JP2023535280A - 大腸癌転移阻害剤をスクリーニングする方法 - Google Patents

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Abstract

【要約】本開示は、大腸癌阻害剤をスクリーニングする方法に関し、より具体的には、大腸癌阻害剤をスクリーニングする方法であって、ＩＣＡＭ－１のＳＲＣに対する結合レベルを増加させる物質が治療物質として選択される、方法に関する。本開示において、ＩＣＡＭ－１は、ＳＲＣに依存して癌転移及び血管形成を調節することが特定され、これにより、ＩＣＡＭ－１は、大腸癌治療薬の開発のための潜在的な標的因子となり得ることを示している。したがって、本開示の方法によってスクリーニングされる標的因子を採用する大腸癌治療薬は、大腸癌患者の治療効果を増大させることができる。

Description

本開示は、大腸癌転移阻害剤をスクリーニングする方法に関する。より詳細には、本開示は、ＩＣＡＭ－１のＳＲＣに対する結合レベルを増加させる材料を治療物質として選択する大腸癌転移阻害剤をスクリーニングする方法に関する。
大腸癌は、世界で３番目に多く診断されている癌であり、４番目に多い死因として知られている。韓国内での大腸癌の死亡率は、徐々に増加しており、７３％に達している。大腸癌は、発生要因に応じて、散発性大腸癌及び大腸炎関連大腸癌に分類することができる。散発性大腸癌は、遺伝的要因、年齢、２型糖尿病、肥満、飲酒、及び喫煙等のいくつかの要因によって引き起こされ、大腸炎関連大腸癌は、主に、クローン病及び潰瘍性大腸炎等の慢性的な炎症性腸疾患によって引き起こされる。散発性大腸癌は、ほとんどが年齢又は遺伝的要因によって引き起こされるため、主に高齢患者において見られるものであるが、大腸炎関連大腸癌は、より低年齢の患者に発生する可能性がより高く、散発性大腸癌よりも高い死亡率を有することが知られている。
一方、大腸鏡検査は、ポリープを識別して除去する一般的なスクリーニング方法であるが、大腸鏡検査は、腸穿孔、腸出血、及び睡眠時無呼吸等の多くの副作用を引き起こし、腫瘍を正確にスクリーニングするには多くの難点がある。したがって、大腸癌を診断又は治療するマーカの開発が必要とされている。
近年、Ｅ３リガーゼ調節の阻害により、大腸癌の成長、転移、及び癌幹細胞増殖が増加するという研究報告（Ｃｈｒｉｓｔｉｎａ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ，２００７，Ｊｕｎｅ，７０５－７０７．（２００７．０６））があるが、具体的には、癌細胞の転移及び血管形成のメカニズムは未だ知られていない。
［開示］
上記問題を解決するために、本発明者らは、大腸癌転移阻害剤の候補物質の研究結果として、ＩＣＡＭ－１がＳＲＣに依存して癌転移及び血管形成を制御することを確認することによって、本開示を完成させた。
したがって、本開示の目的は、大腸癌転移阻害剤をスクリーニングする方法を提供することである。
加えて、本開示の別の目的は、ＩＣＡＭ－１遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する薬剤、又は遺伝子がエンコードするタンパク質のレベルを測定する薬剤を備える、大腸癌転移を予測するための組成物を提供することである。
本開示の他の目的は、ＩＣＡＭ－１遺伝子又は遺伝子がエンコードするタンパク質を有効成分として含む、大腸癌転移を阻害する医薬組成物を提供することである。
しかしながら、本開示によって達成される技術的問題は、上述の問題に限定されず、当業者であれば、言及されない他の問題を以下の説明から明確に理解するであろう。
上記目的を達成するために、本開示は、大腸癌転移阻害剤をスクリーニングする方法であって、（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで候補物質によって細胞を処理する段階；（ｂ）前記細胞内の細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１）のＳＲＣに対する結合レベルを測定する段階；及び（ｃ）前記候補物質による非処理群と比較して、前記ＩＣＡＭ－１のＳＲＣに対する結合レベルを増加させる物質を、治療物質として選択する段階を備える、方法を提供する。
本開示の１つの実施形態において、前記細胞は、大腸癌細胞とすることができる。
本開示の別の実施形態において、前記候補物質は、化合物、微生物培養物又は抽出物、天然物抽出物、核酸、及びペプチドからなる群から選択することができる。
本開示の更に別の実施形態において、前記核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及びモルホリノからなる群から選択することができる。
本開示の更に別の実施形態において、ＩＣＡＭ－１のＳＲＣに対する結合レベルの測定は、ＩＣＡＭ－１及びＳＲＣ遺伝子のｍＲＮＡレベルの測定を含むことができる。
本開示の更に別の実施形態において、前記ｍＲＮＡレベルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（ＲＰＡ）、マイクロアレイ、及びノーザンブロット法からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって測定することができる。
加えて、本開示は、ＩＣＡＭ－１遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する薬剤、又は遺伝子がエンコードするタンパク質のレベルを測定する薬剤を備える、大腸癌転移を予測するための組成物を提供する。
加えて、本開示は、ＩＣＡＭ－１遺伝子又は遺伝子がエンコードするタンパク質を有効成分として含む、大腸癌転移を阻害する医薬組成物を提供する。
［有利な効果］
本開示は、ＩＣＡＭ－１がＳＲＣに依存して癌転移及び血管形成を調節することができることを確認することによって、ＩＣＡＭ－１が大腸癌治療の開発のための潜在的な標的となり得ることを示している。したがって、本開示の方法によってスクリーニングされた標的因子を使用する大腸癌治療薬を使用することによって、大腸癌患者の治療効果を増大させることが可能である。
健常者と炎症性腸疾患患者との間のＩＣＡＭ－１発現における相違点を確認した結果を示す図である。
健常者と癌患者との間のＩＣＡＭ－１発現における相違点を確認した結果を示す図である。
免疫組織化学（ＩＨＣ）実験を通して大腸癌患者におけるＩＣＡＭ－１の発現が増加することを確認した結果を示す図である。
正常細胞株ＣＣＤ８４１及び大腸癌細胞株（ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６、ＳＷ－６２０、ＳＷ－４８０、ＤＬＤ－１）に対してリアルタイムＰＣＲを実行することによって、大腸癌細胞におけるＩＣＡＭ－１の発現レベルを確認した結果を示す図である。
ＣＰＴＡＣデータベース及び大腸癌患者組織データを通して、大腸癌の悪性度とＩＣＡＭ－１との関係を確認した結果を示す図である。 ＣＰＴＡＣデータベース及び大腸癌患者組織データを通して、大腸癌の悪性度とＩＣＡＭ－１との関係を確認した結果を示す図である。
ＩＣＡＭ－１の発現率が高いほど、生存率及び疾患特異的生存率が低くなることが確認される、図１Ｅ及び１Ｆにおいて使用されるデータを分析した結果を示す図である。 ＩＣＡＭ－１の発現率が高いほど、生存率及び疾患特異的生存率が低くなることが確認される、図１Ｅ及び１Ｆにおいて使用されるデータを分析した結果を示す図である。
リンパ節への転移が発生した患者におけるＩＣＡＭ－１の発現レベルを確認した結果を示す図である。 リンパ節への転移が発生した患者におけるＩＣＡＭ－１の発現レベルを確認した結果を示す図である。
ＧＳＥＡ解析を使用して、ＩＣＡＭ－１の高発現レベルと腫瘍転移及び血管形成との関係を確認した結果を示す図である。
ＩＣＡＭ－１発現を低減したＳＷ－４８０細胞株をマウスの盲腸に注入する方法を示す概略図である。
図２ＢにおいてＳＷ－４８０細胞株を移植されたマウスにおけるＩＣＡＭ－１発現と腫瘍転移との関係を確認した結果を示す図である。
図２ＢにおいてＳＷ－４８０細胞株を移植されたマウスにおけるＥＭＴマーカの発現レベル及び転移因子等を確認した結果を示す図である。 図２ＢにおいてＳＷ－４８０細胞株を移植されたマウスにおけるＥＭＴマーカの発現レベル及び転移因子等を確認した結果を示す図である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＩＣＡＭ－１の発現レベルと血管形成との関係を確認した結果を示す図である。
ＰＣＲ及び組織免疫蛍光によってｉｎ ｖｉｖｏで、図２ＢのマウスモデルにおけるＩＣＡＭ－１の発現レベルと血管形成との関係を確認した結果を示す図である。 ＰＣＲ及び組織免疫蛍光によってｉｎ ｖｉｖｏで、図２ＢのマウスモデルにおけるＩＣＡＭ－１の発現レベルと血管形成との関係を確認した結果を示す図である。
ＩＣＡＭ－１に対してキナーゼアレイを実行することによって、ＩＣＡＭ－１とｐ－ＳＲＣとの相関を確認した結果を示す図である。
大腸癌患者のＴＣＧＡデータベースを通してＩＣＡＭ－１発現に応じたＳＲＣ活性を確認した結果を示す図である。 大腸癌患者のＴＣＧＡデータベースを通してＩＣＡＭ－１発現に応じたＳＲＣ活性を確認した結果を示す図である。
免疫沈降法を使用してＩＣＡＭ－１とＳＲＣとの間の相互作用を確認した結果を示す図である。
ＩＣＡＭ－１とＳＲＣとの間の相互作用を具体的に確認するために、組織免疫蛍光を実行することによってＳＲＣのＩＣＡＭ－１に対する結合位置を確認した結果を示す図である。
ＩＣＡＭ－１のＴｙｒ５１２残基を阻害又は活性化させる突然変異を生成した後の腫瘍転移と血管形成との関係を確認した結果を示す図である。 ＩＣＡＭ－１のＴｙｒ５１２残基を阻害又は活性化させる突然変異を生成した後の腫瘍転移と血管形成との関係を確認した結果を示す図である。
４つのＧＥＯデータベースを通して大腸癌患者に共通の高発現を示す遺伝子を確認した結果を示す図である。
ｃ－ＭＥＴ阻害剤による処理後のＩＣＡＭ－１及びＳＲＣの発現を具体的に確認した結果を示す図である。
ＩＣＡＭ－１の発現を阻害した後に、ｃ－ＭＥＴのリガンドであるＨＧＦを処理した場合の、ｐ－ＳＲＣの発現レベルを確認した結果を示す図である。
ＩＣＡＭ－１過剰発現変異体におけるＳＲＣの活性を確認した結果を示す図である。
ＩＰ及びＰＬＡを通して、ＩＣＡＭ－１の低減に応じたｃ－ＭＥＴのＳＲＣに対する結合レベルを観測した結果を示す図である。 ＩＰ及びＰＬＡを通して、ＩＣＡＭ－１の低減に応じたｃ－ＭＥＴのＳＲＣに対する結合レベルを観測した結果を示す図である。
ＩＣＡＭ－１及びｃ－ＭＥＴが同じ位置に存在する場合の、ＩＣＣを通してｐ－ＳＲＣの発現レベルを確認した結果を示す図である。
ＩＣＡＭ－１を過剰発現させた後にＳＲＣをノックダウンした場合の転移を確認した結果を示す図である。
ＩＣＡＭ－１を過剰発現させた後にＳＲＣをノックダウンした場合の、リアルタイムＰＣＲ及びウエスタンブロットを通してＥＭＴマーカ及び転写因子の発現レベルを確認した結果を示す図である。 ＩＣＡＭ－１を過剰発現させた後にＳＲＣをノックダウンした場合の、リアルタイムＰＣＲ及びウエスタンブロットを通してＥＭＴマーカ及び転写因子の発現レベルを確認した結果を示す図である。
ＩＣＡＭ－１を過剰発現させた後にＳＲＣをノックダウンした場合の、血管形成及び血管形成を誘導する成長因子の発現を確認した結果を示す図である。
ＩＣＡＭ－１を過剰発現させた後にＳＲＣをノックダウンした場合の、血管形成及び血管形成を誘導する成長因子の発現を確認した結果を示す図である。 ＩＣＡＭ－１を過剰発現させた後にＳＲＣをノックダウンした場合の、血管形成及び血管形成を誘導する成長因子の発現を確認した結果を示す図である。
ＩＣＡＭ－１発現に応じた大腸癌の生存率を確認した結果を示す図である。
ＩＣＡＭ－１発現に応じた大腸癌グレードを分析した結果を示す図である。 ＩＣＡＭ－１発現に応じた腫瘍サイズを分析した結果を示す図である。
大腸癌患者の組織におけるＩＣＡＭ－１とｐ－ＳＲＣとの相関を確認した結果を示す図である。
ＩＣＡＭ－１及びｐ－ＳＲＣの発現における増加に応じた予後を確認した結果を示す図である。 腫瘍を盲腸内に注入し、次いでモノクローナル抗体を腹腔内に注入した後の、腫瘍の転移を確認した結果を示す図である。
腫瘍を盲腸内に注入した後の、ＰＣＲ及び組織免疫染色を通して転移関連遺伝子の発現レベルを確認した結果を示す図である。 腫瘍を盲腸内に注入した後の、ＰＣＲ及び組織免疫染色を通して転移関連遺伝子の発現レベルを確認した結果を示す図である。
ＳＷ－４８０細胞株においてＩＣＡＭ－１モノクローナル抗体を処理した後の、血管の血管形成能を確認した結果を示す図である。
ｉｎ ｖｉｖｏで血管形成を制御する因子の発現、及び新たに生成された血管の数を確認した結果を示す図である。 ｉｎ ｖｉｖｏで血管形成を制御する因子の発現、及び新たに生成された血管の数を確認した結果を示す図である。 ［最良の形態］
大腸癌転移阻害剤の候補物質の研究結果として、本発明者らは、ＩＣＡＭ－１がＳＲＣに依存して癌転移及び血管形成を調節することを確認することによって、本開示を完成させた。
したがって、本開示は、大腸癌転移阻害剤をスクリーニングする方法であって、（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで候補物質によって細胞を処理する段階；（ｂ）前記細胞内の細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１）のＳＲＣに対する結合レベルを測定する段階；及び（ｃ）前記候補物質による非処理群と比較して、前記ＩＣＡＭ－１のＳＲＣに対する結合レベルを増加させる物質を、治療物質として選択する段階を備える、方法を提供する。
本開示において、「大腸癌転移の阻害」とは、大腸癌を原因とする細胞増殖を阻害するだけでなく、大腸癌の転移及び移動性も阻害することを意味する。大腸癌転移阻害剤は、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、有機小分子、ポリサッカリド、ポリヌクレオチド、及び広範な化合物等の任意の分子を含むことができる。
本開示において、「細胞」は、大腸組織由来の細胞とすることができるが、これに限定されず、ＩＣＡＭ－１のＳＲＣに対する結合レベルを比較するために使用され、好ましくは、大腸癌細胞とすることができるが、これに限定されない。
本開示において使用される「候補物質」という用語は、ＩＣＡＭ－１のＳＲＣに対する結合レベルを増加させることが期待される物質を意味し、候補物質は、化合物、微生物培養物又は抽出物、天然物抽出物、核酸、及びペプチドからなる群から選択することができるが、これに限定されない。
本開示において、前記核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及びモルホリノからなる群から選択されるが、これに限定されない。
本開示によるＩＣＡＭ－１のＳＲＣに対する結合レベルの測定は、ＩＣＡＭ－１及びＳＲＣ遺伝子のｍＲＮＡレベルの測定を含むことができる。
本開示において、前記ｍＲＮＡレベルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（ＲＰＡ）、マイクロアレイ、及びノーザンブロット法からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって測定することができる。
本発明者らは、特定の実施形態を通して、ＩＣＡＭ－１がＳＲＣに依存して転移及び血管形成を制御することを特定した。
本開示の１つの実施形態において、ＩＣＡＭ－１の発現が阻害されると、ＳＲＣが減少し、ＩＣＡＭ－１が発現すると、ＳＲＣの活性が増加することが確認され、また、免疫沈降反応によって、ＩＣＡＭ－１のＴｙｒ５１２残基がＳＲＣに結合することが確認された（例３を参照）。
本開示の別の実施形態において、ＩＣＡＭ－１の過剰発現後にＳＲＣをノックダウンした場合、ＩＣＡＭ－１の発現が増加しても、ＳＲＣの減少に伴って転移が減少することが確認された。ＥＭＴマーカ及び転写因子の発現、及び血管形成を誘導する成長因子の発現レベルの減少を確認することによって、ＩＣＡＭ－１がＳＲＣに依存して転移及び血管形成を調節することが確認された（例４を参照）。
上記例から、ＩＣＡＭ－１が大腸癌の転移及び血管形成に関与することを確認することができ、ＩＣＡＭ－１の大腸癌阻害効果がＳＲＣに依存して制御されることを推測することができる。
したがって、本開示の別の態様として、本開示は、ＩＣＡＭ－１遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する薬剤、又は遺伝子がエンコードするタンパク質のレベルを測定する薬剤を備える、大腸癌転移を予測するための組成物、及び同組成物を備えるキットを提供する。
本開示において、ＩＣＡＭ－１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列を含むことができ、ヌクレオチド配列の相同体も本開示の範囲内に含まれる。具体的には、遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、及び最も好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列の相同性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。
加えて、ＩＣＡＭ－１遺伝子がエンコードするタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むことができ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と実質的な同一性を有する配列を含むものと解釈される。上記の実質的な同一性とは、本開示の配列及び他の任意の配列が可能な限り整列され、整列された配列が当該技術分野において一般的に使用されるアルゴリズムを使用して分析される場合に、少なくとも８０％の相同性、より好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、及び９５％の相同性、最も好ましくは９６％、９７％、９８％、及び９９％の相同性を表す配列を指す。
本開示において、ｍＲＮＡレベルを測定する薬剤は、センス及びアンチセンスプライマー又は遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するプローブとすることができる。
本開示において使用される、ＤＮＡ合成の始点となる短い遺伝子配列としての「プライマー」という用語は、診断、ＤＮＡ配列決定等において使用するために合成されたオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、１５～３０の塩基対の長さで合成及び使用することができるが、使用の目的に応じて変わる場合があり、既知の方法により、メチル化、キャッピング等によって改変することができる。
本明細書において使用される場合、「プローブ」という用語は、酵素化学分離及び精製又は合成プロセスを通して準備される、ｍＲＮＡに特異的に結合することができる数個～数百個の核酸を指す。ｍＲＮＡの有無は、既知の方法によって設計及び改変することができる放射性同位体又は酵素で、プローブを標識することによってチェックすることができる。
本開示において、タンパク質のレベルを測定する薬剤は、遺伝子によってエンコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体とすることができるが、これに限定されない。
本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、特定の抗原との免疫学的反応性を有する免疫グロブリン分子を含み、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の双方を含む。抗体は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）及び異種結合抗体（例えば、二重特異性抗体）等の遺伝子工学によって生成される形態を含む。
本開示の予測用キットは、分析方法に好適な１つ又は複数の他の成分組成物、溶液、又は装置から構成される。
例えば、ＰＣＲを実行するために、本開示のキットは、分析対象の試料由来のゲノムＤＮＡ、本開示のマーカ遺伝子に特異的なプライマーセット、適量のＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物、ＰＣＲバッファ溶液、及び水を備えるキットとすることができる。ＰＣＲバッファ溶液は、ＫＣｌ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、及びＭｇＣｌ２を含むことができる。加えて、ＰＣＲ産物の増幅の有無を確認する電気泳動を実行するのに必要な成分を、本開示のキットに追加で含むことができる。
加えて、本開示のキットは、ＲＴ－ＰＣＲを実行するのに必要な必須要素を備えるキットとすることができる。マーカ遺伝子に対する各特異的なプライマー対に加えて、ＲＴ－ＰＣＲキットは、試験管又は他の好適な容器、反応バッファ、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、Ｔａｑポリメラーゼ及び逆転写酵素等の酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ＤＥＰＣ水、及び滅菌水を備えることができる。加えて、定量的対照群として使用される遺伝子に特異的なプライマー対を、ＲＴ－ＰＣＲキットに含むことができる。
加えて、本開示のキットは、ＤＮＡチップを実行するのに必要な必須要素を備えるキットとすることができる。ＤＮＡチップキットは、遺伝子又はその断片に対応するｃＤＮＡがプローブとして取り付けられる基質を備え、基質は、定量的構造遺伝子又はその断片に対応するｃＤＮＡを含むことができる。加えて、本開示のキットは、本開示のマーカ遺伝子が固定される物質を有するマイクロアレイの形態とすることができる。
加えて、本開示のキットは、ＥＬＩＳＡを実行するのに必要な必須要素を備えるキットとすることができる。ＥＬＩＳＡキットは、マーカタンパク質に特異的な抗体、及びタンパク質のレベルを測定する薬剤を備える。ＥＬＩＳＡキットは、「抗原抗体複合体」を形成する抗体、例えば、標識二次抗体の検出を可能にする試薬、発色団、酵素、及びそれらの基質を備えることができる。ＥＬＩＳＡキットは、定量的対照としてのタンパク質に特異的な抗体も備えることができる。
本明細書において使用される場合、「抗原抗体複合体」という用語は、遺伝子によってエンコードされるタンパク質及びこれに特異的な抗体の組み合わせを指す。抗原抗体複合体の形成量は、検出標識のシグナルの大きさを通して定量的に測定することができる。検出標識は、酵素、蛍光物質、リガンド、発光物質、微粒子、レドックス分子、及びラジオアイソトープからなる群から選択することができるが、これに限定されない。
本開示の別の態様として、本開示は、対象由来の生体試料におけるＩＣＡＭ－１遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル又は遺伝子によってエンコードされるタンパク質を測定する段階を備える、大腸癌転移を予測するための情報提供方法を提供する。
本開示において使用される「大腸癌転移を予測するための情報提供方法」という用語は、診断の予備段階として大腸癌転移の診断に必要とされる客観的な基本情報を提供するものであり、医師の臨床判断又は見解は除外される。
対象由来の生体試料は、組織、細胞、全血、血液、唾液、喀痰、脳脊髄液、及び尿を含むことができるが、これに限定されない。
ｍＲＮＡの発現レベルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（ＲＰＡ）、マイクロアレイ、及びノーザンブロット法からなる群から選択されるが、これに限定されない、少なくとも１つの方法によって測定することができる。
タンパク質発現レベルは、当該技術分野において既知の従来の方法に従って、ウエスタンブロット法、放射免疫測定（ＲＩＡ）、放射免疫拡散、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、フローサイトメトリー、免疫蛍光、オクタロニー法、補体結合アッセイ、及びタンパク質チップからなる群から選択されるが、これに限定されない、少なくとも１つの方法によって測定することができる。
本開示の別の態様として、本開示は、ＩＣＡＭ－１遺伝子又は遺伝子によってエンコードされるタンパク質を有効成分として備える、大腸癌転移を阻害する医薬組成物を提供する。
本開示において使用される「転移阻害」という用語は、本開示による医薬組成物の投与によって大腸癌の転移及び血管形成を阻害することを含む、大腸癌の発症を遅延させる全ての作用を指す。
本開示による医薬組成物は、ＩＣＡＭ－１遺伝子又は遺伝子によってエンコードされるタンパク質を有効成分として備え、薬学的に許容される担体を更に備えることができる。薬学的に許容される担体は、製剤中に一般的に使用され、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソーム等を含むが、これに限定されず、必要に応じて、酸化防止剤及びバッファ等の他の従来の添加剤を更に含むことができる。加えて、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、滑沢剤等を追加で添加して、水溶液、懸濁液、乳剤等の注入可能な製剤、丸薬、カプセル、顆粒、又は錠剤を形成することができる。
本開示の医薬組成物は、所望の方法応じて、経口又は非経口で投与する（例えば、静脈内、皮下、腹腔内又は局所的に適用する）ことができるが、経口投与されることが好ましい。投与量は、患者の病状及び体重、疾患の重症度、剤形、投与経路、及び時間に応じて変化するが、当業者によって適切に選択することができる。
本開示の医薬組成物は、薬学的に有効な量で投与される。本開示において、「薬学的に有効な量」とは、医療的処置又は診断に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比で疾患を治療又は診断するのに十分な量を意味する。有効用量レベルは、患者の疾患タイプ、重症度、薬物活性、薬物に対する感度、投与時間、投与経路及び排泄率、治療の持続時間、併用薬を含む要因、及び医療分野においてよく知られている他の要因に依存する。本開示による医薬組成物は、個別の治療薬又は他の治療薬との組み合わせとして投与することができ、従来の治療薬と逐次的又は同時に投与することができ、単回又は複数回投与することができる。上記要因を全て考慮して、副作用を伴わずに最小量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、この量は、当業者によって容易に決定することができる。
具体的には、本開示の医薬組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内での有効成分の吸収、不活性率及び排泄率、疾患タイプ、及び併用薬に応じて変化する。一般に、体重１ｋｇあたり０．００１～１５０ｍｇ、好ましくは０．０１～１００ｍｇを、毎日又は１日おきに投与するか、又は１日あたり１～３回に分割することができる。しかしながら、上記用量は、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、及び年齢等に応じて増減し得るため、本開示の範囲にいかようにも限定されない。
一方、本開示は、大腸癌転移を予測するための組成物を使用して大腸癌転移を予測する方法を提供する。
本開示は、医薬組成物を個人に投与する方法を含む、大腸癌転移を予防、阻害、又は治療する方法も提供する。
加えて、本開示は、大腸癌転移を予測するための組成物の、大腸癌転移を予測するための使用を提供する。
加えて、本開示は、医薬組成物の、大腸癌転移を予防、阻害、又は治療するための使用を提供する。
以降、本開示を、例を通して詳細に説明する。しかしながら、本開示の例は、本開示を例示することを意図し、本開示の範囲は、これらの例に限定されない。
［例］
［例１］
大腸疾患及び大腸癌におけるＩＣＡＭ－１発現の確認
図１Ａに示されているように、ＧＥＯデータベースに基づいてＩＣＡＭ－１の発現を確認した結果、ＧＳＥ４１８３において、ＩＣＡＭ－１の発現は、大腸癌形成の段階である炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の段階から高かった。ＧＳＥ５９０７１において、ＩＣＡＭ－１の発現は、クローン病及び活動性潰瘍性大腸炎において高いことが確認された。
加えて、ＧＳＥ４１２５８においてＩＣＡＭ－１の発現を確認した結果、図１Ｂに示されているように、癌患者においては正常な対象よりもＩＣＡＭ－１の発現が高いことが確認された。免疫組織化学（ＩＨＣ）を実行したとき、図１Ｃに示されているように、大腸癌患者においてＩＣＡＭ－１の発現が高いことが確認された。ＩＣＡＭ－１の発現における特異的な変化を確認するために、正常細胞株であるＣＣＤ８４１、及び大腸癌細胞株（ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６、ＳＷ－６２０、ＳＷ－４８０、ＤＬＤ－１）に対してリアルタイムＰＣＲを実行した結果、図１Ｄに示されているように、大腸癌細胞株においてＩＣＡＭ－１の発現が増加していることが確認された。
図１Ｅ及び１Ｆにおいて示されているように、悪性化段階が進むにつれてＩＣＡＭ－１の発現が徐々に増加することが、ＣＰＴＡＣデータベース及び大腸癌患者組織を通して詳細に確認された。ＴＣＧＡデータベースを通して、疾患特異的生存率（ＤＳＳ）及び全生存率（ＯＳ）は、ＩＣＡＭ－１の発現レベルが増加するほど減少する。図１Ｉに示されているように、ＩＣＡＭ－１の発現は、リンパ節転移を有する患者において更に増加し、図１Ｊに示されているように、リンパ節転移を有する患者において、高いＩＣＡＭ－１発現を伴う患者の予後はより悪いことが具体的に確認された。図１Ｊに示されているように、リンパ節転移を有する患者の場合でも、ＩＣＡＭ－１の高発現を伴う患者は、より悪い予後を有した。
［例２］
ＩＣＡＭ－１発現に応じた大腸癌細胞の転移及び血管形成の確認
ＩＣＡＭ－１の発現と転移及び血管形成との相関を調査するために、本発明者らは、ＩＣＡＭ－１発現の抑制又は過剰発現後の浸潤能及び血管形成における変化を確認した。
まず、ＧＳＥＡ解析を通してＩＣＡＭ－１の高発現を示す患者における腫瘍転移と血管形成との関係を確認すると、図２Ａに示されているように、ＩＣＡＭ－１の発現がより高いほど、より多く腫瘍転移及び血管形成が増加することが確認された。ＩＣＡＭ－１の発現レベルが低いＳＷ－４８０細胞株を準備した後、図２Ｂに示されているように、それをマウスの盲腸に注入し、腫瘍転移を観察した。図２Ｃに示されているように、ＩＣＡＭ－１の発現が低いとき、肺に形成される病巣の数が低減し、図２Ｄ及び２Ｅに示されているように、ＰＣＲ及び組織免疫染色を実行したとき、転移に関連する遺伝子（Ｅ－カドヘリン、スネイル、及びスラッグ）の発現レベルも低減した。ｉｎ ｖｉｖｏで血管形成を促進する因子の発現レベル及び血管形成のレベルをＰＣＲ及び組織免疫蛍光染色を通して観察すると、図２Ｇ及び２Ｈに示されているように、ＩＣＡＭ－１の発現レベルが低減する場合、血管形成及び血管形成を誘導する因子の発現の双方が低減することが具体的に確認された。
［例３］
ＩＣＡＭ－１及びＳＲＣの作用メカニズムの確認
３－１．ＩＣＡＭ－１のＳＲＣに対する結合の確認
ＩＣＡＭ－１が大腸癌細胞における転移及び血管形成を調節する際のシグナリングメカニズムを確認するために、ＩＣＡＭ－１の阻害後にホスホキナーゼアレイを実行した。図３Ａに示されているように、ｐ－ＳＲＣの減少が確認された。
加えて、ＴＣＧＡデータベースを通してＩＣＡＭ－１発現とＳＲＣ活性化との関連を確認した結果、図３Ｂに示されているように、ＩＣＡＭ－１の発現が高いほど、ＳＲＣの活性がより多く増加し、図３Ｃに示されているように、ＩＣＡＭ－１の発現レベルが増加するにつれて、ＳＲＣの癌遺伝子シグネチャも増加することが確認された。
大腸癌細胞であるＳＷ－４８０及びＨＣＴ－１１６においてＩＣＡＭ－１とＳＲＣとの発現相関を確認するために免疫沈降を実行した結果、図３Ｄに示されているように、ＩＣＡＭ－１がＳＲＣに内在的に結合することが確認された。特に、図３Ｅに示されているように、ＳＲＣは、ＩＣＡＭ－１のＴｙｒ残基部位に結合することが確認された。
さらに、ＩＣＡＭ－１が特定の残基によってＳＲＣに結合することを確認するために、ＩＣＡＭ－１のＴｙｒ５１２リン酸化残基を阻害（Ｙ５１２Ａ）又は活性化（Ｙ５１２Ｄ）するホスホミメティクス型を有する変異体を使用して、免疫沈降反応を実行した。結果として、図３Ｆ及び３Ｇに示されているように、リン酸残基が活性化されるほど、ＳＲＣにより強く結合されることが確認された。
３－２．ＩＣＡＭ－１及びＳＲＣとｃ－ＭＥＴとの関連性の確認
４つのＧＥＯデータベースを検討した結果、図４Ａに示されているように、ｃ－ＭＥＴの発現は、全ての大腸癌患者において増加することが確認され、これらの結果に基づいて、ＩＣＡＭ－１及びＳＲＣのメカニズムにおけるｃ－ＭＥＴの役割が具体的に確認された。ｃ－ＭＥＴ阻害剤が処理される場合、図４Ｂに示されているように、ＩＣＡＭ－１及びＳＲＣのリン酸化が低減することが確認された。ＩＣＡＭ－１の発現が減少した後に、ｃ－ＭＥＴのリガンドであるＨＧＦが処理された場合、図４Ｃに示されているように、ＩＣＡＭ－１の発現に依存してｐ－ＳＲＣの発現が減少した。
例３－１においてＩＣＡＭ－１を阻害又は過剰発現した変異体を構築した後、ＳＲＣの活性化を確認した結果、図４Ｄに示されているように、ＩＣＡＭ－１が過剰発現した変異体におけるＳＲＣの活性化が有意なレベルに増加したことが確認された。上記結果を支持するために、免疫沈降及びＰＬＡ染色を実行した結果、図４Ｅ及び４Ｆに示されているように、ＩＣＡＭ－１の発現が減少するにつれて、ｃ－ＭＥＴのＳＲＣに対する結合が低減することが確認された。ＩＣＡＭ－１及びｃ－ＭＥＴが同じ位置に存在する場合、ＩＣＣを通して、ｐ－ＳＲＣが増加することが確認され、その結果が図４Ｇに示されている。
［例４］
ＳＲＣに依存するＩＣＡＭ－１の転移能及び血管形成能の確認
ＩＣＡＭ－１がＳＲＣに依存して癌転移及び血管形成を調節するか否かが確認された。
まず、転移能を確認するために、レスキュー実験において、ＩＣＡＭ－１を過剰発現させ、次いでＳＲＣをノックダウンした後、図５Ａに示されているように、ＩＣＡＭ－１発現が増加した場合でも、ＳＲＣが減少するにつれて、転移能が減少した。
次に、ＲＴ－ＰＣＲ及びウエスタンブロットを使用して、ＥＭＴマーカ及び転写因子の発現を確認した結果、図５Ｂ及び５Ｃに示されているように、ＳＲＣの発現が減少するにつれて、ＥＭＴマーカ及び転写因子の発現が減少することが確認された。
加えて、血管形成における変化を確認するために、血管を撮影して、血管形成を誘導する成長因子の発現を確認し、次いで長さを測定した結果、ＩＣＡＭ－１を過剰発現させ、次いでＳＲＣをノックダウンすると、血管形成が低減し（図５Ｄ）、血管形成に関与する因子（図５Ｅ）及び成長因子（図５Ｆ）の発現も減少することが確認された。
上記結果から、ＩＣＡＭ－１の転移能及び血管形成能がＳＲＣに依存して調節されることを推測することができる。
［例５］
ＩＣＡＭ－１の発現に応じた患者の生存率及び癌の悪性度の確認
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験に加えて、患者に直接適用した場合でも、ＩＣＡＭ－１の発現が大腸癌との相関を示すか否かを確認するために、ＴＣＧＡデータベースを通して大腸癌患者の生存率をチェックした。結果として、図６Ａに示されているように、大腸癌患者の生存率は、ＩＣＡＭ－１が高発現すると低下することが確認された。
加えて、ＧＳＥ１７５３８におけるＩＣＡＭ－１発現に応じた大腸癌患者の癌グレードをチェックした結果、図６Ｂに示されているように、ＩＣＡＭ－１がより低い場合に比べてＩＣＡＭ－１がより高い場合に、ステージ３に相当する患者がより多くなることが確認された。
さらに、ＧＤＣ ＴＣＧＡを通して癌の悪性度を確認し、このとき、癌の悪性度は、ＴＮＭステージ中で腫瘍サイズに従って区分されるＴステージとして示した。各ステージは、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４に区分され、数が大きくなるほど、癌はより悪性に進行している。結果として、図６Ｃに示されているように、ＩＣＡＭ－１の発現が高いほど、Ｔ３及びＴ４に相当する患者がより多く見られることが確認された。
例３及び４によって相互作用が確認されたＩＣＡＭ－１及びＳＲＣの腫瘍悪性作用を具体的に確認するために、大腸癌患者の組織を観察した。図６Ｄに示されているように、ＩＣＡＭ－１及びｐ－ＳＲＣは正の相関を有し、予後を詳細に検討した場合、図６Ｅに示されているように、ＩＣＡＭ－１及びｐ－ＳＲＣの発現レベルが高いほど、予後は悪化することが確認された。
［例６］
ＩＣＡＭ－１活性の阻害による腫瘍悪性度の改善効果の確認
ＩＣＡＭ－１阻害剤が投与された場合、腫瘍の転移の改善効果を確認するために、腫瘍を盲腸に注入した後、３週間が経過したときに、ＩＣＡＭ－１を標的とするモノクローナル抗体によって処理し、経過を確認した。結果として、図７Ａに示されているように、抗体を処理した場合、腫瘍の転移が対照群と比較して低減することが確認され、ＰＣＲ及び組織免疫染色を実行した場合、図７Ｂ及び７Ｃに示されているように、転移に関与する遺伝子であるＣＤＨ１、ビメンチン、スネイル、及びＺｅｂ１の発現レベルが低減することが確認された。
ＩＣＡＭ－１を標的とするモノクローナル抗体によってＳＷ－４８０細胞株を処理した場合、血管のイメージング及び長さを測定することによって、血管形成が有意に低減することが確認された（図７Ｄ）。図７Ｅ及び図７Ｆに示されているように、ｉｎ ｖｉｖｏで血管形成及び血管形成を制御する成長因子の発現が低減することが具体的に確認された。
本開示の上述の説明は、例としてのものであり、本開示は、本開示の技術的精神又は不可欠な特徴を変更することなく、他の特定の形態において容易に改変することができることが当業者には理解されるであろう。したがって、上述した実施形態は、例示的なものであり、全ての観点において限定されないことが理解されるべきである。
［産業上の利用可能性］
本開示は、ＩＣＡＭ－１がＳＲＣに依存して癌転移及び血管形成を調節することができることを確認することによって、ＩＣＡＭ－１が大腸癌治療の開発のための潜在的な標的となり得ることを示している。したがって、本開示の方法によってスクリーニングされた標的因子を使用すると、大腸癌の治療の開発のための産業分野において有用となることが期待される。
本開示は、ＩＣＡＭ－１がＳＲＣに依存して癌転移及び血管形成を調節することができることを確認することによって、ＩＣＡＭ－１が大腸癌治療の開発のための潜在的な標的となり得ることを示している。したがって、本開示の方法によってスクリーニングされた標的因子を使用すると、大腸癌の治療の開発のための産業分野において有用となることが期待される。
［項目１］
大腸癌転移阻害剤をスクリーニングする方法であって、
ｉｎ ｖｉｔｒｏで候補物質を細胞に処理する段階；
細胞内のＩＣＡＭ－１（細胞間接着分子１）のＳＲＣに対する結合レベルを測定する段階；及び
候補物質による非処理群と比較して、ＩＣＡＭ－１のＳＲＣに対する結合レベルを増加させる候補物質を、治療物質として選択する段階
を備える、方法。
［項目２］
細胞は、大腸癌である、項目１に記載の方法。
［項目３］
候補物質は、化合物、微生物培養物又は抽出物、天然抽出物、核酸、及びペプチドからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
［項目４］
核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、及びモルホリノからなる群から選択される、項目３に記載の方法。
［項目５］
ＩＣＡＭ－１のＳＲＣに対する結合レベルを測定する段階は、ＩＣＡＭ－１及びＳＲＣ遺伝子のｍＲＮＡのレベル、又は遺伝子によってエンコードされるタンパク質のレベルを測定する段階を有する、項目１に記載の方法。
［項目６］
ｍＲＮＡのレベルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（ＲＰＡ）、マイクロアレイ、及びノーザンブロット法からなる群から選択される少なくとも１つの方法を通して測定される、項目５に記載の方法。
［項目７］
ＩＣＡＭ－１遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定する薬剤、又は遺伝子によってエンコードされるタンパク質のレベルを測定する薬剤を備える、大腸癌転移を予測するための組成物。
［項目８］
ＩＣＡＭ－１遺伝子又は遺伝子によってエンコードされるタンパク質を有効成分として備える、大腸癌転移を阻害する医薬組成物。
［項目９］
項目７に記載の大腸癌転移を予測するための組成物を使用する、大腸癌転移を予測する方法。
［項目１０］
項目８に記載の医薬組成物を対象に投与する段階を備える、大腸癌転移を予防、阻害、又は治療する方法。
［項目１１］
大腸癌転移を予測するための、項目７に記載の大腸癌転移を予測するための組成物の使用。
［項目１２］
大腸癌転移を予防、阻害、又は治療するための、項目８に記載の医薬組成物の使用。

Claims (12)

  1. 大腸癌転移阻害剤をスクリーニングする方法であって、
    ｉｎ ｖｉｔｒｏで候補物質を細胞に処理する段階；
    前記細胞内のＩＣＡＭ－１（細胞間接着分子１）のＳＲＣに対する結合レベルを測定する段階；及び
    前記候補物質による非処理群と比較して、前記ＩＣＡＭ－１のＳＲＣに対する結合レベルを増加させる前記候補物質を、治療物質として選択する段階
    を備える、方法。
  2. 前記細胞は、大腸癌である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記候補物質は、化合物、微生物培養物又は抽出物、天然抽出物、核酸、及びペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、及びモルホリノからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ＩＣＡＭ－１のＳＲＣに対する結合レベルを測定する前記段階は、ＩＣＡＭ－１及びＳＲＣ遺伝子のｍＲＮＡのレベル、又は前記遺伝子によってエンコードされるタンパク質のレベルを測定する段階を有する、請求項１に記載の方法。
  6. 前記ｍＲＮＡのレベルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（ＲＰＡ）、マイクロアレイ、及びノーザンブロット法からなる群から選択される少なくとも１つの方法を通して測定される、請求項５に記載の方法。
  7. ＩＣＡＭ－１遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定する薬剤、又は前記遺伝子によってエンコードされるタンパク質のレベルを測定する薬剤を備える、大腸癌転移を予測するための組成物。
  8. ＩＣＡＭ－１遺伝子又は前記遺伝子によってエンコードされるタンパク質を有効成分として備える、大腸癌転移を阻害する医薬組成物。
  9. 請求項７に記載の大腸癌転移を予測するための組成物を使用する、大腸癌転移を予測する方法。
  10. 請求項８に記載の医薬組成物を対象に投与する段階を備える、大腸癌転移を予防、阻害、又は治療する方法。
  11. 大腸癌転移を予測するための、請求項７に記載の大腸癌転移を予測するための組成物の使用。
  12. 大腸癌転移を予防、阻害、又は治療するための、請求項８に記載の医薬組成物の使用。
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