KR101207981B1 - 호르몬 불응성 전립선암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그의 스크리닝 방법 - Google Patents

호르몬 불응성 전립선암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 호르몬 불응성 전립선암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 호르몬 불응성 전립선암에 대한 현저한 항암 효능이 있고, 다른 화학 항암제와 관련하여 화학감작제로서도 뛰어난 효능을 나타낸다. 또한 본 발명의 스크리닝 방법은 새로이 규명한 항암 메카니즘을 통해 항암 물질을 정확하고 쉽게 동정할 수 있다.

Description

호르몬 불응성 전립선암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그의 스크리닝 방법{Pharmaceutical Composition for Preventing or Treating Hormone-refractory Prostate Cancer and Method of Screening the Same}
본 발명은 호르몬 불응성 전립선암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
전립선암은 전립선에서 발병하는 악성종양으로써 현재 미국 등의 서구 여러 나라의 남성에서 높은 사망률과 발병률을 가지고 있다. 대부분의 전립선암은 호르몬 의존적인 특징을 가지고 있어서 초기 전립선암 환자의 경우 남성호르몬 박탈요법(androgen deprivation therapy, ADT)로 치료받으며, 대부분의 환자가 처음에는 ADT에 좋은 반응을 보이지만 평균 18 내지 24개월 후에는 일부 환자에서 ADT에 반응하지 않는 암 세포가 발생하게 된다. 이를 호르몬 불응성 전립선암(hormone-refractory prostate cancer)이라 일컫는다. 역사적으로 전립선 암은 항암화학요법(chemotherapy)에 잘 반응하지 않는 암으로 알려져 있다. 그러나, 호르몬 불응성 전립선암에서는 더 이상 남성호르몬 중재와 남성호르몬 수용체에 작용하는 약제들이 효과가 없이 진행을 하기 때문에, 항암화학요법이 관심을 받고 있으며, 많은 항암화학요법을 전립선암 치료에 이용하고자 하는 노력에도 불구하고 뚜렷한 효과를 보이지 못하고 있는 상태이다. 호르몬 불응성 전립선암 치료를 위해 현재 사용되고 있는 화학약제로는 케토코나졸, 도세탁셀, 프레드니손, 에스트라무스틴 등이 있으나, 뚜렷한 치료효과를 나타내지 못하고 있다. 따라서 호르몬 불응성 전이성 전립선암의 더 나은 치료전략을 개발하기 위해선 분자수준에서의 기전 연구가 매우 필요한 상황이다.
암의 성장에 있어서 후생유전학 특징들은 중요하게 영향을 끼치는 요소들이다. 예를 들어 암세포를 억제하는 유전자로 잘 알려진 PTEN(Phosphatase and tensin homolog)의 손실과 같은 돌연변이로 암은 더욱 진보하게 된다. 호르몬 불응성 전이성 전립선암도 역시 PTEN 이 손실됨으로써 AKT-mTOR 경로는 더욱 활성화되고 암세포를 억제하는 단백질인 Rb(Retinoblastoma protein)의 기능이상으로 세포주기에 관여하는 E2F1 경로에 의해 자급자족식의 세포 성장이 더욱 활발해진다.
E2F1는 정상적인 생장 주기를 가진 세포에서 세포성장과 세포사에 관여하는 단백질이다. 세포주기에서 CDK 저해제인 p16과 E2F1의 조절자인 Rb의 돌연변이로 E2F1의 활성화와 E2F1의 과발현에 의해서 세포의 성장이 촉진된다. 최근에 보고된 바에 의하면 암세포에서 E2F1에 의해 유도되는 세포사는 PI3K-AKT 경로와 같은 생존 경로에 의해서 저해되기 때문에 E2F1은 세포의 성장에 관여하게 된다. PI3K-AKT 경로는 BAD, Caspase-9, Mdm2 와 같은 세포고사 유전자를 인산화시킴으로써 저해하는데 관여하는 것으로 알려져 있다. 그러나 호르몬 불응성 전립선암에선 E2F1의 역할과 분자기전에 관한 연구는 아직 미비한 상황이다.
최근에 들어서 천연물을 이용한 신약 개발이 재조명되고 있다. 터펜(terpene) 화합물은 지금까지 식품 및 화장품 원료로 사용되어온 천연물로써 현재 미국 FDA에서 GRAS(generally recognized as safe)로 분류되고 있다. 이러한 터펜 화합물(모노터펜, 바이터펜 등)은 인 비보 그리고 인 비트로 모델에서 survival 경로를 억제하면서 항암 효과를 보여준다는 몇몇 보고들이 있다. 하지만 모노터펜 화합물이 호르몬 불응성 전립선암에서는 항암제로써 항암치료 효과를 보인 바가 없으며, 그 만큼 호르몬 불응성 전립선 암의 치료는 매우 어려운 과제라 할 것이다. 따라서 별다른 치료 방법이 없는 호르몬 불응성 전립선암의 항암치료를 위한 선도 물질로서 모노터펜 화합물을 이용하여 새로운 분자타겟을 발굴해 낼 수 있다면 호르몬 불응성 전립선암 암치료에 있어 획기적인 기술이 될 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 호르몬 불응성 전립선암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 물질의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 특정 모노터펜 화합물이 호르몬 불응성 전립선암에 대한 현저한 항암 효능이 있고, 다른 화학 항암제와 관련하여 화학감작제로서도 뛰어난 효능을 나타냄을 밝혀내었으며, 또한 본 발명의 모노터펜 화합물뿐만 아니라 기존의 항암제들도 거치게 되는 신규한 항암 메카니즘을 규명해내어 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 호르몬 불응성 전립선암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 호르몬 불응성 전립선암의 화학감작제용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물; 이들의 약제학적으로 허용가능한 염; 또는 이들의 용매화물 또는 수화물을 포함하는 호르몬 불응성 전립선암(hormone-refractory prostate cancer)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
화학식 1
Figure 112010059070499-pat00001
화학식 2
Figure 112010059070499-pat00002
상기 화학식 1 또는 화학식 2에서 R1 내지 R4는 서로 독립적으로 수소 또는 C1-5의 알킬이다.
본 발명자들은 호르몬 불응성 전립선암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 물질의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 특정 모노터펜 화합물이 호르몬 불응성 전립선암에 대한 현저한 항암 효능이 있음을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 특정 화합물은 하이드록시기를 갖는 알콜이자 모노터페노이드(monoterpenoid)로서, 상기 R1 내지 R4로 표시되는 치환기는 서로 독립적으로 수소 또는 C1 -5의 알킬이며, 바람직하게는 서로 독립적으로 수소 또는 메틸이다. 가장 바람직하게는 상기 R1 내지 R3는 메틸이고, 상기 R4는 수소일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “C1 -5의 알킬”은 탄소수 1 내지 5의 직쇄 또는 분쇄의 단가(monovalent) 알킬 그룹을 의미하며, 예컨대 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, 펜틸기 및 이들의 다양한 이성질체(isomer) 등이 있으며 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용되는 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물은 이들의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 용매화물 또는 수화물의 형태로 상기 조성물에 포함될 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염"은, 투여대상 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는, 제형을 의미하며, 예컨대, 암모니움 염, 알칼리 금속염, 알칼리 토금속염, 전이금속염, 4차 아민 염 또는 아미노산 염 등이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "수화물(hydrate)"은 비공유적 분자간력(non-covalent intermolecular force)에 의해 결합된 화학양론적(stoichiometric) 또는 비화학양론적(non-stoichiometric) 량의 물을 포함하고 있는 형태를 의미한다.
용어 "용매화물(solvate)"은 비공유적 분자간력에 의해 결합된 화학양론적 또는 비화학양론적 량의 용매를 포함하고 있는 형태를 의미한다. 그에 관한 바람직한 용매들로는 휘발성, 비독성, 및/또는 인간에게 투여되기에 적합한 용매들이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 상세하게 설명한 유효성분 이외에도 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 모두 가능하며, 비경구 투여는 종양 내 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 투여 또는 종양 내 주입될 수 있다.
상기 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으나, 경고제 (Plasters), 과립제(Granule), 산제(Powders), 시럽제(Syrups), 액제(solutions), 유동엑스제(FluidextractsI), 유제(Emulsions), 현탁제(Suspensions), 침제 (Infusions), 정제(Tablets), 주사제(Injections), 캅셀제(Capsules) 및 환제(Pills)등으로 제조할 수 있다. 적합한 제형은 선택된 투여 루트에 따라 좌우되며, 안구에 직접투여하는 경우 액제(solutions), 유동엑스제(FluidextractsI), 유제(Emulsions), 현탁제(Suspensions) 등으로 제조하는 것이 바람직하다. 공지 기술들, 담체 및 부형제들 중의 어느 것이라도 적합하게, 그리고 당해 분야, 예를 들어, 앞서 설명한 Remingston's Pharmaceutical Sciences에서 이해되는 바와 같이 사용될 수 있다.
아울러, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 병용되는 약물을 고려하여 결정하는 것이 좋으며, 상기 유효성분인 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 기준으로 하였을 때 0.001 ㎍/㎏(체중) 내지 10 ㎎/㎏(체중)으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 호르몬 불응성 전립선암(hormone-refractory prostate cancer)의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 호르몬 불응성 전립선암이란 남성호르몬 박탈요법(androgen deprivation therapy, ADT)에 반응하지 않는 암을 말하며 이에 대한 뚜렷한 치료제는 아직 개발되지 않은 상태이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 인체 내에 투여되었을 때, 아폽토시스 뿐만 아니라 비-아폽토시스적인 경로 즉 오토파지 경로를 통해서 호르몬 불응성 전립선 암세포의 사멸을 효과적으로 유도할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물; 이들의 약제학적으로 허용가능한 염; 또는 이들의 용매화물 또는 수화물을 포함하는 호르몬 불응성 전립선암의 화학감작제(chemosensitizer)용 조성물을 제공한다.
화학식 1
Figure 112010059070499-pat00003
화학식 2
Figure 112010059070499-pat00004
상기 화학식 1 또는 화학식 2에서 R1 내지 R4는 서로 독립적으로 수소 또는 C1 -5의 알킬이며, 바람직하게는 R1 내지 R4는 서로 독립적으로 수소 또는 메틸일 수 있다. 가장 바람직하게는 R1 내지 R3는 메틸이고 R4는 수소일 수 있다.
용어 “화학감작제”란 약물에 대한 종양 세포의 감수성을 증가시키거나, 약물이 종양 세포 특이적으로 작용하도록 하여 적은 투여량으로도 치료 효과를 달성할 수 있도록 돕는 물질이다.
기존에 호르몬 불응성 전립선암 치료에 사용하고 있는 화학 항암제들은 정상세포에 독성을 일으키고 부작용이 커서 그 투여량을 줄이는 것은 당업계의 오래된 과제이다. 또한, 항암화학요법제에 대한 종양 세포 내성은 종양학에서 중요한 문제이다. 약제 내성 문제는 크게 두 가지로 나눌 수 있는데 신내성(denovo resistance)과 획득내성(acquired resistance)이 그것이다. 신내성에서는 종양 세포가 초기에 화학요법에 반응하지 않으며 이는 대부분의 호르몬 불응성 전립선암 세포에서 존재한다. 획득내성에서는 종양은 초기에 화학요법에 반응하지만 계속적인 치료에 내성이 발생한다. 호르몬 불응성 전립선암 세포는 화학요법 초기에 치료에 반응을 나타내더라고 결국 대부분 획득내성을 갖게 되는 바 그 치료법이 전무한 상태이다.
본 발명자들은 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 특정 모노터펜 화합물을 기존에 사용하고 있는 화학 항암제들과 병용하는 경우, 독성이 강한 기존 화학 항암제들의 투여량을 나노몰 심지어는 피코몰의 수준까지 줄이면서도 치료가 극히 어려운 호르몬 불응성 전립선암 세포에 대해 강력한 항암 효과를 나타낼 수 있음을 밝혀내었다. 즉 상기 모노터펜 화합물의 호르몬 불응성 전립선암 관련 화학감작제로서의 신규한 용도를 밝혀낸 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 화학감작제용 조성물; 및 화학 항암제를 포함하는 것을 특징으로 하는 호르몬 불응성 전립선암(hormone-refractory prostate cancer)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 상기 화학 항암제는 호르몬 불응성 전립선암 치료를 위해 사용될 수 있는 화학 항암제라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예컨대 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 5-FU(Fluorouracil), 시스플라틴(cisplatin) 케토코나졸(ketoconazole), 프레드니손(prednisone) 및 에스트라무스틴(estramustine) 등이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel) 또는 시스플라틴(cisplatin)을 사용할 수 있는데, 독소루비신 및 시스플라틴의 경우 본 발명의 화학감작제에 의하여 나노몰 수준의 투여량으로도 호르몬 불응성 전립선암 세포의 사멸을 강력하게 유도할 수 있으며, 파클리탁셀 및 도세탁셀의 경우는 본 발명의 화학감작제와 병용 투여하는 경우, 심지어 피코몰 수준의 투여량으로도 현저한 항암 효능 특히 치료가 불가능한 것으로 알려진 호르몬 불응성 전립선암 세포의 사멸을 강력하게 유도할 수 있게 된다. 이는 이들 화학 약제 단독으로는 도대체 달성할 수 없는 현저한 효과이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) E2F1(E2F transcription factor 1)을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 세포 내 E2F1의 발현 또는 활성을 분석하는 단계를 포함하며, 상기 시험물질이 E2F1의 발현을 억제하거나 또는 활성을 억제하면 암 예방 또는 치료제로 판단하는 암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) E2F1(E2F transcription factor 1) 및 세린/트레오닌 단백질 키나아제 Akt(serine/threonine protein kinase Akt)를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 세포 내 E2F1 및 세린/트레오닌 단백질 키나아제 Akt의 활성을 분석하는 단계, 상기 시험물질이 E2F1 및 세린/트레오닌 단백질 키나아제 Akt의 활성을 모두 억제하면 암 예방 또는 치료제로 판단하는 암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명자들은 본 발명의 특정 모노터펜 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이 세포 내 E2F1의 생존 시그널 활성 억제를 통해 항암 효능을 나타냄을 밝혀내었으며, 특히 기존 항암 기전 중 하나로 알려진 AKT억제 경로와 E2F1 억제 경로를 공동으로 타겟팅 한다는 사실을 알아혀내었다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물 뿐만 아니라 AKT 억제제와 같이 전립선암, 방광암, 유방암, 대장암, 자궁내막암 등의 다양한 암 치료제의 유효 성분으로 이용되고 있는 기존의 항암제(e.g. 페리포신 등) 역시 그 동안 알려진 AKT억제 경로이외에도 E2F1 억제 경로를 통해 항암 효능을 나타낸다는 사실을 새로이 밝혀내었다. 그러므로, E2F1의 발현 또는 활성을 억제하거나 또는 AKT 활성 및 E2F1 활성을 모두 억제시키는 물질은 유력한 항암제 후보물질로서의 지위를 갖게 된다고 할 것이다.
본 발명의 방법으로 예방 또는 치료제를 스크리닝 할 수 있는 암은 예컨대 전립선암, 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 대장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신장암, 방광암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 피부암, 흑색종, 난소암, 갑상선암, 자궁내막암 또는 자궁경부암 등이 있으며, 이중 바람직하게는 전립선암, 방광암, 유방암, 대장암, 자궁내막암, 신장암, 백혈병, 폐암, 흑색종 또는 갑상선암일 수 있다.
예방 또는 치료제가 거의 없을 뿐만 아니라, 초기에 일부 반응을 나타내더라도 대부분 내성을 나타내기 때문에, 호르몬 불응성 전립선암을 실질적으로 제어 하기가 쉽지 않은 현실에서, 그 자체로서도 호르몬 불응성 전립선암에 대해서 현저한 항암효과를 가질 뿐만 아니라, 독성이 강한 기존 화학 치료제에 대한 호르몬 불응성 전립선암 세포의 민감성을 높여주는 본 발명의 조성물은 호르몬 불응성 전립선암을 공략하기 위한 매우 현실적인 방법이라 할 것이다. 또한, 새로이 밝혀진 항암 기전을 통해 새로운 항암제 개발이 가능하게 되었다는 점에서도 그 가치가 크다고 할 것이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 호르몬 불응성 전립선암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그의 스크리닝 방법을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 조성물은 호르몬 불응성 전립선암에 대한 현저한 항암 효능이 있고, 다른 화학 항암제와 관련하여 화학감작제로서도 뛰어난 효능을 나타낸다.
(iii) 또한 본 발명의 스크리닝 방법은 새로이 규명한 항암 메카니즘을 통해 항암 물질을 정확하고 쉽게 동정할 수 있다.
도 1. 제라니올에 의한 세포 사멸 유도(인 비트로 배양 시스템에서의 제나리올의 종양 사멸 효과를 확인할 수 있음). (A) MTT 분석, (B) LDH 방출 분석(n=4-5, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.005).
도 2. 제라니올 특이적인 세포사멸. (A) 모노터펜의 화학구조, (B) MTT 분석법(n=4, * p<0.05, *** p<0.005).
도 3. 제라니올에 의한 카스파제-3의 활성과 zVAD-fmk으로 억제할 수 없는 세포사멸. (A) 카스파제-3 활성 분석법(n=4, * p<0.05, ** p<0.01), (B) 웨스턴 블롯 분석, (C) MTT 분석법 (n=4).
도 4. 제라니올에 의한 오토파지 유도. (A) 공초점 현미경 분석, (B) GFP-LC3 반점 카운팅(n=45-60, ** p<0.01), (C) 웨스턴 블롯 분석.
도 5. zVAD-fmk와 3-MA에 의한 세포 생존능력 회복과 제라니올에 의한 Bcl-2 family 의 발현증감. (A) MTT 분석법(n=5, *** p<0.005), (B) 웨스턴 블롯 분석.
도 6. 제라니올에 의한 세포 사이클 분석. (A) FACs 분석(n=3), (B) 웨스턴 블롯 분석.
도 7. 인 비보 이종 이식 모델에서 제라니올의 항암 효과 확인. (A) 종양 내 주입, (B) 종양 무게(n=4-5), (C) 웨스턴 블롯 분석.
도 8. 제라니올에 의한 화학민감성(chemosensitivity) 향상. (A) 제라니올과 독소루비신(Doxorubicin), (B) 파클리탁셀(Paclitaxel), (C) 도스탁셀(docetaxel), (D) 에토포사이드(ectoposide), (E) 5-불소화우라실(fluorouracil), (F) 시스플라틴(cisplatin). (G) 제라니올과 화학치료제를 최대의 농도로 사용한 경우(n=4-5, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.005).
도 9. 메발로네이트에 의해 영향을 받지 않는 제라니올-유도성 세포사멸, MTT 분석법(n=4).
도 10. 전 세포 패치 클램프 방법으로 TRPM8 활성 측정. (A 및 E) GFP-TRPM8을 과발현시킨 HEK 293에 멘톨, （B 및 F) 리날룰, (C 및 G) 시네올, (D 및 H) 제라니올을 처리하면서 전류를 기록(n=7-13).
도 11. 전 세포 패치 클램프. (A) 멘톨, （B) 리날룰, (C) 시에놀, (D) 제라니올을 처리한 PC-3 세포주에서 I-V 커브를 분석(n=8-15).
도 12. 칼슘 측정. (A) 멘톨, （B) 리날룰, (C) 시에놀, (D) 제라니올을 처리한 PC-3 세포주에서 세포질 칼슘 농도 변화를 분석(n=4-7).
도 13. 제라니올에 의한 Akt의 활성 감소. 표시한 웨스턴 블롯 데이터는 4 내지 6의 독립적인 실험의 대표적인 결과이다.
도 14. 제라니올에 의한 mTOR 경로의 활성 감소. 표시한 웨스턴 블롯 데이터는 3 내지 6의 독립적인 실험의 대표적인 결과이다.
도 15. PP2A 억제제에 의한 Akt의 활성 회복. 표시한 웨스턴 블롯 데이터는 4 내지 6의 독립적인 실험의 대표적인 결과이다.
도 16. Akt 억제제와 siAKt에 의한 아폽토시스와 오토파지 확인. (A) 웨스턴 블롯 분석, (B) MTT 분석(n=5, *** p<0.005).
도 17. 모노터펜 처리한 마이크로어레이 분석 (A, B 및 C) 벤 디아그램, (D, E 및 F) GO 분석(n=3, p<0.05, 1.7-fold).
도 18. 대표적 유전자 발현 클러스터 단계적 덴드로그램(n=3, p<0.05, 1.7-fold).
도 19. 제라니올에 의한 E2F1 활성 감소. (A 및 B) 루시페라제 분석(n=4-5, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.005).
도 20. AKT 억제제에 의한 E2F1 활성 감소. (A) 웨스턴 블롯 분석, (B) 루시페라제 분석(n=4-5, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.005).
도 21. 제라니올에 의한 E2F1 mRNA의 감소. (A 및 D) 웨스턴 블롯 분석(표시한 데이터는 4 내지 6의 독립적인 실험의 대표적인 결과임), (B) 실시간 PCR(n=7, ** p<0.01), (C) 반-정량적 RT-PCR.
도 22. CA-Akt/E2F1 과발현에 의한 표현형 구조(rescue). (A) MTT 분석(n=3), (B) LDH 방출 분석(n=4-5, ** p<0.01).
도 23. Akt/E2F1 녹다운에 의한 제라니올-유도성 세포사멸. (A) MTT 분석(n=3) (B) 웨스턴 블롯 분석.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
하기 실시예에서는 본 발명을 대표하는 일 구현예로서, 도 2A에 나타낸 화학 구조를 갖는 화합물인 제라니올을 이용하여 그의 호르몬 불응성 전립선암에 대한 항암 효과 및 화학감작제로서의 효과를 확인하고 그 항암 기전을 연구하였다.
실험재료 및 방법
1. 세포 배양 및 시약
다음의 세포주들은 ATCC 및 한국 세포주 은행(KCLB)으로부터 취득하였다: PC-3(안드로겐 비의존성 전립선암, AIPC), DU145(AIPC), AGS(위암), Saos-2(골육종), MCF7(유방암), HeLa(자궁경부암), HepG2(간세포암), A549(폐선암) 및 HEK(Human embryonic kidney)-293 세포. 상기 세포들은 공급자가 추천한 각각의 배지에서 유지 배양하였다. 모든 세포 배양 시약은 Invitrogen으로부터 구입하였고 그 외 다른 시약은 전부 Sigma로부터 구입하였다.
2. 세포 생존능력 분석
24-웰 배양 플레이트(Nunc)에서 상기 세포들을 배양하였다. 세포의 생존능력을 측정하기 위하여 제조사 지시에 따라 MTT 또는 LDH 방출 분석법을 수행하였다(각각 Sigma 또는 Promega). 제라니올은 0.1%의 농도로 에탄올에 용해시켰다. 상기 분석 결과는 마이크로 플레이트 분광광도계(ASYS)를 사용하여 MTT 분석의 경우 570 nm에서, LDH 분석의 경우 490 nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다.
3. 카스파제 분석(색효소 분석법)
Capase-3 활성도는 상업적으로 구입한 키트(BioMol)를 사용하여 제조사 지시에 따라 측정하였다. PC-3 세포의 크루드 추출물을 측색(colorimetric) 카스파제-3 기질과 혼합하였다. 마이크로 플레이트 분광광도계(ASYS)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
4. 유세포 측정법
70% 에탄올로 고정시킨 PC-3 세포는 유세포 분석기(BD Biosciences)를 사용한 분석에 앞서, RNase A(100 /ml)를 포함하는 프로피디움 요오드화물 용액(propidium iodide, 50 mg/ml)으로 표지하였다. 분석을 위해 ModFitLT V3.0 소프트웨어를 사용하였다.
5. 미토콘드리아 막 탈분극 측정
미토콘드리아 막의 탈분극은 JC-1 형광 프로브를 사용하여 제조사(Molecular Probes) 지시에 따라 측정하였다. PC-3 세포는 37℃에서 30분간 2mM의 JC-1으로 표지하고, 530/30 또는 585/42 nm 바이패스 방사 필터와 함께 488 nm 여기(excitation)를 사용하여 유세포 분석기로 분석하였다. 적 형광을 나타내지 않는 세포는 미토콘드리아 막이 탈분극 된 것을 나타내는 것으로 간주하였다.
6. 전기생리학 검사
Axopatch I-D 증폭기를 사용하여 전 세포 배열 내 패치 클램프 실험을 수행하였다. 전극 저항은 2-5 MW이었고, 직렬저항의 60%가 상쇄되었다. 세포 내부 및 세포 외 용액은 문헌에 기재된 바에 따라 준비하였다(Biochim Biophys Acta. 2009 Jan;1792(1):33-8). TRPM8 전류의 자극은 (-)-메탄올 또는 제라니올을 욕조(bath) 용액에 적용하여 취득하였다. 전류-전압 관계는 -60 mV의 유지 전위에서 -100 mV로부터 +100 mV까지의 400-ms 선형 전압 램프를 사용하여 측정하였다.
7. 세포 내 Ca 2 + 측정
세포 내 칼슘 농도([Ca2 +]cyt)는 문헌에 기술된 바에 따라 측정하였다(Biochim Biophys Acta. 2009 Jan;1792(1):33-8). 형광 분광광도계(Photon Technology Instrument)의 교반된 석영 마이크로큐벳 내에서 340/380 nm에서 여기(excitation)시켜 510 nm에서의 형광 발광을 측정하였다. 0.2% 트리톤 X-100 및 10mM EGTA를 각각 첨가하여 380 nm에서의 최대 및 최소 형광 밸브((Fmax 및 Fmin)를 교정하였다. [Ca2 +]cyt는 다음의 식을 사용하여 계산하였다: [Ca2 +]=Kdxβx(R-Rmin)/(Rmax-R), Kd는 Fura-2(224nM)의 해리 상수이고, b는Fmin/Fmax, 그리고 R는 F340/F380이다.
8. RNA 분리 및 마이크로어레이 발현 분석
3중의 Human Gene 1.0 ST 어레이(Affymetrix)를 사용하여 유전자 발현 프로파일 분석을 수행하였다. 총 RNA를 세포로부터 추출하고 Affymetrix 가이드라인에 따라 처리하였다. Human Gene 1.0 ST 어레이는 전-전사 발현 분석을 지원할 수 있는 33,257개의 프로브 세트를 제공한다.
9. 웨스턴 블롯 분석
프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일(Calbiochem)을 포함하는 RIPA 완충액으로 배양하여 총 단백질을 준비하였다. 상기 단백질을 10, 12 또는 15% SDS-PAGE로 분해하고 하기 나타낸 항체들로 분석하였다. 사이클린 D, 사이클린 E, Bcl-xl, 빔(Bim), pAKTS473, pAKTS473, AKT, pPDK1S241, PDK1, pGSK-3bS9, pERKT202 / Y204, ERK, pp38T180 / Y182, p38, pJNKT183 / Y185, JNK, pmTORS2448, mTOR, pS6KT389, S6K, p4EBPT37 / T46, 4EBP, Binp3, 클리브드(Cleaved) 카스파제-3 및 Cdc2에 대한 항체는 Cell Signaling로부터 취득하였다. Cyclin A, Cyclin B1, p21, p27, Bcl-2, Bcl-w, Bax, GSK-3b, Cdk 2, Cdk 4, Cdk 6, E2F1, E2F2 및 E2F3에 대한 항체는 Santa Cruz로부터 구입하였고 LC3에 대한 항체는 MBL(medical & biological laboratories co.)로부터 구입하였다.
10. 이종이식 실험
흉선이 없는 누드 마우스(Charles River, Wilmington, MA, USA)의 피하에 PC-3 세포를 주입하였다. 1주에 두 번씩 캘리퍼스를 사용하여 종양 크기를 측정하였다. 12일째 마우스를 희생시키고 종양의 무게를 측정하였다. 종양 부피는 하기의 식을 사용하여 계산하였다: 종양 부피(mm3)= 너비_길이2/2(Dachs et al., 1997).
11. 전사인자들의 활성측정(리포터 에세이)
루시퍼레이즈 활성도를 측정하기위해 제조사(Promega) 지시에 따라 측정하였다. 내부 대조군으로 pCMV-b-Gal을 세포에 주입하여 b-갈락토시다제 활성도를 이용하여 루시퍼레이즈 활성도를 교정하였다(normalize).
12. 역전사 중합효소연쇄반응 ( Reverse transcription - PCR )
총 RNA를 RNdasy 미니 키트(Qiagen)를 이용하여 세포로부터 추출하였다. RNA의 역전사는 Superscript Ⅲ와 랜덤 헥사머 프라이머를 이용하여 제조사(Invitrogen)의 지시에 따라 시행하였다. E2F1의 PCR 프라이머는 다음과 같다: 업스트림 프라이머(gccaccatagtgtcaccacc) 및 다운스트림 프라이머(ggtgaggtccccaaagtcac).
13. 실시간 중합효소연쇄반응 ( Real - time PCR )
정량적인 실시간 중합효소 연쇄반응을 시행하기 위해서 미리 디자인된 유전자-특이적 Taq-Man(Applied Biosystems)과 1mg의 정제된 RNA를 사용하였다. 내부 대조군으로는 액틴을 사용하여 표준화하였다(Livak and Schmitten, 2001).
14. 통계적 분석법
모든 데이터는 평균 ± SEM로 표시하였다. ANOVA를 사용하여 실험 군 사이의 평균 비교를 수행한 후 포스트 hoc 테스트를 수행하였다. p < 0.05는 통계학적으로 중요하게 고려되었다.
실험결과
제라니올에 의한 세포 사멸 기전 규명
1. 제라니올의 인 비트로 종양 사멸 효과 확인
제라니올의 항암 작용를 확인하기 위해 PC-3 세포주에 제라니올을 72시간 동안 처리한 후, MTT 분석과 LDH 방출 분석 방법으로 세포 사멸을 분석하였다. 제라니올은 세포 사멸을 유도하였고, 용량-반응 관계(dose-response relationship)가 관찰되었다(도 1).
2. 제라니올에 대한 세포반응의 특이성
식품 및 화장품 원료로 사용되고 있는 천연물질인 모노터펜(monoterpene) 화합물 중에서 멘톨(menthol), 리날룰(linalool), 시네올(cineol)은 제라니올과 화학구조가 유사하다(도 2A). 제라니올에 대한 세포반응의 특이성을 확인하기 위해 PC-3 세포주에 상기 4종류의 모노터펜 화합물을 72시간 동안 처리한 후(부형약(vehicle)은 0.1% DMSO), MTT 분석 방법으로 세포 사멸을 비교 분석하였다.
멘톨은 미미하게 세포 사멸을 유도하였으나 리날룰과 시네올은 세포 사멸을 전혀 유도하지 못하였다. 이와 달리 제라니올은 현저히 PC-3의 세포 사멸을 유도하였다(도 2B).
3. 제라니올에 의한 아폽토시스성 및 비아폽토시스성 세포 사멸 유도
제라니올에 의해 유도되는 세포 사멸이 아폽토시스성인지 확인하기 위해 PC-3 세포주에 제라니올을 48-60시간 동안 처리한 후, 색효소분석법(colorimetric enzyme assay)과 웨스턴 블롯 방법으로 카스파제-3(아폽토시스의 바이오마커로써 활성이 되면 클리브드(cleaved) 카스파제-3 가 형성됨)의 활성을 측정하였다. 제라니올에 의해서 카스파제-3의 효소 활성이 증가되었고, 용량-반응 관계가 관찰되었다(도 3A).
다른 모노터펜 화합물과 달리 제라니올에 의해서만 활성형 효소 형태인 클리브드 카스파제-3의 양도 증가되었고, 용량-반응 관계가 관찰되었다(도 3B).
아폽토시스가 제라니올-유도성 세포 사멸의 주요 경로인지를 확인하기 위해 판(pan)-카스파제 억제제인 zVAD-fmk과 제라니올을 동시에 72시간 처리한 후, MTT 분석 방법으로 세포사멸 억제(phenotype rescue) 여부를 분석하였다. 카스파제-3의 활성이 관찰되었지만 zVAD-fmk에 의해서 억제되는 세포사멸은 20% 정도에 불구하였고 여전히 50% 정도의 세포사멸(즉 zVAD-fmk로 억제할 수 없는 세포사멸)이 관찰되었다(도 3C). 즉 제라니올은 아폽토시스뿐만 아니라 비-아폽토시스성 경로를 통해서도 세포사멸을 유도함을 확인하였다.
4. 제라니올에 의한 오토파지의 유발
zVAD-fmk로 억제할 수 없는 경로에 의한 세포사멸에 오토파지가 관여하는지를 확인하기 위해 PC-3 세포주에 GFP-LC3를 트랜스펙션하고 제라니올을 20-24시간 처리한 후, 공초점 현미경으로 오토파지 바이오마커인 GFP-LC3 반점 형성을 분석하였다. 제라니올을 처리하지 않은 세포에서는 GFP-LC3가 널리 퍼진 염색 패턴을 보이는 반면, 제라니올를 처리한 세포에서는 세포당 GFP-LC3 반점 수가 400-500% 증가되는 것이 관찰되었다(도 4A 및 B).
또한 제라니올-유도성 오토파지를 검증하기 위해서 LC3 성숙에 따른 빠른 이동(오토파지 바이오마커)을 웨스턴 블롯 방법으로 분석하였다. 제라니올을 처리한 세포에서 LC3의 빠른 이동 밴드(LC3Ⅱ)가 관찰되었고, 리소솜 프로테아제 억제제인 펩스타틴(pepstatin) A와 E64D를 처리하면 빠른 이동 밴드의 강도가 증가되었다(도 4C). 상기와 같이 제라니올이 오토파지를 유도함을 확인하였으며, 제라니올-유도성 오토파지는 zVAD-fmk가 억제할 수 없는 경로에 의한 세포사멸을 설명할 수 있는 단서가 될 수 있다.
5. 제라니올은 아폽토시스와 오토파지를 통해 세포사멸을 유도
제라니올에 의한 세포사멸에서 오토파지가 중요한 역할을 하는지 확인하기 위해서 PC-3 세포주에 제라니올과 클래스 III PI3K 억제제(오토파고섬 형성 억제제)인 3-메틸아데닌(3-MA)을 동시에 72시간 처리한 후, MTT 분석법으로 표현형 구조를 분석하였다. 3-MA에 의해서 억제되는 세포사멸은 15% 정도에 불구하였고, 여전히 55% 정도의 세포사멸이 관찰되었다(도 5A). 즉 아폽토시스와 오토파지를 각각 따로 억제하면 제라니올에 의한 세포사멸이 크게 감소되지 않았기 때문에 PC-3세포주에 제라니올, zVAD-fmk, 3-MA를 동시에 72시간 처리한 후, MTT 분석법으로 표현형 구조를 분석하였다. zVAD-fmk와 3-MA를 동시에 처리하면 세포사멸이 거의 대부분 억제되었고 종양 세포 생존능력이 회복되는 것을 확인하였다(도 5A).
또한 제라니올-유도성 아폽토시스 와 오토파지를 검증하기 위해서 내인성 아폽토시스 경로와 오토파지를 조절하는 것으로 잘 알려진 Bcl-2 군을 웨스턴 블롯 방법으로 분석하였다. 항-아폽토시스 단백질인 Bcl-2, Bcl-w의 발현이 감소하였고, 이에 반하여 호-아폽토시스 단백질인 Bax, Bim 그리고 Bnip3 의 발현이 증가된 것을 확인하였다(도 5B).
제라니올-유도성 세포사멸을 확인하기 위해 제라니올을 30시간 동안 처리한 후 핵안의 핵산을 염색하는 PI 염색 방법을 이용하여 FACs(fluorescent activated cell sorter) 분석을 하였다. 제라니올을 처리한 경우 sub-G1 어레스트가 일어나는 것을 FACs 분석으로 확인하였고 이를 웨스턴 블롯으로 검증한 결과 세포주기에 관련된 단백질의 발현의 증감을 관찰하였다(도 6A 및 B). 즉 제라니올은 두 가지 경로, 즉 아폽토시스와 오토파지를 통해 세포사멸을 유도함을 확인하였다.
제라니올의 항암 효과 확인
1. 제라니올의 인 비보 종양 사멸 효과 확인
제라니올의 인 비보 효과를 확인하기 위해 2× 106개의 PC-3 세포를 누드 마우스에 주입한 후, 종양 내 주입 또는 경구투여 방식으로 제라니올을 처리하면서 종양 부피를 측정하였다. 제라니올이 GRAS(Generally-Recognized-As-Safe)로 분류되어 있는 것에서 예상할 수 있듯이 사용하는 용량에서 눈에 띄는 독성이 관찰되지는 않았다. 제라니올을 종양 내 주입하면 종양 부피가 현저히 감소되었고(도 7A), 현재 진행 중인 경구투여 실험에서도 종양 부피가 감소되는 것이 관찰되어(도 7B) 인 비보 종양 모델에서 제라니올의 항암 효과를 확인하였다.
2. 제라니올의 화학민감성( chemosensitivity ) 향상 효과
조합 치료요법의 타당성을 확인하기 위해서 PC-3 세포주에 화학적 치료제인독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 5-불소화우라실(fluorouracil), 시스플라틴(cisplatin)과 제라니올을 동시에 72시간 처리한 후, MTT 분석법으로 세포사멸을 분석하였다. 상기 화학적 항암제를 단독으로 투여 했을 때에는 PC-3 세포의 사멸을 거의 유도하지 못하였으나, 화학 치료제와 제라니올을 같이 처리하자 세포사멸이 매우 현저하게 증가되는 것이 관찰되었다(도 8). 이는 제라니올이 암 세포의 화학적 항암제에 대한 민감도를 높여주는 화학감작제(chemosinsitizer)로서 작용하였음을 보여주고 있다. 즉 상기 화학적 항암제들 또는 제라니올을 단독으로 투여 했을 때보다 상기 화학적 항암제들과 제라니올을 병용 투여하는 경우 암 세포 사멸에 있어 현저한 상승효과가 발생함을 확인하였다.
제라니올의 항암 효과와 HMGR 또는 TRPM8 과의 관계 규명
1. 제라니올의 HMGR 활성 억제 효과와 세포사멸과의 관계
제라니올은 스타틴계 약물의 타깃인 HMG-Co 리덕타아제(HMGR)의 활성을 억제할 수 있음이 보고된 바 있다. HMGR 활성이 억제되면 메발론산염(mevalonate)이생성되지 않았다. 제라니올의 항암 효과가 HMGR의 활성을 억제하기 때문에 나타나는 현상인지 확인하기 위해 PC-3 세포주에 제라니올과 메발론산염을 동시에 72시간 처리한 후, MTT 분석법으로 표현형 구조(rescue)를 확인하였다. 메발론산염은제라니올에 의해 유도되는 세포사멸을 억제하지 못하였다(도 9). 즉 제라니올의 항암 효과는 HMGR 활성 억제와는 무관한 것임을 확인하였다.
2. 제라니올의 TRPM8 채널 작동적 활성과 세포사멸과의 관계
제라니올을 비롯하여 멘톨, 리날룰, 시네올은 TRPM8 칼슘 채널 작동자(agonist)로 알려져 있으나, 멘톨을 제외하고는 패치 클램프 방법으로 검증된 바 없다. 칼슘 정량 분석법으로는 4가지 모노터펜 모두 세포내 칼슘을 증가시킬 수 있으나, TRPM8-매개 칼슘 증가인지는 패치 클램프 방법으로만 증명이 가능하다. TRPM8 작동 활성을 확인하기 위해 GFP-TRPM8을 HEK 293 세포에 과발현시킨 후, 전 세포 패치 클램프 방법으로 TRPM8 전류를 측정하였다. TRPM8 전류 기록 조건은 본 연구자가 교신저자로 논문(Biochemica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease , 1792:33-38(2009))에 이미 발표한 바 있다.
전류-전압(I-V) 관계 분석에서 멘톨만 TRPM8의 특징인 겉보기 정류 전류(outward rectificating current)를 나타내었고, 리날룬, 시네올 및 제라니올에 의해서는 TRPM8-특이적 전류가 나타나지 않았다(도 10A-D). 또한 멘톨에 의해서만 TRPM8의 특징인 빠른 활성/불활성 패턴이 나타났고, 리날룬, 시네올 및 제라니올에 의해서는 나타나지 않았다(도 10E-H). 이와 같이 제라니올은 TRPM8 작동자로 작용하지 않는다는 것을 패치 클램프 방법으로 확인하였기 때문에 제라니올의 항암 효과는 TRPM8 칼슘 채널 활성과는 무관한 것임을 확인하였다.
3. 제라니올의 칼슘 동원 활성과 세포사멸과의 관계
제라니올은 TRPM8 작동자는 아니지만 칼슘을 동원 시킬 수 있기 때문에 전 세포 패치 클램프와 푸라-2 형광염료(이중 여기(excitation) 염료)를 이용한 비율계량분석법(ratiometric assay)으로 PC-3 세포주의 전기생리학적 특성과 세포질 칼슘 변화를 측정하였다. 멘톨을 처리했을 때 전류가 기록되었지만 TRPM8-특이적 전류(겉보기 정류 I-V 커브)는 아니었고, 리날룬, 시네올 및 제라니올에 의해서는 거의 전류가 기록되지 않았다(도 11). 4가지 모노터펜(monoterpene) 모두 세포질 칼슘 농도를 증가시켰지만, 그 중 제라니올은 칼슘 농도 증가폭이 가장 미미하였다 (도 13). 제라니올의 항암효과는 TRPM8 칼슘채널과 무관하며, 세포질 칼슘 농도 변화와도 무관함을 확인하였다.
제라니올에 의한 Akt 와 E2F1 의 생존 신호 활성 억제를 통한 항암효과
1. 제라니올에 의한 Akt 활성 감소
Akt-mTOR 경로는 오토파지를 억제하는 것으로 잘 알려져 있기 때문에 제라니올은 Akt 활성을 억제하여 오토파지를 유도할 것으로 추정하였다. Akt의 활성을 확인하기 위해 PC-3 세포주에 제라니올을 0-4 시간 처리한 후, 인-특이적 항체를 이용하여 인산화된 Akt 양을 분석하였다. 인산화된 Akt의 양은 제라니올 처리 1시간 후부터 현저히 감소하였고, Akt의 기질인 GSK-3β의 인산화도 감소되었다(도 13A). 인산화된 Akt의 감소는 제라니올를 처리했을 때에만 관찰되었고, 멘톨, 리날룬 및 시네올은 영향을 주지 못하였다(도 13B). 제라니올의 용량과 인산화된 Akt 및 인산화된 GSK-3β의 감소와 상관관계가 관찰되었다(도 13C). Akt 다운스트림인 mTOR의 인산화도 감소되었으며, mTOR의 기질인 S6K와 4EBP의 인산화도 감소되어(도 14) 제라니올이 Akt-mTOR 경로를 억제시킴을 확인하였다.
2. 제라니올에 의한 Akt 활성 감소 기전
제라니올에 의한 Akt 활성 감소 기전을 이해하기 위해 PC-3 세포주에 제라니올을 2-30시간 처리한 후, Akt 업스트림인 IGF-1 수용체와 PDK1의 양과 활성을 분석하였다. 제라니올은 IGF-1 수용체의 발현 양과 PDK1의 인산화에 영향을 주지 않았다(도 15A, B). 제라니올이 포스파타제-의존적 경로를 통해 Akt의 활성을 저해하는지를 확인하기 위해 PP2A 억제제인 오카다산(okadaic acid)과 PP2B 억제제인 타우토마이신(Tautomycin)의 효과를 분석하였다. 타우토마이신은 제라니올에 의해 감소된 인산화된 Akt의 양을 회복시키지 못했지만 오카다산에 의해서는 인산화된 Akt의 양이 회복되었다(도 15C). 즉 제라니올은 PP2A-의존적 경로를 통해 Akt의 활성을 억제함을 확인하였다.
3. Akt 활성 감소와 세포사멸 와의 관계
Akt의 활성감소에 의한 세포사멸을 확인하기 위해 현재 전립선암에서 임상시험 중인 페리포신(perifosine)을 비롯한 Akt 억제제와 siRNA를 이용하여 Akt를 녹 다운하여 MTT 분석과 웨스턴 블롯 으로 분석하였다. PC-3 세포주에 Akt 억제제(페리포신, API-2, AKTi)들을 처리하여 클리브드 카스파제-3(아폽토시스 마커)와 LC3(오토파지 마커)를 확인한 결과 아폽토시스와 오토파지를 확인 할 수 있었다(도 16A). 그러나 siAkt를 트랜스펙션한 실험에서는 오토파지는 관찰할 수 있었으나 아폽토시스는 관찰 할 수 없었기 때문에 제라니올과 Akt 억제제에 의해 유도되는 세포사멸에는 Akt외에 다른 타겟을 필요로 할 것이라는 단서를 찾을 수 있었다(도 16A).
MTT 분석에서도 마찬가지로 Akt 억제제는 세포사멸을 유도하였지만 siAkt를 트랜스펙션한 조건에서는 세포 생존능력에 영향을 주지 않았다(도 16B). 즉 제라니올에 의해 유도되는 세포사멸은 Akt에 의한 오토파지 와 다른 기전에 의해서 유도되는 아폽토시스를 경유하게 된다.
4. 제라니올에 의한 E2F1 활성 감소
제라니올에 의해 유도되는 세포사멸에서 아폽토시스의 작용 기전에 대한 단서를 확보하기 위해 PC-3 세포주에 모노터펜 화합물을 24시간 동안 처리하여 마이크로 어레이 분석을 시행하였다. 기존의 전립선암 조직의 마이크로 어레이 실험 데이터와 비교 분석하여 제라니올 특이적인 유전자 중에서 전립선암에서 과발현 되어 있다고 보고되어진 E2F1가 크게 하향 조절되있음을 확인하였다(도 17 및 18).
또한 이러한 제라니올의 작용 기전에 대한 단서를 확보하기 위해 전립선암에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 전사인자들의 활성을 리포터 분석법으로 분석하였다. TGF-β, AP-1, NF-kB 및 NFAT의 활성에는 제라니올이 영향을 주지 못했으나, E2F의 활성은 감소시켰고 용량-반응 상관관계가 관찰되었다(도 19A). E2F1의 transcriptional target인 Egr-1의 활성도 감소되는 것을 관찰하였다(도 19B). 이러한 제라니올에 의한 E2F1의 활성의 감소로 유도되는 아폽토시스가 현재 임상시험 단계에 있는 Akt 억제제도 경유하는지 확인하기 위해 Akt 억제제를 처리하여 E2F1의 발현 정도를 웨스턴 블롯과 E2F1의 전사 활성을 리포터 분석법으로 분석하였다. 제라니올과 마찬가지로 Akt 억제제를 처리한 후 E2F1,2의 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다(도 20A).
또한 Akt 억제제를 처리후 E2F1의 전사 활성 감소도 관찰하였다(도 20B). 제라니올은 E2F1의 활성을 감소시킴으로써 아폽토시스를 유도하게 되며 이러한 작용기전은 현재 제1상 및 제2상으로 임상시험 중에 있는 다른 약물들(Akt 억제제)의 기전과 동일함을 알 수 있었다.
5. 제라니올에 의한 E2F1 활성 감소 기전
제라니올에 의한 E2F1 활성 감소 기전을 이해하기 위해 PC-3 세포주에 제라니올을 처리한 후, E2F1의 단백질 양을 웨스턴 블롯 방법으로 분석하였다. 멘톨, 시네올 및 리날룰은 E2F1의 단백질 양에 영향을 주지 않았으나 제라니올에 의해서는 감소되었다(도 21A).
E2F1 단백질 양의 감소가 전사 조절에 의한 것인지를 확인하기 위해 PC-3 세포주에 제라니올을 처리한 후, E2F1의 mRNA 양을 TaqMan 프로브 실시간 PCR과 반(semi)-정량적 RT-PCR 방법으로 분석하였다. 시네올은 E2F1의 mRNA 양에 영향을 주지 않았으나, 제라니올에 의해서는 감소되었다(도 21B 및 C).
전사 조절이 E2F1 발현 조절의 주요 기전인지 확인하기 위해 MG132 (proteosome inhibitor)를 처리한 후, E2F1의 단백질 양을 분석하였다. MG132를 처리하더라도 E2F1의 단백질 양은 회복되지 않았다(도 19D). 제라니올은 전사수준에서 E2F1의 발현을 감소시킴을 확인하였다.
6. 제라니올에 의한 Akt / E2F1 억제와 세포사멸과의 관계
제라니올의 항암 효과가 Akt/E2F1의 활성을 억제하기 때문에 나타나는 현상인지 확인하기 위해 PC-3 세포주에 CA(constitutively active) Akt와 E2F1을 Fugene-6로 과발현시키면서 제라니올을 72시간 처리한 후, MTT 분석과 LDH 방출 분석법으로 표현형 구조(rescue)를 확인하였다. EGFP 벡터를 PC-3 세포주에 트랜스펙션시켰을 때 70-80%의 세포에서 GFP가 발현됨을 확인하였다.
CA-Akt나 E2F1의 단독 발현만으로는 제라니올-유도성 세포사멸을 억제하지 못하였으나, CA-Akt와 E2F1을 동시에 발현시키면 제라니올-유도성 세포사멸이 현저히 억제되었다(도 22). 또한 제라니올의 항암 효과가 과연 E2F1과 Akt를 동시에 표적하는 것임을 검증하기 위해서 siRNA를 48시간 과발현시킨 후에 MTT 분석과 웨스턴 블롯으로 분석하였다. Akt와 E2F1을 단독 녹다운시켰을 때에 반해 동시에 녹다운하였을 때 제라니올-유도성 세포 생존능력을 더욱 감소시켰다(도 23A).
siAkt와 siE2F1를 과발현하여 유도되는 세포사멸을 확인한 결과 siAkt와 siE2F1를 동시에 과발현 시킨 조건에서 제라니올-유도성 세포사멸과 마찬가지로 아폽토시스(활성형 카스파제-3) 와 오토파지(LC-3)를 검증할 수 있었다(도 23B). 결국 제라니올은 Akt와 E2F1의 활성을 동시에 억제하여 세포사멸을 유도함을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물로서 제라니올(geraniol); 이들의 약제학적으로 허용가능한 염; 또는 이들의 용매화물 또는 수화물을 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 조성물은 E2F1 및 세린/트레오닌 단백질 키나아제 Akt의 활성을 억제함으로써 호르몬 불응성 전립선 암 세포의 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 호르몬 불응성 전립선암(hormone-refractory prostate cancer)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
    화학식 1
    Figure 112012087240367-pat00005

    화학식 2
    Figure 112012087240367-pat00006

    상기 화학식 1 또는 화학식 2에서 R1 내지 R3은 메틸이고, R4는 수소이다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 경구 투여, 종양 내 주입, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입 및 경피 투여로 구성된 군으로부터 선택되는 투여 방법으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. (a) 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물로서 제라니올(geraniol); 이들의 약제학적으로 허용가능한 염; 또는 이들의 용매화물 또는 수화물을 포함하는 화학감작제 조성물로서, 상기 조성물은 E2F1 및 세린/트레오닌 단백질 키나아제 Akt의 활성을 억제함으로써 호르몬 불응성 전립선 암 세포의 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 호르몬 불응성 전립선암의 화학감작제(chemosensitizer)용 조성물; 및 (b) 화학 항암제로서 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel) 또는 시스플라틴(cisplatin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 호르몬 불응성 전립선암(hormone-refractory prostate cancer)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물,
    화학식 1
    Figure 112012087240367-pat00032

    화학식 2
    Figure 112012087240367-pat00033

    상기 화학식 1 또는 화학식 2에서 R1 내지 R3은 메틸이고, R4는 수소이다.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 다음의 단계를 포함하는 호르몬 불응성 전립선암(hormone-refractory prostate cancer) 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법:
    (a) E2F1(E2F transcription factor 1)을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 세포 내 E2F1의 발현 또는 활성을 분석하는 단계, 상기 시험물질이 E2F1의 발현을 억제하거나 또는 활성을 억제하면 호르몬 불응성 전립선암 예방 또는 치료제로 판단한다.
  11. 다음의 단계를 포함하는 호르몬 불응성 전립선암(hormone-refractory prostate cancer) 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법:
    (a) E2F1(E2F transcription factor 1) 및 세린/트레오닌 단백질 키나아제 Akt(serine/threonine protein kinase Akt)를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 세포 내 E2F1 및 세린/트레오닌 단백질 키나아제 Akt의 활성을 분석하는 단계, 상기 시험물질이 E2F1 및 세린/트레오닌 단백질 키나아제 Akt의 활성을 모두 억제하면 호르몬 불응성 전립선암 예방 또는 치료제로 판단한다.
  12. 삭제
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