RU2797489C2

RU2797489C2 - Дезоксипроизводные цитидина или уридина для применения при лечении рака

Info

Publication number: RU2797489C2
Application number: RU2021123816A
Authority: RU
Inventors: Адам Брайан РОБЕРТСОН; Терезья ПРИКРЫЛОВА
Original assignee: Хемисфериэн Ас
Priority date: 2019-02-01
Filing date: 2020-02-03
Publication date: 2023-06-06

Abstract

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины и направлено на лечение рака нервной системы. Раскрывается применение соединения формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемой соли для лечения или профилактики рака центральной нервной системы у субъекта, где Х представляет собой -(CH2)n-X', где n – от 0 до 6, и X' представляет собой -CHO, -OH, -OR или -OC(=O)R, где R представляет собой метил; R1 является -OH или -O(P(=O)(OH)O)nH, где n – от 1 до 3; и R2 является -ОН. Кроме того, раскрывается набор для лечения или профилактики рака центральной нервной системы, содержащий соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемую соль и другое противораковое средство, представляющее собой темозоломид или 5-фторурацил, фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака центральной нервной системы, а также применение указанного выше соединения для приготовления лекарственного средства для лечения или профилактики рака центральной нервной системы у субъекта. Группа изобретений обеспечивает эффективное лечение рака центральной нервной системы. 4 н. и 26 з.п. ф-лы, 15 ил., 7 табл., 17 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к соединениям для применения в терапии, в частности при лечении или профилактике рака. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим такие соединения, и к применению таких фармацевтических композиций в терапии, в частности при лечении или профилактике рака. Настоящее изобретение также относится к таким соединениям для комбинированного лечения совместно с известными противораковыми средствами. Соответственно, настоящее изобретение относится к применению для лечения или профилактики рака соединений по настоящему изобретению, либо отдельно, либо в комбинации с одним или более дополнительными или другими противораковыми средствами. Настоящее изобретение также относится к способам лечения или профилактики рака с использованием соединений по настоящему изобретению, либо отдельно, либо в комбинации с одним или более другими противораковыми средствами.

Рак - это заболевание, характеризующееся отсутствием надлежащего контроля за ростом и пролиферацией клеток. По оценкам Американского онкологического общества в Соединенных Штатах Америки в 2010 году было зарегистрировано более 1,5 миллионов новых случаев рака, и примерно 570000 смертей в этом году предположительно связанно с раком. Всемирная Организация Здравоохранения определила, что рак был основной причиной смертей в мире в 2010 г., и что число смертей, вызванных раком, вырастет до 12 миллионов в год к 2030 году.

Хотя имеется множество способов лечения рака, резистентность к известным противораковым средствам может быть препятствием для успешного лечения рака у пациентов. Сохраняется потребность в дополнительных способах лечения рака.

В некоторых случаях желательны противораковые средства, способные убивать широкий спектр типов раковых клеток. Одним из таких противораковых средств является фторурацил (5-FU; от англ.: 5-fluorouracil), обычно назначаемый для лечения широкого спектра видов рака.

Однако многие противораковые средства, способные убивать широкий спектр типов раковых клеток, также убивают нераковые клетки, например нормальные, здоровые клетки, которые делятся. В некоторых случаях это становится проблемой, так что существует также потребность в цитотоксичных противораковых средствах широкого спектра действия, которые не были бы цитотоксичными для нераковых клеток. Кроме того, существует потребность в противораковых средствах с более специфической цитотоксичностью, то есть убивающих более узкий спектр типов раковых клеток. Такие более специфические противораковые средства с меньшей вероятностью вызовут нежелательные побочные эффекты.

Мультиформная глиобластома - это наиболее распространенный и наиболее агрессивный рак центральной нервной системы. Мультиформная глиобластома - это второй по частоте рак у детей. Потребности в лечении взрослых с диагнозом мультиформной глиобластомы являются одними из самых неудовлетворенных в онкологии. При использовании имеющихся в настоящее время видов лечения средняя продолжительность жизни после постановки диагноза составляет 14,6 месяцев. Менее 5% пациентов с диагнозом мультиформной глиобластомы проживают более 5 лет. Длительный срок жизни после постановки диагноза мультиформной глиобластомы является редким и чаще встречается у детей.

Существующие виды лечения являются в значительной мере паллиативными и предназначены для повышения качества жизни. После постановки диагноза современное лечение мультиформной глиобластомы всегда идет по сходной схеме: хирургическая резекция пораженной области головного мозга, если предполагается, что пациент перенесет хирургическую операцию, с последующей лучевой терапией и химиотерапией. Мультиформная глиобластома образует щупальцевидные структуры в пораженном головном мозге; поэтому даже в тех случаях, когда показана полная хирургическая резекция, она затруднена и часто невозможна. Кроме хирургического вмешательства и лучевой терапии для лечения мультиформной глиобластомы одобрены три лекарственных средства:

1) Авастин (RTM) (бевацизумаб) - ингибитор ангиогенеза с широким спектром онкологических показаний. Считается, что Авастин (RTM) ингибирует рост опухоли за счет ингибирования образования новых кровеносных сосудов внутри опухоли, что эффективно нарушает питание опухоли. Авастин (RTM) одобрен в США и Японии, однако Авастин (RTM) не разрешен к применению для лечения мультиформной глиобластомы (GBM; от англ.: glioblastoma multiforme) в ЕС. На самом деле, клинические исследования Фазы II показали, что Авастин (RTM) не обеспечивает общего увеличения продолжительности жизни (NCI 06-С-0064Е). Хотя в некоторых исследованиях Авастин (RTM) немного увеличивал период без прогресса заболевания, польза для пациента часто является номинальной, и лечение Авастином (RTM) не приносит пользы пациентам с рецидивирующей мультиформной глиобластомой.

2) Темозоломид (Темодал (RTM)/Темодар (RTM)) (4-метил-5-оксо-2,3,4,6,8-пентазабицикло[4.3.0]нона-2,7,9-триен-9-карбоксамид) - мутагенный агент, алкилирующий ДНК; также существуют композиции-дженерики. Считается, что Темозоломид ингибирует рост мультиформной глиобластомы за счет множественных мутаций опухолевой ДНК, вызывающих гибель клеток. Вследствие такого механизма действия, клетки, экспрессирующие белок репарации ДНК O6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазу (MGMT; от англ.: О6-methylguanine-DNA-methyltransferase), практически всегда резистентны к лечению Темозоломидом. Лечение Темозоломидом обеспечивает общее увеличение продолжительности жизни на 2,5 месяца. В то же время лечение Темозоломидом часто вызывает значительные побочные эффекты. Темозоломид является средством первой линии при лечении мультиформной глиобластомы.

3) Глиадел (RTM) (пластины с кармустином) (1,3-бис(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевина) - цитотоксичный азотистый иприт. Он производится в форме биоразлагаемого диска, имплантируемого прямо в головной мозг после хирургической резекции. Рандомизированное исследование продемонстрировало, что Глиадел (RTM) увеличивает медианную продолжительность жизни на 2,1 месяца. Пациенты, получавшие лечение Глиаделом (RTM), сообщали о меньшем числе и меньшей степени тяжести побочных эффектов, чем пациенты, получавшие лечение Темозоломидом; однако по сравнению с Темозоломидом общая продолжительность жизни снижалась.

Поэтому сохраняется потребность в других противораковых средствах для лечения мультиформной глиобластомы и других видов рака. В частности, сохраняется потребность в противораковых средствах, которые эффективно лечили бы виды рака, резистентные к лечению Темозоламидом.

Белок человека цитидиндеаминаза (CDA; от англ.: cytidine deaminase) катализирует гидролитическое дезаминирование цитидина и дезоксицитидина до уридина и дезоксиуридина, соответственно. Некоторые известные противораковые средства являются аналогами нукпеозидов/нукпеотидов, например - гемцитабин (2,2-дифтордезоксицитидин) и цитарабин (Ара-С, цитозина арабинозид). Проблемой является то, что CDA инактивирует такие противораковые средства, в том числе гемцитабин и цитарабин. Сохраняется потребность в других противораковых средствах, которые не инактивировались бы CDA.

Авторы настоящего изобретения обнаружили избранный класс соединений, которые обладают активностью при лечении мультиформной глиобластомы и широкого спектра других видов рака. Такие соединения пригодны для ингибирования пролиферации опухолевых клеток вообще и, в частности, опухолевых клеток, связанных с различными видами рака головного мозга, в частности - мультиформной глиобластомы.

В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает соединение Формулы (I):

или его стереоизомер, сольват, таутомер или фармацевтически приемлемую соль для применения в терапии,

в которой:

X является группой, содержащей от 1 до 20 неводородных атомов, которая содержит по меньшей мере одну функциональную группу, выбранную из альдегидной группы, спиртовой группы, защищенной спиртовой группы, простой эфирной группы, сложноэфирной группы и карбоновой кислоты, при условии, что X не является группой -СООН;

W₁ и W₂ независимо друг от друга являются О, S или NH;

Y является атомом Н или группой, содержащей от 1 до 15 неводородных атомов;

Z является -OPG, -OR₂ или -N(R_xR_y), где R_x, R_y и R_z независимо друг от друга являются атомом Н или группой, содержащей от 1 до 10 неводородных атомов;

R₁ является атомом Н или группой, содержащей от 1 до 15 неводородных атомов;

R₂ является атомом Н, -ОН, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I или -N₃; и

R₃ является атомом Н, -F, -Cl, -Br, -I или -N₃;

причем PG является группой, защищающей спиртовую группу, такой как ацетильная (Ас), бензильная (Bn) или бензоильная (Bz) группа.

Соединения по настоящему изобретения предназначены, в частности, для применения при лечении или профилактике рака. Соответственно, в следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает соединение Формулы (I):

или его стереоизомер, сольват, таутомер или фармацевтически приемлемую соль для применения при лечении или профилактике рака;

в которой:

Z является -OPG, -OR_z или -N(R_xR_y), где R_x, R_y и R_z независимо друг от друга являются атомом Н или группой, содержащей от 1 до 10 неводородных атомов;

R₃ является атомом Н, -F, -Cl, -Br, -I или -N₃;

Настоящее изобретение применимо к любому типу рака. В контексте настоящего изобретения термин «рак» имеет широкое значение, охватывает любое неопластическое состояние и включает, в частности, злокачественные или предзлокачественные состояния. Рак может быть причиной, или приводить к появлению, или проявляться в форме солидных опухолей, но он не ограничен ими и включает также раки кроветворной системы. В контексте настоящего изобретения термины «рак» и «раковые клетки» использованы как взаимозаменяемые. В контексте настоящего изобретения «опухоль» и «опухолевые клетки» использованы как взаимозаменяемые. При использовании в контексте настоящего изобретения доброкачественные опухоли и злокачественные опухоли также включены в термин «рак», то есть термины «рак» и «опухоль» использованы как взаимозаменяемые. Предпочтительным является лечение злокачественных опухолей.

Поэтому, другими словами, настоящее изобретение обеспечивает соединение Формулы (I) для применения при лечении или профилактике опухоли.

Альтернативно, настоящее изобретение обеспечивает соединение Формулы (I) для применения в качестве противоракового средства. Альтернативно, настоящее изобретение обеспечивает применение соединения Формулы (I) для лечения или профилактики рака.

Альтернативно, настоящее изобретение обеспечивает соединение Формулы (I) для применения в качестве противоопухолевого средства. Альтернативно, настоящее изобретение обеспечивает применение соединения Формулы (I) для лечения или профилактики опухоли.

Альтернативно, этот аспект настоящего изобретения обеспечивает применение соединения Формулы (I) при производстве противоракового терапевтического продукта (то есть препарата или медикамента, например - фармацевтической композиции, рецептуры, комбинированного продукта, объединенного продукта или набора) или, альтернативно, для производства медикамента для применения в качестве противоракового средства или для лечения или профилактики рака.

Альтернативно, этот аспект настоящего изобретения обеспечивает применение соединения Формулы (I) при производстве противоопухолевого терапевтического продукта (то есть препарата или медикамента, например - фармацевтической композиции, рецептуры, комбинированного продукта, объединенного продукта или набора) или, альтернативно, для производства медикамента для применения в качестве противоопухолевого средства или для лечения или профилактики опухоли.

В следующем аспекте настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения или профилактики рака у субъекта, причем этот способ включает введение соединения Формулы (I) этому субъекту.

В следующем аспекте настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения или профилактики опухоли у субъекта, причем этот способ включает введение соединения Формулы (I) этому субъекту.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения соединение Формулы (I) используют в качестве единственного активного агента (единственного активного агента в схеме лечения). Соответственно, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения лечение является монотерапией. Термин «монотерапия» относится к использованию одного лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, в данном случае - рака (то есть опухоли). Соответственно, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения соединение Формулы (I) используют отдельно. Термин «единственный активный агент» (или «единственный активный ингредиент») означает единственный агент или ингредиент, который является терапевтически активным (или биологически активным). Соответственно, такие компоненты, как консерванты, наполнители или агенты, которые не имеют отношения к болезни, подлежащей лечению, не считаются активными агентами.

При лечении или профилактике рака (то есть опухоли) соединение Формулы (I) можно использовать отдельно или, необязательно, в комбинации с другим противораковым средством, то есть с одним или более противораковыми средствами (то есть с дополнительным или вторым противораковым средством (или средствами)).

Соединение Формулы (I), отдельно или в комбинации с другим противораковым средством, можно использовать согласно настоящему изобретению в любом способе лечения или профилактики рака (то есть опухоли) у субъекта.

Как продемонстрировано в Примерах, применение соединения Формулы (I) в комбинации с одном или более другими противораковыми средствами приводит к синергистическим цитотоксическим эффектам.

Соответственно, в следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает соединение Формулы (I) совместно с другим противораковым средством для применения при лечении или профилактике рака (то есть опухоли) или, другими словами, соединение Формулы (I) для применения совместно с другим противораковым средством для лечения или профилактики рака (то есть опухоли).

Альтернативно, этот аспект настоящего изобретения обеспечивает применение соединения Формулы (I) при производстве противоракового (то есть противоопухолевого) терапевтического продукта (то есть препарата или медикамента, например - фармацевтической композиции, рецептуры, комбинированного продукта или набора) или, альтернативно, для производства медикамента для применения в качестве противоракового средства (то есть противоопухолевого средства) или для лечения или профилактики рака (то есть опухоли), причем это лечение дополнительно включает введение другого противоракового средства.

В другом аспекте настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения или профилактики рака (то есть опухоли) у субъекта, причем этот способ включает введение субъекту соединения Формулы (I), необязательно - совместно с другим (то есть вторым) противораковым средством. В частности, в этом аспекте способ включает введение эффективного количества соединения Формулы (I) и необязательного другого противоракового средства.

Соединение Формулы (I) и другое противораковое средство (или другие противораковые средства) могут быть объединены в одну композицию. Однако это не является обязательным. Медикамент может быть комбинированным препаратом, композицией или набором и т.п., и в любом из аспектов настоящего изобретения не является обязательным объединение соединения Формулы (I) и другого противоракового средства (или других противораковых средств) в одну композицию - они могут находиться в разных композициях, и их можно вводить раздельно, в том числе последовательно или одновременно.

Соответственно, настоящее изобретение также обеспечивает набор, содержащий соединение Формулы (I) и другое (то есть одно или более другое или второе) противораковое средство (или другие противораковые средства) для применения при лечении или профилактике рака (то есть опухоли).

Более конкретно, настоящее изобретение обеспечивает продукт (в частности, фармацевтический продукт), содержащий соединение Формулы (I) и другое (то есть одно или более другое или второе) противораковое средство (или другие противораковые средства) в форме комбинированного препарата для раздельного, последовательного или одновременного применения при лечении или профилактике рака (то есть опухоли).

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает продукт (в частности, фармацевтический продукт), содержащий соединение Формулы (I), объединенное с другим (то есть одним или более другим или вторым) противораковым средством (или другими противораковыми средствами).

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую соединение Формулы (I) и одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных средств, необязательно дополнительно содержащую другое противораковое средство.

Во всех аспектах настоящего изобретения соединение по настоящему изобретению является соединением Формулы (I), описанным в любом месте данной публикации, и предпочтительные и возможные варианты осуществления, касающиеся соединения, описанного в связи с одним аспектом настоящего изобретения, применимы, с необходимыми изменениями, ко всем остальным аспектам настоящего изобретения.

Во всех аспектах и вариантах осуществления настоящего изобретения предпочтительным является лечение злокачественных опухолей.

X

X является группой, содержащей от 1 до 20 неводородных атомов, которая содержит по меньшей мере одну функциональную группу, выбранную из альдегидной группы, спиртовой группы, защищенной спиртовой группы, простой эфирной группы, сложноэфирной группы и карбоновой кислоты, при условии, что X не является группой -СООН.

Предпочтительно X является группой, содержащей от 1 до 10 неводородных атомов, более предпочтительно - содержащей от 1 до 5 неводородных атомов, еще более предпочтительно - содержащей от 1 до 3 неводородных атомов, и наиболее предпочтительно - содержащей 2 неводородных атома.

Более предпочтительно X является группой, содержащей по меньшей мере 2 неводородных атома, то есть группой, содержащей от 2 до 20 неводородных атомов. Соответственно, предпочтительно X является группой, содержащей от 2 до 10 неводородных атомов, более предпочтительно - содержащей от 2 до 5 неводородных атомов, еще более предпочтительно - содержащей от 2 до 3 неводородных атомов, и наиболее предпочтительно - содержащей 2 неводородных атома.

Предпочтительно X содержит по меньшей мере одну функциональную группу, выбранную из альдегидной группы, спиртовой группы, защищенной спиртовой группы, простой эфирной группы и сложноэфирной группы. Более предпочтительно, X содержит по меньшей мере одну функциональную группу, выбранную из альдегидной группы, спиртовой группы, простой эфирной группы и сложноэфирной группы. Наиболее предпочтительно, X содержит по меньшей мере одну функциональную группу, выбранную из альдегидной группы и спиртовой группы. Например, X предпочтительно содержит альдегидную функциональную группу. Например, X предпочтительно содержит спиртовую функциональную группу.

Предпочтительно X содержит только одну функциональную группу.

Предпочтительно X является группой, определенной в данной публикации, при условии, что X не является -СООН группой или -ОН группой.

X может быть определена как -L-X', в которой:

L является связью, алкильной, алкенильной, алкинильной, галоалкильной, алкоксильной, галоалкоксильной группой; и

X' является группой -СНО, -ОН, -OPG, -СООН, -OR, -OC(=O)R или -C(=O)OR, причем PG является защитной группой для спирта, такой как ацетильная (Ас), бензильная (Bn) или бензоильная (Bz) группа, и

R является алкильной группой, предпочтительно - метильной группой.

Термин «алкильная группа» относится к неразветвленным и разветвленным насыщенным алифатическим углеводородным цепям. Предпочтительно термин «алкильная группа» относится к C₁-C₁₀ алкильным группам. Примеры алкильных групп включают, но не ограничиваются этим, метильную группу (Me), этильную группу (Et), пропильную группу (например, н-пропильную группу и изопропильную группу), бутильную группу (например, н-бутильную группу, изобутильную группу, трет-бутильную группу) и пентильную групу (например, н-пентильную группу, изопентильную группу, неопентильную группу).

R может быть любой алкильной группой, примеры которых приведены выше. Например, R может быть группой -(СН₂)_nH, где n лежит в диапазоне от 1 до 10, предпочтительно - от 1 до 5, более предпочтительно - от 1 до 3, и наиболее предпочтительно n равно 1. Если n равно 1, то R является группой -СН₃.

Термин «алкенильная группа» относится к неразветвленным и разветвленным углеводородным цепям, содержащим одну или более, предпочтительно - одну или две, углерод-углеродных двойных связей. Предпочтительно термин «алкенильная группа» относится к С₂-С₁₀ алкенильным группам. Примеры алкенильных групп включают, но не ограничиваются этим, этенильную, 1-пропенильную, 2-пропенильную, 2-бутенильную, 3-бутенильную, 2-пентенильную, 3-пентенильную, 4-пентенильную, 2-гексенильную, 3-гексенильную, 4-гексенильную, 5-гексенильную, 2-метил-2-пропенильную и 4-метил-3-пентенильную группы.

Термин «алкинильная группа» относится к неразветвленным и разветвленным углеводородным цепям, содержащим одну или более, предпочтительно - одну или две, углерод-углеродных тройных связей. Предпочтительно термин «алкинильная группа» относится к С₂-С₁₀ алкинильным группам. Примеры алкинильных групп включают, но не ограничиваются этим, этинильную, пропинильную и пропаргильную группы.

Термин «галоалкильная группа» относится к неразветвленным и разветвленным насыщенным алифатическим углеводородным цепям, замещенным 1 или более атомами галогенов (фтора (F), хлора (Cl), брома (Br) и йода (I)). Предпочтительно термин «галоалкильная группа) относится к С₁-С₁₀ галоалкильным группам. Примеры галоалкильных групп включают, но не ограничиваются этим, фторметильную, дифторметильную, трифторметильную, трихлорметильную, пентафторэтильную, пентахлорэтильную, 2,2,2-трифторэтильную, гептафторпропильную и гептахлорпропильную группы.

Термин «алкоксильная группа» относится к -О-алкильной группе. Предпочтительно термин «алкоксильная группа» относится к С₁-С₁₀ алкоксильным группам. Примеры алкоксильных групп включают, но не ограничиваются этим, метоксильную, этоксильную, пропоксильную (например, н-пропоксильную и изопропоксильную) и трет-бутоксильную группы.

Термин «галоалкоксильная группа» относится к галоалкильной группе, определенной выше, присоединенной через кислородный мостик. Предпочтительно термин «галоалкоксильная группа» относится к С₁-С₁₀ галоалкоксильным группам. Примеры галоалкоксильных групп включают, но не ограничиваются этим, трифторметоксильную, 2,2,2-трифторэтоксильную и пентафторэтоксильную группы.

Если X является -L-X', то X группа по-прежнему должна содержать необходимое количество неводородных атомов.

Предпочтительно L является связью, алкильной, алкенильной или алкинильной группой, более предпочтительно - связью или алкильной группой. Например, L может быть связью или С₁-С₆ алкильной группой. Более предпочтительно L является связью или С₁-С₄ алкильной группой. Наиболее предпочтительно L является связью или C₁ алкильной группой (-СН₂-).

X' предпочтительно является -СНО, -ОН, -OPG, -OR, -OC(=O)R или -C(=O)OR, более предпочтительно - -СНО, -ОН, -OR, -OC(=O)R или -C(=O)OR, наиболее предпочтительно -СНО, -ОН, -OR или -OC(=O)R.

Соответственно, предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n лежит в диапазоне от 0 до 6, предпочтительно - от 0 до 4, и более предпочтительно оно равно 0 или 1, и X' является таким, как определено выше, предпочтительно - -СНО, -ОН, -OR или -OC(=O)R, где R является таким, как определено выше.

Предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n лежит в диапазоне от 0 до 6, а X' является -ОН или -СНО. Предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n лежит в диапазоне от 0 до 6, и X' является -ОН. Предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n лежит в диапазоне от 0 до 6, и X' является -СНО.

Более предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n лежит в диапазоне от 0 до 4, и X' является -ОН или -СНО. Предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n лежит в диапазоне от 0 до 4, и X' является -ОН. Предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n лежит в диапазоне от 0 до 4, и X' является -СНО.

Более предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n лежит в диапазоне от 0 до 2, и X' является -ОН или -СНО. Предпочтительно X является -(СН₂)n-Х', причем n лежит в диапазоне от 0 до 2, и X' является -ОН. Предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n лежит в диапазоне от 0 до 2, и X' является -СНО.

Более предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n равно 0 или 1, и X' является -ОН или -СНО. Предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n равно О или 1, и X' является -ОН. Предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n равно 0 или 1, и X' является -СНО.

Более предпочтительно, X является -СНО, -СН₂ОН, -СН₂ОСН₃ или -СН₂ОС(=O)СН₃.

Более предпочтительно, X является а) -СНО или -СН₂ОН; или b) -СН₂ОСН₃ или -СН₂ОС(=O)СН₃.

Более предпочтительно X is -СНО или -СН₂ОН, наиболее предпочтительно -СН₂ОН.

Во всех приведенных выше определениях X предпочтительно, чтобы X не был группой -ОН. Соответственно, если X' является -ОН, то предпочтительно, чтобы L не являлась связью (то есть n не было равно 0), В этом случае n может лежать в диапазоне от 1 до 6, предпочтительно - от 1 до 4, более предпочтительно - от 1 до 2, и наиболее предпочтительно оно равно 1.

W₁ и W₂

W₁ и W₂ независимо друг от друга являются О, S или NH, предпочтительно -О или S, более предпочтительно - О.

Соответственно, W₁ предпочтительно является О или S, a W₂ является О, S или NH; или W₂ является О или S, а W₁ является О, S или NH.

Более предпочтительно W₁ и W₂ обе являются О или S, и еще более предпочтительно - W₁ является О, a W₂ является О или S; или W₂ является О, а W₁ является О или S.

Наиболее предпочтительно обе группы W₁ и W₂ являются О.

Y

Y является атомом Н или группой, содержащей от 1 до 15 неводородных атомов. Предпочтительно Y является атомом Н или группой, содержащей от 1 до 10 неводородных атомов. Более предпочтительно Y является атомом Н или группой, содержащей от 1 до 5 неводородных атомов.

Например, Y может быть Н, -ОН, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I или -N₃, причем PG является защитной группой для спирта, такой как ацетильная, бензильная или бензоильная группы.

Если Y является атомом Н или группой, содержащей от 1 до 5 неводородных атомов, Y может быть Н, -ОН, -ОАс, -F, -Cl, -Br, -I или -N₃.

Наиболее предпочтительно Y является атомом Н.

Z

Z является -OPG, -OR_z или -N(R_xR_y), причем R_x, R_y и R_z независимо друг от друга являются атомом Н или группой, содержащей от 1 до 10 неводородных атомов, и причем PG является защитной группой для спирта, такой как ацетильная, бензильная или бензоильная группа.

Предпочтительно Z является -OR_z или -N(R_xR_y).

Предпочтительно R_z является атомом Н или группой, содержащей от 1 до 5 неводородных атомов, более предпочтительно - атомом Н или группой, содержащей от 1 до 3 неводородных атомов, и наиболее предпочтительно он является атомом Н.

Предпочтительно R_x и R_y независимо друг от друга являются атомом Н или С₁-С₈ сложным эфиром. Более предпочтительно R_x и R_y независимо друг от друга являются атомом Н или -С(O)O(СН₂)_nCH₃, где _n лежит в диапазоне от 1 до 4, предпочтительно - n равно 4.

Предпочтительно по меньшей мере один из радикалов R_x и R_y является атомом Н. Например, предпочтительно R_x является Н, a R_y независимо является атомом Н или -С(O)O(СН₂)_nCH₃, где n лежит в диапазоне от 1 до 4, предпочтительно - n равно 4. Более предпочтительно оба радикала R_x и R_y являются атомами Н.

Поэтому Z предпочтительно является -NH₂ или -ОН. Более предпочтительно Z является -NH₂, если X является -СНО или -СН₂ОН, наиболее предпочтительно - -СН₂ОН; и Z является -ОН, если X является -СН₂ОСН₃ или -СН₂ОС(=O)СН₃.

Если Z является -ОН, то соединение Формулы (I) можно изобразить в таутомерной форме, как показано ниже:

Таутомерная форма Формулы (I), если Z является -ОН

Альтернативно, Z предпочтительно является группами -OPG, -OR_z или -N(R_xR_y), в которых PG, R_x и R_y являются такими, как определено выше, и в которых R_z является группой, содержащей от 1 до 10 неводородных атомов.

В этом случае R_z предпочтительно является группой, содержащей от 1 до 5 неводородных атомов, более предпочтительно - группой, содержащей от 1 до 3 неводородных атомов.

В этом случае Z предпочтительно является группами -OPG или -N(R_xR_y), в которых PG, R_x и R_y являются такими, как определено выше.

Наиболее предпочтительно Z является группой -N(R_xR_y), в которой R_x и R_y являются такими, как определено выше.

Поэтому Z предпочтительно является группой -NH₂.

R₁

R₁ является атомом Н или группой, содержащей от 1 до 15 неводородных атомов, предпочтительно - атомом Н или группой, содержащей от 1 до 13 неводородных атомов.

Предпочтительно R₁ является Н, -ОН, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I, -N₃ или -O(Р(=O)(ОН)O)_nH, где n лежит в диапазоне от 1 до 3, и где PG является защитной группой для спирта, такой как ацетильная, бензильная или бензоильная группа.

Предпочтительно R₁ является Н, -ОН, -F, -Cl, -Br, -I, -N₃ или -O(Р(=O)(ОН)O)_nH, где n лежит в диапазоне от 1 до 3, предпочтительно n равно 3. Более предпочтительно R₁ является Н, -ОН или -O(Р(=O)(ОН)O)_nH, где n лежит в диапазоне от 1 до 3, предпочтительно n равно 3. Еще более предпочтительно R₁ является -ОН или -O(Р(=O)(ОН)O)_nH, где n лежит в диапазоне от 1 до 3, предпочтительно n равно 3. Наиболее предпочтительно R₁ является -ОН.

R₂

R₂ является Н, -ОН, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I или -N₃, где PG является защитной группой для спирта, такой как ацетильная, бензильная или бензоильная группа.

Предпочтительно R₂ является Н, -ОН, -F, -Cl, -Br, -I или -N₃. Более предпочтительно R₂ является Н или -ОН, и наиболее предпочтительно R₂ является -ОН.

R₃

R₃ является Н, -F, -Cl, -Br, -I или -N₃, предпочтительно - Н.

Наиболее предпочтительно R₁ является -ОН или -O(Р(=O)(ОН)O)_nH, где n лежит в диапазоне от 1 до 3, предпочтительно - n равно 3; R₂ является -ОН; и R₃ является Н.

Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения

Предпочтительно соединение Формулы (I) является соединением Формулы (IIa) или Формулы (IIb), или его стереоизомером, сольватом, таутомером или фармацевтически приемлемой солью.

в которых X, R₁ и R₂ являются такими, как определено выше.

Более предпочтительно соединение Формулы (I) является соединением Формулы (Ма) или его стереоизомером, сольватом, таутомером или фармацевтически приемлемой солью.

В этих предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, в частности - в Формуле (IIa), X предпочтительно является группой - (СН₂)_n-Х', в которой n лежит в диапазоне от 0 до 6, а X' является -ОН или -СНО. Предпочтительно X является группой -(СН₂)_n-Х', в которой n лежит в диапазоне от 0 до 6, а X' является -ОН. Предпочтительно X является группой -(СН₂)_n-Х', в которой n лежит в диапазоне от 0 до 6, а X' является -СНО.

Более предпочтительно X является группой -(СН₂)_n-Х', в которой n лежит в диапазоне от 0 до 4, а X' является -ОН или -СНО. Предпочтительно X является группой -(СН₂)_n-Х', в которой n лежит в диапазоне от 0 до 4, а X' является -ОН. Предпочтительно X является группой -(СН₂)_n-Х', в которой n лежит в диапазоне от 0 до 4, а X' является -СНО.

Более предпочтительно X является группой -(СН₂)_n-Х', в которой n лежит в диапазоне от 0 до 2, а X' является -ОН или -СНО. Предпочтительно X является группой -(СН₂)_n-Х', в которой n лежит в диапазоне от 0 до 2, а X' является -ОН. Предпочтительно X является группой -(СН₂)_n-Х', в которой n лежит в диапазоне от 0 до 2, а X' является -СНО.

Более предпочтительно X является группой -(СН₂)_n-Х', в которой n равно 0 или 1, а X' является -ОН или -СНО. Предпочтительно X является группой -(СН₂)_n-X', в которой n равно 0 или 1, а X' является -ОН. Предпочтительно X является группой -(СН₂)_n-Х', в которой n равно 0 или 1, а X' является -СНО.

Более предпочтительно X является -СНО, -СН₂ОН, -СН₂ОСН₃ или -СН₂ОС(=O)СН₃. Более предпочтительно X является а) -СНО или -СН₂ОН; или b) -СН₂ОСН₃ или -СН₂ОС(=O)СН₃. Более предпочтительно X является -СНО или -СН₂ОН, наиболее предпочтительно - -СН₂ОН

В Формуле (IIa) X предпочтительно является -СНО или -СН₂ОН, наиболее предпочтительно -СН₂ОН. В Формуле (IIb) X предпочтительно является -СН₂ОСН₃ или -СН₂ОС(=O)СН₃.

Во всех этих предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения предпочтительно, чтобы X не являлся -ОН. Соответственно, если X' является -ОН, то предпочтительно, чтобы n не было равно 0. В этом случае n может лежать в диапазоне от 1 до 6, предпочтительно - от 1 до 4, более предпочтительно - от 1 до 2, и наиболее предпочтительно n равно 1.

В Формулах (IIa) и (IIb) R₁ предпочтительно является -ОН или -O(Р(=O)(ОН)O)_nH, где n лежит в диапазоне от 1 до 3, предпочтительно n равно 3; и R₂ является -ОН.

Более предпочтительно соединение Формулы (I) является соединением Формулы (IIIa), (IIIb), (IIIc) или (IIId) или его стереоизомером, сольватом, таутомером или фармацевтически приемлемой солью:

причем X является таким, как определено выше.

Более предпочтительно соединение Формулы (I) является соединением Формулы (IIIa), (IIIb) или (IIIc) или его стереоизомером, сольватом, таутомером или фармацевтически приемлемой солью.

Еще более предпочтительно соединение Формулы (I) является соединением Формулы (IIIa) или (IIIc) или его стереоизомером, сольватом, таутомером или фармацевтически приемлемой солью.

В Формулах (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), в частности - в Формулах (IIIa) и (IIIc), X предпочтительно является -(СН₂)_n-Х', причем n лежит в диапазоне от 0 до 6, и X' является -ОН или -СНО. Предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n лежит в диапазоне от 0 до 6, и X' является -ОН. Предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n лежит в диапазоне от 0 до 6, и X' является -СНО.

Более предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n лежит в диапазоне от 0 до 2, и X' является -ОН или -СНО. Предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n лежит в диапазоне от 0 до 2, и X' является -ОН. Предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n лежит в диапазоне от 0 до 2, и X' является -СНО.

Более предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n равно 0 или 1, и X' является -ОН или -СНО. Предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n равно 0 или 1, и X' является -ОН. Предпочтительно X является -(СН₂)_n-Х', причем n равно 0 или 1, и X' является -СНО.

Более предпочтительно X является -СНО, -СН₂ОН, -СН₂ОСН₃ или -СН₂ОС(=O)СН₃. Более предпочтительно X является а) -СНО или -СН₂ОН; или b) -СН₂ОСН₃ или -СН₂ОС(=O)СН₃. Более предпочтительно X является -СНО или -СН₂ОН, наиболее предпочтительно - -СН₂ОН.

В Формуле (IIIa) и Формуле (IIIc) X предпочтительно является -СНО или -СН₂ОН, наиболее предпочтительно - -СН₂ОН. В Формуле (IIIb) и Формуле (IIId), X предпочтительно является -СН₂ОСН₃ или -СН₂ОС(=O)СН₃.

Наиболее предпочтительно соединение Формулы (I) является соединением Формулы (IVa), (IVb), (IVc), (IVd), (IVe) или (IVf) или его стереоизомером, сольватом, таутомером или фармацевтически приемлемой солью:

Формула (IVa) является 5-формил-2'-дезоксицитидином (также обозначаемым как 5f2dC, 5fdC, 2d5fC и d5fC в данной публикации). Формула (IVb) является 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином (также обозначаемым как 5hm2dC, 5hmdC, 2d5hmC и d5hmC в данной публикации). Формула (IVc) является 5-метоксиметил-2'-дезоксиуридином. Формула (IVd) является 5-ацетоксиметил-2'-дезоксиуридином. Формула (IVe) является 5-формил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфатом. Формула (IVf) является 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфатом.

Поэтому предпочтительно соединение для использования по настоящему изобретению выбрано из 5-формил-2'-дезоксицитидина, 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидина, 5-метоксиметил-2'-дезоксиуридина, 5-ацетоксиметил-2'-дезоксиуридина, 5-формил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата или их стереоизомеров, сольватов, таутомеров или фармацевтически приемлемых солей. Более предпочтительно соединение является а) 5-формил-2'-дезоксицитидином или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином или его стереоизомером, сольватом, таутомером или фармацевтически приемлемой солью; или b) 5-метоксиметил-2'-дезоксиуридином или 5-ацетоксиметил-2'-дезоксиуридином или его стереоизомером, сольватом, таутомером или фармацевтически приемлемой солью.

Альтернативно, соединение для использования по настоящему изобретению предпочтительно выбрано из 5-формил-2'-дезоксицитидина, 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидина, 5-формил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата или его стереоизомера, сольвата, таутомера или фармацевтически приемлемой соли.

Наиболее предпочтительно соединение является 5-формил-2'-дезоксицитидином или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином или его стереоизомером, сольватом, таутомером или фармацевтически приемлемой солью, наиболее предпочтительно - 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином или его стереоизомером, сольватом, таутомером или фармацевтически приемлемой солью.

При использовании в контексте настоящего лечения термины «лечение» или «терапия» включают любое лечение или любую терапию, которые приводят к улучшению здоровья или состояния пациента или к облегчению симптома рака, которым они страдают. «Лечение» не ограничено радикальными видами лечения (например, такими, которые приводят к удалению раковых клеток, опухолей или метастазов из организма пациента), но включает любую терапию, которая оказывает полезный эффект на рак или на пациента, например - вызывает регрессию или уменьшение опухоли, снижение метастатического потенциала, увеличение общей выживаемости, увеличивает или продлевает срок жизни или продолжительность ремиссии, вызывает ремиссию, замедляет или снижает прогресс заболевания или скорость прогресса заболевания или развития опухоли, повышает субъективно воспринимаемое качество жизни, снижает боль или другие симптомы, связанные с болезнью, повышает аппетит, снижает тошноту или облегчает любые симптомы рака.

Соответственно, при использовании в контексте настоящего изобретения термин «лечение» может относиться к уменьшению, облегчению, снижению интенсивности или устранению рака или одного или более симптомов рака, подлежащих лечению, по сравнению с выраженностью рака или симптома до лечения. Лечение может включать уменьшение числа или удаление раковых клеток, например - содержащихся в опухолях, например - в солидных опухолях. Лечение является лечением субъекта, то есть субъекта, нуждающегося в лечении. Соответственно, лечение может включать уменьшение размеров опухоли или предотвращение роста опухоли или дальнейшего роста опухоли, то есть стабилизацию размеров опухоли.

Термин «профилактика» относится к задержке или предотвращению появления симптомов рака, например - при развитии опухоли.

Предпочтительно соединения по настоящему изобретению оказывают прямой эффект на раковые/опухолевые клетки. При использовании в контексте настоящего изобретения термин «прямой эффект» означает, что соединения по настоящему изобретению непосредственно взаимодействуют с раковыми/опухолевыми клетками для оказания противораковых/противоопухолевых эффектов. Другими словами, соединения по настоящему изобретению, то есть соединения Формулы (I), предпочтительно являются цитотоксичными для раковых/опухолевых клеток. Предпочтительно соединения по настоящему изобретению вводят субъекту, чтобы вызвать прямой эффект на раковые/опухолевые клетки.

Способы по настоящему изобретению предпочтительно не включают введение соединений по настоящему изобретению с целью истощения популяции клеток, которые были введены в качестве части клеточной терапии. Клеточные терапии хорошо известны как терапии, в которых субъекту вводят популяцию клеток, чтобы вызвать определенный терапевтический эффект. Хорошо известные клеточные терапии включают Т-клеточную терапию, например - терапию Т-клетками с химерными рецепторами антигена (CAR; от англ.: chimeric antigen receptor).

Способы по настоящему изобретению предпочтительно не включают введение соединений по настоящему изобретению после введения популяции клеток, которая была введена в качестве части клеточной терапии.

Способы по настоящему изобретению предпочтительно не включают CAR-Т-клеточную терапию. Предпочтительно способы по настоящему изобретению не включают Т-клеточную терапию. Предпочтительно способы по настоящему изобретению не включают клеточные терапии.

Предпочтительно способы по настоящему изобретению включают введение соединения по настоящему изобретению субъекту, не проходящему CAR-T-клеточную терапию, предпочтительно - не проходящему Т-клеточную терапию, предпочтительно - не проходящему клеточную терапию. Другими словами, предпочтительно субъект не получал и не будет получать CAR-T-клеточную терапию, предпочтительно - Т-клеточную терапию, предпочтительно - клеточную терапию, в качестве части его лечения.

В контексте настоящего изобретения «субъектом» может быть человек или животное, предпочтительно - млекопитающее животное, например - корова, лошадь, овца, свинья, коза, кролик, кошка, собака, особо предпочтительно - человек. Таким образом, раки, о которых идет речь в данной публикации, предпочтительно являются раками человека, а опухоли, о которых идет речь в данной публикации, предпочтительно присутствуют в организме человека.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способы лечения по настоящему изобретению могут быть использованы у субъектов с риском рецидива, повторного появления или метастазирования рака. Поэтому, альтернативно, соединения Формулы (I) можно использовать для предотвращения рецидива, повторного появления или метастазирования рака.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение может включать первоначальную идентификацию или определение того, что у субъекта, который будет получать лечение, имеется рак (то есть опухоль), или он является восприимчивым к раку, или у него существует риск возникновения рака.

Альтернативно или дополнительно настоящее изобретение может включать оценку или мониторинг эффекта введения соединения Формулы (I) и/или другого противоракового средства (или средств) на субъекта или, более конкретно, на рак (опухоль), или на развитие или прогресс рака (опухоли). Процедуры и средства для оценки и/или мониторинга противоракового эффекта хорошо известны в данной области техники, например - посредством определения или мониторинга симптомов, клинического состояния, размера или распространенности опухоли (например, с использованием способов визуализации) или других индикаторов рака или опухоли, например - раковых/опухолевых маркеров и т.п.

Как указано выше, настоящее изобретение применимо к любому типу рака. В контексте настоящего изобретения термин «рак» имеет широкое значение, охватывает любое неопластическое состояние и включает, в частности, злокачественные или предзлокачественные состояния. Рак может быть причиной, или приводить к появлению, или проявляться в форме солидных опухолей, но он не ограничен ими и включает также раки кроветворной системы. При использовании в контексте настоящего изобретения доброкачественные опухоли и злокачественные опухоли также включены в термин «рак», то есть термины «рак» и «опухоль» использованы как взаимозаменяемые. Предпочтительным является лечение злокачественных опухолей.

Рак/опухоль может возникнуть в любой ткани или органе организма. Например, настоящее изобретение можно использовать для лечения или профилактики любого из следующих видов рака у пациента или субъекта: рака центральной нервной системы, предпочтительно - рака головного мозга, предпочтительно - глиомы; острого лимфобластного лейкоза (ALL; от англ.: Acute Lymphoblastic Leukaemia); острого миелоидного лейкоза (AML; от англ.: Acute Myeloid Leukaemia); адренокортикальной карциномы; рака, связанного со СПИДом (например, саркомы Капоши и лимфомы); анального рака; рака аппендикса; базальноклеточной карциномы; рака желчных протоков; внепеченочного рака желчного пузыря; рака костей (например, саркомы Юинга, остеосаркомы и злокачественной фиброзной гистиоцитомы); рака молочной железы; опухолей бронхов; лимфомы Беркитта; карциноидной опухоли; кардиальных опухолей (опухолей сердца); рака шейки матки (цервикальной аденокарциномы); хордомы; острого промиелоцитарного лейкоза; хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL; от англ.: Chronic Lymphocytic Leukaemia); хронического миелогенного лейкоза (CML; от англ.: Chronic Myelogenous Leukaemia); хронического миелопролиферативного заболевания; рака ободочной кишки; коло ректального рака; Т-клеточной лимфомы кожи; рака желчных протоков; внепеченочной карциномы желчных протоков in situ (DCIS; от англ.: Ductal Carcinoma In Situ); эмбриональных опухолей; рака эндометрия; рака пищевода; эстезионейробластомы; саркомы Юинга; экстракраниальной герминогенно-клеточной опухоли; экстрагонадной герминогенно-клеточной опухоли; внепеченочного рака желчных протоков; рака глаз (включая интраокулярную меланому и ретинобластому); фиброзной гистиоцитомы костей; рака желчного пузыря; гастрального рака (рака желудка); гастроинтестинальной карциноидной опухоли; гастроинтестинальных стромальных опухолей (GIST; от англ.: Gastrointestinal Stromal Tumours); герминогенной опухоли; гестационной трофобластической болезни; волосатоклеточного лейкоза; рака головы и шеи; рака сердца; гепатоклеточного рака (печени); гистиоциоза из клеток Лангерганса; лимфомы Ходжкина; гипофарингеального рака; интраокулярной меланомы; опухолей из островковых клеток; панкреатических нейроэндокринных опухолей; саркомы Капоши; рака почек (включая почечноклеточный рак и опухоль Вильмса); гистиоциоза из клеток Лангерганса; рака гортани; лейкоза (включая острый лимфобластный лейкоз (ALL); острый миелоидный лейкоз (AML); хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL); хронический миелогенный лейкоз (CML)); рака губ и ротовой полости; рака печени (первичного); лобулярной карциномы in situ (LCIS; от англ.: Lobular Carcinoma In Situ); рака легких; лимфомы; макроглобулинемии Вальденстрема; меланомы (злокачественной меланомы); карциномы из клеток Меркеля; мезотелиомы; метастатического плоскокпеточного рака шеи неизвестного происхождения; карциномы средней линии с NUT-перегруппировкой; рака ротовой полости; синдромов множественной эндокринной неоплазии у детей; множественной миеломы/неоплазмы из плазматических клеток; грибовидного микоза (Mycosis fungoides); миелодиспластических синдромов; миелодиспластических/миелопролиферативных неоплазм; множественной миеломы; миелопролиферативных заболеваний; рака носовой полости и параназальных синусов; назофарингеального рака; нейробластомы; неходжкинской лимфомы; немелкоклеточного рака легких; орального рака; рака ротовой полости; орофарингеального рака; остеосаркомы; рака яичников (аденокарциномы яичников); рака поджелудочной железы; панкреатических нейроэндокринных опухолей (опухолей из островковых клеток); папилломатоза; параганглиомы; рака параназальных синусов и носовой полости; рака пара щитов ид ной железы; рака полового члена; рака глотки; феохромоцитомы; эпителиальной аденокарциномы; неоплазмы из плазматических клеток/множественной миеломы; плевропульмональной бластомы; рака при беременности и рака молочной железы; рака предстательной железы; рака прямой кишки; почечноклеточного рака (рака почек); рака почечной лоханки и мочеточника; переход но клеточного рака; ретинобластомы; рабдомиосаркомы; рака слюнной железы; саркомы; синдрома Сезари; рака кожи; мелкоклеточного рака легкого; рака тонкого кишечника; саркомы мягких тканей; плоскокпеточной карциномы; плоскоклеточного рака шеи неизвестного происхождения; метастатического рака желудка (гастрального рака); Т-клеточной лимфомы; рака яичка; рака горла; тимомы и карциномы тимуса; рака щитовидной железы; переходноклеточного рака почечной лоханки и мочеточника; рака уретры; рака матки; саркомы эндометрия матки; рака влагалища; рака вульвы; макроглобулинемии Вальденстрема и опухоли Вильмса.

Клетки человеческого эмбриона образуют три определенных зародышевых листка: наружную эктодерму, внутреннюю эндодерму и мезодерму, которая развивается между эктодермой и эндодермой. Все органы организма планомерно развиваются или дифференцируются из этих трех первичных зародышевых листков.

В настоящем изобретении рак/опухоль предпочтительно является раком/опухолью ткани, производной из эктодермы, параксиальной мезодермы или боковой пластинки мезодермы, предпочтительно - из эктодермы.

Предпочтительно рак является раком центральной нервной системы, предпочтительно - раком головного мозга. Во избежание неверного толкования, рак головного мозга в данной области техники и в данной публикации считается раком центральной нервной системы. Центральная нервная система состоит из головного мозга и спинного мозга. Соответственно, опухоль предпочтительно является опухолью центральной нервной системы, предпочтительно - опухолью головного мозга. Предпочтительно рак/опухоль ЦНС выбран из группы, состоящей из лимфомы ЦНС, рабдоидной опухоли, эмбриональных опухолей, герминогенно-кпеточной опухоли и хордомы, или он является раком/опухолью головного мозга. Предпочтительно рак/опухоль головного мозга выбран из группы, состоящей из глиомы, невриномы слухового нерва, лимфомы ЦНС, краниофарингиомы, медуллобластомы, менингиомы, метастатической опухоли головного мозга, опухолей гипофиза, примитивной нейроэктодермальной опухоли (PNET; от англ.: Primitive Neuroectodermal Tumor), шванномы, опухоли эпифиза, трилатеральной ретинобластомы и рабдоидной опухоли.

Наиболее предпочтительно рак/опухоль является раком головного мозга/опухолью головного мозга, более предпочтительно - глиомой. Глиома может быть глиомой любого типа, например - астроцитомой, эпендимомой, субэпендимомой, олигодендроглиомой, глиомой ствола головного мозга, глиомой зрительного нерва или смешанной глиомой.

Предпочтительно глиома является астроцитомой. Астроцитома может быть астроцитомой I степени (предпочтительно - пилоцитарной астроцитомой или субэпендимальной гигантокпеточной астроцитомой), астроцитомой II степени (предпочтительно - низкодифференцированной астроцитомой, плеоморфной ксантоастроцитомой или смешанной олигоастроцитомой), астроцитомой III степени (анапластической астроцитомой) или, наиболее предпочтительно, астроцитомой IV степени (глиобластомой).

Системы оценок для классификации опухоли центральной нервной системы хорошо известны специалистам в данной области техники. Предпочтительно используют систему оценки Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ). Система оценки ВОЗ хорошо известна в данной области техники и основана на появлении определенных характеристик: атипии, митоза, пролиферации эндотелия некроза, которые отражают злокачественный потенциал опухоли в отношении инвазии и скорости роста.

Глиомы можно также классифицировать в зависимости от того, расположены они выше или ниже намета мозжечка (тенториума) - мембраны, которая отделяет мозг от мозжечка. Супратенториальные глиомы обнаруживаются выше тенториума - в мозге, тогда как инфратенториальные глиомы обнаруживаются ниже тенториума - в мозжечке. Глиома, которую лечат по настоящему изобретению, может быть супратенториальной глиомой или инфратенториальной глиомой.

Таким образом, в контексте настоящего изобретения рак/опухоль особо предпочтительно является глиомой, наиболее предпочтительно - глиомой IV степени, то есть мультиформной глиобластомой. Мультиформная глиобластома является злокачественной астроцитомой и наиболее часто встречающейся первичной опухолью головного мозга у взрослых. Мультиформная глиобластома также известна как глиома IV степени, глиобластома и GBM (от англ. glioblastoma multiforme - мультиформная глиобластома).

Предпочтительно рак/опухоль выбран из группы, состоящей из рака головного мозга (как определено выше, предпочтительно - глиомы, более предпочтительно - глиобластомы), рака желудка, рака поджелудочной железы, лимфомы, рака легкого, рака кожи, острого промиелоцитарного лейкоза, рака яичника, рака молочной железы, рака кости и рака шейки матки.

Более предпочтительно рак/опухоль выбран из группы, состоящей из рака головного мозга (как определено выше, предпочтительно - глиомы, более предпочтительно - глиобластомы), рака желудка, лимфомы, рака молочной железы и рака шейки матки.

Предпочтительно рак/опухоль выбран из группы, состоящей из рака головного мозга (как определено выше, предпочтительно - глиомы, более предпочтительно - глиобластомы), рака желудка, рака поджелудочной железы, рака кожи, острого промиелоцитарного лейкоза, рака молочной железы и рака шейки матки.

Предпочтительно рак/опухоль выбран из группы, состоящей из рака головного мозга (как определено выше, предпочтительно - глиомы, более предпочтительно - глиобластомы), рака кожи и рака молочной железы, более предпочтительно - из рака головного мозга (как определено выше, предпочтительно - глиомы, более предпочтительно - глиобластомы) и рака кожи.

В этих вариантах осуществления настоящего изобретения предпочтительными соединениями по настоящему изобретению являются соединения, в которых X содержит альдегидную функциональную группу, предпочтительно - соединения, в которых X является группой -(СН₂)_n-Х', в которой X' является группой -СНО, а n лежит в диапазоне от 0 до 6, более предпочтительно - от 0 до 4, еще более предпочтительно - от 0 до 2, более предпочтительно - n равно 0 или 1, и наиболее предпочтительно X является группой -СНО, и предпочтительно Z является группой -NH₂. Как продемонстрировано в примерах осуществления настоящего изобретения, такие соединения по настоящему изобретению обладают выгодной широкой цитотоксичностью против широкого спектра типов рака при ограниченной цитотоксичности против нераковых клеток.

Альтернативно, рак/опухоль предпочтительно выбран из группы, состоящей из рака головного мозга (как определено выше, предпочтительно - глиомы, более предпочтительно - глиобластомы) и хронического миелогенного лейкоза. В этих вариантах осуществления настоящего изобретения предпочтительными соединениями по настоящему изобретению являются соединения, в которых X содержит спиртовую функциональную группу, предпочтительно - в которых X является группой -(СН₂)_n-Х', в которой X' является группой -ОН, а n лежит в диапазоне от 0 до 6, более предпочтительно - от 0 до 4, еще более предпочтительно - от 0 до 2, более предпочтительно - n равно 0 или 1, и наиболее предпочтительно X является группой -СН₂ОН, и предпочтительно Z является группой -NH₂. Как продемонстрировано в примерах осуществления настоящего изобретения, такие соединения по настоящему изобретению обладают выгодной специфической цитотоксичностью против этих предпочтительных типов рака при ограниченной цитотоксичности против нецелевых раковых и нераковых клеток.

Предпочтительно опухоль желудка является карциномой желудка. Предпочтительно опухоль поджелудочной железы является карциномой поджелудочной железы. Предпочтительно рак кожи является злокачественной меланомой. Предпочтительно рак яичника является аденокарциномой яичника. Предпочтительно рак молочной железы является эпителиальной аденокарциномой. Предпочтительно рак кости является остеосаркомой кости. Предпочтительно рак легкого является метастатической аденокарциномой, предпочтительно - немелкоклеточной аденокарциномой. Предпочтительно рак шейки матки является аденокарциномой шейки матки.

Тем не менее, предпочтительно рак не является раком легкого или раком молочной железы. Предпочтительно рак также не является раком поджелудочной железы, раком желудка, раком яичка или раком влагалища. Предпочтительно рак также не является раком почки или раком кишечника.

Предпочтительно рак не является раком легкого. Предпочтительно рак также не является раком предстательной железы, раком почки, раком печени, раком молочной железы, раком ободочной кишки, раком яичника или раком шейки матки.

Предпочтительно рак/опухоль не является раком ободочной кишки, раком легкого, раком предстательной железы или раком почки. Предпочтительно рак/опухоль также не является раком поджелудочной железы.

Предпочтительно рак/опухоль также не является хроническим миелогенным лейкозом, и в этом случае предпочтительные соединения по настоящему изобретению (то есть соединения Формул (I), (IIa), (IIb), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId), (IVa), (IVb), (IVc), (IVd), (IVe) и (IVf)) являются соединениями, в которых X содержит альдегидную функциональную группу, предпочтительно - в которых X является группой -(СН₂)_n-Х', в которой X' является группой -СНО, а n лежит в диапазоне от 0 до 6, более предпочтительно - от 0 до 4, еще более предпочтительно - от 0 до 2, более предпочтительно - n равно 0 или 1, и наиболее предпочтительно X является группой -СНО, и предпочтительно Z является группой -NH₂.

Кроме того, рак предпочтительно не является:

i) раком молочной железы, предпочтительно он также не является раком поджелудочной железы, раком желудка, раком яичка или раком влагалища, более предпочтительно он также не является раком кишечника; и/или

ii) раком печени, раком молочной железы, раком яичника или раком шейки матки.

Предпочтительно рак не является раком, выбранным из группы, состоящей из рака легкого, рака предстательной железы, рака почки, рака печени, рака молочной железы, рака ободочной кишки, рака яичника, рака шейки матки, хронического миелогенного лейкоза, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичка, рака влагалища и рака кишечника. Предпочтительно рак не является любым из этих видов рака.

Предпочтительно рак молочной железы, который лечат по настоящему изобретению,

i) является инвазивной протоковой карциномой,

ii) экспрессирует белок р53 дикого типа; и/или

iii) не является трижды негативным, то есть экспрессирует один или более из рецептора эстрогенов (ER+), рецептора прогестерона (PR+) и HER2 (HER2+), предпочтительно - ER+ и PR+; и/или

iv) является гетерозиготным по гену белка р53.

Раки молочной железы, которые предпочтительно не лечат по настоящему изобретению, предпочтительно являются только такими раками молочной железы, которые:

i) являются аденокарциномами; и/или

ii) являются трижды негативными, то есть не экспрессируют рецептор эстрогена (ER-), рецептор прогестерона (PR-) или HER2 (HER2-); и/или

iii) экспрессируют мутантный вариант белка р53; и/или

iv) является гомозиготным по гену белка р53.

Белок человека цитидиндеаминаза (CDA) катализирует гидролитическое дезаминирование цитидина и дезоксицитидина до уридина и дезоксиуридина, соответственно. Некоторые известные противораковые средства являются аналогами нуклеозидов/нуклеотидов, например - гемцитабин (2,2-дифтордезоксицитидин) и цитарабин (Ара-С, цитозина арабинозид). Проблемой является то, что CDA инактивирует такие противораковые средства, в том числе гемцитабин и цитарабин. Как продемонстрировано в примерах осуществления настоящего изобретения, соединения по настоящему изобретению оказывают свои цитотоксические эффекты независимо от экспрессии CDA.

Соответственно, в предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения рак/опухоль является раком/опухолью, который экспрессирует CDA, предпочтительно - в котором CDA:

i) гиперэкспрессирована;

ii) не гиперэкспрессирована;

iii) недоэкспрессирована;

iv) не недоэкспрессирована;

v) гиперэкспрессирована или недоэкспрессирована; или

vi) не гиперэкспрессирована и не недоэкспрессирована.

Каждый из типов рака/опухоли с i) по vi), указанных выше, представляет собой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения. В особо предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рак/опухоль, который лечат по настоящему изобретению, является раком, в котором CDA не гиперэкспрессирована.

В контексте экспрессии генов раком/опухолью термины «гиперэкспрессированный» и «недоэкспрессированный» имеют ясный и общеизвестный смысл, а именно - повышенные/более высокие или сниженные/более низкие уровни экспрессии, соответственно.

Гиперэкспрессия (или повышенные или более высокие уровни экспрессии) или недоэкспрессия (или сниженные/более низкие уровни экспрессии) могут быть определены по сравнению с соответствующим контролем (например, контрольным уровнем или уровнем в контрольном образце или биоптате). Например, контрольный уровень может быть уровнем в образце (например, в образце крови или сыворотки или в образце или биоптате ткани) от здорового субъекта (например, субъекта, не имеющего рака). Соответствующие контрольные уровни (или контрольные образцы или значения) могут быть легко выбраны специалистом в данной области техники. Соответствующие контрольные «значения» также можно легко определить без исследования контрольного «образца» в каждом испытании, например - посредством ссылки на диапазон значений для нормальных субъектов.

Предпочтительно термины «гиперэкспрессированный» и «недоэкспрессированный» означают, что уровень РНК-транскрипта соответствующего гена в раковых клетках выше (гиперэкспрессия) или ниже (недоэкспрессия), чем уровень в нераковых клетках из той же ткани, что и раковые клетки, при оценке с использованием одного и того же способа и одних и тех же условий в обоих случаях. Предпочтительные способы и условия для оценки уровня экспрессии гена, например - экспрессии CDA, являются такими же, как раскрыто в литературе.

Предпочтительно гиперэкспрессия или недоэкспрессия являются значимыми. Под значимой гиперэкспрессией/недоэкспрессией, то есть значимо более высокой/более низкой экспрессией, понимают статистически значимую гиперэкспрессию/недоэкспрессию (статистически значимо более высокую/более низкую экспрессию). «Статистически значимый» означает, что наблюдаемый повышенный или пониженный уровень больше, чем можно было ожидать в результате случайного его возникновения. Статистическую значимость определяют любым способом, известным в данной области техники. Например, статистическую значимость определяют по значению вероятности (р-критерию). Значения р-критерия являются мерой вероятности того, что разница между группами во время эксперимента является случайной. Например, значение р-критерия, равное 0,01, означает, что существует 1 шанс из 100 того, что результат является случайным. Чем меньше значение р-критерия, тем больше вероятность того, что разница между группами вызвана лечением. Предпочтительным является значение вероятности менее 0,05 или менее 0,01.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения повышенные уровни экспрессии (то есть гиперэкспрессия) могут соответствовать увеличению по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50% (например, по сравнению с контрольным уровнем). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пониженные уровни экспрессии (то есть недоэкспрессия) могут соответствовать снижению по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50% (например, по сравнению с контрольным уровнем).

Предпочтительно уровень экспрессии генов в клетках, представляющих интерес, определяют посредством обращения к базе данных, содержащей такую информацию. Такие ресурсы, как Атлас генома рака (TCGA; от англ.: The Cancer Genome Atlas, https://cancergenome.nih.gov/), Атлас экспрессии генов Европейской лаборатории молекулярной биологии-Европейского института биоинформатики (EMBL-EBI; от англ.: European Molecular Biology Laboratory - European Bioinformatics Institute, https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), атлас белков человека (https://www.proteinatlas.org/), GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/), Энциклопедия линий раковых клеток (https://portals.broadinstitute.org/ccle) и другие, содержат информацию об уровнях экспрессии генов широкого спектра типов клеток, в том числе раковых, а также обеспечивают статистические данные о том, является ли уровень экспрессии генов в определенном типе раковых клеток значимо более высоким или более низким, чем в нераковых клетках из той же ткани (то есть является ли ген гиперэкспрессированным или недоэкспрессированным в раковых клетках этого типа). Указанные базы данных являются предпочтительными. Таким образом, можно легко идентифицировать типы рака со статистически значимой гиперэкспрессией или недоэкспрессией гена, представляющего интерес. Специалист в данной области техники способен использовать указанные ресурсы для этой цели.

Поэтому предпочтительно рак/опухоль в контексте настоящего изобретения является таким, что уровень экспрессии CDA в этом раке/опухоли определен посредством обращения к базе данных, выбранной из базы данных Атласа экспрессии генов EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), базы данных GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/), Энциклопедии линий раковых клеток (https://portals.broadinstitute.org/ccle) и Атласа белков человека (https://www.proteinatlas.org/).

Предпочтительно рак/опухоль не экспрессирует CDA на уровне, превышающем уровень экспрессии в нераковых клетках из той же ткани, что и рак/опухоль, причем указанная гиперэкспрессия определена посредством обращения к базе данных, выбранной из базы данных Атласа экспрессии генов EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), базы данных GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/), Энциклопедии линий раковых клеток (https://portals.broadinstitute.org/ccle) и Атласа белков человека (https://www.proteinatlas.org/).

Предпочтительно рак/опухоль является раком/опухолью, в котором уровень экспрессии CDA не превышает 90% от уровня экспрессии CDA в эталонной линии раковых клеток при определении с использованием того же способа в тех же условиях, причем эталонной линией раковых клеток является линия MDA-MB-231.

MDA-MB-231 - это хорошо изученная линия клеток, которая широко доступна коммерчески. Линия клеток MDA-MB-231 - это линия клеток эпителиального рака молочной железы человека, которая была впервые получена из плеврального выпота 51-летней белой европеоидной женщины с метастатической аденокарциномой молочной железы, и это одна из чаще всего используемых в медицинских исследовательских лабораториях линий клеток рака молочной железы. Ее можно получить, например, из Европейской коллекции аутентичных культур клеток (ЕСАСС; от англ.: European Collection of Authenticated Cell Cultures), номер по каталогу 92020424. Как показано в Таблице 4А, уровень экспрессии CDA в линии клеток MDA-MB-231 равен 153 транскриптам/млн (ТРМ).

MDA-MB-231 - это линия клеток высокоагрессивного, инвазивного и низкодифференцированного трижды негативного рака молочной железы (TNBC; от англ.: triple-negative breast cancer), поскольку она не экспрессирует рецептор эстрогена (ER) и рецептор прогестерона (PR), а также не амплифицирует HER2 (рецептор 2 эпидермального фактора роста человека). Эта линия клеток признана относящейся к низкоклаудиновому молекулярному подтипу, поскольку она обнаруживает даун-регуляцию клаудина-3 и клаудинина-4, низкую экспрессию маркера пролиферации Ki-67, повышенное содержание маркеров, связанных с эпителиально-мезенхимальным переходом и экспрессию признаков, связанных со стволовыми клетками рака молочной железы (CSCs; от англ.: cancer stem cells), таких как CD44+CD24-/низкого фенотипа. В 3D-культуре клеточная линия обнаруживает эндотелиоподобную морфологию, и она отличается инвазивным фенотипом, наличием звездчатых отростков, которые часто связывают множество клеток с образованием колоний. Стандартные условия для культивирования этой линии клеток хорошо известны. Предпочтительными условиями культивирования являются выращивание при 37°С в среде Лейбовица L-15 с добавлением 2 мМ глутамина и 15% плодной сыворотки коров (FBS; от англ.: foetal bovine serum). Эта среда поддерживает рост клеток в условиях без равновесия CO₂. Клетки MDA-MB-231 предпочтительно высевают с плотностью, лежащей в диапазоне от 1×10⁴ до 3×10⁴ клеток/см² и субкультивируют при 70%-80%-ном слиянии монослоя.

Предпочтительно рак/опухоль является раком/опухолью, в котором уровень экспрессии CDA составляет не более 80%, предпочтительно - не более 70%, предпочтительно - не более 60%, предпочтительно - не более 50%, предпочтительно - не более 40%, предпочтительно - не более 30%, предпочтительно - не более 25% от уровня экспрессии CDA в эталонной линии раковых клеток при определении с использованием того же способа в тех же условиях, причем эталонной линией раковых клеток является линия MDA-MB-231.

Предпочтительно рак/опухоль является раком/опухолью, в котором уровень экспрессии CDA по меньшей мере в 2 раза ниже, предпочтительно - по меньшей мере в 2,5 раза ниже, предпочтительно - по меньшей мере в 3 раза ниже, предпочтительно - по меньшей мере в 3,5 раза ниже, предпочтительно - по меньшей мере в 4 раза ниже, предпочтительно - по меньшей мере в 4,5 раза ниже уровня экспрессии CDA в эталонной линии раковых клеток при определении с использованием того же способа в тех же условиях, причем эталонной линией раковых клеток является линия MDA-MB-231. «По меньшей мере в X раз ниже» в этом контексте означает то, что максимальный уровень экспрессии CDA в раке/опухоли имеет значение, которое ровно в X раз ниже, чем уровень экспрессии в эталонной линии раковых клеток.

Способ и условия, используемые для определения уровня экспрессии CDA в раке/опухоли и в эталонной линии раковых клеток могут быть любым подходящим способом и любыми подходящими условиями, при условии, что для определения уровня экспрессии CDA в раке/опухоли используют тот же способ и те же условия, которые были использованы для определения уровня экспрессии CDA в эталонной линии раковых клеток. Соответственно, эталонная линия раковых клеток является контролем. Специалист в данной области техники легко сможет определить уровень экспрессии гена, представляющего интерес, например - гена CDA, в раковых и нераковых клетках. Такие способы являются частью общих знаний в данной области техники, и в контексте настоящего изобретения можно использовать любой подходящий способ.

Например, уровень экспрессии можно измерить по уровню белка. Способы измерения уровней экспрессии белков хорошо известны в данной области техники. Такие способы обычно включают контакт исследуемого биологического образца с одним или более обнаружимыми реагентами, которые пригодны для измерения уровня экспрессии белка, такими как антитела, и последующее определение уровня экспрессии белка на основании уровня обнаруженного реагента, предпочтительно - после нормализации. Примеры способов, которые обычно включают использование антител, включают, но не ограничиваются этим, Вестерн-блоттинг, иммуноблоттинг, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA; от англ.: enzyme-linked immunosorbent assay), способ иммуноферментных пятен (ELISPOT; от англ.: enzyme-linked immunospot), радиоиммунный анализ (RIA), иммуногистохимию и иммунопреципитацию. Можно использовать другие способы, подходящие для измерения уровня экспрессии белка, в которых необязательно используют антитела, и которые включают, но не ограничиваются этим, сортировку клеток с активированной флуоресценцией (FACS; от англ.: fluorescence activated cell sorting), микроскопию, например - атомно-силовую микроскопию, проточную цитометрию, микроцитометрию, анализ связывания с белком, анализ связывания с лигандом, микроматричный анализ, электрофорез в полиакриламидном геле, например - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE; от англ.: Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis), поверхностный плазмонный резонанс (SPR; от англ.: surface plasmon resonance), ферстеровский резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET; от англ.: Forster resonance energy transfer), резонансный перенос энергии биолюминесценции (BRET; от англ.: bioluminescence resonance energy transfer), хемилюминесценцию, флуоресцентную поляризацию, фосфоресценцию, масс-спектрометрию, например - жидкостную хроматографию с масс-спектрометрией (LC-MS) или жидкостную хроматографию с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS-MS), времяпролетную матрично-активированную лазерную десорбционно-ионизационную масс-спектрометрию (MALDI-TOF; от англ.: matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight), времяпролетную поверхностно-усиленную лазерную десорбционно-ионизационную масс-спектрометрию (SELDI-TOF; от англ.: surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight) и магнитно-резонансную визуализацию (MRI; от англ.: magnetic resonance imaging).

Однако предпочтительно уровень экспрессии гена, например - уровень экспрессии гена CDA, можно измерить по уровню РНК. Способы измерения уровней РНК хорошо известны в данной области техники, и в контексте настоящего изобретения можно использовать любой подходящий способ. Например, можно использовать такие способы, как микроматричный анализ, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с обратной транскрипцией (RT-PCR; от англ.: reverse transcription polymerase chain reaction), количественную ПЦР в реальном времени, секвенирование РНК, Нозерн-блоттинг, удлинение праймера, защиту от РНКазы и профилирование экспрессии РНК. Предпочтительно используемым способом является секвенирование РНК или микроматричный анализ. Секвенирование РНК - это хорошо известный способ, в котором используют секвенирование следующего поколения (NGS; от англ.: next-generation sequencing) для определения присутствия и количества РНК в биологическом образце в определенный момент.

Предпочтительно способом, используемым для определения уровня экспрессии CDA в целевом раке/опухоли по сравнению с уровнем экспрессии CDA в эталонной линии раковых клеток, причем эталонной линией раковых клеток является линия MDA-MB-231, является «Микроматричный способ А», описанный ниже.

Микроматричный способ А включает следующие стадии:

1) Экстракция РНК из раковых/опухолевых клеток, представляющих интерес; экстракцию предпочтительно выполняют с использованием набора реагентов для выделения РНК Norgen Total RNA Purification kit (производства компании Norgen Biotek, № по каталогу 17200);

2) Получение поли(А)+ РНК из экстрагированной РНК, предпочтительно - с использованием набора MEGApure согласно инструкциям производителя (компании Ambion);

3) Получение комплементарной ДНК (кДНК) из поли(А)+ РНК посредством обработки обратной транскриптазой, то есть выполнение обратной транскрипции;

4) Фрагментирование кДНК с использованием терминальной дезоксинукпеотидилтрансферазы (TdT; от англ.: terminal deoxynucleotidyl transferase);

5) Биотинилирование фрагментов кДНК с использованием набора для терминальной маркировки GeneChipWT (Affymetrix);

6) Повторение стадий с 1 по 5 с эталонной линией клеток, причем эталонной линией клеток является линия MDA-MB-231;

7) Гибридизация 5,5 мкг биотинилированных фрагментов кДНК, полученных на стадии 5, к первой ДНК-микроматрице при 45°С в течение 16 часов и гибридизация 5,5 мкг биотинилированных фрагментов кДНК, полученных на стадии 5, к ДНК-микроматрице при 45°С в течение 16 часов, причем микроматрицы предпочтительно являются матрицами Affymetrix GeneChip Human Gene 2.0 ST (производства компании Applied Biosystems);

8) Промывка и окрашивание гибридизированных микроматриц, предпочтительно - в устройстве Affymetrix GeneChip Fluidics Station 450 (производства компании Applied Biosystems);

9) Сканирование окрашенных микроматриц с использованием сканнера Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G, в котором используется программное обеспечение Affymetrix GeneChip Command Console®, с получением необработанных значений сигналов в форме CEL-файлов;

10) Нормализация CEL-файлов с получением значений уровней экспрессии генов с использованием программы Robust Multiarray Average (RMA), встроенной в программный комплекс Affymetrix (версия 1.36.1), предпочтительно - так, как описано в публикации R. A. Irizarry et al., Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics 4, 249-264 (2003);

11) Оценка качества матрицы посредством расчета относительного логарифмического выражения (RLE; от англ.: relative log expression) и нормализованной немасштабированной стандартной ошибки (NUSE) с использованием пакета программ affyPLM (версия 1.34.0). Выходными данными из пакета affyPLM являются коробчатые диаграммы для распределений RLE и NUSE. Матрицы, для которых коробчатые диаграммы RLE не центрированы относительно 0, и матрицы, для которых коробчатые диаграммы NUSE не центрированы относительно 1, помечают как матрицы плохого качества и исключают из дальнейшего анализа. Если матрицу исключают, то повторяют предыдущие стадии способа.

12) Выполнение принципиального компонентного анализа (РСА; от англ.: Principal Component Analysis) с использованием функции Prcomp R с объявленными значениями, которые были нормализованы по всем образцам к среднему значению, равному нулю, и стандартным отклонением. РСА используют в качестве способа снижения размерности для снижения высокой размерности набора данных по экспрессии генов с максимальным сохранением вариации данных. Поэтому выполнение РСА обеспечивает более низкоразмерное представление данных для последующего анализа и визуализации.

13) Оценка дифференциальной экспрессии CDA в раковых/опухолевых клетках, представляющих интерес, и в эталонной линии клеток MDA-MB-231 с использованием модерированного t-теста (эмпирического подхода Байеса), встроенного в пакет программ для построения линейных моделей данных микроматриц (LIMMA; от англ.: Linear Models for Microarray) (версия 3.14.4, http://bioinf.wehiedu.au/limma); причем стадии с 10 по 13 анализа микроматриц выполняют с использованием R-среды для статистических расчетов (версия 2.15.1).

Предпочтительно уровень экспрессии CDA в исследуемом раке/опухоли по сравнению с уровнем экспрессии CDA в эталонной линии раковых клеток, причем эталонной линией раковых клеток является линия MDA-MB-231, определяют посредством обращения к базе данных, выбранной из базы данных Атласа экспрессии генов EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), базы данных GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/), Энциклопедии линий раковых клеток (https://portals.broadinstitute.org/ccle) и Атласа белков человека (https://www.proteinatlas.org/).

Уровень экспрессии гена обычно выражают как отношение количества РНК-транскриптов этого гена к общему количеству РНК-транскриптов в исследуемой клетке/ткани. Уровень транскрипции обычно представляют как число транскриптов на миллион (ТРМ; от англ.: transcripts per million), то есть в каждом 1 миллионе молекул РНК в исследуемой клетке/ткани [х] молекул произошло от исследуемого гена. Опять-таки, специалист в данной области техники может определить уровень РНК-транскриптов в единицах ТРМ рутинными способами, такими как количественная ПЦР в реальном времени или способы секвенирования РНК, и эта информация доступна из таких ресурсов, как TCGA, Атлас экспрессии генов EMBL-EBI, база данных GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/), Энциклопедия линий раковых клеток (https://portals.broadinstitute.org/ccle) и Атлас белков человека (https://www.proteinatlas.org/), и других. Такие способы предпочтительны в настоящем изобретении. Методология определения уровней экспрессии генов в ТРМ описана в литературе, например - в публикациях Wagner et al., (2012) Theory Biosci 131(4):281-285 или Mortazavi A et al., (2008) «Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.» Nature methods 5(7):621-8.

Предпочтительно раковые/опухолевые клетки, которые гиперэкспрессируют CDA, содержат РНК-транскрипты гена CDA в количестве, превышающем 140 ТРМ. Напротив, раковые/опухолевые клетки, которые не гиперэкспрессируют CDA, предпочтительно содержат РНК-транскрипты гена CDA в количестве меньшем или равном 140 ТРМ. Иными словами, предпочтительные по настоящему изобретению раковые/опухолевые клетки имеют уровень экспрессии CDA меньше или равный 140 ТРМ. Соответственно, особо предпочтительными для лечения по настоящему изобретению раками/опухолями являются те раки/опухоли, которые экспрессируют CDA на уровне меньшем или равном 140 ТРМ, более предпочтительно - на уровне меньшем или равном 100 ТРМ, более предпочтительно - на уровне меньшем или равном 50 ТРМ.

Предпочтительно уровень экспрессии CDA в исследуемом раке/опухоли в единицах ТРМ определяют посредством обращения к базе данных, выбранной из базы данных Атласа экспрессии генов EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), базы данных GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/), Энциклопедии линий раковых клеток (https://portals.broadinstitute.org/ccle) и Атласа белков человека (https://www.proteinatlas.org/).

Предпочтительно уровень экспрессии CDA в исследуемом раке/опухоли в единицах ТРМ определяют посредством количественной ПЦР в реальном времени или посредством секвенирования РНК (RNA-seq.) и количественного определения РНК с использованием клеток, полученных из соответствующего рака/опухоли. Предпочтительно используемым способом является секвенирование РНК. Предпочтительно используемым способом является «Способ А секвенирования РНК», описанный ниже.

Уровень экспрессии гена в единицах ТРМ можно определить с использованием любого известного способа, но предпочтительно определять его с использованием секвенирования РНК. Способы секвенирования РНК хорошо известны в данной области техники и широко доступны коммерчески. Для определения уровня экспрессии CDA в единицах ТРМ в исследуемом раке можно использовать любой подходящий способ секвенирования РНК. Приведенный ниже способ, названный «Способ А секвенирования РНК», является предпочтительным и содержит следующие стадии:

1. Экстракция тотальной РНК из исследуемых раковых/опухолевых клеток. Это можно выполнить с использованием стандартных наборов для выделения РНК, предпочтительно - QIAGEN AHPrep DNA/RNA Mini kit (производства компании Hilden, Германия), согласно инструкциям производителя.

2. Необязательное количественное определение и оценка чистоты выделенной РНК, предпочтительно - с использованием автоматизированного устройства для электрофореза, предпочтительно - 2100 Bioanalyzer (производства компании Agilent Technologies). Agilent Bioanalyzer представляет собой микрофлюидную платформу, используемую для определения размеров, количественного определения и контроля качества РНК (и ДНК/белков), которая обеспечивает «число целостности РНК» (RIN; от англ.: RNA Integrity Number), которое является количественной оценкой фрагментации образца РНК. Предпочтительно далее в способе используют только образцы, имеющие RIN, равное по меньшей мере 7, предпочтительно - по меньшей мере 8.

3. Приготовление библиотеки для секвенирования РНК, предпочтительно - с использованием набора реагентов Illumina TruSeq™ RNA Sample Preparation Kit (производства компании Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США). В этом процессе обычно используют образцы, содержащие от 500 мкг до 1000 мкг тотальной РНК. Этот набор и протокол хорошо известны в данной области техники. Эта стадия включает следующие стадии:

3a. Обработка выделенной РНК для удаления бактериальной и эукариотической рибосомальной РНК, предпочтительно - с использованием набора реагентов Ribo-Zero rRNA Removal Kit (производства компании Epicentre, Мэдисон, Висконсин, США), согласно инструкциям производителя.

3b. Обработка оставшейся РНК обратной транскриптазой и рандомными гексамерами для получения однонитевых фрагментов кДНК длиной от 100 до 150 оснований или, предпочтительно, длиной от 200 до 300 оснований.

3c. Обработка однонитевых фрагментов кДНК ДНК-полимеразой I и РНКазой Н для получения двунитевых комплементарных фрагментов ДНК (кДНК); и

3d. Лигирование адаптеров для РНК-секвенирования к концам фрагментов кДНК для получения библиотеки последовательностей «адаптер-кДНК», которые можно проанализировать посредством РНК-секвенирования. Адаптеры для РНК-секвенирования хорошо известны в данной области техники, и можно использовать любые подходящие адаптеры. Адаптеры содержат функциональные элементы, которые позволяют секвенирование; например - амплификационный элемент и первичный сайт секвенирования. Предпочтительно адаптеры являются индексированными адаптерами производства компании lllumina. Адаптеры можно лигировать к одному концу каждого фрагмента кДНК для получения одноконцевой библиотеки (что приводит к одному «прочтению» фрагмента при секвенировании, в этом случае длина фрагмента кДНК на стадии 3b лежит диапазоне от 100 до 150 оснований. Однако предпочтительно адаптеры лигируют к обоим концам каждого фрагмента кДНК с получением парноконцевых библиотек (что приводит к двум «прочтениям» каждого фрагмента при секвенировании - так называемым «прочтениям сопряженных пар» или «прочтениям парных концов»), в этом случае длина фрагмента кДНК на стадии 3b лежит диапазоне от 200 до 300 оснований.

4. Необязательная амплификация последовательностей «адаптер-кДНК» посредством ПЦР. Эту стадию можно выполнить, если количество ДНК недостаточно для выполнения анализа последовательностей на стадии 5. Количество ДНК, необходимое для анализа последовательностей, хорошо известно специалисту в данной области техники (предпочтительно - от 70 мкл до 135 мкл, более предпочтительно - 125 мкл, 20 пМ раствора ДНК загружают в проточную ячейку секвенсера на стадии 5). Способы оценки количества ДНК в образце являются рутинными, и можно использовать любой подходящий способ. Предпочтительно используемым способом является флуориметрия, и предпочтительно используют флуориметр Qubit®.

5. Секвенирование последовательностей «адаптер-кДНК», предпочтительно - с использованием секвенсера lllumina Flowcell, предпочтительно - секвенсера Illumina Flowcell HiSeq 2500 или секвенс lllumina Flowcell NovaSeq 6000, предпочтительно - с использованием цикла секвенирования от 100 до 150 пар оснований, если на стадии 3 получены одноконцевые библиотеки, более предпочтительно - с использованием цикла секвенирования от 200 до 300 пар оснований, если на стадии 3 получены парноконцевые библиотеки. Предпочтительно в проточную ячейку загружают от 70 мкл до 135 мкл, более предпочтительно - 125 мкл, 20 пМ раствора ДНК. Полученный массив необработанных данных обеспечивает уникальный идентификатор последовательностей для каждого проанализированного фрагмента, его последовательность (так называемое «прочтение») и индикатор достоверности при определении последовательности секвенсером для каждого положения основания в прочтении (так называемую «оценку качества Фреда»).

6. Получение массива данных прочтений, отфильтрованных по качеству, посредством удаления из массива данных определенных последовательностей:

i) основания в прочтении, которые имеют оценку качества Фреда менее 10;

ii) основания в прочтении, которые расположены ниже (то есть дальше в направлении секвенирования) основания в том же прочтении, имеющего оценку качества Фреда менее 10;

iii) прочтения, которые содержат не определенные («невостребованные») основания («N»);

iv) прочтения, которые соответствуют эталонному геному загрязнителя, причем эталонный геном загрязнителя является геномом Е. coli; и

v) если используемая библиотека РНК-последовательностей является парноконцевой библиотекой, то те прочтения, «сопряженные прочтения» которых были отброшены на стадии 6(iii) или 6(iv).

7. Выравнивание отфильтрованных по качеству прочтений на геном вида субъекта, то есть предпочтительно - на геном человека. Предпочтительно отфильтрованные по качеству прочтения выравнивают на эталонный геном человека из базы данных Ensembl, версия 98, предпочтительно - на геном Human GRCh38, с использованием базы данных эталонных признаков генов Ensembl (версия Ensembl Genomes 45, GENCODE 32). Средства выравнивания, подходящие для этой стадии, хорошо известны, широко доступны, и можно использовать любое подходящее средство выравнивания. Предпочтительно средством выравнивания является программа TopHat2 (версия 2.1.1) [Trapnell et al., (2010) Nature Biotechnology 28, 511-515].

8. Определение числа прочтений гена CDA и, необязательно, любого другого гена, представляющего интерес. Биоинформатические средства для этой стадии хорошо известны, широко доступны, и можно использовать любое подходящее средство. Предпочтительно число прочтений/ген определяют с использованием пакета программ HTSeq (htseq-count). Эта стадия обеспечивает необработанные данные о числе прочтений.

9. Преобразование необработанных данных о числе прочтений, полученных на стадии 8, в единицы «число транскриптов/млн (ТРМ)». Это стандартная математическая операция, рутинно используемая в данной области техники. Перевод данных о числе прочтений в единицы ТРМ обеспечивает значимую оценку уровней экспрессии генов, поскольку определение значений ТРМ включает нормализацию необработанных данных по i) длине гена; и ii) глубине секвенирования.

i) Что касается нормализации по длине гена, то в необработанных данных большее число прочтений может наблюдаться в более длинных генах просто потому, что гены длиннее, и с таким геном выравнивается больше фрагментов. Нормализация по длине гена включает деление числа прочтений, полученного для каждого гена, на длину гена (в тысячах оснований).

ii) Глубина секвенирования - это межобразцовый эффект, который затрудняет сравнение чисел прочтения одного и того же гена в разных образцах. Для нормализации число прочтений на тысячу оснований, полученное на стадии 9i) делят на «фактор масштабирования на миллион», который получают посредством деления общего числа прочтений в образце на 1 миллион.

Данные по экспрессии генов, полученные с использованием РНК-секвенирования, можно представить в единицах RPKM (число прочтений на тысячу нукпеотидов на миллион картированных прочтений; от англ.: Reads Per Kilobase Per Million). Расчет проводят посредством

i. деления общего числа прочтений в образце на 1.000.000 с получением «фактора масштабирования на миллион»;

ii. деления реального числа прочтений в гене на «фактор масштабирования на миллион», что нормализует по глубине секвенирования, при этом получают единицы «число прочтений на миллион» (RPM; от англ.: reads per million); и

iii. деления значений RPM на длину гена в тысячах оснований, что нормализует по длине гена, при этом получают единицы RPKM.

Другой единицей экспрессии гена является FPKM (число прочтений на тысячу нуклеотидов на миллион картированных прочтений; от англ.: Fragments Per Kilobase Per Million). Единицы RPKM применимы при использовании одноконцевого РНК-секвенирования, когда каждое прочтение соответствует одному секвенированному фрагменту. Единицы FPKM применимы к парноконцевому РНК-секвенированию, когда одному фрагменту могут соответствовать два прочтения или, если одно прочтение в паре не картировано, одно прочтение может соответствовать одному фрагменту. Единственным различием между RPKM и FPKM является то, что в случае FPKM учитывается, что два прочтения могут быть картированы на один фрагмент (и этот фрагмент не будет сосчитан дважды).

Единицы ТРМ очень сходны с RPKM и FPKM. Единственным отличием является порядок операций (i)-(iii), указанных выше. Соответственно, ТРМ определяют следующим образом:

i. деление числа прочтений в гене на длину гена в тысячах оснований, что нормализует данные по длине гена и дает единицы RPK (число прочтений на тысячу оснований);

ii. деление суммарного значения RPK в образце на 1.000.000 с получением «фактора масштабирования на миллион»; и

iii. деление значений RPK, полученных на стадии (i) на «фактор масштабирования на миллион», полученный на стадии (ii), что нормализует данные по глубине секвенирования и дает единицы ТРМ.

Единственным отличием расчета ТРМ от расчета RPKM или FPKM является то, что при расчете ТРМ нормализацию по длине гена выполняют первой. Однако при использовании единиц ТРМ результат сложения всех ТРМ в каждом образце будет одинаковым - 1 миллион. Это обеспечивает более информативное сравнение доли прочтений, картированных на гене, в каждом образце.

Описанный выше «Способ А секвенирования РНК» для определения уровня экспрессии CDA в единицах ТРМ также можно использовать для определения уровня экспрессии CDA в единицах ТРМ в раке/опухоли, представляющем интерес, по сравнению с контролем, то есть контрольными клетками, определенными выше, или с эталонной линией клеток, причем эталонной линией клеток является линия MDA-MB-231. В этих вариантах осуществления настоящего изобретения способ А секвенирования РНК можно осуществить с использованием раковых/опухолевых клеток, представляющих интерес, и повторить с контрольными или эталонными клетками, после чего сравнить определенные значения ТРМ. Альтернативно, Способ А секвенирования РНК можно осуществить с использованием раковых/опухолевых клеток, представляющих интерес, и уровень экспрессии CDA, определенный в единицах ТРМ, сравнить с значением уровня экспрессии CDA в единицах ТРМ, ранее определенным тем же способом с использованием контрольной или эталонной линии клеток.

Альтернативно, уровень экспрессии гена можно определить с использованием микроматричного анализа, который является стандартным способом в данной области техники. Любой подходящий способ микроматричного анализа можно использовать в контексте настоящего изобретения. Мкроматрицы позволяют одновременное обнаружение экспрессии тысяч генов.

Уровень экспрессии гена, определенный микроматричным способом, можно выразить по любой шкале, например - по линейной шкале. Данные, полученные микроматричным способом, можно также преобразовать, предпочтительно - посредством логарифмирования по основанию 2, что обладает преимуществом получения непрерывного спектра значений и обработки генов с повышенным и пониженным уровнем экспрессии сходным образом. Ген с экспрессией, повышенной в 2 раза, после логарифмирования по основанию 2 имеет значение, равное 1.

Предпочтительно раком/опухолью является такой рак/опухоль, в котором уровень экспрессии CDA после логарифмирования по основанию 2 составляет менее 11,75. Такие раки/опухоли описаны как не гиперэкспрессирующие CDA. Предпочтительно раком/опухолью является такой рак/опухоль, в котором уровень экспрессии CDA после логарифмирования по основанию 2 составляет менее 11,75, более предпочтительно - менее 11, более предпочтительно - менее 10,5, более предпочтительно - менее 10, более предпочтительно - менее 9,5.

Предпочтительно раком/опухолью является такой рак/опухоль, в котором линейный уровень экспрессии CDA составляет менее 6500. Такие раки/опухоли описаны как не гиперэкспрессирующие CDA. Предпочтительно раком/опухолью является такой рак/опухоль, в котором линейный уровень экспрессии CDA составляет менее 6000, более предпочтительно - менее 5000, более предпочтительно - менее 4000, более предпочтительно - менее 3000, более предпочтительно - менее 2000, более предпочтительно - менее 1500.

Предпочтительно линейный или логарифмированный по основанию 2 уровень экспрессии CDA раке/опухоли, представляющем интерес, получают посредством обращения к базе данных,, выбранной из базы данных Атласа экспрессии генов EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), базы данных GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/), Энциклопедии линий раковых клеток (https://portals.broadinstitute.org/ccle) и Атласа белков человека (https://www.proteinatlas.org/).

Специалист в данной области техники знает, что возможны вариации уровней экспрессии некоторых генов между опухолями одного типа рака. Например, некоторые раки молочной железы могут гиперэкспрессировать ген CDA, а другие могут не гиперэкспрессировать ген CDA. Поэтому предпочтительно раки/опухоли, указанные в данной публикации как предпочтительные, предпочтительно являются раками/опухолями тех типов, в которых экспрессируется ген CDA, предпочтительно - в которых ген CDA:

i) гиперэкспрессирован;

ii) не гиперкспрессирован;

iii) недоэкспрессирован;

iv) не недоэкспрессирован;

v) гиперэкспрессирован или недоэкспрессирован; или

vi) не гиперэкспрессирован и не недоэкспрессирован.

Предпочтительно рак/опухоль является раком/опухолью, в котором ген CDA не гиперэкспрессирован. Предпочтительно рак/опухоль является раком/опухолью, в котором ген CDA гиперэкспрессирован. Гиперэкспрессия гена CDA определена выше.

В противоположность этому раки, указанные в данной публикации как не являющиеся предпочтительными, предпочтительно являются только раками/опухолями тех типов, в которых ген CDA:

i) гиперэкспрессирован;

ii) не гиперкспрессирован;

iii) недоэкспрессирован;

iv) не недоэкспрессирован;

Предпочтительно рак/опухоль не является раком/опухолью, в котором ген CDA гиперэкспрессирован. Гиперэкспрессия гена CDA определена выше.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рак/опухоль является резистентным к лечению гемцитабином и/или цитарабином. Соответственно, раки/опухоли, описанные в данной публикации как предпочтительные, предпочтительно являются раками/опухолями тех типов, которые являются резистентными к лечению гемцитабином и/или цитарабином. Предпочтительно рак/опухоль, резистентный к гемцитабину и/или цитарабину, является раком головного мозга, предпочтительно - глиомой, более предпочтительно - мультиформной глиобластомой.

Белок человека О-6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза (MGMT; от англ.: О-6-methylguanine-DNA methyltransferase) устраняет повреждение алкилированной ДНК. Экспрессия MGMT делает раковые клетки, такие как клетки глиобластомы, практически полностью резистентными к цитотоксическим эффектам Темозоломида, который проявляет противораковую химиотерапевтическую активность, вызывая такие сильные мутации в опухолевых клетках, что опухолевые клетки погибают. Темозоламид действует посредством алкилирования ДНК, то есть вызывает мутации.

Как показано в представленных примерах осуществления настоящего изобретения, соединения Формулы (I) не являются мутагенными согласно анализу мутаций гена гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (HPRT; от англ.: hypoxantine-guanine phosphoribosyltransferase). Соответственно, соединения Формулы (I) используют, в частности, для лечения раков, в которых экспрессирована MGMT, предпочтительно - гиперэкспрессирована. Соответственно, раки/опухоли, описанные как предпочтительные в данной публикации, предпочтительно являются раками/опухолями тех типов, в которых экспрессирована MGMT, предпочтительно - гиперэкспрессирована.

Тенозоломид (4-метил-5-оксо-2,3,4,6,8-пентазабицикло[4.3.0]нона-2,7,9-триен-9-карбоксамид) является препаратом первой линии для лечения мультиформной глиобластомы, и его также используют при лечении некоторых других раков головного мозга. Однако, как показано в представленных примерах осуществления настоящего изобретения, темозоломид эффективно убивает менее половины исследованных клеточных линий глиобластомы, а резистентные к Темозоломиду клеточные линии эффективно убивают соединения по настоящему изобретению. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рак/опухоль является раком/опухолью, резистентным к Темозоломиду.

Поэтому раки/опухоли, описанные как предпочтительные в данной публикации, предпочтительно являются раками/опухолями тех типов, которые являются резистентными к лечению Темозоломидом. Предпочтительно резистентный к Темозоломиду рак/опухоль является раком головного мозга, предпочтительно - глиомой, более предпочтительно - мультиформной глиобластомой.

Как показано в представленных примерах осуществления настоящего изобретения, соединения по настоящему изобретению эффективно убивают клеточные линии, резистентные к 5-фторурацилу. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рак является раком, резистентным к фторпиримидину. Поэтому раки/опухоли, описанные как предпочтительные в данной публикации, предпочтительно являются раками/опухолями тех типов, которые являются резистентными к лечению фторпиримидином; предпочтительно рак/опухоль, резистентный к лечению фторпиримидином, является раком головного мозга, предпочтительно - глиомой, более предпочтительно - мультиформной глиобластомой.

Предпочтительно рак/опухоль является резистентным и к лечению Темозоломидом, и к лечению фторпиримидином.

Термин «резистентный» в контексте лечения рака/опухоли имеет четкий и понятный смысл в данной области техники. Термин «резистентный» означает, что рак/опухоль не отвечает позитивно на лечение соответствующим противораковым средством (или противораковыми средствами), то есть лечение противораковым средством (или противораковыми средствами) не уменьшает, не облегчает, не устраняет и не удаляет рак или один или более его симптомов и не уменьшает количество раковых клеток и не удаляет раковые клетки, находящиеся в опухоли, по сравнению с раком, опухолью или симптомом до лечения. Рак/опухоль может быть резистентным в начале лечения, или он может стать резистентным во время лечения.

Как указано выше, при лечении или профилактике рака соединение Формулы (I) может быть использовано отдельно или, необязательно, в комбинации с другим противораковым средством, то есть с одним или более другими противораковыми средствами. Во всех аспектах и вариантах осуществления настоящего изобретения другое противораковое средство может быть любым подходящим противораковым средством, известным в данной области техники. Широкий спектр различных типов средств известен или предлагался для использования при лечении рака, и любые из них можно использовать, независимо от химической природы или механизма действия.

Соответственно, противораковые средства включают химические молекулы, выделенные или полученные естественным путем или посредством химического синтеза (например, мелкие органические химические молекулы), и биологические молекулы, такие как белки и пептиды (например, иммунотерапевтические агенты, обсуждаемые ниже). Поэтому противораковые лекарственные средства включают химиотерапевтические средства или препараты, которые могут относиться к широкому спектру различных химических или функциональных классов, а также антитела или производные антител и другие биологические молекулы, действие которых связано, например, со стимуляцией, активацией или усилением различных физиологических процессов или клеток в организме, например - иммунных и/или противовоспалительных ответов или клеток, и т.п.

Репрезентативные примеры противораковых средств, относящихся к классу «химиотерапевтических», включают, но не ограничиваются этим, флударабин, гемцитабин, капецитабин, метотрексат, таксол, таксотере, меркаптопурин, тиогуанин, гидроксимочевину, цитарабин, циклофосфамид, ифосфамид, нитрозомочевины, комплексные соединения платины, такие как цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин, митомицин, дакарбазин, прокарбазин, этопозид, тенипозид, кампатецины, блеомицин, доксорубицин, идарубицин, даунорубицин, дактиномицин, пликамицин, митоксантрон, L-аспарагиназу, эпирубицин, 5-фторурацил, таксаны, такие как доцетаксел и паклитаксел, лейковорин, левамизол, иринотекан, эстрамустин, этопозид, азотистые иприты, бисхлорэтилнитрозомочевина (BCNU; от англ.: bischloroethylnitrosourea), нитрозомочевины, такие как кармустин и ломустин, алкалоиды барвинка, такие как винбластин, винкристин и винорелбин, иматиниба мезилат, гексаметилмеламин или топотекан.

Противораковые средства могут включать ингибиторы киназы, ингибиторы фосфатазы, ингибиторы АТФазы, тирфостины, ингибиторы протеазы, гербимицин А, генистеин, эрбстатин и лавендустин А.

В варианте осуществления настоящего изобретения противораковое средство может быть выбрано, но без ограничения этим, из одного класса или комбинации следующих классов средств: алкилирующие средства, растительные алкалоиды, ингибиторы ДНК-топоизомеразы, антифолаты, аналоги пиримидина, аналоги пурина, антиметаболиты ДНК, таксаны, подофиллотоксин, гормональные терапии, ретиноиды, фотосенсибилизаторы или средства для использования в фотодинамических терапиях, ингибиторы ангиогенеза, антимитотические средства, ингибиторы изопренилирования, ингибиторы клеточного цикла, актиномицины, блеомицины, антрацикпины, ингибиторы множественной лекарственной резистентности (MDR; от англ.: multi-drug resistance) и ингибиторы Са²⁺ АТФазы.

Другие противораковые средства могут быть выбраны, но без ограничения этим, из цитокинов, хемокинов, факторов роста, факторов ингибирования роста, гормонов, растворимых рецепторов, рецепторов-приманок, монокпональных или поликлональных антител, моноспецифических, биспецифических или мультиспецифических антител, монотел, полител.

Альтернативные противораковые средства могут быть выбраны, но без ограничения этим, из факторов роста или гематопоэтических факторов, таких как эритропоэтин и тромбопоэтин, и миметиков факторов роста.

В репрезентативном варианте осуществления настоящего изобретения лекарственное средство является мелкой молекулой, и, в частности, низкомолекулярным химиотерапевтическим агентом. Низкомолекулярное средство можно определить как имеющий молекулярную массу менее 2000 Да, более конкретно - менее 1800, 1500, 1200, 1000, 900, 800 или 700 Да, в характерном случае - менее 1000 Да. Например, низкомолекулярное средство может иметь размер, лежащий в диапазоне от 100 Да до 1000 Да, например - от 100 Да до 800 Да или от 300 Да до 700 Да.

В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения другое противораковое средство является иммунотерапевтический средством. Индукция иммунного ответа для лечения рака известна как «иммунотерапия» рака. Иммунотерапия может включать, например, клеточную терапию, терапию антителами или терапию цитокинами. Во всех трех подходах использован факт, состоящий в том, что раковые клетки часто имеют различные маркеры клеточной поверхности, или раковые антигены, которые могут быть обнаружены иммунной системой. Эти антигены чаще всего являются белками, но могут также включать другие молекулы, такие как углеводы. Другим примером иммунотерапии является ингибирование иммунных контрольных точек, когда ингибируются белки контрольных точек. Это дополнительно обсуждается ниже.

Таким образом, иммунотерапию используют, чтобы спровоцировать иммунную систему к атаке на раковые клетки, и, как обсуждается ниже, различные молекулы могут быть мишенью иммунотерапевтических подходов. Например, мишени для иммунотерапевтической интервенции при раке включают «CD» белки (белки «кластера дифференцировки»; от англ.: «cluster of differentiation*), такие как CD52, CD30, CD33, CD20 CD152 (также известный как CTLA4) и CD279 (также известный как белок запрограммированной клеточной смерти 1; PD-1; от англ.: programmed cell death protein); факторы роста, такие как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF; от англ.: vascular endothelial growth factor); рецепторы факторов роста, такие как рецептор эпидермального фактора роста (EGFR; от англ.: epidermal growth factor receptor) или рецептор эпидермального фактора роста человека 2 типа (HER2; от англ.: human epidermal growth factor receptor 2); ген активации лимфоцитов 3 (LAG3; от англ.: Lymphocyte-activation gene 3) и белки семейства В7, такие как В7-Н3 и В7-Н4. Это лишь репрезентативные примеры, и другие молекулы также могут быть мишенями для иммунотерапевтической интервенции при раке.

Иммунотерапевтический агент может быть пептидом, полипептидом или белком. Иммунотерапевтический агент может быть выбран из антитела, цитокина и ингибитора контрольной точки. Как указано выше, терапевтическое противораковое антитело может иметь ряд мишеней, включающий белки контрольных точек. Соответственно, антитело может быть ингибитором контрольной точки.

Поэтому в первом примере иммунотерапевтический агент является антителом. Антитело может быть выбрано из моноклональных или поликлональных антител, моноспецифических, биспецифических или мультиспецифических антител, монотел и полител или из любых из множества сходных с антителами или производных от антител молекул, известных в данной области техники в настоящее время. Соответственно, термин «антитело» использован в данной публикации в широком смысле и включает любое антитело и любой фрагмент, производное или вариант антитела, известные в данной области техники. Антитело может относиться к любому удобному или желаемому виду, классу или подтипу. Кроме того, антитело может быть натуральным, дериватизированным или синтетическим.

Соответственно, антитело может быть:

(a) любым из различных классов или подклассов иммуноглобулинов, например - IgG, IgA, IgM, IgD или IgE, полученных от любого животного, например - от любого обычно используемого животного, например - от овцы, кролика, козы, мыши или из яичного желтка;

(b) моноклональными или поликлональными антителами;

(c) интактными антителами или фрагментами антител, моноклональных или поликлональных, причем фрагменты являются такими фрагментами, которые содержат область связывания антитела, например - фрагментами без Fc-участка (например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), так называемыми «полумолекулярными» фрагментами, которые получают посредством восстановительного расщепления дисульфидных связей, соединяющих компоненты тяжелых цепей в интактном антителе. Fv можно определить как фрагмент, содержащий вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, экспрессированные в форме двух цепей;

(d) антитела, полученные или модифицированные с использованием рекомбинантной ДНК или других способов синтеза, в том числе моноклональные антитела, фрагменты антител, гуманизированные антитела, химерные антитела или полученные или измененные посредством синтеза сходные с антителами структуры.

Также включены функциональные производные или «эквиваленты» антител, например - одноцепочечные антитела. Одноцепочечное антитело можно определить как полученную посредством генной инженерии молекулу, содержащую вариабельную область легкой цепи, вариабельную область тяжелой цепи, связанные подходящим полипептидным линкером в виде слитой одноцепочечной молекулы. Способы получения антител и фрагментов и производных антител хорошо известны в данной области техники.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело является моноклональным антителом.

Во многих случаях моноклональные антитела являются антителами без модификации, и большинство используемых в настоящее время терапевтических антител попадают в эту категорию. Однако в варианте осуществления настоящего изобретения антитело, например - моноклональное антитело, конъюгировано или слито с другой дополнительной молекулой, например - с токсическим веществом или радиоактивным веществом. Таким образом, конъюгированные или слитые антитела соединены с другой молекулой, которая является либо токсичной для клеток (например, лекарственное средство), либо радиоактивным. Антитело связывается со специфическими антигенами на поверхности раковых клеток и направляет токсин или радиацию к опухоли.

Известные и разрешенные к применению антитела включают: Алемтузумаб, Бевацизумаб, Брентуксимаб ведотин, Цетуксимаб, Гемтузумаб озогамицин, Ибритумомаб тиуксетан, Ипилимумаб, Офатумумаб, Панитумумаб, Ритуксимаб, Тозитумомаб и Трастузумаб.

Во втором примере иммунотерапевтическим агентом является цитокин. Цитокины включают иммуномодулирующие агенты, такие как интерлейкины (IL; от англ.: interleukins) и интерфероны (IFN; от англ.: interferons), а также колониестимулирующие факторы, факторы некроза опухолей (TNF; tumor necrosis factor) и другие регуляторные молекулы. Цитокины классифицировали как лимфокины, интерлейкины и хемокины на основании их функции, секретирующей клетки или мишени действия. Каждый цитокин имеет соответствующий рецептор на поверхности клетки, который запускает каскады внутриклеточной сигнализации, которые изменяют функции клетки. В контексте рака цитокины продуцируются многими типами клеток, присутствующими в опухоли. Цитокины хорошо известны в данной области техники, и все цитокины включены в использование по настоящему изобретению. В варианте осуществления настоящего изобретения иммунотерапевтическим агентом является цитокин. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения цитокин является интерлейкином или интерфероном.

Интерлейкины - это группа цитокинов, оказывающих широкий спектр эффектов на иммунную систему. Примерами интерлейкинов (ILs) являются IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15 и IL-17.

Интерфероны - это цитокины, продуцируемые иммунной системой, обычно участвующие в противовирусном ответе, но также используемые при лечении рака. Есть три группы интерферонов (IFNs): I типа (IFNα и IFNβ), II типа (IFNγ) и относительно недавно открытого III типа (IFNλ).

Все известные формы указанных выше цитокинов можно использовать в настоящем изобретении, в том числе также их эквивалентные варианты, производные и фрагменты. Поэтому термин «цитокин» при использовании в контексте настоящего изобретения включает варианты аминокислотных последовательностей известных цитокиновых полипептидов и фрагменты цитокиновых полипептидов или их производные, если эти фрагменты, варианты или производные являются активными, или «функциональными», то есть сохраняют по меньшей мере одну функцию или активность (например, биологическую активность) соответствующего цитокина. Цитокин может быть рекомбинантным полипептидом, синтетическим полипептидом, или он может быть выделен из природного источника. Подходящие цитокины коммерчески доступны и известны специалистам в данной области техники, например - цитокины человека можно приобрести в компании GenScript (Пискатавей, Нью-Йорк, США).

В третьем примере иммунотерапевтический агент является агентом, который направлен на иммунную контрольную точку, то есть является ингибитором контрольной точки. Белки контрольных точек держат иммунную систему под контролем, указывая иммунной системе, какие клетки являются здоровыми, и какие клетки следует разрушить. Белки контрольных точек действуют как «тормоз» для иммунной системы, препятствуя активации Т-клеток. Если на поверхности клетки нет достаточного количества белков контрольных точек, то она может быть разрушена иммунной системой. Хотя в случае раковых клеток могут иметься молекулы, сигнализирующие о том, что клетка является раковой, но если на поверхности клетки достаточно белков контрольных точек, то клетка может уклониться от иммунного ответа, и предполагают, что белки контрольных точек способствуют отсутствию успеха некоторых видов иммунотерапии рака.

Известно несколько ингибиторов контрольных точек, и их можно использовать в настоящем изобретении, например - ингибиторы, описанные в публикации Creelan (2014) Cancer Control 21:80-89.

Примеры ингибиторов контрольных точек включают: Тремелимумаб (СР-675,206); Ипилимумаб (MDX-010); Ниволумаб (BMS-936558); МК-3475 (ранее ламбролизумаб); Урелумаб (BMS-663513); моноклональное антитело анти-LAG-3 (BMS-986016); и Бавитуксимаб (химерное 3G4). Все эти ингибиторы контрольных точек можно использовать в настоящем изобретении.

Альтернативный вариант иммунотерапии относится к иммунным клеточным терапиям, и настоящее изобретение также можно использовать в комбинации с такими терапиями, например - адоптивный перенос клеток. Разработан ряд Т-клеточных терапий для лечения рака, и эти виды лечения, известные как адоптивный перенос клеток (ACT; от англ.: adoptive cell transfer), в последние годы становились все более привлекательными. На сегодняшний день используют три основные стратегии ACT. Первая и наиболее разработанная включает выделение собственных Т-клеток пациента, активных в отношении опухоли, из периферических или опухолевых участков (известных как инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TILs; от англ.: Tumour Infiltrating Lymphocytes). Эти клетки размножают ex vivo и вводят обратно в организм пациента.

Существуют два альтернативных вида терапии, которые включают модификацию собственных Т-клеток пациента рецепторами, способными распознавать опухоль. В одном варианте можно выделить и охарактеризовать Т-клеточные рецепторы (TcRs; от англ.: T-cell receptors), обладающие активностью против ракового антигена, вставить ген, кодирующий TcR, в Т-клетки и ввести их обратно в организм пациента. Показано, что такая терапия уменьшает солидные опухоли у некоторых пациентов, но это сопряжено с большим недостатком: используемые TcR должны соответствовать иммунному типу пациента. Соответственно, в качестве альтернативы использованию TcR были также предложены терапии, включающие экспрессию химерных рецепторов антигена (CARs; от англ.: chimeric antigen receptors) в Т-клетках. CARs - это слитые белки, содержащие антитело, соединенное с сигнальным доменом TcR комплекса, и их можно использовать для направления Т-клеток против опухоли, если выбрано подходящее антитело. В отличие от TcR, CAR не нуждаются в соответствии главному комплексу гистосовместимости (МНС; от англ.: Major Histocompatibility Complex) пациента.

Альтернативно, клетка может быть клеткой-натуральным киллером (NK; от англ.: Natural Killer), которая необязательно может быть модифицирована для экспрессии CAR.

Поэтому согласно настоящему изобретению иммунотерапевтический агент может быть клеткой, в частности - иммунной клеткой, такой как лимфоцит, более конкретно - Т-клеткой или NK-клеткой, как описано выше, например - Т-клетка может быть TIL, или она может быть модифицирована для экспрессии TcR или CAR. NK можно модифицировать для экспрессии CAR.

Альтернативным вариантом другого противоракового средства является микроРНК (miRNA). МикроРНК - это малые некодирующие молекулы РНК (содержащие около 22 нуклеотидов), обнаруженные в растениях, животных и некоторых вирусах, которые участвуют в РНК-сайленсинге и в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов. микроРНК функционируют через спаривание оснований с комплементарными последовательностями в молекулах мРНК. В результате эти молекулы МРНК подавляются за счет расщепления нити мРНК на две части, дестабилизации мРНК вследствие укорочения ее поли(А)-хвоста или менее эффективной трансляции мРНК в белки. miRNA напоминают siRNA, указанные выше, за исключением того, что miRNA происходят из областей РНК-транскриптов, которые сложены сами на себя с образованием коротких «шпилек», тогда как siRNA происходят из более длинных областей двухнитевой РНК. Обнаружено, что многие miRNA имеют связи с различными типами рака, и, соответственно, их иногда называют «онкомикроРНК».

МикроРНК можно использовать в онкологических терапевтических средствах на основе микроРНК при лечении рака. Соображения в пользу разработки терапевтических средств на основе miRNA основаны на идее, состоящей в том, что ошибочно экспрессированные miRNA играют ключевые роли в развитии рака, и что коррекция этих ошибочных miRNA посредством антагонистического эффекта или восстановления функции miRNA может обеспечить терапевтическую пользу, например - при заместительной терапии miRNA.

Любую подходящую miRNA можно использовать в качестве другого противоракового средства согласно настоящему изобретению. miRNA могут быть в свободной форме, то есть не связанными с другой молекулой. Альтернативно, miRNA могут быть конъюгированы или связаны с другой молекулой, например - с антителом, как обсуждается в данной публикации.

Наиболее предпочтительно другое противораковое средство выбрано из группы, состоящей из темозоломида, 5-фторурацила, гемцитабина, цитарабина и глиадела (RTM). Предпочтительно другим противораковым средством является темозоломид. Предпочтительно другим противораковым средством является 5-фторурацил. Предпочтительно другим противораковым средством является гемцитабин. Предпочтительно другим противораковым средством является цитарабин. Предпочтительно другим противораковым средством является глиадел (RTM).

Соединение Формулы (I) и другое противораковое средство можно использовать согласно настоящему изобретению в форме композиции, то есть фармацевтической композиции. Настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую соединение Формулы (I) и одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, необязательно также содержащую другое противораковое средство.

Продукт (в частности, фармацевтический продукт), содержащий соединение Формулы (I) и другое (то есть одно или более других или второе) противораковое средство, может быть комбинированным препаратом для раздельного, последовательного или одновременного применения при лечении или профилактике рака (то есть опухоли), или он может быть продуктом, в котором соединение Формулы (I) объединено в одной рецептуре с другим противораковым средством.

Соответственно, соединение Формулы (I) и другое противораковое средство могут быть объединены в одной композиции или находиться в раздельных композициях для раздельного введения. Это будет зависеть от природы другого противоракового средства и выбранного или необходимого способа введения.

Композиции для использования в настоящем изобретении могут быть составлены любым удобным способом согласно способам и процедурам, известным в фармацевтической области, например - с использованием одного или более фармацевтически приемлемых разбавителей, носителей или вспомогательных веществ. Такие композиции могут быть предназначены для фармацевтического или ветеринарного применения. Подходящие разбавители, вспомогательные вещества и носители для использования в таких композициях известны специалистам в данной области техники.

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «фармацевтически приемлемый» относится к ингредиентам, которые совместимы с другими ингредиентами композиций и физиологически приемлемы для реципиента. Природа композиции, носители или вспомогательные материалы, дозировки и т.п. могут быть выбраны рутинным способом в зависимости от имеющегося выбора и желаемого пути введения, задачи лечения и т.д.

Таким образом, термины «фармацевтический» или «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным субстанциям и композициям, которые не вызывают неблагоприятную, аллергическую или другую нежелательную реакцию при введении млекопитающему, в частности - человеку, должным образом. Термин «фармацевтически приемлемый носитель» или «фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество» относится к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему материалу или вспомогательной композиции любого типа.

Фармацевтические композиции содержат носители, являющиеся фармацевтически приемлемыми для композиции. Это могут быть, в частности, изотонические стерильные солевые растворы (мононатрия или динатрия фосфата, натрия, калия, кальция или магния хлорида и т.п. или смесей таких солей) или сухие лиофилизированные композиции, которые после добавления, в зависимости от ситуации, стерильной воды или физиологического раствора обеспечивают введение растворов.

Композиции по настоящему изобретению могут быть представлены в стандартных фармакологических формах введения, таких как таблетки, таблетки с покрытием, назальные спреи, растворы, эмульсии, липосомы, порошки, капсулы или формы с замедленным высвобождением. Для приготовления этих форм могут быть использованы стандартные фармацевтические вспомогательные вещества и обычные способы производства.

Для приготовления фармацевтических композиций эффективное количество соединения Формулы (I) или другого противоракового средства по настоящему изобретению можно растворить или диспергировать в фармацевтически приемлемом носителе или водной среде. Композиции могут содержать любой известный носитель, разбавитель или наполнитель. Например, композиции, пригодные для парентерального введения, обычно содержат стерильные водные растворы и/или суспензии фармацевтически активных ингредиентов, предпочтительно изотоничные крови реципиента, как правило, приготовленные с использованием хлорида натрия, глицерина, глюкозы, маннитола, сорбитола и т.п.

Вспомогательные вещества, которые могут быть включены в любую фармацевтическую композицию, включают, среди прочего, консерванты (например, п-гидроксибензоаты), хелатирующие агенты (такие как ЭДТА), стабилизаторы, средства, регулирующие тоничность, антимикробные агенты, флоккулянты/суспендирующие агенты, увлажнители, растворители и системы растворителей, антиоксиданты и буферные средства. Специалист в данной области техники сможет выбрать и оптимизировать такие вспомогательные вещества и их количества при составлении рецептуры фармацевтической композиции для конкретной желаемой цели.

Композиции предпочтительно имеют форму водных растворов. Эти растворы готовят согласно способам, известным в данной области техники, и затем загружают в флаконы для инъекций или ампулы.

Форма фармацевтических композиций, путь введения, доза и схема введения, естественно, зависят от природы рака, подлежащего лечению, степени тяжести заболевания, возраста, массы тела и пола пациента и т.п. или, альтернативно, от желаемой продолжительности лечения.

Лечение включает введение соединения Формулы (I), необязательно - с другим противораковым средством.

Соединения Формулы (I) для использования согласно настоящему изобретению могут быть введены субъекту любым подходящим способом. Это применимо также к композициям или рецептурам, содержащим соединения Формулы (I).

Соединения Формулы (I) и, соответственно, содержащие их композиции и рецептуры могут быть представлены, например, в форме, подходящей для орального, назального, парентерального, внутривенного, местного, ректального или интратекального введения. Предпочтительно соединения представлены в форме, подходящей для системного (например, внутривенного) введения.

Можно использовать любой способ введения, обычный или стандартный для данной области техники, например - инъекцию, инфузию, местное нанесение, ингаляцию, трансдермальное введение, нанесение на внутренние и наружные поверхности тела и т.д. любым подходящим способом, известным в области медицины. Соответственно, способы введения включают оральное, назальное, энтеральное, ректальное, вагинальное, трансмукозальное, местное или парентеральное введение или введение посредством ингаляции. Возможно прямое введение в опухоль (внутриопухолевое введение).

Предпочтительны оральное или парентеральное введения. Предпочтительными способами парентерального введения являются внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутричерепное и подкожное введения и введение в цереброспинальную жидкость (интратекальное введение). Более предпочтительно введение является внутрибрюшинным или внутривенным введением, наиболее предпочтительно - внутривенным введением.

Предпочтительно введение является оральным или внутривенным.

Внутривенное введение может быть внутривенной инъекцией или внутривенной инфузией, наиболее предпочтительно - внутривенной инфузией (например, с использованием инфузионного насоса).

Соединение Формулы (I) и другое противораковое средство могут быть введены одинаковым способом или разными способами.

Как указано выше, соединение Формулы (I) и другое противораковое средство могут быть введены одновременно, раздельно или последовательно. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения соединение Формулы (I) и другое противораковое средство вводят последовательно, например - в различные моменты времени, то есть не совместно в одной композиции. В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения соединение Формулы (I) и другое противораковое средство вводят совместно и одновременно, например - в форме одной композиции или в форме раздельных композиций.

Выбор моментов времени для раздельных введений можно определить в соответствии с конкретным соединением Формулы (I) или конкретным другим противораковым средством, композициями и/или использованными способами введения. Поэтому соединение Формулы (I) можно вводить до или после другого противоракового средства.

Например, вначале можно ввести другое противораковое средство, а соединение Формулы (I) можно ввести через подходящий промежуток времени после этого, чтобы обеспечить оптимальное время для доставки другого противоракового средства к целевому участку, или наоборот. Такие определения полностью находятся в рамках рутинных навыков клиницистов. Так, например, соединение Формулы (I) можно ввести, предпочтительно - парентерально, предпочтительно - внутривенно, по меньшей мере за 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 90 минут или 2, 3, 4, 5 или 6 часов до другого противоракового средства или по меньшей мере через 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 90 минут или 2, 3, 4, 5 или 6 часов после другого противоракового средства.

Дозы и режимы дозирования можно определить рутинным образом, и они могут зависеть от природы молекулы, цели лечения, возраста пациента, способа введения и т.д. Любое терапевтическое средство по настоящему изобретению, описанное выше, можно объединить с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами с получением терапевтических композиций. Термин «доза» относится к определенному количеству лекарственного средства, принимаемому за один раз, то есть термины «разовая доза» и «доза» использованы как взаимозаменяемые. Курс лечения может содержать несколько доз, то есть несколько разовых доз, принимаемых за определенный период времени.

В способах и применениях настоящего изобретения предпочтительно вводят эффективное количество соединения Формулы (I) и необязательного другого противоракового средства, если его используют. Другими словами, доза предпочтительно содержит эффективное количество соединения Формулы (I) и необязательного другого противоракового средства, если его используют.

Как показано в примерах осуществления настоящего изобретения, соединения Формулы (I) хорошо переносятся в высоких дозах по сравнению с дозой, необходимой для того, чтобы убить опухоль. Это свойство отличается от многих химиотерапевтических соединений; действительно, большинство химиотерапевтических соединений вызывают значительные побочные эффекты в дозе, необходимой для того, чтобы убить рак. Приведенные примеры осуществления настоящего изобретения показывают, что соединения Формулы (I) можно успешно вводить в дозах, которые значительно превышают дозу, необходимую для того, чтобы убить опухоль.

Как показано в примерах осуществления настоящего изобретения, мыши переносили разовые дозы соединений Формулы (I), равные 200 мг/кг и 2000 мг/кг, но не переносили разовую дозу, равную 8000 мг/кг. Эти данные свидетельствуют о том, что у мышей максимальная переносимая доза соединений Формулы (I) равна по меньшей мере 2000 мг/кг, но меньше 8000 мг/кг. Переходной коэффициент от дозы для мышей к дозе для человека равен 0,081 (Nair et al., (2016) Basic Clin Pharm. 7(2): 27-31. Поэтому данные, приведенные в примерах осуществления настоящего изобретения, показывают, что у людей максимальная переносимая доза соединений Формулы (I) равна по меньшей мере 162 мг/кг, но меньше 648 мг/кг.

Поэтому предпочтительно соединение Формулы (I) вводят в дозе, которая меньше или равна 405 мг/кг, предпочтительно - в дозе, которая меньше или равна 324 мг/кг, более предпочтительно - в дозе, которая меньше или равна 243 мг/кг, более предпочтительно - в дозе, которая меньше или равна 162 мг/кг, более предпочтительно - в дозе, которая меньше или равна 81 мг/кг, более предпочтительно - в дозе, которая меньше или равна 40,5 мг/кг, более предпочтительно - в дозе, которая меньше или равна 24,3 мг/кг. Предпочтительно соединение Формулы (I) вводят в дозе, равной по меньшей мере 10 мг/кг, более предпочтительно - в дозе, равной по меньшей мере 20 мг/кг, более предпочтительно - в дозе, равной по меньшей мере 30 мг/кг, более предпочтительно - в дозе, равной по меньшей мере 40 мг/кг, более предпочтительно - в дозе, равной по меньшей мере 500 мг/кг, более предпочтительно - в дозе, равной по меньшей мере 100 мг/кг.

Предпочтительно соединение Формулы (I) вводят в дозе, лежащей в диапазоне от 10 мг/кг до 405 мг/кг, предпочтительно - от 20 мг/кг до 324 мг/кг, более предпочтительно - от 20 мг/кг до 243 мг/кг, более предпочтительно - от 30 мг/кг до 162 мг/кг, более предпочтительно - от 40 мг/кг до 81 мг/кг.

Эти дозы являются предпочтительными дозами для субъектов-людей.

Дозы и схемы дозирования могут варьироваться в зависимости от таких параметров, как возраст, масса тела, состояние и пол субъекта, цель лечения, болезнь, подлежащая лечению, возраст и/или состояние пациента, способ введения и т.д.

Подходящие дозы и схемы лечения можно легко определить. Подходящие единицы дозирования можно легко приготовить. Схемы дозирования можно определить рутинным образом.

Лечение может состоять в единственном введении соединения Формулы (I), необязательно - с другим противораковым средством, или оно может включать многократные введения соединения Формулы (I), необязательно - с другим противораковым средством. Схемы дозирования соединения Формулы (I) и другого противоракового средства, если его используют, необязательно должны быть идентичными. Альтернативно, лечение может включать однократное введение соединения Формулы (I) и многократные введения другого противоракового средства, или наоборот.

Предпочтительно соединение Формулы (I) вводят, предпочтительно - в одной из указанных доз, через каждые 1, 2, 3, 4, 5 или 6 дней, более предпочтительно - через каждые 2, 3 или 4 дня, более предпочтительно - через каждые 3 дня, выполняя в общей сложности от 2 до 10 введений, более предпочтительно - от 3 до 8 введений, более предпочтительно - от 4 до 6 введений, более предпочтительно -5 введений.

Однако специалист в данной области техники способен определить подходящий режим дозирования и соответствующие дозы в рамках этого режима, исходя из природы соединения, цели лечения, болезни, подлежащей лечению, возраста и/или состояния пациента, способа введения и т.д.

Настоящее изобретение также предусматривает продукт или набор, содержащий соединение Формулы (I) и другое противораковое средство. Набор или продукт можно использовать в любом из применений или способов, описанных в данной публикации, то есть использовать для лечения или профилактики рака. Более конкретно, набор или продукт предназначен для одновременного, раздельного или последовательного использования. Предпочтительно соединение Формулы (I) и, необязательно, также другое противораковое средство входят с состав композиции для парентерального введения, предпочтительно - для внутривенного введения.

Каждый компонент наборов по настоящему изобретению (то есть каждое противораковое средство) может находиться в отдельной ячейке или в отдельном резервуаре. Если это удобно и целесообразно, можно предусмотреть смеси компонентов. Компоненты могут быть представлены в сухой форме, например - в кристаллической, сублимированной или лиофилизированной форме, или в форме раствора, в характерном случае эти жидкие композиции являются водными и забуферены стандартными буферными растворами, такими как Tris, HEPES и т.п.

Предпочтительно наборы предназначены для лечения рака, например - для использования в способах или применениях по настоящему изобретению, описанных в данной публикации.

Соединения по настоящему изобретению (то есть соединения Формул (I), (IIa), (IIb), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId), (IIIa), (IVb), (IVc), (IVd), (IVe) и (IVf)) являются коммерчески доступными, известны из литературы или могут быть получены с использованием стандартных процедур синтеза в соответствии со стандартными способами из доступных исходных материалов с использованием подходящих реагентов и условий реакций. В этой связи специалист в данной области техники, среди прочего, может обратиться к публикациям ((.Comprehensive Organic Synthesis» by В. M. Trost and I. Fleming, Pergamon Press, 1991 и ((.Protective Groups in Organic Synthesis», 3^rd edition, T.W. Greene & P.G.M. Wutz, Wiley-lnterscience (1999).

Соединения по настоящему изобретению коммерчески доступны, например, из компаний Berry and Associates, Toronto Research Chemicals, Sigma Aldrich, Carbosynth, Trilink Biotech и от других известных коммерческих поставщиков.

Краткое описание графических материалов

Далее изобретение будет описано со ссылкой на не ограничивающие примеры его осуществления, в которых:

Фиг. 1 демонстрирует, что 5-формил-2'-дезоксицитидин и 5-гидроксиметил-2'-цитидин хорошо переносятся мышами и уменьшают размеры опухолей мультиформной глиобластомы человека в ксенотрансплантатных моделях у мышей.

Фиг. 1А: Протокол исследования на максимальную переносимую дозу в однодозовом режиме. Мышам вводили указанную дозу в форме одной внутрибрюшинной инъекции. Если все мыши в соответствующей группе переносили указанную дозу, дозу повышали так, как показано на рисунке.

Фиг. 1В: Массу тела мышей измеряли в указанный момент времени после внутрибрюшинной инъекции указанной дозы указанного соединения, инъекции выполняли через каждые три дня, в общей сложности было введено 5 доз.

Фиг. 1С-Н: клетки U87-MG имплантировали в бока 32 иммунодефицитных мышей. После того как опухоли достигли объема, лежавшего в диапазоне от 129 мм3 до 131 мм3, мышей разделили на четыре группы по 8 мышей в каждой. Группу отрицательного контроля лечили носителем, группу положительного контроля лечили 40 мг/кг темозоломида один раз в день в течение 5 дней, группы лечения лечили 2000 мг/кг 5-формил-2'-дезоксицитидина или 2000 мг/кг 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидина раз в три дня, в общей сложности было введено пять доз. Объемы опухолей измеряли через каждые три дня (Фиг. 1С), и массу тела мышей также измеряли через каждые три дня (Фиг. 1D). После завершения исследования рассчитали процент ингибирования роста опухоли (TGI(%); от англ.: tumor growth inhibition) (Фиг. 1Е), опухоли иссекли, сфотографировали (Фиг. 1F), измерили (Фиг. 1G), изготовили срезы и окрасили их гематоксилином и эозином (Фиг. 1Н).

Фиг. 2 демонстрируют, что 5-формил-2'-дезоксицитидин и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин убивают мультиформную глиобластому по механизму, не связанному с используемыми аналогами нуклеотидов:

Фиг. 2А: проточная цитометрия клеток, обработанных 5-формил-2'-дезоксицитидином и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином и окрашенных Annexin V и 7AAD.

Фиг. 2В: Кривые выживания клеток HeLa, обработанных посредством титрования 5-формилцитозином, 5-формилцитидином или 5-формил-2'-дезоксицитидином.

Фиг. 2С: Кривые выживания клеток U87-MG, обработанных посредством титрования 5-гидроксиметилцитозином, 5-гидроксиметилцитидином или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином.

Фиг. 3 демонстрирует количественное определение мутаций в гене гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), вызванных 5-формил-2'-дезоксицитидином и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином в клетках млекопитающих. Показано, что 5-формил-2'-дезоксицитидин и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин не являются мутагенными.

Фиг. 4 демонстрирует уровень цитотоксичности (% выживания клеток) 5-формил-2'-дезоксицитидина, 5-формилцитидина и 5-хлор-2'-дезоксицитидина для клеток HeLa после обработки в течение трех дней.

Фиг. 5 демонстрирует уровень цитотоксичности (% выживания клеток) 5-формил-2'-дезоксицитидина (d5fC), 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидина (dShmC), 5-хлор-2'-дезоксицитидина (5CldC), 5-бром-2'-дезоксицитидина (5BrdC), 5-йод-2'-дезоксицитидина (5ldC) и тимидина для клеток U87-MG.

Фиг. 6 демонстрирует, что цитотоксические эффекты (% выживания клеток) 5-формил-2'-дезоксицитидина и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидина не подавлялись при добавлении тимидина к клеткам U87-MG, что свидетельствует о том, что 5-формил-2'-дезоксицитидин и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин не действуют через ингибирование тимидинсинтазы.

Фиг. 7 демонстрирует цитотоксические эффекты (% выживания клеток) 5-формил-2'-дезоксицитидина в комбинации с Темозоломидом на клетки U87-MG.

Фиг. 8 демонстрирует цитотоксические эффекты (% выживания клеток) 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидина в комбинации с Темозоломидом на клетки U87-MG.

Фиг. 9 демонстрирует цитотоксические эффекты 5-метоксиметил-2'-дезоксиуридина и 5-ацетоксиметил-2'-дезоксиуридина на клетки U87-MG. Обработка в течение 72 часов. Выживание количественно оценивали с использованием МТТ анализа.

Фиг. 10 демонстрирует % выживания различных клеток после обработки dSfCTP или d5hmCTP.

Фиг. 10А: % выживания клеток HeLa после обработки 5-формил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфатом (d5fCTP) в течение 72 часов. Выживание количественно оценивали с использованием МТТ анализа.

Фиг. 10В: % выживания клеток U87-MG (глиома, IV степень) после обработки либо 5-формил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфатом, либо 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфатом в течение 72 часов. Выживание количественно оценивали с использованием МТТ анализа.

Фиг. 11 демонстрирует уровни экспрессии CDA в различных клеточных линиях. Значения нормализованы посредством расчета логарифма по основанию 2 от уровней экспрессии CDA. Уровни экспрессии определяли с использованием матричной платформы Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 и базы данных GENEVESTIGATOR (https://genevestigator.com/gv/).

Фиг. 12 демонстрирует уровни экспрессии CDA в различных клеточных линиях. Уровни экспрессии определяли с использованием матричной платформы Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 и базы данных GENEVESTIGATOR (https://genevestigator.com/gv/).

Фиг. 13А и 13В демонстрируют уровни экспрессии CDA в различных опухолях головного мозга человека. Значения нормализованы посредством расчета логарифма по основанию 2 от уровней экспрессии CDA. Уровни экспрессии определяли с использованием матричной платформы Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 и базы данных GENEVESTIGATOR (https://genevestigator.com/gv/).

Фиг. 14А и 14В демонстрируют линейные уровни экспрессии CDA в различных опухолях головного мозга человека. Уровни экспрессии определяли с использованием матричной платформы Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array platform и базы данных GENEVESTIGATOR (https://genevestigator.com/gv/).

Фиг. 15 демонстрирует результаты анализа РАМРА, демонстрирующие, что 2d5hmC и 2d5fC могут проходить гематоэнцефалический барьер.

Описание примеров осуществления изобретения

Материалы и методы

Животные

Все аспекты данной работы, включая содержание, проведение экспериментов и ликвидацию животных, были выполнены в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition (National Academy Press, Washington, D. C, 2011)) в виварии для лабораторных животных, аккредитованном Ассоциацией по оценке и аккредитации содержания лабораторных животных (AAALAC; от англ.: Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care). Протокол содержания и использования лабораторных животных был прорецензирован и утвержден Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных (IACUC; от англ.: Institutional Animal Care and Use Committee) при компании Pharmacology Discovery Services Taiwan, Ltd.

Культура клеток

Первичные нейрональные глиомные стволовые (GNS; от англ.: glioma neural stem) клетки (G7, G14, G144, G166) культивировали на планшетах, покрытых поли-D-лизином (Merck Millipore, номер по каталогу А-003-Е) и ламинином (R&D Systems, номер по каталогу 3446-005-01), в среде для нейрональных стволовых клеток (50% DMEM-F12 (Thermofisher, номер по каталогу 21041025), 50% нейробазальной среды (Thermofisher, номер по каталогу 10888-022), добавки N2 (Life Technologies, номер по каталогу А-003-Е) и В27 (Life Technologies, номер по каталогу 12587010), 1 мМ пирувата натрия (Life Technologies, номер по каталогу 11360-039), 2 мМ глутамакса (Life Technologies, номер по каталогу 35050038), 1 мМ HEPES (Fisher Scientific, номер по каталогу ВР299-1), 0,1 мМ (3-меркаптоэтанола (Life Technologies, номер по каталогу 31350010), 1 × заменимых аминокислот (Life Technologies, номер по каталогу 11140-035), 0,006% бычьего сывороточного альбумина (Sigma, номер по каталогу A8577-10ML), 4 мкг/мл гепарина (Sigma, номер по каталогу Н3149-25KU), 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 20 нг/мл hEGF (R&D Systems, номер по каталогу 236-EG-200), 10 нг/мл bFGF (Peprotech, номер по каталогу 100-18В).

Клетки НСТ116 выращивали в модифицированной среде МакКоя 5а (Life Technologies, номер по каталогу 36600021) с добавлением 10% плодной сыворотки коров, 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина.

Клетки Arpe 19 выращивали в среде DMEM:F12 (Life Technologies, номер по каталогу 21331-020) с добавлением 10% плодной сыворотки коров, 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина.

Клетки НАР1 выращивали в среде IMDM (Gibco, номер по каталогу 12440-05) с добавлением 10% плодной сыворотки коров, 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина.

Клеточные линии, не указанные выше, выращивали в DMEM (Sigma, номер по каталогу D6429) с добавлением 10% плодной сыворотки коров, 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина. Все клетки находились в увлажняемом инкубаторе с водяной рубашкой при концентрации CO₂, равной 5%, и при температуре, равной 37°С. Клетки субкультивировали при степени слияния монослоя, лежавшей в диапазоне от 70% до 90%.

Лекарственные средства

Соединения, использованные в представленных Примерах, получили следующим образом (КАТ № - номер по каталогу).

Анализ выживаемости

В планшет с 96 лунками засеивали 4000 клеток в 100 мкл соответствующей среды. На следующий день добавляли лекарственные средства, разведенные в диметилсульфоксиде (ДМСО), в 8 концентрациях с использованием трех параллельных проб. Лекарственные средства добавляли в форме серии 4-кратных разведений, начиная со 100 мкМ. Клетки инкубировали с лекарственными средствами в течение 72 часов. Пролиферацию клеток оценивали с использованием МТТ анализа согласно протоколу производителя (АТСС, номер по каталогу 30-1010К). Выживание клеток нормализовали по отношению к выживанию клеток, обработанных только ДМСО. Эксперимент выполняли три раза, данные представляют среднее значение для девяти лунок плюс/минус стандартная ошибка среднего (SEM; от англ.: standard error of the mean).

Максимальная переносимая доза (MTD; от англ.: maximum tolerated dose)

5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин и 5-формил-2'-дезоксицитидин (Berry and Associates) разводили в смеси диметилсульфоксида (ДМСО) / Solutol (RTM) R HS15 / фосфатного буферного раствора (PBS; от англ.: phosphate buffered saline) (5/5/90, объем/объем/объем) в концентрациях, равных 30 мг/мл, 200 мг/мл и 400 мг/мл, для внутрибрюшинного введения в объеме дозирования, равном 5 мл/кг.Использовали объем дозирования, равный 10 мл/кг или 20 мл/кг.

Самцы нелинейных ICR мышей с массой тела, равной 23 плюс/минус 3 г, были поставлены компанией BioLasco Taiwan (по лицензии Charles River Laboratories). Животных акклиматизировали в течение 3 дней перед использованием и подтвердили их хорошее здоровье. Всех животных содержали в гигиеничной среде при контролируемой температуре (в диапазоне от 20°С до 24°С), влажности (от 30% до 70%) и 12-часовом цикле «свет/темнота». Был обеспечен свободный доступ к стерилизованному стандартному лабораторному корму [MFG (Oriental Yeast Co., Ltd., Япония)] и к автоклавированной водопроводной воде.

5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин и 5-формил-2'-дезоксицитидин вводили внутрибрюшинно группам, состоявшим из трех самцов ICR мышей с массой тела, равной 23 плюс/минус 3 г. Животные получали начальную дозу, равную 300 мг/кг. Если животные выживали в течение 72 часов, дозу для следующей когорты повышали. Если одно или более животных погибали, дозу для следующей когорты понижали. Испытание прекращали, если все животные выживали на верхней границе, или после исследования трех уровней доз, или после достижения верхней или нижней границы. При каждом уровне дозы животных обследовали на наличие острых токсических симптомов (смертность, судороги, треморы, мышечная релаксация, седация и т.п.) и эффектов со стороны автономной нервной системы (диарея, саливация, лакримация, вазодилатация, пилоэрекция и т.п.) в течение первых 30 минут, затем через 1 час, 24 часа, 48 часов и 72 часа. Массу тела регистрировали перед введением дозы и через 72 часа. Животных наблюдали и ежедневно отмечали смертность после введения соединения. У всех животных было выполнено макроскопическое вскрытие без забора тканей, и следующий уровень дозы определяли на основании таблицы с планом исследования.

Максимальная переносимая доза (MTD) при многократном введении

5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин и 5-формил-2'-дезоксицитидин (Berry and Associates) разводили в смеси диметилсульфоксида (ДМСО) / Solutol (RTM) R HS15 / фосфатного буферного раствора (PBS) (5/5/90, объем/объем/объем) в концентрациях, равных 15 мг/мл, 50 мг/мл и 100 мг/мл, для внутрибрюшинного введения в объеме дозирования, равном 20 мл/кг. Исследуемые соединения вводили через каждые три дня, в общей сложности было введено 5 доз (через 3 дня × 5).

Животных обследовали на наличие острых токсических симптомов (смертность, судороги, треморы, мышечная релаксация, седация и т.п.) и эффектов со стороны автономной нервной системы (диарея, саливация, лакримация, вазодилатация, пилоэрекция и т.п.) в течение первых 30 минут после каждого введения (Дни 1, 4, 7, 10 и 13) и затем через 1 час, 24 часа, 48 часов и 72 часа после последней дозы (День 13). Смертность регистрировали по такой же схеме. Кроме того, регистрировали массу тела перед введением каждой дозы и через 24 часа, 48 часов и 72 часа после последнего введения. У всех животных было выполнено макроскопическое вскрытие без забора тканей.

Ксенотрансплантат

Перед каждым введением дозы готовили свежие дозируемые растворы 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидина и 5-формил-2'-дезоксицитидина (Berry and Associates) посредством начального добавления соответствующего раствора ДМСО к предварительно взвешенному соединению и последующего добавления соответствующих объемов Solutol (RTM) и фосфатного буферного раствора (PBS) (5% ДМСО/5% Solutol (RTM)/90% PBS). Стандартный агент Темозоломид был предоставлен Университетским госпиталем Осло в порошкообразной форме, и перед каждым дозированием готовили свежую композицию посредством начального добавления соответствующего раствора ДМСО к предварительно взвешенному соединению и последующего добавления соответствующих объемов Solutol (RTM) и фосфатного буферного раствора (PBS) (5% ДМСО/5% Solutol (RTM)/90% PBS). 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин и 5-формил-2'-дезоксицитидин вводили в объеме дозирования, равном 20 мл/кг. Стандартный агент Темозоломид вводили в объеме дозирования, равном 10 мл/кг.

Линия клеток злокачественной глиомы головного мозга человека U87-MG (АТСС НТВ-14, эпителиальная глиобластома) была получена из Американской коллекции типовых культур (АТСС; от англ.: American Type Culture Collection). Клетки культивировали в минимальной поддерживающей среде, содержавшей 5% плодной сыворотки коров (FBS), при 37°С и 5% CO₂ в инкубаторе.

Использовали самок голых мышей (nu/nu), полученных от компании BioLasco Taiwan (по лицензии Charles River Laboratories). Животных содержали в индивидуально вентилируемых клетках (IVC, система 36 Mini Isolator). Размер клетки для 5 животных был равен 27 см × 20 см × 14 см. Всех животных содержали в гигиеничной среде при контролируемой температуре (в диапазоне от 20°С до 24°С), влажности (от 30% до 70%) и 12-часовом цикле «свет/темнота». Был обеспечен свободный доступ к стерилизованному стандартному лабораторному корму [MFG (Oriental Yeast Co., Ltd., Япония)] и к автоклавированной водопроводной воде.

Живые клетки U87-MG (АТСС НТВ-14) имплантировали подкожно (5×10⁶ клеток/мышь в PBS по 0,2 мл/мышь) в правый бок самок nu/nu мышей. Когда средний размер опухолей в группе достиг примерно от 129 мм³ до 131 мм³, мышей с имплантированными опухолями разделили на четыре экспериментальные группы, каждая группа содержала восемь животных, и начали введение доз (этот день обозначен как День 1).

5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин, 5-формил-2'-дезоксицитидина в дозе, равной 2000 мг/кг, и соответствующий носитель (5% ДМСО/5% Solutol (RTM)/90% PBS) вводили внутрибрюшинно (IP) через каждые три дня, в общей сложности было выполнено пять введений. Темозоломид в дозе, равной 40 мг/кг, вводили орально (РО) раз в день, в общей сложности было выполнено пять введений.

Контролировали объем опухоли, массу тела, смертность и клинические признаки токсичности и регистрировали их два раза в неделю в течение 29 дней. Объем опухоли (в мм³) определяли по формуле объема эллипсоида: длина × (ширина)² × 0,5. Ингибирование роста опухоли (Т/С) рассчитывали по следующей формуле:

%Т/С=(Tn/Cn) × 100%

в которой Cn: Масса опухоли, измеренная в День n в контрольной группе; Tn: Масса опухоли, измеренная в День n в экспериментальной группе.

Значение %Т/С, меньшее или равное 42%, было признано значимой противоопухолевой активностью (#).

Ингибирование роста опухоли в процентах (TGI) также рассчитывали по следующей формуле:

%TGI=(1-(Tn/Cn))x100%

Значение %TGI, большее или равное 58%, было признано значимой противоопухолевой активностью (#).

Двумерный дисперсионный анализ (ANOVA; от англ.: analysis of variation) (RTM) с последующим тестом Бонферрони также использовали для оценки статистически значимых различий по сравнению с группой негативного контроля во время исследования - с Дня 1 по День 29. Различия считались значимыми при р менее 0,05 (*).

После завершения исследования опухоли у всех животных, участвовавших в исследовании, иссекали и фотографировали.

Анализ мутагенности в отношении гена HPRT

Анализ мутагенности в отношении гена гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (HPRT) был выполнен на клетках W9. 50000 клеток V79 обработали тремя различными концентрациями d5hmC или d5fC (1 мкМ, 10 мкМ, 100 мкМ) в течение 24 часов в 6-луночном планшете. ДМСО использовали в качестве негативного контроля. После обработки клетки субкультивировали по мере необходимости во флаконах Т75 в течение 9 дней для обеспечения экспрессии HPRT-мутантов. 10000 клеток пересеяли в 10 реплик чашек Петри (100 мм × 15 мм) с селективной средой (2,5 мкг/мл 6TG).

Выживание (относительную эффективность пересева) определили посредством пересева 200 клеток в четыре реплики чашек Петри (60 мм × 15 мм) без селективной среды. Колонии зафиксировали, окрасили по Гимзе и подсчитали через 7 дней. Частоту мутантов выразили как общее число мутантов, подсчитанное на всех чашках, деленное на число засеянных клеток, с корректировкой на эффективность пересева. Эксперимент выполнили три раза, данные представили как среднее значение для трех параллельных проб плюс/минус SEM.

Определение апптоза посредством проточной цитометрии

100000 клеток засеяли в 6-луночный планшет и инкубировали с 100 мкМ Темозоломида, 2'-дезокси-5-гидроксиметилцитидина, 5-формил-2'-дезоксицитидина или ДМСО в течение 72 часов. Выявление апоптотических клеток оценивали с использованием Набора для выявления апоптоза на основе аннексина V-7 и аминоактиномицина D (7-AAD) (производства компании Nordic Biosite AS, номер по каталогу 640922) согласно протоколу производителя.

Анализ на основе сортировки клеток с активированной флуоресценцией был проведен на проточном цитометре LSR Fortessa (производства компании BD Biosciences), и данные проанализировали с использованием программного обеспечения FlowJo. Все эксперименты были выполнены в трех параллельных копиях.

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоты были выполнены так, как описано ранее (Towbin et al., 1979. Biotechnology, 24, 145-149). Антисыворотку с антителами к CDA (производства компании Abcam, номер по каталогу Ab82346) использовали в соответствии с концентрацией, рекомендованной производителем. Белки количественно определяли по сигналу, генерируемому при окислении люминола пероксидазой хрена, конъюгированной с вторичным антителом.

Пример 1

Цитотоксичность для опухолевых клеток

Клетки HeLa, выращенные так, как описано выше («Материалы и методы»), обработали 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином и 5-формил-2'дезоксицитидином. После обработки этими соединениями в течение трех дней выживание клеток оценили так, как описано выше («Материалы и методы»). Несмотря на то, что выживание после обработки 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином не отличалось от выживания клеток, обработанных ДМСО, неожиданно было обнаружено, что 5-формил-2'-дезоксицитидин был цитотоксичным для клеток HeLa.

Цитотоксический эффект 5-формил-2'-дезоксицитидина сравнили с двумя хорошо изученными цитотоксическими соединениями - 5-фторурацилом и темозоломидом. Было определено, что 5-формил-2'-дезоксицитидин является более цитотоксичным для клеток HeLa (IC₅₀ равен 0,76 мкМ), чем 5-фторурацил (IC₅₀ более 25 мкМ) и темозоломид (IC₅₀ более 25 мкМ).

С учетом того, что 5-формил-2'-дезоксицитидин был цитотоксичным для клеток карциномы шейки матки (HeLa), исследование расширили в двух направлениях: (i) оценили еще одно вещество - 5-карбокси-2'-дезоксицитидин; и (ii) оценили их цитотоксические эффекты в отношении широкого спектра линий раковых клеток человека (Таблица 1).

Как показано в Таблице 1, 5-карбокси-2'-дезоксицитидин не имеет цитотоксических свойств в отношении всех исследованных линий раковых клеток. Интересно, что 5-формил-2'-дезоксицитидин является цитотоксичным для широкого спектра раковых клеток человека, что свидетельствует о потенциальной возможности его применения для лечения широкого спектра типов рака. 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин имеет более узкий профиль цитотоксичности; на самом деле, это производное цитидина было цитотоксичным только для двух исследованных клеточных линий: U87-MG - клеток глиомы IV степени (IC₅₀ более 0,3340 мкМ) и НАР1 - клеток хронического миелогенного лейкоза (IC₅₀более 3,027 мкМ). Это свидетельствует о том, что это соединение может хорошо переноситься пациентами. 5-формил-2'-дезоксицитидин и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин оказались наиболее цитотоксичным и для клеточных линий мультиформной глиобластомы (U87-MG).

Поскольку наибольший цитотоксический эффект 5-формил-2'-дезоксицитидина и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидина наблюдали на клетках глиомы IV степени (U87-MG), то цитотоксическую активность этих соединений исследовали с использованием более широкого спектра клеток глиомы IV степени, полученных от пациентов (Таблица 2). Из-за отсутствия активности в предыдущих исследованиях 5-карбокси-2'-дезоксицитидин не был включен в этот более подробный анализ.

Как показано в Таблице 2, после обработки соответствующим соединением 5 из 12 клеточных линий глиомы IV степени были убиты 5-формил-2'-дезоксицитидином и 6 из 12 клеточных линий глиомы IV степени были убиты 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином. Это свидетельствует об активности этих соединений против широкого спектра глиом. Эти результаты сопоставили с темозоломидом, в настоящее время являющимся препаратом выбора для лечения глиом IV степени, и 5-фторурацилом, широко используемым противораковым средством. Темозоломид эффективно убил 5 из 12 клеточных линий глиомы IV степени, а 5-фторурацил убил 11 из 12 клеточных линий глиомы IV степени. Таким образом, данные демонстрируют, что 5-формил-2'-дезоксицитидин является столь же эффективным в отношении глиом IV степени, как современный препарат выбора, и что 5-фторурацил является более эффективным, чем современный препарат выбора, в отношении глиом IV степени.

Кроме того, Таблица 2 демонстрирует, что и 5-формил-2'-дезоксицитидин, и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин являются цитотоксичными для клеточных линий, являющихся резистентными к современному препарату выбора (Темозоломиду). Это доказывает, что эти соединения могут быть более эффективными, чем существующие способы лечения, в отношении опухолей, резистентных к Темозоломиду. Альтернативно, Таблица 2 показывает, что Темозоломид в комбинации с 5-формил-2'-дезоксицитидином и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином может быть оптимальным лечением.

Пример 2

Цитотоксичность для нормальных клеток

Как продемонстрировано в Примере 1, 5-формил-2'-дезоксицитидин и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин являются полезными терапевтическими средствами для лечения различных типов рака, в частности - глиом IV степени, и особенно тех глиом, которые являются резистентными к лечению темозоломидом.

Авторы настоящего исследования далее исследовали, в какой степени эти соединения убивают нормальные клетки человека; низкая цитотоксичность в отношении нормальных клеток человека является предпочтительным свойством для противораковых средств. Поэтому была исследована цитотоксичность этих соединений для различных нормальных клеточных линий человека (Таблица 3). Клетки выращивали и анализ выживаемости выполняли так, как описано выше («Материалы и методы»).

Как показано в Таблице 3, 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин не был цитотоксичным ни для одной из исследованных нормальных клеточных линий. 5-формил-2'-дезоксицитидин был цитотоксичным только для одной нормальной клеточной линии человека (HaCat, кератиноциты). Эти результаты показывают, что эти соединения не только являются эффективными химиотерапевтическими средствами для лечения рака, но и могут хорошо переноситься людьми.

Пример 3

Максимальная переносимая доза

Поскольку 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин и 5-формил-2'-дезоксицитидин оказывали ограниченные эффекты на нормальные клетки, авторы настоящего изобретения пришли к выводу, что эти соединения можно назначать в относительно высоких дозах, и они не вызовут побочных эффектов, обычно связанных с химиотерапией рака. Максимальную переносимую дозу (MTD) этих соединений у мышей определяли так, как описано выше («Материалы и методы»). Была разработана схема определения MTD (Фиг. 1А). Хотя конечной точкой исследования было выживание в течение 72 часов, наличие острых токсических симптомов (смертность, судороги, треморы, мышечная релаксация, седация и т.п.) и эффектов со стороны автономной нервной системы (диарея, саливация, лакримация, вазодилатация, пилоэрекция и т.п.) у животных контролировали в течение первых 30 минут и затем через 1 час, 24 часа, 48 часов и 72 часа. Массу тела регистрировали перед введением дозы и через 72 часа.

Результаты показали, что мыши могут переносить разовую дозу, равную 300 мг/кг и 2000 мг/кг 5-формил-2'-дезоксицитидина и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидина. Мыши были неспособны перенести разовую дозу, равную 8000 мг/кг, 5-формил-2'-дезоксицитидина и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидина (не показано на рисунке). Эти результаты свидетельствуют о том, что у мышей максимальная переносимая разовая доза 5-формил-2'-дезоксицитидина и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидина равна по меньшей мере 2000 мг/кг, но меньше 8000 мг/кг.

Переходной коэффициент между дозой для мыши и дозой для человека равен 0,081 (Nair et al., (2016) Basic Clin Pharm. 7(2): 27-31. Поэтому данные показывают, что у людей максимальная переносимая доза соединений Формулы (I) равна по меньшей мере 162 мг/кг, но меньше 648 мг/кг.

Предпочтительными являются химиотерапевтические средства для лечения рака, которые можно переносить при многократном повторном введении доз в течение многих дней. Поэтому авторы настоящего изобретения провели оценку максимальной переносимой дозы при многократном введении 5-формил-2'-дезоксицитидина и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидина, как описано выше («Материалы и методы»). Для оценки максимальной переносимой дозы при многократном введении были выбраны дозы, равные 300 мг/кг, 1000 мг/кг и 2000 мг/кг, поскольку они хорошо переносились в форме разовых доз в обеих экспериментальных группах.

Мышам вводили соответствующее соединение в соответствующей дозе внутрибрюшинно раз в три дня в общей сложности в количестве 5 доз. Хотя конечной точкой этого исследования было выживание, первичной конечной точкой исследования была масса тела; наличие острых токсических симптомов (смертность, судороги, треморы, мышечная релаксация, седация и т.п.) и эффектов со стороны автономной нервной системы (диарея, саливация, лакримация, вазодилатация, пилоэрекция и т.п.) у животных контролировали в течение первых 30 минут и затем через 1 час, 24 часа, 48 часов и 72 часа. Массу тела регистрировали перед введением дозы и через 72 часа.

Масса тела у животных, не получавших лечения, статистически не отличалась от массы тела животных, получавших 5-формил-2'-дезоксицитидин или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин, при всех исследованных дозах (Фиг. 1В). Эти результаты показывают, что эти соединения хорошо переносятся в указанных дозах в течение продолжительных периодов времени.

Пример 4

Цитотоксичность in vivo

5-формил-2'-дезоксицитидин или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин оценили в ксенотрансплантатных моделях мультиформной глиобластомы у мышей, как описано выше («Материалы и методы»). Клетки U87-MG инъецировали подкожно в бока голых мышей. Опухолям позволяли сформироваться так, как описано выше («Материалы и методы»). После того как опухоли достигли размеров, лежавших в диапазоне от 129 мм³ до 131 мм³, животных разделили на 4 группы - две группы, получавшие лечение, группу негативного контроля и группу позитивного контроля. Две группы, получавшие лечение, были группами, получавшими 5-формил-2'-дезоксицитидин или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин. Мыши в группах, получавших лечение, получали дозу, равную 2000 мг/кг 5-формил-2'-дезоксицитидина или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидина раз в три дня в общей сложности в количестве 5 доз. Группу негативного контроля лечили так же, как группы, проходившие лечение, за исключением того, что внутрибрюшинная инъекция содержала только носитель и не содержала исследуемого соединения. Группа позитивного контроля получила 5 доз темозоломида, равных 40 мг/кг.

Контролировали объем опухоли (Фиг. 1C), массу тела (Фиг. 1D), смертность и признаки клинической токсичности и регистрировали их два раза в неделю в течение 29 дней. Объем опухоли (в мм³) определяли по формуле объема эллипсоида: длина × (ширина)² × 0,5. Ингибирование роста опухоли в процентах (%TGI) определяли с использованием следующей формулы: %TGI=(1-(Tn/Cn))×100%, где Tn - средний объем опухоли в экспериментальной группе, измеренный в день «n», a Cn - средний объем опухоли в контрольной группе, измеренный в день «n». %Т/С меньшее или равное 42% или значение TGI в процентах большее или равное 58% от значений в группе негативного контроля считали значимой противоопухолевой активностью. Двумерный дисперсионный анализ (ANOVA) (RTM) с последующим тестом Бонферрони также использовали для оценки статистически значимых различий по сравнению с группой негативного контроля во время исследования - с Дня 1 по День 29 (*р менее 0,05).

Фиг. 1 С показывает, что лечение 5-формил-2'-дезоксицитидином или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином приводило к заметному уменьшению объема опухолей по сравнению с уменьшением объема опухолей, достигнутым при использовании Темозоломида, во все моменты времени.

В конце исследования и 5-формил-2'-дезоксицитидин, и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин продемонстрировали значимую противоопухолевую активность - 83% TGI и 93% TGI, соответственно (Фиг. 1Е). Группа позитивного контроля, получавшая лечение темозоломидом, показала 94% TGI. Все соединения хорошо переносились мышами, и не было обнаружено значимых изменений массы тела в результате лечения (Фиг. 1D). После завершения исследования опухоли иссекали из мышей, фотографировали (Фиг. 1F) и измеряли (Фиг. 1G); выраженные цитотоксические эффекты были обнаружены в обеих группах, получавших лечение.

Одна мышь из контрольной группы погибла во время эксперимента, размер опухоли этой мыши в день 29 не определен; однако размеры опухоли этой мыши в предыдущие дни включены в обработку.

Совместно, эти неожиданные результаты демонстрируют, что 5-формил-2'-дезоксицитидин и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин эффективно убивают клетки мультиформной глиобластомы (глиомы IV степени) и не являются очень цитотоксичными для нормальных клеток. Кроме того, эти соединения хорошо переносятся мышами и обеспечивают выраженное уменьшение объема опухоли у мышей при минимальных побочных эффектах. Результаты демонстрируют, что соединения по настоящему изобретению, можно использовать для лечения раков человека, и их можно использовать в высоких дозах, чтобы убить опухолевые клетки, не убивая нераковые клетки. Таким образом, имеется широкое терапевтическое окно для применения этих соединений в качестве противораковых лекарственных средств.

Пример 5

Сравнение цитотоксического и цитостатического эффектов

В указанных выше исследованиях клеточных линий измеряли метаболическую активность и не проводили различий между ингибированием деления клеток и гибелью клеток. Поэтому было проведено исследование, убивают ли 5-формил-2'-дезоксицитидин и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин чувствительные клетки или вызывают задержку их клеточного цикла. Клетки глиомы IV степени SF-188 обрабатывали ДМСО, темозоломидом, 5-формил-2'-дезоксицитидином или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином в указанной концентрации. Клетки собирали, окрашивали Аннексином V (выявляет апоптотические клетки за счет его способности связываться в фосфатидилсерином) и 7AAD (краситель ДНК, который плохо проходит через интактные клеточные мембраны; поэтому избирательно окрашиваются клетки с поврежденными мембранами) и анализировали с использованием проточной цитометрии, как описано выше («Материалы и методы»). Клетки SF-188, обработанные ДМСО или темозоломидом, демонстрировали сходные цитометрические профили с небольшим увеличением числа мертвых клеток в контроле, обработанном темозоломидом. Согласно цитометрическому профилю (Фиг. 2А), большинство клеток SF-188, обработанных 5-формил-2'-дезоксицитидином или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином, погибли. Очевидно, что клетки SF-188, обработанные 5-формил-2'-дезоксицитидином или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином, погибают, а не задерживаются в контрольной точке клеточного цикла.

Пример 6

Потребность в 2'-дезоксипроизводных сахаров

5-фторурацил, широко используемое противораковое химиотерапевтическое средство, имеет множество вариантов, которые являются цитотоксичными; эти варианты включают нуклеозиды (5-фторуридин и 5-фтор-2'-дезоксиуридин) и нуклеиновое основание 5-фторурацил. Авторы настоящего изобретения исследовали, будут ли рибонуклеозидные и нуклеоосновные варианты 5-формил-2'-дезоксицитидина и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидина также цитотоксичными.

Как показано в Таблице 1, 5-формил-2'-дезоксицитидин является цитотоксичным для клеток HeLa. Цитотоксичность 5-формилцитидина и 5-формилцитозина для клеток HeLa оценили в анализе выживаемости, как описано выше. Неожиданно, и в отличие от 5-фторуридина и 5-фторурацила, ни 5-формилцитидин, ни 5-формилцитозин не были цитотоксичными для клеток HeLa (Фиг. 2В).

Таблица 1 показывает, что 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин является цитотоксичным для клеток U87-MG. Цитотоксичность 5-гидроксиметилцитидина и 5-гидроксиметилцитозина для клеток U87-MG оценили в анализе выживаемости, как описано выше. Неожиданно, и в отличие от 5-фторуридина и 5-фторурацила, было показано, что 5-гидроксиметилцитидин и 5-гидроксиметилцитозин не были цитотоксичными для клеток U87-MG (Фиг. 2С).

Эти результаты показывают, что для цитотоксичности соединений по настоящему изобретению необходим 2'-дезоксирибозный сахар. Кроме того, этот результат неожиданно показывает, что 5-формил-2'-дезоксицитидин и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин используют принципиально иной клеточный путь, нежели фторпиримидины.

Пример 7

Отсутствие эффекта цитидиндеаминазы

Мутированные аналоги нуклеозидов и нуклеотидов часто удаляются из нуклеотидного пула цитидиндеаминазой (CDA). CDA инактивирует гемцитабин и цитозина арабинозид - два распространенных средства для лечения рака, являющиеся аналогами нуклеотидов. Желательны противораковые средства, которые не инактивируются CDA. Поскольку 5-формил-2'-дезоксицитидин и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин являются производными цитидина, авторы настоящего изобретения выдвинули гипотезу о том, что клетки, экспрессирующие CDA, могут быть резистентными к лечению 5-формил-2'-дезоксицитидином и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином.

Однако неожиданно оказалось, что фактически не наблюдается корреляции между экспрессией CDA и резистентностью или чувствительностью к 5-формил-2'-дезоксицитидину и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидину, как показано в Таблице 4А. Данные по IC₅₀, приведенные в Таблице 4, идентичны данным из Таблицы 1. Уровни экспрессии CDA в указанных клеточных линиях были определены с использованием атласа экспрессии EMBL (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home) с использованием ключевого слова «CDA». Экспрессия CDA приведена как число РНК-транскриптов на миллион (ТРМ), как описано в публикациях Wagner et al., (2012) Theory Biosci 131(4):281-285 или Mortazavi A er al., (2008) «Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.» Nature methods 5(7):621-8. Если было приведено больше одного значения, то использовали минимальное значение.

Линейная корреляция между цитотоксичностью и воздействием вещества показала неудовлетворительное соответствие (линейная модель для 2d5fC, R_z, равное 0,00173; линейная модель для 2d5hmC, R_z, равное 0,02262). Эти данные, взятые совместно с данными из EMBL, свидетельствуют о том, что экспрессия CDA не имеет отношения к чувствительности или резистентности к 5-формил-2'-дезоксицитидину или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидину.

Кроме того, определили уровень экспрессии CDA (TPM) в различных клеточных линиях глиомы, и он показан в Таблице 4В. Уровни экспрессии CDA в указанных клеточных линиях были определены с использованием Энциклопедии линий раковых клеток (https://portals.broadinstitute.org/ccle), которая описана в публикации Barretina, J et al. (2012) The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483:603-7. Экспрессию CDA выражена как число РНК-транскриптов на миллион (TPM), как описано в публикации Wagner et al., (2012) Theory Biosci 131(4):281-285. Если было приведено больше одного значения, то использовали наибольшее значение.

Пример 8

Немутагенный эффект

Современный препарат выбора для лечения мультиформной глиобластомы - Темозоломид - является сильным мутагеном. На самом деле, Темозоломид проявляет свою химиотерапевтическую активность в отношении рака, вызывая настолько сильные мутации в раковых клетках, что опухолевые клетки погибают. Темозоломид действует через алкилирование ДНК, вызывающее мутации. Экспрессия MGMT - белка, ответственного за устранение повреждений в алкилированной ДНК, делает клетки глиобластомы практически полностью резистентными к цитотоксическим эффектам Темозоломида.

Поэтому авторы настоящего изобретения исследовали, имеют ли 5-формил-2'-дезоксицитидин или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин сходный механизм действия. Мутагенность этих соединений оценивали посредством анализа мутаций гена гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), как описано выше («Материалы и методы»). Как показано в HPRT-анализе, ни 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин, ни 5-формил-2'-дезоксицитидин не были генотоксичными для клеток млекопитающих во всех исследованных концентрациях (Фиг. 3). Эти результаты показывают, что 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин и 5-формил-2'-дезоксицитидин не являются мутагенами, то есть что их цитотоксические эффекты не обусловлены мутагенной активностью.

Пример 9

Цитотоксичность других соединений для клеток HeLa

Клетки HeLa обрабатывали 5-формил-2'-дезоксицитидином, 5-формилцитидином или 5-хлор-2'-дезоксицитидином. После обработки этими соединениями в течение трех дней в концентрациях, равных 100 мкМ, 25 мкМ, 6,25 мкМ, 1,56 мкМ, 0,39 мкМ, 0,1 мкМ, 0,02 мкМ или 0,006 мкМ, выживание клеток оценивали с использованием МТТ-анализа, как описано выше («Материалы и методы»).

Как показано на Фиг. 4, заметно больший цитотоксический эффект наблюдали после обработки 5-формил-2'-дезоксицитидином, затем следовали обработки 5-формилцитидином или 5-хлор-2'-дезоксицитидином.

Пример 10

Цитотоксичность других соединений для клеток глиомы

Клетки U87-MG (глиома, IV степень) обрабатывали 5-формил-2'-дезоксицитидином, 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином, 5-карбокси-2'-дезоксицитидином, Темозоломидом, 5-фторурацилом, 5-бром-2'-дезоксицитидином, 5-йод-2'-дезоксицитидином или 5-хлор-2'-дезоксицитидином в концентрациях, равных 100 мкМ, 25 мкМ, 6,25 мкМ, 1,56 мкМ, 0,39 мкМ, 0,1 мкМ, 0,02 мкМ или 0,006 мкМ. После трехдневной обработки этими соединениями выживание клеток оценивали с использованием МТТ-анализа, как описано выше («Материалы и методы»).

Культура клеток

Клеточные линии U87-MG выращивали в DMEM (производства компании Sigma, номер по каталогу D6429) с добавлением 10% плодной сыворотки коров. Все клетки находились в увлажненном инкубаторе с водяной рубашкой при 5% CO₂ и 37°С. Клетки субкультивировали при степени слияния монослоя, лежавшей в диапазоне от 70% до 90%.

Анализ выживания

В 96-луночный планшет засеяли 4000 клеток в 100 мкл соответствующей среды. На следующий день добавили лекарственные средства, разведенные в ДМСО, в концентрациях, равных 100 мкМ, 25 мкМ, 6,25 мкМ, 1,56 мкМ, 0,39 мкМ, 0,1 мкМ, 0,02 мкМ или 0,006 мкМ, с использованием трех параллельных проб в каждом случае. Клетки инкубировали с лекарственными средствами в течение 72 часов. Пролиферацию клеток оценили с использованием МТТ-анализа согласно протоколу производителя (АТСС, номер по каталогу 30-1010K). Выживание клеток нормализовали к выживанию клеток, обработанных только ДМСО. Эксперимент повторили 3 раза, данные представили как среднее значение для девяти лунок плюс/минус SEM.

Как показано в Таблице 5, 5-формил-2'-дезоксицитидин и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин неожиданно проявили большую эффективность в отношении цитотоксичности для клеток U87-MG, чем другие исследованные соединения, включая 5-бром-2'-дезоксицитидин, 5-йод-2'-дезоксицитидин и 5-хлор-2'-дезоксицитидин.

Дополнительно клетки U87-MG обработали 5-формил-2'-дезоксицитидином (d5fC), 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином (d5hmC), 5-хлор-2'-дезоксицитидином (5CIdC), 5-бром-2'-дезоксицитидином (5BrdC), 5-йод-2'-дезоксицитидином (5IdC) и Тимидином. Результаты представлены на Фиг. 5. d5hmC и d5fC были заметно более цитотоксичными, чем 5CIdC, 5BrdC, 5IdC и тимидин, для клеток глиомы.

В 96-луночный планшет засеяли 4000 клеток в 100 мкл соответствующей среды. На следующий день добавили лекарственные средства, разведенные в ДМСО, в концентрациях, равных 100 мкМ, 25 мкМ, 6,25 мкМ, 1,56 мкМ, 0,39 мкМ, 0,1 мкМ, 0,02 мкМ или 0,006 мкМ, с использованием трех параллельных проб в каждом случае. Клетки инкубировали с лекарственными средствами в течение 72 часов. Пролиферацию клеток оценили с использованием МТТ-анализа согласно протоколу производителя (АТСС, номер по каталогу 30-1010К). Выживание клеток нормализовали к выживанию клеток, обработанных только ДМСО. Эксперимент повторили 3 раза, данные представили как среднее значение для девяти лунок плюс/минус SEM.

Пример 11

Эффект, не опосредованный тимидинсинтазой

Культура клеток

Клеточные линии U87-MG выращивали в DMEM (производства компании Sigma, номер по каталогу D6429) с добавлением 10% плодной сыворотки коров. Все клетки находились в увлажненном инкубаторе с водяной рубашкой при 5% СО₂ и 37°С. Клетки субкультивировали при степени слияния монослоя, лежавшей в диапазоне от 70% до 90%.

Анализ выживания

В 96-луночный планшет засеяли 4000 клеток в 100 мкл соответствующей среды. На следующий день добавили лекарственные средства, разведенные в ДМСО, в 8 концентрациях с использованием трех параллельных проб в каждом случае. Лекарственные средства добавляли в форме серии последовательных разведении в 4 раза, начиная с 100 мкМ. Клетки инкубировали с лекарственными средствами в течение 72 часов. Пролиферацию клеток оценили с использованием МТТ-анализа согласно протоколу производителя (АТСС, номер по каталогу 30-1010К). Выживание клеток нормализовали к выживанию клеток, обработанных только ДМСО. Эксперимент повторили 3 раза, данные представили как среднее значение для трех лунок плюс/минус SEM.

Результаты представлены на Фиг. 6. Цитотоксичность 5-формил-2'-дезоксицитидина и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидина не ослаблялась при добавлении тимидина к клеткам U87-MG. Этот результат показывает, что 5-формил-2'-дезоксицитидин и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин не действуют через ингибирование тимидинсинтазы.

Пример 12

Комбинированная терапия с Темозоломидом

Культура клеток

Анализ выживания

В 96-луночный планшет засеяли 4000 клеток в 100 мкл соответствующей среды. На следующий день добавили лекарственные средства, разведенные в ДМСО, в 8 концентрациях с использованием трех параллельных проб в каждом случае. Лекарственные средства добавляли в форме серии последовательных разведении в 4 раза, начиная с 100 мкМ. Клетки инкубировали с лекарственными средствами в течение 72 часов. Пролиферацию клеток оценили с использованием МТТ-анализа согласно протоколу производителя (АТСС, номер по каталогу 30-1010К). Выживание клеток нормализовали к выживанию клеток, обработанных только ДМСО. Эксперимент повторили 3 раза, данные представили как среднее значение для трех экспериментов.

Как показано на Фиг. 7, линию клеток мультиформной глиобластомы, резистентную к Темозоломиду, обрабатывали только Темозоломидом, 5-формил-2'-дезоксицитидином (d5fC) или комбинацией d5fC и Темозоломида. Комбинация Темозоломида и d5fC является более эффективной при лечении мультиформной глиобластомы человека, чем каждое из этих химических веществ по отдельности.

Как показано на Фиг. 8, линию клеток мультиформной глиобластомы, резистентную к Темозоломиду, обрабатывали только Темозоломидом, 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином (d5hmC) или комбинацией d5hmC и Темозоломида. Комбинация Темозоломида и d5hmC является более эффективной при лечении мультиформной глиобластомы человека, чем каждое из этих химических веществ по отдельности.

Таким образом, 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин и 5-формил-2'-дезоксицитидин действуют синергистически с Темозоломидом.

Пример 13

Аналоги уридина

Исследовали цитотоксические эффекты 5-метоксиметил-2'-дезоксиуридина и 5-ацетоксиметил-2'-дезоксиуридина.

Культура клеток

Анализ выживания

В 96-луночный планшет засеяли 4000 клеток в 100 мкл соответствующей среды. На следующий день добавили лекарственные средства, разведенные в ДМСО, в 8 концентрациях с использованием трех параллельных проб в каждом случае. Лекарственные средства добавляли в форме серии последовательных разведении в 4 раза, начиная с 100 мкМ. Клетки инкубировали с лекарственными средствами в течение 72 часов. Пролиферацию клеток оценили с использованием МТТ-анализа согласно протоколу производителя (АТСС, номер по каталогу 30-1010К). Выживание клеток нормализовали к выживанию клеток, обработанных только ДМСО. Эксперимент повторили 3 раза, данные представили как среднее значение для девяти лунок плюс/минус SEM.

Как показано на Фиг. 9, клеточная линия U87-MG мультиформной глиобластомы не способна переживать лечение возрастающими концентрациями 5-метоксиметил-2'-дезоксиуридина и 5-ацетоксиметил-2'-дезоксиуридина. Поэтому 5-метоксиметил-2'-дезоксиуридин и 5-ацетоксиметил-2'-дезоксиуридин являются эффективными противораковыми средствами, в частности - против мультиформной глиобластомы.

Пример 14

Цитотоксичность 5-формил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата

Культура клеток

Анализ выживания

Как показано на Фиг. 10, линия HeLa клеток карциномы шейки матки не способна переживать лечение возрастающими концентрациями 5-формил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата. Это демонстрирует пригодность 5-формил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата для лечения раков человека, например -карциномы шейки матки.

Пример 15

Цитотоксичность 5-формил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата (для клеток глиомы) Клетки U87-MG (глиомы IV степени) обрабатывали либо 5-формил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфатом, либо 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфатом в концентрациях, равных 100 мкМ, 25 мкМ, 6,25 мкМ, 1,56 мкМ, 0,39 мкМ, 0,1 мкМ, 0,02 мкМ или 0,006 мкМ. После трех дней обработки этими соединениями оценивали выживание клеток с использованием МТТ-анализа, как описано выше («Материалы и методы»).

Культура клеток

Анализ выживания

В 96-луночный планшет засеяли 4000 клеток в 100 мкл соответствующей среды. На следующий день добавили лекарственные средства, разведенные в ДМСО, в концентрациях, равных 100 мкМ, 25 мкМ, 6,25 мкМ, 1,56 мкМ, 0,39 мкМ, 0,1 мкМ, 0,02 мкМ или 0,006 мкМ, с использованием трех параллельных проб в каждом случае. Клетки инкубировали с лекарственными средствами в течение 72 часов. Пролиферацию клеток оценили с использованием МТТ-анализа согласно протоколу производителя (АТСС, номер по каталогу 30-1010К). Выживание клеток нормализовали к выживанию клеток, обработанных только ДМСО. Эксперимент повторили 3 раза, данные представили как среднее значение для по меньшей мере трех лунок плюс/минус SD.

Как показано на Фиг. 10В, и 5-формил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат, и 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат были цитотоксичными для клеток глиомы U87-MG.

Пример 16

Экспрессия CDA

Определили линейные и логарифмированные по основанию 2 уровни экспрессии CDA в различных клеточных линиях глиомы. Уровни экспрессии CDA в выбранных клеточных линиях определили с использованием базы данных GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/), проведя поиск по ключевым словам «CDA, организм: homo sapiens», платформа: Affymetrix Human Genome U 133 2.0 Array. Результаты показаны на Фигурах с 11 по 13 и в Таблице 6.

Фиг. 11 демонстрирует нормализованные уровни экспрессии CDA, логарифмированные по основанию 2, определенные для различных типов рака. Фиг. 12 демонстрирует линейные уровни экспрессии CDA, определенные для различных типов рака. Фиг. 13А и 13В демонстрируют нормализованные уровни экспрессии CDA, логарифмированные по основанию 2, определенные в различных опухолях головного мозга человека. Фиг. 14А и 14В демонстрирует линейные уровни экспрессии CDA, определенные в различных опухолях головного мозга человека.

В Таблице 6 ниже показаны уровни экспрессии CDA в различных клеточных линиях и значения IC₅₀ для 2d5hmC и/или 2d5fc в этих клеточных линиях. Значения IC₅₀ определены так, как описано выше («Материалы и методы» и Пример 1).

В приведенной ниже Таблице 7 показаны линейные уровни экспрессии CDA в различных клеточных линиях и значения IC₅₀ для 2d5hmC и/или 2d5fc в этих клеточных линиях. Значения IC₅₀ определены так, как описано выше («Материалы и методы» и Пример 1).

Взятые совместно, эти результаты демонстрируют, что многие виды рака, в том числе - все исследованные виды рака центральной нервной системы, не гиперэкспрессируют CDA; скорее, они экспрессируют низкие уровни CDA. Результаты также демонстрируют, что отсутствует корреляция между экспрессией CDA и чувствительностью к 5-формил-2'-дезоксицитидину или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидину.

Пример 17

Проницаемость гематоэнцефалического барьера

Проницаемость гематоэнцефалического барьера измеряли с использованием набора реактивов для параллельного анализа проницаемости искусственных мембран Parallel Artificial Membrane Permeability Assay Kit (PAMPA) производства компании BioAssay. Для определения проницаемости точно следовали инструкциям производителя.

Инструкции производителя: 1. В отдельных пробирках для центрифугирования приготовить 500 мкл раствора исследуемого соединения с концентрацией 500 мкМ: смешать 25 мкл раствора исследуемого соединения в ДМСО и 475 мкл PBS. При использовании Контролей проницаемости также разбавить их до концентрации, равной 500 мкМ: смешать 25 мкл Контроля проницаемости и 475 мкл PBS. 2. В отдельных пробирках приготовить растворы Равновесных стандартов каждого исследуемого соединения и контроля с концентрацией 200 мкМ: смешать 80 мкл 500 мкМ раствора исследуемого соединения или контроля с 120 мкл PBS. Если соединение способно пермеабилизовать мембрану и достигать полного равновесия, то концентрация, равная 200 мкМ, будет конечной концентрацией раствора в донорных и акцепторных лунках. Затем в отдельной пробирке смешать 5 мкл ДМСО и 245 мкл PBS для получения Холостого контроля. Отставить в сторону Равновесные стандарты и Холостой контроль для анализа на следующий день. 3. Добавить 300 мкл PBS в лунки акцепторного планшета. 4. Оставив донорный планшет в лотке, поместить 5 мкл 4%-ного раствора лецитина в додекане непосредственно на мембраны лунок донорного планшета. Соблюдайте осторожность, чтобы не проколоть мембраны кончиком пипетки. 5. Добавить по 200 мкл каждого 500 мкМ раствора исследуемого соединения и 500 мкМ раствора Контролей проницаемости в лунки донорного планшета, в каждом случае использовать по две лунки. Примечание: мы рекомендуем получать все экспериментальные значения по меньшей мере в двух экспериментах. Осторожно поместите донорный планшет в ячейки акцепторного планшета. Инкубируйте при комнатной температуре или при 37°С в течение 18 часов или желаемого периода инкубации (например, от 16 часов до 24 часов). 6. Осторожно удалите донорный планшет и соберите жидкость из лунок акцепторного планшета для анализа. Это будет Акцепторный раствор. 7. Добавьте 100 мкл Акцепторного раствора и Равновесных стандартов каждого исследуемого соединения и Контроля проницаемости. Также добавьте 100 мкл Холостого контроля в ячейки УФ-планшета (номер по каталогу P96UV). 8. Зарегистрируйте спектр поглощения в диапазоне от 200 нм до 500 нм с интервалами по 10 нм и определите пиковую оптическую плотность исследуемых соединений. Холостой контроль предназначен для подтверждения пиков, вызванных исследуемым соединением, а не ДМСО, находящимся в растворе. Пиковые значения оптической плотности для высокой проницаемости, средней проницаемости и низкой проницаемости контролей находятся на длинах волн, равных 280 нм, 270 нм и 270 нм, соответственно.

Как показано на Фиг. 15, 2d5hmC и 2d5fC проходят гематоэнцефалический барьер.

Claims

1. Применение соединения Формулы (IIa):

или его фармацевтически приемлемой соли для лечения или профилактики рака центральной нервной системы у субъекта,

где:

X представляет собой -(СН₂)_n-Х', где n - от 0 до 6, и X' представляет собой -СНО, -ОН, -OR или -OC(=O)R, где R представляет собой метил;

R₁ является -ОН или -O(Р(=O)(ОН)O)_nH, где n - от 1 до 3; и

R₂ является -ОН.

2. Применение по п. 1, где соединение является соединением Формулы (IIIa) или (IIIc) или его фармацевтически приемлемой солью:

причем X является таким, как определено в п. 1.

3. Применение по п. 1 или 2, где X является:

a) -СНО или -СН₂ОН; или

b) -СН₂ОСН₃ или -СН₂ОС(=O)СН₃.

4. Применение по любому из пп. 1-3, где X является -СНО или -СН₂ОН.

5. Применение по любому из пп. 1-4, где X является -СН₂ОН.

6. Применение по любому из пп. 1-5, где указанное соединение является 5-формил-2'-дезоксицитидином, 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином, 5-формил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфатом или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфатом или его фармацевтически приемлемой солью.

7. Применение по п. 6, где соединение является 5-формил-2'-дезоксицитидином или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином, или его фармацевтически приемлемой солью.

8. Применение по п. 7, где соединение является 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином или его фармацевтически приемлемой солью.

9. Применение по любому из пп. 1-8, где рак является раком головного мозга.

10. Применение по любому из пп. 1-9, где рак является глиомой.

11. Применение по п. 10, где рак является глиобластомой.

12. Применение по любому из пп. 1-11, где рак является резистентным к лечению гемцитабином, цитарабином, темозоломидом или 5-фторурацилом.

13. Применение по любому из пп. 1-12, где указанное лечение включает введение указанного соединения в дозе, лежащей в диапазоне от 10 мг/кг до 405 мг/кг.

14. Применение по любому из пп. 1-13, где указанное лечение дополнительно включает введение другого противоракового средства.

15. Набор для лечения или профилактики рака центральной нервной системы, содержащий соединение Формулы (IIa):

или его фармацевтически приемлемую соль, где:

R₂ является -ОН;

и другое противораковое средство, представляющее собой темозоломид или 5-фторурацил.

16. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака центральной нервной системы, содержащая соединение Формулы (IIa):

R₂ является -ОН,

в эффективном количестве и другое противораковое средство, совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, причем указанное другое противораковое средство представляет собой темозоломид или 5-фторурацил.

17. Применение соединения Формулы (IIa):

или его фармацевтически приемлемой соли, где:

R₂ является -ОН,

для приготовления лекарственного средства для лечения или профилактики рака центральной нервной системы у субъекта.

18. Применение по п. 17, где соединение является соединением формулы (IIIa) или (IIIc) или его фармацевтически приемлемой солью:

19. Применение по п. 17 или 18, где X является:

a) -СНО или -СН₂ОН; или

b) -СН₂ОСН₃ или -СН₂ОС(=O)СН₃.

20. Применение по любому из пп. 17-19, где X является -СНО или -СН₂ОН.

21. Применение по любому из пп. 17-20, где X является -СН₂ОН.

22. Применение по любому из пп. 17-21, где указанное соединение является 5-формил-2'-дезоксицитидином, 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином, 5-формил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфатом или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфатом или его фармацевтически приемлемой солью.

23. Применение по п. 22, где соединение является 5-формил-2'-дезоксицитидином или 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином, или его фармацевтически приемлемой солью.

24. Применение по п. 23, где соединение является 5-гидроксиметил-2'-дезоксицитидином или его фармацевтически приемлемой солью.

25. Применение по любому из пп. 17-24, где рак является раком головного мозга.

26. Применение по любому из пп. 17-25, где рак является глиомой.

27. Применение по п. 26, где рак является глиобластомой.

28. Применение по любому из пп. 17-27, где рак является резистентным к лечению гемцитабином, цитарабином, темозоломидом или 5-фторурацилом.

29. Применение по любому из пп. 17-28, где указанное лечение включает введение указанного соединения в дозе, лежащей в диапазоне от 10 мг/кг до 405 мг/кг.

30. Применение по любому из пп. 17-29, где указанное лечение дополнительно включает введение другого противоракового средства, причем указанное другое противораковое средство представляет собой темозоломид или 5-фторурацил.