶實體瘤中多種多樣的BCL-2家族蛋白依賴性，本發明人開發了一種有效的BCL-2和BCL-XL雙重抑制劑，稱為化合物A，目前正處於針對實體瘤的1期試驗中。為了促進臨床發展，本發明人已經在來源於實體瘤患者的PDX模型中進行了試驗，並進行了藥效學（PD）和生物標記研究。
選擇PDX模型（包括8種胃癌和3種食道癌）用於BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑化合物A的試驗。每週兩次持續三周用100 mg/kg的劑量方案治療模型，然後收穫腫瘤組織，用MSD方法進行複合體分析（在圖中顯示）。化合物A處理的藥效學（PD）和生物標記研究通過MSD和蛋白質墨點（WB）測定進行。具體地，用樣品進行蛋白質提取，通過MSD方法測量蛋白質複合體的表現量，並且通過蛋白質墨點法測量蛋白質的表現量。計算每只動物的TGI。
圖1A-1C說明了在胃癌和食道癌PDS模型中進行的化合物A的治療功效的體內評估的概述。圖1A和1B顯示了PDX模型的摘要以及研究過程和結果。圖1C顯示了在使用化合物A治療之前，PDX模型（實體瘤）和Toledo細胞系（血液學癌症）中不同複合體的基線表現量。
圖2A和2B顯示了用化合物A處理後，PDX模型中BCL-XL: BIM複合體的表現量下降，表明化合物A破壞了PDX模型中的BCL-XL:BIM複合體。
圖3顯示基線BCL-2/BCL-xL複合體表現量與化合物A觸發的腫瘤生長抑制相關，可用於指導患者選擇。
圖3A是包括BCL-XL: BIM和BCL-XL: PUMA的BCL-XL複合體。將基線複合體表現量歸一化為同一組的平均表現量，並用腫瘤生長抑制（TGI）作圖。圖3B顯示了包括BCL-2: BIM和BCL-2: PUMA在內的BCL-2複合體的基線表現量與TGI的相關性。BCL-2複合體和BCL-XL複合體（包括BCL-XL: BIM和BCL-XL: PUMA、BCL-2: BIM和BCL-2: PUMA）的基線表現量的相關性如圖3C所示。雖然單獨的BCL-XL或BCL-2基線複合體顯示出與化合物A觸發腫瘤生長抑制相關的趨勢，但預測兩種複合體的總和最佳，r = 0.775，P = 0.0051（圖3C）。除BCL-XL/BCL-2複合體外，MCL-1表現量也會影響腫瘤對化合物A的反應，如圖3D和圖4中的表所示。較高的MCL-1表現量（在化合物A處理之前或之後）導致更多的抗性表型。
圖4A（圖像）和4B（定量）顯示了在用化合物A處理之前和之後，PDX模型的細胞裂解液的蛋白質墨點結果。進一步的統計分析表明，化合物A會顯著或呈趨勢地增加BCL-2和MCL-1的抗死亡蛋白表現量（圖4C），而不是增加促死亡蛋白BIM或PUMA（圖4D）。圖4E是顯示處理後相對蛋白質表達表現量變化的圖。
圖5顯示BCL-2/BCL-xL複合體表現量的變化與化合物A觸發的腫瘤生長抑制相關，其可用於預測患者反應和預後。對PDX腫瘤樣品進行不同複合體的MSD測定。分析了包括BCL-XL: BIM和 BCL-XL: PUMA的BCL-XL複合體的基線表現量和治療後表現量。將BCL-XL複合體的變化（即Δ，基線與治療組之間的差異）歸一化為同一組的平均Δ，並以腫瘤生長抑制（TGI）作圖。圖5中顯示的是BCL-XL複合體的變化越大，TGI越好。但是，較高的MCL-1表現量（藍點，在圖3D和圖4的表中也有顯示）也會影響對化合物A的總體敏感性。
實例2
諸位發明人進一步檢查了用於細胞系測定的化合物A的活性代謝產物化合物B對BCL-2和BCL-XL的結合親和力是否相似，以及化合物A（或化合物B）是否與ABT-737或者ABT-263（BCL-2/BCL-XL抑制劑的參考化合物）不同。
選擇Toledo（彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞系，ATCC CRL-2631）和RS4;11（急性淋巴細胞性白血病細胞系）進行該研究。用圖6A和7A（Toledo）和6B和7B（RS4;11；對每種細胞系使用相同濃度的化合物B和ABT-737以及ABT-263）中指定的化合物處理細胞24小時，並收穫細胞以進行複合體分析。按照先前建立的MSD高級ELISA方法分析BCL-2: BIM和BCL-XL: BIM複合體兩者。
如圖6A和6B所示，在Toledo和RS4;11細胞系中，相比於BCL-2:BIM複合體，化合物B更有效地破壞BCL-XL:BIM。相比之下，ABT-737也是BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑（但在結構上與化合物B不同），但在Toledo細胞中對BCL-XL:BIM複合體的破壞卻比化合物B少得多（參見圖6A），並且在RS4細胞中幾乎沒有破壞BCL-xL:BIM複合體（見圖6B）。
類似的，如圖7A和7B所示，
在Toledo和RS4;11細胞系中，相比於BCL-2:BIM複合體，化合物B更有效地破壞BCL-XL:BIM複合體。相比之下，ABT-263也是BCL-2 / BCL-XL雙重抑制劑（但在結構上與化合物B不同），但在Toledo細胞和RS4細胞中對BCL-XL：BIM複合體的破壞卻比化合物B少得多（參見圖7A和圖7B）。與之相反，ABT-263顯示能夠減少BCL-2：BIM複合體。
根據圖1C的結果，其中實體瘤細胞的BCL-XL:BIM複合體表現量要比血液癌症細胞（例如Toledo細胞）高得多，因此破壞BCL-XL:BIM複合體對於治療實體腫瘤很重要。這些血細胞系結果與實例1中所示的胃/食道癌PDX試驗的複合體分析一致，證實化合物A（PDX中）或化合物B（細胞系中）相較於BCL-2複合體更好地標靶BCL-XL，因此其不同於參考化合物ABT-737或者ABT-263。該結果還表明，BCL-XL:BIM複合體的表現量可以作為預測對BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑（例如化合物A和化合物B）的反應性的生物標記。
儘管已經參考特定的實施例（其中的一些是較佳的實施例）具體示出並描述了本揭露，但是本領域通常知識者應當理解，在不脫離如本文揭露的本揭露的精神和範圍的情況下，可以在形式和細節上進行各種改變。
以下附圖構成本說明書的一部分，並且被包括在內以進一步說明本揭露的某些方面。通過參考這些附圖中的一個或多個附圖，結合本文中呈現的具體實施例的詳細描述，可以更好地理解本揭露內容。
圖 1A
至1C
說明了在11種實體瘤模型上進行PDX試驗的總結（圖1A），用於藥物效應動力學（藥效學，Pharmacodynamics，PD）和生物標記研究的PDX試驗的程序（圖1B）以及通過MSD測定在實體瘤PDX樣品和血液學癌細胞系（Toledo）中的複合體（即BCL-2:BIM、BCL-xL:BIM、BCL-2: PUMA、BCL-xL: PUMA、MCL-1:BIM、MCL-1: PUMA）的基線表現量（圖1C）。「BCL-XLamp
」是指樣品具有與平均表現量相當的BCL-XL基因擴增表現量，「MCL-XLnor
」是指樣品具有MCL-1基因的正常表現量。
圖 2A
和2B
說明了通過MSD測定溶媒對照組和化合物A組中BCL-xL:BIM複合體表現量的變化。
圖 3A
至3C
說明了腫瘤生長抑制（TGI）與化合物A和以下蛋白質複合體的基線表現量的相關性：BCL-XL: BIM和BCL-XL: PUMA（圖3A）或BCL-2: BIM和BCL-2: PUMA（圖3B），或四個複合體：BCL-XL: BIM、BCL-XL:PUMA、BCL-2:BIM和BCL-2:PUMA這些基線的組合（圖3C）。
圖 3D
說明了TGI與BCL-XL: BIM、BCL-XL: PUMA、BCL-2: BIM和BCL-2: PUMA的組合表現量的相關性，TGI和MCL-1蛋白基線表現量與治療後變化的相關性。
圖 4A 和 4B
說明了通過蛋白質墨點測定在PDX樣品中的凋亡蛋白表達表現量（圖4A中的圖）和定量（4B）。
圖 4C 和 4D
說明了通過WB測定在溶媒對照和化合物A組中凋亡（促死亡和抗死亡）蛋白表達的相對蛋白表現量，以及示於圖 4E
中的定量。
圖 5
說明了TGI與BCL-xL: BIM和BCL-xL: PUMA，兩種主要複合體的治療後變化的相關性。
圖 6A 和 6B
說明了用化合物B或ABT-737處理的Toledo（6A）和RS4;11（6B）細胞中BCL-2:BIM和BCL-XL:BIM複合體的MSD高級ELISA分析結果。
圖 7A
和7B
說明了用化合物B或ABT-263處理的Toledo（7A）和RS4;11（7B）細胞中BCL-2:BIM和BCL-XL:BIM複合體的MSD高級ELISA分析結果。
圖 8
顯示如本文提供的生物標記的示例性序列，包括本發明揭露的SEQ ID 編號的關鍵BCL-2家族蛋白質（主要同種型）的mRNA和蛋白（胺基酸）序列。
<110> 大陸商蘇州亞盛藥業有限公司 香港商亞盛醫藥集團(香港)有限公司
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Claims (18)
- 一種鑒定及/或選擇患有癌症的受試者的方法，該方法包括：a)在包含獲得自該受試者的細胞的測試樣品中，測量包含第一複合體的至少一種生物標記的測試表現量，其中該第一複合體包含與僅BH3蛋白複合的BCL-XL蛋白；該僅BH3蛋白為BIM；b)將該至少一種生物標記的測試表現量與該至少一種生物標記的對應的參考表現量進行比較，以確定差異，其中該參考表現量是相同類型癌症的代表性樣品中至少一種生物標記的平均表現量或其中該參考表現量是相同類型癌症腫瘤樣品中生物標記的經驗表現量；以及c)當該差異達到閾值時，確定該受試者可能對施用BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑產生反應；其中該癌症是實體瘤，其中該實體瘤是胃癌、食道癌；或其中該癌症是血液癌症，其中該血液癌症是急性淋巴母細胞性白血病(ALL)或淋巴瘤；該BCL-2/BCL-XL雙重抑制劑為：
- 如請求項1所述的方法，其中該至少一種生物標記進一步包含第二複合體，其中該第二複合體包含與僅BH3蛋白複合的BCL-XL蛋白；該僅BH3蛋白為PUMA。
- 如請求項2中所述的方法，其中該至少一種生物標記的表現量包含該第一複合體的表現量和該第二複合體的表現量的組合，其中通過蛋白質間相互作用測定測量該第一及第二複合體的表現量，其中該蛋白質間相互作用測定是基於免疫測定或鄰近測定，其中該蛋白質間相互作用測定是介觀尺度探索(MSD)高級酶聯免疫吸附測定(MSD-ELISA)、標準複合體ELSIA、鄰位連接技術、共免疫沉澱、免疫墨點測定或交聯測定。
- 如請求項2所述的方法，其中通過使用與該複合體特異性結合的抗體來測量該第一及第二複合體的表現量。
- 如請求項1所述的方法，其中該第一複合體是該樣品中的優勢複合體。
- 如請求項2所述的方法，其中該第一及第二複合體是該樣品中的優勢複合體。
- 如請求項2所述的方法，其中該至少一種生物標記包含BCL-XL：BIM和BCL-XL：PUMA。
- 如請求項2所述的方法，其中該至少一種生物標記包含BCL-2：BIM和BCL-2：PUMA。
- 如請求項8所述的方法，其中該至少一種生物標記包含BCL-2：BIM、BCL-2：PUMA、BCL-XL：BIM和BCL-XL：PUMA的組合。
- 如請求項9所述的方法，其中當BCL-2：BIM、BCL-2：PUMA、BCL-XL：BIM和BCL-XL：PUMA的組合的測試表現量比參考表現量高至少2倍時，達到閾值。
- 如請求項2所述的方法，其中該至少一種生物標記進一步包含MCL-1。
- 如請求項11所述的方法，其中當MCL-1的測試表現量不超過MCL-1的參考表現量的100%時，達到閾值。
- 如請求項1-12中任一項所述的方法，其中該比較是用算法進行的，其中該算法是分類算法，其中該差異包括該測試表現量的測試得分和該參考表現量的參考得分之間的差異，並且其中該測試得分和該參考得分是由該算法計算的。
- 如請求項1-12中任一項所述的方法，其中該測試樣品是體液樣品或組織樣品。
- 一種用於在如請求項1-14中任一項所述的方法中使用的試劑盒，該試劑盒包含用於測量該至少一種生物標記的表現量的至少一種試劑，其中該至少一種試劑包含第一試劑，該第一試劑包含與該複合體特異性結合的第一抗體。
- 如請求項15所述的試劑盒，其中該至少一種試劑進一步包含第二試劑，該第二試劑包含與該複合體中的僅BH3蛋白特異性結合的第二抗體，其中該第一抗體及/或該第二抗體被可檢測地標記，及/或其中該第一抗體及/或該第二抗體中的一個被可檢測地標記，並且另一個能夠被捕獲。
- 如請求項15或16所述的試劑盒，其中該至少一種試劑進一步包含第三試劑，該第三試劑包含能夠與MCL-1的多核苷酸雜交的第一寡核苷酸、或能夠與MCL-1的蛋白特異性結合的第三抗體。
- 一種用於測量包含複合體的至少一種生物標記的表現量的至少一種試劑在生產用於進行如請求項1-14中任一項所述的方法的試劑盒中的用途。
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