KR101591378B1

KR101591378B1 - Ddias 및 stat3의 상호작용을 이용한 암 치료제 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR101591378B1
Application number: KR1020140105776A
Authority: KR
Inventors: 원미선; 임주영; 김보경; 반현승; 정경숙
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2014-08-14
Filing date: 2014-08-14
Publication date: 2016-02-03

Abstract

본 발명은 DDIAS(DNA damage-induced apoptotic suppressor)와 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)의 상호작용을 억제함으로써 STAT3의 분해를 촉진하는 항암 물질의 발굴에 유용하게 사용할 수 있는 스크리닝 방법에 관한 것으로, DDIAS가 암유전자인 STAT3과 상호작용하여 STAT3을 안정화시킴으로써 암 증식 및 암의 악성화에 관여하며, DDIAS의 낙다운(knockdown)이 STAT3의 안정성을 감소시킴을 확인하였고, DDIAS 낙다운 세포에서 STAT3의 유비퀴틴화(ubiquitination)가 증가하여 STAT3이 분해되고, STAT3 타겟 단백질의 발현이 감소하여 폐암세포주의 세포성장이 저해되는 것을 확인하였으며, 효모 이중혼성(yeast two-hybrid) 분석을 통해 DDIAS의 C-말단과 STAT3의 C-말단이 서로 상호작용함을 확인하였으므로, DDIAS와 STAT3 상호작용을 억제하여 항종양 효능을 나타내는 암 치료제 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

DDIAS 및 STAT3의 상호작용을 이용한 암 치료제 스크리닝 방법{A screening method for therapeutic agent of cancer using of interaction between DDIAS and STAT3}

본 발명은 DDIAS(DNA damage-induced apoptotic suppressor) C-말단 단편과 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) C-말단 단편의 상호작용을 억제하는 암 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

최근, 전 세계적으로 난치병인 암의 생성 및 치료와 관련된 유전자의 기능 연구를 통해 치료용 표적을 발굴하고 이들을 진단 및 치료제 개발에 이용하기 위한 치열한 경쟁이 불붙고 있다. 게놈 연구의 활성화와 함께 인간 유전자 DNA 칩 또는 프로테옴 분석 연구가 활발하게 이루어지고 암과 관련된 유전자가 대량 발굴됨에 따라 많은 유전자들의 목록과 관련 데이터베이스는 구축되어 있으나 대부분 이들 유전자들에 대한 세포 내에서의 구체적 생물학적 기능 및 암 관련성은 아직 연구되지 않았거나 불확실하여 실제 암 관련성 또는 진단 및 표적 유전자로 활용하기에 상당한 어려움이 있다.

난치성 암 치료를 위한 글로벌 신약 개발을 하기 위해서 많은 연구가 진행되고 있는 기존 타겟 및 작용 기전에 대해서는 비교적 경쟁력이 약하여 혁신 신약 개발이 어려움이 있으며 틈새시장을 공략하는 것이 유리하다. 따라서, 치료 타겟이 될 수 있는 주요한 신규 타겟은 높은 가치를 가지고 있으며 혁신 신약을 개발할 수 있도록 필요한 지원을 하여 유전자 기능을 비롯한 전사 기전 등 분석 연구가 진행되어야 한다.

DDIAS(GenBank 등록번호: NM_145018, FLJ25416, FLJ13936, UniProtKB/TrEMBL entry Q8IXT1)는 mouse Noxin의 상동(homolog) 단백질로 인간 Noxin 유전자 hNoxin으로 보고되었다. 최근, 인간 Noxin이 DNA가 손상된 세포의 세포사멸을 억제한다는 사실에 근거하여 DNA 손상-유도 세포사멸 억제 유전자(DDIAS, DNA damage-induced apoptotic suppressor)로 명명되었다(Human Noxin is an anti-apoptotic protein in response to DNA damage of A549 non-small cell lung carcinoma. Int J Cancer. 2014 Jun 1;134(11):2595-2604). 인간 Noxin(DDIAS)이 낙다운(knockdown) 되면 정상세포주에는 영향이 없으나 암세포주에서는 세포사멸을 유도한다. DNA 손상에 의해 세포 사멸을 유도하는 항암제와 DDIAS를 낙다운하면 암세포 성장 억제의 시너지 효과를 나타내었다. DDIAS 단백질은 p53/TP53 비의존적으로 G1기 또는 초기 S기에서 세포주기 억제(cell cycle arrest)를 유도한다. 그러나, DDIAS의 암과 연관된 기능은 잘 알려져 있지 않다.

STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)은 매우 안정적인(stable) 단백질로 다양한 암의 성질을 나타내는 대표적인 암유전자(oncogene)이다. 난치성 암의 주요 원인 유전자인 STAT3을 타겟으로 하는 항암제 개발이 오랫동안 진행되어 왔으며 지금까지 개발 중인 STAT3 저해제는 (1)JAK receptor에 STAT3의 결합을 방해하는 펩타이드, (2)STAT3의 인산화 저해제, (3)STAT3의 이합체화 반응(dimerization) 억제제, (4)STAT3의 핵으로 이동 억제제 및 (5)STAT3이 타겟 유전자의 프로모터에의 결합을 억제하는 것을 표적으로 하였다.

이에 본 발명자들은 암 치료를 위한 물질을 스크리닝하는 방법을 찾기 위해 노력한 결과, DDIAS가 암유전자인 STAT3과 상호작용하여 STAT3을 안정화시킴으로써 암 증식 및 암의 악성화에 관여하며, DDIAS의 낙다운이 STAT3의 안정성을 감소시킴을 확인하였다. DDIAS 낙다운 세포에서 STAT3의 유비퀴틴화(ubiquitination)가 증가하여 STAT3이 분해되고, STAT3 타겟 단백질의 발현이 감소하여 폐암세포주의 세포성장이 저해되는 것을 확인하였으며, 면역침강법(immunoprecipitation, IP)을 통해 DDIAS의 C-말단과 STAT3의 C-말단이 서로 상호작용함을 확인하였으므로, DDIAS와 STAT3 상호작용을 억제하여 항종양 효능을 나타내는 암 치료제 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은

1) 실험군으로 암 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 피검물질이 처리된 세포주에서 DDIAS(DNA damage-induced apoptotic suppressor) 및 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)의 결합수준을 측정하는 단계;

3) 단계 2)의 DDIAS 및 STAT3 단백질의 결합수준을 대조군과 비교하여 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료제 스크리닝 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 실험군으로 암 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

3) 단계 2)의 DDIAS 및 STAT3 단백질의 결합수준을 대조군과 비교하여 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 시험관내(In vitro)에서 DDIAS 및 STAT3에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 DDIAS 및 STAT3의 결합수준을 측정하는 단계;

3) 단계 2)의 DDIAS 및 STAT3 단백질의 결합수준을 대조군과 비교하여 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료제 스크리닝 방법.

또한, 본 발명은 DDIAS 및 STAT3 결합 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 DDIAS(DNA damage-induced apoptotic suppressor)와 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)의 상호작용을 억제함으로써 STAT3의 분해를 촉진하는 암 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로, DDIAS가 암유전자인 STAT3과 상호작용하여 STAT3을 안정화시킴으로써 암 증식 및 암의 악성화에 관여하며, DDIAS의 낙다운(knockdown)이 STAT3의 안정성을 감소시킴을 확인하였고, DDIAS 낙다운 세포에서 STAT3의 유비퀴틴화(ubiquitination)가 증가하여 STAT3이 분해되고, STAT3 타겟 단백질의 발현이 감소하여 폐암세포주의 세포성장이 저해되는 것을 확인하였으며, 효모 이중혼성(yeast two-hybrid) 분석을 통해 DDIAS의 C-말단과 STAT3의 C-말단이 서로 상호작용함을 확인하였으므로, DDIAS와 STAT3 상호작용을 억제하여 항종양 효능을 나타내는 암 치료제 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 DDIAS(서열번호 : 1)의 낙다운(knockdown)에 의한 폐암세포주의 성장억제 효과를 나타낸 도이다.
도 2는 폐암세포주에서 DDIAS의 낙다운에 의한 STAT3의 변화를 웨스턴블롯팅(western blotting, WB)과 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 확인한 결과를 나타내며, 총 STAT3 단백질(서열번호 : 2)과 인산화(타이로신 705) STAT3의 감소를 나타낸 도이다.
도 3은 폐암세포주에서 DDIAS의 과발현(overexpression)에 의한 폐암세포주의 총 STAT3과 인산화 STAT3의 증가를 나타낸 도이다.
도 4는 NCI-H1703 세포에서 DDIAS의 낙다운과 과발현에 의한 STAT3 타겟 단백질의 양 변화를 나타낸 도이다.
도 5는 DDIAS의 낙다운에 의한 세포 성장억제 효과가 STAT3의 과발현에 의해 극복됨을 나타낸 도이다.
도 6은 DDIAS를 낙다운한 세포에 STAT3 과발현으로 타겟 단백질의 양이 증가함을 나타낸 도이다.
도 7a는 DDIAS의 낙다운에 의한 STAT3 단백질의 분해가 빨라짐으로써 안정성이 감소함을 나타낸 도이다.
도 7b는 DDIAS의 낙다운에 의한 STAT3 단백질의 반감기가 감소함을 나타낸 도이다.
도 8은 프로테아좀 억제제가 DDIAS의 낙다운에 의한 STAT3 단백질의 분해를 억제함을 나타낸 도이다:
E : epoxomicin;
L : lactacystin;
M : MG132.
도 9는 DDIAS의 낙다운에 의한 STAT3 단백질의 유비키틴화가 증가함을 나타낸 도이다.
도 10a 내지 b는 DDIAS와 STAT3의 결합을 나타낸 도이다.
도 11a는 STAT3 단백질의 결실돌연변이주들의 모식도이다:
F : 1-770 aa(amino acid);
N : 1-321 aa;
M : 321-688 aa;
C : 583-770 aa(서열번호 : 4).
도 11b는 DDIAS와 STAT3의 결합 위치를 면역침강법을 통해 확인하여 나타낸 도이다:
F : 1-770 aa;
N : 1-321 aa;
M : 321-688 aa;
C : 583-770 aa.
도 12a는 DDIAS 단백질의 결실돌연변이주들의 모식도이다.
N : 1-401 aa;
M : 401-601 aa;
C : 601-998 aa(서열번호 : 3).
도 12b는 STAT3과 DDIAS의 결합 위치를 면역침강법을 통해 확인하여 나타낸 도이다.
도 13은 NCI-H1703 세포를 이용한 종양 이식 동물모델에서 DDIAS siRNA를 투여하였을 때 종양 부피 변화를 나타낸 도이다.
도 14는 NCI-H1703 세포를 이용한 종양 이식 동물모델에서 DDIAS siRNA에 의한 DDIAS mRNA 양의 감소를 확인하여 나타낸 도이다.
도 15는 NCI-H1703 세포를 이용한 종양 이식 동물모델에서 DDIAS siRNA에 의한 STAT3 단백질과 타겟 단백질의 감소를 확인하여 나타낸 도이다.
도 16은 DDIAS의 C-말단과 STAT3의 C-말단간의 상호작용을 효모 이중혼성(yeast two-hybrid) 분석을 이용하여 확인한 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

1) 실험군으로 암 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 피검물질이 처리된 세포주에서 DDIAS(DNA damage-induced apoptotic suppressor) 및 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)의 결합수준을 측정하는 단계; 및

상기 단계 1)의 암 세포주는 간암 세포주, 대장암 세포주, 자궁경부암 세포주, 신장암 세포주, 위암 세포주, 전립선암 세포주, 유방암 세포주, 뇌종양 세포주, 폐암 세포주, 자궁암 세포주, 결장암 세포주, 방광암 세포주, 혈액암 세포주 및 췌장암 세포주로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 2)의 DDIAS는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 것이 바람직하고, STAT3은 서열번호 2의 mouse STAT3 아미노산 서열로 구성된 것이 바람직하며, 760번 아미노산 아스파르트산(aspartic acid, D)이 글루탐산(glutamic acid, E)으로 바뀐 서열은 human STAT3 서열인 것이 바람직하다.

상기 단계 2)의 DDIAS 및 STAT3의 결합은 DDIAS의 C-말단과 STAT3의 C-말단이 결합하는 것이 바람직하고, 상기 DDIAS의 C-말단은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 것이 바람직하며, 상기 STAT3의 C-말단은 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 DDIAS는 STAT3과 결합하여 STAT3의 유비퀴틴화(ubiquitination)를 억제시키고, 상기 DDIAS는 STAT3과 결합하여 STAT3 타겟 단백질의 발현을 증가시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 3)의 결합수준은 면역침전법(immunoprecipitation), 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western Blotting), tag-단백질 pull down 분석, 단백질 칩(Protein Chip), 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET), 이분자 형광 상보(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC) 및 효모 이중혼성(Yeast two-hybrid, Y2H)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 3)의 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 DDIAS(서열번호 : 1)의 발현 억제로 인한 암세포의 성장 억제 기전을 알아보기 위하여 DDIAS이 낙다운(knockdown)된 암세포에서 성장 변화를 확인한 결과, DDIAS 발현을 억제하였을 때 폐암세포주의 세포성장을 억제함을 확인하였고(도 1 참조), DDIAS가 낙다운된 암세포에서 성장에 관여하는 인자들의 변화를 확인한 결과, DDIAS 낙다운이 STAT3 mRNA 수준의 변화 없이 STAT3 인산화와 총 단백질의 양을 감소시킴을 확인하였다(도 2 참조).

또한, 본 발명자들은 DDIAS 과발현이 STAT3(서열번호 : 2) 발현을 변화시키는지 확인한 결과, Flag-DDIAS를 과발현한 폐암세포주에서 STAT3과 인산화된 STAT3이 현저히 증가함을 확인하였고(도 3 참조), DDIAS를 낙다운한 세포에서 STAT3 타겟 유전자들의 발현 변화를 확인한 결과, DDIAS를 낙다운한 NCI-H1703 세포에서 STAT3이 감소한 바와 같이, STAT3 타겟 단백질인 Survivin, Bcl-xL, Bcl2의 양이 현저히 감소하는 것을 확인하였으며, DDIAS 과발현에 의한 STAT3 타겟 유전자들의 발현을 확인한 결과, Flag-DDIAS을 과발현한 NCI-H1703 세포에서 STAT3이 증가되고 STAT3 타겟 단백질인 Survivin, Bcl-xL, Bcl2의 양이 현저히 증가하는 것을 확인하였다(도 4 참조).

또한, 본 발명자들은 DDIAS를 낙다운한 세포에 STAT3을 과발현한 후, 세포 성장을 확인한 결과, DDIAS 낙다운된 세포의 성장이 억제됨을 재확인하였고, STAT3 과발현이 이러한 세포 성장 억제 현상을 저해하는 것을 확인하였고(도 5 참조), DDIAS를 낙다운한 세포에 STAT3을 과발현한 후, STAT3 타겟 단백질의 발현을 확인한 결과, DDIAS 낙다운으로 인해 감소했던 STAT3, survivin, Bcl-xL의 양이 HA-STAT3을 과발현한 세포에서 STAT3 뿐만 아니라 STAT3 타겟 단백질인 Survivin과 Bcl-xL의 양도 현저히 증가하는 것을 확인하였으며(도 6 참조), DDIAS를 낙다운한 세포에서 STAT3 단백질 분해 정도를 확인한 결과, DDIAS를 낙다운한 NCI-H1703 세포에서 STAT3 단백질의 분해가 빠른 시간에 이루어지고 반감기가 감소하는 것을 확인하였다(도 7a 내지 도 7b).

또한, 본 발명자들은 DDIAS를 낙다운한 세포에서 STAT3 단백질의 유비키틴화 정도를 확인한 결과, DDIAS를 낙다운한 NCI-H1703 세포에서 감소한 STAT3 단백질의 양이 프로테아솜 억제제들을 처리한 샘플에서 증가하는 것을 확인하였고(도 8 참조), DDIAS를 낙다운한 NCI-H1703 세포에서 STAT3 단백질의 유비키틴화(ubiquitination)가 증가함을 확인하였으며(도 9 참조), DDIAS와 STAT3의 상호 결합을 확인한 결과, Flag-DDIAS로 면역침강하면 STAT3이 결합하는 것을 확인하였고(도 10a 참조), STAT3 항체로 면역침강하면 Flag-DDIAS가 결합하는 것을 확인하였다(도 10b 참조).

또한, 본 발명자들은 DDIAS와 결합하는 STAT3 위치를 확인한 결과, HA-STAT3로 면역침강하면 STAT3의 전체 길이와 C-말단(서열번호 : 4)이 DDIAS와 결합하는 것을 확인하였고(도 11a 내지 도 11b 참조), Flag-DDIAS로 면역침강하면 DDIAS의 전체 길이와 C-말단(서열번호 : 3)이 STAT3과 결합하는 것을 확인하였다(도 12a 내지 도 12b 참조).

또한, 본 발명자들은 동물 모델에서 DDIAS 낙다운의 항암 효과를 확인한 결과, DDIAS siRNA의 종양 내 반복 투여대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 종양성장 억제를 확인하였고(도 13 참조), 종양 내 투여한 DDIAS siRNA에 의한 낙다운 정도를 확인한 결과, DDIAS siRNA 처리한 절편에서 염색반응이 현저히 감소함을 확인하였으며(도 14 참조), DDIAS 낙다운에 의한 항암 기전을 확인한 결과, DDIAS siRNA를 처리한 조직에서 STAT3과 타겟 단백질인 Survivin과 Bcl-xL의 양이 현저히 감소한 것을 확인하였다(도 15 참조).

또한, 본 발명자들은 효모 이중혼성 분석을 위한 유전자를 클로닝하여 확인한 결과, STAT3 C-말단과 DDIAS C-말단이 상호작용하는 것을 확인하였다(도 16 참조).

따라서, 본 발명의 DDIAS가 암유전자인 STAT3과 상호작용하여 STAT3을 안정화시킴으로써 암 증식 및 암의 악성화에 관여하며, DDIAS의 낙다운이 STAT3의 안정성을 감소시킴을 확인하였고, DDIAS 낙다운 세포에서 STAT3의 유비퀴틴화가 증가하여 STAT3이 분해되고, STAT3 타겟 단백질의 발현이 감소하여 폐암세포주의 세포성장이 저해되는 것을 확인하였으며, DDIAS의 C-말단과 STAT3의 C-말단이 서로 상호작용함을 확인하였으므로, DDIAS와 STAT3 상호작용을 억제하여 항종양 효능을 나타내는 암 치료제 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은

2) 단계 1)의 DDIAS 및 STAT3의 결합수준을 측정하는 단계; 및

상기 단계 1)의 DDIAS는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 것이 바람직하고, STAT3은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 DDIAS는 STAT3과 결합하여 STAT3의 유비퀴틴화를 억제시키고, 상기 DDIAS는 STAT3과 결합하여 STAT3 타겟 단백질의 발현을 증가시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 2)의 결합수준은 면역침전법, 효소면역분석법, 웨스턴 블롯, tag-단백질 pull down 분석, 단백질 칩, 형광 공명 에너지 전이, 이분자 형광 상보 및 효모 이중혼성으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 DDIAS가 암유전자인 STAT3과 상호작용하여 STAT3을 안정화시킴으로써 암 증식 및 암의 악성화에 관여하며, DDIAS의 낙다운이 STAT3의 안정성을 감소시킴을 확인하였고, DDIAS 낙다운 세포에서 STAT3의 유비퀴틴화가 증가하여 STAT3이 분해되고, STAT3 타겟 단백질의 발현이 감소하여 폐암세포주의 세포성장이 저해되는 것을 확인하였으며, DDIAS의 C-말단과 STAT3의 C-말단이 서로 상호작용함을 확인하였으므로, 시험관내에서 DDIAS와 STAT3 상호작용을 억제하여 항종양 효능을 나타내는 암 치료제 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 DDIAS 및 STAT3 결합 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 DDIAS는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하고, STAT3은 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 DDIAS 및 STAT3의 결합은 DDIAS의 C-말단과 STAT3의 C-말단이 결합하는 것이 바람직하고, 상기 DDIAS의 C-말단은 서열번호 3으로 기재되는 것이 바람직하며, 상기 STAT3의 C-말단은 서열번호 4로 기재되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 결합 억제제는 DDIAS 또는 STAT3의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 또는 DDIAS 또는 STAT3 단백질에 상보적으로 결합하는 항체, 화합물(small molecule) 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 결합 억제는 웨스턴 블롯, tag-단백질 pull down 분석, 단백질 칩, 형광 공명 에너지 전이, 이분자 형광 상보로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 DDIAS가 암유전자인 STAT3과 상호작용하여 STAT3을 안정화시킴으로써 암 증식 및 암의 악성화에 관여하며, DDIAS의 낙다운이 STAT3의 안정성을 감소시킴을 확인하였고, DDIAS 낙다운 세포에서 STAT3의 유비퀴틴화가 증가하여 STAT3이 분해되고, STAT3 타겟 단백질의 발현이 감소하여 폐암세포주의 세포성장이 저해되는 것을 확인하였으며, DDIAS의 C-말단과 STAT3의 C-말단이 서로 상호작용함을 확인하였으므로, DDIAS와 STAT3 결합 억제제를 암 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 생지황, 복령, 인삼 및 꿀의 혼합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 상기 조성물은 1일 0.0001 내지 1 g/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 200 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은

1) DDIAS 유전자의 C-말단 및 리포터 유전자의 프로모터에 결합하는 DNA 결합 도메인(DNA-binding domain, DNA-BD)을 융합시킨 이중혼성 벡터를 제조하는 단계;

2) STAT3 유전자의 C-말단 및 리포터 유전자의 전사를 돕는 전사 활성 도메인(transcription activation domain, DNA-AD)을 융합시킨 이중혼성 벡터를 제조하는 단계;

3) 상기 단계 1) 및 단계 2)의 벡터를 동시에 효모에 형질전환하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 형질전환된 효모를 배양하는 단계; 및

5) 피검약물을 형질전환된 효모에 처리한 후, 전사리포터의 활성을 분석하는 단계를 포함하는 암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 단계 1에 있어서, BamHI과 PstI 제한효소를 이용하여 발현벡터 pGBKT7에 존재하는 클로닝 사이트에 DDIAS C-말단과 GAL4의 DNA 결합 도메인(DNA Binding Domain: DNA-BD)을 융합시킨 이중혼성 벡터를 만든다. 바람직한 실시예로서, pGBKT7-DDIAS-C가 있다.

상기 단계 2에 있어서, EcoRI과 XhoI 제한효소를 이용하여 발현벡터 pGADT7에 존재하는 클로닝 사이트에 STAT3 C-말단과 GAL4의 전사활성 도메인(Transcription Activation Domain: DNA-AD)을 융합시킨 이중혼성 벡터를 만든다. 바람직한 실시예로서, pGADT7-STAT3-C가 있다.

상기 전사리포터는 β-갈락토시다제(β-galactosidase), 루시퍼라제(luciferase), GFP(green fluorescent protein) 및 CAT (thioredoxin- chloramphenicol acethyl transferase)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 단계 1)과 단계 2)에서 제조된 효모 이중혼성 발현벡터를 효모에 형질전환시킨 형질전환 세포주를 제조하였다. 바람직한 실시예로서, 본 발명자들은 상기에서 제조된 이중혼성 벡터인 pGBKT7-DDIAS-C와 pGADT7-STAT3-C와 음성대조군 벡터인 pGBKT7과 pGADT7, 양성대조군 벡터인 pGBKT7-PTB와 pGADT7-PTB 쌍을 효모에 동시에 도입시켜 형질전환시켰다.

상기 단계 4)에 있어서, 시료 준비 단계에서 형질전환된 효모세포를 트립토판과 루이신이 결핍된 SD(synthetic dropout) 한천 배지에서 배양한 후 선별된 형질전환 효모를 SD 제한 배지에 놓인 여과지에서 배양하였다. 본 발명에서는 검사하고자 하는 두 융합 단백질의 클론이 들어있는 효모를 한꺼번에 배양하여 액체 질소에 넣어 세포벽을 파괴시킨 후 실험에 사용하였다.

상기 단계 5)에 있어서, 약물 처리 후 약물을 제거하고 베타갈락토시다제 효소의 기질을 사용하여 효소활성을 측정하였고 대조군과 비교하여 pGBKT7-DDIAS-C와 pGADT7-STAT3-C의 상호작용의 저해로 인한 효소 활성을 저해시킨 약물을 찾아낼 수 있도록 하였다.

상기 단계 5)의 분석은 ADE 또는 HIS가 없는 배지에서 형질전환된 균주가 자라는 것을 관찰하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 DDIAS가 암유전자인 STAT3과 상호작용하여 STAT3을 안정화시킴으로써 암 증식 및 암의 악성화에 관여하며, 효모 이중혼성 분석법을 사용하여 DDIAS C-말단과 리포터 유전자의 프로모터에 결합하는 DNA 결합 도메인(GAL4BD)을 융합시킨 이중혼성 벡터인 pGBKT7-DDIAS-C를 제작하고, STAT3 C-말단과 리포터 유전자의 전사를 돕는 전사 활성 도메인(GAL4AD)을 융합시킨 이중혼성 벡터인 pGADT7-STAT3-C를 제작하여, 이를 효모에 동시에 형질 전환하여 배양한 후, DDIAS C-말단과 STAT3 C-말단이 상호작용하는 것을 확인하였으므로, 상기 효모 이중혼성 분석법을 DDIAS 단백질과 STAT3 단백질의 상호작용을 억제하는 약물을 스크리닝하여 이를 이용한 암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 인간 DDIAS 낙다운(knockdown)에 의한 암세포의 성장 억제 확인

DDIAS(서열번호 : 1)의 발현 억제로 인한 암세포의 성장 억제 기전을 알아보기 위하여, 두 종류의 siRNA를 이용해 DDIAS가 낙다운된 암세포에서 성장 변화를 확인하였다.

구체적으로, 폐암세포인 A549 세포와 폐편평세포 암세포인 NCI-H1703 세포(오창, 한국세포주은행)를 48 웰(well) 플레이트(plate)에 1×10⁴의 농도로 분주하여 24시간 배양한 후, 0.5 ㎕ 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000)(Invitrogen), 및 DDIAS 특이적인 siRNA 또는 대조군인 scramble siRNA(Scr) 10 nM을 혼합하여 20분 동안 반응시켜 형질전환(transfection)하였다. 세포성장은 72시간 후 SRB(Sulforhodamine B) 염색을 통해 분석하였다. 세포를 배양한 플레이트를 4% 포르말린(formalin)으로 고정하고, 상온에서 60분간 방치한 뒤 물로 4-5번 정도 세척을 한다. 세척한 플레이트는 건조한 후, 0.4% SRB(Sulforhodamine B)(0.1% 아세트산(acetic acid)으로 용해한 용액; 단백질의 염색시약)을 100 ㎕/웰로 가한다. 30분 정도를 방치한 후에 0.1% 아세트산으로 세척을 하여 결합하지 않은 염색시약을 세척한다. 다시, 플레이트를 건조한 후에 10 mM Tris 염기(pH 10.5)를 100 ㎕/웰로 가하여 염색시약을 용해시키고, 540 nm에서 흡광도를 측정한다. 측정한 흡광도는 대조군에 대한 백분율로 계산한다.

그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 두 종류의 siRNA를 이용한 DDIAS 발현을 억제하였을 때 2종의 폐암세포주의 세포성장을 억제함을 확인하였다(도 1).

< 실시예 2> DDIAS에 의한 STAT3 단백질 조절 확인

<2-1> DDIAS 낙다운에 의한 STAT3 단백질 발현 변화 확인

DDIAS의 발현 억제로 인한 암세포의 성장 억제 기전을 알아보기 위하여, DDIAS가 낙다운된 암세포에서 성장에 관여하는 인자들의 변화를 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR) 및 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 수행하였다.

구체적으로, A549 세포와 NCI-H1703 세포를 6 웰 플레이트에 1×10⁵의 농도로 분주하여 24시간 배양한 후, 2 ㎕ 리포펙타민 2000 및 DDIAS 특이적인 siRNA 또는 대조군인 scramble siRNA 80 nM를 혼합하여 20분 동안 반응시켜 형질전환하였다. 상기 DDIAS를 낙다운한 폐암세포를 48시간 동안 배양한 후, 트리졸(Trizol, Invitrogen) 또는 1x RIPA 완충용액을 이용하여 세포추출물을 획득하였다. 웨스턴 블롯팅을 수행하기 위해, 상기 획득한 각 시료당 약 10 ㎍의 단백질을 SDS 샘플 완충용액으로 반응을 종결하여 SDS-PAGE로 분리하고 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(polyvinylidene fluoride membrane)으로 전달시켰다. 그 다음, 일차 항체로 항-인산화된 STAT3 항체, 항-STAT3 항체, 항-STAT1 항체 및 항-GAPDH 항체를 처리하여 반응시킨 후, 상기 막에 붙은 일차 항체에 HRP-접합 이차 항체를 붙이고, 이를 ECL(Peirce chemical co, USA)을 이용하여 확인하였다. 이 때, GAPDH는 대조 단백질로 사용하였다.

또한, 트리졸을 이용하여 총 RNA를 분리한 후, 분리한 RNA를 주형으로 RT-PCR kit(Enzynomics)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 cDNA(complementary DNA)를 합성하였다. 상기 cDNA를 PCR의 주형으로 사용하여 하기 [표 1]의 프라이머(primer)를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행한 후 아가로즈 겔에 전기영동하여 mRNA 양을 측정하였다. 이때, 내부 통제 유전자로 GAPDH를 사용하였다.

그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, DDIAS를 낙다운 한 폐암세포에서 STAT3과 인산화된 STAT3 단백질의 양이 현저히 감소하였으나 STAT1은 변화가 없었다. 또한, RT-PCR 결과 STAT3의 mRNA 양의 변화는 없었다. 이와 같이, DDIAS 낙다운이 STAT3 mRNA 수준의 변화 없이 STAT3 인산화와 총 단백질의 양을 감소시킴을 확인함으로써, DDIAS에 의해 STAT3의 단백질 양이 조절됨을 확인하였다(도 2).

목적 유전자	Primer
목적 유전자	명칭	서열	서열번호
DDIAS	DDIAS_F	CTTGCAGCAGTTGTTACGAA	서열번호 : 5
DDIAS	DDIAS_R	GTGACCAAGCACTTCGAGTT	서열번호 : 6
STAT3	STAT3_F	GGCTGGACAATATCATTGACC	서열번호 : 7
STAT3	STAT3_R	CCGAGGTCAACTCCATGTCAA	서열번호 : 8
GAPDH	GAPDH_F	TCATGACCACAGTCCATGCC	서열번호 : 9
GAPDH	GAPDH_R	TCCACCACCCTGTTGCTGTA	서열번호 : 10

<2-2> DDIAS 과발현에 의한 STAT3 단백질 발현 변화 확인

DDIAS 과발현이 STAT3(서열번호 : 2) 발현을 변화시키는지 확인하기 위하여, Flag-DDIAS를 NCI-H1703 세포와 A549 세포에 과발현한 후 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.

구체적으로, 6 웰 플레이트에 NCI-H1703 세포와 A549 세포를 분주하여 하루 동안 배양한 후, Flag로 표지된 DDIAS 벡터 2 ㎍과 4 ㎕의 터보펙트(Turbofect reagent, Thermo Scientific)로 제조사의 절차에 따라 형질전환하였다. 36시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 1X RIPA 용해 버퍼(lysis buffer)를 이용하여 용해물(lysate)을 얻어 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.

그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, Flag-DDIAS를 과발현한 NCI-H1703 세포와 A549 세포에서 모두 STAT3과 인산화된 STAT3이 현저히 증가하였으나, DDIAS의 과발현에 의해 STAT1은 변화가 없었다(도 3).

< 실시예 3> DDIAS에 의한 STAT3 타겟 유전자들의 발현 변화 확인

<3-1> DDIAS를 낙다운한 세포에서 STAT3 타겟 유전자들의 발현 변화 확인

DDIAS를 낙다운한 세포에서 STAT3 타겟 유전자들의 발현 변화를 확인하기 위하여, DDIAS siRNA를 처리한 후 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.

구체적으로, NCI-H1703 세포를 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 분주한 후, 2 ㎕ 리포펙타민 2000 및 DDIAS siRNA 또는 대조군인 scramble siRNA 80 nM를 혼합하여 20분 동안 반응시켜 형질전환하였다. 상기 DDIAS를 낙다운한 세포를 72시간 동안 배양한 후, 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 일차 항체로 항-STAT3 항체, 항-Survivin 항체, 항-Bcl-xL 항체, 항-Bcl2 항체 및 항-GAPDH 항체를 이용하여 확인하였다.

그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, DDIAS를 낙다운한 NCI-H1703 세포에서 STAT3이 감소한 바와 같이, STAT3 타겟 단백질인 Survivin, Bcl-xL, Bcl2의 양이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 4). 이는, DDIAS에 의해 STAT3 타겟 단백질의 양도 조절됨을 확인하였다.

<3-2> DDIAS 과발현에 의한 STAT3 타겟 유전자들의 발현 변화 확인

DDIAS 과발현에 의한 STAT3 타겟 유전자들의 발현을 확인하기 위하여, NCI-H1703 세포에 DDIAS를 과발현 한 후 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.

구체적으로, 6 웰 플레이트에 NCI-H1703 세포를 분주하여 하루 동안 배양한 후, Flag로 표지된 DDIAS 벡터 2 ㎍과 4 ㎕의 터보펙트(Turbofect reagent, Thermo Scientific)로 제조사의 절차에 따라 형질 전환하였다. 36시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 1X RIPA 용해 버퍼를 이용하여 용해물을 얻어 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.

그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, Flag-DDIAS를 과발현한 NCI-H1703 세포에서 STAT3이 증가되고 STAT3 타겟 단백질인 Survivin, Bcl-xL, Bcl2의 양이 현저히 증가하였다(도 4). 이는, DDIAS의 과발현에 의해 STAT3 타겟 단백질의 양도 조절됨을 확인하였다.

< 실시예 4> DDIAS 낙다운한 세포에서 STAT3 과발현 효과 확인

<4-1> DDIAS 를 낙다운한 세포에서 STAT3 과발현에 의한 세포 성장 확인

DDIAS를 낙다운한 세포에 STAT3을 과발현한 후, 세포 성장을 확인하였다.

구체적으로, NCI-H1703 세포를 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 분주한 후, 2 ㎕ 리포펙타민 2000 및 DDIAS siRNA 또는 대조군인 scramble siRNA 80 nM를 혼합하여 20분 동안 반응시켜 형질전환하였다. 24시간 후, HA로 표지된 STAT3 벡터 2 ㎍과 4 ㎕의 터보펙트(Thermo Scientific)를 이용하여 형질 전환하였다. 48 시간 후, 세포성장을 <실시예 1>과 동일한 방법으로 SRB염색을 통해 분석하였다.

그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, DDIAS 낙다운된 세포의 성장이 억제됨을 재확인하였고, STAT3 과발현이 이러한 세포 성장 억제 현상을 저해하는 것을 확인하였다(도 5).

<4-2> DDIAS 를 낙다운한 세포에서 STAT3 과발현에 의한 STAT3 타겟 유전자들의 발현 변화 확인

DDIAS를 낙다운한 세포에 STAT3을 과발현한 후, STAT3 타겟 단백질의 발현을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다.

구체적으로, 6 웰 플레이트에 NCI-H1703 세포를 분주하고 24시간 후, 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 형질 전환하여 36시간 동안 배양한 후, 1X RIPA 버퍼를 이용하여 용해물을 얻어 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.

그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, DDIAS 낙다운으로 인해 감소했던 STAT3, survivin, Bcl-xL의 양이 HA-STAT3을 과발현한 세포에서 STAT3 뿐만 아니라 STAT3 타겟 단백질인 Survivin과 Bcl-xL의 양도 현저히 증가하였다(도 6).

< 실시예 5> DDIAS 낙다운에 의해 STAT3 분해 촉진 확인

DDIAS를 낙다운한 세포에서 STAT3 단백질 분해 정도를 확인하기 위하여, DDIAS siRNA를 처리한 후 단백질 합성 억제제인 사이클로헥사마이드 (cycloheximide)를 처리한 후 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.

구체적으로, NCI-H1703 세포를 6 웰 플레이트에 5×10⁵농도의 수로 분주하여 24시간 배양한 후, 2 ㎕ 리포펙타민 2000 및 DDIAS 특이적인 siRNA 또는 대조군인 scramble siRNA 80 nM를 혼합하여 20분 동안 반응시켜 형질전환하였다. 상기 DDIAS를 낙다운한 세포를 48 시간 동안 배양한 후, 사이클로헥사마이드를 3시간 간격으로 처리한 후 완충용액을 이용하여 세포추출물을 획득하였다. 각 시료당 약 10 ㎍의 단백질로 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 일차 항체로 항-STAT3 항체 및 항-GAPDH 항체를 이용하여 확인하였다.

그 결과 도 7a 내지 도 7b에 나타낸 바와 같이, DDIAS를 낙다운한 NCI-H1703 세포에서 STAT3 단백질의 분해가 빠른 시간에 이루어짐을 확인하였고(도 7a), 대조군인 경우 24시간 정도가 STAT3의 단백질 반감기인 반면, DDIAS를 낙다운한 경우 6시간으로 감소하는 것을 확인하였다(도 7b).

< 실시예 6> DDIAS 낙다운에 의해 STAT3 유비키틴화 증가 확인

DDIAS를 낙다운한 세포에서 STAT3 단백질의 유비키틴화 정도를 확인하기 위하여, DDIAS siRNA와 HA로 표지된 유비키틴을 처리한 후 면역침강법(immunoprecipitation, IP)과 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.

구체적으로, NCI-H1703 세포를 100 mm 디쉬(dish)에 5×10⁵ 농도의 수로 분주하여 24시간 배양한 후, 30 ㎕ 리포펙타민 2000 및 DDIAS 특이적인 siRNA 또는 대조군인 scramble siRNA 600 nM를 혼합하여 20분 동안 반응시켜 형질전환하였다. 24시간 후, DDIAS를 낙다운한 세포에 HA로 표지된 유비키틴(HA-Ubiquitin)을 형질 전환하였고, 세포를 회수하기 6시간 전에 프로테아솜 억제제들(proteasome inhibitor; epoxomicin, lactacystin 및 MG132)을 처리하였다. 1X 완충용액을 이용하여 세포추출물을 획득하였고, 각 시료당 약 500 ㎍의 단백질을 항-STAT3 항체로 면역 침강한 후 SDS 샘플 완충용액으로 반응을 종결하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 일차 항체로 항-HA 항체 및 항-STAT3 항체를 이용하여 확인하였다.

그 결과 도 8 내지 도 9에 나타낸 바와 같이, DDIAS를 낙다운한 NCI-H1703 세포에서 감소한 STAT3 단백질의 양이 프로테아솜 억제제들을 처리한 샘플에서 증가하는 것을 확인하였고(도 8), DDIAS를 낙다운한 NCI-H1703 세포에서 STAT3 단백질의 유비키틴화가 증가함을 확인하였다(도 9). 이를 통해, DDIAS가 STAT3의 유비키틴화를 감소시킴을 확인하였다.

< 실시예 7> DDIAS 와 STAT3 의 상호작용 확인

DDIAS와 STAT3의 상호 결합을 알아보기 위해, Flag-DDIAS와 STAT3을 과발현 한 후 면역침강법을 수행하였다.

구체적으로, 2×10⁶세포/㎖로 HEK293 세포를 100 mm 디쉬에 분주하고 24시간 배양한 후, 8 ㎍ DDIAS와 2 ㎍ STAT3을 20 ㎕ 터보펙트(Thermoscientific)와 혼합하여 20분 동안 반응시켜 형질전환하였다. 36시간 후 1X 완충용액을 이용하여 세포추출물을 획득하였다. 각 시료당 약 500 ㎍의 단백질을 항-Flag 항체 또는 항-STAT3 항체로 면역 침강한 후 SDS 샘플 완충용액으로 반응을 종결하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 일차 항체로 항-Flag 항체 및 항-STAT3 항체를 이용하여 확인하였다.

그 결과 도 10a 내지 도 10b에 나타낸 바와 같이, Flag-DDIAS로 면역침강하면 STAT3이 결합하는 것을 확인하였고(도 10a), STAT3 항체로 면역침강하면 Flag-DDIAS가 결합하는 것을 확인하였다(도 10b). 이를 통해, DDIAS가 세포 내에서 STAT3과 결합함을 확인하였다.

< 실시예 8> DDIAS 와 결합하는 STAT3 도메인( domain ) 확인

<8-1> DDIAS와 결합하는 STAT3 도메인 확인

DDIAS와 결합하는 STAT3 위치를 확인하기 위하여, STAT3의 결실돌연변이주(deletion mutant)를 제조하여 면역침강법을 수행하였다.

구체적으로, 도 11a에 나타낸 바와 같이 결실돌연변이주를 만들기 위해, 상기 <실시예 7>에서 사용한 STAT3 유전자를 주형으로 EcoRI과 XhoI 제한 효소를 넣어 PCR로 합성한 후 HA가 표지된 플라스미드에 클로닝하였다. 이렇게 제조한 플라스미드의 염기서열을 확인하여 돌연변이가 없음을 확인하였다. 8×10⁵개의 HEK293 세포를 60 mm 디쉬에 분주하고 24시간 배양한 후, 4 ㎍ DDIAS와 1 ㎍ STAT3을 10 ㎕ 터보팩트(Thermoscientific)와 혼합하여 20분 동안 반응시켜 형질전환하였다. 이때, 형질전환의 효율을 확인하기 위해 100 ng의 GFP 유전자도 동시에 모든 샘플에 형질전환하였다. 36시간 후 1X 완충용액을 이용하여 세포추출물을 획득하였다. 각 시료당 약 500 ㎍의 단백질을 항-HA 항체로 면역 침강한 후 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 일차 항체로 항-Flag 항체, 항-HA 항체 및 항-GFP 항체를 이용하여 확인하였다.

그 결과 도 11b에 나타낸 바와 같이, HA-STAT3로 면역침강하면 STAT3의 전체 길이와 C-말단(서열번호 : 4)이 DDIAS와 결합하는 것을 확인하였다(도 11b). 이를 통해, DDIAS가 세포 내에서 STAT3의 SH2와 TAD(Transactivation domain)를 포함하는 C-말단과 결합함을 확인하였다.

<8-2> STAT3 과 결합하는 DDIAS 도메인 확인

STAT3과 결합하는 DDIAS의 도메인 위치를 확인하기 위하여, DDIAS의 결실돌연변이주를 제조하여 면역침강법을 수행하였다.

구체적으로, 도 12a와 같이 결실돌연변이를 만들기 위해, Flag-DDIAS를 주형으로 제한 효소를 넣어 PCR로 합성한 후 Flag이 표지된 플라스미드에 클로닝하였다. 이렇게 제조한 플라스미드의 염기서열을 확인하여 돌연변이가 없음을 확인하였다. 상기 실시예 <7-1>과 동일한 방법으로 HEK293 세포를 분주하여 형질전환하였고, 36시간 후 1X 완충용액을 이용하여 세포추출물을 획득하였다. 각 시료당 약 500 ㎍의 단백질을 항-Flag 항체로 면역 침강한 후 항-Flag 항체, 항-HA 항체 및 항-GFP 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.

그 결과 도 12b에 나타낸 바와 같이, Flag-DDIAS로 면역침강하면 DDIAS의 전체 길이와 C-말단(서열번호 : 3)이 STAT3과 결합하는 것을 확인하였다(도 12b). 이를 통해, DDIAS의 C-말단과 STAT3의 SH2와 TAD를 포함하는 C-말단이 세포 내에서 결합함을 확인하였다.

< 실시예 9> 동물 모델에서 DDIAS 낙다운의 항암 효과

<9-1> DDIAS 낙다운의 동물 모델에서 암 증식 억제 확인

동물 모델에서 DDIAS 낙다운의 항암 효과를 알아보기 위해, NCI-H1703 세포를 누드마우스(nude mouse)에 이식한 후 DDIAS siRNA의 종양 내 반복 투여에 의한 항암활성을 검증하였다.

구체적으로, 배양 최종일에 모든 암세포를 수거하여 계수하고 무혈청배지(serum free media)를 이용하여 세포 농도를 3×10⁷ 세포/ml로 조절하였다. 이렇게 조절된 세포 배양액을 마우스당 0.3 ml(9×10⁶ 세포/마우스)씩 우측의 견갑부와 흉벽 사이의 액와 부위 피하에 주입하였다. DDIAS siRNA는 에스티팜에서 0.589 mg/ml로 공급받아 0, 2, 4, 6, 8일에 51 ㎕의 액량으로 총 5회 종양 내 투여하였다. 암세포 이식 후 측정 가능한 종양이 형성되었을 때부터 16일째까지 총 8회 개체별로 버니어 캘리퍼(vernier caliper)를 이용하여 3 방향을 측정한 후 길이×너비×높이/2의 계산식으로 확인하였다.

약물투여 개시 후 16일째 CO₂ 가스를 이용하여 치사시킨 뒤 종양을 분리하여 화학 저울(Chemical balance)에 무게를 측정하였으며, 사진 촬영 후 반씩 나누어 액체 질소 또는 포르말린에 고정하였다. NCI-H1703 세포 이식 누드마우스에 DDIAS siRNA를 51 ㎕(1.5 mg/kg) 액량으로 반복 종양 내 투여 시 독성 정도를 알아보기 위해 투여기간 동안 동물의 일반증상 및 체중 변화를 관찰하였다.

그 결과 도 13에 나타낸 바와 같이, 모든 약물 투여 군에서 실험 최종일(day 16)까지 용매 대조군과 비교해서 통계적으로 유의한 체중 감소는 나타나지 않았으나, 실험 최종일인 16일 결과를 보면 용매 대조군과 비교하여 1.5 mg/kg 군에서 49.9%(p<0.01)의 통계적으로 유의한 종양성장 억제를 확인하였다(도 13). 약물투여 개시 후 16일째 NCI-H1703 세포 종양을 절제하여 그 무게를 측정한 결과 용매 대조군과 비교하여 1.5 mg/kg 군에서 50.3%(p<0.05)의 통계적으로 유의한 종양무게 억제를 확인하였다.

<9-2> 동물 모델에서 DDIAS 낙다운에 의한 mRNA 발현량 확인

종양 내 투여한 DDIAS siRNA에 의한 낙다운 정도를 확인하기 위해, 각각의 종양을 고정하여 mRNA in situ hybridazation을 수행하였다.

구체적으로, 분리한 종양을 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하였다. 고정된 종양을 파라핀(paraffin) 블록으로 만든 후 단면을 3 ㎛로 절단하였다. mRNA in situ hybridization을 ViewRNA system(Affymetrix, Inc.)을 이용하여 분석하였다. Affymetrix, Inc.로부터 제작한 DDIAS과 GAPDH 프로브를 사용하여 염색하였다. 간단히 설명하면, 조직 슬라이드를 80℃에서 3분간 반응한 후, PBS로 세척 후 Histoclear로 파라핀을 깨끗이 제거했다. 95% 에탄올에 2번 세척한 후, 100℃ 전처리 용액에서 10분간 반응시킨 후 3차 증류수로 세척했다. 프로테아제 용액(protease solution)을 분주하여 20분간 반응시킨 후, PBS로 세척하여 4% 포름알데하이드로 고정했다. PBS로 세척 후, DDIAS 프로브(VA1-11392)와 GAPDH 프로브(positive control, VA1-10119)를 각각 분주하여 40℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼(Wash buffer)로 3번 세척한 후, preAmp1 용액을 분주하여 40℃에서 25분간 반응시켜 프로브에 preAmp1을 붙였다. Wash buffer로 3번 세척한 후, Amp1 용액을 분주하여 40℃에서 15분간 반응시켜 preAmp1에 Amp1을 붙였다. Wash buffer로 3번 세척한 후, Label probe-AP 용액을 분주하여 40℃에서 15분간 반응시켰다. Wash buffer로 3번 세척한 후, AP-Enhancer 용액을 분주하여 실온에서 5분간 반응시키고 Fast Red substrate를 분주하여 40℃, 30분간 반응시켰다. PBS로 세척 후, 4% 포름알데하이드로 5분간 고정했다. PBS로 세척 후 , Gill's Hematoxylin 용액을 분주하여 실온에서 5분간 반응시켜 조직을 염색했다. 3차 증류수로 3번 세척한 후, 0.01% 암모니아수에 10초간 반응시켰다. 3차 증류수로 세척한 후 조직슬라이드를 건조시킨 후, 마운트(Mount) 용액을 슬라이드에 분주하여 커버 글라스(cover glass)를 덮었다. 형광 현미경으로 염색된 DDIAS mRNA를 관찰하였다(LSM5, Zeiss).

그 결과 도 14에 나타낸 바와 같이, 대조군인 GAPDH는 scramble siRNA와 DDIAS siRNA 처리한 절편 모두 염색이 되는 한편, DDIAS는 DDIAS siRNA 처리한 절편에서 염색반응이 현저히 감소함을 확인하였다(도 14). 이를 통해, 종양 내 siRNA 전달이 잘 되었고 DDIAS의 siRNA에 의한 항암효과가 DDIAS의 낙다운 효과임을 확인하였다.

< 실시예 10> DDIAS 낙다운에 의한 암조직에서의 STAT3 및 타겟 단백질 발현 확인

동물 모델에서 DDIAS 낙다운에 의한 항암 기전을 알아보기 위하여, siRNA를 처리한 암 조직에서 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.

구체적으로, 분리한 종양을 액체 질소에 동결 건조한 후 막자사발로 분획하여 1X RIPA 완충용액을 이용하여 추출물을 획득하였다. 상기 획득한 각 시료 당 약 20 ㎍의 단백질을 SDS 샘플 완충용액으로 반응을 종결하여 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 일차 항체로 항-STAT1 항체, 항-STAT3 항체, 항-NFAT2 항체, 항-Survivin 항체, 항-Bcl-xL 항체 및 항-GAPDH 항체를 이용하여 확인하였다.

그 결과 도 15에 나타낸 바와 같이, DDIAS siRNA를 처리한 조직에서 STAT3과 타겟 단백질인 Survivin과 Bcl-xL의 양이 현저히 감소한 것을 확인한 반면, STAT1과 NFAT2의 양은 큰 변화가 없는 것을 확인하였다(도 15). 이를 통해, DDIAS siRNA에 의한 생체 내 암조직의 억제 기전이 STAT3 경로를 차단함으로써 암 증식을 억제하는 것을 확인하였다.

< 실시예 11> 효모 이중혼성( yeast two - hybrid ) 분석을 위한 유전자 클로닝 (cloning)

효모 이중혼성 분석을 위해 유전자를 클로닝하였다.

구체적으로, BamHI/PstI 제한효소로 처리한 DDIAS 유전자의 C-말단(784-998 aa, 서열번호 : 3) DNA 단편을 Gal4 프로모터에 결합부위를 포함하는 베이트(bait) 벡터인 pGBKT7에 클로닝하여 GAL4의 DNA 결합부위인 GAL4BD와 융합 단백질이 발현되도록 pGBKT7-DDIAS-C를 제작하였다. 또한, EcoRI/XhoI 제한효소를 이용하여 STAT3 C-말단(583-770 aa, 서열번호 : 4)을 포함하는 DNA 단편을 pGADT7 벡터에 클로닝하여 GAL4의 전사활성화 부위인 GAL4AD과 융합단백질을 만들도록 pGADT7-STAT3-C를 제작하였다.

<실시예 12> 리포터 유전자를 이용한 STAT3 과 DDIAS 단백질 상호작용 확인

형질 전환된 효모 AH109(ADE2, HIS3, LacZ)의 replica를 만들어 단백질 상호작용을 리포터 유전자를 이용하여 알아보았다. 형질 전환된 유전자들로부터 생성된 두 단백질이 상호 작용을 하면 베타갈락토시다제가 생성되어 x-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 분해하고 푸른색을 나타내므로 상호작용 정도를 알 수 있다.

구체적으로, 효모 AH109(ADE2, HIS3, LacZ) 균주를 YPD(0.5% Yeast extract, 1% peptone, 2% glucose)에서 탁도 0.5까지 배양한 후 리튬아세테이트 방법을 이용하여 competent 효모세포를 만들고, 상기 <실시예 11>에서 제조한 이중혼성 벡터 pGBKT7-DDIAS-C와 pGADT7-STAT3-C를 열충격으로 형질 전환하였다. 음성 대조군으로 pGBKT7과 pGADT7 벡터를 사용하였고, 양성 대조군은 호모다이머(homodimer)를 형성하는 PTB(polypyrimidine track binding protein)를 GBKT7과 pGADT7 벡터에 각각 클로닝하여 사용하였다. pGBKT7-DDIAS-C와 pGADT7-STAT3-C, 음성 대조군인 pGBKT7과 pGADT7, 양성대조군 pGBKT7-PTB와 pGADT7-PTB 두 벡터를 동시에 도입시킨 후 효모세포를 트립토판과 루이신이 결핍된 SD(synthetic dropout) 한천 배지에 배양하여 3-4일 후 형질 전환된 효모가 자라도록 하였다. 또한, 트립토판과 루이신이 결핍된 SD 배지에서 선별된 형질전환 효모를 SD 제한 배지에 놓인 UV 멸균된 여과지 #1 종이에서 배양한 후 x-gal을 기질로 사용하여 베타갈락토시다제 활성을 측정하였다. 여과지에서 자란 효모를 액체 질소에 20초간 2회 넣어 세포벽을 파괴한 후 x-gal을 함유한 버퍼 용액이 담긴 샬레에 넣고 30℃에서 6시간 배양하였다.

그 결과 도 16A 내지 16B에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군은 아무 변화가 없었고 양성 대조군 또는 STAT3의 C-말단과 DDIAS의 C-말단을 발현시킨 효모에서 x-gal을 푸른색으로 변화시키며 베타갈락토시다제의 활성을 나타내었다(도 16A 내지 16B).

또 다른 리포터 유전자 ADE2와 HIS3의 활성을 보기 위해 아데노신과 히스티딘이 결핍된 배지(LWHA)에 균주 replica를 만들어 세포가 자라는 것을 확인한 결과 도 16C에 나타낸 바와 같이, 양성 콘트롤과 STAT3의 C-말단과 DDIAS의 C-말단을 발현시키는 균주만 제한 배지에서 자라는 것을 확인하였다(도 16C).

또한 아데노신(LWA) 내지 히스티딘(LWH)이 결핍된 배지에 균주 replica를 만들어 세포가 자라는 것을 확인한 결과 도 16D에 나타낸 바와 같이, 양성 콘트롤과 STAT3의 C-말단과 DDIAS의 C-말단을 발현시키는 균주만 자라는 것을 확인하였다(도 16D).

HIS3 리포터 유전자의 자발적 활성을 배제하기 위해 SD 배지에 1 mM의 3-AT(3-amino-1,2,4-triazole)를 첨가하여 형질 전환된 세포를 자라게 한 결과 도 16E에 나타낸 바와 같이, 양성 콘트롤 또는 STAT3의 C-말단과 DDIAS의 C-말단을 발현시키는 균주만 자라는 것을 확인하였다(도 16E).

따라서 효모 이중혼성 분석을 통해 STAT3의 C-말단과 DDIAS의 C-말단이 상호작용하는 것을 확인하였고, DDIAS와 STAT3 단백질의 상호작용을 억제하는 약물을 스크리닝하는데 효모 이중혼성 분석 방법이 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A screening method for therapeutic agent of cancer using of interaction between DDIAS and STAT3 <130> 2014P-06-019 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 998 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Arg Arg Arg Lys Phe Leu Leu Ala Ser Val Leu Ala Leu Gln 1 5 10 15 Asn Ser Ser Phe Ile Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Cys Phe Ser Arg Ile 20 25 30 Ile Leu Val Ser Lys Arg Ser Asn Cys Pro Lys Cys Gly Ser Thr Gly 35 40 45 Glu Ser Gly Asn Ala Asn Tyr Arg Tyr Lys Leu Ser Leu Lys Val Ala 50 55 60 Glu Ser Asn Lys Leu Phe Val Ile Thr Val Phe Gly Ser Cys Leu Asp 65 70 75 80 Thr Phe Phe Gly Leu Thr Ala Thr Gly Leu His Arg Tyr Ile Gln Asp 85 90 95 Pro Asn Lys Ile Pro Glu Thr Leu Asp Asn Asp Thr Thr Gln Asn Leu 100 105 110 Leu Thr Lys Ala Val Glu Thr Cys Phe Val Gly Gln Ser Phe Ile Phe 115 120 125 Gly Val Thr Asn Phe Glu Asn Gln Pro Gly Gln Gly Ser Asp Ala Ser 130 135 140 Asn Phe Leu Gln Gln Cys Ser Asp His Lys Arg Lys Ala Lys Ala Leu 145 150 155 160 Val Ala Cys Gln Ile Val Leu Pro Asp Pro Gly Ile Ala Gly Phe Thr 165 170 175 Val Ile Asp Tyr Phe His Gln Leu Leu Gln Thr Phe Asn Phe Arg Lys 180 185 190 Leu Gln Cys Asp Ser Gln Ala Pro Asn Asn His Leu Leu Ala Leu Asp 195 200 205 His Ser Asn Ser Asp Leu Ser Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Ser Thr Ser 210 215 220 Asp Phe Phe Lys Ser Cys Ser Lys Asp Thr Phe Ser Lys Phe Trp Gln 225 230 235 240 Pro Ser Leu Glu Phe Thr Cys Ile Val Ser Gln Leu Thr Asp Asn Asp 245 250 255 Asp Phe Ser Ala Ser Glu Gln Ser Lys Ala Phe Gly Thr Leu Gln Gln 260 265 270 Asn Arg Lys Ser Ile Ser Ile Ala Glu Ala Thr Gly Ser Ser Ser Cys 275 280 285 His Asp Pro Ile Gln Asp Ser Trp Ser Leu Val Ser Tyr Met Asp Lys 290 295 300 Lys Ser Thr Ala Glu Lys Leu Gly Lys Glu Leu Gly Leu Gln Ala Lys 305 310 315 320 Glu Leu Ser Ala Val His Ser Ser His His Glu Ile Gly Val Asn Asp 325 330 335 Ser Asn Leu Phe Ser Leu Glu Met Arg Glu Pro Leu Glu Ser Ser Asn 340 345 350 Thr Lys Ser Phe His Ser Ala Val Glu Ile Lys Asn Arg Ser Gln His 355 360 365 Glu Leu Pro Cys Phe Gln His His Gly Ile Asp Thr Pro Thr Ser Leu 370 375 380 Gln Lys Arg Ser Ala Cys Cys Pro Pro Ser Leu Leu Arg Leu Glu Glu 385 390 395 400 Thr Ala Ser Ser Ser Gln Asp Gly Asp Pro Gln Ile Trp Asp Asp Leu 405 410 415 Pro Phe Ser Glu Ser Leu Asn Lys Phe Leu Ala Val Leu Glu Ser Glu 420 425 430 Ile Ala Val Thr Gln Ala Asp Val Ser Ser Arg Lys His His Val Asp 435 440 445 Asn Asp Ile Asp Lys Phe His Ala Asp His Ser Arg Leu Ser Val Thr 450 455 460 Pro Gln Arg Thr Thr Gly Ala Leu His Thr Pro Pro Ile Ala Leu Arg 465 470 475 480 Ser Ser Gln Val Ile Val Lys Ala Asn Cys Ser Lys Asp Asp Phe Leu 485 490 495 Phe Asn Cys Lys Gly Asn Leu Ser Pro Ser Val Glu Lys Glu Ser Gln 500 505 510 Pro Asp Asn Lys Val Glu Ala Val Ser Val Asn His Asn Gly Arg Asp 515 520 525 Met Ser Glu Tyr Phe Leu Pro Asn Pro Tyr Leu Ser Ala Leu Ser Ser 530 535 540 Ser Ser Lys Asp Leu Glu Thr Ile Val Thr Leu Lys Lys Thr Ile Arg 545 550 555 560 Ile Ser Pro His Arg Glu Ser Asp His Ser Ser Leu Asn Asn Lys Tyr 565 570 575 Leu Asn Gly Cys Gly Glu Ile Ser Val Ser Glu Met Asn Glu Lys Leu 580 585 590 Thr Thr Leu Cys Tyr Arg Lys Tyr Asn Asp Val Ser Asp Leu Cys Lys 595 600 605 Leu Glu Asn Lys Gln Tyr Cys Arg Trp Ser Lys Asn Gln Asp Asp Ser 610 615 620 Phe Thr Ile Cys Arg Lys Leu Thr Tyr Pro Leu Glu Thr Leu Cys Asn 625 630 635 640 Ser Pro Asn Arg Ser Thr Asn Thr Leu Lys Glu Met Pro Trp Gly His 645 650 655 Ile Asn Asn Asn Val Thr Gln Ser Tyr Ser Ile Gly Tyr Glu Gly Ser 660 665 670 Tyr Asp Ala Ser Ala Asp Leu Phe Asp Asp Ile Ala Lys Glu Met Asp 675 680 685 Ile Ala Thr Glu Ile Thr Lys Lys Ser Gln Asp Ile Leu Leu Lys Trp 690 695 700 Gly Thr Ser Leu Ala Glu Ser His Pro Ser Glu Ser Asp Phe Ser Leu 705 710 715 720 Arg Ser Leu Ser Glu Asp Phe Ile Gln Pro Ser Gln Lys Leu Ser Leu 725 730 735 Gln Ser Leu Ser Asp Ser Arg His Ser Arg Thr Cys Ser Pro Thr Pro 740 745 750 His Phe Gln Ser Asp Ser Glu Tyr Asn Phe Glu Asn Ser Gln Asp Phe 755 760 765 Val Pro Cys Ser Gln Ser Thr Pro Ile Ser Gly Phe His Gln Thr Arg 770 775 780 Ile His Gly Ile Asn Arg Ala Phe Lys Lys Pro Val Phe Tyr Ser Asp 785 790 795 800 Leu Asp Gly Asn Tyr Glu Lys Ile Arg Ile Phe Pro Glu Asn Asp Lys 805 810 815 Gln Gln Ala Ser Pro Ser Cys Pro Lys Asn Ile Lys Thr Pro Ser Gln 820 825 830 Lys Ile Arg Ser Pro Ile Val Ser Gly Val Ser Gln Pro Asp Val Phe 835 840 845 Asn His Tyr Pro Phe Ala Glu Cys His Glu Thr Asp Ser Asp Glu Trp 850 855 860 Val Pro Pro Thr Thr Gln Lys Ile Phe Pro Ser Asp Met Leu Gly Phe 865 870 875 880 Gln Gly Ile Gly Leu Gly Lys Cys Leu Ala Ala Tyr His Phe Pro Asp 885 890 895 Gln Gln Glu Leu Pro Arg Lys Lys Leu Lys His Ile Arg Gln Gly Thr 900 905 910 Asn Lys Gly Leu Ile Lys Lys Lys Leu Lys Asn Met Leu Ala Ala Val 915 920 925 Val Thr Lys Lys Lys Thr His Lys Tyr Asn Cys Lys Ser Ser Gly Trp 930 935 940 Ile Ser Lys Cys Pro Asp Ile Gln Val Leu Ala Ala Pro Gln Leu His 945 950 955 960 Pro Ile Leu Gly Pro Asp Ser Cys Ser Glu Val Lys Cys Cys Leu Pro 965 970 975 Phe Ser Glu Lys Gly Pro Pro Ser Val Cys Glu Thr Arg Ser Ala Trp 980 985 990 Ser Pro Glu Leu Phe Ser 995 <210> 2 <211> 770 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Ala Gln Trp Asn Gln Leu Gln Gln Leu Asp Thr Arg Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Gln Leu His Gln Leu Tyr Ser Asp Thr Phe Pro Met Glu Leu Arg Gln 20 25 30 Phe Leu Ala Pro Trp Ile Glu Ser Gln Asp Trp Ala Tyr Ala Ala Ser 35 40 45 Lys Glu Ser His Ala Thr Leu Val Phe His Asn Leu Leu Gly Glu Ile 50 55 60 Asp Gln Gln Tyr Ser Arg Phe Leu Gln Glu Ser Asn Val Leu Tyr Gln 65 70 75 80 His Asn Leu Arg Arg Ile Lys Gln Phe Leu Gln Ser Arg Tyr Leu Glu 85 90 95 Lys Pro Met Glu Ile Ala Arg Ile Val Ala Arg Cys Leu Trp Glu Glu 100 105 110 Ser Arg Leu Leu Gln Thr Ala Ala Thr Ala Ala Gln Gln Gly Gly Gln 115 120 125 Ala Asn His Pro Thr Ala Ala Val Val Thr Glu Lys Gln Gln Met Leu 130 135 140 Glu Gln His Leu Gln Asp Val Arg Lys Arg Val Gln Asp Leu Glu Gln 145 150 155 160 Lys Met Lys Val Val Glu Asn Leu Gln Asp Asp Phe Asp Phe Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Leu Lys Ser Gln Gly Asp Met Gln Asp Leu Asn Gly Asn Asn 180 185 190 Gln Ser Val Thr Arg Gln Lys Met Gln Gln Leu Glu Gln Met Leu Thr 195 200 205 Ala Leu Asp Gln Met Arg Arg Ser Ile Val Ser Glu Leu Ala Gly Leu 210 215 220 Leu Ser Ala Met Glu Tyr Val Gln Lys Thr Leu Thr Asp Glu Glu Leu 225 230 235 240 Ala Asp Trp Lys Arg Arg Gln Gln Ile Ala Cys Ile Gly Gly Pro Pro 245 250 255 Asn Ile Cys Leu Asp Arg Leu Glu Asn Trp Ile Thr Ser Leu Ala Glu 260 265 270 Ser Gln Leu Gln Thr Arg Gln Gln Ile Lys Lys Leu Glu Glu Leu Gln 275 280 285 Gln Lys Val Ser Tyr Lys Gly Asp Pro Ile Val Gln His Arg Pro Met 290 295 300 Leu Glu Glu Arg Ile Val Glu Leu Phe Arg Asn Leu Met Lys Ser Ala 305 310 315 320 Phe Val Val Glu Arg Gln Pro Cys Met Pro Met His Pro Asp Arg Pro 325 330 335 Leu Val Ile Lys Thr Gly Val Gln Phe Thr Thr Lys Val Arg Leu Leu 340 345 350 Val Lys Phe Pro Glu Leu Asn Tyr Gln Leu Lys Ile Lys Val Cys Ile 355 360 365 Asp Lys Asp Ser Gly Asp Val Ala Ala Leu Arg Gly Ser Arg Lys Phe 370 375 380 Asn Ile Leu Gly Thr Asn Thr Lys Val Met Asn Met Glu Glu Ser Asn 385 390 395 400 Asn Gly Ser Leu Ser Ala Glu Phe Lys His Leu Thr Leu Arg Glu Gln 405 410 415 Arg Cys Gly Asn Gly Gly Arg Ala Asn Cys Asp Ala Ser Leu Ile Val 420 425 430 Thr Glu Glu Leu His Leu Ile Thr Phe Glu Thr Glu Val Tyr His Gln 435 440 445 Gly Leu Lys Ile Asp Leu Glu Thr His Ser Leu Pro Val Val Val Ile 450 455 460 Ser Asn Ile Cys Gln Met Pro Asn Ala Trp Ala Ser Ile Leu Trp Tyr 465 470 475 480 Asn Met Leu Thr Asn Asn Pro Lys Asn Val Asn Phe Phe Thr Lys Pro 485 490 495 Pro Ile Gly Thr Trp Asp Gln Val Ala Glu Val Leu Ser Trp Gln Phe 500 505 510 Ser Ser Thr Thr Lys Arg Gly Leu Ser Ile Glu Gln Leu Thr Thr Leu 515 520 525 Ala Glu Lys Leu Leu Gly Pro Gly Val Asn Tyr Ser Gly Cys Gln Ile 530 535 540 Thr Trp Ala Lys Phe Cys Lys Glu Asn Met Ala Gly Lys Gly Phe Ser 545 550 555 560 Phe Trp Val Trp Leu Asp Asn Ile Ile Asp Leu Val Lys Lys Tyr Ile 565 570 575 Leu Ala Leu Trp Asn Glu Gly Tyr Ile Met Gly Phe Ile Ser Lys Glu 580 585 590 Arg Glu Arg Ala Ile Leu Ser Thr Lys Pro Pro Gly Thr Phe Leu Leu 595 600 605 Arg Phe Ser Glu Ser Ser Lys Glu Gly Gly Val Thr Phe Thr Trp Val 610 615 620 Glu Lys Asp Ile Ser Gly Lys Thr Gln Ile Gln Ser Val Glu Pro Tyr 625 630 635 640 Thr Lys Gln Gln Leu Asn Asn Met Ser Phe Ala Glu Ile Ile Met Gly 645 650 655 Tyr Lys Ile Met Asp Ala Thr Asn Ile Leu Val Ser Pro Leu Val Tyr 660 665 670 Leu Tyr Pro Asp Ile Pro Lys Glu Glu Ala Phe Gly Lys Tyr Cys Arg 675 680 685 Pro Glu Ser Gln Glu His Pro Glu Ala Asp Pro Gly Ser Ala Ala Pro 690 695 700 Tyr Leu Lys Thr Lys Phe Ile Cys Val Thr Pro Thr Thr Cys Ser Asn 705 710 715 720 Thr Ile Asp Leu Pro Met Ser Pro Arg Thr Leu Asp Ser Leu Met Gln 725 730 735 Phe Gly Asn Asn Gly Glu Gly Ala Glu Pro Ser Ala Gly Gly Gln Phe 740 745 750 Glu Ser Leu Thr Phe Asp Met Asp Leu Thr Ser Glu Cys Ala Thr Ser 755 760 765 Pro Met 770 <210> 3 <211> 398 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asn Asp Val Ser Asp Leu Cys Lys Leu Glu Asn Lys Gln Tyr Cys Arg 1 5 10 15 Trp Ser Lys Asn Gln Asp Asp Ser Phe Thr Ile Cys Arg Lys Leu Thr 20 25 30 Tyr Pro Leu Glu Thr Leu Cys Asn Ser Pro Asn Arg Ser Thr Asn Thr 35 40 45 Leu Lys Glu Met Pro Trp Gly His Ile Asn Asn Asn Val Thr Gln Ser 50 55 60 Tyr Ser Ile Gly Tyr Glu Gly Ser Tyr Asp Ala Ser Ala Asp Leu Phe 65 70 75 80 Asp Asp Ile Ala Lys Glu Met Asp Ile Ala Thr Glu Ile Thr Lys Lys 85 90 95 Ser Gln Asp Ile Leu Leu Lys Trp Gly Thr Ser Leu Ala Glu Ser His 100 105 110 Pro Ser Glu Ser Asp Phe Ser Leu Arg Ser Leu Ser Glu Asp Phe Ile 115 120 125 Gln Pro Ser Gln Lys Leu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Asp Ser Arg His 130 135 140 Ser Arg Thr Cys Ser Pro Thr Pro His Phe Gln Ser Asp Ser Glu Tyr 145 150 155 160 Asn Phe Glu Asn Ser Gln Asp Phe Val Pro Cys Ser Gln Ser Thr Pro 165 170 175 Ile Ser Gly Phe His Gln Thr Arg Ile His Gly Ile Asn Arg Ala Phe 180 185 190 Lys Lys Pro Val Phe Tyr Ser Asp Leu Asp Gly Asn Tyr Glu Lys Ile 195 200 205 Arg Ile Phe Pro Glu Asn Asp Lys Gln Gln Ala Ser Pro Ser Cys Pro 210 215 220 Lys Asn Ile Lys Thr Pro Ser Gln Lys Ile Arg Ser Pro Ile Val Ser 225 230 235 240 Gly Val Ser Gln Pro Asp Val Phe Asn His Tyr Pro Phe Ala Glu Cys 245 250 255 His Glu Thr Asp Ser Asp Glu Trp Val Pro Pro Thr Thr Gln Lys Ile 260 265 270 Phe Pro Ser Asp Met Leu Gly Phe Gln Gly Ile Gly Leu Gly Lys Cys 275 280 285 Leu Ala Ala Tyr His Phe Pro Asp Gln Gln Glu Leu Pro Arg Lys Lys 290 295 300 Leu Lys His Ile Arg Gln Gly Thr Asn Lys Gly Leu Ile Lys Lys Lys 305 310 315 320 Leu Lys Asn Met Leu Ala Ala Val Val Thr Lys Lys Lys Thr His Lys 325 330 335 Tyr Asn Cys Lys Ser Ser Gly Trp Ile Ser Lys Cys Pro Asp Ile Gln 340 345 350 Val Leu Ala Ala Pro Gln Leu His Pro Ile Leu Gly Pro Asp Ser Cys 355 360 365 Ser Glu Val Lys Cys Cys Leu Pro Phe Ser Glu Lys Gly Pro Pro Ser 370 375 380 Val Cys Glu Thr Arg Ser Ala Trp Ser Pro Glu Leu Phe Ser 385 390 395 <210> 4 <211> 188 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Gly Tyr Ile Met Gly Phe Ile Ser Lys Glu Arg Glu Arg Ala Ile Leu 1 5 10 15 Ser Thr Lys Pro Pro Gly Thr Phe Leu Leu Arg Phe Ser Glu Ser Ser 20 25 30 Lys Glu Gly Gly Val Thr Phe Thr Trp Val Glu Lys Asp Ile Ser Gly 35 40 45 Lys Thr Gln Ile Gln Ser Val Glu Pro Tyr Thr Lys Gln Gln Leu Asn 50 55 60 Asn Met Ser Phe Ala Glu Ile Ile Met Gly Tyr Lys Ile Met Asp Ala 65 70 75 80 Thr Asn Ile Leu Val Ser Pro Leu Val Tyr Leu Tyr Pro Asp Ile Pro 85 90 95 Lys Glu Glu Ala Phe Gly Lys Tyr Cys Arg Pro Glu Ser Gln Glu His 100 105 110 Pro Glu Ala Asp Pro Gly Ser Ala Ala Pro Tyr Leu Lys Thr Lys Phe 115 120 125 Ile Cys Val Thr Pro Thr Thr Cys Ser Asn Thr Ile Asp Leu Pro Met 130 135 140 Ser Pro Arg Thr Leu Asp Ser Leu Met Gln Phe Gly Asn Asn Gly Glu 145 150 155 160 Gly Ala Glu Pro Ser Ala Gly Gly Gln Phe Glu Ser Leu Thr Phe Asp 165 170 175 Met Asp Leu Thr Ser Glu Cys Ala Thr Ser Pro Met 180 185 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DDIAS_F <400> 5 cttgcagcag ttgttacgaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DDIAS_R <400> 6 gtgaccaagc acttcgagtt 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STAT3_F <400> 7 ggctggacaa tatcattgac c 21 <210> 8 <211> 21 <212> 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Claims

1) 실험군으로 폐암 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 피검물질이 처리된 폐암 세포주에서 DDIAS(DNA damage-induced apoptotic suppressor) 및 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)의 결합수준을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 DDIAS 및 STAT3 단백질의 결합수준을 대조군과 비교하여 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 폐암 치료제 스크리닝 방법.

삭제

제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 DDIAS는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 폐암 치료제 스크리닝 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 STAT3은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 폐암 치료제 스크리닝 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 DDIAS 및 STAT3의 결합은 DDIAS의 C-말단과 STAT3의 C-말단이 결합하는 것을 특징으로 하는 폐암 치료제 스크리닝 방법.

제 5항에 있어서, 상기 DDIAS의 C-말단은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암 치료제 스크리닝 방법.

제 5항에 있어서, 상기 STAT3의 C-말단은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암 치료제 스크리닝 방법.

제 1항에 있어서, 상기 DDIAS은 STAT3과 결합하여 STAT3 타겟 단백질의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 폐암 치료제 스크리닝 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 결합수준은 면역침전법(immunoprecipitation), 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western Blotting), tag-단백질 pull down 분석, 단백질 칩(Protein Chip), 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET), 이분자 형광 상보(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC) 및 효모 이중혼성(Yeast two-hybrid, Y2H)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 폐암 치료제 스크리닝 방법.

삭제

1) 시험관내(In vitro)에서 DDIAS 및 STAT3에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 DDIAS 및 STAT3의 결합수준을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 DDIAS 및 STAT3 단백질의 결합수준을 대조군과 비교하여 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 폐암 치료제 스크리닝 방법.

삭제

1) DDIAS 유전자의 C-말단 및 리포터 유전자의 프로모터에 결합하는 DNA 결합 도메인(DNA-binding domain, DNA-BD)을 융합시킨 이중혼성 벡터를 제조하는 단계;
2) STAT3 유전자의 C-말단 및 리포터 유전자의 전사를 돕는 전사 활성 도메인(transcription activation domain, DNA-AD)을 융합시킨 이중혼성 벡터를 제조하는 단계;
3) 상기 단계 1) 및 단계 2)의 벡터를 동시에 효모에 형질전환하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 형질전환된 효모를 배양하는 단계; 및
5) 피검약물을 형질전환된 효모에 처리한 후, 전사리포터의 활성을 분석하는 단계를 포함하는 폐암 치료제 스크리닝 방법.

제 14항에 있어서, 상기 이중혼성 벡터는 DNA 결합 부위 유전자, 전사 활성 부위 유전자 및 전사 리포터를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암 치료제 스크리닝 방법.

제 15항에 있어서, 상기 DNA 결합 부위 유전자는 GAL4BD인 것을 특징으로하는 폐암 치료제 스크리닝 방법.

제 15항에 있어서, 상기 전사 활성 부위 유전자는 GAL4AD인 것을 특징으로 하는 폐암 치료제 스크리닝 방법.

제 15항에 있어서, 상기 전사 리포터는 베타갈락토시다제(β-galactosidase), 루시퍼라제(luciferase), GFP(green fluorescent protein) 및 CAT(thioredoxin-chloramphenicol acethyl transferase)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폐암 치료제 스크리닝 방법.

제 15항에 있어서, 상기 단계 5)의 분석은 ADE 또는 HIS가 없는 배지에서 형질전환된 균주가 자라는 것을 관찰하는 것을 특징으로 하는 폐암 치료제 스크리닝 방법.