KR101722534B1 - TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료, 또는 암 전이 억제용 조성물 - Google Patents

TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료, 또는 암 전이 억제용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101722534B1
KR101722534B1 KR1020140135813A KR20140135813A KR101722534B1 KR 101722534 B1 KR101722534 B1 KR 101722534B1 KR 1020140135813 A KR1020140135813 A KR 1020140135813A KR 20140135813 A KR20140135813 A KR 20140135813A KR 101722534 B1 KR101722534 B1 KR 101722534B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cys
gly
ala
thr
tm4sf5
Prior art date
Application number
KR1020140135813A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150041751A (ko
Inventor
이정원
이봉진
송행은
김도희
이두형
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Publication of KR20150041751A publication Critical patent/KR20150041751A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101722534B1 publication Critical patent/KR101722534B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1741—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals alpha-Glycoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료, 또는 암 전이 억제용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로세포 내로의 이동에 효과적인 TAT 혹은 antennapedia 펩타이드 등의 CPP에 TM4SF5(Transmembrane 4 L6 family member 5)의 C-terminal 서열을 접합시킨, TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제는 TM4SF5를 특이적으로 표적화하여 TM4SF5에 의해 매개된 c-Src의 SH1과의 결합을 감소시켜 c-Src의 활성화가 억제되도록 하여 세포이동, 세포침윤, 세포의 타원형 형성(spheroid growth), 종양 형성, 혈액 내 순환하는 암세포의 존재 등을 불가능하게 함으로써 세포의 침윤과 전이를 억제할 수 있고, 동물에서 독성 없이 종양 조직의 부피 및 전이를 유의적으로 감소시키므로, 상기 TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 암 예방 및 치료, 또는 암 전이 억제용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료, 또는 암 전이 억제용 조성물{The composition for the prevention and treatment of cancers, or inhibition of metastasis containing binding inhibitor of TM4SF5 protein and c-Src protein}
본 발명의 목적은 TM4SF5(Transmembrane 4 L6 family member 5) 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료, 또는 암 전이 억제용 조성물에 관한 것이다.
암으로 인한 사망의 90%는 전이 때문이라고 알려져 있다. 전이는 혈류와 다른 인자들에 의해 암세포가 특정 기관으로 전달되는 것을 시작으로, 그 새로운 장소에서 암세포의 상호작용을 통해 다시 성장하는 것을 말한다. 종양특이항원으로 알려진 Transmembrane 4 L6 family member 5(TM4SF5, GenBank No.: NM-003963)는 이러한 전이와 그것을 위한 상피-중간엽 전이(Epithelial-mesenchymal transition, EMT) 뿐만 아니라 침윤(invasion)을 일으키는 단백질로서, 간암을 포함한 다양한 암의 종류에서 발현된다. 당단백질(Glycoprotein)의 일종인 TM4SF5는 4개의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 세포질에 존재하는 인터셀룰라 루프(intercellular loop), N-말단(N-terminal), C-말단(C-terminal)으로 이루어져 있으며 이것의 인터셀룰라 루프(intercellular loop)는 FAK의 FERM 도메인과 결합하여 FAK의 구조를 변화시켜 열린 상태로 만들어 활성화시킨다(O jung et al. (2012) Journal of Cell Science. 125(Pt 24):5960-73). 또한, C-말단(C-terminal)은 세포 내 c-Src와 결합함으로써 TM4SF5에 의해 매개 되는 세포의 전이와 침윤을 조절하는데(O.Jung et al. (2013) Biochimica et Biophysica Acta 1833(3):629-42) 이에 따른 자세한 분자적 수준의 기전은 보고된바 없다.
HIV로부터 유래한 TAT은 Trans-Activator of Transcription의 약자로 PTD(protein transduction domain)의 일종이다. Antennapedia 펩타이드(Antp)의 16개 아미노산 펩타이드도 역시 PTD의 일종이다. PTD는 CPP(cell permeable protein)라고도 불리는 10-16개의 염기성 아미노산으로 구성된 작은 펩타이드로, 특별한 수용체의 도움 없이 자기 자신 혹은 자신과 결합하고 있는 물질들과 함께 플라스마 멤브레인(plasma membrane)을 통과하여 세포 내에 축적되는 물질을 말한다. 상기 보고된 PTD로 처음 발견된 단백질이 바로 TAT protein이며 RKKRRQRRRP의 아미노산 서열이고, Antp는 RQIKIWFQNRRMKWKK의 서열로서 이러한 CPP는 결합하고 있는 물질들을 세포 내로 이동시키는 역할을 수행한다. TAT 혹은 Antp protein이 세포 내로 이동하는 메커니즘은 두 가지 모델로 기재되고 있으며, 하나는 직접적 침투하는 기전(direct penetration pathway)으로 세포 내로의 직접적인 삽입을 통해 세포막을 통과하고 세포질로 들어갈 수 있다는 것이다. 두 번째 모델은 lipid raft-dependent macropinocytosis를 통해 삽입되는 것이다. 하지만, 아직까지 TAT/Antp의 세포 내 유입에 관한 정확한 메커니즘은 밝혀지지 않은 상태이다.
이에 본 발명자들은, 암 예방 또는 치료, 또는 암전이 억제용 조성물을 개발하기 위해 노력하던 중, 세포 내로의 이동에 효과적인 TAT(Trans-Activator of Transcription) 혹은 Antp에 TM4SF5(Transmembrane 4 L6 family member 5)의 C-terminal을 접합시킨, TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제는 TM4SF5를 특이적으로 표적화하여 TM4SF5에 의해 매개된 c-Src의 SH1 도메인과의 결합을 감소시킴으로써 세포의 침윤과 전이를 억제할 수 있고, 동물에서 독성 없이 종양 조직의 부피 및 전이를 유의적으로 감소시키는 것을 확인함으로써, 상기 결합 억제제를 암 예방 및 치료, 또는 암 전이 억제용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 TM4SF5(Transmembrane 4 L6 family member 5) 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료, 또는 암 전이 억제용 조성물에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TM4SF5(Transmembrane 4 L6 family member 5) 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 유효성분으로 함유하는 암 전이 억제용 약학적 조성물 제공한다.
또한, 본발명은
1) 피검체로부터 TM4SF5 단백질과 c-Src 단백질의 결합 수준 또는 c-Src의 Tyr419 인산화 및 활성화를 측정하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 결합 수준이 정상 대조군의 결합수준에 비해 증가하는 개체, 또는 상기 단계 1)의 결합 수준 또는 결합에 따른 c-Src의 인산화 및 활성화가 세포의 spheroid growth, 종양형성, 혈액 내 순환하는 암세포의 존재를 증가하게 하는 개체를 선별하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 선별된 개체가 암에 걸릴 위험을 가질 개체로 판단하는 단계를 포함하는 암 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 간 결합수준의 측정방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검체로부터 수득한 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에서 TM4SF5 단백질과 c-Src의 결합을 감소시키거나, TM4SF5-매개하는 c-Src 활성화, FAK, 코택틴의 인산화, 세포의 타원형 형성(spheroid growth), 종양 형성, 혈액 내 순환하는 암세포의 존재를 저해시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제 후보물질 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 세포 내로의 이동에 효과적인 TAT(Trans-Activator of Transcription)에 TM4SF5(Transmembrane 4 L6 family member 5)의 C-terminal을 접합시킨, TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제는 TM4SF5를 특이적으로 표적화하여 TM4SF5에 의해 매개된 c-Src의 SH1과의 결합을 감소시켜 c-Src의 활성화가 억제되도록 하여 세포의 타원형 형성(spheroid growth), 종양 형성, 혈액 내 순환하는 암세포의 존재 등을 불가능하게 함으로써 세포의 침윤과 전이를 억제할 수 있고, 동물에서 독성 없이 종양 조직의 부피 및 전이를 유의적으로 감소시키므로, 상기 TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 암 예방 및 치료, 또는 암 전이 억제용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1A는 TM4SF5(Transmembrane 4 L6 family member 5) 단백질의 C-말단(C-terminal)부분에 TAT를 접합시켜 만든 펩타이드의 서열을 나타낸 도이다.
도 1B는 펩타이드를 처리한 세포에서 세포표면에 붙은 게 아니라, TAT항체가 투과되도록 Triton x-100으로 처리한 경우에서만 형광신호가 보임에 따라 세포 안에 TAT 펩타이드들이 TAT에 의해 세포 내로 이동을 한 것을 나타낸 도이다.
도 2a는 TM4SF5를 발현하지 않는 대조군 SNU449Cp 세포와 TM4SF5를 발현하는 SNU449Tp 세포에 펩타이드를 처리한 후, TM4SF5 단백질에 의해 조절되는 다양한 신호전달 분자들의 발현 및 인산화가 감소하는 영향을 나타낸 도이다:
Cp: 대조군,
Tp: TM4SF5 과발현 세포,
TCsr: TAT-Cscram peptide,
TC: TAT-Cter 펩타이드; 및
TcxC: TAT-caax-Cter 펩타이드.
도 2b는 TM4SF5를 발현하지 않는 대조군 SNU449Cp 세포와 TM4SF5를 발현하는 SNU449Tp 세포에 펩타이드를 처리한 후, 펩타이드가 Tyr397이 인산화된 FAK과 actin으로 염색된 초점 접착(focal adhesion)의 감소를 초래하는 영향을 나타낸 도이다:
Cp: 대조군,
Tp: TM4SF5 과발현 세포,
TCsr: TAT-Cscram 펩타이드,
TC: TAT-Cter 펩타이드; 및
TcxC: TAT-caax-Cter 펩타이드.
도 2c는 TM4SF5를 발현하지 않는 대조군 SNU761-Mock 세포와 TM4SF5를 발현하는 SNU761-TM4SF5-FLAG 세포에 펩타이드를 처리하고 TM4SF5 단백질에 의해 조절되는 신호전달 인자들의 인산화 발현을 나타낸 도이다:
Mock: 대조군,
WT: TM4SF5 과발현 세포,
TCsr: TAT-Cscram peptide,
TC: TAT-Cter 펩타이드; 및
TcxC: TAT-caax-Cter 펩타이드.
도 2d는 SNU449 세포주에 TM4SF5-FLAG를 일시적으로 발현시킨 후 펩타이드를 처리하여 인산화 발현을 나타낸 도이다:
Mock: 대조군,
TM4SF5-FLAG: TM4SF5-FLAG를 과발현하는 세포
TCsr: TAT-Cscram peptide,
TC: TAT-Cter 펩타이드; 및
TcxC: TAT-caax-Cter 펩타이드.
도 2e는 TM4SF5를 본래 발현하는 간암 세포주인 Huh7와 HepG2 세포에 펩타이드를 처리하여 인산화를 감소시키는 영향을 나타낸 도이다.
TCsr: TAT-Cscram peptide,
TC: TAT-Cter 펩타이드; 및
TcxC: TAT-caax-Cter 펩타이드.
도 2f는 TM4SF5를 원래 발현하지 않는 간암 SNU449 세포주 및 SNU398 세포주에 펩타이드를 처리하여 인산화의 감소를 초래하지 않는 것을 나타낸 도이다:
TCsr: TAT-Cscram peptide,
TC: TAT-Cter 펩타이드; 및
TcxC: TAT-caax-Cter 펩타이드.
도 2g는 TAT 펩타이드가 아닌 antennapedia peptide(Antp)에 CaaX 서열과 더불어 TM4SF5 C-terminal 아미노산 서열(GDCRKKQDTPH)을 부착하여 c-Src 인산화 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 3a는 실험에서 사용한 c-Src의 제작체(construct)를 모식화한 도이다. c-Src는 N-terminus에 SH4, SH3, SH2, 그리고 C-terminal에 SH1 kinase도메인이 존재하며, 536개의 아미노산으로 이루어졌다. SH4나 SH1 도메인이 각각 없는 construct나, 398번부터 아미노산 잔기가 없앤 1-397 제작체, 그리고 250-536번의 아미노산으로 이루어진 SH1 도메인 제작체를 나타낸다.
도 3b는 TM4SF5를 발현하지 않는 SNU449 세포주에 STrEP-Mock 이나 STrEP-TM4SF5 플라스미드를 주입 발현시키고 세포추출액을 수득한 후 streptavidin으로 코팅된 beads로 면역침강하여, c-Src가 함께 침강하는 것을 확인한 도이다.
도 3c는 TM4SF5를 발현하지 않는 SNU449 세포주에 STrEP-Mock 이나 STrEP-TM4SF5 플라스미드와 c-Src 전체(WT, 아미노산 1번에서 536번까지 전체)나 SH321(아미노산 91번에서 536까지의 construct), SH1 도메인을 공동주입발현시키고 세포추출액을 수득한 후 streptavidin으로 코팅된 beads로 면역침강하여, c-Src 전체, SH321 도메인들, SH1도메인이 함께 침강하는 것을 확인한 것이다.
도 3d는 TM4SF5를 발현하지 않는 SNU449 세포주에 STrEP-Mock 이나 STrEP-TM4SF5 플라스미드와 c-Src 전체(WT, 아미노산 1번에서 536번까지 전체)나 SH321(아미노산 91번에서 536까지의 construct), SH1 도메인을 공동주입발현시키고 세포추출액을 수득한 후 streptavidin으로 코팅된 beads로 면역침강하여, c-Src 전체, SH321 도메인들, SH1 도메인이 함께 침강하지만, TM4SF5가 발현하지 않는 대조군 SNU449Cp 세포주에서는 그러한 침강이 확인되지 않음을 나타낸 도이다.
도 3e는 TM4SF5를 발현하지 않는 SNU449 세포주에 STrEP-Mock 이나 STrEP-TM4SF5 플라스미드와 c-Src 전체(WT), 1-397번까지 아미노산으로 이루어진 제작체(1-397), SH432 도메인(아미노산 1번에서 250까지의 construct)을 공동주입발현시키고 세포추출액을 수득한 후 streptavidin으로 코팅된 beads로 면역침강하여, 원래 세포내에 존재하던 c-Src 전체는 함께 침강하지만, 외부에서 플라스미드로 발현시킨 1-397 및 SH432 도메인들은 침강이 확인되지 않음을 나타낸 도이다.
도 4a는 TM4SF5와 세포 내재적인 FAK과 c-Src 사이의 결합을 확인한 도이다:
도 4b는 TM4SF5의 C 말단이 결실되어 있는 SNU761 Flag-TM4SF5 △C 세포를 이용하여 면역 침강 실험을 수행한 도이다. TM4SF5-FLAG WT을 발현하는 세포는 공동 주입 발현시킨 c-Src WT 및 SH1 도메인과 면역침강하여 결합하나, Flag-TM4SF5 △C를 발현하는 세포는 SH1 도메인이 결합하지 않음을 나타낸다.
도 4c는 TM4SF5의 intercellular loop 부분의 19개 아미노산이 결실되어 있는 SNU761 Flag-TM4SF5 △ICL19 세포를 이용한 면역 침강 실험을 수행한 도이다. Flag-TM4SF5 △ICL19를 발현하는 세포는 SH1 도메인과의 결합이 TM4SF5-FLAG WT에 비해 저하됨을 나타내는 도이다.
도 4d는 TM4SF5 C 말단의 189번 시스테인(cysteine) 잔기를 알라닌(alanine)으로 치환하여 만든 Strep-TM4SF5C189A DNA를 Strep-Mock, Strep-TM4SF5 DNA 및 c-Src SH1 도메인과 함께 SNU449 세포에 형질 감염시킨 후 면역 침강 실험을 수행한 도이다. Strep-TM4SF5 WT을 발현하는 세포는 SH1 도메인이 결합하지만, C189A 돌연변이 TM4SF5는 결합하지 않음을 나타내는 도이다.
도 5a는 실험에서 사용한 c-Src의 제작체(construct)를 모식화한 도이다.
도 5b는 c-Src의 제작체(construct)로 SNU449 세포주에서의 내재적인 c-Src의 결합을 확인한 도이다: TM4SF5를 발현하지 않는 SNU449 세포주에 STrEP-TM4SF5 플라스미드와 c-Src 전체(WT), SH1 도메인 및 SH1 도메인의 점 돌연변이체(K298M-tagged HA 혹은 K298M/Y530F-tagged HA)를 공동주입 발현시키고 세포추출액을 얻은 후 streptavidin으로 코팅된 beads로 면역침강하여, c-Src전체나 SH1 도메인보다 SH1 도메인의 K298M-tagged HA 돌연변이체가 더욱더 함께 침강하는 것을 확인한 것이다. 하지만 c-SH1의 K298M/Y530F-tagged HA 돌연변이체와는 결합하지 않음을 나타내는 도이다.
도 5d는 SNU449 세포에 STrEP-TM4SF5 플라스미드와 c-Src의 SH1 도메인, 그리고 SH1의 점 돌연변이체들(Y419F, Y530F, Y419F/Y530F, K298M-tagged HA, K298M/Y530F-tagged HA) 제작체(construct)를 함께 주입발현이용하여 일시적으로 c-Src의 발현을 조절한 후 TM4SF5와의 결합과 FAK, c-Src, 코택틴(cortactin)의 인산화을 나타낸 도이다.
도 5d는 TM4SF5를 발현하지 않는 SNU761-mock, TM4SF5 와일드타입(WT)를 발현하는 SNU761-TM4SF5 WT, intracellular loop 의 71-89번 아미노산 잔기가 제거된 돌연변이 TM4SF5ΔICL19가 발현되는 SNU761-TM4SF5ΔICL19 세포주에 STrEP-TM4SF5 플라스미드와 c-Src 전체(WT) 및 Y419F, Y530F, K298R 돌연변이체, SH1 도메인 및 SH1 도메인의 점 돌연변이체(Y419F, Y530F, Y419F/Y530F, K298M-tagged HA 혹은 K298M/Y530F-tagged HA)을 공동으로 주입발현시키고 세포추출액을 수득한 후 FAK의 c-Src 인산화를 나타내는 것을 확인한 도이다.
도 6a는 PCR mutagenesis 방법을 이용하여 SH1 도메인을 돌연변이로 제작하기 위한 Y419F, Y530F, Y419F/Y530F construct 및 c-Src를 항상 닫힌 구조(closed form)로 유지시키는 삼중 돌연변이인 Q531E/P532E/G533I construct 및 사중 돌연변이인 Y418F/Q531E/P532E/G533I의 모식도를 나타낸 도이다.
도 6b는 상기 돌연변이 DNA를 Strep-TM4SF5 DNA와 함께 SNU449 세포에 형질 감염시킨후 면역 침강 실험을 수행한 도이다. TM4SF5-Strep WT에 SH321 도메인 WT은 결합하지만, Y530F, 혹은 Y419F/Y530F 돌연변이 SH321 도메인은 결합이 안되는 것을 나타내는 도이다.
도 6c는 상기 도 6a의 DNA들을 Strep-TM4SF5 DNA와 함께 SNU449 세포에 형질 감염시킨후 면역 침강 실험을 수행한 도이다. TM4SF5-Strep WT에 SH321 도메인 WT혹은 Q531E/P532E/G533I은 결합하지만, Y419F 및 Y419F/Q531E/P532E/G533I 돌연변이 SH321 도메인은 결합이 안되는 것을 나타내는 도이다.
도 7a는 SNU449 세포에 Strep-Mock 혹은 Strep-TM4SF5, PTP1B 혹은 그것의 Mock DNA, c-Src SH321 construct를 형질 감염 시킨 후 PTP1B를 추가로 과발현시킨 후 면역 침강 법을 수행한 도이다. PTP1B를 추가로 발현하지 않은 경우에 대비하여, 과다발현시켰을 경우에, TM4SF5-Strep WT과 c-Src SH321도메인과의 결합이 감소함을 나타내는 도이다.
도 7b는 SNU761 stable 세포를 이용하여 PTP1B를 과발현시켰을 때 TM4SF5와 c-Src 사이의 결합을 나타낸 도이다. PTP1B를 과다발현되지 않은 경우에 대비하여, 과다발현시켰을 경우에, TM4SF5-FLAG WT과 c-Src SH321도메인과의 결합이 감소함을 나타내는 도이다.
도 7c는 PTP1B의 siRNA를 이용하여 PTP1B를 발현 억제시킨 후 면역 침강법을 이용하여 실험한 결과를 나타낸 도이다. PTP1B를 발현 억제되지 않은 경우에 대비하여, 발현 억제시켰을 경우에, TM4SF5-FLAG WT과 c-Src 와의 결합이 증가함을 나타내는 도이다.
도 8은 TM4SF5를 발현하지 않는 SNU449 세포주에 STrEP-Mock 이나 STrEP-TM4SF5 플라스미드와 c-Src SH1 도메인 construct를 공동주입발현시키고, 세포에 대조군 TAT-Cscram 펩타이드 혹은 TAT-caax-Cter 펩타이드를 24 시간 처리하고 세포추출액을 얻은 후, streptavidin으로 코팅된 beads로 면역침강하여, 원래 세포에 발현되는 c-Src 전체와 SH1 도메인과 TM4SF5의 결합이 TAT-caax-Cter 펩타이드 처리에 의해 감소하는 것을 나타낸 도이다.
도 9a는 TM4SF5를 발현하지 않는 SNU761-mock, TM4SF5 와일드타입(WT)를 발현하는 SNU761-WT 세포주에 대조군 TAT-Cscram 펩타이드 및 TAT-Cter, TAT-caax-cTer 펩타이드를 처리한 후 세포 침윤(녹색형광으로 표지화된 젤라틴을 세포가 분해하여 색깔이 검게되는 정도를 형광현미경으로 확인)에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 9b는 TM4SF5를 발현하지 않는 SNU449Cp, TM4SF5 와일드타입(WT)를 발현하는 SNU449Tp 세포주에 대조군 TAT-Cscram 펩타이드 및 TAT-Cter, TAT-caax-Cter 펩타이드를 처리한 후 transwell migration 분석을 통하여 세포 이동에 미치는 영향을 나타낸 도이다. TAT-Cscram 펩타이드 처리에 대비하여 TAT-Cter, TAT-caax-Cter 펩타이드를 처리하는 경우, TM4SF5를 발현하는 SNU449Tp 세포주의 이동 능력이 감소함을 나타내는 도이다.
도 10a는 c-Src 억제제인 PP2 및 대조군 PP3 화합물을 TM4SF5를 발현하는 세포 SNU449Tp 세포를 누드 마우스에 피하 주사하여 종양조직의 부피와 마우스의 체중을 나타낸 도이다. TM4SF5을 발현하는 세포주에 의한 종양형성이 PP2의 처리에 의해 PP3를 처리하는 것보다 훨씬 효과적으로 감소함을 보여주는 도이다.
도 10b는 TM4SF5를 발현하는 세포 SNU449Tp 세포를 피하 주사한 누드 마우스에 TAT-caax-Cter 펩타이드를 투여함에 따라 농도 의존적으로 종양의 부피가 감소함을 나타낸 도이다.
도 11은 TM4SF5를 과발현하고 있는 SNU449T7 클론을 마우스의 꼬리 정맥에 주사하고 폐에 암전이가 되는 것을 확인하고자 하였을 때, 누드마우스에 TAT-caax-Cter 펩타이드를 투여함에 따라 농도 의존적으로 암덩이의 숫자가 감소되는 것을 나타낸 도이다.
도 12a는 내재적으로 TM4SF5를 발현하는 Huh7과 HepG2 세포는 spheroid 타입의 세포가 형성되는 것을 확인한 도이다. TM4SF5를 발현하지 않는 세포 (SNU449 및 SNU761 세포주)에 대비하여 TM4SF5를 내재적으로 발현하는 Huh7 및 HepG2 세포주는 spheroid를 잘 형성함을 보여주는 도이다.
도 12b는 TM4SF5를 발현하지 않는 SNU449 모세포주(P), 대조군 세포주 (Cp), 혹은 N138A-TM4SF5, N155Q-TM4SF5, 혹은 N138A/N155Q-TM4SF5 돌연변이체를 발현하는 세포주에 대비하여, TM4SF5 WT을 발현하는 SNU449의 단일 클론 세포들(T3, T7, T10 및 T16) 및 TM4SF5의 N-glycosylation 돌연변이 세포들(N138A, N115Q 또는 N138A/N155Q)의 spheroid 타입의 세포를 형성하는 것을 확인한 도이다.
도 12c는 상기 도 12b에서 70 μm 이상의 크기를 가지는 spheroid 세포를 카운팅한 도이다.
도 12d는 aldehyde dehydrogenase(ALDH)의 활성과 TM4SF5 WT의 발현의 상관관계를 나타낸 도이다.
도 12e는 TM4SF5의 발현을 억제시킨 Huh7 세포에서 다양한 세포 신호인자들의 활성화가 억제되는 것을 확인한 도이다.
도 12f는 TM4SF5의 발현을 억제하는 shRNA (shTM4SF5)를 주입하여 TM4SF5의 발현을 억제시킨 Huh7 세포에서 spheroid 타입의 세포의 형성이 억제되는 것을 확인한 도이다.
도 13a는 TM4SF5를 발현하지 않는 세포(P, Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(N138A, N155Q, N138A/N155Q(NA/NQ))를 과발현시킨 세포, wild-type TM4SF5(Tp, T3, T7, T10, T16)를 과발현시킨 세포주의 CD44, TM4SF5 및 CD24의 mRNA를 나타낸 도이다.
도 13b는 TM4SF5를 발현하지 않는 세포(P, Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(N138A, N155Q, NA/NQ)를 과발현시킨 세포, wild-type TM4SF5(Tp, T3, T7, T10, T16)를 과발현시킨 세포주의 CD44, TM4SF5 및 CD24의 단백질량을 나타낸 도이다.
도 14a는 TM4SF5를 발현하지 않는 세포(Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(NA/NQ) 또는 wild-type TM4SF5(T7)를 과발현시킨 세포를 이용하여 각각 500, 2000, 5000 cells/site를 피하 주사한 후 TM4SF5에 의한 종양형성능력을 측정한 결과를 나타낸 도이다. TM4SF5를 발현하지 않는 세포(Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(NA/NQ)에 대비하여, wild-type TM4SF5(T7)를 과발현시킨 세포는 적은 수의 세포를 주사하였음에도 종양을 잘 형성함을 보여주는 도이다.
도 14b는 누드마우스에서 형성된 종양조직에서 세포를 분리하여 western blotting을 수행한 결과를 나타낸 도이다. TM4SF5를 발현하지 않는 세포(Cp)에 대비하여 Wild-type TM4SF5(T7)를 과발현시킨 세포에 의해 생성된 종양 조직에서 p27Kip의 발현이 증가하고, p27Kip1, FAK, c-Src 및 STAT3의 인산화가 증가하였음을 나타내는 도이다.
도 14c는 상기 도 14a와 같이 처음 누드마우스에서 형성된 종양조직에서 분리한 세포(ExpT7 #2)를 이용하여 각각 200, 500, 2000, 5000 cells/site를 피하 주사하여 TM4SF5에 의한 serial 종양형성능력을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 14d는 1차, 2차 누드마우스에서 형성된 종양조직에서 세포를 분리하여 western blotting을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 14e는 누드마우스에서 형성된 종양조직에서 분리하여 얻은 세포주(ExpT7-2, T7-3)와 TM4SF5를 과발현시킨 세포(T7)를 이용해 FACS analysis을 수행한 결과를 나타낸 도이다. 원래 주사하였던 SNU449T7 세포주에 비하여, 누드마우스에 주사하여 생긴 첫 종양의 세포(ExpT7-2 및 ExpT7-3)들은 CD44, TM4SF5이 각각 혹은 둘 다 더 많이 발현하는 세포가 생긴다는 것을 보여주는 도이다.
도 15a는 2d에서 배양한 TM4SF5를 발현하지 않는 세포(P, Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(N138A, N155Q, NA/NQ) 또는 wild-type TM4SF5(Tp, T3, T7, T10, T16)를 과발현 시킨 세포주, 그리고 이 세포를 이용하여 RT-PCR, Western blotting 을 수행한 결과를 나타낸 도이다. TM4SF5 WT을 발현하는 세포주들에서 FAK, c-Src, STAT3의 활성이 증가하고, twist1 및 Bmi1의 발현이 증가함을 나타내는 도이다.
도 15b는 Src kinase activity를 저해시키는 PP2와 control인 DMSO, PP3 처리하는 조건에서 내재적인 TM4SF5를 발현하지 않는 세포(Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(NANQ) 또는 TM4SF5(Tp,T7)을 과발현시킨 세포를 이용하여 spheroid formation assay를 수행한 결과를 나타낸 도이다. TM4SF5를 발현하는 세포주들의 spheroid 생성이 DMSO나 PP3의 처리에는 영향받지 않으나 PP2의 처리에 의해 억제되는 것을 나타내는 도이다.
도 16a는 TM4SF5를 과발현 시킨 세포와 이들 세포에서 TM4SF5 발현을 저해시킨 세포를 이용하여 누드마우스의 간에 주입한 othotopic model을 만들어서 약 4주후에 마우스 혈액을 확인하여 TM4SF5를 발현하는 세포의 존재를 확인해본 결과를 나타낸 도이다. TM4SF5를 발현하는 세포주들이 혈관 속에 존재할 수 있으나, TM4SF5가 발현 억제된 세포를 주사한 경우에는 혈관 내에서 확인되지 않는 것을 나타내는 도이다.
도 16b는 마우스의 혈액에서 확인된 GFP-positive 세포를 측정한 결과를 나타낸 도이다. TM4SF5를 발현하는 세포주들이 혈관 속에 존재하나, TM4SF5가 발현 억제된 세포를 주사한 경우에는 혈관 내에서 확인되지 않는 것을 나타내는 도이다.
도 16c는 SNU449T7 세포주에 shScramble와 shCD44 DNA를 안정되게 transfection 하여 TM4SF5/CD44가 동시 발현되는 세포(SNU449T7-shScramble)와 이들 세포에서 TM4SF5는 발현을 하지만 CD44의 발현을 저해시킨 세포(SNU449T7-shCD44)를 주입한 지 6 주 후, 각각의 마우스의 혈액에서 확인된 DAPI로 염색되는 핵 혹은 DNA를 가지는 세포를 측정한 결과를 나타낸 도이다. 그리고 (SNU449T7-shCD44)를 주입한 마우스에 대비하여 TM4SF5/CD44가 동시 발현되는 세포(SNU449T7-shScramble)를 주사한 경우 마우스가 생존하는 경우가 줄어듦을 나타내는 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 TM4SF5(Transmembrane 4 L6 family member 5, GenBank No.: NM-003963) 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 TM4SF5 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하고, 상기 c-Src 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 결합억제제는 TM4SF5 단백질의 C-말단 및 c-Src 단백질의 SH1 도메인의 결합을 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 TM4SF5 단백질의 C-말단은 서열번호 3으로 기재되는 아미노선 서열을 갖는 것이 바람직하고, c-Src 단백질의 SH1 도메인은 서열번호 4로 기재되는 아미노선 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 결합 억제제는 TM4SF5 단백질의 C-말단 또는 c-Src 단백질의 SH1 도메인에 상보적으로 결합하는 펩타이드, 펩타이드 미메틱스, 기질 유사체, 앱타머(aptamer) 및 항체인 것이 바람직하고, 세포 내로 직접적인 투과가 가능한 세포투과성 펩타이드(cell-penetrating peptide) 서열을 포함하는, c-Src 단백질의 SH1 도메인에 결합하는 펩타이드인 것이 보다 바람직하며, c-Src 단백질의 SH1 도메인에 결합하는 서열번호 5, 서열번호 6, 또는 서열번호 18로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 세포투과성 펩타이드는 세포 내로의 투과를 돕는 펩타이드라면 어떤 것이든 가능하며, 안테나(antennapedia) 펩타이드 또는 TAT(Trans-Activator of Transcription) 펩타이드인 것이 더욱 바람직하나 TAT 펩타이드인 것이 보다 더 바람직하다.
상기 TM4SF5와 c-Src와의 결합은 c-Src의 Tyr419 인산화 혹은 활성화에 따른 spheroid growth, 5000개 이하(이에 한정하지는 않지만)의 세포를 누드마우스 피하에 주사 하는 경우 생기는 종양형성 기능, 혈관 내 종양세포의 존재에 대한 현상(순환줄기세포)의 특성을 초래하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 암은 췌장암, 위암, 간암, 대장암, 뇌암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 자궁암 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 접합된 운반체(cargo)를 세포내로 이동시킬 수 있는 능력을 가진 TAT은 HIV로부터 유래된 Trans-Activator of Transcription 혹은 antennapedia 펩타이드로서 지질 이중층의 세포막의 배열을 조절함으로써 접합된 운반체를 세포 내로 전달할 수 있다. TM4SF5의 C-terminal 서열을 접합시킨 TAT 펩타이드와 C-terminal의 서열을 무작위로 배열시킨 scramble 펩타이드, 그리고 membrane bound motif인 caax를 TAT과 TM4SF5의 C-terminal 사이에 접합시킨 TAT-caax-Cter 펩타이드(도 1A 참조)들은 TAT을 인지하는 항체를 이용한 면역 염색법을 이용해, 항체가 세포막을 투과하도록 해야만 세포 내에서 탐지되는 것이 확인되어 TAT 펩타이드들이 세포 내로 잘 들어가는 것을 확인하였으며(도 1B 참조), 다양한 조건에서의 실험을 통해 re-plating조건이 아닌, 그리고 serum이 있는 정상적인 배양 조건에서 10 μM, 24시간 처리하였을 때 그것의 효과가 가장 좋은 것을 확인하였다.
또한, TAT-Cter 펩타이드와 TAT-caax-Cter 펩타이드는 세포에 처리하였을 때, TAT-Cscram 펩타이드와는 달리 TM4SF5에 의해 유도되었던 다양한 신호전달 분자들, 그 중 특히 세포의 침윤(invasion)과 전이(migration)에 영향을 미치는 FAK, Paxillin, Src의 활성화에 관련된 다양한 인산화들의 감소가 나타남을 TM4SF5가 과발현된 세포주인 SNU449Tp에서 확인하였다(도 2a 참조). 또한 FAK에 의한 초점 결합(focal adhesion)이 TAT-Cter 펩타이드와 TAT-caax-Cter 펩타이드를 처리함에 따라 TM4SF5 특이적으로 감소되는 것을 면역염색법을 통해 확인하였다(도 2b 참조). SNU449Tp 세포주에서 뿐만 아니라 또 다른 TM4SF5 과발현 세포주인 SNU761WT에서도 TAT-Cter 펩타이드와 TAT-caax-Cter 펩타이드의 효과를 확인하였고(도 2c 참조), 또한 TM4SF5를 일시적인 주입발현을 통해 그 발현을 조절한 세포에서도 같은 효과가 나타남을 확인하였다(도 2d 참조).
또한, TM4SF5가 원래 내성적으로 발현되는 세포주인 Huh7과 HepG2에 동일조건으로 펩타이드를 처리하였을 때도 TAT-Cscram 펩타이드와는 달리 TAT-Cter 펩타이드와 TAT-caax-Cter 펩타이드에 의해 FAK과 Paxillin, Src의 인산화가 감소되는 것과(도 2e 참조) TM4SF5가 내성적으로 발현되지 않는 SNU398 세포에서는 TAT-Cter 펩타이드와 TAT-caax-Cter 펩타이드 효과가 나타나지 않은 것으로 상기 펩타이드들이 TM4SF5를 표적화할 수 있음을 알 수 있다(도 2f 참조). TM4SF5는 내부에 존재하는 c-Src와 세포 내에서 결합이 이루어지며(도 3b 참조), TM4SF5의 C-terminal과의 결합에 관여하는 c-Src의 부분을 확인하고자 다양한 c-Src의 제작체를 제작하여(도 3a 참조) 면역 침강법으로 그 결합을 확인하였다(도 3c 참조). 그 결과 TM4SF5는 c-Src의 SH1 도메인과 결합하며, SH1 도메인이 없는 SH432 제작체와 SH1 도메인의 398번 잔기 이후가 없는 제작체를 감염시켜 면역침강을 진행해본 결과에서 SH1 도메인이 TM4SF5와의 직접적인 결합에 관여하며 그 중에서도 특히 398번 잔기 이후의 잔기들이 결합에 중요하다는 것을 확인하였다(도 3d 참조). 또한, TM4SF5를 발현하지 않는 SNU449 세포주에 STrEP-Mock 이나 STrEP-TM4SF5 플라스미드와 c-Src 전체(WT), 1-397번까지 아미노산으로 이루어진 제작체(1-397), SH432 도메인(아미노산 1번에서 250까지의 construct)을 공동주입발현시키고 세포추출액을 수득한 후 streptavidin으로 코팅된 beads로 면역침강하여, 원래 세포내에 존재하던 c-Src 전체는 함께 침강하지만, 외부에서 플라스미드로 발현시킨 1-397 및 SH432 도메인들은 침강이 확인되지 않는 것을 확인하였다(도 3e 참조).
또한, TM4SF5의 C-말단과 c-Src의 SH1 도메인 사이의 결합 확인을 위해 TM4SF5의 부분 중 C 말단이 결실되어 있는 SNU761 Flag-TM4SF5 △C 세포, TM4SF5의 intercellular loop 부분의 19개 아미노산이 결실되어 있는 SNU761 Flag-TM4SF5 △ICL19 세포 및 TM4SF5 C 말단의 189번 시스테인(cysteine) 잔기를 알라닌(alanine)으로 치환하여 만든 Strep-TM4SF5 C189A DNA를 Strep-Mock, Strep-TM4SF5 DNA 및 c-Src SH1 도메인과 함께 SNU449 세포에 형질 감염시킨 후 면역 침강 실험을 하였다. 그 결과, TM4SF5와 세포 내재적인 FAK과 c-Src 사이의 결합을 확인하였고, TM4SF5 WT에서와는 달리 TM4SF5 △C 혹은 TM4SF5 C 말단의 C189A 돌연변이체에서는 TM4SF5와 c-Src 사이의 결합이 나타나지 않았으며 C 말단이 유지되어 있는 세포에서는 TM4SF5와 c-Src사이의 결합 또한 유지되는 것을 확인하였다. 또한, TM4SF5 C189A DNA를 형질 감염시킨 세포에서 c-Src의 SH1 도메인과의 결합이 감소하는 것을 확인하였다(도 4 참조). 이를 통해 TM4SF5의 C 말단부분이 c-Src의 SH1 도메인과의 특이적인 결합에 중요하게 작용하는 것을 알 수 있었다.
또한, SH1 도메인에 존재하는 주요한 잔기인 298번 라이신(lysine), 419번 타이로신(tyrosine), 530번 타이로신(tyrosine) 잔기들을 점 돌연변이(point mutation)시켜 다양한 돌연변이 construct들을 제작하였다(도 5a 참조). 그러한 construct들을 이용하여 일시적으로 주입발현시킨 후 면역침강법으로 TM4SF5와의 결합을 확인해본 결과(도 5b 참조), 비활성 형태의 닫힌 구조의 c-Src와 TM4SF5의 C-terminal의 결합이 더욱 선호됨을 알 수 있다. 또한, SNU449 세포에 STrEP-TM4SF5 플라스미드와 c-Src의 SH1 도메인, 그리고 SH1의 점 돌연변이체들(Y419F, Y530F, Y419F/Y530F, K298M-tagged HA, K298M/Y530F-tagged HA) 제작체(construct)를 함께 주입발현하여 일시적으로 c-Src의 발현을 조절한 후 TM4SF5와의 결합과 FAK, c-Src, 코택틴(cortactin)의 인산화를 확인하였고(도 5d 참조), 또한, TM4SF5를 발현하지 않는 SNU761-mock, TM4SF5 와일드타입 (WT)를 발현하는 SNU761-TM4SF5 WT, intracellular loop 의 71-89번 아미노산 잔기가 제거된 돌연변이 TM4SF5ΔICL19가 발현되는 SNU761-TM4SF5ΔICL19 세포주에 STrEP-TM4SF5 플라스미드와 c-Src 전체(WT) 및 Y419F, Y530F, K298R 돌연변이체, SH1 도메인 및 SH1 도메인의 점 돌연변이체(Y419F, Y530F, Y419F/Y530F, K298M-tagged HA 혹은 K298M/Y530F-tagged HA)를 공동주입발현시키고 세포추출액을 수득한 후 FAK의 c-Src 인산화를 확인한 결과(도 5d 참조), TM4SF5가 발현될 때 c-Src와의 결합에 의한 c-Src의 활성화가 특이적으로 PY 861 FAK(Tyr861이 인산화된 FAK)에 직결되어 조절되고, 이는 역시 TM4SF5와 FAK과의 결합이 존재하지 않는 TM4SF5ΔICL19 발현 세포(O jung et al. (2012) Journal of Cell Science. 125(Pt 24):5960-73)에서는 일어나지 않음을 확인하였다.
또한, SH1 도메인만이 아니라, c-Src의 닫힌 비활성화된 구조 형성에 중요한 SH3 도메인과 SH2 linker 도메인을 모두 가짐으로써, c-Src의 구조에 중요한 역할을 하는 SH321 도메인 construct를 이용하여 닫힌 구조의 비활성화된 c-Src가 TM4SF5와의 결합에 선호성을 가지는지를 확인하고자 PCR mutagenesis 방법을 이용하여 이전 SH1 도메인 construct들과 동일하게 Y419F, Y530F, Y419F/Y530F 돌연변이 DNA 및 c-Src를 항상 닫힌 구조(closed form)로 유지시키는 삼중 돌연변이인 Q531E/P532E/G533I construct, 및 사중 돌연변이 Y418F/Q531E/P532E/G533I construct도 제작하여 실험을 수행하였으며 그 결과, SH321보다는 SH321Y419F에서 더 높은 결합이 나타났고, SH321Y530F와 SH321Y419F/Y530F에서는 결합이 나타나지 않는 것을 확인하였고 삼중 돌연변이인 SH321Q531E/Y532e/G533I construct를 형질 감염시킨 후 면역 침강을 해본 결과와 함께 닫힌 구조의 비활성화된 c-Src가 TM4SF5와 결합을 더욱 잘한다는 것을 확인 하였다(도 6 참조).
또한, c-Src의 인산화된 530번 타이로신(tyrosine) 잔기를 탈인산화시킴으로써 c-Src를 열린 구조로 만들고 419번 타이로신이 인산화될 수 있게 하는 PTP1B(Protein Tyrosine Phosphatase 1B)를 이용하여 TM4SF5와 c-Src 사이의 결합을 확인하고자 PTP1B를 과발현시킨 후 SNU449 세포에 Strep-Mock 혹은 Strep-TM4SF5, PTP1B 혹은 그것의 Mock DNA, c-Src SH321 construct를 형질 감염시켰으며 또한 PTP1B의 siRNA를 이용하여 PTP1B를 억제시킨 후 면역 침강법을 수행하였다. 그 결과, PTP1B를 과발현시킨 TM4SF5 과발현 세포에서 내재적인 c-Src와 외재적인 c-Src SH321 사이의 결합이 대조군에 비해 감소되는 것을 확인하였고, SNU761 stable 세포를 이용하여 PTP1B를 과발현시켰을 때도 TM4SF5와 c-Src 사이의 결합이 감소함을 확인할 수 있었으며, PTP1B의 siRNA를 이용하여 PTP1B를 발현 억제시켰을 때는 내재적인 발현이 될 때와는 반대로 TM4SF5와 c-Src사이의 결합이 증가하는 것을 확인하였다(도 7 참조). 이러한 결과를 통해 PTP1B가 TM4SF5와 c-Src사이의 결합을 조절한다는 사실을 알 수 있다.
또한, TM4SF5를 발현하지 않는 SNU449 세포주에 STrEP-Mock 이나 STrEP-TM4SF5 플라스미드와 c-Src SH1 도메인 제작체를 공동주입발현시키고, 세포에 대조군 TAT-Cscram 펩타이드 혹은 TAT-caax-Cter 펩타이드를 24 시간 처리하고 세포추출액을 얻은 후, streptavidin으로 코팅된 beads로 면역침강하여, 원래 세포에 발현되는 c-Src 전체와 SH1 도메인과 TM4SF5의 결합이 TAT-caax-Cter 펩타이드 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였다(도 8 참조).
또한, TAT-Cter 펩타이드와 TAT-caax-Cter 펩타이드를 처리함에 따라 감소되는 TM4SF5에 의한 세포의 침윤과 전이는 TM4SF5의 C-terminal과 c-Src의 SH1 도메인의 결합에 TAT-caax-Cter 펩타이드를 처리함으로써 그 이유를 알 수 있다. SNU449 세포에 Strep-TM4SF5와 c-Src의 SH1 제작체를 동시 주입발현시킨 후 TAT-Cscram 펩타이드와는 달리 TAT-caax-Cter 펩타이드를 10μM, 24시간 처리한 후 면역침강법으로 그 결합을 확인해본 결과 TAT-caax-Cter에 의해 TM4SF5의 C-terminal 서열과 내재적인 c-Src의 결합뿐만 아니라 외재적인 c-Src SH1 도메인과의 결합 또한 감소시키는 것을 확인하였다. 따라서 TAT-Cter 펩타이드와 TAT-caax-Cter펩타이드가 TM4SF5와 c-Src와의 결합을 특이적으로 억제함으로써 TM4SF5에 의한 세포의 침윤과 전이를 감소시킬 수 있음을 알 수 있다(도 9 참조).
또한, 상기 펩타이드의 효과는 동일 조건 내에서 시행한 ECM degradation assay와 migration assay를 통해서도 다시 한 번 확인할 수 있었는데 TM4SF5가 발현되지 않는 대조군 세포에 비해 TM4SF5가 발현되는 세포에 의한 invasion과 migration이 TAT-Cter 펩타이드와 TAT-caax-Cter 펩타이드에 의해 감소되었다.
또한, 누드 마우스를 이용한 종양 형성(xenograft)실험을 통하여 TAT-caax-Cter 펩타이드의 동물에서의 실용성을 확인해 본 실험에서, TAT-caax-Cter 펩타이드가 Src의 억제제인 PP2와 비슷한 양상으로 농도 의존적으로 독성 없이 종양 조직의 부피 감소에 효과적임을 확인할 수 있었다(도 10 참조).
따라서, 본 발명의 세포 내로의 이동에 효과적인 CPP의 일종인 Antp나 TAT에 TM4SF5(Transmembrane 4 L6 family member 5)의 C-terminal을 접합시킨, TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제는 TM4SF5를 특이적으로 표적화하여 TM4SF5에 의해 매개된 c-Src의 SH1 도메인과의 결합을 감소시킴으로써 세포의 침윤과 전이를 억제할 수 있고, 동물에서 독성 없이 종양 조직의 부피 및 전이를 유의적으로 감소시키므로, 상기 TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 암 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 TM4SF5(Transmembrane 4 L6 family member 5) 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 TM4SF5 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 c-Src 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 결합억제제는 TM4SF5 단백질의 C-말단 및 c-Src 단백질의 SH1 도메인의 결합을 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 TM4SF5 단백질의 C-말단은 서열번호 3으로 기재되는 아미노선 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 c-Src 단백질의 SH1 도메인은 서열번호 4로 기재되는 아미노선 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 결합억제제는 c-Src 단백질의 SH1 도메인에 결합하는 펩타이드인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 결합억제제는 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 암은 췌장암, 위암, 간암, 대장암, 뇌암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 자궁암 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 결합억제제는 TM4SF5에 의해 유도되는 초점 결합(focal adhesion)을 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 결합억제제는 c-Src 활성화를 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 결합억제제는 FAK, 팍실린(Paxillin) 및 코택틴(cortactin)의 인산화를 저해하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 결합억제제는 FAK, c-Src, STAT3의 인산화, Twist1 및 Bmi-1의 발현을 저해하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 결합억제제는 c-Src의 활성화를 통해 얻어질 수 있는 세포 타원형 형성(spheroid growth), 5000개 이하(이에 한정하지는 않지만)의 세포를 누드마우스 피하에 주사 하는 경우 생기는 종양형성 기능, 혈관 내 종양세포의 존재에 대한 현상(순환줄기세포)의 특성을 저해하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
따라서, 본 발명의 세포 내로의 이동에 효과적인 TAT에 TM4SF5(Transmembrane 4 L6 family member 5)의 C-terminal 서열을 접합시킨, TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제는 TM4SF5를 특이적으로 표적화하여 TM4SF5에 의해 매개된 c-Src의 SH1 도메인과의 결합을 감소시킴으로써 세포의 침윤과 전이를 억제할 수 있고, 동물에서 독성 없이 종양 조직의 부피 및 전이를 유의적으로 감소시키므로, 상기 TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 암 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합 억제제를 함유하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 TM4SF5 및 c-Src의 결합 억제제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 조성물의 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/㎏일 수 있고, 구체적으로 0.001 ~ 1 g/kg일 수 있으며, 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 암 치료 또는 암 전이 억제를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 유효성분으로 함유하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 TM4SF5 및 c-Src 단백질의 결합은 c-Src의 활성화, spheroid growth, 5000개 이하(이에 한정하지는 않지만)의 세포를 누드마우스 피하에 주사하는 경우 생기는 종양형성 기능, 혈관내 종양세포의 존재에 대한 현상(순환줄기세포)의 특성을 가져 전이암을 형성하는 것을 특징으로 한다.
상기 결합억제제는 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 18로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 TM4SF5를 과발현하고 있는 SNU449T7 클론 5 x 106개를 꼬리 미정맥 주사(tail vein injection)를 이용하여 누드 마우스에 주입시킨 후 2주 동안 암세포가 폐로 시키고 TAT-Cscram 펩타이드 또는 TAT-Caax-Cter 펩타이드를 2주일 동안 격일로 복강내주사(intraperitoneal injection, I.C.)를 통해 투여하였다. 그 결과, 많은 수의 작은 암덩이(nodule)을 가진 TAT-Cscram 펩타이드 처리 마우스와는 달리 TAT-Caax-Cter 펩타이드를 처리한 마우스들의 폐에서는 암덩어리의 숫자가 확연히 감소되어 있는 것을 확인하였다(도 11 참조). 이를 통해 TAT-Caax-Cter 펩타이드가 TM4SF5에 의해 유도된 암세포의 전이를 억제할 수 있는 효능을 가진 것을 확인할 수 있었다.
또한, 간암세포에서 TM4SF5가 발현됨에 따라 순환종양세포(Circulating tumor cell)의 형성에 영향을 미친다는 것은, TM4SF5를 발현하는 세포들이 spheroid 타입의 세포를 형성함으로써 혈액 내에서 순환할 수 있다는 것을 의미한다. TM4SF5를 발현하지 않는 SNU449 세포와 SNU761 세포와는 달리, 내재적으로 TM4SF5를 발현하는 Huh7과 HepG2 세포는 spheroid 타입의 세포가 형성되는 것을 확인하였고, TM4SF5를 발현하는 SNU449의 단일 클론 세포들(T3, T7, T10, 및 T16)도 spheroid 타입의 세포를 잘 형성하는 반면, TM4SF5의 N-glycosylation 돌연변이 세포들(N138A, N115Q, 또는 N138A/N155Q)은 그렇지 않은 것 또한 확인하였으며, 70 μm 이상의 크기를 가지는 spheroid 세포를 세어보았을 때, spheroid 세포의 수는 WT TM4SF5의 발현과 관련이 있다는 것을 확인하였다(도 12 참조).
또한, TM4SF5이 aldehyde dehydrogenase(ALDH)의 활성화에 연관이 있는지를 확인해보고자 SNU449 계열의 세포들을 이용하여 유세포분석기(flow cytometry, FACS)로 분석하였으며 그 결과, wild-type TM4SF5(Tp, T3, T7, T10, T16)를 과발현 시킨 세포주는 TM4SF5를 발현하지 않는 세포(P, Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(N138A, N155Q, NA/NQ)에 비해 훨씬 높은 aldehyde dehydrogenase activity를 가지고 있음을 확인하였다(도 12 참조). 적은 수의 세포로 종양이 형성되고, 순차적인 xenograft가 가능하며, ALDH가 더 높게 활성화되는 이러한 결과를 통해 TM4SF5의 발현이 자기 재생능력을 가지는 간암 줄기세포의 특징을 가지게 하는데 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. 이러한 결과를 통해 TM4SF5가 간암 세포에서 spheroid 형성에 관여한다는 것을 알 수 있었다.
또한, TM4SF5의 발현에 따른 다른 간암 줄기세포의 마커인 CD24 및 CD44의 발현 양상을 확인하였으며 그 결과, TM4SF5를 발현하지 않는 세포(P, Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(N138A, N155Q, NA/NQ)를 과발현시킨 세포는 wild-type TM4SF5(Tp, T3, T7, T10, T16)를 과발현시킨 세포주에 비해 CD24의 mRNA 및 단백질이 높은 것을 확인하였고, CD44는 차이가 없는 것을 확인하였다(도 13 참조).
또한, 간암세포에서의 TM4SF5 발현이 순환종양세포와 spheroid 타입의 세포를 형성한다는 것은 암세포의 전이, 침윤 및 EMT에도 관련이 있지만, 자기 재생 능력을 가지는 암세포(tumor initiating cells)의 특성을 가지게 하는 데에도 관련이 있기 때문에 TM4SF5에 의한 자가복제능력 유도 기작이 가능한지를 확인하였다. 그 결과, TM4SF5를 발현하지 않는 세포(Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(NA/NQ) 또는 wild-type TM4SF5(T7)를 과발현시킨 세포를 이용하여 각각 500, 2000, 5000 cells/site를 준비하여 TM4SF5에 의한 종양 형성 능력을 측정한 결과 TM4SF5를 발현하는 세포만이 누드마우스에서 종양을 형성하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 누드마우스에서 형성된 종양조직에서의 TM4SF5 downstream signal 단백질들의 인산화 정도를 확인하였으며 그 결과, 종양조직에서 분리한 세포(ExpT7 #2, #3)는 2차원적 배양 환경에서 배양하던 TM4SF5를 발현하지 않는 세포(Cp)와 TM4SF5를 과발현시킨 세포(T7)에 비해 TM4SF5 downstream signal 단백질인 p27Kip1, FAK, c-Src, STAT3, 및 Twist1 등을 포함하는 TM4SF5 하위인자 신호전달인자들의 발현 및 활성이 증가하였음을 확인하였다(도 14 참조).
또한, TM4SF5에 의한 연속적인 종양 형성 능력 확인하기 위해 상기 1차 누드마우스 및 2차 누드마우스 종양조직으로부터 세포를 분리하여 단백질의 발현양의 변화를 측정하였으며 그 결과, 처음 누드마우스에서 형성된 종양조직에서 분리한 세포(ExpT7 #2)를 이용하여 각각 200, 500, 2000, 5000 cells/site를 준비하여 TM4SF5에 의한 serial 종양형성능력을 측정한 결과 훨씬 낮은 세포수에서도 누드마우스에서 빠르게 종양을 형성하였으며, 1차 누드마우스 종양조직에서 분리한 세포(ExpT7-2)와 2차 누드마우스 종양조직에서 분리한 세포(2ndExpT7-2)는 2차원적 배양 환경에서 배양하던 TM4SF5를 발현하지 않는 세포(Cp)와 TM4SF5를 과발현시킨 세포(T7)에 비해 TM4SF5 downstream signal 단백질인 FAK, c-Src, p27Kip1, STAT3의 인산화 훨씬 높아졌음을 확인하였다. 또한, 누드마우스에서 형성된 종양조직에서 분리하여 얻은 세포주(ExpT7-2, T7-3)와 TM4SF5를 과발현시킨 세포(T7)를 이용해 TM4SF5 및 CD44 단백질의 발현을 확인하기 위해 FACS analysis을 수행하였다. 그 결과, 종양조직에서 분리한 세포(ExpT7 #2, #3)는 2차원적 배양 환경에서 배양하던 TM4SF5를 과발현시킨 세포(T7)에 비해 CD44, TM4SF5이 각각 혹은 둘 다 더 많이 발현이 훨씬 높아졌음을 확인하였다(도 14 참조).
또한, TM4SF5의 발현에 따른 c-Src의 결합 및 활성화가 이루어지는 것으로 확인된 세포주들에서 TM4SF5가 발현하는 조건과 발현하지 않는 조건들을 대비하였을 때, TM4SF5가 발현하는 경우에 더욱 더 FAK, c-Src, STAT3의 활성이 증가하고, twist1 및 Bmi1의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다 (도 15a 참조).
또한, Src kinase activity를 저해시키는 PP2와 control인 DMSO, PP3 처리하는 조건에서 Endogeneous TM4SF5를 발현하지 않는 세포(Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(NANQ) 또는 TM4SF5(Tp,T7)을 과발현시킨 세포를 이용하여 spheroid formation assay를 수행하였다. 그 결과, SNU449Cp 세포와 TM4SF5N138A/N155Q 세포는 PP2의 처리에 따른 차이가 없었지만, SNU449Tp 세포와 SNU449T7 세포에서는 PP3와 비교하여 PP2를 처리하였을 때 spheroid 형성이 억제되는 것을 확인하였다(도 15 참조).
또한, 상피 세포의 특징을 잃고 중간엽 세포의 특징을 얻게 되는 상피-중간엽 전이(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)는 암세포의 전이를 이끌며, 이는 순환종양세포(Circulating tumor cells, CTCs)의 형성과 관련이 있다. 따라서 앞선 연구에 이어 암세포의 전이, 침윤 및 EMT를 촉진한다고 연구된 TM4SF5 및 CD44의 발현이 간암세포에서 순환종양세포의 성격을 가지게 되는지를 연구하였다. TM4SF5가 발현됨으로써 간암세포에서 생기는 순환종양세포(Circulating tumor cell)의 특징을 확인하기 위해 하기와 GFP가 연결되어 있으면서 TM4SF5를 형질 억제시킬 수 있는 shRNA(tGFP-shTM4SF5)와 그것에 대비되는 scramble shRNA(tGFP-shScram)를 SNU449T7 세포에 형질 감염시킨 후 PBS vehicle과 함께 누드 마우스의 간에 직접 주입시켰다. TM4SF5를 과발현시킨 세포(T7)에 pGFP-V-RS shScramble와 pGFP-V-RS-shTM4SF5 DNA를 transfection 하여 TM4SF5를 과발현시킨 세포(pGFP-V-RS shScramble)와 이들 세포에서 TM4SF5 발현을 저해시킨 세포(pGFP-V-RS-shTM4SF5)를 제작하였다. 그 결과, 즉 누드마우스의 혈액에 TM4SF5를 과발현시킨 세포가 순환하고 있음을 확인하였으며, TM4SF5를 과발현시킨 세포(pGFP-V-RS shScramble)를 주입한 마우스의 혈액에서만 GFP-positive 세포가 측정되는 것을 확인하였다(도 16a 및 16 b).
또한, SNU449T7 세포주에 control shRNA 를 발현시킨 세포주(SNU449T7-shScram) 혹은 CD44를 발현 억제할 수 있는 shRNA(shCD44)를 안정적(stably)으로 발현시킴 세포주(SNU449T7-shCD44)를 간에 5 x 105 씩 직접 한 번 주사하고, 6주 후에 혈액 샘플을 마우스로부터 모아 DAPI 염색을 시켜 확인해본 결과, PBS와 SNU449T7-shScram 세포를 주입시킨 마우스의 혈액에서는 세포를 발견할 수 있었고, 연구 중간에 사망하게 되는 개체가 생겨났지만, SNU449T7-shCD44 세포를 주입시킨 마우스로부터 얻은 혈액에서는 TM4SF5-positive 세포를 발견할 수 없었고 모두 생존하였다(도 16c 참조). 이를 통해 TM4SF5의 발현이 CTC의 형성에 영향을 미친다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 세포 내로의 이동에 효과적인 TAT에 TM4SF5(Transmembrane 4 L6 family member 5)의 C-terminal 서열을 접합시킨, TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제는 TM4SF5를 특이적으로 표적화하여 TM4SF5에 의해 매개된 c-Src의 SH1 도메인과의 결합을 감소시킴으로써 세포의 침윤과 전이를 억제할 수 있고, 동물에서 독성 없이 종양 조직의 부피 및 전이를 유의적으로 감소시키므로, 상기 TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 암 전이 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 피검체로부터 TM4SF5 단백질과 c-Src 단백질의 결합 수준을 측정하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 결합 수준이 정상 대조군의 결합수준에 비해 증가하는 개체를 선별하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 선별된 개체가 암에 걸릴 위험을 가질 개체로 판단하는 단계를 포함하는 암 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 간 결합수준의 측정방법을 제공한다.
상기 측정방법에 있어서, 단계 1)의 피검체는 암이 의심되는 개체인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며, 상기 피검체로부터 얻은 혈청, 혈장 및 혈액에서 단백질의 결합 수준을 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 측정방법에 있어서, 단계 1)의 TM4SF5 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 측정방법에 있어서, 단계 1)의 c-Src 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)의 결합수준 측정은 면역형광법, 질량분석법, 단백질 칩, 웨스턴 블랏, ITC (Isothermal Titration Calorimetry) 및 ELISA를 사용할 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 3)의 암은 췌장암, 위암, 간암, 대장암, 뇌암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 자궁암 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 결합수준의 측정은 면역형광법, 질량분석법, 단백질 칩, 웨스턴 블랏, ITC (Isothermal Titration Calorimetry) 및 ELISA로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은
1) 피검체로부터 수득한 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에서 TM4SF5 단백질과 c-Src의 결합을 감소시키거나, TM4SF5-매개하는 c-Src 활성화, FAK, 코택틴의 인산화, 세포의 spheroid growth, 누드마우스에서의 종양형성, 혈액 내 순환하는 암세포의 존재를 저해시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제 후보물질 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 피검체는 세포나 조직의 산물로 암세포의 생성과 이동 침윤을 억제하는 지를 보고자하는 목적으로 펩타이드 혹은 단백질 프래그먼트 (fragment), 소형화합물을 처리한 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> TM4SF5 의 COOH -말단 아미노산 펩타이드의 제작
<1-1> TAT - Cter 및 TAT - caax - Cter 펩타이드 제작
TM4SF5에 의해 조절되는 암전이를 표적화 하는 억제제로써 TM4SF5의 C-말단에 TAT를 접합시킨 펩타이드를 하기와 같은 방법으로 제작하였다.
구체적으로, 본 발명에 사용된 펩타이드는 AnyGen(전라남도 장성군 남면 삼태리 산109번지, www.anygen.com)에서 순도 96 ~ 98%의 펩타이드로 합성하였다. 펩타이드는 각각의 아미노산을 이용하였고, RAININ/PTI SYMPHONY Peptide Synthesizer(Blue Lion Biotech. Snoqualmie, WA, 미국)를 사용하여 합성하였다. 그런 다음, 합성된 TAT-Cscram(서열번호 8)는 AXIMA CFR Kratos 질량분석기(SHIMADZU, 일본)를 사용하여 분석하였고, 분석 질량은 2703.4 달톤(예상치 2703.1 달톤)이었고, HPLC 분석 (Shimadzu HPLC 10AVP system, SHIMADZU C18 analytical column (A buffer: 0.1% Trifluoroacetic acid /H2O, B buffer: 0.1% Trifluoroacetic acid/Acetonitrile)을 buffer B를 30분에 걸쳐 5%-65% gradient 조건에서 이용하여 분석하였을 경우, 96.4%의 순도를 확인하였다. TAT-Cter 펩타이드(서열번호 5)는 동일한 방법으로 합성 분석하였으며, 질량은 2702.5 달톤 (예상치 2703.1 달톤)이며 순도는 96.5%이었고, TAT-caax-Cter 펩타이드(서열번호 6)는 3149.4 달톤 (예상치 3149.8 달톤)이고 순도는 98.8%이었다.
그 결과, 도 1A 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 세포 내로 투과성을 가진 TAT의 서열(서열번호 7)에 TM4SF5의 C-말단(terminal) 서열을 결합시킨 TAT-Cter 펩타이드(서열번호 5), C-말단(terminal)서열(서열번호 3)을 무작위로 배열한 TAT-Cscram 펩타이드(서열번호 8), TAT와 C-말단(terminal)의 서열 사이에 멤브레인 바운드 모티프(membrane bound motif)인 caax(CVIM) 서열을 결합시킨 TAT-caax-Cter(서열번호 6)의 펩타이드를 제작하였다(도 1A 및 표 1).
서열번호 서열
서열번호 3 GDCRKKQDTPH
서열번호 5 RKKRRQRRRPTGDCRKKQDTPH
서열번호 6 RKKRRQRRRPTCVIMGDCRKKQDTPH
서열번호 7 RKKRRQRRRPT
서열번호 8 RKKRRQRRRPTTCKPDKGQRHD
<1-2> 세포배양
인간 간암 세포 SNU449, SNU761 parental 및 대조군 세포 SNU761-Mock를 한국세포주 은행, 서울에서 입수하였다. 또한, 대한민국 출원번호 제 10-2008-0078354에 기재된 방법에 따라 TM4SF5 단백질이 과발현한 세포 SNU449-TM4SF5(SNU449Tp) 및 대조군 벡터를 삽입하여 TM4SF5 단백질이 발현하지 않는 SNU449Cp 세포를 제작하였다. TM4SF5를 발현하지 않는 SNU761 간암세포주에 FLAG-mock 벡터 및 FLAG-TM4SF5 WT를 lipofectamine 2000 (Invrotrogen, 미국)을 이용하여 주입발현시키고 G418(A.G. Sicentifics) 500 μg/ml이 포함된 배양액에서 배양함으로써 안정화된 세포주를 제작하였다. SNU761-mock 세포는 TM4SF5가 발현되지 않고 SNU761-TM4SF5 WT 세포는 TM4SF5가 과발현되는 세포주로 확립되었다. 또한, 돌연변이(SNU761-TM4SF5ΔICL19) 세포는 서열번호 71 내지 89번째 아미노산 서열(서열번호 9)이 제거된 돌연변이체 FLAG-TM4SF5ΔICL19를 주입발현시켜 안정화시킴으로써 제조되었다(표 2).
그런 다음, 상기 세포에 10% FBS, 250 μg/ml G418(A.G. Scientific Inc), 항생제(Invitrogen Carlsbad, CA, USA)를 포함한 RPMI-1640(WelGene, Daegu, Korea)을 처리하여 37℃ CO2 세포 배양기에서 배양하였다. 또한, 내재적으로 TM4SF5 단백질이 없는 SNU398, SNU449, SNU761 세포(한국세포주은행, 서울)에 10% FBS, 항생제(Invitrogen)가 포함된 RPMI-1640(WelGene)을 사용하여 배양하였고, 내재적으로 원래 TM4SF5 단백질이 발현되는 Huh7와 HepG2 세포(American Type Culture Collection, 미국)에는 10% FBS, 항생제(Invitrogen)가 포함된 DMEM(WelGene)을 사용하여 배양하였다.
서열번호 서열
서열번호 9 71-GGKGCCGAGCCGNRCRMLR-89
< 실시예 2> TAT 펩타이드를 이용한 세포의 침윤과 전이 억제
<2-1> TAT가 접합된 펩타이드의 제작 및 세포내 이동성 확인
TAT가 접합된 TAT-Cter 및 TAT-caax-Cter 펩타이드의 세포내 이동성을 확인하기 위하여 면역 염색법(Immunofluorescence assay)을 수행하였다.
구체적으로, SNU449Tp 세포를 37℃ CO2 세포 배양기에서 이틀 동안 배양한 후, 상기 세포에 트립신/EDTA를 처리하여 세포를 분리시켰으며, 혈구계산기(hematocytometer)를 이용하여 세포의 수를 측정하였고, 상기 세포를 커버글라스(cover glass)가 들어 있는 6-웰 플레이트에서 2 x 105 세포/웰 농도로 분주하여 상기 <실시예 1>에서 제작한 TAT가 접합된 TAT-Cter 및 TAT-caax-Cter 펩타이드를 10 μM 처리하고 37℃ CO2 세포배양기 안에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 4% 포름알데히드(formaldehyde)로 10분 동안 고정하여, 30 mM 글라이신을 10분 동안 처리하였다. 그 다음, 0.5% 트리톤(triton) X-100을 이용하여 5분 동안 투과화(permeabilization)를 시키면서 동시에, 투과화 과정을 거치지 않는 샘플도 준비하였다. 그런 다음, 2% BSA 용액으로 1시간 동안 전처리한 후 TAT 1차 항체(cell applications,INC., 미국)를 16 내지 18시간 동안 4℃에서 처리하였다. FITC로 표지 된 2차 항체(Bio Legend, 미국)를 상온에서 1시간 동안 염색을 시켰으며, 염색을 마친 뒤 세포들이 붙어있는 커버글라스를 슬라이드 글라스(slide glass)에 올려 마운팅(mounting)을 한 후, 염색된 세포를 공초점 현미경(Nikon, C2 laser scanning confocal microscope)과 형광현미경(올림푸스, BK51)을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 1B에 나타낸 바와 같이, 항체가 세포질 내에 TAT 펩타이드에 결합이 가능하도록 투과화 과정을 거친 샘플과 투과화 과정을 거치지 않은 샘플을 비교하였을 때, 투과화 과정을 거친 샘플에서만 FITC 형광으로 표지된 TAT를 세포 내에서 확인하였다. 따라서, TM4SF5의 C-터미널 부분에 TAT를 접합시킨 펩타이드는 함께 접합된 caax서열에 의해 세포막 주변에서 특이적으로 위치하고 있음을 확인하였다(도 1B).
<2-2> TM4SF5 에 의해 매개되는 다양한 신호전달분자들의 발현과 인산화 억제 확인
TM4SF5에 의해 매개되는 다양한 신호전달분자들의 발현과 인산화 억제를 확인하기 위하여, 펩타이드를 처리한 후 획득한 단백질을 사용하여 웨스턴 블랏(Western blotting)을 수행하였다.
구체적으로, 인간 간암 세포주인 SNU449 세포(American Type Culture Collection, 미국)를 37℃ CO2 세포배양기 안에서 24시간 동안 배양한 후, 10% FBS가 포함된 배양액에 상기 실시예 <1-1>에서 제작한 TAT 펩타이드를 10 μM의 농도로 24시간 동안 처리한 후, TM4SF5에 의한 세포 침윤과 전이에 관여하는 단백질의 인산화와 발현을 하기와 같은 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다. 20 mM HEPES, pH 7.4, 2 mM MgCl, 2 mM MgCl, 2 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 1% Brij58가 포함된 100 ㎕ 용해완충액(lysis buffer)에 1% SDS, Na3VO4, 단백질 가수분해효소 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktails, GenDepot, 미국)을 첨가하고 4℃에서 15분 이상 처리하였다. 그런 다음, 상기 세포를 4℃에서 13000 rpm으로 30 분 동안 원심분리하였으며, 새 원심분리 튜브에 상층액을 옮기고 BCA 시약(BCA reagent, Thermo Scientifics, 미국)을 이용하여 단백질을 정량하였다. 상기 정량한 단백질에 4 x 샘플 완충액(sample buffer)[100% 글리세롤 4 ㎖, Tris-HCl, pH 6.8, 2.4 ㎖, SDS 0.8 g, 브로모페놀 블루(bromophenol blue) 4 ㎎, β-머르캅토메탄올(β-mercaptoethanol) 0.4 ㎖, H2O 3.1 ㎖(총 10 ㎖기준)]을 첨가하고 5분 동안 100℃에서 끓여주었다. 상기 단백질을 10% SDS-PAGE로 전기영동을 수행한 뒤, 니트로셀룰로오스 막(Nitrocellulose Membranes Protran™(Whatman,독일))에 이동시킨 후, 5% 탈지 우유(skim milk)로 1시간 동안 전처리하였으며 그런 다음, pY397FAK(Abcam, 영국), pY577FAK(Santa Cruz, 미국), pY861FAK(Santa Cruz, 미국), pY925FAK(Santa Cruz, 미국), FAK(Santa Cruz, 미국), pY419c-Src(Cell Signaling, 미국), c-Src(Santa Cruz, 미국), pY118팍실린(pY118paxillin, Santa Cruz, 미국), 팍실린(BD Transduction Laboratories, 미국), pS10p27(Abgent, 미국), α-sma(sigma, 미국), PTP1B(Santa cruz, 미국) 및 α-튜블린(Sigma, 미국)의 1차 항체를 사용하여 4℃에서 15 시간 동안 반응시킨 후, 다음날 2차 항체를 상온에서 한 시간 반응시키고, ECL(Pierce, 미국)을 이용하여 엑스레이 필름에 현상하였다.
그 결과, 도 2a 및 도 4c에 나타낸 바와 같이, TAT-Cter 및 TAT-caax-Cter 펩타이드에 의해 TM4SF5에서 특이적으로 유도되던 FAK, Src, Paxillin의 활성화를 위한 인산화가 감소하는 것을 확인하였고(도 2a), 코택틴(cortactin)의 인산화가 감소하는 것을 확인하였다(도 4c).
<2-3> 초점 결합(focal adhesion) 면역염색법을 통한 TAT 펩타이드의 표적화 및 효과 확인
TAT 펩타이드의 세포 내 표적화 및 효과를 확인하기 위하여, TAT-Cscram 펩타이드, TAT-Cter 혹은 TAT-caax-Cter 펩타이드를 처리한 후 세포들을 4% 포름알데히드용액을 상온에서 10 분간 처리하고 1% triton x-100 용액으로 상온에서 10 분간 투과화시킨 후, 면역 염색법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 방법으로 TM4SF5가 발현하지 않는 SNU449Cp 세포와, TM4SF5를 과발현되도록 벡터를 주입하여 안정화시킨 SNU449Tp 세포에 상기 <실시예 1>에서 제조한 TAT 펩타이드를 처리하여 면역 염색법을 수행하였다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, TAT-Cter 펩타이드 및 TAT-caax-Cter 펩타이드가 TM4SF5 특이적으로 TM4SF5에 의해 유도되던 초점 결합(focal adhesion)을 대조군 TAT-Cscram 펩타이드에 비하여 감소시키는 것을 확인하였다(도 2b).
<2-4> TAT-Cter 펩타이드 및 TAT-caax-Cter 펩타이드 처리에 의한 FAK, Paxillin 및 Src의 인산화 감소 확인
TAT-Cter 펩타이드 및 TAT-caax-Cter 펩타이드에 의한 FAK, Paxillin 및 Src의 인산화 감소를 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-2>에 기재되어 있는 방법으로 TM4SF5가 과발현되지 않은 SNU761-mock 세포주 및 과발현되어 있는 SNU761-TM4SF5 WT 세포주에 TAT 펩타이드를 상기 실시예 <2-2>와 동일조건으로 처리하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, TM4SF5가 과발현되는 세포주에서 TAT-Cter 펩타이드 및 TAT-caax-Cter 펩타이드에 의해 FAK, Paxillin 및 Src의 인산화가 감소하는 것을 확인하였다(도 2c).
<2-5> TM4SF5를 일시적으로 형질감염시킨 SNU449 세포에 TAT 펩타이드 효과 확인
TM4SF5를 일시적으로 형질감염시키기 위하여 FLAG-TM4SF5 플라스미드를 TM4SF5가 발현되지 않는 SNU449 세포에 lipofectamine 2000(Invrotrogen, 미국)을 이용하여 트란스펙션하고 24시간 지난 후, TAT 펩타이드 10 μM을 24 시간 처리한 후, 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 2d에 나타낸 바와 같이, TM4SF5를 일시적으로 형질감염시킨 SNU449 세포에 TAT 펩타이드를 처리하였을 때도 TM4SF5 특이적으로 유도되던 FAK, Paxillin, 및 c-Src의 인산화가 감소하는 것을 확인하였다(도 2d).
<2-6> TM4SF5를 본래 발현하는 인간 암 세포주 Huh7 및 HepG2에 TAT 펩타이드를 처리하여 신호전달 인자 인산화 감소 효과 확인
TM4SF5를 본래 발현하는 인간 암세포주 Huh7 및 HepG2에 TAT 펩타이드를 각각 처리하여 인산화 감소를 확인하기 위하여, 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.
구체적으로, 내재적으로 TM4SF5를 발현하고 있는 인간 간암 세포주인 Huh7 및 HepG2세포(American Type Culture Collection, 미국)에 10 μM TAT 펩타이드를 24시간 동안 처리하여 획득한 추출액을 상기 실시예 <2-2>와 같은 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 2e에 나타낸 바와 같이, 인간 간암 세포주인 Huh7 및 HepG2세포에 TAT-Cter 펩타이드 및 TAT-caax-Cter 펩타이드를 처리하였을 때, FAK, Paxillin, 및 Src의 인산화가 감소됨을 확인하였다(도 2e). 하지만, 도 2f에 나타낸 바와 같이, 이와 반대로 TM4SF5를 내재적으로 발현하지 않는 세포 SNU398에 TAT-Cter 혹은 TAT-caax-Cter 펩타이드를 처리하였을 때, 펩타이드 효과는 나타나지 않았다(도 2f).
따라서, TAT-Cter 혹은 TAT-caax-Cter 펩타이드는 TM4SF5를 특이적으로 표적화하여 FAK, Paxillin 및 Src와 같은 TM4SF5에 의해 유도된 세포 신호전달 분자들의 인산화를 감소시킴을 확인하였다.
<2-7> 이외의 cell - Penetrating peptide ( CPP )의 인산화 감소 효과 확인
상기 본 발명의 펩타이드 외의 cell-Penetrating peptide(CPP)의 효과를 확인하기 위해 TAT peptide 대신에 도 2h에 나타낸 바와 같이 antennapedia peptide(Antp)에 CaaX 서열과 더불어 TM4SF5 C-terminal 아미노산 서열(GDCRKKQDTPH)을 부착하여 실험하였다(도 2h).
구체적으로, 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 방법으로 TM4SF5가 발현하지 않는 SNU449Cp 세포와, TM4SF5를 과발현되도록 벡터를 주입하여 안정화시킨 SNU449Tp 세포에 Antp-Caax-Cter 및 Antp-Caax-Cscram 10 μM 를 24시간 동안 처리하여 획득한 추출액을 상기 실시예 <2-2>에서와 같이 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 2h에 나타낸 바와 같이 TM4SF5를 발현하지 않는 SNU449Cp(Cp) 세포주와 TM4SF5를 과다발현하는 SNU449Tp(Tp) 세포주에 아무것도 처리하지 않거나 (none), Antp-Caax-Cscram 혹은 Antp-Caax-Cter를 24 시간 처리하였을 경우, Cp 세포의 경우에는 FAK (Tyr397), c-Src (Tyr419), 및 paxillin (Tyr118)의 인산화 정도가 살짝 증가하였으나, Tp 세포에서 Antp-Caax-Cter 펩타이드를 처리하였을 때 인산화 정도가 감소하는 것을 확인하였다(도 2h).
따라서, CPP 종류와 무관하게 TM4SF5의 C-terminal 부위의 아미노산 서열을 CPP의 도움을 받아 세포 내로 제공하였을 경우, 세포 내 신호전달 활성, 특히 TM4SF5-의존적인 c-Src의 활성을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.
<실시예 3> TM4SF5와 c-Src의 결합 부분 확인
<3-1> TM4SF5 와 c- Src 의 내재적 결합 확인
인간 간암 세포주인 SNU449 세포(American Type Culture Collection, 미국)에서 TM4SF5와 c-Src의 내재적 결합 확인을 하기 위하여 상기 세포를 37℃ 세포 배양기 안에서 24 시간 동안 배양한 후, 트립신/EDTA를 처리하여 세포를 분리하였다. 상기 분리된 세포를 원심분리기를 사용하여 가라앉힌 후, 전기천공법(Electroporation)을 이용하여 Strep-Mock 혹은 Strep-TM4SF5 DNA와 도 3a에 나타낸 바와 같이 c-Src의 WT의 full length, SH321, SH1 도메인에 해당하는 cDNA를 4 μg 형질 감염시키고 이틀 동안 37℃ 세포 배양기 안에서 배양하고, 세포추출액을 확보하여 면역 침강법을 이용하여 TM4SF5와 내재적인 c-Src의 결합을 확인하였다.
구체적으로, 이틀 동안 배양한 상기 세포를 PBS로 2번 세척하고, 20 mM HEPES, pH 7.4, 2mM MgCl,2mM CaCl2 , 150 mM NaCl, 1% Brij58을 포함한 500 ㎕ 용해완충액(lysis buffer)에 Na3VO4, 단백질 가수분해효소 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktails, GenDepot, 미국)을 첨가하고 4℃에서 15분간 처리하였다. 상기 세포를 수득한 후, 4℃에서 13000 x g로 30분 동안 원심분리하고, 상기 실시예 <2-2>와 같은 방법으로 단백질을 정량하였다. 또한, 상기 실시예 <2-2>와 같은 방법으로 샘플을 준비하였다. 그런 다음, 면역 침강을 수행하기 위하여 상기 정량한 단백질 양에 비례하여 스트렙타비딘 비드(streptavidin bead)를 첨가한 후 4℃에서 16 내지 18시간 동안 회전시켜준 뒤, 4℃에서 7000 x g로 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 그런 다음, 깨끗한 완충용액(lysis buffer)을 첨가하고 가볍게 혼합한 후 다시 4℃에서 7000 x g로 2분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한 다음, 완충용액(lysis buffer)을 사용하여 한번 더 반복하고 차가운 PBS를 사용하여 두 번 더 반복한 뒤, 2 x 샘플 완충액(samplbe buffer)을 첨가하고 5분 동안 100℃에서 끓여주었다. 상기 침강된 샘플을 10% SDS-PAGE로 전기영동을 수행한 뒤, 니트로셀룰로오스 막(Nitrocellulose Membranes Protran™)(Whatman)에 이동시키고, 5% 탈지 우유(skim milk)로 1시간 동안 전처리한 후, PBS(130 mM NaCl, 13 mM Na2HPO4, 3.5 mM NaH2PO4, NaH2PO4, pH 7.4,)로 2번 세척하였으며, c-Src(Santa Cruz Biotech, 미국) 및 strepavidin-HRP 1차 항체(IBA, 미국)를 이용하여 4℃에서 15 시간 동안 반응시켰다. 그 다음날 2차 항체를 상온에서 1시간 반응시켰으며, ECL(Pierce, 미국)을 이용하여 엑스레이 필름에 현상하였다.
그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, TM4SF5와 내재적인 c-Src이 결합함을 확인하였다(도 3b).
<3-2> c-Src의 SH1 도메인과 TM4SF5와의 결합 확인
인간 간암 세포주인 SNU449 세포(American Type Culture Collection, 미국)에서 c-Src의 SH1 도메인과 TM4SF5와의 결합 확인을 하기 위하여 플라스미드 형질감염, 면역침강 및 웨스턴 블랏을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 c-Src의 SH4, SH3, SH2, SH1을 포함하는 WT(서열번호 2), SH3(서열번호 10), SH2(서열번호 11), SH1(서열번호 4)을 포함하는 SH321, SH1을 포함하는 SH1 도메인(도 3a)의 DNA 및 STrEP-mock 혹은 STrEP-TM4SF5 DNA를 SNU449 세포에 공통 형질감염시킨 후 면역침강의 시료를 수득하고, 상기 수득 된 시료에 c-Src(santa cruz, 미국)의 항체를 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 외재적으로 첨가한 c-Src의 제작체(construct) 중 SH1 도메인을 포함한 제작체(construct)에서만 TM4SF5와 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다(도 3c).
<3-3> c-Src의 SH1 도메인중 397번 잔기 이후 TM4SF5와의 부분 결합 확인
인간 간암 세포주인 SNU449 세포(American Type Culture Collection, 미국)에서 c-Src의 SH1 도메인 내 결합부분을 확인하기 위하여 플라스미드 형질감염, 면역침강 및 웨스턴 블랏을 수행하였다.
구체적으로, c-Src의 WT, SH321(서열번호 12), SH432(서열번호 13), 혹은 SH3, SH2, SH1를 포함하는 1-397 제작체(construct)를 STrEP-mock 혹은 STrEP-TM4SF5 DNA와 공통형질감염시킨 후 상기 실시예 <3-1>의 방법으로 면역침강하여 c-Src(santa cruz,미국)의 항체로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 3d 에 나타낸 바와 같이, SH321 도메인 혹은 SH1 도메인을 형질감염시킨 시료는 WT의 제작체(construct) 시료에서처럼 TM4SF5와의 결합이 나타남을 확인하였다(도 3d).
또한, 도 3e에 나타낸 바와 같이, SH1 도메인을 포함하고 있지 않은 SH432 도메인을 형질감염시킨 시료와는 달리 WT의 제작체(construct) 시료에서만 TM4SF5와의 결합이 나타났으며, SH1 도메인 중 397번 잔기까지만을 가지고 있는 제작체(construct)의 시료에서도 결합이 나타나지 않음을 확인하였다(도 3e).
< 실시예 4> TM4SF5 의 C-말단과 c- Src 의 SH1 도메인 사이의 결합 확인
TM4SF5의 C-말단과 c-Src의 SH1 도메인 사이의 결합 확인을 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에서와 같이 Strep-Mock과 Strep-TM4SF5 DNA 4 μg를 형질 감염시킨 SNU449 세포와 Flag-Mock과 Flag-TM4SF5이 안정적으로 발현되는 SNU761 세포들을 이틀 동안 배양한 후 상기 실시예 <3-1>과 같이 면역 침강 실험을 하였다. 또한, TM4SF5의 부분 중 C 말단이 c-Src와 특이적으로 결합한다는 선행 연구에 이어 c-Src의 SH1 도메인과의 결합에도 TM4SF5의 C 말단이 필수적인 부분임을 확인하기 위해 C 말단이 결실되어 있는 SNU761 Flag-TM4SF5 △C 세포를 이용하여 면역 침강 실험을 수행하였다. 더 나아가 TM4SF5의 intercellular loop 부분의 19개 아미노산이 결실되어 있는 SNU761 Flag-TM4SF5 △ICL19 세포를 이용하여 면역 침강 실험을 하였다. 또한, TM4SF5 C 말단의 189번 시스테인(cysteine) 잔기를 알라닌(alanine)으로 치환하여 만든 Strep-TM4SF5 C189A DNA를 Strep-Mock, Strep-TM4SF5 DNA 및 c-Src SH1 도메인과 함께 SNU449 세포에 형질 감염시킨 후 면역 침강 실험을 하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 TM4SF5와 세포 내재적인 FAK과 c-Src 사이의 결합을 확인하였다(도 4a). 또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이 TM4SF5 WT에서와는 달리 TM4SF5 △C에서는 TM4SF5와 c-Src 사이의 결합이 나타나지 않았다(도 4b). 또한, 도 4c에 나타낸 바와 같이 C 말단이 유지되어 있는 이 세포(SNU761 Flag-TM4SF5 △ICL19)에서는 TM4SF5와 c-Src사이의 결합 또한 유지되는 것을 확인하였다(도 4c). 또한, 도 4d에 나타낸 바와 같이 TM4SF5 C189A DNA를 형질 감염시킨 세포에서 c-Src의 SH1 도메인과의 결합이 감소하는 것을 확인하였다(도 4d).
이를 통해 TM4SF5의 C 말단부분이 c-Src의 SH1 도메인과의 특이적인 결합에 중요하게 작용하는 것을 알 수 있었다.
< 실시예 5> 닫힌 구조( closed form )의 비활성화된 c- Src SH1 도메인과 TM4SF5 의 결합 확인
<5-1> c- Src SH1 도메인의 다양한 점 돌연변이( point mutation ) 제작체( construct ) 제조
c-Src SH1 도메인의 다양한 점 돌연변이(point mutation) 제작체(construct) 제조를 하기 위하여 프라이머(primer)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
구체적으로, c-Src SH1 도메인의 염기서열 분석을 통하여 인산화에 중요한 타이로신(tyrosine) 419번 잔기와 530번 잔기를 페닐알라닌(phenylalanine)으로 치환할 수 있는 프라이머(primer)를 제작하였고, PCR을 사용하여 돌연변이화(mutagenesis)를 시켰다. c-Src의 타이로신 419번 잔기는 자동인산화(autophosphorylation)가 되는 잔기로서 c-Src의 활성화에 중요하며 타이로신 530번 잔기는 세포 내의 다양한 기전에 의해 인산화가 진행되며 인산화됨으로써 c-Src가 자동억제(autoinhibition)되는 닫힌 형태(closed form)로 변화하게 되며 본 발명에 사용된 프라이머 서열번호 14, 15, 16 및 17은 하기 표 3에 나타내었다(표 3).
primer 서열(5'→3') Tm값(℃)
Y419F 정방향(forward)-서열번호 14 GAAGACAATGAGTTCACGGCGCGGCAA 65
Y419F 역방향(reverse)-서열번호 15 TTGCCGCGCCGTGAACTCATTGTCTTC 65
Y530F 정방향(forward)-서열번호 16 CGAGCCCCAGTTCCAGCCCGG 67.5
Y530F 역방향(reverse)-서열번호 17 CCGGGCTGGAACTGGGGCTCG 67.5
<5-2> 수립된 c- Src SH1 돌연변이 제작체(construct)에서 면역침강을 통한 비활성화 형태인 SH1 Y419F 및 SH1 K298M - HA 와의 결합 선호 확인
상기 실시예 <5-1>의 방법으로 제조된 c-Src SH1 돌연변이 제작체에서 SH1 Y419F 및 SH1 K298M-HA와의 결합 선호를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 인산화효소로서의 활성이 비활성화된 형태인 c-Src K298M-HA의 제작은 pKH3-(HA)3-c-Src WT에 점 돌연변이를 라이신 298번을 메치오닌으로 바꾼 것으로 이미 개재된 바[O.Jung et al. (2013) Biochimica et Biophysica Acta 1833(3):629-42)] 있다.
구체적으로, 상기 실시예 <5-1>의 방법으로 제조된 c-Src SH1 돌연변이 제작체(도 5a)들을 이용하여 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 면역 침강을 수행하였고, 상기 방법으로 획득한 침강샘플을 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 5b 및 도 5d에 나타낸 바와 같이, c-Src(santa cruz,미국)의 항체로 TM4SF5와의 결합을 확인하였을 때, c-Src의 SH1 도메인에 비해 SH1 Y419F 제작체 와 SH1 K298M-HA 제작체(HA tag와 결합된 298번 라이신 아미노산 잔기를 메치오닌으로 치환한 돌연변이체)에서 결합이 더욱 증가하는 것을 확인하였고, SH1 Y530F, SH1 K298MY530F-HA(HA tag와 결합된 298번 라이신 아미노산 잔기를 메치오닌으로 그리고 타이로신 530 잔기를 페닐알라닌으로 이중 치환한 돌연변이체) 제작체에서는 결합이 없어지는 것을 확인하였다(도 5b 및 도 5d).
또한, TM4SF5와 결합하는 c-Src의 제작체에 의한 pY861FAK(Tyr861이 인산화된)의 인산화 정도가 향상되는 것이 TM4SF5가 과발현된 세포(SNU761-TM4SF5 WT)에서는 확연하게 보였지만, TM4SF5가 과발현하지 않는 대조군 세포(SNU761-Mock), 그리고 FAK이 결합하는 부위인 intercellular loop(ICL)를 삭제한 세포(SNU761-TM4SF5ΔICL19: ICL의 아니노산잔기 19개를 없앤 deletion 돌연변이체) 에서는 그렇지 못하고 TM4SF5와 c-Src 제작체와의 결합과 무관함을 보이는 것을 확인하였다. 이것은 TM4SF5가 발현될 때 c-Src와의 결합에 의한 c-Src의 활성화가 특이적으로 pY861FAK에 직결되어 조절됨을 확인하였다(도 5D).
따라서, 상기 실시예 <5-2>의 결과를 통하여, TM4SF5는 c-Src의 SH1 도메인과의 결합에 있어서 c-Src(혹은 SH1 도메인)의 활성화 상태에 따라 결합의 정도가 달라짐을 확인하였다.
<5-3> 닫힌 구조의 비활성화된 c- Src 가 TM4SF5 와의 결합에 대한 선호성 확인
상기 결과에 이어 c-Src의 구조에 중요한 역할을 하는 SH321 도메인 construct를 이용하여 닫힌 구조의 비활성화된 c-Src가 TM4SF5와의 결합에 선호성을 가지는지를 확인하고자 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, PCR mutagenesis 방법을 이용하여 이전 SH1 도메인 construct들과 동일하게 Y419F, Y530F, Y419F/Y530F 돌연변이 DNA를 제작하였다. 이에 더하여 c-Src를 항상 닫힌 구조(closed form)로 유지시키는 삼중 돌연변이인 Q531E/P532E/G533I construct 및 사중 돌연변이인 Y419F/Q531E/P532E/G533I도 제작하여 실험을 수행하였다(도 6a). 이러한 construct DNA들을 Strep-TM4SF5 DNA와 함께 SNU449 세포에 형질 감염시킨후 면역 침강법으로 결합을 확인하였다.
그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이 SH321보다는 SH321-Y419F에서 더 높은 결합이 나타났고, SH321-Y530F와 SH321-Y419F/Y530F construct에서는 결합이 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 6b). 이는 SH1 도메인에서의 결과와 동일하며, 도 6c에 나타낸 바와 같이 삼중 돌연변이인 SH321-Q531E/Y532E/G533I construct를 형질 감염시킨 후 면역 침강을 해본 결과와 함께 닫힌 구조의 비활성화된 c-Src가 TM4SF5와 결합을 더욱 잘한다는 것을 확인 하였으나, Y419F/Q531E/P532E/G533I는 결합하지 않았다(도 6c).
<5-4> PTP1B 에 의해 조절되는 TM4SF5 와 c- Src 사이의 결합 확인
c-Src의 인산화된 530번 타이로신(tyrosine) 잔기를 탈인산화시킴으로써 c-Src를 열린 구조로 만들고 419번 타이로신이 인산화될 수 있게 하는 PTP1B(Protein Tyrosine Phosphatase 1B)를 이용하여 TM4SF5와 c-Src 사이의 결합을 확인하고자 하기와 같은 실험을 실시하였다.
구체적으로, PTP1B를 과발현시킨 후 TM4SF5와 c-Src사이의 결합을 확인하고자 SNU449 세포에 Strep-Mock 혹은 Strep-TM4SF5, PTP1B 혹은 그것의 Mock DNA, c-Src SH321 construct를 형질 감염시킨 후 면역 침강 법을 수행하였다. 또한 PTP1B의 siRNA를 이용하여 PTP1B를 억제시킨 후 면역 침강 법을 수행하였다.
그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이 PTP1B를 과발현시킨 TM4SF5 과발현 세포에서 내재적인 c-Src와 외재적인 c-Src SH321 사이의 결합이 대조군에 비해 감소되는 것을 확인하였다(도 7a). 또한 도 7b에 나타낸 바와 같이 SNU761 stable 세포를 이용하여 앞과 같이 PTP1B를 과발현시켰을 때도 TM4SF5와 c-Src 사이의 결합이 감소함을 확인할 수 있었다(도 7b). 다음으로 도 7c에 나타낸 바와 같이 PTP1B의 siRNA를 이용하여 PTP1B를 억제시켰을 때는 과발현시켰을 때와는 반대로 TM4SF5와 c-Src사이의 결합이 증가하는 것을 확인하였다(도 7c).
이러한 결과를 통해 PTP1B가 TM4SF5와 c-Src사이의 결합을 조절한다는 사실을 알 수 있다.
<5-5> TM4SF5 와 c- Src SH1 도메인의 결합에 있어서의 TAT 펩타이드 처리의 효과 확인
TM4SF5와 c-Src SH1 도메인의 결합에 있어서의 TAT 펩타이드의 효과를 확인하기 위하여 플라스미드 형질감염, 면역침강 및 웨스턴 블랏을 수행하였다.
구체적으로, TM4SF5와 c-Src의 결합에 있어서 TAT 펩타이드 효과를 확인하기 위하여, Strep-TM4SF5(STrEP tag가 결합된 TM4SF5 발현 플라스미드)와 c-Src SH1 도메인을 동시적으로 SNU449에 형질 감염시키고, 24시간 후, TAT-Cscram 대조군 펩타이드와 TAT-caax-Cter 펩타이드를 10 μM로 24시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 상기 실시예 <3-1>에 기재한 방법으로 면역 침강을 수행하였고, 상기 방법으로 획득한 침강샘플을 웨스턴 블랏을 사용하여 분석하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, TAT-caax-Cter 펩타이드를 처리하였을 때, TAT-Cscram 펩타이드를 처리한 결과와 달리 TM4SF5와 c-Src의 내재적인 결합뿐만 아니라 외재적으로 주입한 c-Src의 SH1 도메인과의 외재적인 결합도 감소하는 것을 확인하였다(도 8).
따라서, 상기 실시예 <4-3>의 결과들을 통해 TAT-caax-Cter 펩타이드가 TM4SF5와 c-Src의 결합을 표적화함으로써 TM4SF5에 의해 매개 되었던 세포의 침윤과 전이를 억제하는 것을 확인하였다.
< 실시예 6> ECM degradation assay 와 트랜스웰 이동성분석( transwell migration assay)을 통한 TAT 펩타이드의 효과
<6-1> 면역염색법( immunostaining )을 통한 TAT 펩타이드의 표적화 및 효과 확인
세포의 침윤성에 대한 TAT 펩타이드의 표적화 및 효과를 확인하기 위하여 형광인자가 연결된 세포외기질(gelatin)이 코팅된 커버글라스위에 세포을 배양하다가, 세포에 의해 젤라틴의 분해가 이루어짐에 따라 형광(Oregon green 488에 의한 녹색)이 없어져 검은 스팟을 확인하고 그를 세포외기질분해 정도로 확인하는 면역염색(immunostaining)법을 수행하였다.
구체적으로, Oregon Green488-conjugated gelatin(10 μg/ml; Molecular Probes)으로 코팅한 글라스 위에 10 μM 펩타이드를 24시간 동안 처리한 TM4SF5를 과발현하는 SNU761-TM4SF5 WT 세포와 이에 따른 대조군 SNU761-mock 세포를 3 ×105 농도로 분주하고 배양하였다. 4 시간 후, 상기 세포를 3.7% 포름알데하이드로 고정시킨 뒤, 5% triton X-100를 이용하여 5분 동안 투과화(permeabilization)하고 2% BSA 용액을 사용하여 1시간 동안 블록킹(blocking)을 하였다. 그런 다음, 상기 세포를 팔로이딘(phalloidin)으로 사용하여 액틴(Actin)을 염색시키고 마운팅(mounting)하여 형광현미경(BX51; Olympus, 일본)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이, TM4SF5에 의해 증가되었던 침윤(invasion) 혹은 세포외 기질분해 기능이 TAT-Cter 혹은 TAT-caax-Cter 펩타이드에 의해 더욱 감소되는 것을 확인하였다(도 9a).
<6-2> 세포 이동성분석(migration assay)에 대한 TAT 펩타이드의 표적화 및 효과 확인
세포 이동 기능에 대한 TAT 펩타이드의 표적화 및 효과를 확인하기 위하여 세포 이동성 분석(migration assay)을 수행하였다.
구체적으로, 10 μM 펩타이드를 24시간 동안 처리한 TM4SF5를 과발현하는 SNU449와 그에 따른 대조군 세포를 트랜스웰 챔버(Transwell chambers)(8 μm porosity; Corning Costar)를 이용하여 이동성 어세이(migration assay)를 수행하였다. 10% FBS/RPMI-1640으로 아래쪽 챔버(chamber)를 채워준 뒤, 위쪽 챔버(chamber)에는 세포(5×105 세포/0.2 ml serum-containing media)를 첨가하여 37°C CO2 세포배양기에서 배양하였다. 일정시간 배양 후, 위쪽 챔버(chamber)에서 이동하지 않은 세포들은 제거하고 필터(filter) 아래쪽으로 이동한 세포들은 3.7% 포름알데하이드로 고정시키고, 0.5% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하고 그 필터를 제거하고 광학현미경(BX41, 올림푸스, 일본)으로 관찰하여 이동 세포의 이미지를 촬영한 후 최소한 5개 이미지에서 이동 세포의 수를 카운팅하고 평균값과 표준편차값을 구하였다.
그 결과, 도 9b에 나타낸 바와 같이, TM4SF5를 발현하지 않는 세포에서와는 달리, TM4SF5의 발현에 의해 증가된 세포의 이동이 TAT-Cter 혹은 TAT-caax-Cter 처리에 의하여 감소함을 확인하였다(도 9b).
< 실시예 7> 종양형성 ( xenograft )을 유발시킨 누드마우스에서 TAT 펩타이드의 효과 확인
<7-1> c- Src 억제제 PP2 와 대조군 PP3 의 효과 확인
종양형성(xenograft)을 유발시킨 누드마우스에서 c-Src의 억제제 PP2와 대조군 PP3의 효과를 확인하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다.
구체적으로, 5주령 누드 마우스(BALB c/nu-nu, 오리엔트 바이오,한국)에 TM4SF5를 과발현시킨 SNU449T7 클론을 5 x 106 세포/마리로 피하주사(subcutaneous injection, S.C)를 통해 주입시킨 후, 발생된 종양 조직의 부피가 100 mm3이 되었을 때 c-Src의 억제제 PP2와 대조군 PP3를 3 mg/kg을 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 일주일 동안 매일 복강내주사(intraperitoneal injection, I.C.) 방법으로 투여하였다.
그 결과, 도 10a에 나타낸 바와 같이, c-Src의 억제제 PP2와 대조군 PP3를 상기 마우스에 투여하였을 때, 마우스의 체중이 서서히 증가하고 줄어들지 않았으므로 상기 물질에 대한 독성은 나타나지 않았으며, c-Src의 억제제 PP2를 처리한 마우스는 대조군 PP3와 비교하여 1/2정도 종양 조직 부피가 효과적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 10a)
<7-2> TAT - caax - Cter 펩타이드에 의한 마우스 종양 조직의 부피 감소 효과 확인
종양형성(xenograft)을 유발시킨 누드마우스에서 TAT-caax-Cter 펩타이드에 의한 마우스 종양 조직의 부피 감소 효과를, c-Src 억제제 PP2처리에서 보았던 것처럼 확인하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <7-1>에 기재된 방법으로 누드 마우스의 피하 종양 조직 부피가 100 mm3이 되었을 때, 상기 마우스(5 마리)에 각각 600 μg TAT_Scram 펩타이드, 200 μg TAT-caax-Cter 펩타이드, 600 μg TAT-caax-Cter 펩타이드를 일주일 동안 매일 복강내 주사 방법으로 투여하였다.
그 결과, 도 10b에 나타낸 바와 같이, 600 μg TAT-Cscram 펩타이드, 200 μg TAT-caax-Cter 펩타이드, 600 μg TAT-caax-Cter 펩타이드를 일주일 동안 매일 복강내주사 방법으로 투여한 상기 마우스 성장에는 영향을 미치지 않았으며, TAT-caax-Cter 펩타이드를 처리한 상기마우스에서 농도 의존적으로 종양 조직의 부피가 감소됨을 확인하였다(도 10b).
따라서, 상기 실시예 <7-2>의 결과들을 통해 TAT-caax-Cter 펩타이드를 처리한 상기 마우스 종양 조직의 부피 감소는 c-Src의 억제제인 PP2보다 뛰어나며, 이것으로 TM4SF5를 표적화하여 c-Src의 억제한 효과임을 확인하였다.
< 실시예 8> TAT - caax - Cter 펩타이드에 의한 마우스에서 암세포 전이 억제 효과 확인
TM4SF5를 과발현하고 있는 SNU449T7 클론 5 x 106개를 꼬리 미정맥 주사(tail vein injection)를 이용하여 상기 실시예 <7-1>의 누드 마우스에 주입시킨 후 2주 동안 암세포가 폐로 전이될 수 있도록 하였다. 그 후 100μg의 TAT-Cscram 펩타이드와 100 혹은 500μg의 TAT-Caax-Cter 펩타이드를 2주일 동안 격일로 복강내주사(intraperitoneal injection, I.C.)를 통해 투여하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이 많은 수의 작은 암덩이(nodule)을 가진 TAT-Cscram 펩타이드 처리 마우스와는 달리 TAT-Caax-Cter 펩타이드를 처리한 마우스들의 폐에서는 암덩어리의 숫자가 확연히 감소되어 있는 것을 확인하였다(도 11).
이를 통해 TAT-Caax-Cter 펩타이드가 TM4SF5에 의해 유도된 암세포의 전이를 억제할 수 있는 효능을 가진 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 9> 간암세포에서 spheroid 타입의 세포 형성 유도 확인
<9-1> TM4SF5 의 발현에 따른 spheroid 타입의 세포 형성 확인
간암세포(HCC)에서 TM4SF5가 발현됨에 따라 순환종양세포(Circulating tumor cell)의 형성에 영향을 미친다는 것은, TM4SF5를 발현하는 세포들이 spheroid 타입의 세포를 형성함으로써 혈액 내에서 순환할 수 있다는 것을 의미하기에 이를 연구하고자 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 여러 간암 세포, HepG2, Huh7, SNU449 및 SNU761를 ultra low attachment 6-well plate에 5 X 103 개/well이 넘지 않도록 배양하였다. spheroid 타입의 세포를 배양하기 위해 Normal culture plate에서 배양한 상기 세포들을 떼어낸 뒤 PBS를 이용하여 Serum component를 제거해 주었다. 이러한 세포들을 25 ng/ml EGF, 25 ng/ml bFGF, 2% B27 supplement, 1% P/S DMEM/F12 배지에 재현탁 한 후 6 well-Ultra low attach plate에 각각 5x105씩 되도록 넣어 주었다. EGF와 bFGF는 각각 2일에 한번씩 25 ng/ml이 될 수 있도록 넣어주었다. 각각의 well을 3일에 한번씩 phase contrast 현미경을 이용하여 관찰한 후 촬영하였다.
그 결과, 도 12b에 나타낸 바와 같이 TM4SF5를 발현하지 않는 SNU449 세포와 SNU761 세포와는 달리, 내재적으로 TM4SF5를 발현하는 Huh7과 HepG2 세포는 spheroid 타입의 세포가 형성되는 것을 확인하였다(도 12b). 또한 도 12b에 나타낸 바와 같이 TM4SF5를 발현하는 SNU449의 단일 클론 세포들(T3, T7, T10, 및 T16)도 spheroid 타입의 세포를 잘 형성하는 반면, TM4SF5의 N-glycosylation 돌연변이 세포들(N138A, N115Q, 또는 N138A/N155Q)은 그렇지 않은 것 또한 확인하였다(도 12b). 또한, 도 12c에 나타낸 바와 같이 70 μm 이상의 크기를 가지는 spheroid 세포를 세어보았을 때, spheroid 세포의 수는 WT TM4SF5의 발현과 관련이 있다는 것을 확인하였다(도 12c).
<9-2> TM4SF5 와 aldehyde dehydrogenase ( ALDH )의 활성화와의 관계 확인
TM4SF5이 aldehyde dehydrogenase(ALDH)의 활성화에 연관이 있는지를 확인해보고자 SNU449 계열의 세포들을 이용하여 유세포분석기(flow cytometry, FACS)로 분석해보았다. 최근 연구에서 ALDH1이 암줄기세포의 마커이며 간암을 포함한 다양한 암종에서 자가복제 능력과 종양의 악성 정도와 매우 밀접하게 관련이 있다는 것이 보고된 바 있기 때문이다.
구체적으로, ALDEFLUOR assay kit에 포함되어 있는 ALDEFLUOR? assay buffer(6 × 105 cells/ml)에 세포들을 두고, 37°C에서 45분간 ALDEFLUOR? substrate와 함께 배양시킨 후 유세포분석기를 통해 ALDH의 활성화 정도를 분석하였다. aldehyde dehydrogenase activity를 측정하기 위해 2d에서 배양한 세포를 떼어 낸 뒤 ALDEFLUOR assay kit를 이용하여 aldehyde dehydrogenase activity를 측정하였다. Assay buffer를 이용하여 재현탁 해준 뒤 1.5 ml 튜브에 각각 6x105 cell을 넣어주었다. 이들 튜브를 37°C에서 45분간 배양하였다. Negative control은 일부분의 세포를 새로운 튜브에 옮겨주고 억제제(inhibitor)인 DEAB를 처리하여 준비하였다. 이들 샘플을 FACS Calibur를 이용하여 FL-1 channel 파장에서 측정하였다. 상기 실시예 <9-1>과 같이 TM4SF5를 발현하지 않는 세포(P, Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(N138A, N155Q, NA/NQ) 또는 wild-type TM4SF5(Tp, T3, T7, T10, T16)를 과발현시킨 세포주를 이용하여 Aldefluor assay를 수행하였다.
그 결과, 도 12d에 나타낸 바와 같이 wild-type TM4SF5(Tp, T3, T7, T10, T16)를 과발현 시킨 세포주는 TM4SF5를 발현하지 않는 세포(P, Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(N138A, N155Q, NA/NQ)에 비해 훨씬 높은 aldehyde dehydrogenase activity를 가지고 있음을 확인하였다.
적은 수의 세포로 종양이 형성되고, 순차적인 xenograft가 가능하며, ALDH가 더 높게 활성화되는 이러한 결과를 통해 TM4SF5의 발현이 자기 재생능력을 가지는 간암 줄기세포의 특징을 가지게 하는데 영향을 미친다는 것을 알 수 있다.
<9-3> TM4SF5 에 의한 다양한 세포 신호인자들의 활성화 억제 확인
TM4SF5에 의해 매개되는 다양한 세포 신호인자들의 활성화가 억제되는 것을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 2d에서 하루 이상 배양한 세포를 이용하여 lysis buffer에 SDS, Na3VO4, protease inhibitor cocktails(GenDepot))를 넣고 4℃에서 1시간 이상 처리해주었다. 4℃, 13000 rpm으로 30분 동안 원심분리한 후, 새 microcentrifuge-tube에 상층액만을 옮겨주었다. 각각의 protein 양을 BCA 정량을 통해 확인한 후 4 x sample buffer를 넣어준 후, 5 분 동안 100℃에서 끓였다. 이 샘플을 이용한 Western blot을 통해서 α-tubulin 발현양을 기준으로 다른 단백질의 발현양의 변화를 측정하였다. 이후 5 분 동안 100℃에서 끓였다. 또한, 내재적인 TM4SF5를 발현하는 세포(Huh7-shScram)와 이 세포에 TM4SF5발현을 저해시킨 세포주(Huh7-shTM4SF5)를 이용하여 serum component와 adhesive environment가 없는 조건에서 spheroid formation assay를 수행하였다.
그 결과, 도 12e에 나타낸 바와 같이 2d에서 배양한 내재적 TM4SF5를 발현하는 세포(Huh7 shScram)에 비해 TM4SF5발현을 저해시킨 세포(Huh7 shTM4SF5)에서 TM4SF5 downstream signal인 FAK, p27의 인산화가 저해되었고, 종양줄기세포 마커인 CD133의 발현은 차이가 없는 것을 확인하였다(도 12e). 또한, 도 12f에 나타낸 바와 같이 wild-type TM4SF5를 발현하는 세포만이 spheroid를 형성함을 확인하였다(도 12f).
이러한 결과를 통해 TM4SF5가 간암 세포에서 spheroid 형성에 관여한다는 것을 알 수 있었다.
< 실시예 10> TM4SF5 의 발현에 따른 다른 간암 줄기세포 마커의 발현 양상 확인
TM4SF5의 발현에 따른 다른 간암 줄기세포의 마커인 CD24 및 CD44의 발현 양상을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 2D에서 하루 이상 배양한 TM4SF5를 발현하지 않는 세포(P, Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(N138A, N155Q, NA/NQ) 또는 wild-type TM4SF5(Tp, T3, T7, T10, T16)를 과발현시킨 세포주(SNU449)를 이용하여 Trizol solution을 이용하여 total RNA를 추출한 후, 각각의 RNA량을 nano-drop를 통해 정량한 후 cDNA 샘플을 만들었다. 이러한 샘플을 이용하여 PCR을 수행하여 각각의 mRNA량을 측정하였다. 또한, 상기 실시예 <9-3>에 나타낸 바와 같이 단백질의 발현양의 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이 TM4SF5를 발현하지 않는 세포(P, Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(N138A, N155Q, NA/NQ)를 과발현시킨 세포는 wild-type TM4SF5(Tp, T3, T7, T10, T16)를 과발현시킨 세포주에 비해 CD24의 mRNA 및 단백질이 높은 것을 확인하였고, CD44는 차이가 없는 것을 확인하였다(도 13).
< 실시예 11> TM4SF5 의 발현에 따른 간암 줄기세포의 자기 재생 능력 확인
<11-1> TM4SF5 에 의한 누드 마우스에서 종양 형성 확인
간암세포에서의 TM4SF5 발현이 순환종양세포와 spheroid 타입의 세포를 형성한다는 것은 암세포의 전이, 침윤 및 EMT에도 관련이 있지만, 자기 재생 능력을 가지는 암줄기세포(Caner Stem Cells, CSCs)의 특성을 가지게 하는 데에도 관련이 있기 때문에 TM4SF5에 의한 자가복제능력 유도 기작이 가능한지를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <9-1>에서와 같이 plate에서 자라고 있는 세포를 떼어낸 뒤 normal culture media와 matrigel을 각각 1:1 비율로 섞은 buffer에 각각 500, 2000, 5000 cells/50 ㎕씩 계산하여 준비한 튜브에 옮겼다. 이러한 세포들을 상기 실시예 <7-1>에서와 같이 누드 마우스의 왼쪽 옆구리에는 SNU449Cp 세포와 TM4SF5N138A/N155Q 세포를, 오른쪽 옆구리에는 WT TM4SF5-positive SNU449T7 세포를 5000개 미만으로 각각 피하주사로 주입하여 종양 형성 능력을 측정하였다.
그 결과, 도 14a에 나타낸 바와 같이 TM4SF5를 발현하지 않는 세포(Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(NA/NQ) 또는 wild-type TM4SF5(T7)를 과발현시킨 세포를 이용하여 각각 500, 2000, 5000 cells/site를 준비하여 TM4SF5에 의한 종양 형성 능력을 측정한 결과 TM4SF5를 발현하는 세포만이 누드마우스에서 종양을 형성하는 것을 확인하였다(도 14a). 더욱이 500개의 세포를 주입시킨 마우스에서도 5000개의 세포를 주입시킨 것과 동일하게 종양이 형성된 것 또한 확인하였다.
<11-2> TM4SF5 downstream signal 단백질들의 인산화 확인
상기 실시예 <11-1>의 누드마우스에서 형성된 종양조직에서의 TM4SF5 downstream signal 단백질들의 인산화 정도를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 종양조직에서 collagenase Ⅱ와 DNase Ⅰ를 이용하여 37℃에서 배양하는 과정을 거쳐 얻은 세포와 2차원적 배양 환경에서 배양하던 세포를 수확한 뒤 lysis buffer에 SDS, Na3VO4, protease inhibitor cocktails(GenDepot)) 를 넣고 4℃에서 1시간 이상 처리하였다. 상기 실시예 <9-3>에서와 같이 단백질의 발현양의 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 14b에 나타낸 바와 같이 종양조직에서 분리한 세포(ExpT7 #2, #3)는 2d에서 배양하던 TM4SF5를 발현하지 않는 세포(Cp)와 TM4SF5를 과발현시킨 세포(T7)에 비해 TM4SF5 downstream signal 단백질인 FAK, c-Src, p27Kip1, STAT3의 인산화가 훨씬 높아졌음을 확인하였다(도 14b).
<11-3> TM4SF5 에 의한 연속적( serial) 종양 형성 능력 확인
TM4SF5에 의한 serial 종양 형성 능력 확인하기 위해 상기 1차 종양조직에서 collagenase Ⅱ와 DNase Ⅰ를 이용하여 37℃에서 배양하는 과정을 거쳐 얻은 세포를 약 일주일간 2차원적 배양 환경에서 배양하였다. 이때 G418 500 μg/ml이 첨가된 배양 배지를 사용하여 선별 과정을 거쳐 세포를 떼어낸 뒤 normal culture media와 matrigel을 각각 1:1 비율로 섞은 buffer에 각각 200, 500, 2000, 5000 cells/50 ㎕씩 계산하여 준비한 튜브에 옮겨줬다. 이러한 세포들을 누드마우스의 피하에 주입하여 종양 형성 능력을 측정하였다. 또한, 상기 1차 누드마우스 및 2차 누드마우스 종양조직으로부터 세포를 분리하여 상기 실시예 <9-3>에서와 같이 단백질의 발현양의 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 14c에 나타낸 바와 같이 처음 누드마우스에서 형성된 종양조직에서 분리한 세포(ExpT7 #2)를 이용하여 각각 200, 500, 2000, 5000 cells/site를 준비하여 TM4SF5에 의한 serial 종양형성능력을 측정한 결과 훨씬 낮은 세포수에서도 누드마우스에서 빠르게 종양을 형성하였다(도 14c). 또한, 도 14d에 나타낸 바와 같이 1차 누드마우스 종양조직에서 분리한 세포(ExpT7-2)와 2차 누드마우스 종양조직에서 분리한 세포(2ndExpT7-2)는 2d에서 배양하던 TM4SF5를 발현하지 않는 세포(Cp)와 TM4SF5를 과발현시킨 세포(T7)에 비해 TM4SF5 downstream signal 단백질인 FAK, c-Src, p27Kip1, STAT3의 인산화 훨씬 높아졌음을 확인하였다(도 14d).
<11-4> TM4SF5 및 CD44 단백질의 발현 확인
누드마우스에서 형성된 종양조직에서 분리하여 얻은 세포주(ExpT7-2, T7-3)와 TM4SF5를 과발현시킨 세포(T7)를 이용해 TM4SF5 및 CD44 단백질의 발현을 확인하기 위해 FACS analysis을 수행하였다.
구체적으로, 상기 세포를 2mM EDTA, PBS buffer를 이용하여 culture plate에서 떼어낸 뒤, 1% BSA, PBS buffer로 blocking 하였다. 이러한 세포들을 counting 하여 튜브당 1x106으로 준비한 뒤 각각 no-Antibody, CD44-antibody, CD44-negative antibody, TM4SF5-antibody, TM4SF5-negative antibody, CD44-antibody & TM4SF5-antibody로 염색하였다. 이들 샘플을 FACS calibur로 CD44의 경우엔 FL-2, TM4SF5의 경우엔 FL-1, double staining의 경우 FL-1,FL-2 laser로 단백질의 발현량을 측정하였다.
그 결과, 도 14e에 나타낸 바와 같이 종양조직에서 분리한 세포(ExpT7 #2, #3)는 2d에서 배양하던 TM4SF5를 과발현시킨 세포(T7)에 비해 TM4SF5와 CD44 단백질의 발현이 훨씬 높아졌음을 확인하였다(도 14e).
인산화된 c-Src의 정도는 본래의 SNU449Cp와 SNU449T7과 비교하였을 때 더욱 높은 것으로 보아, 순차적인 xenograft에서 더욱 뚜렷한 종양 형성을 확인할 수 있었다. 특히, 1차 xenograft 마우스 및 2차 xenograft 마우스로부터 종양세포를 분리하여, 유세포분석기(flow cytometry)로 분석하였을 경우, 1차 xenograft 세포(ExpT7-2)와 마찬가지로 2차 xengraft 세포(2ndExpT7-2)에서도 원래 주사하였던 SNU449T7(T7) 세포보다 각각 따로 TM4SF5, CD44를 혹은 TM4SF5와 CD44를 함께 증가된 발현 정도를 보여주는 세포 그룹이 생기는 것을 보아 T7 세포주가 xengraft 동안에 암줄기세포의 성격을 가진 것처럼 분화되었음을 나타내었다.
< 실시예 12> spheroid 형성을 위한 신호전달 과정과 c- Src 의 저해제 처리를 통한 spheroid 형성 억제 확인
<12-1> TM4SF5 downstream signal 의 인산화 정도 확인
상기 2d에서 하루 이상 배양한 2d에서 배양한 TM4SF5를 발현하지 않는 세포(P, Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(N138A, N155Q, NA/NQ) 또는 wild-type TM4SF5(Tp, T3, T7, T10, T16)를 과발현 시킨 세포주를 이용하여 lysis buffer에 SDS, Na3VO4, protease inhibitor cocktails (GenDepot)) 를 넣고 4℃에서 1시간 이상 처리하였다. 상기 실시예 <9-3>과 같이 단백질의 발현양의 변화를 측정하였다. 2d에서 하루 이상 배양한 세포를 이용하여 Trizol solution을 이용하여 total RNA를 추출한 후, 각각의 RNA량을 nano-drop를 통해 정량한 후 cDNA 샘플을 만들었다. 이러한 샘플을 이용하여 PCR을 수행하여 각각의 mRNA량을 측정하였다.
그 결과, 도 15a에 나타낸 바와 같이 내재적 TM4SF5를 발현하는 세포(Huh7-shScram)와 wild-type TM4SF5(Tp, T3, T7, T10, T16)를 과발현시킨 세포주는 TM4SF5를 발현하지 않는 세포(P, Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(N138A, N155Q, NA/NQ) 과발현시킨 세포, 내재적 TM4SF5 발현을 저해시킨 세포주(Huh7-shTM4SF5)에 비해 Twist1의 발현과 TM4SF5 downstream signal의 인산화가 높은 것을 확인하였으며 Twist1, Bmi1의 전사와 발현이 높은 것을 확인하였다(도 15a).
<12-2> c- Src 의 저해제 처리에 의한 spheroid 형성이 억제 효과
순차적인 xenograft 실험 결과에서 인산화된 c-Src의 정도가 원래의 SNU449T7에 비교하여 더욱 높은 것을 확인할 수 있었다. 이것은 TM4SF5가 c-Src와의 결합을 통한 c-Src의 활성화에 따른 암세포의 전이와 침윤을 조절한다는 결과와 더불어 TM4SF5에 의한 spheroid 형성에 c-Src가 매우 중요하게 작용한다는 것으로 유추해 볼 수 있다. 따라서 c-Src의 저해제인 PP2와 그것의 negative 대조군인 PP3를 처리하여 확인하고자 하였다. Src kinase activity를 저해시키는 PP2와 control인 DMSO, PP3 처리하는 조건에서 Endogeneous TM4SF5를 발현하지 않는 세포(Cp)와 이 세포에 mutant TM4SF5(NANQ) 또는 TM4SF5(Tp,T7)을 과발현시킨 세포를 이용하여 spheroid formation assay를 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <9-1>과 같이 상기 세포들을 배양하였으며 EGF와 bFGF는 각각 2일에 한번씩 25 ng/ml이 될 수 있도록 넣어주었다. 세포를 배양한지 24시간이 지났을 때 PP2, PP3(40 um/ml)과 동량의 DMSO를 처리하고 2일에 한번씩 넣어주었다. 각각의 well을 3일에 한번씩 phase contrast 현미경을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 15b에 나타낸 바와 같이 SNU449Cp 세포와 TM4SF5N138A/N155Q 세포는 PP2의 처리에 따른 차이가 없었지만, SNU449Tp 세포와 SNU449T7 세포에서는 PP3와 비교하여 PP2를 처리하였을 때 spheroid 형성이 억제되는 것을 확인하였다(도 15b).
< 실시예 13> 간암세포에서 순환종양세포( Circulating tumor cell )의 특징 확인
상피 세포의 특징을 잃고 중간엽 세포의 특징을 얻게 되는 상피-중간엽 전이(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)는 암세포의 전이를 이끌며, 이는 순환종양세포(Circulating tumor cells, CTCs)의 형성과 관련이 있다. 따라서 앞선 연구에 이어 암세포의 전이, 침윤 및 EMT를 촉진한다고 연구된 TM4SF5 및 CD44의 발현이 간암세포에서 순환종양세포의 성격을 가지게 되는지를 연구하였다. TM4SF5가 발현됨으로써 간암세포에서 생기는 순환종양세포(Circulating tumor cell)의 특징을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, GFP가 연결되어 있으면서 TM4SF5를 형질 억제시킬 수 있는 shRNA(tGFP-shTM4SF5)와 그것에 대비되는 scramble shRNA(tGFP-shScram)를 SNU449T7 세포에 형질 감염시킨 후 PBS vehicle과 함께 누드 마우스의 간에 직접 주입시켰다. TM4SF5를 과발현시킨 세포(T7)에 pGFP-V-RS shScramble와 pGFP-V-RS-shTM4SF5 DNA를 transfection 하여 TM4SF5를 과발현시킨 세포(pGFP-V-RS shScramble)와 이들 세포에서 TM4SF5 발현을 저해시킨 세포(pGFP-V-RS-shTM4SF5)를 제작하였다. 이들 세포를 떼어낸 뒤 counting 하여 각각 5x105 cells/ PBS 50 ㎕로 준비하였다. 이들 샘플과 함께 동량의 PBS를 마우스의 왼쪽 간에 주입하였다. 약 4~6주 후에 마우스를 해부하여 심장에서 혈액을 분리한 뒤 sucrose-density gradient 방법을 이용하여 PBMC를 분리하였다. 이들 PBMC 샘플들을 각각 FACS aria Ⅲ를 이용하여 GFP-positive 분리해 주었다. 분리한 GFP-positive PBMC를 각각 10 μg/ml RPMI1640으로 coating 해준 cover glass에 키운 뒤 tGFP-antibody와 DAPI를 이용하여 immunofluorescence 하고 fluorescent 현미경을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 도 16a 및 도 16b에 나타낸 바와 같이 PBS와 SNU449T7-(tGFP)-shTM4SF5 세포를 주입시킨 마우스의 혈액에서는 어떠한 세포도 발견할 수 없었지만 SNU449T7-(tGFP)-shScram 세포를 주입시킨 마우스로부터 얻은 혈액에서는 TM4SF5-positive 세포를 발견할 수 있었다. 즉 누드마우스의 혈액에 TM4SF5를 과발현시킨 세포가 순환하고 있음을 확인하였으며, TM4SF5를 과발현시킨 세포(pGFP-V-RS shScramble)를 주입한 마우스의 혈액에서만 GFP-positive 세포가 측정되는 것을 확인하였다(도 16a 및 B). 한편, 도 16c에 나타낸 바와 같이 SNU449T7 세포주에 control shRNA 를 발현시킨 세포주(SNU449T7-shScram) 혹은 CD44를 발현 억제할 수 있는 shRNA(shCD44)를 안정적(stably)으로 발현시킴 세포주(SNU449T7-shCD44)를 간에 5 x 105 씩 직접 한 번 주사하고, 6주 후에 혈액 샘플을 마우스로부터 모아 DAPI 염색을 시켜 확인해본 결과, PBS와 SNU449T7-shScram 세포를 주입시킨 마우스의 혈액에서는 세포를 발견할 수 있었고, 연구 중간에 사망하게 되는 개체가 생겨났지만, SNU449T7-shCD44 세포를 주입시킨 마우스로부터 얻은 혈액에서는 TM4SF5-positive 세포를 발견할 수 없었고 모두 생존하였다(도 16c).
이를 통해 TM4SF5의 발현이 CTC의 형성에 영향을 미친다는 것을 확인할 수 있었다.
<110> Seoul National University Industry Foundation <120> The composition for the prevention and treatment of cancers, or inhibition of metastasis containing bindin inhibitor of TM4SF5 protein and c-Src protein <130> 2014P-09-045 <150> KR10-2013-120164 <151> 2013-10-08 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 197 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Cys Thr Gly Lys Cys Ala Arg Cys Val Gly Leu Ser Leu Ile Thr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Val Cys Ile Val Ala Asn Ala Leu Leu Leu Val Pro Asn 20 25 30 Gly Glu Thr Ser Trp Thr Asn Thr Asn His Leu Ser Leu Gln Val Trp 35 40 45 Leu Met Gly Gly Phe Ile Gly Gly Gly Leu Met Val Leu Cys Pro Gly 50 55 60 Ile Ala Ala Val Arg Ala Gly Gly Lys Gly Cys Cys Gly Ala Gly Cys 65 70 75 80 Cys Gly Asn Arg Cys Arg Met Leu Arg Ser Val Phe Ser Ser Ala Phe 85 90 95 Gly Val Leu Gly Ala Ile Tyr Cys Leu Ser Val Ser Gly Ala Gly Leu 100 105 110 Arg Asn Gly Pro Arg Cys Leu Met Asn Gly Glu Trp Gly Tyr His Phe 115 120 125 Glu Asp Thr Ala Gly Ala Tyr Leu Leu Asn Arg Thr Leu Trp Asp Arg 130 135 140 Cys Glu Ala Pro Pro Arg Val Val Pro Trp Asn Val Thr Leu Phe Ser 145 150 155 160 Leu Leu Val Ala Ala Ser Cys Leu Glu Ile Val Leu Cys Gly Ile Gln 165 170 175 Leu Val Asn Ala Thr Ile Gly Val Phe Cys Gly Asp Cys Arg Lys Lys 180 185 190 Gln Asp Thr Pro His 195 <210> 2 <211> 1611 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Thr Gly Gly Gly Thr Ala Gly Cys Ala Ala Cys Ala Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Thr Gly Cys 20 25 30 Cys Ala Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly Cys Cys Gly Cys 35 40 45 Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Cys Cys Gly Cys Cys Gly 50 55 60 Ala Gly Ala Ala Cys Gly Thr Gly Cys Ala Cys Gly Gly Cys Gly Cys 65 70 75 80 Thr Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Cys Thr Thr Thr Cys 85 90 95 Cys Cys Cys Gly Cys Cys Thr Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Cys Cys 100 105 110 Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys 115 120 125 Gly Gly Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys 130 135 140 Gly Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr 145 150 155 160 Thr Cys Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys Gly Gly Cys Cys Gly Cys 165 170 175 Cys Gly Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys 180 185 190 Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr Cys Ala Ala Cys Thr Cys Cys Thr 195 200 205 Cys Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Ala Cys Cys Thr Cys 210 215 220 Cys Cys Cys Gly Cys Ala Gly Ala Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Cys 225 230 235 240 Cys Cys Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly 245 250 255 Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Gly Thr Gly Gly Cys 260 265 270 Cys Cys Thr Cys Thr Ala Thr Gly Ala Cys Thr Ala Thr Gly Ala Gly 275 280 285 Thr Cys Thr Ala Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Gly Ala Cys Ala Gly 290 295 300 Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala 305 310 315 320 Ala Gly Gly Cys Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly 325 330 335 Ala Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Cys Ala Gly 340 345 350 Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr 355 360 365 Gly Gly Cys Cys Cys Ala Cys Thr Cys Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys 370 375 380 Ala Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Thr 385 390 395 400 Ala Cys Ala Thr Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Thr Ala 405 410 415 Cys Gly Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Cys 420 425 430 Thr Cys Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Gly 435 440 445 Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr Thr Thr Thr Gly Gly Cys Ala Ala 450 455 460 Gly Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Gly Ala Cys Gly Gly Gly Ala Gly 465 470 475 480 Thr Cys Ala Gly Ala Gly Cys Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys 485 490 495 Thr Cys Ala Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Ala Ala Cys Cys Cys 500 505 510 Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys 515 520 525 Gly Thr Gly Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr Gly Ala Gly Ala 530 535 540 Cys Cys Ala Cys Gly Ala Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys Cys Thr Ala 545 550 555 560 Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Thr Gly Thr Cys Thr 565 570 575 Gly Ala Cys Thr Thr Cys Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala 580 585 590 Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Ala Ala 595 600 605 Gly Cys Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys 610 615 620 Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly 625 630 635 640 Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Thr Cys 645 650 655 Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Cys 660 665 670 Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly 675 680 685 Thr Gly Gly Cys Cys Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Ala Ala 690 695 700 Ala Cys Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys Thr Gly 705 710 715 720 Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala 725 730 735 Cys Cys Gly Thr Gly Thr Gly Cys Cys Cys Cys Ala Cys Gly Thr Cys 740 745 750 Cys Ala Ala Gly Cys Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Thr Cys Ala Gly 755 760 765 Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Thr Gly 770 775 780 Cys Cys Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys Cys Cys Thr Cys Gly 785 790 795 800 Gly Gly Ala Gly Thr Cys Gly Cys Thr Gly Cys Gly Gly Cys Thr Gly 805 810 815 Gly Ala Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Gly Cys Cys 820 825 830 Ala Gly Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Thr Thr Gly Gly Cys Gly Ala 835 840 845 Gly Gly Thr Gly Thr Gly Gly Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys 850 855 860 Thr Gly Gly Ala Ala Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala 865 870 875 880 Gly Gly Gly Thr Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Ala Ala Cys 885 890 895 Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys Ala Cys Gly 900 905 910 Ala Thr Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Cys Thr 915 920 925 Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Cys Cys Ala 930 935 940 Gly Gly Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly 945 950 955 960 Ala Gly Gly Cys Ala Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly 965 970 975 Thr Gly Cys Ala Gly Thr Thr Gly Thr Ala Thr Gly Cys Thr Gly Thr 980 985 990 Gly Gly Thr Thr Thr Cys Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Cys Cys Cys 995 1000 1005 Ala Thr Thr Thr Ala Cys Ala Thr Cys Gly Thr Cys Ala Cys Gly Gly 1010 1015 1020 Ala Gly Thr Ala Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Gly 1025 1030 1035 1040 Gly Ala Gly Thr Thr Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr Thr Thr 1045 1050 1055 Cys Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala Cys Ala Gly 1060 1065 1070 Gly Cys Ala Ala Gly Thr Ala Cys Cys Thr Gly Cys Gly Gly Cys Thr 1075 1080 1085 Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys 1090 1095 1100 Ala Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly Ala Thr Cys Gly 1105 1110 1115 1120 Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Cys Ala Thr Gly Gly Cys Gly Thr Ala 1125 1130 1135 Cys Gly Thr Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys 1140 1145 1150 Thr Ala Cys Gly Thr Cys Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Ala Cys Cys 1155 1160 1165 Thr Thr Cys Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala Ala Cys Ala Thr 1170 1175 1180 Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Cys 1185 1190 1195 1200 Cys Thr Gly Gly Thr Gly Thr Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly 1205 1210 1215 Cys Cys Gly Ala Cys Thr Thr Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Cys 1220 1225 1230 Thr Cys Gly Gly Cys Thr Cys Ala Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Cys 1235 1240 1245 Ala Ala Thr Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Cys Gly Gly Cys Gly Cys 1250 1255 1260 Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys Cys Ala Ala Ala Thr Thr 1265 1270 1275 1280 Cys Cys Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly 1285 1290 1295 Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Cys Cys 1300 1305 1310 Thr Cys Thr Ala Thr Gly Gly Cys Cys Gly Cys Thr Thr Cys Ala Cys 1315 1320 1325 Cys Ala Thr Cys Ala Ala Gly Thr Cys Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly 1330 1335 1340 Thr Gly Gly Thr Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Gly Ala Thr Cys Cys 1345 1350 1355 1360 Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr Cys Ala Cys 1365 1370 1375 Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys Gly Gly Gly Thr Gly 1380 1385 1390 Cys Cys Cys Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Ala Thr Gly Gly 1395 1400 1405 Thr Gly Ala Ala Cys Cys Gly Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Thr 1410 1415 1420 Gly Gly Ala Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly 1425 1430 1435 1440 Gly Gly Cys Thr Ala Cys Cys Gly Gly Ala Thr Gly Cys Cys Cys Thr 1445 1450 1455 Gly Cys Cys Cys Gly Cys Cys Gly Gly Ala Gly Thr Gly Thr Cys Cys 1460 1465 1470 Cys Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Cys Gly Ala Cys 1475 1480 1485 Cys Thr Cys Ala Thr Gly Thr Gly Cys Cys Ala Gly Thr Gly Cys Thr 1490 1495 1500 Gly Gly Cys Gly Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala 1505 1510 1515 1520 Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys 1525 1530 1535 Gly Ala Gly Thr Ala Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Cys Thr 1540 1545 1550 Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Thr 1555 1560 1565 Cys Ala Cys Gly Thr Cys Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Cys Cys Cys 1570 1575 1580 Cys Ala Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Gly 1585 1590 1595 1600 Ala Gly Ala Ala Cys Cys Thr Cys Thr Ala Gly 1605 1610 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Asp Cys Arg Lys Lys Gln Asp Thr Pro His 1 5 10 <210> 4 <211> 864 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Cys Gly Thr Cys Cys Ala Ala Gly Cys Cys Gly Cys Ala Gly Ala 1 5 10 15 Cys Thr Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Ala 20 25 30 Gly Gly Ala Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys 35 40 45 Cys Cys Thr Cys Gly Gly Gly Ala Gly Thr Cys Gly Cys Thr Gly Cys 50 55 60 Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Cys Thr 65 70 75 80 Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Thr Thr 85 90 95 Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Thr Gly Gly Ala Thr Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Gly Gly Thr Ala Cys 115 120 125 Cys Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys 130 135 140 Ala Ala Ala Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly 145 150 155 160 Gly Cys Ala Cys Gly Ala Thr Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala 165 170 175 Gly Gly Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Ala Gly 180 185 190 Gly Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala 195 200 205 Ala Gly Cys Thr Gly Ala Gly Gly Cys Ala Thr Gly Ala Gly Ala Ala 210 215 220 Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Thr Thr Gly Thr Ala Thr 225 230 235 240 Gly Cys Thr Gly Thr Gly Gly Thr Thr Thr Cys Ala Gly Ala Gly Gly 245 250 255 Ala Gly Cys Cys Cys Ala Thr Thr Thr Ala Cys Ala Thr Cys Gly Thr 260 265 270 Cys Ala Cys Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys 275 280 285 Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Thr Thr Thr Gly Cys Thr Gly Gly 290 295 300 Ala Cys Thr Thr Thr Cys Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala 305 310 315 320 Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Ala Ala Gly Thr Ala Cys Cys Thr Gly 325 330 335 Cys Gly Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly 340 345 350 Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala 355 360 365 Gly Ala Thr Cys Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Cys Ala Thr Gly 370 375 380 Gly Cys Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly Ala 385 390 395 400 Thr Gly Ala Ala Cys Thr Ala Cys Gly Thr Cys Cys Ala Cys Cys Gly 405 410 415 Gly Gly Ala Cys Cys Thr Thr Cys Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys 420 425 430 Ala Ala Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly 435 440 445 Ala Gly Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Thr Gly Cys Ala Ala 450 455 460 Ala Gly Thr Gly Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Thr Thr Gly Gly Gly 465 470 475 480 Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Gly Gly Cys Thr Cys Ala Thr Thr Gly 485 490 495 Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Cys 500 505 510 Gly Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys Cys 515 520 525 Ala Ala Ala Thr Thr Cys Cys Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Gly Thr 530 535 540 Gly Gly Ala Cys Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys 545 550 555 560 Thr Gly Cys Cys Cys Thr Cys Thr Ala Thr Gly Gly Cys Cys Gly Cys 565 570 575 Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Gly Thr Cys Gly Gly 580 585 590 Ala Cys Gly Thr Gly Thr Gly Gly Thr Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly 595 600 605 Gly Ala Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Thr Gly Ala Gly 610 615 620 Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys 625 630 635 640 Gly Gly Gly Thr Gly Cys Cys Cys Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly 645 650 655 Gly Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Cys Cys Gly Cys Gly Ala Gly 660 665 670 Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Gly 675 680 685 Ala Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Cys Cys Gly Gly Ala Thr 690 695 700 Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Gly Cys Cys Gly Gly Ala Gly 705 710 715 720 Thr Gly Thr Cys Cys Cys Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys 725 730 735 Ala Cys Gly Ala Cys Cys Thr Cys Ala Thr Gly Thr Gly Cys Cys Ala 740 745 750 Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly 755 760 765 Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Ala 770 775 780 Cys Cys Thr Thr Cys Gly Ala Gly Thr Ala Cys Cys Thr Gly Cys Ala 785 790 795 800 Gly Gly Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Cys 805 810 815 Thr Ala Cys Thr Thr Cys Ala Cys Gly Thr Cys Cys Ala Cys Cys Gly 820 825 830 Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Cys 835 840 845 Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Cys Cys Thr Cys Thr Ala Gly 850 855 860 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Thr Gly Asp Cys Arg Lys 1 5 10 15 Lys Gln Asp Thr Pro His 20 <210> 6 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Thr Cys Val Ile Met Gly 1 5 10 15 Asp Cys Arg Lys Lys Gln Asp Thr Pro His 20 25 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Thr 1 5 10 <210> 8 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Thr Thr Cys Lys Pro Asp 1 5 10 15 Lys Gly Gln Arg His Asp 20 <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Gly Lys Gly Cys Cys Gly Ala Gly Cys Cys Gly Asn Arg Cys Arg 1 5 10 15 Met Leu Arg <210> 10 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gly Cys Cys Cys Thr Cys Thr Ala Thr Gly Ala Cys Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Thr Ala Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Gly Ala Cys 20 25 30 Ala Gly Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly 35 40 45 Ala Ala Ala Gly Gly Cys Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr Cys Cys 50 55 60 Ala Gly Ala Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Cys 65 70 75 80 Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly 85 90 95 Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Ala Cys Thr Cys Gly Cys Thr Cys Ala 100 105 110 Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Cys Ala Gly Gly 115 120 125 Cys Thr Ala Cys Ala Thr Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys 130 135 140 Thr Ala Cys Gly Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Gly 145 150 155 160 Ala Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala 165 170 175 Gly Gly Ala Gly 180 <210> 11 <211> 297 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Thr Gly Gly Thr Ala Thr Thr Thr Thr Gly Gly Cys Ala Ala Gly Ala 1 5 10 15 Thr Cys Ala Cys Cys Ala Gly Ala Cys Gly Gly Gly Ala Gly Thr Cys 20 25 30 Ala Gly Ala Gly Cys Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys Thr Cys 35 40 45 Ala Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Gly Gly Gly Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Gly Thr 65 70 75 80 Gly Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr Gly Ala Gly Ala Cys Cys 85 90 95 Ala Cys Gly Ala Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys Cys Thr Ala Cys Thr 100 105 110 Gly Cys Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Thr Gly Thr Cys Thr Gly Ala 115 120 125 Cys Thr Thr Cys Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly 130 135 140 Gly Gly Cys Cys Thr Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Cys 145 150 155 160 Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys Ala Ala 165 170 175 Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys 180 185 190 Thr Thr Cys Thr Ala Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Thr Cys Cys Cys 195 200 205 Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly 210 215 220 Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly 225 230 235 240 Gly Cys Cys Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Ala Ala Ala Cys 245 250 255 Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly 260 265 270 Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys 275 280 285 Gly Thr Gly Thr Gly Cys Cys Cys Cys 290 295 <210> 12 <211> 1341 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gly Cys Cys Cys Thr Cys Thr Ala Thr Gly Ala Cys Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Thr Ala Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Gly Ala Cys 20 25 30 Ala Gly Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly 35 40 45 Ala Ala Ala Gly Gly Cys Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr Cys Cys 50 55 60 Ala Gly Ala Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Cys 65 70 75 80 Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly 85 90 95 Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Ala Cys Thr Cys Gly Cys Thr Cys Ala 100 105 110 Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Cys Ala Gly Gly 115 120 125 Cys Thr Ala Cys Ala Thr Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys 130 135 140 Thr Ala Cys Gly Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Gly 145 150 155 160 Ala Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala 165 170 175 Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr Thr Thr Thr Gly Gly Cys 180 185 190 Ala Ala Gly Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Gly Ala Cys Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Gly Thr Cys Ala Gly Ala Gly Cys Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr 210 215 220 Gly Cys Thr Cys Ala Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Ala Ala Cys 225 230 235 240 Cys Cys Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys 245 250 255 Thr Cys Gly Thr Gly Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr Gly Ala 260 265 270 Gly Ala Cys Cys Ala Cys Gly Ala Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys Cys 275 280 285 Thr Ala Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Thr Gly Thr 290 295 300 Cys Thr Gly Ala Cys Thr Thr Cys Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys 305 310 315 320 Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly 325 330 335 Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Gly Ala Thr Cys Cys 340 345 350 Gly Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Gly Gly 355 360 365 Cys Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys 370 375 380 Thr Cys Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Thr Thr Cys Ala 385 390 395 400 Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr 405 410 415 Gly Gly Thr Gly Gly Cys Cys Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys 420 425 430 Ala Ala Ala Cys Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys 435 440 445 Thr Gly Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr Cys Ala Cys 450 455 460 Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Gly Cys Cys Cys Cys Ala Cys Gly 465 470 475 480 Thr Cys Cys Ala Ala Gly Cys Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Thr Cys 485 490 495 Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala 500 505 510 Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys Cys Cys Thr 515 520 525 Cys Gly Gly Gly Ala Gly Thr Cys Gly Cys Thr Gly Cys Gly Gly Cys 530 535 540 Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Gly 545 550 555 560 Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Thr Thr Gly Gly Cys 565 570 575 Gly Ala Gly Gly Thr Gly Thr Gly Gly Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ala 580 585 590 Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Cys 595 600 605 Cys Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Ala 610 615 620 Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys Ala 625 630 635 640 Cys Gly Ala Thr Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys 645 650 655 Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Cys 660 665 670 Cys Ala Gly Gly Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Cys 675 680 685 Thr Gly Ala Gly Gly Cys Ala Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly Cys Thr 690 695 700 Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Thr Thr Gly Thr Ala Thr Gly Cys Thr 705 710 715 720 Gly Thr Gly Gly Thr Thr Thr Cys Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Cys 725 730 735 Cys Cys Ala Thr Thr Thr Ala Cys Ala Thr Cys Gly Thr Cys Ala Cys 740 745 750 Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys Ala Ala Gly 755 760 765 Gly Gly Gly Ala Gly Thr Thr Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr 770 775 780 Thr Thr Cys Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala Cys 785 790 795 800 Ala Gly Gly Cys Ala Ala Gly Thr Ala Cys Cys Thr Gly Cys Gly Gly 805 810 815 Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly 820 825 830 Ala Cys Ala Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly Ala Thr 835 840 845 Cys Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Cys Ala Thr Gly Gly Cys Gly 850 855 860 Thr Ala Cys Gly Thr Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly Ala Thr Gly Ala 865 870 875 880 Ala Cys Thr Ala Cys Gly Thr Cys Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Ala 885 890 895 Cys Cys Thr Thr Cys Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala Ala Cys 900 905 910 Ala Thr Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala 915 920 925 Ala Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Thr Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr 930 935 940 Gly Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Thr Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly 945 950 955 960 Gly Cys Thr Cys Gly Gly Cys Thr Cys Ala Thr Thr Gly Ala Ala Gly 965 970 975 Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Cys Gly Gly Cys 980 985 990 Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys Cys Ala Ala Ala 995 1000 1005 Thr Thr Cys Cys Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Gly Thr Gly Gly Ala 1010 1015 1020 Cys Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys 1025 1030 1035 1040 Cys Cys Thr Cys Thr Ala Thr Gly Gly Cys Cys Gly Cys Thr Thr Cys 1045 1050 1055 Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Gly Thr Cys Gly Gly Ala Cys Gly 1060 1065 1070 Thr Gly Thr Gly Gly Thr Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Gly Ala Thr 1075 1080 1085 Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr Cys 1090 1095 1100 Ala Cys Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys Gly Gly Gly 1105 1110 1115 1120 Thr Gly Cys Cys Cys Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Ala Thr 1125 1130 1135 Gly Gly Thr Gly Ala Ala Cys Cys Gly Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly 1140 1145 1150 Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Cys 1155 1160 1165 Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Cys Cys Gly Gly Ala Thr Gly Cys Cys 1170 1175 1180 Cys Thr Gly Cys Cys Cys Gly Cys Cys Gly Gly Ala Gly Thr Gly Thr 1185 1190 1195 1200 Cys Cys Cys Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Cys Gly 1205 1210 1215 Ala Cys Cys Thr Cys Ala Thr Gly Thr Gly Cys Cys Ala Gly Thr Gly 1220 1225 1230 Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Cys Cys Thr 1235 1240 1245 Gly Ala Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Ala Cys Cys Thr 1250 1255 1260 Thr Cys Gly Ala Gly Thr Ala Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys 1265 1270 1275 1280 Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys 1285 1290 1295 Thr Thr Cys Ala Cys Gly Thr Cys Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Cys 1300 1305 1310 Cys Cys Cys Ala Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly 1315 1320 1325 Gly Gly Ala Gly Ala Ala Cys Cys Thr Cys Thr Ala Gly 1330 1335 1340 <210> 13 <211> 747 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Thr Gly Gly Gly Thr Ala Gly Cys Ala Ala Cys Ala Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Thr Gly Cys 20 25 30 Cys Ala Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly Cys Cys Gly Cys 35 40 45 Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Cys Cys Gly Cys Cys Gly 50 55 60 Ala Gly Ala Ala Cys Gly Thr Gly Cys Ala Cys Gly Gly Cys Gly Cys 65 70 75 80 Thr Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Cys Thr Thr Thr Cys 85 90 95 Cys Cys Cys Gly Cys Cys Thr Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Cys Cys 100 105 110 Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys 115 120 125 Gly Gly Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys 130 135 140 Gly Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr 145 150 155 160 Thr Cys Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys Gly Gly Cys Cys Gly Cys 165 170 175 Cys Gly Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys 180 185 190 Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr Cys Ala Ala Cys Thr Cys Cys Thr 195 200 205 Cys Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Ala Cys Cys Thr Cys 210 215 220 Cys Cys Cys Gly Cys Ala Gly Ala Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Cys 225 230 235 240 Cys Cys Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly 245 250 255 Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Gly Thr Gly Gly Cys 260 265 270 Cys Cys Thr Cys Thr Ala Thr Gly Ala Cys Thr Ala Thr Gly Ala Gly 275 280 285 Thr Cys Thr Ala Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Gly Ala Cys Ala Gly 290 295 300 Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala 305 310 315 320 Ala Gly Gly Cys Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly 325 330 335 Ala Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Cys Ala Gly 340 345 350 Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr 355 360 365 Gly Gly Cys Cys Cys Ala Cys Thr Cys Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys 370 375 380 Ala Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Thr 385 390 395 400 Ala Cys Ala Thr Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Thr Ala 405 410 415 Cys Gly Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Cys 420 425 430 Thr Cys Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Gly 435 440 445 Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr Thr Thr Thr Gly Gly Cys Ala Ala 450 455 460 Gly Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Gly Ala Cys Gly Gly Gly Ala Gly 465 470 475 480 Thr Cys Ala Gly Ala Gly Cys Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys 485 490 495 Thr Cys Ala Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Ala Ala Cys Cys Cys 500 505 510 Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys 515 520 525 Gly Thr Gly Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr Gly Ala Gly Ala 530 535 540 Cys Cys Ala Cys Gly Ala Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys Cys Thr Ala 545 550 555 560 Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Thr Gly Thr Cys Thr 565 570 575 Gly Ala Cys Thr Thr Cys Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala 580 585 590 Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Ala Ala 595 600 605 Gly Cys Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys 610 615 620 Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly 625 630 635 640 Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Thr Cys 645 650 655 Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Cys 660 665 670 Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly 675 680 685 Thr Gly Gly Cys Cys Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Ala Ala 690 695 700 Ala Cys Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys Thr Gly 705 710 715 720 Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala 725 730 735 Cys Cys Gly Thr Gly Thr Gly Cys Cys Cys Cys 740 745 <210> 14 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gly Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Gly Thr Thr Cys Ala 1 5 10 15 Cys Gly Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala 20 25 <210> 15 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Thr Thr Gly Cys Cys Gly Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Ala Ala Cys 1 5 10 15 Thr Cys Ala Thr Thr Gly Thr Cys Thr Thr Cys 20 25 <210> 16 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Cys Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Thr Thr Cys Cys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Cys Cys Gly Gly 20 <210> 17 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Cys Cys Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Cys Thr Cys Gly 20 <210> 18 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antp-Caax-Cter <400> 18 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Cys Val Ile Met Gly Asp Cys Arg Lys Lys Gln Asp Thr Pro His 20 25 30

Claims (18)

1) 피검체로부터 수득한 세포에 피검물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 세포에서 TM4SF5(Transmembrane 4 L6 family member 5) 단백질과 c-Src 단백질의 결합 및 세포의 스페로이드(spheroid) 형성 및 성장을 억제하는 피검물질을 선별하는 단계;
를 포함하는 간암, 식도암, 대장암, 유방암, 유두암, 기관지암, 폐암, 췌장암, 위암 및 연부조직육종(soft tissue sarcoma)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 암의 치료 또는 전이 억제 후보물질 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 TM4SF5 단백질과 c-Src 단백질의 결합 억제는 c-Src 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
삭제
삭제
1) 피검체로부터 수득한 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에서 TM4SF5 단백질과 c-Src 단백질의 결합을 억제하고, p27Kip1, Twist1 및 Bmi-1으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현을 억제하며, CD24를 발현시키는 피검물질을 선별하는 단계; 및
3) 혈액 내 순환하는 암세포로서의 암줄기세포 및 순환줄기세포의 특성을 가져 전이암을 형성하는 것 또는 혈액 내 순환하는 암세포의 존재를 저해시키는 피검물질을 선별하는 단계;
를 포함하는 간암, 식도암, 대장암, 유방암, 유두암, 기관지암, 폐암, 췌장암, 위암 및 연부조직육종(soft tissue sarcoma)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 암의 치료 또는 전이 억제 후보물질 스크리닝 방법.
제 5항에 있어서, 상기 단계 2)의 TM4SF5 단백질과 c-Src 단백질의 결합 억제는 c-Src 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
KR1020140135813A 2013-10-08 2014-10-08 TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료, 또는 암 전이 억제용 조성물 KR101722534B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130120164 2013-10-08
KR20130120164 2013-10-08

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150041751A KR20150041751A (ko) 2015-04-17
KR101722534B1 true KR101722534B1 (ko) 2017-04-04

Family

ID=53035104

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140135813A KR101722534B1 (ko) 2013-10-08 2014-10-08 TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료, 또는 암 전이 억제용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101722534B1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023535280A (ja) * 2020-07-20 2023-08-17 エフエヌシーティー バイオテック、インコーポレイテッド 大腸癌転移阻害剤をスクリーニングする方法
KR102549771B1 (ko) * 2020-07-20 2023-07-03 주식회사 에프엔씨티바이오텍 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법
CN116178358B (zh) * 2022-11-04 2024-04-19 济南大学 一种靶向c-Src激酶SH3结构域的化合物及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLOOD, 19 FEBRUARY 2009 VOLUME 113, NUMBER 8, Pages 1845-1855*
Choi Yoonju 외 1인, ‘[P4-62] The COOH-terminus of Tetraspan TM4SF5 Regulates s-Src to form Invasive Protrusions via Try845 Phosphorylation of EGFR’, 2011 추계국제학술대회(대한약학회), 포스터 발표, 2011.11.09.*
NCBI Reference Sequence: NP_003954.2, 2012.11.24.*
NCBI Reference Sequence: NP_198291.1, 2012.11.25.*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150041751A (ko) 2015-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9226952B2 (en) Na/K-ATPase-derived peptide Src inhibitors and ouabain antagonists and uses thereof
US7223733B2 (en) Modulation of TRIP-Br function and method of treating proliferative disorders
Lai et al. Ror2-Src signaling in metastasis of mouse melanoma cells is inhibited by NRAGE
Chastre et al. TRIP6, a novel molecular partner of the MAGI‐1 scaffolding molecule, promotes invasiveness
Pang et al. Apoptotic role of TGF-β mediated by Smad4 mitochondria translocation and cytochrome c oxidase subunit II interaction
KR101722534B1 (ko) TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료, 또는 암 전이 억제용 조성물
WO2015181526A1 (en) Senescent cell biomarkers
KR101198714B1 (ko) Ｃ１２ｏｒｆ５９ 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR102194025B1 (ko) CD44v6에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
Vickers et al. Ligand activation of alternatively spliced fibroblast growth factor receptor-1 modulates pancreatic adenocarcinoma cell malignancy
Yan et al. High-risk human papillomavirus type 18 E7 caused p27 elevation and cytoplasmic localization
KR101966246B1 (ko) FCHo1 조절제를 포함하는 세포 분열 조절용 조성물 및 이를 이용한 세포 분열 조절 방법
KR101771070B1 (ko) Mrs와 cdk4의 결합을 저해하는 항암제 스크리닝 방법
Kedlaya et al. Interactions between GIPC–APPL and GIPC–TRP1 regulate melanosomal protein trafficking and melanogenesis in human melanocytes
CN110563830B (zh) Anxa1衍生多肽及其应用
BRPI0707272A2 (pt) uso de um fragmento de ácido nucleico de seq id no: 1 ou 2, ou de uma variante de seq id no: 1 ou 2, fragmento de ácido nucleico de senso e/ou anti-senso de seq id no: 1 ou 2, ou de uma variante de seq id no: 1 ou 2, composição, proteìna, método para diagnosticar cánceres de origem neuroectodermal, e, kit diagnóstico
US20130157959A1 (en) Use of hades as tumor suppressor target
TW202233246A (zh) 含有抗癌劑之粒線體及其用途
US9617304B2 (en) Pharmaceutical composition containing an endocytic motif and protein transduction domains for preventing or treating cancer
EP3280801B1 (en) Internalisation of human htra1 and cargo proteins into mammalian cells
KR102079546B1 (ko) 종양 단백질 ｃｉｐ２ａ의 발현에 의한 섬모형성 조절제의 스크리닝 방법 및 그의 용도
KR101419999B1 (ko) Ａｋｔ 음성 조절제로서의 Ｈａｄｅｓ의 용도
KR101591378B1 (ko) Ddias 및 stat3의 상호작용을 이용한 암 치료제 스크리닝 방법
US11851475B2 (en) Membrane-type metalloprotease inhibitory protein and pharmaceutical and pharmaceutical composition containing same, and respective uses thereof
Liu Eukaryotic Initiation Factor 2-associated glycoprotein P67 inhibits the tumorigenicity of Alveolar Rhabdomyosarcoma (ARMS) and involves its differentiation and migration

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200302

Year of fee payment: 4