KR20200112069A - 골 질환의 예방 또는 치료를 위한 Ｊｍｊｄ２ｂ 억제제의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 골 질환의 예방 또는 치료를 위한 Jmjd2b 억제제의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 Jmjd2b(histone demethylase Jumonji domain-containing protein 2B)의 억제제를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, Jmjd2b 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는 골질환 진단용 조성물, 진단키트, 골질환 진단을 위한 정보 제공 방법 및 골질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 골 질환의 예방 또는 치료를 위한 Jmjd2b 억제제의 용도에 관한 것이다.
골(bone)은 근육과 연합되어 있는 석회화된 결체조직으로서 표면은 두껍고 단단한 석회화 조직으로 신체균형을 이루는 지주역할을 하며 장기를 보호한다. 골의 안쪽은 골수조직으로 칼슘대사의 중심이 되는 부위이다. 골은 콜라겐(collagen), 오스테오칼신(osteocalcin), 오스테오넥틴(osteonectin) 등 유기질(organic substance)과 칼슘, 인, 불소 등의 무기질(inorganic substance) 및 수분으로 구성되어 있다. 생체에서는 항상 골형성(bone formation)과 골흡수(bone resorption)가 일어나고 있다. 골형성은 소량의 부갑상선 호르몬이나 안드로겐, 에스트로겐, 불소, 인 등에 의하여 촉진되며, 골흡수는 물리적 감압, 무중력상태, 다량의 부갑상선 호르몬, 부신피질 스테로이드 등에 의하여 촉진된다. 따라서 골대사에는 이들 사이의 균형(balance)이 중요하다. 그러므로 골의 항상성은 파골세포(osteoclast)에 의한 골 흡수(bone resoprtion)와 조골세포(osteoblast)에 의한 골 형성(bone formation)의 대등한 작용에 의한 리모델링 과정(bone remodeling)이 지속적으로 조절되어 유지된다.
뼈의 재형성, 즉 리모델링 과정에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있고, 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)이다. 그러나 이들 두 세포의 불균형, 특히 파골세포의 과도한 형성이나 활성화에 의한 지나친 뼈의 분해는 골다공증을 포함한 각종 골 질환의 주요 원인이 된다.
특히 파골세포 형성(osteoclastogenesis)은 M-CSF(machrophage colony-stimulating factor)와 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand)과 같은 사이토카인(cytokine)의 자극에 의해 파골 전구세포들이 서로 융합하여 다핵을 가진 파골세포가 형성되는 과정이다. 성숙된 파골세포들은 세포 골격화 과정을 일으키며, 세포 골격화는 파골세포가 뼈에 부착함과 동시에 세포 외 공간과 뼈를 흡수하는 공간을 구분하기 위해 파골세포의 액틴(actin)이 하나의 큰 고리(ring)으로 조직화되어 뼈를 흡수하게 되는 과정을 말한다.
따라서, 파골세포의 분화나 성숙 또는 활성을 저해함으로써 뼈의 흡수 작용을 억제하는 것은 다양한 골 질환 치료제 개발의 효과적인 방법이 될 수 있다.
현재까지 여러 물질이 골 질환 치료제로 개발되었다. 그 중 골다공증 치료제로 가장 많이 사용되는 에스트로겐은 그 실제적인 효능이 아직 검증되지 않은 상태이며 생애 동안 계속 복용해야 하는 단점이 있고, 장기간 투여하는 경우 유방암이나 자궁암이 증가하는 부작용이 있다. 비스포스포네이트 계열의 약물인 알렌드로네이트는 그 효능이 명확하지 않고 소화관에서의 흡수가 더디며 위장과 식도점막에 염증을 유발하는 문제가 있다. 칼슘 제제는 부작용이 적으면서도 효과가 우수한 것으로 알려져 있지만 치료제라기보다는 예방제에 해당한다. 또한, 칼시토닌과 같은 비타민 D 제제가 알려져 있으나 아직 효능 및 부작용에 대한 연구가 충분히 되어있지 않은 상태이다.
따라서 부작용이 적고 효과가 우수한 새로운 골 질환 치료제의 개발이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 새로운 골질환의 치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, 파골세포 분화가 과도하게 진행될수록 Jmjd2b 유전자 및 단백질의 발현이 증가됨을 최초로 확인함으로써, Jmjd2b와 파골세포 분화와의 관련성 및 Jmjd2b 억제를 통한 파골세포의 과도한 분화 억제 작용을 확인하였다. 따라서 Jmjd2b의 발현 또는 활성 억제가 파골세포의 과분화에 의한 골질환을 치료할 수 있는 새로운 방법임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 Jmjd2b(histone demethylase Jumonji domain-containing protein 2B)의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Jmjd2b(histone demethylase Jumonji domain-containing protein 2B) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 골질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 골질환 진단용 조성물을 포함하는 골질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 골질환의 발병을 예측 또는 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 골질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 Jmjd2b(histone demethylase Jumonji domain-containing protein 2B)의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Jmjd2b의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 Jmjd2b 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 Jmjd2b의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질로서, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, 화합물 및 펩타이드로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골질환은 파골세포의 과분화에 기인한 골다공증, 파세트 골질환, 구루병, 골연화증, 신부전 환자의 신성골이영양증, 류머티스성 골질환, 퇴행성 골질환, 뼈전이성 병소(bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은, Jmjd2b(histone demethylase Jumonji domain-containing protein 2B) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 골질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 물질은 Jmjd2b의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 항체일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Jmjd2b의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 골질환 진단용 조성물을 포함하는 골질환 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은, (a) 골질환이 의심되는 환자에서 채취된 생물학적 시료로부터 Jmjd2b 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 골질환의 발병을 예측 또는 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료에 존재하는 Jmjd2b 유전자의 발현 수준 또는 Jmjd2b 단백질의 발현수준이 정상 대조구에 비해 증가되어 있는 경우, 파골세포가 과분화되어 골질환의 발병 가능성이 높다고 판정하거나 또는 골질환이 발병된 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
나아가 본 발명은, (a) Jmjd2b(histone demethylase Jumonji domain-containing protein 2B) 유전자 또는 Jmjd2b 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, Jmjd2b 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 감소되는 경우, 상기 시료를 골질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 골질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에서는 파골세포의 분화에 Jmjd2b 유전자가 관여한다는 것을 최초로 규명하였는데, 파골세포의 분화가 진행될수록 Jmjd2b 유전자 및 단백질의 발현이 증가됨을 확인하였고, Jmjd2b의 발현 억제 시 파골세포의 분화가 억제됨을 확인함으로써, 본 발명은 파골세포 과분화 관련 골질환의 새로운 치료제로서 Jmjd2b 억제제를 제공하는 효과가 있고, 파골세포 과분화 관련 골질환의 발생 위험을 예측하거나 진단할 수 있을 뿐만 아니라 파골세포 과분화 관련 골질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝할 수 있는 방법을 제공할 수 있는 등 골 질환과 관련된 다양한 연구에 유용할 수 있다.
도 1은 파골세포의 분화에 따른 Jmjd2b 유전자 및 단백질의 발현변화를 분석한 결과를 나타낸 것으로, 1a는 파골전구세포인 마우스 유래 대식세포주 RAW264.7에 RANKL를 처리하여 파골세포 분화를 유도한 후, 파골세포 분화 경과시간에 따른 Jmjd2 그룹 유전자들의 발현변화를 qRT-PCR를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이고, 1b는 수컷 6주령 C57BL/6 생쥐로부터 대식세포(bone marrow-derived macrophages, BMMs)를 수득한 후, RANKL를 처리하여 파골세포 분화를 유도한 다음, 파골세포 분화 경과시간에 따른 Jmjd2b 및 NFATc1 단백질의 발현변화를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Jmjd2b 넉다운(knock down)에 의한 파골세포 분화 억제를 확인한 결과로서, 2a는 수컷 6주령 C57BL/6 생쥐 유래의 대식세포(bone marrow-derived macrophages, BMMs)에 Jmjd2b shRNA를 처리한 결과, 대조군(NCsh)에 비해 Jmjd2b의 단백질 발현이 감소된 것을 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이고, 2b는 BMMs 세포에 Jmjd2b shRNA를 처리한 후, RANKL(100ng/ml)를 처리하여 파골세포 분화를 유도한 후, 5일 후에 TRAP 염색방법으로 분석한 결과로서, 핵이 3개 이상인 TRAP 양성 세포를 성숙한 파골세포로 여겨 세포수를 세어 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Jmjd2b 넉다운에 의한 파골세포분화 마커 유전자들(NFATc1, CTSK, OSCAR 및 TRAP)의 발현 변화를 real-time PCR 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 4는 마우스 동물모델에서 Jmjd2b 넉아웃에 의한 파골세포 분화 억제를 확인한 결과로서, 4a는 파골세포에만 특이적으로 Jmjd2b가 넉아웃된 마우스로부터 대식세포를 분리한 후, 웨스턴 블럿을 통해 Jmjd2b 단백질의 발현 감소를 확인한 것이고, 4b는 상기 대식세포에 RANKL(100ng/ml)를 처리하여 파골세포 분화를 유도한 후 5일 후에 TRAP 염색을 통한 파골세포 분화 세포 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이며, 4c는 real-time PCR을 통해 Jmjd2b 발현억제에 따른 NFATc1의 발현변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Jmjd2b 저해제인 NSC636819 또는 ML324 처리에 의한 파골세포분화 억제를 확인한 결과로서, 5a는 마우스 유래의 대식세포(bone marrow-derived macrophages, BMMs)에 RANKL를 처리하여 파골세포 분화를 유도한 후, 농도별 NSC636819 처리군에서의 TRAP 양성세포를 확인한 결과를 나타낸 것이고, 5b는 real-time PCR을 실시하여 파골세포분화 마커 유전자의 발현을 확인한 결과이며, 5c는 마우스 유래의 대식세포(BMMs)에 RANKL를 처리하여 파골세포 분화를 유도한 후, 농도별 ML324 처리군에서의 TRAP 양성세포를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Jmjd2b 넉다운(knock down)에 의한 파골세포 분화 억제를 확인한 결과로서, 2a는 수컷 6주령 C57BL/6 생쥐 유래의 대식세포(bone marrow-derived macrophages, BMMs)에 Jmjd2b shRNA를 처리한 결과, 대조군(NCsh)에 비해 Jmjd2b의 단백질 발현이 감소된 것을 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이고, 2b는 BMMs 세포에 Jmjd2b shRNA를 처리한 후, RANKL(100ng/ml)를 처리하여 파골세포 분화를 유도한 후, 5일 후에 TRAP 염색방법으로 분석한 결과로서, 핵이 3개 이상인 TRAP 양성 세포를 성숙한 파골세포로 여겨 세포수를 세어 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Jmjd2b 넉다운에 의한 파골세포분화 마커 유전자들(NFATc1, CTSK, OSCAR 및 TRAP)의 발현 변화를 real-time PCR 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 4는 마우스 동물모델에서 Jmjd2b 넉아웃에 의한 파골세포 분화 억제를 확인한 결과로서, 4a는 파골세포에만 특이적으로 Jmjd2b가 넉아웃된 마우스로부터 대식세포를 분리한 후, 웨스턴 블럿을 통해 Jmjd2b 단백질의 발현 감소를 확인한 것이고, 4b는 상기 대식세포에 RANKL(100ng/ml)를 처리하여 파골세포 분화를 유도한 후 5일 후에 TRAP 염색을 통한 파골세포 분화 세포 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이며, 4c는 real-time PCR을 통해 Jmjd2b 발현억제에 따른 NFATc1의 발현변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Jmjd2b 저해제인 NSC636819 또는 ML324 처리에 의한 파골세포분화 억제를 확인한 결과로서, 5a는 마우스 유래의 대식세포(bone marrow-derived macrophages, BMMs)에 RANKL를 처리하여 파골세포 분화를 유도한 후, 농도별 NSC636819 처리군에서의 TRAP 양성세포를 확인한 결과를 나타낸 것이고, 5b는 real-time PCR을 실시하여 파골세포분화 마커 유전자의 발현을 확인한 결과이며, 5c는 마우스 유래의 대식세포(BMMs)에 RANKL를 처리하여 파골세포 분화를 유도한 후, 농도별 ML324 처리군에서의 TRAP 양성세포를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 골 질환의 예방 또는 치료를 위한 Jmjd2b 억제제의 용도에 관한 것으로, 골질환의 치료제 발굴을 위한 새로운 타겟을 발굴하기 위해 연구하던 중, 파골세포의 과분화시 Jmjd2b 유전자의 발현 및 단백질 수준이 증가되는 것을 확인함으로써, 파골세포 분화에 미치는 Jmjd2b의 작용을 최초로 규명하였다.
Jmjd2b(histone demethylase Jumonji domain-containing protein 2B)는 히스톤 탈메틸화효소인 Jmjd2 단백질 그룹 중의 한 종류로 알려져 있으며, 간지방증에서 과발현되어 있는 것으로 알려져 있고 대장암 및 위암과의 관련성도 연구된 바 있으나, 아직까지 골질환과의 관련성에 대한 연구는 보고된 바가 없다.
그러나 본 발명에서는 파골세포 분화 과정에서 분화가 진행될수록 Jmjd2b 유전자의 발현이 현저히 증가하고 있음을 확인하였고, 특히 Jmjd2 단백질 그룹에 해당하는 Jmjd2a, Jmjd2c 및 Jmjd2d와는 달리 Jmjd2b만 특이적으로 과발현되어 있는 것을 확인하였다(도 1 참조).
따라서 본 발명자들은 파골세포의 분화에 Jmjd2b 가 중요하게 관여하고 있음을 알 수 있었고, 구체적인 작용을 확인하기 위해 Jmjd2b를 넉다운 또는 넉아웃시킨 파골전구세포에 파골세포 분화를 유도하는 RANKL을 처리 후 파골세포의 분화 정도를 확인하였는데, 그 결과, Jmjd2b의 발현을 억제한 군에서 파골세포의 분화가 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 2 및 도 4 참조).
또한 본 발명의 다른 일실시예에서 Jmjd2b의 발현 억제가 파골세포의 분화에 관여하는 유전자들의 발현에도 영향을 미치는지 분석한 결과, Jmjd2b의 발현이 억제된 군에서는 파골세포의 분화마커 유전자로 알려진 NFATc1(nuclear factor of activated T-cells c1)의 타겟 유전자들인 CTSK(cathepsin K), OSCAR(osteoclast-associated receptor) 및 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 유전자들의 발현이 모두 감소됨을 확인할 수 있었다(도 3 참조).
따라서 본 발명은 Jmjd2b 유전자의 발현 또는 단백질의 발현을 억제시킬 경우, 파골세포의 과도한 분화를 억제할 수 있으므로, 파골세포 과분화로 기인되는 골질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은 Jmjd2b(histone demethylase Jumonji domain-containing protein 2B)의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 Jmjd2b의 억제제는 Jmjd2b의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질로서, 이에 제한되지는 않으나 Jmjd2b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, 화합물 또는 펩타이드일 수 있으며, 이들 물질은 Jmjd2b에 직접적으로 또는 간접적으로 작용하여 Jmjd2b의 발현 또는 활성을 억제할 수 있다.
바람직하게 상기 Jmjd2b의 억제제는 서열번호 19로 표시되는 Jmjd2b shRNA 이거나, Jmjd2b 억제 화합물로는 NSC636819(1,5-Bis[(1E)-2-(3,4-dichlorophenyl)ethenyl]-2,4-dinitrobenzene) 또는 ML324(N-(3-(Dimethylamino)propyl)-4-(8-hydroxyquinolin-6-yl)benzamide)일 수 있다.
또한 바람직하게 본 발명에서 Jmjd2b의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있고, Jmjd2b 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 상기 유전자의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, 상기 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.
또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 "siRNA”라는 용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(상기 마커 유전자의 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(상기 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 상기 마커 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포 안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.
또한, 본 발명에 따른 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 골질환을 치료할 수 있는 약학적 조성물로서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 투여란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
또한, 상기에서 유효량 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.
본 발명에서 예방, 개선, 치료 또는 진단하고자 하는 상기 골질환이란, 파골세포의 과분화로 인해 유발되어 골조직의 장애를 초래하거나 또는 골조직을 파괴하는 질환을 의미하는데, 상기 골 질환은 이에 제한되지는 않으나, 골다공증, 파세트 골질환, 구루병, 골연화증, 신부전 환자의 신성골이영양증, 류머티스성 골질환, 퇴행성 골질환, 뼈전이성 병소(bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환일 수 있다.
또한, 본 발명은 Jmjd2b(histone demethylase Jumonji domain-containing protein 2B) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 골질환 진단용 조성물을 제공함에 특징이 있다.
본 발명자들은 하기 실시예의 실험을 통해 파골세포가 과분화되거나 파골세포의 분화가 진행될수록 Jmjd2b의 발현이 현저하게 증가하는 것을 확인하였고, 따라서 Jmjd2b 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질의 양의 측정을 통해 골질환의 여부를 진단할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
본 발명에서 상기 유전자의 발현 수준은, 바람직하게 상기 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 Jmjd2b 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 상기 Jmjd2b 의 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다. 바람직하게 상기 Jmjd2b 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것일 수 있고, 상기 Jmjd2b 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍일 수 있다.
본 발명에서 상기 프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.
상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 본 발명의 Jmjd2b 유전자로부터 발현된 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다.
상기 “항체”는 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 제조된 것을 사용할 수 있는데, 상기 항체의 제조는 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 골질환 진단용 조성물을 포함하는 골질환 진단용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 골질환 진단용 키트는 상기 Jmjd2b 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.
본 발명의 골질환 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으며, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 Jmjd2b 유전자의 발현수준 또는 그 발현 단백질 수준을 측정하는 방법을 통해 골질환의 발병을 예측 또는 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있는데, 바람직하게 상기 방법은, (a) 골질환이 의심되는 환자에서 채취된 생물학적 시료로부터 Jmjd2b 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기에서 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준(양)을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 간암의 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.
상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 Jmjd2b 유전자의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양과 골질환 환자 또는 골질환 의심환자에서의 mjd2b 유전자의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 대조군과 비교함으로써 골질환의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.
보다 구체적으로 상기 골질환의 발병을 예측 또는 진단하는 방법은 본 발명에 따른 Jmjd2b 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 정상 대조군 시료에 비해 증가되었을 경우, 파골세포가 과분화되어 골질환의 발병 가능성이 높다고 판정하거나 또는 골질환이 발병된 것으로 판정할 수 있다.
나아가 본 발명은 (a) Jmjd2b(histone demethylase Jumonji domain-containing protein 2B) 유전자 또는 Jmjd2b 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, Jmjd2b 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 감소되는 경우, 상기 시료를 골질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 먼저 상기 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기시료는 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 올리고뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA), shRNA 또는 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 감소되는 것이 측정되면 상기 시료는 골질환을 치료 또는 예방할 수 있는 치료제로 판단할 수 있다.
상기에서 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법을 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
파골세포 분화 과정에서 Jmjd2b의 발현 변화 분석
<1-1> Jmjd2b의 mRNA 수준 측정
본 발명자들은 파골세포의 분화 및 형성 억제를 통해 골질환을 치료할 수 있는 새로운 치료제를 발굴하기 위한 방안으로, 파골세포 분화과정에서 발현의 변화를 보이는 유전자의 분석을 위해 히스톤 탈메틸화효소인 Jmjd2 그룹에 해당하는 Jmjd2a, Jmjd2b, Jmjd2c, Jmjd2d의 각각의 발현수준을 분석하였다. 구체적으로 마우스 유래 대식세포주 RAW264.7을 파골전구세포로 하고 상기 세포에 RANKL을 처리하여 파골세포로 분화시켰으며, 이때 RANKL 처리 후, 1일, 2일, 3일째의 세포로부터 RNA를 분리하여 qRT-PCR (real-time quantitative PCR)을 수행하여, Jmjd2a, Jmjd2b, Jmjd2c, Jmjd2d의 mRNA 수준을 측정하였다.
| 유전자 | 프라이머 | 프라이머 서열 | 서열번호 |
| Jmjd2a | 정방향 | TTCTGTGAATCCTGCGTCTG | 3 |
| 역방향 | TAGCTGTGCACGGTGAGAAC | 4 | |
| Jmjd2b | 정방향 | CATGTGGAAGACCACGTTTG | 5 |
| 역방향 | AAGGGGATGCCGTACTTCTT | 6 | |
| Jmjd2c | 정방향 | GATGACTGGCCTTACGTGGT | 7 |
| 역방향 | CTTCACACAGTTTCGGCTCA | 8 | |
| Jmjd2d | 정방향 | TCACCGATTTATGGTGCTGA | 9 |
| 역방향 | GGTCTTCCACATGCCAAAGT | 10 |
분석 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 파골세포로의 분화가 진행됨에 따라 히스톤 탈메틸화효소 Jmjd2 유전자 그룹 중에서 Jmjd2b의 mRNA만 특이적으로 증가하는 것으로 나타났고, 다른 Jmjd2 유전자인 Jmjd2a, Jmjd2c 및 Jmjd2d의 발현은 파골세포의 분화와는 크게 관계가 없는 것으로 나타났다.
<1-2> Jmjd2b의 단백질 수준 측정
파골세포 분화과정에서 Jmjd2b의 mRNA 발현수준이 특이적으로 증가함을 확인함에 따라, Jmjd2b의 단백질 발현에도 변화가 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 수컷 6주령 C57BL/6 생쥐를 100% CO2 가스를 이용하여 안락사 시킨 뒤 대퇴골과 경골을 분리하였다. 분리된 경골과 대퇴골의 양끝을 절단한 뒤 1 mL 주사기로 골수강 내의 세포를 채취하고 적혈구 세포 용해 버퍼(red blood cell lysis buffer:RBCL)를 이용하여 적혈구를 용해시켜 제거하였다. 얻어진 골수세포를 10% FBS, M-CSF (30 ng/mL)가 포함된 α-MEM 배지에서 3일간 배양하였다. 배양 3일 후, 부착된 세포를 대식세포(bone marrow-derived macrophages, BMMs)로 실험하였다. 파골세포로의 분화를 위해 상기 준비한 대식세포에 M-CSF (30 ng/mL)와 RANKL (100ng/mL)을 처리하고, 1일, 2일, 3일째 세포 용해물(lysates)를 얻어서 Jmjd2b와 파골세포분화에 중요한 전자인자인 NFATc1 단백질에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블럿으로 단백질 수준을 분석하였다.
그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 파골세포로의 분화가 진행됨에 따라 Jmjd2b 의 단백질 수준도 증가하는 것으로 나타났고, 파골세포분화에 중요한 전자인자인 NFATc1 의 단백질 수준도 증가하는 것으로 나타났다.
이러한 결과를 토대로, 본 발명자들은 Jmjd2 유전자 그룹 중에서 특이하게 Jmjd2b가 파골세포의 분화에 중요하게 관여하고 있다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 2>
Jmjd2b 넉다운(konck down)에 의한 파골세포 분화 억제 분석
상기 실시예 1에서 Jmjd2b의 유전자 및 단백질의 수준이 파골세포의 분화가 진행될 수도록 증가되는 것을 확인함에 따라 파골세포의 분화에 미치는 Jmjd2b 유전자의 역할을 규명하기 위해 다음과 같은 실험을 진행하였다.
구체적으로 상기 실시예 1에서 사용한 대식세포(bone marrow-derived macrophages, BMMs)에 Jmjd2b에 특이적으로 작용하는 shRNA (5'-CCGGTTCGGTGGACAGACGGTAATCCTCGAGGATTACCGTCTGTCCACCGAATTTTTG-3'; 서열번호 19)를 포함하는 lentivirus particle을 처리하고 세포를 48 웰 플레이트에 분주한 후, RANKL(100ng/ml)을 처리하고 2일 마다 새로운 배지로 교환하였으며, 5일 후에 파골세포 확인을 위한 TRAP 염색을 실시한 후, 현미경으로 확인하여 핵이 3개 이상 가진 TRAP(+) multinuclear cells (MNCs)을 성체 파골세포로 간주하여 파골세포로 분화된 세포수를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, Jmjd2b에 특이적인 shRNA을 처리한 군에서 shRNA를 처리하지 않은 대조군에 비해 Jmjd2b의 발현이 현저하게 억제되어 있음을 웨스턴 블럿을 통해 확인할 수 있었고(도 2a 참조), Jmjd2b의 발현이 억제된 군이 대조군에 비해 파골세포로 분화된 세포의 수가 현저하게 감소되어 있는 것으로 나타났다(도 2b 참조).
이러한 결과를 통해, Jmjd2b의 발현을 억제할 경우 파골세포의 분화를 억제할 수 있음을 알 수 있었고, Jmjd2b의 억제제가 파골세포의 분화 억제를 통해 골질환을 치료할 수 있는 새로운 치료제로서의 사용 가능성을 예측할 수 있었다.
<실시예 3>
Jmjd2b 넉다운(konck down)에 의한 파골세포 분화마커 유전자의 발현 억제 분석
상기 실시예 2에서 사용한 BMMs에 lentivirus를 이용하여 Jmjd2b shRNA를 첨가한 후, 세포를 48웰 플레이트에 분주하고 RANKL(100ng/ml)을 처리한 다음, 2일 마다 새로운 배지로 교환하였다. 5일 후에 Jmjd2b shRNA를 처리하지 않은 대조군 세포에서 파골세포로의 분화가 일어난 것을 확인하고, 실험 세포군으로부터 RNA를 분리한 후, real-time PCR을 수행하여 파골세포분화 마커 유전자들의 발현변화를 관찰하였다.
| 유전자 | 프라이머 | 프라이머 서열 | 서열번호 |
| NFATc1 | 정방향 | CTCGAAAGACAGCACTGGAGCAT | 11 |
| 역방향 | CGGCTGCCTTCCGTCTCATAG | 12 | |
| CTSK | 정방향 | ACGGAGGCATTGACTCTGAAGATG | 13 |
| 역방향 | GGAAGCACCAACGAGAGGAGAAAT | 14 | |
| OSCAR | 정방향 | CTGCTGGTAACGGATCAGCTCCCCAGA | 15 |
| 역방향 | CCAAGGAGCCAGAACCTTCGAAACT | 16 | |
| TRAP | 정방향 | CTGGAGTGCACGATGCCAGCGACA | 17 |
| 역방향 | TCCGTGCTCGGCGATGGACCAGA | 18 |
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, Jmjd2b의 발현이 억제되었을 때, 파골세포 핵심 유전자인 NFATc1 유전자를 비롯하여 NFATc1(nuclear factor of activated T-cells c1)의 타겟 유전자들인 CTSK(cathepsin K), OSCAR(osteoclast-associated receptor) 및 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 유전자들의 발현이 모두 현저하게 억제된 것으로 나타났다.
<실시예 4>
Jmjd2b 넉아웃(konck out)된 마우스에서의 파골세포 분화 억제 분석
Jmjd2b의 억제가 파골세포의 분화를 억제할 수 있는 것인지를 동물실험을 통해 다음과 같이 확인하였다. 컨디셔널 넉아웃 마우스 Jmjd2bLyz2 -/-는 Jmjd2bflox / flox 마우스와 Lyz2-Cre 마우스를 메이팅시켜 얻었는데 대식세포에서만 특이적으로 Jmjd2b 발현이 억제되는 컨디셔널 넉아웃 마우스이다. 먼저 파골세포에만 특이적으로 Jmjd2b가 넉아웃된 컨디셔널 넉아웃 마우스(conditional knockout mouse: Jmjd2b Lyz2 -/-)와 대조군 마우스로부터 대식세포(BMMs)를 분리한 후, 웨스턴 블럿을 통해 Jmjd2b의 넉아웃 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, Jmjd2b가 넉아웃된 마우스의 BMMs 세포에서는 Jmjd2b 단백질 발현이 억제되어 있음을 확인할 수 있었다.
이후, Jmjd2b 발현이 억제되어 있음을 확인한 마우스의 BMMs 세포를 48 웰 플레이트에 분주하고 RANKL(100ng/ml)을 처리한 다음, 2일 마다 새로운 배지로 교환하였다. 5일후에 파골세포 확인을 위한 TRAP 염색을 실시한 후 현미경으로 확인하며 핵이 3개 이상 가진 TRAP(+) multinuclear cells (MNCs)을 성체 파골세포로 간주하여 세포수를 측정하였다.
그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 Jmjd2b의 발현이 억제된 군이 대조군에 비해 파골세포의 분화가 현저히 감소되어 있는 것으로 나타났다.
나아가 상기 실험에 사용한 세포들로부터 RNA를 분리하고 real-time PCR을 실시하여 파골세포분화 핵심마커인 NFATc1 유전자의 발현을 관찰하였다. 그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, Jmjd2b 발현이 억제됨으로써 NFATc1 유전자의 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 Jmjd2b의 발현 또는 활성 억제가 파골세포 분화에 관여하는 인자들의 발현을 억제함으로써 파골세포로의 분화를 억제할 수 있음을 의미한다.
<실시예 5>
Jmjd2b 억제제 처리에 따른 파골세포 분화 억제 여부 확인
본 발명자들은 Jmjd2b의 저해제 처리에 따른 파골세포 분화 억제 여부를 확인하기 위해 저해제로서, NSC636819 (구입처:TOCRIS) 및 ML324 (구입처:Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 구체적으로, 상기 실시예에서 사용한 대식세포인 BMMs 세포를 48웰 플레이트에 분주한 후, RANKL(100ng/ml)을 첨가하여 파골세포로 분화되는 것을 유도하였고, 이 과정에 NSC636819를 농도별로 처리하고 3일 후에 TRAP 염색을 수행하였고, 또한, 각 실험 세포군으로부터 RNA를 분리하여 real-time PCR을 통해 파골세포분화 마커 유전자의 발현을 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, Jmjd2b의 저해제인 NSC636819 의 처리 농도 의존적으로 파골세포?? 분화가 억제되는 것으로 나타났고(도 5a 참조), 파골세포 핵심유전자인 NFATc1 유전자와 이의 타겟 유전자들인 CTSK 및 TRAP 유전자의 발현이 현저히 억제되어 있음을 확인할 수 있었다(도 5b 참조).
또한, Jmjd2b의 저해제인 ML324를 처리한 군에서도 처리 농도 의존적으로 파골세포의 분화가 억제되는 것으로 나타났다(도 5c 참조).
이상의 결과를 통해, 본 발명자들은 Jmjd2b가 파골세포의 분화에 밀접하게 관련되어 있으며, 특히 Jmjd2b의 발현 또는 활성을 억제할 경우 파골세포의 분화를 억제할 수 있음을 알 수 있었고, Jmjd2b의 억제제를 파골세포 과분화에 의해 유발되는 골질환의 치료제로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Chungbuk National University
<120> Use of Jmjd2b inhibitors for preventing or treating of bone
diseases
<130> NPDC77726
<160> 19
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 3393
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Jmjd2b cDNA sequence
<400> 1
atggggtctg aggaccacgg cgcccagaac cccagctgta aaatcatgac gtttcgccca 60
accatggaag aatttaaaga cttcaacaaa tacgtggcct acatagagtc gcagggagcc 120
caccgggcgg gcctggccaa gatcatcccc ccgaaggagt ggaagccgcg gcagacgtat 180
gatgacatcg acgacgtggt gatcccggcg cccatccagc aggtggtgac gggccagtcg 240
ggcctcttca cgcagtacaa tatccagaag aaggccatga cagtgggcga gtaccgccgc 300
ctggccaaca gcgagaagta ctgtaccccg cggcaccagg actttgatga ccttgaacgc 360
aaatactgga agaacctcac ctttgtctcc ccgatctacg gggctgacat cagcggctct 420
ttgtatgatg acgacgtggc ccagtggaac atcgggagcc tccggaccat cctggacatg 480
gtggagcgcg agtgcggcac catcatcgag ggcgtgaaca cgccctacct gtacttcggc 540
atgtggaaga ccaccttcgc ctggcacacc gaggacatgg acctgtacag catcaactac 600
ctgcactttg gggagcctaa gtcctggtac gccatcccac cagagcacgg caagcgcctg 660
gagcggctgg ccatcggctt cttccccggg agctcgcagg gctgcgacgc cttcctgcgg 720
cataagatga ccctcatctc gcccatcatc ctgaagaagt acgggatccc cttcagccgg 780
atcacgcagg aggccgggga attcatgatc acatttccct acggctacca cgccggcttc 840
aatcacgggt tcaactgcgc agaatctacc aacttcgcca ccctgcggtg gattgactac 900
ggcaaagtgg ccactcagtg cacgtgccgg aaggacatgg tcaagatctc catggacgtg 960
ttcgtgcgca tcctgcagcc cgagcgctac gagctgtgga agcagggcaa ggacctcacg 1020
gtgctggacc acacgcggcc cacggcgctc accagccccg agctgagctc ctggagtgca 1080
tcccgggcct cgctgaaggc caagctcctc cgcagacaaa ttagtctgaa agaaaacaga 1140
cactggagaa agactgagga ggagaggaaa ccaagtctag aaaggaagaa agagcagacc 1200
aaaaggccgg ggctgtcgtc tcaccggaaa cggagccagc ccaagaagcc gaagcccgaa 1260
gaccccaagt tccctgggga gggtacggct ggggcagcgc tcctagagga ggctgggggc 1320
agcgtgaagg aggaggctgg gccggaggtt gaccccgagg aggaggagga ggagccgcag 1380
ccactgccac acggccggga ggccgagggc gcagaagagg acgggagggg caagctgcgg 1440
ccaaccaagg ccaagagcga gcggaagaag aagagcttcg gcctgctgcc cccacagctg 1500
ccgcccccgc ctgctcactt cccctcagag gaggcgctgt ggctgccatc cccactggag 1560
cccccggtgc tgggcccagg ccctgcagcc atggaggaga gccccctgcc ggcacccctt 1620
aatgtcgtgc cccctgaggt gcccagtgag gagctagagg ccaagcctcg gcccatcatc 1680
cccatgctgt acgtggtgcc gcggccgggc aaggcagcct tcaaccagga gcacgtgtcc 1740
tgccagcagg cctttgagca ctttgcccag aagggtccga cctggaagga accagtttcc 1800
cccatggagc tgacggggcc agaggacggt gcagccagca gtggggcagg tcgcatggag 1860
accaaagccc gggccggaga ggggcaggca ccgtccacat tttccaaatt gaagatggag 1920
atcaagaaga gccggcgcca tcccctgggc cggccgccca cccggtcccc actgtcggtg 1980
gtgaagcagg aggcctcaag tgacgaggag gcatcccctt tctccgggga ggaagatgtg 2040
agtgacccgg acgccttgag gccgctgctg tctctgcagt ggaagaacag ggcggccagc 2100
ttccaggccg agaggaagtt caacgcagcg gctgcgcgca cggagcccta ctgcgccatc 2160
tgcacgctct tctaccccta ctgccaggcc ctacagactg agaaggaggc acccatagcc 2220
tccctcggag agggctgccc ggccacatta ccctccaaaa gccgtcagaa gacccgaccg 2280
ctcatccctg agatgtgctt cacctctggc ggtgagaaca cggagccgct gcctgccaac 2340
tcctacatcg gcgacgacgg gaccagcccc ctgatcgcct gcggcaagtg ctgcctgcag 2400
gtccatgcca gttgctatgg catccgtccc gagctggtca atgaaggctg gacgtgttcc 2460
cggtgcgcgg cccacgcctg gactgcggag tgctgcctgt gcaacctgcg aggaggtgcg 2520
ctgcagatga ccaccgatag gaggtggatc cacgtgatct gtgccatcgc agtccccgag 2580
gcgcgcttcc tgaacgtgat tgagcgccac cctgtggaca tcagcgccat ccccgagcag 2640
cggtggaagc tgaaatgcgt gtactgccgg aagcggatga agaaggtgtc aggtgcctgt 2700
atccagtgct cctacgagca ctgctccacg tccttccacg tgacctgcgc ccacgccgca 2760
ggcgtgctca tggagccgga cgactggccc tatgtggtct ccatcacctg cctcaagcac 2820
aagtcggggg gtcacgctgt ccaactcctg agggccgtgt ccctaggcca ggtggtcatc 2880
accaagaacc gcaacgggct gtactaccgc tgtcgcgtca tcggtgccgc ctcgcagacc 2940
tgctacgaag tgaacttcga cgatggctcc tacagcgaca acctgtaccc tgagagcatc 3000
acgagtaggg actgtgtcca gctgggaccc ccttccgagg gggagctggt ggagctccgg 3060
tggactgacg gcaacctcta caaggccaag ttcatctcct ccgtcaccag ccacatctac 3120
caggtggagt ttgaggacgg gtcccagctg acggtgaagc gtggggacat cttcaccctg 3180
gaggaggagc tgcccaagag ggtccgctct cggctgtcac tgagcacggg ggcaccgcag 3240
gagcccgcct tctcggggga ggaggccaag gccgccaagc gcccgcgtgt gggcaccccg 3300
cttgccacgg aggactccgg gcggagccag gactacgtgg ccttcgtgga gagcctcctg 3360
caggtgcagg gccggcccgg agcccccttc tag 3393
<210> 2
<211> 1096
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Jmjd2b amino acid sequence
<400> 2
Met Gly Ser Glu Asp His Gly Ala Gln Asn Pro Ser Cys Lys Ile Met
1 5 10 15
Thr Phe Arg Pro Thr Met Glu Glu Phe Lys Asp Phe Asn Lys Tyr Val
20 25 30
Ala Tyr Ile Glu Ser Gln Gly Ala His Arg Ala Gly Leu Ala Lys Ile
35 40 45
Ile Pro Pro Lys Glu Trp Lys Pro Arg Gln Thr Tyr Asp Asp Ile Asp
50 55 60
Asp Val Val Ile Pro Ala Pro Ile Gln Gln Val Val Thr Gly Gln Ser
65 70 75 80
Gly Leu Phe Thr Gln Tyr Asn Ile Gln Lys Lys Ala Met Thr Val Gly
85 90 95
Glu Tyr Arg Arg Leu Ala Asn Ser Glu Lys Tyr Cys Thr Pro Arg His
100 105 110
Gln Asp Phe Asp Asp Leu Glu Arg Lys Tyr Trp Lys Asn Leu Thr Phe
115 120 125
Val Ser Pro Ile Tyr Gly Ala Asp Ile Ser Gly Ser Leu Tyr Asp Asp
130 135 140
Asp Val Ala Gln Trp Asn Ile Gly Ser Leu Arg Thr Ile Leu Asp Met
145 150 155 160
Val Glu Arg Glu Cys Gly Thr Ile Ile Glu Gly Val Asn Thr Pro Tyr
165 170 175
Leu Tyr Phe Gly Met Trp Lys Thr Thr Phe Ala Trp His Thr Glu Asp
180 185 190
Met Asp Leu Tyr Ser Ile Asn Tyr Leu His Phe Gly Glu Pro Lys Ser
195 200 205
Trp Tyr Ala Ile Pro Pro Glu His Gly Lys Arg Leu Glu Arg Leu Ala
210 215 220
Ile Gly Phe Phe Pro Gly Ser Ser Gln Gly Cys Asp Ala Phe Leu Arg
225 230 235 240
His Lys Met Thr Leu Ile Ser Pro Ile Ile Leu Lys Lys Tyr Gly Ile
245 250 255
Pro Phe Ser Arg Ile Thr Gln Glu Ala Gly Glu Phe Met Ile Thr Phe
260 265 270
Pro Tyr Gly Tyr His Ala Gly Phe Asn His Gly Phe Asn Cys Ala Glu
275 280 285
Ser Thr Asn Phe Ala Thr Leu Arg Trp Ile Asp Tyr Gly Lys Val Ala
290 295 300
Thr Gln Cys Thr Cys Arg Lys Asp Met Val Lys Ile Ser Met Asp Val
305 310 315 320
Phe Val Arg Ile Leu Gln Pro Glu Arg Tyr Glu Leu Trp Lys Gln Gly
325 330 335
Lys Asp Leu Thr Val Leu Asp His Thr Arg Pro Thr Ala Leu Thr Ser
340 345 350
Pro Glu Leu Ser Ser Trp Ser Ala Ser Arg Ala Ser Leu Lys Ala Lys
355 360 365
Leu Leu Arg Arg Ser His Arg Lys Arg Ser Gln Pro Lys Lys Pro Lys
370 375 380
Pro Glu Asp Pro Lys Phe Pro Gly Glu Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu
385 390 395 400
Leu Glu Glu Ala Gly Gly Ser Val Lys Glu Glu Ala Gly Pro Glu Val
405 410 415
Asp Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gln Pro Leu Pro His Gly Arg
420 425 430
Glu Ala Glu Gly Ala Glu Glu Asp Gly Arg Gly Lys Leu Arg Pro Thr
435 440 445
Lys Ala Lys Ser Glu Arg Lys Lys Lys Ser Phe Gly Leu Leu Pro Pro
450 455 460
Gln Leu Pro Pro Pro Pro Ala His Phe Pro Ser Glu Glu Ala Leu Trp
465 470 475 480
Leu Pro Ser Pro Leu Glu Pro Pro Val Leu Gly Pro Gly Pro Ala Ala
485 490 495
Met Glu Glu Ser Pro Leu Pro Ala Pro Leu Asn Val Val Pro Pro Glu
500 505 510
Val Pro Ser Glu Glu Leu Glu Ala Lys Pro Arg Pro Ile Ile Pro Met
515 520 525
Leu Tyr Val Val Pro Arg Pro Gly Lys Ala Ala Phe Asn Gln Glu His
530 535 540
Val Ser Cys Gln Gln Ala Phe Glu His Phe Ala Gln Lys Gly Pro Thr
545 550 555 560
Trp Lys Glu Pro Val Ser Pro Met Glu Leu Thr Gly Pro Glu Asp Gly
565 570 575
Ala Ala Ser Ser Gly Ala Gly Arg Met Glu Thr Lys Ala Arg Ala Gly
580 585 590
Glu Gly Gln Ala Pro Ser Thr Phe Ser Lys Leu Lys Met Glu Ile Lys
595 600 605
Lys Ser Arg Arg His Pro Leu Gly Arg Pro Pro Thr Arg Ser Pro Leu
610 615 620
Ser Val Val Lys Gln Glu Ala Ser Ser Asp Glu Glu Ala Ser Pro Phe
625 630 635 640
Ser Gly Glu Glu Asp Val Ser Asp Pro Asp Ala Leu Arg Pro Leu Leu
645 650 655
Ser Leu Gln Trp Lys Asn Arg Ala Ala Ser Phe Gln Ala Glu Arg Lys
660 665 670
Phe Asn Ala Ala Ala Ala Arg Thr Glu Pro Tyr Cys Ala Ile Cys Thr
675 680 685
Leu Phe Tyr Pro Tyr Cys Gln Ala Leu Gln Thr Glu Lys Glu Ala Pro
690 695 700
Ile Ala Ser Leu Gly Glu Gly Cys Pro Ala Thr Leu Pro Ser Lys Ser
705 710 715 720
Arg Gln Lys Thr Arg Pro Leu Ile Pro Glu Met Cys Phe Thr Ser Gly
725 730 735
Gly Glu Asn Thr Glu Pro Leu Pro Ala Asn Ser Tyr Ile Gly Asp Asp
740 745 750
Gly Thr Ser Pro Leu Ile Ala Cys Gly Lys Cys Cys Leu Gln Val His
755 760 765
Ala Ser Cys Tyr Gly Ile Arg Pro Glu Leu Val Asn Glu Gly Trp Thr
770 775 780
Cys Ser Arg Cys Ala Ala His Ala Trp Thr Ala Glu Cys Cys Leu Cys
785 790 795 800
Asn Leu Arg Gly Gly Ala Leu Gln Met Thr Thr Asp Arg Arg Trp Ile
805 810 815
His Val Ile Cys Ala Ile Ala Val Pro Glu Ala Arg Phe Leu Asn Val
820 825 830
Ile Glu Arg His Pro Val Asp Ile Ser Ala Ile Pro Glu Gln Arg Trp
835 840 845
Lys Leu Lys Cys Val Tyr Cys Arg Lys Arg Met Lys Lys Val Ser Gly
850 855 860
Ala Cys Ile Gln Cys Ser Tyr Glu His Cys Ser Thr Ser Phe His Val
865 870 875 880
Thr Cys Ala His Ala Ala Gly Val Leu Met Glu Pro Asp Asp Trp Pro
885 890 895
Tyr Val Val Ser Ile Thr Cys Leu Lys His Lys Ser Gly Gly His Ala
900 905 910
Val Gln Leu Leu Arg Ala Val Ser Leu Gly Gln Val Val Ile Thr Lys
915 920 925
Asn Arg Asn Gly Leu Tyr Tyr Arg Cys Arg Val Ile Gly Ala Ala Ser
930 935 940
Gln Thr Cys Tyr Glu Val Asn Phe Asp Asp Gly Ser Tyr Ser Asp Asn
945 950 955 960
Leu Tyr Pro Glu Ser Ile Thr Ser Arg Asp Cys Val Gln Leu Gly Pro
965 970 975
Pro Ser Glu Gly Glu Leu Val Glu Leu Arg Trp Thr Asp Gly Asn Leu
980 985 990
Tyr Lys Ala Lys Phe Ile Ser Ser Val Thr Ser His Ile Tyr Gln Val
995 1000 1005
Glu Phe Glu Asp Gly Ser Gln Leu Thr Val Lys Arg Gly Asp Ile Phe
1010 1015 1020
Thr Leu Glu Glu Glu Leu Pro Lys Arg Val Arg Ser Arg Leu Ser Leu
1025 1030 1035 1040
Ser Thr Gly Ala Pro Gln Glu Pro Ala Phe Ser Gly Glu Glu Ala Lys
1045 1050 1055
Ala Ala Lys Arg Pro Arg Val Gly Thr Pro Leu Ala Thr Glu Asp Ser
1060 1065 1070
Gly Arg Ser Gln Asp Tyr Val Ala Phe Val Glu Ser Leu Leu Gln Val
1075 1080 1085
Gln Gly Arg Pro Gly Ala Pro Phe
1090 1095
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Jmjd2a F primer
<400> 3
ttctgtgaat cctgcgtctg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Jmjd2a R primer
<400> 4
tagctgtgca cggtgagaac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Jmjd2b F primer
<400> 5
catgtggaag accacgtttg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Jmjd2b R primer
<400> 6
aaggggatgc cgtacttctt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Jmjd2c F primer
<400> 7
gatgactggc cttacgtggt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Jmjd2c R primer
<400> 8
cttcacacag tttcggctca 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Jmjd2d F primer
<400> 9
tcaccgattt atggtgctga 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Jmjd2d R primer
<400> 10
ggtcttccac atgccaaagt 20
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NFATc1 F primer
<400> 11
ctcgaaagac agcactggag cat 23
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NFATc1 R primer
<400> 12
cggctgcctt ccgtctcata g 21
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTSK F primer
<400> 13
acggaggcat tgactctgaa gatg 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTSK R primer
<400> 14
ggaagcacca acgagaggag aaat 24
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OSCAR F primer
<400> 15
ctgctggtaa cggatcagct ccccaga 27
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OSCAR R primer
<400> 16
ccaaggagcc agaaccttcg aaact 25
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAP F primer
<400> 17
ctggagtgca cgatgccagc gaca 24
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAP R primer
<400> 18
tccgtgctcg gcgatggacc aga 23
<210> 19
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Jmjd2b shRNA sequence
<400> 19
ccggttcggt ggacagacgg taatcctcga ggattaccgt ctgtccaccg aatttttg 58
Claims (13)
- Jmjd2b(histone demethylase Jumonji domain-containing protein 2B)의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 Jmjd2b의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 Jmjd2b 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 억제제는 Jmjd2b의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질로서, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, 화합물 및 펩타이드로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 골질환은 파골세포의 과분화에 기인한 골다공증, 파세트 골질환, 구루병, 골연화증, 신부전 환자의 신성골이영양증, 류머티스성 골질환, 퇴행성 골질환, 뼈전이성 병소(bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - Jmjd2b(histone demethylase Jumonji domain-containing protein 2B) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 골질환 진단용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 물질은 Jmjd2b의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 항체인 것을 특징으로 하는, 골질환 진단용 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 Jmjd2b의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 골질환 진단용 조성물. - 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 골질환 진단용 키트.
- (a) 골질환이 의심되는 환자에서 채취된 생물학적 시료로부터 Jmjd2b 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 골질환의 발병을 예측 또는 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 골질환의 발병을 예측 또는 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 생물학적 시료에 존재하는 Jmjd2b 유전자의 발현 수준 또는 Jmjd2b 단백질의 발현수준이 정상 대조구에 비해 증가되어 있는 경우, 파골세포가 과분화되어 골질환의 발병 가능성이 높다고 판정하거나 또는 골질환이 발병된 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 골질환의 발병을 예측 또는 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법. - (a) Jmjd2b(histone demethylase Jumonji domain-containing protein 2B) 유전자 또는 Jmjd2b 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, Jmjd2b 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 감소되는 경우, 상기 시료를 골질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 골질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법. - 제12항에 있어서,
상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 골질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190031971A KR20200112069A (ko) | 2019-03-20 | 2019-03-20 | 골 질환의 예방 또는 치료를 위한 Ｊｍｊｄ２ｂ 억제제의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020190031971A KR20200112069A (ko) | 2019-03-20 | 2019-03-20 | 골 질환의 예방 또는 치료를 위한 Ｊｍｊｄ２ｂ 억제제의 용도 |
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| KR20200112069A true KR20200112069A (ko) | 2020-10-05 |
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ID=72809382
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| KR (1) | KR20200112069A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101694909B1 (ko) | 2015-03-31 | 2017-01-11 | 이화여자대학교 산학협력단 | Tspan7 억제제를 포함하는 파골세포 형성 억제 또는 골 질환의 치료용 조성물 |
-
2019
- 2019-03-20 KR KR1020190031971A patent/KR20200112069A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
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| KR101694909B1 (ko) | 2015-03-31 | 2017-01-11 | 이화여자대학교 산학협력단 | Tspan7 억제제를 포함하는 파골세포 형성 억제 또는 골 질환의 치료용 조성물 |
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