KR102066929B1 - Hsp90 억제제 내성 세포주 및 이를 이용한 항암제 스크리닝 방법 - Google Patents

Hsp90 억제제 내성 세포주 및 이를 이용한 항암제 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Hsp90 억제제 내성 세포주의 제조방법 및 이의 방법으로 제조된 Hsp90 억제제 내성 세포주에 관한 것이다. 또한 본 발명은 Hsp90 억제제 내성 세포주를 이용하여, 상기 세포주에 항암 활성을 나타내는 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 Hsp90 억제제 내성에 관여하는 유전자 마커들을 동정함으로써, Hsp90 억제제 내성 세포주를 제공할 수 있고, Hsp90 억제제 내성 세포주를 통해 Hsp90 억제제 저항성을 극복하고 효과적인 항암 치료를 가능하게 하는 새로운 Hsp90 억제제를 스크리닝할 수 있도록 함으로써 항암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Hsp90 억제제 내성 세포주 및 이를 이용한 항암제 스크리닝 방법 {Hsp90 Inhibitor-resistant cell lines and A method for screening anti-cancer agent using the same}
본 발명은 Hsp90 억제제 내성 세포주의 제조 방법 및 이 제조방법에 의해 제조된 Hsp90 억제제 내성 세포주에 관한 것이다. 또한 본 발명은 Hsp90 억제제 내성 세포주를 이용하여, 상기 세포주에 항암 활성을 보이는 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
Hsp90(Heat-shock-protein 90) 샤페론(chaperon)은 진핵세포 내부에 가장 많이 존재하는 분자성 샤페론 중 하나로 세포성장, 분화, 생존에 관련된 다양한 단백질들의 안정화 및 활성 조절을 담당한다. 클라이언트 단백질(client protein)로 불리는 Hsp90의 기질 단백질에는 50여 가지의 암을 유발하는 단백질들이 포함되어 있는데, Hsp90 활성이 억제될 경우 정상적인 구조를 갖지 못한 Hsp90 클라이언트 단백질들은 프로테아좀에 의해 분해된다. 따라서 Hsp90 활성 억제제는 다양한 암 유발 단백질을 감소시키는 효과를 나타낼 수 있으므로 항암제로 크게 주목 받고 있다.
암의 발생은 세포 성장 조절의 이상으로 인한 무한한 세포분열과 주변 세포로의 전이 등을 동반한다. 따라서, 자가 성장 신호를 통한 세포 증식, 성장 억제 신호에 대한 반응성 저하, 세포사멸 과정으로부터의 회피, 무한 증식 능력의 획득, 지속적인 혈관 증식, 세포 침투와 전이 등이 암에서 나타나는 여섯 가지 특징으로 제시되고 있다. Hsp90에 의해 그 구조적 안정성과 활성이 조절되는 많은 클라이언트 단백질들이 이러한 암세포로의 분화 과정에 관여하고 있다. 또한, Hsp90는 불안정한 상태의 단백질을 보호함으로써 생물체의 진화를 유발함이 알려져 있는데, 형질전환 과정에서 생겨난 v-Src, Bcr-Abl, p53등의 불안정한 돌연변이 단백질들이 Hsp90에 의해 안정화됨으로써 암세포로의 분화가 촉진되는 결과를 초래하게 된다. 한편, 암세포에서는 Hsp90의 발현 및 활성이 증가하는 현상이 관찰되는데, 이는 암세포 주변의 환경조건 [저산소증(hypoxia), pH, 영양분의 고갈] 또는 암 유발 단백질을 활성화시키는 스트레스 조건에 의한 Hsp90 의 발현 및 활성 유도에서 그 원인을 찾을 수 있다. 암세포의 Hsp90가 정상세포에 존재하는 Hsp90에 비해 활성이 높은 상태로 존재한다는 사실은 Hsp90 억제제를 실제 항암제로 사용할 수 있는 근본적인 이유가 되기도 한다. 이러한 높은 활성을 가지는 암세포의 Hsp90가 Hsp90억제제에 대한 강한 결합력을 보임으로써, Hsp90 억제제가 정상세포에는 비교적 적은 영향을 미치면서 선택적으로 암세포에 효과를 발휘할 수 있다는 사실이 이미 알려져 있다 (문헌 [항암제 및 퇴행성 신경질환 치료제로써의 Hsp90 억제제 개발 동향, 생화학분자생물학 뉴스 12월호] 참조).
Hsp90은 대부분의 종양에서 높게 발현되고, Hsp90 억제제는 HER2/neu, EGFR, IGF1R, AKT, RAF-1, IKK, c-Kit, v-SRC, NPM-ALK, BCR-ABL, p53, STAT3, HIF1, 및 CDK4/6 를 포함하는 Hsp90 클라이언트 단백질의 프로테오좀(proteasomal) 분해를 유도한다. 그리고, AKT-활성화된 종양은 Hsp90 억제제에 대해 민감한 것으로 알려져 있다.
고형암에서 Hsp90 억제제인 AUY922을 이용하는 많은 임상적 시도가 세계적으로 이루어지고 있으며, 무엇보다 AUY922는 이러한 임상 시험에서 낮은 독성을 나타낸다. MTD(Maximum Tolerated Dose, 최대 내성 용량)는 주당 1회 50-70 mg/m2(kg) 이며, Cmax(최고 혈중 농도) (ng/mL)는 1278 ± 506 이나 AUC(Area Under the blood Concentration versus time curve, 혈중농도곡선하 면적) (ng.h/mL)은 13457 ± 6200 이다. 그러나, 안타깝게도 Hsp90 억제제 NVP-AUY922은 단일제제 활성에 한정되는 것으로 나타났으며, 2014년 12월에 시행된 2상의 폐암 연구에서 효과가 확인되지 않았다. AUY922를 비롯한 많은 HSP90 억제제들이 여전히 단독 및 병용 요법으로 전임상 및 임상 단계에서 연구되고 있지만, 현재 임상 시험 단계에서, 2세대 Hsp90 억제제는 임상 3상에서 저항성 메커니즘(resistance mechanism)의 출현에 의하여 성공을 거두지 못하고 있다. 그러므로, 이와 같은 저항성 메커니즘을 극복하기 위한 연구를 통해 새로운 Hsp90 억제제를 개발함으로써 3세대 Hsp90 억제제를 개발하기 위한 필요성이 있으며, 이를 개발하기 위한 새로운 스크리닝 방법 구축에 대한 필요성이 있다.
본 발명자들은, 2세대 Hsp90 억제제에 대한 저항성을 극복하기 위한 연구를 수행하던 중 2세대 Hsp90 억제제의 저항성에 관여하는 유전자 마커를 확인하고 본 발명을 완성하였다. 따라서, 본 발명은 동정된 유전자의 발현을 증가 또는 감소시킴으로써 달성되는 Hsp90 억제제 내성 세포주의 제조방법 및 이 제조방법에 의해 제조된 Hsp90 억제제 내성 세포주, 이를 이용한 Hsp90 억제제 내성 세포주에 항암 활성을 나타내는 3세대 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
따라서 본 발명의 목적은 Hsp90 억제제 내성 세포주의 제조방법을 제공하는 것이다.
보다 구체적으로 본 발명의 목적은 암 세포주에서 표 1에 기재된 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 단계; 또는 표 2에 기재된 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 단계; 를 포함하는, Hsp90(Heat Shock Protein 90) 억제제 내성 세포주의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 제조방법으로 제조된 Hsp90 억제제 내성 세포주를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 표 1에 기재된 158종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 증가된; 또는 표 2에 기재된 112종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 감소된 것을 특징으로 하는, Hsp90 억제제 내성 세포주를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 세포주에서 세포 생존률을 확인하는 단계; 를 포함하는 Hsp90 억제제 내성 세포주에 항암 활성을 나타내는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 세포주에서 표 1 및 표 2에 기재된 270 종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 발현의 변화를 확인하는 단계; 를 포함하는 Hsp90 억제제 내성 세포주에 항암 활성을 나타내는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 표 1에 기재된 158 종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현 억제제 또는 표 2 에 기재된 112종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자를 포함하는, 항암제 보조제를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 표 1 및 표 2 에 기재된 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자를 포함하는, Hsp90(Heat Shock Protein 90) 억제제 내성 진단용 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면 Hsp90 억제제 내성에 관여하는 유전자 마커들을 동정함으로써, Hsp90 억제제 내성 세포주를 제공할 수 있고, Hsp90 억제제 내성 세포주를 통해 Hsp90 억제제 내성을 극복하고 효과적인 항암 치료를 가능하게 하는 새로운 3세대 Hsp90 억제제를 스크리닝할 수 있도록 함으로써 항암 치료제 개발 및 약효 평가에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 K-Ras 돌연변이 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer; NSCLC) 세포주에서 AUY922 (Hsp90 억제제)의 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 AUY922 내성 NSCLC 세포주의 확립을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 AUY922 내성 세포주의 EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition, 상피-중간엽 세포변이) 능력의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 ITGB3 가 AUY922에서 Hsp90 억제제에 대한 내성을 유발함을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 AUY922 처리 후 Hsp90 억제제 내성 세포주 및 Hsp90 억제제 민감성 세포주에서 Axl, Trk3, 비멘틴(Vimentin), PD-L1 발현의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 AUY922 처리 후 Hsp90 억제제 내성 세포주 및 Hsp90 억제제 민감성 세포주에서 베타-카테닌(beta-catenin) 발현의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 AUY922 처리 후 민감성 세포주와 A549S (ITGB3 과다발현 세포주), A549R (약물처리로 유도된 Hsp90 억제제 내성 세포주)에서의 포스포릴화-Src(phosphorylated-Src) 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 AUY922 내성 세포주에서 ITGB3 억제제인 실린지타이드(Cilingitide)에 의한 세포 생존률을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 세포주에 ITGB3, TNFAIP6, TP53I3, TSPAN7, CXCR7, NTRK3, IL11, AXL, 비멘틴(Vimentin), SNAIL2, PD-L1, PD-L2 및 베타-카테닌 (Beta-Catenin) 등 158종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 단계; 또는 PRTFDC1, CCNA1, SGPP2 및 SLPI 등 112종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 단계; 를 포함하는, Hsp90 억제제 내성 세포주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 Hsp90 억제제 내성에 따라 발현이 증가되는 유전자를 표 1에 나타내었으며, 발현이 감소되는 유전자를 표 2에 나타내었다.
상기 Hsp90 억제제 내성 세포주의 제조방법은 세포주에서 본원 발명을 통해 확인한 유전자 마커인 표 1에 기재된 유전자로부터 선택된 1종 이상의 유전자 발현을 증가시키거나, 또는 표 2에 기재된 유전자로부터 선택된 1종 이상의 유전자의 발현을 감소시킴으로써 수행될 수 있다.
Hsp90 억제제 내성 세포주는 암세포주이며, 상기 암은 유방암, 전립선암, 대장암, 흑색종(melanoma) 및 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer; NSCLC)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 암일 수 있다.
본원 명세서에서 민감성이란, 처리된 약물, 바람직하게는 Hsp90 억제제 처리에 의한 결과 세포, 바람직하게는 암세포에서 원하는 효과를 도출할 수 있는 세포의 특징을 말하며, 예컨대 Hsp90 억제제 처리에 의하여 암세포의 생존률이 감소되는 경우, 상기 암세포는 Hsp90 억제제에 민감성인 것으로 정의할 수 있다.
본원 명세서에서 저항성 또는 내성이란, 처리된 약물, 바람직하게는 Hsp90 억제제를 처리하였음에도 불구하고 세포, 바람직하게는 암세포에서 원하는 효과가 도출되지 않는 세포의 특징을 말하며, 예컨대 Hsp90 억제제 처리에 의하여 암세포의 생존률 등이 영향받지 않는 경우, 상기 암세포는 Hsp90 억제제에 내성 또는 저항성인 것으로 정의할 수 있다.
Hsp90 억제제 내성 세포주를 제조하기 위하여, Hsp90 억제제 내성 세포주에서 발현이 증가되어 있는 것으로 본 발명을 통해 확인된 마커인 표 1에 기재된 158종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 세포주에서 증가시킬 수 있으며, 바람직하게는 ITGB3, AXL, Vimentin, NTRK3, 베타-카테닌 (Beta-Catenin) 의 발현을 증가시킬 수 있다. ITGB3(NM_000212) 은 인간에서 인테그린 베타-3(integrin beta-3) 또는 CD61을 암호화하는 유전자로 세포 표면에서 발현되며 다른 인테그린들과 결합하여 암을 포함한 다양한 질병의 진행에서 그 신호전달에 관여한다고 알려져 있다. AXL와 NTRK3는 타이로신 키나제 수용체(Tyrosine kinase receptor)로써 세포의 분열과 증식에 관여함이 증명되어 있다. 비멘틴(Vimentin) 은 대표적인 암전이 마커로 알려져 있다. 베타-카테닌 (Beta-Catenin)은 세포 발달 등 다양한 기능에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 특히 세포의 성장과 세포간 부착을 조절하고 Wnt 신호전달 경로에서 세포 내 신호 변환기로 작용하는 것으로 알려져 있다.
Hsp90 억제제 내성 세포주를 제조하기 위하여, Hsp90 억제제 내성 세포주에서 발현이 감소되어 있는 것으로 본 발명을 통해 확인된 마커인, 표 2에 기재된 112종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 세포주에서 감소시킬 수 있다.
상기 Hsp90 억제제 민감성 세포주는 KRAS 돌연변이 세포주일 수 있으며, 바람직하게는 2세대 Hsp90 억제제에 민감성인 세포주일 수 있고, 예컨대 Hsp90 억제제 민감성 암세포, 예컨대 비소세포성 폐암세포주일 수 있고, AUY922 등의 처리에 의해 세포의 사멸이 유도되는 암세포 일 수 있다.
상기 Hsp90 억제제 내성 세포주는 Hsp90 억제제의 지속적이고 연속적인 노출을 통해 얻을 수 있으며, 본원 발명의 구현에에서는 Hsp90 억제제 민감성 세포주에 2세대 Hsp90 억제제를 농도를 증가시키면서 처리하여 Hsp90 억제제 내성 세포를 얻는 방법을 개시한다.
상기 유전자 발현의 증가는 당 분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 유전공학적 기법을 통해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 표 1에 기재된 158종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자를 포함하는 벡터의 도입에 의해 유도될 수 있다.
"벡터(vector)"라는 용어는 다른 핵산을 그것이 연관된 곳으로 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 상기 벡터는 유전자를 목적 세포에 전달할 수 있는 플라스미드(plasmid), 코스미드(cosmid) 또는 파지(phage)를 제한없이 포함한다.
또한 상기 유전자 발현의 감소는 표 2에 기재된 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스-올리고뉴클레오티드(antisense-oligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA 또는 이를 포함하는 벡터; 및 표 2에 기재된 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자에 의해 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 억제제에 의해 유도되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 Hsp90 억제제 내성 세포주에 관한 것이다.
상기 Hsp90 억제제 내성 세포주는 Hsp90 억제제 민감성 세포주와 달리 Hsp90 억제제에 대하여 높은 IC50 값을 나타내며 Hsp90 억제제를 처리하더라도 예컨대 pMEK, pERK 및 pAkt의 감소가 관찰되지 않는 등 클라이언트 단백질의 변화 양상이 변화된 세포주이다. 또한 제조된 Hsp90 억제제 내성 세포주는 민감성 세포주와 비교하여 이동 및 침습 능력이 증가된 세포주일 수 있다.
보다 구체적으로 본원 발명의 Hsp90 억제제 내성 세포주는 표 1에 기재된 158종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 증가된; 또는 표 2에 기재된 112종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 감소된, HSP90 억제제 내성 세포주일 수 있다.
바람직하게는 본원 발명의 Hsp90 억제제는 2세대 Hsp90 억제제일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 AUY922, AT13387, STA9090(Ganetespib), CNF2024/BIIB021, CUDC-305, PU-H71, NVP-HSP990, KW-2478, ATI3387, SNX-5422, DS-2248, XL888및 MPC3100 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본원 발명에 있어서, 2세대 Hsp90 억제제는 겔다나마이신(Geldanamycin)으로부터 유래된 타네스피마이신(Tanespimycin), 알베스피마이신(Alvespimycin), 레터스피마이신(Retaspimycin), IPI-493과 같은 1세대 Hsp90 억제제와 달리, 완전히 합성되거나 또는 반합성된 약물을 의미한다 (문헌 [Experience with HSP90 inhibitor AUY922 in patients with relapsed or refractory non-Hodgkin lymphoma, Haematologica. 2015 Jul; 100(7): e272-e274.] 참조).
또한 본 발명은 상기 Hsp90 억제제 내성 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 세포주에서 세포 생존률을 확인하는 단계; 를 포함하는 Hsp90 억제제 내성 세포주에 항암 활성을 나타내는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 스크리닝 방법에 따르면, Hsp90 억제제 내성 세포주의 사멸을 유도할 수 있는 물질을 확인함으로써 Hsp90 억제제, 보다 바람직하게는 2세대 Hsp90 억제제에 내성을 갖는 암세포를 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 3세대 Hsp90 억제제를 동정할 수 있다.
상기 후보물질은 단백질 제제, 분자제제, 유전자 기반 제제 등을 제한없이 포함할 수 있으며 항암 활성을 시험하기 위한 물질을 총칭한다.
상기 세포 생존률은 당업계에 공지된 방법을 통해 제한없이 확인할 수 있으며, 일 후보물질을 Hsp90 억제제 내성 세포주에 처리한 후 측정한 세포 생존률이 후보물질을 처리하지 않은 세포주와 비교하여 낮아지는 것으로 측정되는 경우 해당 후보물질이 Hsp90 억제제에 내성인 세포주에서 항암활성을 나타낼 수 있는 치료제인 것으로 판정할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 Hsp90 억제제 내성 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계; 세포주에서 표 1 및 표 2에 기재된 270종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현의 변화를 확인하는 단계; 를 포함하는 Hsp90 억제제 내성 세포주에 항암 활성을 나타내는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 유전자 발현의 변화를 확인하는 방법은 당분야에 공지된 방법을 제한없이 사용할 수 있으며, 일 후보물질을 Hsp90 억제제 내성 세포주에 처리한 후 유전자 발현을 확인하였을 때 표 1에 기재된 158종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 후보물질을 처리하지 않은 세포주와 비교하여 낮아지는 것으로 확인되거나, 표 2에 기재된 112종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 후보물질을 처리하지 않은 세포주와 비교하여 증가하는 것으로 확인되는 경우 상기 후보물질이 Hsp90 억제제에 내성인 세포주에서 항암활성을 나타낼 수 있는 물질인 치료제인 것으로 판정될 수 있다.
또한 일 후보물질을 Hsp 90 억제제 내성 세포주에 처리한 후, 단백질 발현을 확인하였을 때 표 1에 기재된 158종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 발현이 후보물질을 처리하지 않은 세포주와 비교하여 낮아지는 것으로 확인되거나, 표 2에 기재된 112종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 발현이 후보물질을 처리하지 않은 세포주와 비교하여 증가하는 것으로 확인되는 경우, 상기 후보물질이 Hsp90 억제제에 내성인 세포주에서 항암 활성을 나타낼 수 있는 물질인 치료제인 것으로 판정될 수 있다.
상기 유전자 또는 단백질의 발현 변화는 당분야에 알려진 통상의 방법을 이용하여 확인할 수 있으며, 예컨대 마이크로어레이(microarray), 웨스턴 블랏(western blot)과 같은 방법을 이용하여 확인할 수 있다.
또한 본 발명은 표 1에 기재된 158종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자의 발현억제제 또는 표 2에 기재된 112종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현을 유도하는 발현 유도물질을 포함하는 포함하는, 암 예방 또는 치료용 항암제 보조제 또는 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본원 발명의 항암 보조제는 항암제의 효과를 증진시킬 수 있는 물질을 말하며 항암 감작제와 동일한 의미로 사용될 수 있다. 이는 항암제, 특히 Hsp90 억제제에 대한 저항성을 제거하고, Hsp90 억제제에 대한 내성을 갖는 개체에 Hsp90 억제제와 함께 투여함으로써, Hsp90 억제제의 효과를 발휘할 수 있도록 돕는 물질을 말한다. 상기 감작제는 약물에 대한 암세포의 감수성을 증가시키거나, 약물이 암세포 특이적으로 작용하도록 하여 적은 투여량으로도 치료 효과를 달성할 수 있도록 돕는 물질을 말하며, 특히 본 발명에서는 Hsp 90 억제제 내성 세포에서 Hsp 90 억제제에 대한 감수성을 증가시킬 수 있도록 돕는 물질을 의미한다.
본원 발명에 있어 상기 발현 유도물질은 표 2에 기재된 112종의 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 전사인자 또는 상기 전사인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 물질일 수 있다.
상기 암은 Hsp90 억제제 저항성일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2세대 Hsp90 억제제 저항성 암일 수 있고, 유방암, 전립선암, 대장암, 흑색종 및 비소세포성 폐암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 암일 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼제(유제), 시럽제, 에어로졸제 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제에는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylen glycol), 올리브 오일(olive oil)과 같은 식물성 기름, 에틸 올레에이트(ethyl oleate)와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴(glycerogelatin) 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료, 면역치료제 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 표 1 및 표 2 에 기재된 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자를 포함하는, Hsp90(Heat Shock Protein 90) 억제제 내성 진단용 마커 조성물에 관한 것이다.
상기 표 1 및 표 2에 기재된 유전자는 Hsp90 억제제, 바람직하게는 2세대 Hsp90 억제제, 더욱 바람직하게는 AUY922 에 대하여 민감성을 나타내는 세포주 대비 내성을 나타내는 세포주에서 발현이 현저히 증가 또는 감소된 유전자로, 이들의 발현을 확인하여, 해당 세포주가 Hsp90 억제제 내성 암 세포인지 여부를 진단할 수 있다.
본 발명의 용어 “진단”이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것으로서, 본 발명의 목적상, Hsp90 억제제 내성 암 여부를 확인하는 것뿐만 아니라 Hsp90 억제제 내성 암의 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등과 같은 경과를 판단하는 것을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로 암 세포주에서 상기 표 1에 기재된 유전자가 Hsp90 억제제 민감성 세포 대비 발현이 증가되어 있는 경우, 또는 표 2에 기재된 유전자가 Hsp90 억제제 민감성 세포 대비 발현이 감소되어 있는 경우, 해당 세포를 Hsp90 억제제 내성 암 세포인 것으로 진단할 수 있다.
또한 본 발명은 표 1 및 표 2 에 기재된 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 이들로부터 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 Hsp90(Heat Shock Protein 90) 억제제 내성 진단용 마커 조성물을 제공할 수 있다.
상기 "발현수준을 측정하는 제제"란 Hsp90 억제제 처리에 의해 발현이 상향조절되는 유전자인 표 1 또는 발현이 하향 조절되는 표 2 유전자의 발현 수준 또는 이들로부터 코딩되는 단백질의 발현을 확인함으로써 유전자 또는 단백질의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하고, 바람직하게는 상기 유전자 또는 단백질에 특이적인 항체, 프라이머(Primer) 또는 프로브(Probe)를 의미한다.
또한 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 Hsp90 억제제 내성 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 Hsp90 억제제 내성 진단용 키트는 암에 Hsp90 억제제 내성을 부여할 수 있는 표 1 및 표 2 의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 또는 이들로부터 코딩되는 단백질의 수준을 측정할 수 있는 제제 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실험예. 비소세포성 폐암에서 2세대 HSP90 억제제 효과 확인
세포 배양 및 시약
인간 비소세포성 폐암(NSCLC)세포주인 H23, H358, H647, H1944 및 A549 은 모두 ATCC (Manassas, VA, USA) 에서 구입하여 사용하였다. 이들 세포주들은 10% 우태아혈청(GIBCO) 를 함유하는 RPMI-1640에서 37℃, 5%CO2 환경에서 자라게 하였다.
NVP-AUY922 (Luminespib) 및 STA-9090 (Ganetespib) 은 Selleck Chemicals (Houston, TX, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 최종 농도 100mM 으로 만들기 위하여 DMSO에 용해시키고, -80℃에서 저장한 이후 실험에 사용하였다.
2세대 Hsp90 억제제 효과 확인
단일 제제로서 세포 생존을 억제하는 AUY922의 능력을 평가하기 위하여, KRAS 돌연변이 비소세포성폐암 세포주 (H1944, H358, H23, A549 및 H647) 에 AUY922를 72시간 동안 처리하였고 세포 생존률 및 IC50 값을 확인하였다. 세포 생존률은 제조사의 매뉴얼에 따라 CellTiter-Glo luminescent assay (Promega, Madison, WI, USA) 를 이용하여 측정하였다. 간단하게 3x103 세포들을 90ul 부피의 미세적정 플레이트(microtiter plate) 내 트리플리케이트 웰(triplicate well)에 플레이팅하였다. 다음날, 상기 세포들을 최종 부피 100uL 에서 원하는 농도의 AUY922 와 함께 배양하였다. 72시간 뒤, 100uL 의 CellTiter-Glo 시약을 첨가하고 세포들을 실온에서 10분동안 배양하였다. 형광을 Wallac 1420 (PerkinElmer, Boston, MA, USA)에서 확인하여, 세포 생존율을 확인하였다.
또한 상기 세포주들에 AUY922 1000 nM를 24시간 동안 처리하고, 단백질 발현 수준의 변화를 웨스턴 블랏팅을 통해 확인하였다. 보다 구체적으로 세포들을 얼음상에서 프로테아제 저해제 칵테일(protease inhibitor cocktail) (Roche, Mannheim, 독일) 및 인산가수분해효소 억제제 [1 mM 소듐 플루오라이드(sodium fluoride) 및 2 mM 소듐 오르토바나데이트(sodium orthovanadate)] 를 갖는 변형된 RIPA 용해 완충액 (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1% NP-40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 0.1% SDS, 및 50 mM Tris-HCl [pH 7.4]) 에서 30분 동안 현탁시키고, 전체 세포 용해물을 수집하기 위하여 30분 동안 15,000g으로 원심분리하였다. 1020 μg의 단밸질들을 812% SDS-PAGE 에서 분리하였고 PVDF 막(Millipore, Bedford, MA, USA) 으로 이동시켰다. 웨스턴 블랏팅을 특이적 일차항체 및 페록시다아제-접합 항-마우스 또는 항-래빗 이차 항체를 이용하여 수행하였다. 단백질을 ECL Plus 증강 화학발광 시약(enhanced chemiluminescence reagents) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)으로 시각화하였다. 이하 실시예에서 상용 항체로 phospho-ERK, phospho-MEK, Akt, phospho-Akt, c-Raf, phospho-SRC, ITGB3, β-액틴(β-actin) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)를 이용하였다. 웨스턴 블랏 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 A 에 나타낸 바와 같이 각 세포주의 조직학적 분석결과 및 IC50은 대부분의 NSCLC 세포에서 AUY922 의 IC50은 30nM 이하인 것으로 나타났다.
도 1B에 나타낸 바와 같이 Hsp90 클라이언트 단백질(client proteins)의 발현은 24시간동안 AUY922 1000nM 를 처리한 결과 감소하는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 통해 2세대 Hsp90억제제는 KRAS 돌연변이 비소세포성폐암 세포주들에서 우수한 항암 효과를 나타내며, Hsp90 클라이언트 단백질 발현의 감소를 유도한다는 것을 확인하였다.
실시예 1. Hsp90 억제제 내성 세포 수립 및 Hsp90 억제제 내성 확인
Hsp90 억제제 내성 세포 수립
AUY922 저항성 세포인, A549R 및 H1944R 을 수개월 동안의 AUY922 에 대한 연속적인 노출에 의해 수득하였다. 보다 구체적으로 다음과 같은 방법을 통해 내성 세포를 수득하였다.
A549 및 H1944 세포를 10% FBS(Gibco) 및 1% 페니실린/스트렙토마아신 (Gibco)가 보충된 RPMI 1640 (Welgene) 내 100 mm 디쉬에 분주하였다.
NVP-AUY922 를 1nM 시작 농도로 첨가하였으며, 3일 마다 약물을 포함하는 배지를 교체하면서 세포를 유지시켰다. 세포는 100% 컨플루언스에 도달할 때까지 계대배양하였다. 주어진 약물 농도에서 매 5번 계대배양 이후, NVP-AUY922 는 최종 농도인 1uM까지 증가시키면서 첨가하였다. 이를 통해 수득한 저항성 세포주들을 각각 A549R 및 H1944R 로 명명하였으며, 1 uM NVP-AUY922 를 함유하는 10% FBS 가 보충된 RPMI 1640에서 유지시켰다.
저항성 세포에서 2세대 Hsp90 억제제 내성 확인
수립된 A549R 및 H1944R 에서 보편적인 2세대 Hsp90 억제제에 대한 내성을 확인하기 위하여 2세대 Hsp90 억제제인 AUY922 및 STA-9090을 처리하고 이의 세포 생존률을 Hsp90 억제제 내성을 나타내지 않는 A549, H1944 (이하, Hsp90 억제제 민감성 세포)와 비교하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 세포 생존률에 대한 실험은 상기 실험예와 동일한 방법으로 수행하였다.
도 2A 및 2B에 나타낸 바와 같이 AUY922 내성 세포주인 A549R 및 H1944R은 AUY922뿐만 아니라 다른 2세대 Hsp90 억제제인 STA-9090 처리에 대해서도 Hsp 억제제 민감성 세포와 비교하여 더욱 높은 IC50 값을 나타내어, Hsp90 억제제에 대한 내성을 가진 세포주임을 확인하였다.
Hsp90 억제제에 대해 내성을 갖는 세포에서 내성의 매커니즘을 확인하기 위하여, Hsp90 억제제의 클라이언트 단백질의 발현의 변화를 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 부모세포인 A549 및 H1944 세포와 이의 저항성 세포인 A549R 및 H1944R에 AUY922 를 처리하고 클라이언트 단백질의 변화를 실험예와 동일한 웨스턴 블랏을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 2의 C에 나타내었다.
도 2의 C에 나타낸 바와 같이 RAF 및 AKT 는 Hsp90 억제제의 클라이언트 단백질이므로 AUY922 는 Hsp90 억제제 민감성 세포에서 pMEK, pERK 및 pAKT을 감소시켰다. 그러나 Hsp90 억제제에 대해 내성을 갖는 A549R및 H1944R 세포에서는 이들 단백질의 수준이 감소되지 않는 것을 확인하였다. 상기와 같은 결과를 통해 Hsp90 내성을 가진 세포가 확립되었음을 확인하였다.
실시예 2. 내성 세포에서 EMT 능력 변화 확인
Hsp90 억제제 내성 세포주에서 EMT(epithelial-mesenchymal transition, 상피-중간엽 세포 변이) 능력의 변화를 확인하였다. 보다 구체적으로 A549, A549R, H1944, H1944R 의 세포 성장 속도 및 이동, 침습 능력의 변화를 확인하였으며, 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, A549R 세포주는 증식 특성이 변화하지 않았으나, H1944R 세포주는 Hsp90 억제제 민감성인 H1944 세포주와 비교하여 성장이 증가하였다. 또한 이동 챔버 및 침습 챔버를 이용한 이동 및 침습 분석에서, 두 개의 내성 세포주들은 모두 Hsp90 억제제 민감성 세포와 비교하여 이동 및 침습 능력이 증가된 것을 확인하였다. 상기와 같은 결과를 통해 Hsp90 억제제 내성 세포주들은 기존의 세포주와 비교하여 EMT 능력이 달라진 새로운 세포주임을 확인하였다.
실시예 3. Hsp90 억제제 내성 세포주에서의 발현 특성 분석
Hsp90 억제제 내성 세포주의 유전자 마커를 확인하기 위하여 cDNA 마이크로어레이를 이용하여 A549R 및 H1944R 세포에서 DEGs(Differentially Expressed Genes) 를 분석하였다. 보다 구체적으로 A549, A549R, H1944, H1944R 을 1mM AUY922로 처리하고 수확하였으며, RNA 시료를 RNeasy kit (Qiagen)를 이용하여 분리하였다. 마이크로어레이를 Affymetrix GeneChip human genome U133 plus 2.0 arrays (Macrogen, Seoul, Korea)를 이용하여 수행하였다. 데이터는 global scaling (GenPlex)을 통하여 표준화하였으며, 유전자들을 log2 (fold-change) 값에 기초하여 선별하였다: 검출값에 대하여 'p < 0.05'인 상향되거나 하향된 유전자들을 A549R 및 H1944R 분석에서 선별하였다. 유의적 유전자들에 대한 분석을 Welch's t-test를 이용하여 수행하였다. DEGs를 Hsp90 억제제 민감성 세포주 및 AUY922 내성 세포주에서 확인하였다. FDR(False discovery rate, 오류 발견율) 및 본페로니 정정된(Bonferroni-corrected) p-값을 계산하였다. 상기와 같은 분석을 통해 약 295종의 유전자가 상향발현되거나 하향발현되는 것을 확인하였으며, 저항성 세포에서 2배 이상 발현이 증가된 유전자들 157종은 하기 표 1a, 감소된 유전자 112종은 표 2a 에 나타내었다.
[표 1a]
Figure 112017102829127-pat00001
Figure 112017102829127-pat00002
Figure 112017102829127-pat00003
Figure 112017102829127-pat00004
Figure 112017102829127-pat00005
Figure 112017102829127-pat00006
Figure 112017102829127-pat00007
[표 2a]
Figure 112017102829127-pat00008
Figure 112017102829127-pat00009
Figure 112017102829127-pat00010
Figure 112017102829127-pat00011
Figure 112017102829127-pat00012
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표 1a에 나타낸 바와 같이, Hsp90 억제제 내성 세포에서 2배 이상 상향 발현되는 유전자 157종이 확인되었으며, 이 중에서 발암성 유전자로 알려져 있는 ITGB3, TNFAIP6, TP53I3, TSPAN7, CXCR7, NTRK3, IL11 역시 높은 발현 증가를 나타냄을 확인하였다. 특히, AXL, 비멘틴(Vimentin), SNAIL2 은 다양한 암종에서 전이 및 약물 저항성과 상관관계가 있다. 면역-체크포인트(immune checkpoint) 관련 단백질, PD-L1 및 PD-L2 역시 내성 세포들에서 발현이 증가되었다.
표 2a에 나타낸 바와 같이, Hsp90 억제제 내성 세포주에서 종양 억제자로 알려진, PRTFDC1, CCNA1, SGPP2, SLPI 등을 포함한 112종의 유전자의 발현이 하향 조절되었다.
특히 도 4에 나타낸 바와 같이 마이크로어레이 데이터와 일치하는 결과로 A549R 및 H1944R 세포에서 ITGB3 의 단백질 및 mRNA 수준이 Hsp90 억제제 민감성 세포주와 비교하여 현저히 증가되어 있는 것을 확인하였다.
또한 AUY 922를 처리하는 경우 Hsp90 억제제 민감성 세포주와 Hsp90 억제제 내성 세포주에서 상기 표에서 확인한 유전자들의 발현 변화가 다르게 나타나는지 여부를 확인하였으며 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, Hsp90 억제제 내성세포주에서 상향발현되는 유전자로 확인된 Axl은 AUY922 처리 후 민감성 세포주에서는 감소하는 반면 Hsp90 억제제 내성 세포주에서는 발현이 감소하지 않았다. 표 1a에서 상향발현되어 있는 유전자로 확인된 Trk3와 비멘틴(Vimentin) 역시 AUY922를 처리하더라도 Hsp90 억제제 내성 세포주에서는 발현이 감소되지 않고 증가된 상태를 유지하였다. 또한 면역 체크포인트 중 하나인 PD-L1 은 Hsp90 억제제 내성 세포주에서 감수성 세포주보다 많이 증가되어 있는 것을 확인하였으며, 이와 같은 결과를 통해 본 발명의 Hsp90 억제제 내성 마커 및 Hsp90 억제제 내성 세포주를 이용하는 경우, Hsp90억제제 저항성 환자를 치료하기 위한 새로운 병용요법의 타깃, 예컨데 PD-L1을 포함하는 면역치료제를 병용하는 병용 요법에 대한 예측이 가능하며 이를 활용하여 Hsp90 억제제 내성 환자를 치료하기 위한 새로운 치료법을 개발할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. Hsp90 억제제 내성 세포주에서의 베타-카테닌 발현 특성 분석
실시예 3에서 확인한 결과에 더하여, 추가적으로 A549R 및 H1944R 세포에서 베타-카테닌의 발현을 분석하였다. A549, A549R, H1944, H1944R 에 1μM AUY922를 처리하고 수확하였으며, 유전자 발현의 변화는 웨스턴 블랏과 면역화학분석을 통해 확인하였다. 보다 구체적으로 NuPAGE Mops SDS running buffer (Invitrogen) 을 이용한 NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (Invitrogen) 상에서, 전기영동을 통해 세포질 분획을 분리하였다. 단백질들은 폴리 PVDF (polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰으며, 5% 소 혈청 알부민으로 차단하고, 항-베타-카테닌 항체 (Cell Signaling Technologies) 를 1차 항체로, 항-β-액틴항체 (Abcam) 를 2차 항체로 하여 함께 배양하였다. 그 후 강화된 chemiluminescence (Pierce) 을 이용하여 신호를 검출하였다. 또한 면역화학분석을 위하여 A549 및 A549R 세포를 1×105 로 웰에 분주하였다. 세포들을 얼음상의 3.7% 파라포름알데히드에서 15 분동안 배양하였으며, 0.1% PBS-T (phosphatebuffered saline with Tween 20) 로 세척하고 0.5% PBS-T로 5분동안 투과시켰다. 이 후 세포들을 0.1% PBS-T로 다시 세척하고 1시간 동안 10% 소 혈청 및 0.5% 젤라틴이 포함된 PBS 에서 배양하였으며, 0.1% PBS-T 로 최종 세척하였다. 고정된 세포들을 1:100로 희석된 항-베타-카테닌 항체와 1시간동안 실온에서 함께 배양하고 0.1% PBS-T 로 세척한 후 실온에서 1시간 동안 1:200으로 희석된 형광 아이소싸이오사이아네이트(isothiocyanate) 접합-항-토끼 면역글로불린 G 항체 (Jackson ImmunoResearch Inc.)와 함께 다시 배양하였다. 그 결과를 도 6 에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 베타-카테닌은 저항성 세포인 A549R 및 H1944R 세포에서 더 상향 발현되어 있었으며, HSP90 억제제인 AUY99 처리 후에도 민감성 세포인 A549 및 H1944 세포와 비교하여 발현이 감소되지 않고 뚜렷한 증가를 나타내었다.
실시예 5. ITBG3 과다발현 안정 세포주의 제조 및 저항성 확인
ITBG3 과다발현 안정 세포주를 pcDNA3.1/ITGB3 벡터를 이용한 형질감염을 통해 제조하였으며, 항생제 G418 500ug/ml 를 이용하여 선별하였고, 이를 내성 세포주인 A549S로 기재하였다. 또한 비교를 위해 약물처리를 통해 수득된 내성 세포주인 A549R과 미처리 A549 세포주를 이용하여 저항성을 확인하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이 ITGB3 과다발현 안정적 세포인 A549S은 AUY922 에 대한 용량-의존적 저항성을 나타내었다.
또한, AUY922 를 처리하거나 처리하지 않은 AUY922 내성 및 민감성 세포에서 포스포릴화-Src(phosphorylated-Src)를 western blot 방법으로 확인하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 포스포릴화-Src(phosphorylated-Src)는 ITGB3의 하위 신호전달이며, 민감성 세포주와 달리 내성 세포주에서는 AUY922 처리 후에 감소되지 않았다. 이러한 결과는 앞서 실시예 3에서 확인된 저항성 세포에서 2배 이상 발현이 증가되거나 감소된 유전자들이 실제 AUY922 의 저항성과 관련이 있음을 확인하는 결과이며, 이들의 발현 조절을 통해 AUY922 내성 세포주를 제조할 수 있음을 보여주는 결과이다.
상기와 같이 제조된 내성 세포주 및 이들에서 발현이 변화된 유전자를 타깃으로 하여 내성 세포주에 효과를 나타내는 새로운 항암제를 스크리닝할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 과다 발현된 ITBG3 을 타깃으로 하는 억제제를 단독으로 또는 AUY922 와 함께 조합하여 투여하였다. 실렌지타이드(Cilengitide)는 인테그린 알파 v(ITGAv) 표적 억제제로 알려져 있으며, 인터그린 알파 v(ITGAv) 및 인테그린 베타 3(ITGB3) 사이의 결합을 차단하는 것으로 알려져 있으므로, 실렌지타이드를 ITGB3 를 타깃으로 하는 억제제로 사용하였다. 실렌지타이드를 AUY922, AUY922R, H1944, H1944R 세포에 단독으로 또는 AUY922와 조합하여 투여하고 각 세포의 세포 생존률을 확인하였으며 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 실렌지타이드는 A549R 및 H1944R와 같은 내성 세포주보다 ITGB3 가 적게 발현하는 민감성 세포주에서는 뚜렷한 효과를 나타내지 않는 것으로 나타났다. 그러나 AUY922 내성 세포주에서 실렌지타이드는 단일제제로 효과를 나타내었으며, AUY922 를 함께 처리하는 경우 시너지 효과를 나타내었다(ED30, 50 및 90에서 CI 값< 1).
상기와 같은 결과를 통해, 단일 투여시 내성 세포주에서 효과를 나타내지 못했던 AUY922 와 실렌지타이드를 병용 처리하는 경우, 실린지타이드가 내성 세포주에서 발현이 증가된 ITGB3 의 발현 또는 활성을 저해함으로써, 시너지 효과를 유도하여 암세포의 세포 생존률을 더욱 감소시킬 수 있음을 확인하였으며, 실린지타이드를 저항성을 갖는 항암제의 항암 활성을 높이는 보조제로서 사용할 수 있음을 확인하였다. 따라서, AUY922와 같은 2세대 Hsp 억제제 내성 세포주에서 발현이 증가된 내성 관련 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 물질, 또는 AUY922 내성 세포주에서 발현이 감소된 내성 관련 유전자의 발현을 유도하는 유도물질을 스크리닝하고선별함으로써 2세대 Hsp 억제제 내성을 극복하고 항암 효과를 달성하기 위한 항암 보조제로 사용할 수 있음을 알 수 있다.
상기 실시예를 통해 Hsp90 억제제 내성 세포주를 확립하고, 내성과 관련있는 유전자의 발현 변화를 확인함으로써 내성 세포주에 효과를 나타내는 새로운 항암제 및 보조제, 감작제를 스크리닝할 수 있음을 확인하였으며, 상기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 자명할 것이다.

Claims (15)

  1. 암 세포주에서 ITGB 3 (Gene Accession number: NM_000212) 의 유전자 발현을 증가시키는 단계; 를 포함하는 Hsp90 억제제 내성 세포주에 항암 활성을 나타내는 치료제의 스크리닝용 Hsp90(Heat Shock Protein 90) 억제제 내성 세포주의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 발현 증가는 ITGB 3 (Gene Accession number: NM_000212) 유전자를 포함하는 벡터의 도입에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는, Hsp90 억제제 내성 세포주에 항암 활성을 나타내는 치료제의 스크리닝용 Hsp90 억제제 내성 세포주의 제조방법.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된, Hsp90 억제제 내성 세포주를 포함하는 Hsp90 억제제 내성 세포주에 항암 활성을 나타내는 치료제의 스크리닝용 조성물.
  4. ITGB 3 (Gene Accession number: NM_000212) 유전자의 발현이 증가된 Hsp 90 억제제 내성 세포주를 포함하는 Hsp90 억제제 내성 세포주에 항암 활성을 나타내는 치료제의 스크리닝용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 세포주는 표 1에 기재된 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 증가되거나,
    표 2에 기재된 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 감소된 것을 특징으로 하는, Hsp90 억제제 내성 세포주를 포함하는 Hsp90 억제제 내성 세포주에 항암 활성을 나타내는 치료제의 스크리닝용 조성물.
    [표 1]
    Figure 112019087446104-pat00038

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    Figure 112019087446104-pat00046

    [표 2]
    Figure 112019087446104-pat00047

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    Figure 112019087446104-pat00054

  6. 제4항에 있어서, 상기 Hsp90 억제제는 2세대 Hsp90 억제제인, Hsp90 억제제 내성 세포주를 포함하는 Hsp90 억제제 내성 세포주에 항암 활성을 나타내는 치료제의 스크리닝용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 2세대 Hsp90 억제제는 AUY922, AT13387, STA9090(Ganetespib) CNF2024/BIIB021, CUDC-305, PU-H71, NVP-HSP990, KW-2478, ATI3387, SNX-5422, DS-2248, XL888 및 MPC3100 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, Hsp90 억제제 내성 세포주를 포함하는 Hsp90 억제제 내성 세포주에 항암 활성을 나타내는 치료제의 스크리닝용 조성물.
  8. 제4항에 있어서, 상기 세포주는 Hsp90 억제제 민감성 세포주와 비교하여 이동 또는 침습 능력이 증가된 것을 특징으로 하는 Hsp90 억제제 내성 세포주를 포함하는 Hsp90 억제제 내성 세포주에 항암 활성을 나타내는 치료제의 스크리닝용 조성물.
  9. 제4항의 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    상기 세포주에서 세포 생존률을 확인하는 단계; 를 포함하는 Hsp90 억제제 내성 세포주에 항암 활성을 나타내는 치료제의 스크리닝 방법.
  10. 제4항의 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    상기 세포주에서 ITGB 3 (Gene Accession number: NM_000212) 유전자 또는 ITBG3 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 발현 변화를 확인하는 단계; 를 포함하는 Hsp90 억제제 내성 세포주에 항암 활성을 나타내는 치료제의 스크리닝 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. ITGB3 (Gene Accession number: NM_000212) 의 유전자를 포함하는, Hsp90(Heat Shock Protein 90) 억제제 내성 진단용 마커 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 하기 표 3 및 제5항의 표 2 에 기재된 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자를 더 포함하는, Hsp90(Heat Shock Protein 90) 억제제 내성 진단용 마커 조성물.
    [표 3]
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