WO2022019626A1 - 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법 - Google Patents

대장암 전이 억제제 스크리닝 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2022019626A1
WO2022019626A1 PCT/KR2021/009367 KR2021009367W WO2022019626A1 WO 2022019626 A1 WO2022019626 A1 WO 2022019626A1 KR 2021009367 W KR2021009367 W KR 2021009367W WO 2022019626 A1 WO2022019626 A1 WO 2022019626A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
icam
colorectal cancer
src
cancer metastasis
expression
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/009367
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이수재
임은지
Original Assignee
주식회사 에프엔씨티바이오텍
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 에프엔씨티바이오텍 filed Critical 주식회사 에프엔씨티바이오텍
Priority to CN202180060202.3A priority Critical patent/CN116134319A/zh
Priority to JP2022579115A priority patent/JP2023535280A/ja
Priority to CA3189430A priority patent/CA3189430A1/en
Priority to EP21845811.5A priority patent/EP4184166A1/en
Priority to US18/016,752 priority patent/US20230288399A1/en
Priority claimed from KR1020210095111A external-priority patent/KR102549771B1/ko
Publication of WO2022019626A1 publication Critical patent/WO2022019626A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70525—ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a colon cancer metastasis inhibitor screening method, and more particularly, to a colorectal cancer metastasis inhibitor screening method in which a substance that increases the binding level of ICAM-1 and SRC is selected as a therapeutic substance.
  • Colorectal cancer is the third most commonly diagnosed cancer in the world and the fourth most common cause of death. Colorectal cancer can be classified into sporadic colon cancer and colitis associated colorectal cancer depending on the onset factor. Sporadic colorectal cancer is caused by several factors such as genetic factors, aging, type 2 diabetes, overweight, drinking and smoking, and inflammatory colorectal cancer is a persistent inflammatory bowel disease such as Crohn's disease and ulcerative colitis. (Inflammatory bowel disease) is the main cause. Since sporadic colorectal cancer is mostly caused by aging or genetic factors, it mainly appears in elderly patients. However, inflammatory colorectal cancer is more likely to occur in younger patients and is known to have a higher mortality rate than sporadic colorectal cancer.
  • colonoscopy is a common screening method for identifying and removing polyps, but it causes many side effects, such as intestinal perforation, intestinal bleeding, and sleep apnea, and there are many difficulties in accurately selecting tumors. Therefore, there is a need to develop a marker for diagnosing or treating colorectal cancer.
  • the present inventors completed the present invention by confirming that ICAM-1 regulates cancer metastasis and angiogenesis in a SRC-dependent manner as a result of researching on a candidate colorectal cancer metastasis inhibitor.
  • an object of the present invention is to provide a method for screening a colon cancer metastasis inhibitor.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for predicting colon cancer metastasis comprising an agent for measuring the mRNA level of the ICAM-1 gene or an agent for measuring the protein level encoded by the gene.
  • the present invention comprises the steps of (a) treating a candidate material in cells in Vitro; (b) measuring the level of binding between intracellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and SRC in the cell; And (c) provides a colon cancer metastasis inhibitor screening method comprising the step of selecting a substance that increases the binding level of ICAM-1 and SRC compared to the untreated group of the candidate substance as a therapeutic substance.
  • ICAM-1 intracellular adhesion molecule 1
  • the cell may be a colorectal cancer cell.
  • the candidate material may be selected from the group consisting of compounds, microbial cultures or extracts, natural product extracts, nucleic acids, and peptides.
  • the nucleic acid is siRNA, shRNA, microRNA, antisense RNA, aptamer (aptamer), LNA (locked nucleic acid), PNA (peptide nucleic acid), and morpholino (morpholino) consisting of can be selected from the group.
  • the measurement of the binding level of ICAM-1 and SRC may be measuring the mRNA level of ICAM-1 and SRC genes.
  • the mRNA level is polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR), RNase protection assay (RNase protection) assay; RPA), microarray, and northern blotting (northern blotting) can be measured through one or more methods selected from the group consisting of.
  • the present invention provides a composition for predicting colon cancer metastasis comprising an agent for measuring the mRNA level of the ICAM-1 gene or an agent for measuring the protein level encoded by the gene.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting colon cancer metastasis comprising the ICAM-1 gene or a protein encoded by the gene as an active ingredient.
  • the present invention showed that ICAM-1 could be a potential target for the development of a treatment for colorectal cancer by confirming that ICAM-1 can regulate cancer metastasis and angiogenesis in an SRC-dependent manner. Accordingly, it is possible to increase the therapeutic effect of colorectal cancer patients by using the colorectal cancer therapeutic agent using the target screened by the method of the present invention.
  • 1a is a result of confirming the difference in ICAM-1 expression between normal people and inflammatory bowel disease patients.
  • Figure 1b is the result of confirming the difference in ICAM-1 expression in normal people and cancer patients.
  • 1d is a normal cell line CCD841 and colon cancer cell lines (HT-29, HCT-116, SW-620, SW-480, DLD-1) by performing real-time PCR, the expression level of ICAM-1 in colorectal cancer cells is the result of checking
  • 1e and 1f are results of confirming the relationship between colorectal cancer malignancy and ICAM-1 through the CPTAC data base and colorectal cancer patient tissue data.
  • 1I and 1J are results of confirming the expression level of ICAM-1 in a patient who has metastasized to a lymph node.
  • Figure 2a is a result of confirming the relationship between the high expression level of ICAM-1 and tumor metastasis and angiogenesis using GSEA analysis.
  • Figure 2b is a schematic diagram illustrating a method of injecting the SW-480 cell line with reduced ICAM-1 expression into the cecum of mice.
  • FIG. 2c is a result confirming the relationship between ICAM-1 expression and tumor metastasis in the mouse transplanted with the SW-480 cell line in FIG. 2b.
  • 2D and 2E are results of confirming the expression levels of EMT markers and metastasis factors in mice transplanted with the SW-480 cell line of FIG. 2B.
  • Figure 2f is the result of confirming the relationship between the expression level of ICAM-1 and angiogenesis in vitro.
  • 2G and 2H are results of confirming the relationship between the expression level of ICAM-1 and the angiogenesis ability in vivo in the mouse model of FIG. 2B through PCR and tissue immunofluorescence.
  • 3a is a result of confirming the correlation with p-SRC by performing a kinase array for ICAM-1.
  • 3b and 3c are results of confirming SRC activity according to ICAM-1 expression through the TCGA database for colorectal cancer patients.
  • 3d is a result of confirming the interaction between ICAM-1 and SRC using the immunoprecipitation method.
  • 3e is a result of confirming the binding position of SRC to ICAM-1 by performing tissue immunofluorescence to confirm the interaction between ICAM-1 and SRC in detail.
  • 3f and 3g show the results of confirming the relationship between tumor metastasis and angiogenesis after constructing a mutant that inhibits or activates the Tyr512 residue of ICAM-1.
  • Figure 4a is the result of confirming the gene exhibiting high expression in common in colorectal cancer patients through four GEO databases.
  • Figure 4b is a result of specifically confirming the expression of ICAM-1 and SRC after treatment with a c-MET inhibitor.
  • Figure 4c is a result of confirming the expression level of p-SRC when the ICAM-1 expression is suppressed and then treated with HGF, a ligand of c-MET.
  • 4d is a result confirming the activation of SRC in the mutant overexpressing ICAM-1.
  • 4e and 4f are results of observing the binding level of c-MET and SRC according to the reduction of ICAM-1 through IP and PLA.
  • Figure 4g is a result of confirming the expression level of p-SRC through ICC when ICAM-1 and c-MET are present at the same position.
  • 5a is a result of confirming metastatic potential when ICAM-1 is overexpressed and then SRC is knocked down.
  • 5b and 5c are results of confirming the expression levels of EMT markers and transcription factors through real-time PCR and western blot when SRC is knocked down after overexpressing ICAM-1.
  • 5d, 5e, and 5f are results of confirming the angiogenic ability and the expression of growth factors that induce the angiogenesis when SRC is knocked down after overexpressing ICAM-1.
  • Figure 5g is a result of confirming the correlation between the expression level of ICAM-1 and p-SRC in the tissue of a colorectal cancer patient.
  • 5h is the result of confirming the correlation between the expression level of ICAM-1 and p-SRC and the prognosis of colorectal cancer patients.
  • Figure 6a is the result of confirming the metastatic ability of the tumor when 3 weeks have elapsed after injecting the tumor into the cecum, and then injecting the monoclonal antibody into the abdominal cavity.
  • 6b and 6c show the results of confirming the expression level of metastasis-related genes by PCR and tissue immunostaining when 3 weeks have elapsed after the tumor was injected into the cecum.
  • Figure 6d is the result of confirming the angiogenic ability of the blood vessel when the SW-480 cell line is treated with a monoclonal antibody.
  • 6e and 6f are results of observing the expression level and angiogenesis level of growth factors regulating angiogenesis in vivo in the case of monoclonal antibody treatment.
  • 6a is a result of confirming the survival rate of colorectal cancer according to ICAM-1 expression.
  • 6b is a result of analyzing colorectal cancer grade according to ICAM-1 expression.
  • 6c shows the results of analyzing the tumor size according to ICAM-1 expression.
  • Figure 6d confirms the correlation between ICAM-1 and p-SRC in the tissue of a colorectal cancer patient.
  • 6e is a result confirming the prognosis according to the increase in the expression of ICAM-1 and p-SRC.
  • 7a is a result of injecting a tumor into the cecum, then injecting a monoclonal antibody into the abdominal cavity and confirming the metastatic ability of the tumor.
  • 7B and 7C are results of confirming the expression level of metastasis-related genes through PCR and tissue immunostaining after injecting the tumor into the cecum.
  • Figure 7d is the result of confirming the angiogenesis ability of SW-480 cell line after treatment with ICAM-1 monoclonal antibody.
  • 7e and 7f are results of confirming the expression of factors regulating angiogenesis in vivo and the number of new blood vessels.
  • the present inventors completed the present invention by confirming that ICAM-1 regulates cancer metastasis and angiogenesis in a SRC-dependent manner as a result of research on colorectal cancer metastasis inhibitor candidates.
  • the present invention comprises the steps of: (a) treating cells with a candidate material in Vitro; (b) measuring the level of binding between intracellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and SRC in the cell; And (c) provides a colon cancer metastasis inhibitor screening method comprising the step of selecting a substance that increases the binding level of ICAM-1 and SRC compared to the untreated group of the candidate substance as a therapeutic substance.
  • ICAM-1 intracellular adhesion molecule 1
  • colorectal cancer metastasis inhibitor means not only to inhibit the proliferation of cells caused by colon cancer, but also to inhibit metastasis and mobility of colon cancer.
  • the colorectal cancer metastasis inhibitor may include any molecule such as, for example, proteins, oligopeptides, small organic molecules, polysaccharides, polynucleotides, and a wide range of compounds.
  • the "cell” may be a colon tissue-derived cell, but is not limited thereto, and is used to compare the binding level of ICAM-1 and SRC, and preferably may be a colon cancer cell, but is not limited thereto. it is not
  • the term “candidate material” refers to a material expected to increase the binding level of ICAM-1 and SRC, and the candidate material is a compound, a microbial culture medium or extract, a natural product extract, a nucleic acid, and a peptide consisting of It may be selected from the group, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid may be selected from the group consisting of siRNA, shRNA, microRNA, antisense RNA, aptamer, LNA (locked nucleic acid), PNA (peptide nucleic acid), and morpholino.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the measurement of the binding level of ICAM-1 and SRC according to the present invention may be measuring the mRNA level of ICAM-1 and SRC genes.
  • the mRNA level is polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR), RNase protection assay (RPA), micro
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • Real-time PCR real-time polymerase chain reaction
  • RNase protection assay micro
  • microarray microarray
  • northern blotting microblotting
  • the present inventors have identified that ICAM-1 regulates metastatic potential and angiogenesis in a SRC-dependent manner through specific examples.
  • ICAM-1 is involved in the metastatic and angiogenic ability of colorectal cancer, and it can be inferred that the colorectal cancer inhibitory effect of ICAM-1 is regulated in a SRC-dependent manner.
  • the present invention provides a composition for predicting colon cancer metastasis comprising an agent for measuring the mRNA level of the ICAM-1 gene or an agent for measuring the protein level encoded by the gene, and a kit comprising the same do.
  • the ICAM-1 gene may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and homologues of the nucleotide sequence are also included within the scope of the present invention.
  • the gene includes a nucleotide sequence having a sequence homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the protein encoded by the ICAM-1 gene may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and is interpreted to include a sequence showing substantial identity to the sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the substantial identity is at least 80% when the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art after aligning the sequence of the present invention with any other sequence as much as possible.
  • a sequence exhibiting homology more preferably 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% homology, most preferably 96%, 97%, 98%, 99% homology. it means.
  • the agent for measuring the mRNA level may be sense and antisense primers or probes that complementarily bind to the mRNA of a gene.
  • primer refers to an oligonucleotide synthesized for use in diagnosis, DNA sequencing, etc. as a short gene sequence serving as a starting point of DNA synthesis.
  • the primers may be synthesized and used with a length of typically 15 to 30 base pairs, but may vary depending on the purpose of use, and may be modified by methylation, capping, etc. by a known method.
  • probe refers to a nucleic acid capable of specifically binding to mRNA having a length of several bases to several hundreds of bases produced through enzymatic, chemical separation, purification or synthesis.
  • the presence or absence of mRNA can be checked by labeling radioactive isotopes or enzymes, and it can be designed and modified by a known method.
  • the agent for measuring the protein level may be an antibody that specifically binds to a protein encoded by a gene, but is not limited thereto.
  • antibody includes immunoglobulin molecules having immunological reactivity with a specific antigen, and includes both monoclonal and polyclonal antibodies.
  • the antibody also includes forms produced by genetic engineering such as chimeric antibodies (eg, humanized murine antibodies) and heterologous antibodies (eg, bispecific antibodies).
  • the kit for prediction of the present invention consists of one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the analysis method.
  • the kit of the present invention contains genomic DNA derived from a sample to be analyzed, a primer set specific for the marker gene of the present invention, an appropriate amount of a DNA polymerase, a dNTP mixture, a PCR buffer, and water to perform PCR. It may be a kit comprising
  • the PCR buffer solution may contain KCl, Tris-HCl and MgCl 2 .
  • components necessary for performing electrophoresis that can confirm whether or not the PCR product is amplified may be additionally included in the kit of the present invention.
  • the kit of the present invention may be a kit including essential elements necessary for performing RT-PCR.
  • the RT-PCR kit includes a test tube or other suitable container, reaction buffer, deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC -Water (DEPC-water), sterile water, etc. may be included.
  • dNTPs deoxynucleotides
  • enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase
  • DNase DNase
  • RNase inhibitors DEPC -Water
  • sterile water etc.
  • a primer pair specific for a gene used as a quantitative control may be included.
  • the kit of the present invention may be a kit including essential elements necessary for performing a DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which cDNA corresponding to a gene or fragment thereof is attached as a probe, and the substrate may include cDNA corresponding to a quantitative structural gene or fragment thereof.
  • the kit of the present invention may be in the form of a microarray having a substrate on which the marker gene of the present invention is immobilized.
  • the kit of the present invention may be a kit characterized in that it includes essential elements necessary for performing ELISA.
  • the ELISA kit includes an antibody specific for a marker protein, and an agent for measuring the protein level.
  • the ELISA kit may include a reagent capable of detecting an antibody that has formed an "antigen-antibody complex", for example, a labeled secondary antibody, chromopores, an enzyme, and a substrate thereof.
  • an antibody specific for the quantitative control protein may be included.
  • the term “antigen-antibody complex” refers to a combination of a protein encoded by a gene and an antibody specific thereto.
  • the amount of formation of the antigen-antibody complex can be quantitatively measured through the magnitude of the signal of the detection label.
  • the detection label may be selected from the group consisting of an enzyme, a fluorescent substance, a ligand, a luminescent substance, a microparticle, a redox molecule, and a radioisotope, but is not limited thereto.
  • the present invention provides information for predicting metastasis of colorectal cancer comprising measuring the expression level of the mRNA of the ICAM-1 gene or the protein encoded by the gene in a biological sample derived from a subject.
  • the term "information providing method for metastasis prediction of colorectal cancer" used in the present invention is a preliminary step for diagnosis, providing objective basic information necessary for diagnosing colorectal cancer metastasis, and the clinical judgment or opinion of a doctor is excluded. .
  • the biological sample derived from the subject may include, but is not limited to, tissues, cells, whole blood, blood, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, and urine.
  • the expression level of the mRNA is NanoString nCounter analysis, polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR), RNase protection It may be measured by at least one method selected from the group consisting of RNase protection assay (RPA), microarray, and northern blotting, but is not limited thereto.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • Real-time PCR real-time polymerase chain reaction
  • RNase protection RPA
  • microarray microarray
  • northern blotting but is not limited thereto.
  • the protein expression level is determined by western blotting, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation according to a conventional method known in the art. ), flow cytometry, immunofluorescence, ouchterlony, complement fixation assay, and at least one method selected from the group consisting of a protein chip It may be measured through, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting colon cancer metastasis comprising the ICAM-1 gene or a protein encoded by the gene as an active ingredient.
  • metastasis inhibition refers to any action that delays the onset of colon cancer, including inhibition of metastasis and angiogenesis, of colon cancer by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention includes the ICAM-1 gene or a protein encoded by the gene as an active ingredient, and may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in formulation, and includes, but is not limited to, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome, and the like. It does not, and may further include other conventional additives, such as antioxidants and buffers, if necessary.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, lubricants, etc. may be additionally added to form an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules or tablets.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or locally applied) according to a desired method, but preferably may be administered orally, and the dosage Although it varies depending on the condition and weight of the patient, the degree of disease, the drug form, the route and time of administration, it may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat or diagnose a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment or diagnosis, and the effective dose level is determined by the patient's disease type, severity, drug activity, sensitivity to drugs, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including concurrent drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the patient's age, sex, condition, weight, absorption of the active ingredient into the body, inactivation rate and excretion rate, disease type, and drugs used in combination, in general 0.001 to 150 mg, preferably 0.01 to 100 mg per 1 kg of body weight, may be administered daily or every other day, or may be administered in divided doses 1 to 3 times a day.
  • the dosage since it may increase or decrease depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., the dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • the present invention provides a method for predicting colorectal cancer metastasis using the composition for predicting colorectal cancer metastasis.
  • the present invention provides a method for preventing, inhibiting or treating colon cancer metastasis, including a method of administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • the present invention provides a colorectal cancer metastasis predictive use of the composition for predicting colorectal cancer metastasis.
  • the present invention provides a use for preventing, inhibiting or treating colon cancer metastasis of the pharmaceutical composition.
  • ICAM-1 As a result of confirming the expression of ICAM-1 based on the GEO database, as shown in Fig. 1a, in GSE4183, it was found that the expression of ICAM-1 was high from the stage of inflammatory bowel disease (IBD), which is the stage of colorectal cancer formation, In GSE59071, it was confirmed that the expression of ICAM-1 was high in Crohn's disease and active ulcerative colitis.
  • IBD stage of inflammatory bowel disease
  • GSE59071 it was confirmed that the expression of ICAM-1 was high in Crohn's disease and active ulcerative colitis.
  • the expression of ICAM-1 as described above gradually increased as the stage of malignancy progressed. It was specifically confirmed through the CPTAC database and colon cancer patient tissues. Through the TCGA database, disease-specific survival (DSS) and overall survival (OS) decrease as the expression level of ICAM-1 increases. It was specifically confirmed that the expression of ICAM-1 was further increased, and the prognosis was worse as shown in FIG.
  • ICAM-1 regulates cancer metastasis and angiogenesis in an SRC-dependent manner.
  • the degree of cancer malignancy was confirmed through GDC TCGA, and at this time, the T stage was marked according to the size of the tumor among the TNM stages, and each stage is divided into T1, T2, T3, and T4. means more advanced. As a result, as shown in FIG. 6c , it was confirmed that the higher the expression of ICAM-1, the more patients corresponding to T3 and T4 appeared.
  • the present invention has shown that ICAM-1 can be a potential target for the development of colorectal cancer therapeutics by confirming that ICAM-1 can regulate cancer metastasis and angiogenesis in an SRC-dependent manner. Accordingly, when the target screened by the method of the present invention is used, it is expected to be usefully utilized in the industrial field for the development of a treatment for colorectal cancer.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)

Abstract

본 발명은 대장암 억제제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 ICAM-1와 SRC의 결합수준을 증가시키는 물질을 치료물질로 선정하는 대장암 억제제 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 ICAM-1이 SRC에 의존적으로 암 전이능 및 혈관신생을 조절할 수 있음을 확인함으로써, ICAM-1이 대장암 치료제 개발의 잠재적 표적인자가 될 수 있음을 보여주었다. 이에, 본 발명의 방법으로 스크리닝된 표적인자를 이용한 대장암 치료제를 이용하여 대장암 환자의 치료효과를 높일 수 있다.

Description

대장암 전이 억제제 스크리닝 방법
본 발명은 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 ICAM-1와 SRC의 결합수준을 증가시키는 물질을 치료물질로 선정하는 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
대장암은 세계에서 세번째로 흔히 진단되는 암이며 네번째로 많은 사망원인으로 알려져 있으며, 국내 대장암 사망률은 점차 증가하는 추세로 사망률이 73%에 이르는 것으로 집계되고 있다. 대장암은 발병 요인에 따라 산발적 대장암(sporadic colon cancer)과 염증성 대장암(colitis associated colorectal cancer)으로 구별할 수 있다. 산발적 대장암은 유전적 요인, 노화, 2형 당뇨, 과체중, 음주 및 흡연 등 여러 요인에 의해 발병되고, 염증성 대장암은 크론병(Crohn's disease)과 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 같은 지속적인 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)이 주된 원인이다. 산발적 대장암은 대부분 노화 혹은 유전적 요인에 의해 발병되기 때문에 주로 고령의 환자에게 나타나지만, 염증성 대장암은 젊은 층의 환자에게도 발병되기 쉬우며 산발적 대장암보다 사망률이 더 높은 것으로 알려져 있다.
한편, 용종을 식별하고 제거할 수 있는 선별방법으로는 대장 내시경이 일반적이나 장천공, 장출혈, 수면무호흡증 등 많은 부작용을 야기시키며, 종양을 정확하게 선별하기에는 많은 어려움이 있다. 따라서, 대장암을 진단하거나 치료하기 위한 마커의 개발이 필요한 실정이다.
최근 E3 ligase의 조절 억제가 대장암에 성장, 전이 및 암 줄기 세포 증식을 증가시키는 연구보고가 있으나(Christina L et al, Surgery, 2007, June, 705-707. (2007.06)), 구체적으로 암세포의 전이 및 혈관생성에 대한 매커니즘은 아직 알려지지 않은 실정이다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 대장암 전이 억제제 후보물질에 대해 연구한 결과, ICAM-1이 SRC에 의존적으로 암 전이능 및 혈관신생을 조절하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 ICAM-1 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 전이 예측용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 ICAM-1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하는 대장암 전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) In Vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 세포에서 ICAM-1(Intracellular adhesion molecule 1)과 SRC와의 결합수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 후보물질의 비처리군에 비해 ICAM-1과 SRC의 결합수준을 증가시키는 물질을 치료물질로 선정하는 단계를 포함하는 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 세포는 대장암 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 핵산은 siRNA, shRNA, microRNA, 안티센스 RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 ICAM-1과 SRC의 결합수준 측정은 ICAM-1 및 SRC 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 mRNA 수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 ICAM-1 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 전이 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ICAM-1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하는 대장암 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 ICAM-1이 SRC에 의존적으로 암 전이능 및 혈관신생을 조절할 수 있음을 확인함으로써, ICAM-1이 대장암 치료제 개발의 잠재적 표적인자가 될 수 있음을 보여주었다. 이에, 본 발명의 방법으로 스크리닝된 표적인자를 이용한 대장암 치료제를 이용하여 대장암 환자의 치료효과를 높일 수 있다.
도 1a는 정상인 및 염증성 장 질환 환자의 ICAM-1 발현 차이를 확인한 결과이다.
도 1b는 정상인 및 암 환자에서 ICAM-1 발현 차이를 확인한 결과이다.
도 1c는 조직면역염색실험을 통해 대장암 환자내에서 ICAM-1의 발현이 증가해 있음을 확인한 결과이다.
도 1d는 정상세포주인 CCD841과 대장암 세포주(HT-29, HCT-116, SW-620, SW-480, DLD-1)에 Real-time PCR를 수행하여, 대장암세포에서 ICAM-1의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 1e 및 도 1f는 CPTAC data base와 대장암 환자 조직 데이터를 통하여 대장암의 악성화와 ICAM-1의 관련성을 확인한 결과이다.
도 1g 및 도 1h는 상기 도 1e 및 도 1f에서 활용한 데이터를 분석했을 때, ICAM-1의 발현이 높을수록 질병특이생존율 및 생존율이 감소한다는 사실을 확인한 결과이다.
도 1i 및 도 1j는 림프절로 전이가 일어난 환자에서 ICAM-1의 발현수준을 확인한 결과이다.
도 2a는 GSEA analysis를 활용하여 ICAM-1의 높은 발현 수준과 종양 전이 및 혈관 신생과의 관련성을 확인한 결과이다.
도 2b는 ICAM-1의 발현이 감소된 SW-480 세포주를 쥐의 맹장에 주입하는 방식을 나타낸 모식도이다.
도 2c는 상기 도 2b에서 SW-480 세포주가 이식된 마우스의 ICAM-1 발현과 종양 전이와의 관련성을 확인한 결과이다.
도 2d 및 도 2e는 상기 도 2b의 SW-480 세포주가 이식된 마우스의 EMT마커 및 전이 인자 등의 발현수준을 확인한 결과이다.
도 2f는 in vitro에서 ICAM-1의 발현수준과 혈관신생능의 관계를 확인한 결과이다.
도 2g 및 도 2h는 상기 도 2b의 마우스 모델의 in vivo에서 ICAM-1의 발현수준과 혈관신생능의 관계를 PCR 및 조직면역형광을 통해 확인한 결과이다.
도 3a는 ICAM-1에 대한 kinase array를 수행하여 p-SRC과의 상관관계를 확인한 결과이다.
도 3b 및 도 3c는 대장암 환자에 대한 TCGA 데이터베이스를 통해 ICAM-1 발현에 따른 SRC 활성을 확인한 결과이다.
도 3d는 면역침강법을 활용하여 ICAM-1과 SRC의 상호작용 여부를 확인한 결과이다.
도 3e는 ICAM-1과 SRC의 상호작용을 구체적으로 확인하기 위하여, 조직면역형광을 수행하여 ICAM-1에 대한 SRC의 결합위치를 확인한 결과이다.
도 3f 및 도 3g는 ICAM-1의 Tyr512 잔기를 억제 또는 활성화 시키는 돌연변이를 제작한 다음, 종양의 전이 및 혈관신생능과의 관계를 확인한 결과이다.
도 4a는 4개의 GEO database를 통해 대장암 환자에서 공통적으로 높은 발현을 나타내는 유전자를 확인한 결과이다.
도 4b는 c-MET 억제제를 처리한 다음, ICAM-1 및 SRC의 발현을 구체적으로 확인한 결과이다.
도 4c는 ICAM-1의 발현을 억제시킨 다음, c-MET의 ligand인 HGF를 처리했을 때, p-SRC의 발현수준을 확인한 결과이다.
도 4d는 ICAM-1을 과발현하는 돌연변이에서 SRC의 활성화를 확인한 결과이다.
도 4e 및 도 4f는 IP와 PLA를 통하여 ICAM-1의 감소에 따른 c-MET과 SRC의 결합수준을 관찰한 결과이다.
도 4g는 ICAM-1 및 c-MET이 같은 위치에 존재할 때, p-SRC의 발현 수준을 ICC를 통해 확인한 결과이다.
도 5a는 ICAM-1을 과발현 시킨 후, SRC를 녹다운 시켰을 때, 전이능을 확인한 결과이다.
도 5b 및 도 5c는 ICAM-1을 과발현 시킨 후, SRC를 녹다운 시켰을 때, EMT 마커 및 전사 인자의 발현 수준을 real-time PCR 및 웨스턴블랏을 통해 확인한 결과이다.
도 5d, 도 5e 및 도 5f는 ICAM-1을 과발현 시킨 후, SRC를 녹다운 시켰을 때, 혈관신생능 및 이를 유도하는 성장인자의 발현을 확인한 결과이다.
도 5g는 대장암 환자의 조직에서 ICAM-1과 p-SRC의 발현수준의 상관관계를 확인한 결과이다.
도 5h는 ICAM-1 및 p-SRC의 발현수준과 대장암 환자의 예후와의 상관관계를 확인한 결과이다.
도 6a는 맹장에 종양을 주입하고 3주가 경과한 다음, 단일클론 항체를 복강에 주입햇을 때, 종양의 전이능을 확인한 결과이다.
도 6b 및 도 6c는 맹장에 종양을 주입하고 3주가 경과했을 때, 전이와 관련된 유전자의 발현 수준을 PCR 및 조직면역염색법으로 확인한 결과이다.
도 6d는 SW-480 세포주에 단일클론 항체를 처리햇을 때, 혈관의 신생능을 확인한 결과이다.
도 6e 및 도 6f는 단일클론 항체를 처리한 경우, in vivo 상에서 혈관신생 조절하는 성장인자의 발현 수준 및 혈관 신생수준을 관찰한 결과이다.
도 6a는 ICAM-1 발현에 따른 대장암의 생존율을 확인한 결과이다.
도 6b는 ICAM-1 발현에 따른 대장암 grade를 분석한 결과이다.
도 6c는 ICAM-1 발현에 따른 종양크기를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6d는 대장암 환자의 조직내에서 ICAM-1과 p-SRC의 상관관계를 확인한 것이다.
도 6e는 ICAM-1과 p-SRC의 발현이 증가함에 따른, 예후를 확인한 결과이다.
도 7a는 종양을 맹장에 주입한 다음, 단일클론 항체를 복강에 주입하고 종양의 전이능을 확인한 결과이다.
도 7b 및 7c는 종양을 맹장에 주입한 다음, PCR 및 조직면역염색을 통해, 전이와 관련된 유전자의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 7d는 SW-480 세포주에 ICAM-1 단일클론항체를 처리한 다음, 혈관의 신생능을 확인한 결과이다.
도 7e 및 7f는 in vivo 상에서 혈관신생을 조절하는 인자의 발현 및 신생된 혈관의 수를 확인한 결과이다.
본 발명자들은 대장암 전이 억제제 후보물질에 대해 연구한 결과, ICAM-1이 SRC에 의존적으로 암 전이능 및 혈관신생을 조절하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 (a) In Vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 세포에서 ICAM-1(Intracellular adhesion molecule 1)과 SRC와의 결합수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 후보물질의 비처리군에 비해 ICAM-1과 SRC의 결합수준을 증가시키는 물질을 치료물질로 선정하는 단계를 포함하는 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 "대장암 전이 억제"는 대장암에 의한 세포 증식을 억제하는 작용을 할 뿐 아니라, 대장암의 전이 및 이동성을 억제할 수 있음을 의미한다. 상기 대장암 전이 억제제는 예를 들어, 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오타이드 및 광범위한 화합물 등 임의 분자를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "세포"는 대장 조직 유래 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, ICAM-1 및 SRC의 결합 수준을 비교하기 위해 사용되는 것이고, 바람직하게는 대장암 세포일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "후보물질"이란 ICAM-1 및 SRC의 결합수준을 증가시킬 것으로 예상되는 물질을 의미하고, 상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 핵산은 siRNA, shRNA, microRNA, 안티센스 RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 ICAM-1과 SRC의 결합수준 측정은 ICAM-1 및 SRC 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 mRNA 수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정할 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 ICAM-1이 SRC에 의존적으로 전이능 및 혈관생성능을 조절하는 것을 규명하였다.
본 발명의 일 실시예서는, ICAM-1을 억제시키는 경우 SRC가 감소하는 것을 확인하였으며, ICAM-1을 발현시키는 경우 SRC의 활성이 증가하는 것을 확인하였고, 면역침강반응을 통해 ICAM-1의 Tyr512 잔기와 SRC가 결합하는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, ICAM-1을 과발현시킨 후 SRC를 넉다운 시켰을 때 ICAM-1의 발현이 증가되었어도 SRC가 감소함에 따라 전이능이 감소하는 것을 확인하였으며, EMT 마커, 전사인자의 발현 및 혈관신생능 유도 성장인자의 발현 수준이 감소하는 것을 확인함으로써, ICAM-1이 SRC에 의존적으로 전이능과 혈관신생을 조절하는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
상기 실시예로부터 ICAM-1이 대장암의 전이능 및 혈관신생능에 관여하는 것을 확인할 수 있으며, ICAM-1의 대장암 억제 효능은 SRC에 의존적으로 조절된다는 것을 유추할 수 있다.
이에, 본 발명의 다른 양태로서 본 발명은 ICAM-1 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 전이 예측용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 ICAM-1 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 염기서열의 상동체도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 ICAM-1 유전자가 암호화하는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 서열번호 1에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%의 상동성, 가장 바람직하게는 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
본 발명에서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프라이머"란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프로브"란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.
본 발명의 예측용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커 유전자가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 "항원-항체 복합체"를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소, 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항원-항체 복합체"란 유전자가 코딩하는 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미한다. 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미세입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 피검자 유래의 생물학적 시료에서 ICAM-1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 대장암의 전이 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "대장암의 전이 예측을 위한 정보제공방법"은 진단을 위한 예비적 단계로써 대장암 전이 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
상기 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 mRNA의 발현수준은 나노스트링 엔카운터 분석(NanoString nCounter analysis), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 ICAM-1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하는 대장암 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "전이 억제"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 대장암의 전이 억제 및 혈관신생 억제를 비롯하여 대장암의 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 ICAM-1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
한편, 본 발명은 상기 대장암 전이 예측용 조성물을 활용한 대장암의 전이 예측방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 방법을 포함하는, 대장암 전이 예방, 억제 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 대장암 전이 예측용 조성물의 대장암 전이 예측용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 대장암 전이 예방, 억제 또는 치료용도를 제공한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 대장 질환 및 대장암에서 ICAM-1의 발현 확인
GEO 데이터베이스를 토대로 ICAM-1의 발현을 확인한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이 GSE4183에서는 대장암 형성단계인 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD) 단계부터 ICAM-1의 발현이 높은 것으로 나타났으며, GSE59071에서도 크론병(Crohn's disease) 및 궤양성 대장염(active ulcerative colitis)에서 ICAM-1의 발현이 높게 나타나는 것을 확인하였다.
또한, GSE 41258에서 ICAM-1 발현을 확인한 결과 도 1b에 나타낸 바와 같이 정상인보다 암 환자에서 ICAM-1발현이 높게 나타나는 것을 확인하였으며, 조직면역염색을 수행했을 때, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 대장암 환자내에서 ICAM-1의 발현이 높게나타나는 것을 확인하였다. ICAM-1의 발현 변화를 구체적으로 확인하기 위하여 정상세포주인 CCD841과 대장암 세포주(HT-29, HCT-116, SW-620, SW-480, DLD-1)에 Real-time PCR을 진행한 결과, 도 1d에 나타낸 바와 같이, 대장암세포주에서 ICAM-1의 발현이 증가되어 있음을 확인하였다.
상기와 같은 ICAM-1의 발현은 도 1e 및 도 1f에 나타낸 바와 같이, 악성화단계가 진행될수록 ICAM-1의 발현이 점차 증가함을 CPTAC 데이터 베이스와 대장암 환자 조직을 통하여 구체적으로 확인하였다. TCGA 데이터베이스를 통하여 질병특이 생존율(DSS, disease-specific survival) 및 생존율(OS, overall survival)은 ICAM-1의 발현수준이 증가할수록 낮아지며, 도 1i에 나타낸 바와 같이, 림프절로 전이가 일어난 환자의 경우 ICAM-1의 발현이 더욱 증가하며, 림프절로 전이가 일어난 환자 내에서도 ICAM-1의 발현수준이 높은 환자의 경우, 도 1j에 나타낸 바와 같이 예후가 더욱 나쁘다는 사실을 구체적으로 확인하였다.
실시예 2. ICAM-1 발현에 따른 대장암 세포의 전이 및 혈관신생 확인
ICAM-1의 발현과 전이능 및 혈관신생능의 상관성을 규명하기 위하여, ICAM-1의 발현을 억제하거나 과발현시킨 후 침윤능 및 혈관신생능의 변화를 확인하였다.
먼저, GSEA 분석을 통하여 ICAM-1의 높은 발현을 보이는 환자에서 종양의 전이와 혈관신생과의 관련성을 확인하였을 때, 도 2a에 나타낸 바와 같이, ICAM-1의 발현이 높게 나타나는 환자일수록 종양의 전이와 혈관신생이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. ICAM-1의 발현수준이 낮은 SW-480 세포주를 제작한 다음, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 쥐의 맹장에 주입하고 종양의 전이를 관찰한 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, ICAM-1의 발현이 낮을 경우 폐에 형성된 foci의 수가 감소한 것을 확인할 수 있었고, PCR 및 조직면역염색법을 수행했을 때, 도 2d 및 도 2e에 나타낸 바와 같이, 전이와 관련된 유전자(E-캐드헤린(E-cadherin), 스네일(snail), 슬러그(slug))의 발현 수준 또한 감소하였음을 확인하였다. In vivo에서 혈관신생을 촉진시키는 인자의 발현 수준과 혈관의 생성정도를 PCR 및 조직면역형광 염색법을 통해 관찰했을 때에도 도 2g 및 도 2h에 나타낸 바와 같이 ICAM-1의 발현수준이 감소된 경우, 혈관신생 및 이를 유도하는 인자의 발현이 모두 감소된 것을 구체적으로 확인할 수 있었다.
실시예 3. ICAM-1과 SRC의 작용기전 확인
3-1. ICAM-1과 SRC의 결합 확인
대장암세포에서 ICAM-1이 전이능과 혈관신생능을 조절하는 신호 기전을 확인하기 위해, ICAM-1을 억제시킨뒤 phospho-kinase array를 진행한 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 p-SRC가 감소하는 것을 확인하였다.
이에 더하여, TCGA 데이터베이스를 통해 ICAM-1 발현과 SRC의 활성화 연관성을 확인한 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이 ICAM-1 발현이 높을수록 SRC 활성이 증가하며, 도 3c에 나타낸 바와 같이, ICAM-1의 발현 수준이 증가함에 따라서 SRC의 oncogene signature 또한 증가하는 것을 확인하였다.
대장암 세포인 SW-480 및 HCT-116에서 ICAM-1과 SRC의 발현 상관성을 확인하기 위하여 면역침강법을 수행한 결과, 도 3d에 나타낸 바와 같이 ICAM-1과 SRC가 endogenous하게 결합하고 있는 것을 확인하였으며, 특히 도 3e에 나타낸 바와 같이, ICAM-1의 Tyr 잔기 부위에 SRC가 결합하고 있는 것을 확인하였다.
나아가, ICAM-1이 특정 잔기에 의해 SRC와 결합한다는 것을 확인하기 위해, ICAM-1의 Tyr512번 인산화 잔기를 억제시키거나(Y512A), 활성화시키는(Y512D) Phosphomimeitc한 변이 형태를 이용해 면역침강반응을 진행한 결과, 도 3f 및 3g에 나타낸 바와 같이, Phospho 잔기가 활성화될수록 SRC와 더욱 강하게 결합되어 있음을 확인하였다.
3-2. ICAM-1 및 SRC와 c-MET의 관련성 확인
4개의 GEO 데이터베이스를 검토한 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 대장암 환자에서 모두 c-MET의 발현이 증가되어 있음을 확인할 수 있었고, 이러한 결과를 토대로 ICAM-1 및 SRC의 메커니즘에서 c-MET의 역할을 구체적으로 확인하였다. c-MET의 억제제를 처리하는 경우, 도 4b에 나타낸 바와 같이, ICAM-1 및 SRC의 인산화가 감소하는 것을 확인할 수 있었고, ICAM-1의 발현을 감소시킨 다음, c-MET의 ligand인 HGF를 처리했을 때에는 도 4c에 나타낸 바와 같이, ICAM-1 발현 의존적으로 p-SRC의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다.
상기 실시예 3-1에서 제작한 ICAM-1가 억제 또는 과발현된 돌연변이를 제작한 다음, SRC의 활성화를 확인해본 결과, 도 4d에 나타낸 바와 같이, ICAM-1이 과발현된 돌연변이에서 SRC의 활성화가 유의한 수준으로 증가되었음을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 결과를 뒷받침 하기 위하여, 면역침강법 및 PLA 염색을 수행한 결과, 도 4e 및 도 4f에 나타낸 바와 같이, ICAM-1의 발현이 감소함에 따라, c-MET과 SRC의 결합이 감소되는 것을 확인하였으며, ICAM-1과 c-MET이 같은 위치에 존재할 때, p-SRC이 증가함을 ICC를 통해 확인하였고, 그 결과를 도 4g에 나타내었다.
실시예 4. SRC에 의존적인 ICAM-1의 전이능 및 혈관신생능 확인
ICAM-1이 SRC에 의존적으로 암의 전이능 및 혈관신생능을 조절하는지 확인하였다.
먼저, ICAM-1을 과발현시킨 후 rescue 실험으로 SRC를 넉다운한 후 전이능을 확인한 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 ICAM-1 발현이 증가되었어도 SRC가 감소함에 따라 전이능이 감소하는 것을 확인하였다.
다음으로, RT-PCR 및 웨스턴블랏을 사용하여 EMT 마커 및 전사인자의 발현을 확인한 결과, 도 5b 및 도 5c에 나타낸 바와 같이 SRC 발현이 감소함에 따라 EMT 마커 및 전사인자의 발현이 감소되는 것을 확인하였다.
이에 더하여, 혈관신생능의 변화를 확인하기 위해 혈관신생능을 유도하는 성장인자의 발현을 확인하기 위하여 혈관을 촬영한 다음, 길이를 측정한 결과, ICAM-1을 과발현 한 다음, SRC를 넉다운 시키는 경우, 혈관 신생이 감소함을 확인할 수 있었으며(도 5d), 혈관 신생을 관여하는 인자(도 5e) 및 성장인자(도 5f) 또한 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, ICAM-1의 전이능 및 혈관신생능은 SRC에 의존적으로 조절된다는 것을 유추할 수 있다.
실시예 5. ICAM-1 발현에 따른 환자의 생존율 및 암 악성화 정도 확인
In vitro 실험과 더불어 환자에 직접 적용하는 경우에도 ICAM-1의 발현이 대장암과의 상관성을 나타내는지 확인하기 위해, TCGA 데이터 베이스를 통해 대장암 환자의 생존율을 확인하였다. 그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이 ICAM-1이 높게 발현되는 경우 대장암 환자의 생존율이 낮아지는 것을 확인하였다.
이에 더하여, GSE 17538에서 ICAM-1 발현에 따른 대장암 환자의 암 grade를 확인한 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이 ICAM-1이 낮은 경우에 비해 ICAM-1이 높은 경우에 3기에 해당하는 환자가 더 많은 것을 확인하였다.
나아가, GDC TCGA를 통해 암의 악성화 정도를 확인 하였으며, 이때 TNM stage 중 종양 크기에 따라 구분되는 T 단계로 표시하였으며 각 단계는 T1, T2, T3, T4로 구분되며, 숫자가 높을수록 암의 악성화가 더욱 진행된 것을 의미한다. 그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이 ICAM-1의 발현이 높을수록 T3 및 T4에 해당하는 환자가 더 많게 나타나는 것을 확인하였다.
상기 실시예 3 및 4를 통해 상호작용을 확인한 ICAM-1 및 SRC의 종양 악성화 효과 등을 구체적으로 확인하기 위하여, 대장암 환자의 조직을 관찰한 결과, 도 6d에 나타낸 바와 같이, ICAM-1 및 p-SRC의 발현양상은 양의 상관관계를 가지고 있음을 확인하였고, 예후를 구체적으로 검토했을 때에도 도 6e에 나타낸 바와 같이, ICAM-1 및 p-SRC의 발현수준이 높아질수록 예후에도 나쁜 영향을 주는 것을 확인하였다.
실시예 6. ICAM-1 활성 억제에 따른 종양 악성화 개선효과 확인
ICAM-1의 억제제를 투여했을 때, 종양의 전이능 개선효과를 확인하기 위해서, 종양을 맹장에 주입한 다음, 3주가 경과했을 때 ICAM-1을 표적으로 하는 단일클론항체를 처리하고, 경과를 확인하였다. 그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, 상기 항체를 처리한 경우, 대조군에 비해 종양의 전이능이 감소한 것을 확인하였으며, PCR 및 조직면역염색법을 수행한 경우, 도 7b 및 7c에 나타낸 바와 같이, 전이와 관련된 유전자인 CDH1, Vimentin, Snail, Zeb1의 발현수준이 감소된 것을 확인하였다.
ICAM-1을 타겟으로 하는 단일클론 항체를 SW-480 세포주에 처리하는 경우, 혈관의 신생능이 유의하게 감소함을 혈관의 이미징 및 길이를 측정하여 확인하였으며(도 7d), 도 7e 및 도 7f에서 나타낸 바와 같이, in vivo 상에서도 혈관신생을 조절하는 성장인자들의 발현 및 혈관신생이 감소되어 있음을 구체적으로 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 ICAM-1이 SRC에 의존적으로 암 전이능 및 혈관신생을 조절할 수 있음을 확인함으로써, ICAM-1이 대장암 치료제 개발의 잠재적 표적인자가 될 수 있음을 보여주었다. 이에, 본 발명의 방법으로 스크리닝된 표적인자를 이용하는 경우, 대장암 치료제 개발을 위한 산업분야에서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

Claims (12)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법:
    (a) In Vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 세포에서 ICAM-1(Intracellular adhesion molecule 1)과 SRC와의 결합수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 후보물질의 비처리군에 비해 ICAM-1과 SRC의 결합수준을 증가시키는 물질을 치료물질로 선정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 대장암 세포인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 핵산은 siRNA, shRNA, microRNA, 안티센스 RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 ICAM-1과 SRC의 결합수준 측정은 ICAM-1 및 SRC 유전자의 mRNA 수준 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 mRNA 수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  7. ICAM-1 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 전이 예측용 조성물.
  8. ICAM-1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 대장암 전이 억제용 약학 조성물.
  9. 제7항의 대장암 전이 예측용 조성물을 활용한 대장암의 전이 예측방법.
  10. 제8항의 약학적 조성물을 개체에 투여하는 방법을 포함하는, 대장암 전이 예방, 억제 또는 치료방법.
  11. 제7항의 대장암 전이 예측용 조성물의 대장암의 전이 예측용도.
  12. 제8항의 약학적 조성물의 대장암 전이 예방, 억제 또는 치료용도.
PCT/KR2021/009367 2020-07-20 2021-07-20 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법 WO2022019626A1 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202180060202.3A CN116134319A (zh) 2020-07-20 2021-07-20 用于筛选结直肠癌转移抑制剂的方法
JP2022579115A JP2023535280A (ja) 2020-07-20 2021-07-20 大腸癌転移阻害剤をスクリーニングする方法
CA3189430A CA3189430A1 (en) 2020-07-20 2021-07-20 Method for screening colorectal cancer metastasis inhibitor
EP21845811.5A EP4184166A1 (en) 2020-07-20 2021-07-20 Method for screening colorectal cancer metastasis inhibitor
US18/016,752 US20230288399A1 (en) 2020-07-20 2021-07-20 Method for screening colorectal cancer metastasis inhibitor

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2020-0089603 2020-07-20
KR20200089603 2020-07-20
KR10-2021-0095111 2021-07-20
KR1020210095111A KR102549771B1 (ko) 2020-07-20 2021-07-20 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022019626A1 true WO2022019626A1 (ko) 2022-01-27

Family

ID=79729638

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/009367 WO2022019626A1 (ko) 2020-07-20 2021-07-20 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230288399A1 (ko)
JP (1) JP2023535280A (ko)
KR (1) KR20230107484A (ko)
CA (1) CA3189430A1 (ko)
WO (1) WO2022019626A1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120067672A (ko) * 2010-12-16 2012-06-26 사회복지법인 삼성생명공익재단 대장암의 간 전이 진단용 조성물 및 그 용도
KR20150041751A (ko) * 2013-10-08 2015-04-17 서울대학교산학협력단 TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료, 또는 암 전이 억제용 조성물
KR20170058104A (ko) * 2015-11-18 2017-05-26 주식회사 메타신 Fstl1 단백질을 유효성분으로 함유하는 골대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120067672A (ko) * 2010-12-16 2012-06-26 사회복지법인 삼성생명공익재단 대장암의 간 전이 진단용 조성물 및 그 용도
KR20150041751A (ko) * 2013-10-08 2015-04-17 서울대학교산학협력단 TM4SF5 단백질 및 c-Src 단백질의 결합억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료, 또는 암 전이 억제용 조성물
KR20170058104A (ko) * 2015-11-18 2017-05-26 주식회사 메타신 Fstl1 단백질을 유효성분으로 함유하는 골대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN JIEZHONG, ELFIKY AYMEN, HAN MEI, CHEN CHEN, SAIF M. WASIF: "The Role of Src in Colon Cancer and Its Therapeutic Implications", CLINICAL COLORECTAL CANCER, C I G MEDIA GROUP, L.P., US, vol. 13, no. 1, 1 March 2014 (2014-03-01), US , pages 5 - 13, XP055892657, ISSN: 1533-0028, DOI: 10.1016/j.clcc.2013.10.003 *
CHRISTINA L ET AL., SURGERY, June 2007 (2007-06-01), pages 705 - 707
TACHIMORI, A. ; YAMADA, N. ; SAKATE, Y. ; YASHIRO, M. ; MAEDA, K. ; OHIRA, M. ; NISHINO, H. ; HIRAKAWA, K.: "Up regulation of ICAM-1 gene expression inhibits tumour growth and liver metastasis in colorectal carcinoma", EUROPEAN JOURNAL OF CANCER, vol. 41, no. 12, 1 August 2005 (2005-08-01), Elsevier, Amsterdam NL, pages 1802 - 1810, XP027785674, ISSN: 0959-8049 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA3189430A1 (en) 2022-01-27
US20230288399A1 (en) 2023-09-14
KR20230107484A (ko) 2023-07-17
JP2023535280A (ja) 2023-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2010120143A2 (ko) 간암 예후 마커
WO2017026843A1 (ko) 만성골수성백혈병에 관한 정보 제공 방법
WO2017217807A2 (ko) Nckap1을 유효성분으로 포함하는 대장암 진단 또는 대장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물
WO2021086014A1 (ko) 폐암 환자의 면역치료 반응성 예측용 cxcl13 마커 및 이의 용도
WO2018026190A1 (ko) 암 예후 예측용 바이오마커
WO2011081421A9 (en) Complement c9 as markers for the diagnosis of cancer
WO2014014157A1 (ko) 위암 진단 및 치료를 위한 ａｄｃｙ3의 용도
WO2022019626A1 (ko) 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법
AU2010200731A1 (en) Novel compositions and methods in cancer associated with altered expression of PRLR
WO2018105921A2 (ko) 지방간의 진단 또는 치료를 위한 류신 지퍼 단백질의 용도
KR100948808B1 (ko) 간암 마커로서의 ｌｃｎ2 유전자, 단백질 및 간암 진단키트
WO2018048257A1 (ko) 간섬유화 진단용 마커로서의 akap12의 용도
WO2021025412A1 (ko) 보체 성분 c8 감마를 이용한 알츠하이머병의 진단방법
KR20030051871A (ko) 항암제에 대한 종양 세포의 감수성을 검정하는 방법
WO2009131366A2 (ko) 위암 또는 대장암 진단 마커 및 치료제로서의 ｃdca5
EP4184166A1 (en) Method for screening colorectal cancer metastasis inhibitor
WO2019103456A2 (ko) Pmvk를 유효성분으로 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 또는 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물
WO2019088348A1 (ko) Egfr 저해제 저항성 암 치료제
WO2023287079A1 (ko) Csde1을 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 전이 예측용 바이오마커 조성물
WO2022231102A1 (ko) 항암제 반응성 예측용 바이오마커 및 이의 용도
WO2010140824A9 (ko) 간세포암의 진단 및 예후결정용 조성물
CN112359111B (zh) Prcc或其上调剂在肝癌治疗中的应用及prcc在肝癌诊断或预后中的应用
WO2016200120A1 (ko) 교모세포종 환자에서 이브루티닙 감수성과 관련된 유전자 및 그 용도
KR102202120B1 (ko) 알츠하이머 질환의 진단 또는 치료를 위한 Ｕｂｅ２ｈ의 용도
WO2023101316A1 (ko) Axl을 포함하는 지방간 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21845811

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022579115

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3189430

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021845811

Country of ref document: EP

Effective date: 20230220