WO2019088348A1 - Egfr 저해제 저항성 암 치료제 - Google Patents

Egfr 저해제 저항성 암 치료제 Download PDF

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WO2019088348A1
WO2019088348A1 PCT/KR2017/014207 KR2017014207W WO2019088348A1 WO 2019088348 A1 WO2019088348 A1 WO 2019088348A1 KR 2017014207 W KR2017014207 W KR 2017014207W WO 2019088348 A1 WO2019088348 A1 WO 2019088348A1
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gnb5
cancer
egfr
inhibitor
cetuximab
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PCT/KR2017/014207
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조광현
박상민
황채영
이대원
공정렬
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한국과학기술원
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Definitions

  • the present invention relates to a novel cancer therapeutic agent, and more particularly, to a therapeutic agent effective for resistance cancer against an EGFR inhibitor and a screening method thereof.
  • Colorectal cancer is one of the most common types of cancer in the world.
  • the overall 5-year relative survival rate of colorectal cancer patients in the localized stage is almost 90%. However, at the onset of progression, the 5-year survival rate is known to decrease to about 20% (Siegel et al ., Cancer J. Clin . 62 (4): 220-241, 2012).
  • the prognosis of patients with metastatic colorectal cancer (mCRC) remains poor despite therapeutic advances in the median overall survival time of 18-21 months (Bardelli and Siena, J. Clin . Oncol . 28 (7): 1254-1261, 2010). This has led to much effort to identify more effective drug targets for mCRC.
  • Cetuximab (trade name Erbitux ® ) is a monoclonal antibody to the epithelial growth factor receptor (EGFR) and is used to treat CRC patients by inhibiting EGFR.
  • EGFR epithelial growth factor receptor
  • the EGFR signaling pathway plays an important role in various cellular functions such as cell growth, differentiation, survival, cell cycle progression and angiogenesis.
  • KRAS is a signaling molecule downstream of the EGFR pathway, and mutations occur in about 40% of CRC patients. Inhibition of the EGFR pathway by cetuximab or other EGFR inhibitors may induce tumor regression, but always active mutant KRAS has been shown to confer resistance to cetuximab.
  • KRAS mutation status is an important indicator of the benefits of cetuximab treatment, and cetuximab is currently used in patients with wild-type KRAS. However, almost half of wild-type KRAS patients do not respond to treatment with cetuximab. On the other hand Some patients with KRAS mutations could still respond to treatment with cetuximab. These results indicate that KRAS mutation alone is not sufficient to predict cetuximab reactivity.
  • the prior art promotes the death of resistant colon cancer cells and head and neck cancer cells against EGFR inhibitors
  • the combined cytotoxic agent maytansinoid itself also has cytotoxicity against these cancer cells
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and it is an object of the present invention to provide a more effective EGFR inhibitor-resistant cancer therapeutic agent and a screening method for the therapeutic agent.
  • these problems are exemplary and do not limit the scope of the present invention.
  • a pharmaceutical composition for treating EGFR inhibitor-resistant cancer which contains an inhibitor specific for GNB5 and an EGFR inhibitor as an active ingredient.
  • a method for producing a test compound comprising: reacting a test compound or a natural substance with GNB5; And selecting a test compound or a natural substance that specifically binds to GNB5.
  • the present invention also provides a method for screening a candidate compound for resistance cancer treatment for an EGFR inhibitor.
  • a method for treating GNB5 comprising: treating a cell expressing GNB5 with a test compound or a natural product; There is provided a screening method for a cancer resistant therapeutic agent candidate for an EGFR inhibitor, comprising the step of screening a test compound or natural product significantly inhibiting the expression of GNB5 as compared with a control without any treatment.
  • a method for producing a compound comprising the steps of: treating a compound or natural product with a composition comprising GNB5 and a pair protein interacting with GNB5;
  • a screening method for a candidate cancer resistant therapeutic agent for an EGFR inhibitor comprising the step of screening a test compound or natural product significantly inhibiting the interaction of GNB5 and the parent protein, as compared to a control not subjected to any treatment.
  • a method of treating a patient suffering from an EGFR inhibitor resistant cancer comprising administering a GNB5 inhibitor and an EGFR inhibitor to a patient suffering from an EGFR inhibitor.
  • a method of treating cancer comprising: separating cancer cells from cancer patients; Treating the cancer cells with an EGFR inhibitor; Determining whether the cancer cell is resistant to the EGFR inhibitor; And, when it is determined that the cancer cell is resistant to the EGFR inhibitor, administering a combination of the GNB5 inhibitor and the EGFR inhibitor to the cancer patient in combination with an EGFR inhibitor.
  • the treatment efficiency of the resistant intestine cancer against the EGFR inhibitor can be drastically increased.
  • the scope of the present invention is not limited by these effects.
  • Figure 1 shows the process of searching for potential targets to overcome cetuximab resistance.
  • A Data set Heat map of genes differentially expressed between cetuximab-resistant and cetuximab-resistant patients in GSE5851. The hue scale shows a multiple of expression relative to the intermediate expression level of each gene in all patient samples, UP and DOWN Show upregulated genes and downregulated genes in cetuximab resistant patients, respectively.
  • B A graph showing expression patterns of eight genes continuously up-regulated from the cetuximab-resistant cell line of the data set GSE59857 compared to the susceptible cells.
  • C A graph showing the expression levels of eight genes in cetuximab-resistant cell line NCI-H508 and cetuximab-resistant cell lines HCT116, HT29 and SW48 by qRT-PCR.
  • FIG. 2 shows the results of the reaction of cisplatin with KRAS wild type CRC cells by potential target knockdown, showing that (A) DUSP4, (B) ETV5, (C) GNB5, (D) NT5E and (E) PHLDA1 shRNAs
  • FIG. 5 is a graph showing the results of cell death analysis.
  • Each target gene was transiently knocked down in SW48 cells.
  • the knockdown efficiency of the target gene was confirmed by Western blot or RT-PCR. ⁇ -actin was used as a loading control.
  • FIG. 3 shows the results of the reaction of erlotinib of KRAS wild type CRC cells with potential target knockdown by (A) DUSP4, (B) ETV5, (C) GNB5, (D) NT5E and (E) PHLDA1 shRNAs transfection
  • FIG. 5 is a graph showing the results of cell death analysis.
  • Each target gene was transiently knocked down in SW48 cells.
  • Target gene-knockdown SW48 cells were cultured in 96-well plates for 24 hours (1 ⁇ 10 4 cells / well) and treated with erlotinib (10 ⁇ M) for 72 hours.
  • Figure 5 is a series of photographs showing that cetuximab-induced cytotoxicity is enhanced in HCT116 cells by GNB5 knockdown.
  • PI propidium iodide
  • Figure 6 shows the effect of GNB5 expression and GNB5 knockdown in the KRAS mutant cell line.
  • A A graph showing the degree of GNB5 expression in KRAS wild type NCI-H508 cell line and cetuximab resistant cell line with other KRAS mutants.
  • B, C Data set GSE59857 (B) and Cancer Cell Line Encyclopedia A graph showing the degree of GNB5 expression in the corresponding cell line,
  • D a graph showing the cell viability of cetuximab and GNB5 knockdown shRNA in SW620 cells (left panel), and a GNB5 knockdown GNB5 mRNA level With the graph showing the results (right panel), the result is similar to that of FIG. 4C.
  • FIG. 7 shows the results of transfection of KRAS mutant CRC cells with erlotinib by potential knockdown in the presence of (A) DUSP4, (B) ETV5, (C) GNB5, (D) NT5E, and (E) PHLDA1 shRNAs
  • FIG. 5 is a graph showing the results of cell death analysis.
  • Each target gene was transiently knocked down in HCT116 cells.
  • Target gene-knockdown HCT116 cells were cultured in 96-well plates for 24 hours (0.7 ⁇ 10 4 cells / well) and treated with erlotinib (10 ⁇ M) for 72 hours.
  • Figure 8 shows the characteristics of GNB5 in colorectal cancer.
  • A a graph showing the frequency of GNB5 gene modification in the CRC of cBioPortal
  • B a graph comparing GNB5 expression levels in CRC and normal adjacent mucosa
  • C the overall survival curves of CRC patients classified as GNB5 expression levels
  • D Normalized concentration scores (NES) and FDR-corrected P -values are presented in the GNB5 gene set enrichment assay (GSEA).
  • GSEA GNB5 gene set enrichment assay
  • Fig. 9 shows the result of analysis of the concentration of the GNB5 gene group.
  • the GNB5 expression data from the TCGA and GO gene sets, the carcinogenic gene sets and the gene markers of MSIGDB were used in the GSEA and the positive or negative NES and FDR-corrected P -values are presented.
  • Figure 10 shows the effect of cetuximab treatment on Akt and ERK signaling.
  • A A photograph showing the result of Western blot analysis performed after NCI-H508 and SW48 cells were treated with 100 ⁇ g / mL of cetuximab for 1 hour, (B) for 24 hours, harvested and dissolved, (C)
  • C C
  • D Quantification of the expression level of each cell line at 0 hour before treatment with cetuximab, and a graph showing normalized Akt and ERK activity, respectively, by RT-PCR analysis of GNB5 expression level in H508 and SW48 cells.
  • Figure 11 shows the effect of GNB5 overexpression in cetuximab sensitive cells.
  • A A photograph showing Western blot analysis results using anti-phosphorylated-Akt, anti-phosphorylated-ERK and anti-GNB5 antibodies against GNF5 overexpressing NCI-H508 cell lysates. And used as a control.
  • FIG. 12 is a graph showing the results of analysis of GNB5 expression in GSE59857 through one-way dual sample t-test.
  • Figure 13 shows a network model of GNB5 for cetuximab resistance.
  • A KRAS wild type and
  • B KRAS mutation
  • CTX represents cetuximab
  • GNB5 O / E represents GNB5 overexpression
  • GNB5 K / D represents GNB5 knockdown.
  • the simulation time is expressed in arbitrary units (a.u.), and the gray area of the shade in survival represents the boundary between sensitive and resistive reactions.
  • C Represents the cetuximab resistance for the proposed GNB5 network.
  • Figure 14 shows the effect of GNB knockdown on Akt and ERK signaling in cetuximab treatment in SW620 cells.
  • A Western blot analysis showing the levels of Akt and ERK phosphorylation in SW620 cells with KRAS mutation after knockdown and cetuximab treatment of GNB5,
  • B time-dynamics graphs quantifying and normalizing Akt and ERK signals,
  • C And the corresponding simulation curve for the ERK activity (CTX or GNB5 K / D represents the cetuximab treatment or knockdown condition of GNB5 respectively and the initial state of CTX + GNB5 K / D represents the normal state at the state of GNB5 K / D of the middle panel of FIG.
  • D cetuximab, GNB5 knockdown, and a graph showing a comparison of Akt and ERK activity between simulation results and actual experimental results in SW620 cells after 2 hours of combined treatment.
  • the GNB5 network was simulated with a random arbitrary perturbation of nominal parameter values in the range of 0 to 50% and the change in survival rate was less than or equal to 0.5 at cetuximab treatment in the KRAS wild type and in combination with GNB5 knockdown and cetuximab in the KRAS mutation And showed sensitivity to cetuximab, while in other cases it was 0.5 or more.
  • epidermal growth factor receptor is a transmembrane protein that is a receptor for an epithelial growth factor family protein, an extracellular ligand. Mutations that affect the expression or activity of EGFR in a large number of cancers can cause the development and progression of cancer. Accordingly, anticancer agents targeting EGFR have been developed. Such anticancer agents include cetuximab (trade name: Erbitux ® ), which is an antagonistic antibody targeting EGFR.
  • guanine nucleotide binding protein (G protein), beta 5)
  • RRS7 G-protein signaling 7
  • GNG13 G-protein gamma subunit 13
  • the term "functional fragment of an antibody” refers to a fragment of an antibody in which an antigen-binding site is conserved, not a full-length antibody as a heterodimer consisting of two heavy chains and two light chains,
  • the fragments include Fab, F (ab ') 2 , Fab', a single chain fragment variable (scFv), or a single-domain antibody (sdAb) derived from the antibody.
  • Fab is an antigen-binding antibody fragment that is produced by digesting an antibody molecule into a protease, papain, and is a dimer of two peptides of VH-CH1 and VL- , And other fragments generated by papain are referred to as Fc (fragment crystalisable).
  • F (ab ') 2 refers to a fragment comprising an antigen binding site in a fragment produced by digesting an antibody with pepsin, a protease, and the form of a tetramer in which two Fabs are linked by a disulfide bond .
  • Another fragment produced by pepsin is referred to as pFc '.
  • Fab &quot is produced by reducing the F (ab ') 2 as an antibody fragment having a locus similar to that of the Fab, and the length of the heavy chain portion is slightly longer than that of Fab.
  • scFv refers to a single chain fragment variable, a recombinant antibody fragment in which the variable regions (V H and V L ) of a Fab of an antibody are produced in a single strand using a linker do.
  • sdAb single doamain antibody
  • sdAb single doamain antibody
  • a single variable region fragment of an antibody referred to as a nanobody.
  • the sdAb derived mainly from the heavy chain is used, but a single variable region fragment derived from the light chain has also been reported to be a specific binding to the antigen.
  • antibody mimetic is intended to include only heavy chains without light chains, unlike conventional full-length antibodies in which two heavy chains and two light chains form a quaternary structure of a hetero- Like protein produced from non-antibody-derived protein scaffolds such as antibody fragments (V H H, V NAR, etc.) derived from camelia or cartilaginous fish, or nanobody, monobody, variable lymphocyte receptor (VLR).
  • V H H, V NAR, etc. antibody fragments derived from camelia or cartilaginous fish, or nanobody, monobody, variable lymphocyte receptor (VLR).
  • a pharmaceutical composition for treating cancer resistant to an EGFR inhibitor which comprises an inhibitor specific for GNB5 and an EGFR inhibitor as an active ingredient.
  • the inhibitor specific to GNB5 may be a GNB5 activity inhibitor or a GNB5 expression inhibitor
  • the GNB5 activity inhibitor may be a GNB5 antagonistic antibody or a functional fragment thereof, an antibody analogue specifically binding to GNB5, gallein or GRK2i
  • the GNB5 expression inhibitor may be an antisense nucleotide, siRNA, shRNA or microRNA that specifically binds to the GNB5 gene.
  • the resistant cancer to the EGFR inhibitor may be a mutant or non-mutated KRAS gene, the mutation may be derived from exon 2 of the KRAS gene, and the mutation occurring in the exon 2 may be 12 Th and / or 13th amino acid glycine may be substituted with another amino acid.
  • the EGFR inhibitor may be an EGFR inhibitory compound or an EGFR antagonistic antibody
  • the EGFR inhibitory compound may be gefitinib, erlotinib, lapatinib, vadetanib, neratinib, or osimertinib
  • the EGFR antagonist may be cetuximab, pantiumumab, or necitumumab.
  • the cancer resistant to the EGFR inhibitor may be colon cancer, lung cancer, pancreatic cancer or head and neck cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier can be of various oral or parenteral formulations.
  • a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used.
  • Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, .
  • lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like.
  • excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • the non-aqueous solvent and the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, It can have one formulation.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • parenterally it can be administered intravenously, intranasally, intramuscularly, intraperitoneally, intrathecally, intraspinally, subcutaneously, intradermally Intraperitoneal, intrathecal, intrathecal, intracerebral, transdermal, and the like.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dosage level will vary depending on the species and severity, age, sex, The activity of the compound, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of the treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered at a dose of 0.1 mg / kg to 1 g / kg, more preferably at a dose of 1 mg / kg to 500 mg / kg. On the other hand, the dose can be appropriately adjusted according to the age, sex and condition of the patient.
  • a method for producing a test compound comprising: reacting a test compound or a natural substance with GNB5; And selecting a test compound or a natural substance that specifically binds to GNB5.
  • the present invention also provides a method for screening a candidate compound for resistance cancer treatment for an EGFR inhibitor.
  • the specific binding of GNB5 to the test compound or the natural product is determined by radioisotope labeling-using cell-affinity chromatography, drug affinity responsive target stability (DARTS) Differential scanning light scattering (DSLS) analysis, differential scanning fluorometry (DSF), or differential emissivity capillary behavior analysis of ligands (Differential Scanning Calorimetry) radial capillary action of ligand assay, DraCALA).
  • DARTS drug affinity responsive target stability
  • DSLS Differential scanning light scattering
  • DSF differential scanning fluorometry
  • DraCALA differential emissivity capillary behavior analysis of ligands
  • the screening method may further comprise the step of treating the EGFR inhibitor resistant cancer cell with the EGFR inhibitor to determine whether the EGFR inhibitor resistance is reduced by treating the selected test compound or natural product with the EGFR inhibitor resistant cancer cell.
  • a method for treating GNB5 comprising: treating a cell expressing GNB5 with a test compound or a natural product; And selecting a test compound or a natural substance that significantly inhibits the expression of GNB5 as compared with a control group to which nothing is treated.
  • the expression of GNB5 can be performed by measuring the protein level of GNB5 or the expression level of mRNA encoding GNB5, and the protein level of GNB5 can be determined by Western blot analysis, HPLC, LC / MS, Precipitation method, ELISA, RIA, or mass spectrometry, and the expression level of mRNA encoding the GNB5 can be measured by Northern blot analysis, quantitative PCR, or microarray analysis.
  • the screening method may further comprise the step of treating the EGFR inhibitor resistant cancer cell with the EGFR inhibitor to determine whether the EGFR inhibitor resistance is reduced by treating the selected test compound or natural product with the EGFR inhibitor resistant cancer cell.
  • a method for producing a compound comprising the steps of: treating a compound or natural product with a composition comprising GNB5 and a pair protein interacting with GNB5; And selecting a test compound or a natural substance that significantly inhibits the interaction of GNB5 and the parent protein as compared to a control group that has not been subjected to any treatment, is provided as a method for screening a candidate for a resistance cancer therapeutic agent for an EGFR inhibitor .
  • G protein gamma 2 (G protein), RGS11 (regulator of G-protein signaling 11), GNG2 (guanine nucleotide binding protein (Regulator of G-protein signaling 6), RGS7 (regulator of G-protein signaling 7), RGS7BP (regulator of G-protein signaling 7 binding protein), DRD2 (dopamine receptor D2) (COP5 signalosome subunit 5), CCT3 (chaperonin containing TCP1, subunit 3), RGS9 (regulator of G protein signaling 9), GNG5 (guanine nucleotide binding protein G protein 5), CDKN1A inhibitor 1A), MTOR (mechanistic target of rapamycin), CCT2 (chaperonin containing TCP1, subunit 2), PRPF40B (PRP40 pre-mRNA processing factor 40 homolog B), CUL4A (cullin 4A), PFDN5 (prefoldin subunit 5) t-complex 1), GIT11 (heterotrimeric G
  • the screening method may further comprise the step of treating the EGFR inhibitor resistant cancer cell with the EGFR inhibitor to determine whether the EGFR inhibitor resistance is reduced by treating the selected test compound or natural product with the EGFR inhibitor resistant cancer cell.
  • a method of treating a patient suffering from an EGFR inhibitor resistant cancer comprising administering a GNB5 inhibitor and an EGFR inhibitor to a patient suffering from an EGFR inhibitor.
  • a method of treating cancer comprising: separating cancer cells from cancer patients; Treating the cancer cells with an EGFR inhibitor; Determining whether the cancer cell is resistant to the EGFR inhibitor; And, when it is determined that the cancer cell is resistant to the EGFR inhibitor, administering a combination of the GNB5 inhibitor and the EGFR inhibitor to the cancer patient in combination with an EGFR inhibitor.
  • the present inventors identified five potential target genes (DUSP4, ETV5, GNB5, NT5E, and PHLDA1) for cetuximab-resistant CRC through gene expression data analysis and cell line experiments. Knockdown of these 5 genes in KRAS wild type cells increased susceptibility to cetuximab. In addition, we confirmed that knockdown of GNB5 increases cetuximab susceptibility in KRAS mutant cells. The present inventors further investigated the role of GNB5 in cancer progression and found that GNB5 contributes to cetuximab resistance by predominantly regulating Akt signaling pathway. Our findings suggest that GNB5 may be a promising target for combination therapy with cetuximab in cetuximab resistant cancers, regardless of KRAS mutations.
  • Gene expression data for CRC patients who received Cetuximab monotherapy were obtained from the Gene Expression Omnibus (GEO, //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo).
  • GEO Gene Expression Omnibus
  • Differentially expressed genes (DEG) between cetuximab-sensitive and resistant patients were identified using the Benjamini-Hochberg step-down FDR algorithm. The algorithm adjusts the P value to reflect the effects of various tests.
  • the heat map of differentially expressed genes was generated by a multiple change of each gene to the average expression level.
  • Gene expression data of human CRC cell line using cetuximab treatment was also obtained from GEO.
  • the gene expression data pairs of CRC and normal adjacent mucosa were obtained from TCGA and compared using the Wilcoxon rank sum test.
  • a set of input data for gene set enrichment assay (GSEA) analysis was prepared as follows: (1) RNA-seq data from CRC patients were obtained from TCGA. (2) The phenotype marker is determined based on the median value of GNB5 expression. (3) A gene ontology (GO) gene set, a carcinogenic gene set and an imprinted gene set were downloaded from MSigDB (// www.broadinstitute.org/gsea/msigdb). Other parameters were set to default values.
  • GSEA analysis was performed using a javaGSEA Desktop Application with 3,000 permutations.
  • the overall survival rate of CRC patients was obtained from TCGA. Kaplan-Meier plots of overall survival were generated and compared by log rankings using Survival package in R. Expression levels of GNB5 were differentiated high or low on the basis of median values.
  • ODEs Ordinary differential equations
  • ⁇ molecule> a or ⁇ molecule> i represents the concentration of the active or inactive form of each ⁇ molecule>, and the total concentration of the two types of molecules is set to ⁇ molecule> tot).
  • the inhibition of EGFR by cetuximab was modeled by competitive inhibition kinetics. Survival variables are calculated as a linear combination of ERKa and AKTa, yielding quantities with arbitrary units.
  • the KRAS mutation of this model was used by reduced degradation of KRAS. It is important to note that the network model is structured to describe the mechanism in a qualitative way without rigorously reproducing the amount of actual biochemical reaction. Nominal or conditioned values of kinetic parameters and concentrations were determined to simply indicate the causal relationship between signal molecules. All parameters used in the analysis are as described in Tables 1 and 2 below.
  • NCI-H508, HCT116 and HEK293T cells were incubated with 10% fetal bovine serum (FBS) and antibiotics (100 units / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin and 0.25 ug / (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM, Welgene Inc., Korea) and incubated at 37 ° C in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 .
  • FBS fetal bovine serum
  • antibiotics 100 units / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin and 0.25 ug / (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM, Welgene Inc., Korea)
  • SW48 cells were cultured in a culture medium (Leibovitz's L15 Medium) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and antibiotics (100 units / ml penicillin, 100 ⁇ ⁇ / ml streptomycin and 0.25 ⁇ ⁇ / , Welgene Inc., Korea) and cultured at 37 ° C in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 .
  • a culture medium Leibovitz's L15 Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • antibiotics 100 units / ml penicillin, 100 ⁇ ⁇ / ml streptomycin and 0.25 ⁇ ⁇ / , Welgene Inc., Korea
  • Cetuximab was purchased from Merck Sereno (Erbitux, Darmstadt, Germany) and dimethylsulfoxide (DMSO) and propidium iodide (PI) were purchased from Sigma-Aldrich (Saint Louis, Mo.). Erlotinib was purchased from Cell Signaling (Danvers, MA).
  • HEK 293T cells were transfected with related lentiviral plasmid and packaging mixtures (pLP1, pLP2 and pLP / VSVG) using Lipofectamine (Invitrogene, Carlsbad, CA) according to the manufacturer's instructions to generate lentiviral particles.
  • pLP1, pLP2 and pLP / VSVG Lipofectamine
  • full-length human GNB5 was PCR amplified from human brain cDNA library (Clontech), ligated to pLentiM1.4 lentivirus vector, and sequenced.
  • pLKO.1 lentiviral-based plasmids containing shRNAs for DUSP4, ETV5, NT5E, GNB5 and PHLDA1 Sigma-Aldrich, USA
  • PI-based assays were performed to analyze cell death. The degree of apoptosis was detected according to the manufacturer's instructions using IncuCyte ZOOM (Essen Biosciences, Ann Arbor, MI, USA). Temporally knock down or overexpressed cells were seeded in 96-well plates and cultured for 24 hours (1 x 10 4 cells / well). Cells were then treated with cetuximab (Merck Sereno, USA) at the indicated concentrations for 72 hours. After seeding, cells were imaged using IncuCyte ZOOM. To assess cell death, the mean area of PI-labeled cells at each time point was determined using IncuCyte ZOOM analysis software. Images were acquired at 3 hour intervals from three separate areas per well with a 20x objective.
  • GNB5 is an intracellular protein that is already known to interact with various partner proteins or conjugate proteins. Thus, when a particular compound or natural product is combined with the GNB5 protein, the activity of GNB5 can be inhibited by interfering with the interaction with these paired proteins. Thus, by screening for the binding of the GNB5 protein to the test compound or the natural substance, it is possible to screen candidate therapeutic agents for cancer resistant to the EGFR inhibitor by inhibiting GNB5 activity.
  • various protein and compound binding assays can be used. These methods include radioisotope labeling-using small molecule-affinity chromatography, drug affinity responsive target stability analysis, (DSR) analysis, differential scanning fluorometry (DSF), and differential radiation capillary (DSF) analysis of the ligand. (McFedries et al ., Chem . Biol ., 20: 667-673, 2013).
  • the assay may be performed using a differential radial capillary action of ligand assay (DraCALA). This document is incorporated herein by reference.
  • a test compound or a natural substance is treated with GNB5 and a conjugate protein-containing reaction solution known to interact with GNB5, and then the test compound or natural product .
  • Methods for analyzing the interaction between these proteins include yeast two hybrid analysis, immunocomplex assay, surface plasmon resonance assay, continuous affinity purification-mass spectrometry (TAP-MS), fluorescence resonance energy transfer (FRET) analysis, a protein-fragment complementation assay, a phage display, an affinity capture, a reconstituted complex analysis, etc.
  • TEP-MS continuous affinity purification-mass spectrometry
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the GNB5 expression inhibitor that inhibits GNB5 expression can be designed based on the nucleic acid sequence of the nucleic acid molecule encoding GNB5.
  • GNB5 expression inhibitors include small interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA) targeting oligonucleotide molecules that specifically bind to nucleic acid molecules encoding GNB5 or complementary nucleic acid molecules thereof, or nucleic acid molecules that encode GNB5, Or a nucleic acid molecule that induces RNA interference phenomena such as microRNAs (miRNAs).
  • Example 1 Selection of candidate targets capable of overcoming cetuximab resistance
  • Example 2 Correlation between inhibition of potential target gene and cetuximab reactivity recovery
  • the five potential target genes DUSP4, ETV5, GNB5, NT5E, and PHLDA1 have been suggested to be related to the reactivity of cetuximab in some previous studies (Khambata-Ford et al ., J. Clin . Oncol . 2007; 25 ):... 3230-3237, 2007 ; Cushman et al, Clin Cancer Res 21 (5):.. 1078-1086, 2015; Oliveras-Ferraros et al, J. Cell Biochem 112 (1): 10-29, 2011; Balko et al ., BMC Cancer . 9: 145, 2009), there was no experimental study of how cancer cells actually responded.
  • the present inventors examined whether the potential target gene is an effective combination target that can induce cetuximab reactivity in CRC, by expressing shRNA against the genes, thereby inducing RNA interference, (Fig. 2 and Fig. 5). The results showed that the cell response by each of these knockdown was different depending on the mutation of KRAS. As shown in Figure 2, knockdown for the five potential target genes increased cetuximab responsiveness in the KRAS wild type cetuximab resistant cell line, SW48. All of the knockdowns of the five potential target genes showed increased cell death relative to the control. The present inventors have also found that the susceptibility to erlotinib (FIG. 3), another known EGFR inhibitor, in knockdown of any of the five target genes is increased.
  • FOG. 3 susceptibility to erlotinib
  • the present inventors investigated the characteristics of GNB5 in a database to identify the role of GNB5 in CRC. Since biomarkers are often overexpressed or mutated in cancer cells, genetic variation of CRC was identified in cBioPortal (// cbioportal.org) (Cerami et al ., Cancer Discov . 2 (5): 401-404, 2012). As a result, there was almost no amplification, mutation or deletion of the GNB5 gene in the CRC, as shown in Fig. 8A. Thus, the present inventors investigated whether GNB5 is highly expressed in CRC using the RNA-seq data of TCGA (Cancer Genome Atlas) (Giannakis et al ., Cell reports. 15 (4): 857-865, 2016). However, despite the investigation of 50 colorectal tumors and adjacent normal mucosa, there was no difference in the expression pattern of GNB5 (Fig. 8B).
  • GNB5 hypoxia and epithelial-mesenchymal (EMT) (Fig. 9). These results also suggest that the function of GNB5 may be related to the progression of cancer. Furthermore, the present inventors confirmed that GNB5 has a positive correlation with genes upregulated by MEK or Akt (Fig. 8D, center and right panel).
  • GNB5 is a molecule downstream of the largest receptor family of G protein coupled receptors (GPCRs) mediating physiologically important signaling (Osmond et al ., Curr . Opin . Mol . Ther . 12 (3): 305 -315, 2010).
  • GPCRs G protein coupled receptors
  • One of the G ⁇ subunits, GNB5 signals from the GPCR to various downstream effectors (O'Hayre et al ., Curr . Opin. Cell Biol . 27: 126-135, 2014).
  • Fig. 10 To explore the role of GNB5 in cetuximab resistance, we investigated whether the cell signaling pathways of MEK and Akt are related to cetuximab resistance (Fig. 10). As a result, as shown in FIG.
  • cetuximab inhibited ERK and Akt phosphorylation in cetuximab-sensitive NCI-H508 cells but not cetuximab-resistant SW48 cells.
  • the present inventors further investigated whether the level of ERK and Akt activity could be an indicator of cetuximab resistance by manipulating the expression of GNB5.
  • the present inventors analyzed phosphorylation of ERK and Akt by overexpression of GNB5 in NCI-H508 cells (FIG. 11A).
  • phosphorylation of Akt was significantly increased by overexpression of GNB5, whereas phosphorylation of ERK was moderate, as shown in Fig. 11A.
  • GNB5 expression GES59757 was analyzed by unidirectional double-sample t-test ( Figure 12).
  • Figure 12 the expression pattern of GNB5 appeared independent of the mutation of KRAS.
  • GNB5 inhibitors may be effective in combination with EGFR inhibitors, independent of KRAS mutations.
  • a mathematical model of the EGFR-GNB5 signaling network was constructed as described above.
  • the standard RAS-MEK-ERK and PI3K-Akt route, as well as interaction with GNB5 KRAS and PI3K was incorporated, including the cross-regulation between ERK and PI3K (Won et al., J. Mol . Cell Biol . 4 (3): 153-163, 2012).
  • All specifications of the network model were mathematically described using Ordinary Differential Equations (ODEs). The magnification changes of ERK and Akt activity were calculated based on activity levels under control conditions.
  • the survival parameter was defined as a linear combination of ERK and Akt activity.
  • the cetuximab responsiveness of the network model was reduced by cetuximab treatment (Fig. 13A, left panel).
  • overexpression of GNB5 mainly increased Akt activity (Figure 13A, middle panel) and then led to cetuximab resistance ( Figure 13A, right panel).
  • KRAS mutation resulted in cetuximab resistance (Fig. 13B, left panel).
  • the knockdown of GNB5 alone did not significantly change the cell viability of the network model (Fig.
  • the main mechanism of drug resistance by GNB5 is described as Akt and its activity.
  • another mechanism related to cetuximab resistance of GNB5 is immunological effect, that is, overexpression of GNB5 induces antibody-dependent cellular cytotoxicity ADCC). ≪ / RTI >
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment of the present invention can be used for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer which is resistant to an EGFR inhibitor such as cancer, especially cetuxmab.
  • Nucleic acid sequences shown in SEQ ID NOS: 1 to 22 are nucleic acid sequences of primers for RT-PCR for confirming the degree of expression of various genes such as GNB5.

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Abstract

본 발명은 본 발명은 신규 암 치료제에 관한 것으로서, GNB5에 특이적인 저해제 및 EGFR 저해제를 유효성분으로 포함하는 EGFR 저해제에 대한 저항성 암의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

Description

EGFR 저해제 저항성 암 치료제
본 발명은 신규 암 치료제에 관한 것으로서 보다 구체적으로는 EGFR 저해제에 대한 저항성 암에 효율적인 치료제 및 그의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
대장암(colorectal cancer, CRC)는 세계에서 자주 발생하는 암 유형 중 하나로, 국소화 단계(localized stage)에 있는 대장암 환자들의 전체 5년 상대 생존율은 거의 90%에 달한다. 그러나 진행이 시작되면 5년 생존율은 약 20%로 감소하는 것으로 알려지고 있다(Siegel et al., CA Cancer J. Clin. 62(4): 220-241, 2012). 전체 생존 기간의 중앙값이 18 ~ 21 개월 증가되는 치료적 진보에도 불구하고 전이성 대장암(mCRC) 환자의 예후는 여전히 좋지 않다(Bardelli and Siena, J. Clin . Oncol . 28(7): 1254-1261, 2010). 이 때문에 mCRC에 대한보다 효과적인 약물 표적을 확인하기 위한 많은 노력이 이루어지고 있다.
Cetuximab(상표명 Erbitux®)은 상피세포 성장인자 수용체(EGFR)에 대한 단일클론 항체로서 EGFR을 억제하여 CRC 환자를 치료하는데 사용된다. EGFR 신호 전달 경로는 세포성장, 분화, 생존, 세포주기 진행 및 혈관신생과 같은 다양한 세포기능에 중요한 역할을 한다. KRAS는 EGFR 경로의 하류 신호 분자로, 약 40%의 CRC 환자에서 돌연변이가 일어난다. cetuximab 또는 다른 EGFR 억제제에 의한 EGFR 경로의 억제는 종양 퇴행(tumor regression)을 유도할 수 있지만, 항상적으로 활성화된 돌연변이 KRAS는 cetuximab에 대한 내성을 부여하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 KRAS의 돌연변이 상태는 cetuximab 치료의 이점을 예고하는 중요한 지표이며, cetuximab은 현재 야생형 KRAS 환자에게 사용되고 있다. 그러나 야생형 KRAS 환자의 거의 절반은 cetuximab 치료에 반응하지 않는다. 반면 KRAS 돌연변이를 가진 일부 환자는 cetuximab 치료에도 여전히 반응 할 수 있었다. 이러한 결과는 KRAS 돌연변이 상태만으로는 cetuximab 반응성을 예측하기에 충분하지 않다는 것을 의미한다.
KRAS 외에도 cetuximab 치료의 반응률과 상관 관계가 있는 다른 예측 마커가 연구되고 있다. 예를 들어, BRAF, PI3K 및 PTEN을 포함한 EGFR 경로의 하류 신호분자는 항-EGFR 표적 치료의 부정적인 결과를 예측한다고 알려지고 있다. 그러나, 상기 신호분자들 cetuximab에 대한 반응과 일관되게 연관되어 있지 않는다(De Roock et al., Lancet Oncol. 12(6): 594-603, 2011; Lech et al., World J Gastroenterol. 22(5): 1745-1755, 2016). 따라서 cetuximab 치료에 대한 반응성을 향상시키기 위해서는 다른 예측 마커를 확인해야 할 필요가 있으며, 더 나아가cetuximab 저항성을 극복 할 수 있는 약물조합을 찾을 필요가 있다.
현재까지, EGFR 표적 치료에 저항성을 가지는 암에 대한 치료방법으로 항-EGFR 항체와 세포독성 제제의 콘주게이트를 투여하는 방법이 제안되고 있다(US9233171B1).
그러나 상기 선행기술의 경우, EGFR 저해제에 대한 저항성 대장암 세포 및 두경부암 세포에 대한 사멸을 촉진하긴 하였으나, 결합된 세포독성 제제인 메이탄시노이드(maytansinoid) 자체 역시 이들 암세포들에 대한 세포독성을 나타냈고, EGFR 저해제 저항성 암 뿐만 아니라 다른 항암제 저항성 암에 대하여도 저항성을 완화시키는 것으로 나타나, EGFR 저해제에 대한 저항성을 완전히 극복한 것이라고 보기 어렵다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효율적인 EGFR 저해제에 대한 저항성 암의 치료제 및 상기 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, GNB5에 특이적인 저해제 및 EGFR 저해제를 유효성분으로 함유하는 EGFR 저해제 저항성 암의 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 피검 화합물 또는 천연물을 GNB5와 반응시키는 단계; 및 GNB5와 특이적으로 결합하는 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는, EGFR 저해제에 대한 저항성 암 치료제 후보물질의 선별방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, GNB5를 발현하는 세포에 피검 화합물 또는 천연물을 처리하는 단계; 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 GNB5의 발현을 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 EGFR 저해제에 대한 저항성 암 치료제 후보물질의 선별방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, GNB5 및 상기 GNB5와 상호작용하는 짝단백질을 포함하는 조성물에 피검 화합물 또는 천연물을 처리하는 단계; 아무 것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 GNB5 및 상기 짝단백질의 상호작용을 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 EGFR 저해제에 대한 저항성 암 치료제 후보물질의 선별방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, GNB5 저해제 및 EGFR 저해제를 EGFR 저해제에 대한 저항성 암환자에게 투여하는 단계를 포함하는, EGFR 저해제 저항성 암환자의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 암환자로부터 암세포를 분리하는 단계; 상기 암세포에 EGFR 저해제를 처리하는 단계; 상기 암세포가 상기 EGFR 저해제에 대하여 저항성지 여부를 판정하는 단계; 및 상기 암세포가 EGFR 저해제에 대한 저항성이 있는 것으로 판정되면, 상기 암환자에 대하여 GNB5 저해제 및 상기 EGFR 저해제를 병용투여하는 단계를 포함하는 EGFR 저해제에 대한 저항성 암환자의 치료방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, EGFR 저해제에 대하여 저항성 난치암의 치료효율을 획기적으로 증가시킬 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 cetuximab 저항성을 극복하기 위한 잠재적 표적을 탐색하는 과정을 나타낸다. (A) 데이터 세트 GSE5851에서 cetuximab 내성과 cetuximab 민감성 환자 사이에 차별적으로 발현된 유전자의 히트 맵으로 색상 척도는 모든 환자 샘플에서 각 유전자의 중간 발현 수준에 비해 발현의 배수 변화를 나타니고, UP와 DOWN은 각각 cetuximab 내성 환자에서 상향 조절 된 유전자와 하향 조절 된 유전자를 나타낸다. (B) 데이터 세트 GSE59857의 cetuximab 내성 세포주에서 감수성 세포 대비 지속적으로 상향조절된 8 개의 유전자를 발현 양상을 나타내는 그래프. (C) qRT-PCR에 의한 cetuximab 내성 세포주 NCI-H508 및 cetuximab 내성 세포주 HCT116, HT29 및 SW48에서의 8 가지 유전자의 발현 수준을 나타낸 그래프.
도 2는 잠재적인 표적의 넉다운에 의한 KRAS 야생형 CRC 세포의 cetuximab에 대한 반응으로, (A) DUSP4, (B) ETV5, (C) GNB5, (D) NT5E 및 (E) PHLDA1 shRNAs 형질감염에 의한 세포사멸 분석결과를 나타내는 그래프이다. 각 표적 유전자는 SW48 세포에서 일시적으로 넉다운되었다. 표적 유전자-넉다운된 SW48 세포를 96-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하고(1×104 cells/well), 72시간 동안 cetuximab(100 ㎍/mL)를 처리 하였다. 결과는 평균±표준편차(오차 막대)로 나타내었다(n=3). 표적 유전자의 넉다운 효율은 웨스턴 블랏 또는 RT-PCR에 의해 확인되었다. β-actin은 적재 대조군을로 사용하였다.
도 3은 잠재적인 표적의 넉다운에 의한 KRAS 야생형 CRC 세포의 erlotinib에 대한 반응으로, (A) DUSP4, (B) ETV5, (C) GNB5, (D) NT5E 및 (E) PHLDA1 shRNAs 형질감염에 의한 세포사멸 분석결과를 나타내는 그래프이다. 각 표적 유전자는 SW48 세포에서 일시적으로 넉다운되었다. 표적 유전자-녹다운 SW48 세포를 96-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하고(1×104 cells/well), 72 시간 동안 erlotinib (10 μM)를 처리하였다.
도 4는 잠재적인 표적의 넉다운에 의한 KRAS 돌연변이체 CRC 세포의 cetuximab에 대한 반응으로, (A) DUSP4, (B) ETV5, (C) GNB5, (D) NT5E, 및 (E) PHLDA1 shRNAs 형질감염에 의한 세포사멸 분석결과를 나타내는 그래프이다. 각 표적 유전자는 HCT116 세포에서 일시적으로 넉다운되었다. 표적 유전자-넉다운 HCT116 세포를 96-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하고(0.7×104 cells/well), 72 시간 동안 cetuximab(100 ㎍/mL)을 처리하였고, 결과는 평균±표준편차(오차 막대)로 나타내었다(n=3). 표적 유전자의 넉다운 효율은 RT-PCR에 의해 확인되었다. GAPDH는 적재 대조군으로 사용하였다.
도 5는 GNB5 넉다운에 의해 HCT116 세포에서 cetuximab-유도 세포독성이 강화되는 것을 나타내는 일련의 사진이다. 세포사멸을 분석하기 위해, 프로피디움 요오드(PI) 1 ㎍/mL을 세포에 처리하고 cetuximab 처리 72간 경과 후 형광현민경 이미지를 수득하였다.
도 6은 KRAS 돌연변이 세포주의 GNB5 발현 및 GNB5 넉다운의 효과를 나타낸다. (A) KRAS 야생형인 NCI-H508 세포주 및 다른 KRAS 돌연변이가 있는 cetuximab 저항성 세포주에서의 GNB5 발현 정도를 나타내는 그래프, (B, C) 데이터 세트 GSE59857 (B) 및 Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE, C)의 해당 세포주에 대한 GNB5 발현 정도를 나타내는 그래프, (D) SW620 세포에서의 cetuximab 및 GNB5 넉다운용 shRNA 처리시 세포생존도를 측정한 결과를 나타내는 그래프(좌측 판넬) 및 GNB5 넉다운시 GNB5 mRNA 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프(우측 판넬)로, 상기 결과는 도 4C의 그것과 유사하다.
도 7은 잠재적인 표적의 넉다운에 의한 KRAS 돌연변이 CRC 세포의 erlotinib에 대한 반응으로, (A) DUSP4, (B) ETV5, (C) GNB5, (D) NT5E, 및 (E) PHLDA1 shRNAs 형질감염시 세포사멸 분석결과를 나타내는 그래프이다. 각각의 표적 유전자는 HCT116 세포에서 일시적으로 넉다운되었다. 표적 유전자-넉다운 HCT116 세포를 96-웰 플레이트에서 24 시간 동안 배양하고(0.7×104 cells/well), 72시간 동안 erlotinib(10 μM)을 처리하였다.
도 8은 대장암에서 GNB5의 특징을 나타낸다. (A) cBioPortal의 CRC에서 GNB5 유전자 변형 빈도를 나타내는 그래프, (B) CRC 및 정상 인접 점막에서 GNB5 발현수준을 비교한 그래프, (C) GNB5의 발현 수준으로 분류된 CRC 환자의 전체 생존 곡선, (D) GNB5의 유전자 집단 농축도 분석(gene set enrichment assay, GSEA)으로, 정규화된 농축도 점수(NES)와 FDR-보정 P-값이 제시된다.
도 9는 GNB5의 유전자 집단 농축도 분석 결과를 나타낸다. TCGA 및 GO 유전자 세트, 발암 유전자 세트 및 MSIGDB의 유전자 표지로부터의 GNB5 발현 데이타를 GSEA에 사용하였으며, 양성 또는 음성 NES 및 FDR-보정 P-값이 제시된다.
도 10은 cetuximab 치료가 Akt 및 ERK 신호전달에 미치는 영향을 나타낸다. (A) NCI-H508과 SW48 세포를 100 ㎍/mL의 cetuximab으로 1시간, (B) 24시간 처리한 후, 세포를 수확하여 용해시킨 후 수행한 웨스턴 블랏 분석결과를 나타내는 사진, (C) NCI-H508 및 SW48 세포에서 GNB5 발현 수준을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진, (D) cetuximab 처리 전인 0 시간의 각 세포주의 발현수준 대비 정량화 및 정규화 된 Akt 및 ERK 활성을 나타내는 그래프.
도 11은 cetuximab 민감성 세포에서 GNB5 과발현의 효과를 나타낸다. (A) GNB5 과발현 NCI-H508 세포의 세포 용해물에 대하여 항-인산화-Akt, 항-인산화-ERK, 항-GNB5 항체를 이용하여 수행한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타내는 사진으로 α-튜불린을 적재 대조군으로 사용하였다. (B) 대조군 또는 GNB5 발현을 나타내는 NCI-H508 세포의 세포 생존능 분석결과를 나타내는 그래프로, 결과는 평균±표준편차(오차 막대)로 나타내었다(n=3). (C) GNB5 과발현 및 대조군 NCI-H508 세포를 6-웰 플레이트에 2×102 cells/well의 밀도로 접종한 후, 작은 콜로니가 명확하게 형성될 때까지 세포를 14일 동안 성장시키고, 콜로니를 크리스탈 바이올렛 용액으로 1시간 동안 염색한 결과를 나타내는 사진(상단), 및 세포-결합된 염료를 1% SDS 용액으로 용출시킨 후 용출물의 흡광도를 590 nm에서 측정한 결과를 나타내는 그래프(하단).
도 12는 GSE59857에서 GNB5의 발현을 일방향 이중 시료 t-테스트를 통해 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. S는 cetuximab 민감성 세포를 나타내고(n=10), R_WT 또는 R_MT는 각각 GNB5 고발현을 나타내는(P-값 < 0.05), KRAS 야생형(n= 57) 및 돌연변이형(n=69)인 cetuximab 저항성 세포를 나타낸다.
도 13은 cetuximab 저항성에 있어서 GNB5의 네트워크 모델을 나타낸다. (A) KRAS 야생형 및 (B) KRAS 돌연변이를 이용한 네트워크 모델의 시뮬레이션 결과로, CTX는 cetuximab을 나타내고, GNB5 O/E은 GNB5의 과발현을 나타내고 GNB5 K/D는 GNB5의 넉다운을 나타낸다. 시뮬레이션 시간은 임의 단위(a.u.)로 표시되고, 생존에서 음영의 회색 영역은 민감반응과 저항반응 사이의 경계를 나타낸다. (C) 제시 된 GNB5 네트워크에 대한 cetuximab 저항을 나타낸다.
도 14는 SW620 세포에서 cetuximab 처리시 Akt 및 ERK 신호전달에 대한 GNB 넉다운의 효과를 나타낸다. (A) GNB5의 넉다운 및 cetuximab 처리 후 KRAS 돌연변이를 가진 SW620 세포에서의 Akt 및 ERK 인산화 수준을 나타내는 웨스턴 블랏 분석 결과, (B) Akt 및 ERK 신호를 정량화 및 정규화시킨 시간 역학 그래프, (C) Akt 및 ERK 활성에 대한 해당 시뮬레이션 곡선(CTX 또는 GNB5 K/D는 각각 GNB5의 cetuximab 처리 또는 넉다운 조건을 나타내고, CTX + GNB5 K/D의 초기 상태는 도 12B 중간 판넬의 GNB5 K/D의 상태에서 정상상태로 주어짐), (D) cetuximab, GNB5 넉다운 및 병용 처리 2시간 경과 후 SW620 세포에서의 시뮬레이션 결과 및 실제 실험결과 사이의 Akt 및 ERK 활성의 비교를 나타낸 그래프.
도 15는 GNB5 네트워크 모델의 매개변수 섭동 분석결과를 나타낸다. GNB5 네트워크는 0~50%의 범위에서 명목상 매개변수 값의 1,000 임의 섭동으로 시뮬레이션하였고, 생존율의 배수변화는 KRAS 야생형에서 cetuximab 처리시와 KRAS 돌연변이에서 GNB5 넉다운 및 cetuximab의 병용투여시 임계치인 0.5 이하로 나타냈고, cetuximab에 대한 민감도를 나타내는 반면 다른 경우는 0.5 이상으로 나타냈다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "EGFR(epidermal growuth factor receptor)"은 세포외 리간드인 상피성장인자 족 단백질에 대한 수용체인 막통과 단백질이다. 다수의 암에서 EGFR의 발현 또는 활성에 영향을 미치는 돌연변이들 암의 발생 및 진행을 야기할 수 있다. 이에, EGFR을 표적으로 하는 항암제가 개발되어 오고 있으며, 이러한 항암제에는 EGFR을 표적으로 하는 길항항체인 cetuximab(상표명: Erbitux®)가 대표적이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "GNB5[guanine nucleotide binding protein (G protein], beta 5)"는 이형삼량체(heterotrimer) 단백질으로, 수용체 및 효과기 단백질 사이에서 신호를 중개하는 역할을 수행하는 구아닌 뉴클레오타이드 결합 단백질(G 단백질)의 세 서브유닛(알파, 베타 및 감마 서브유닛) 중 하나인 베타 서브유닛으로서 특정 신호전달 수용체 및 효과기 뿐만 아니라, 알파 서브유닛에 대한 중요한 조절자로 알려져 있고, 다른 동형단백질(isoform)을 암호화하는 대체 스플라이싱된 전사 변이체가 존재하는 것으로 알려져 있다. GNB5는 G-단백질 신호 조절자 7(regulator of G-protein signaling 7, RGS7), 및 G-단백질 감마 서브유닛 13(G protein gamma subunit 13, GNG13)과 상호작용하는 것으로 알려져 있으며, 일부 암세포에서 과발현되는 것으로 알려져 있으나, 마커로서의 용도 외에는 이들 암에서의 역할에 대하여는 자세히 알려진 바 없다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항체의 기능성 단편"은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 이형4량체로서의 전장 항체가 아닌 항원 결합부위가 보존된 항체의 단편을 의미하며, 이러한 항체의 기능성 단편에는 기능성 단편은 항체로부터 유래한 Fab, F(ab')2 , Fab', scFv(single chain fragment variable), 또는 단일-도메인 항체(single-domain antibody, sdAb)가 포함된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Fab"는 항원-결합 항체단편(fragment antigen-binding)으로서 항체 분자를 단백질 분해효소인 파파인으로 절단하여 생성되는 단편으로 VH-CH1 및 VL-CL의 두 펩타이드의 이량체로, 파파인에 의해 생성된 다른 단편은 Fc(fragment crystalisable)라 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "F(ab')2"는 항체를 단백질 분해효소인 펩신으로 절단하여 생성되는 단편 중 항원결합 부위를 포함하는 단편으로 상기 Fab 두 개가 이황화결합으로 연결된 4량체의 형태를 나타낸다. 펩신에 의해 생성된 다른 단편은 pFc'으로 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Fab'"는 상기 Fab와 유사한 구소를 갖는 항체단편으로서 상기 F(ab')2를 환원시켜 생성되며, Fab에 비해 중쇄 부분의 길이가 약간 더 길다.
본 문서에서 사용되는 용어 "scFv"는 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable)로서 항체의 Fab 중 가변영역(VH 및 VL)을 링커를 이용하여 단일쇄로 제조한 재조합 항체 단편을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "sdAb(single doamain antibody)"는 나노바디(nanobody)라고 지칭되며, 항체의 단일 가변영역 단편으로 구성된 항체 단편이다. 주로 중쇄로부터 유래한 sdAb가 사용되나, 경쇄로부터 유래한 단일 가변영역 단편 역시 항원에 대하여 특이적 결합이 되는 것으로 보고되고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항체 유사체(antibody mimetic)"는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄가 이종사합체의 4차구조를 형성하여 기능을 발휘하는 통상의 전장 항체와 달리, 경쇄가 없이 중쇄만으로 구성되는 낙타과 또는 연골어류 유래의 항체 단편(VHH, VNAR 등) 또는 nanobody, monobody, 가변 림프구 수용체(VLR) 등 비항체 유래의 단백질 스캐폴드로부터 제조되는 항체 유사단백질을 포함하는 개념이다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, GNB5에 특이적인 저해제 및 EGFR 저해제를 유효성분으로 포함하는 EGFR 저해제에 대한 저항성 암의 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 GNB5에 특이적인 저해제는 GNB5 활성 억제제 또는 GNB5 발현 억제제일 수 있고, 상기 GNB5 활성 억제제는 GNB5 길항 항체 또는 그의 기능성 단편, GNB5에 특이적으로 결합하는 항체 유사체, 갈레인(gallein) 또는 GRK2i일 수 있고, 상기 GNB5 발현 억제제는 GNB5 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로 RNA일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 EGFR 저해제에 대한 저항성 암은 KRAS 유전자에 돌연변이가 일어나거나 일어나지 않은 암일 수 있고, 상기 돌연변이는 KRAS 유전자의 엑손 2에서 발생한 것일 수 있으며, 상기 엑손 2에서 발생한 돌연변이는 12번째 및/또는 13번째 아미노산인 글리신이 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 EGFR 저해제는 EGFR 저해 화합물 또는 EGFR 길항항체일 수 있고, 상기 EGFR 저해 화합물은 gefitinib, erlotinib, lapatinib, vadetanib, neratinib, 또는 osimertinib일 수 있으며, 상기 EGFR 길항 항체는 cetuximab, pantiumumab, 또는 necitumumab일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 EGFR 저해제에 대한 저항성 암은 대장암, 폐암, 췌장암 또는 두경부암일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있는데, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주사, 비강내 흡입, 근육내 투여, 복강내 투여, 경막내 투여, 척수내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 골내 투여, 경막외 투여, 흉곽내 투여, 괄절강내 투여, 뇌실내 투여, 경피 투여 등 다양한 경로를 통해 투여하는 것이 가능하다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 피검 화합물 또는 천연물을 GNB5와 반응시키는 단계; 및 GNB5와 특이적으로 결합하는 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는, EGFR 저해제에 대한 저항성 암 치료제 후보물질의 선별방법이 제공된다.
상기 선별방법에 있어서, 상기 피검 화합물 또는 천연물과 GNB5의 특이적인 결합 여부는 방사성 동위원소 표지 세포 이용 소화합물-친화성 크로마토그래피, 약물 친화 반응 표적 안정성 분석(drug affinity responsive target stability, DARTS), 산화율 이용 단백질 안정성 분석(stability of proteins from rate of oxidation, SPROX), 차등 정적 광산란(differential static light scattering DSLS) 분석, 차등 스캐닝 형광측정(differential scanning fluorometry, DSF), 또는 리간드의 차등 방사 모세관 거동 분석(differential radial capillary action of ligand assay, DraCALA)를 이용하여 수행될 수 있다.
상기 선별방법은 선별된 피검 화합물 또는 천연물을 EGFR 저해제 저항성 암세포에 EGFR 저해제와 함께 처리하여 EGFR 저해제 저항성이 감소되는지 여부를 관찰하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, GNB5를 발현하는 세포에 피검 화합물 또는 천연물을 처리하는 단계; 및 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 GNB5의 발현을 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 EGFR 저해제에 대한 저항성 암 치료제 후보물질의 선별방법이 제공된다.
상기 선별방법에 있어서, 상기 GNB5의 발현은 GNB5의 단백질 수준 또는 GNB5를 암호화하는 mRNA의 발현수준을 측정함으로 수행될 수 있고, 상기 GNB5의 단백질 수준은 웨스턴 블랏 분석, HPLC, LC/MS, 단백질 면역침강법, ELISA, RIA, 또는 질량분석을 통해 측정될 수 있으며, 상기 GNB5를 암호화하는 mRNA의 발현수준은 노던 블랏 분석, 정량 PCR, 또는 마이크로어레이 분석을 통해 수행될 수 있다.
상기 선별방법은 선별된 피검 화합물 또는 천연물을 EGFR 저해제 저항성 암세포에 EGFR 저해제와 함께 처리하여 EGFR 저해제 저항성이 감소되는지 여부를 관찰하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, GNB5 및 상기 GNB5와 상호작용하는 짝단백질을 포함하는 조성물에 피검 화합물 또는 천연물을 처리하는 단계; 및 아무 것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 GNB5 및 상기 짝단백질의 상호작용을 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 EGFR 저해제에 대한 저항성 암 치료제 후보물질의 선별방법이 제공된다.
상기 선별방법에 있어서, 상기 짝단백질은 GNG13(guanine nucleotide binding protein (G protein), gamma 13), RGS11(regulator of G-protein signaling 11), GNG2(guanine nucleotide binding protein (G protein), gamma 2), PDCL(phosducin-like), RGS6(regulator of G-protein signaling 6), RGS7(regulator of G-protein signaling 7), RGS7BP(regulator of G-protein signaling 7 binding protein), DRD2(dopamine receptor D2), COPS5(COP9 signalosome subunit 5), CCT3(chaperonin containing TCP1, subunit 3), RGS9(regulator of G-protein signaling 9), GNG5(guanine nucleotide binding protein (G protein), gamma 5), CDKN1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A), MTOR(mechanistic target of rapamycin), CCT2(chaperonin containing TCP1, subunit 2), PRPF40B(PRP40 pre-mRNA processing factor 40 homolog B), CUL4A(cullin 4A), PFDN5(prefoldin subunit 5), TCP1(t-complex 1), GIT11(heterotrimeric G protein gamma subunit Git11), CCT6B(chaperonin containing TCP1, subunit 6B), USP38(ubiquitin specific peptidase 38), RPA1(replication protein A1), ANXA7(annexin A7), E2F2(E2F transcription factor 2), PSMD4(proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 4), APP(amyloid beta (A4) precursor protein), MVD(mevalonate (diphospho) decarboxylase), CCT5(chaperonin containing TCP1, subunit 5 ), GNG4(guanine nucleotide binding protein(G protein), gamma 4), MCM2(minichromosome maintenance complex component 2), BNIP3L(BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like), CSNK2B(casein kinase 2, beta polypeptide), ELAVL1(ELAV like RNA binding protein 1), TSC22D1(TSC22 domain family, member 1), 또는 CCT7(chaperonin containing TCP1, subunit 7)일 수 있고, 상기 GNB5 및 상기 짝단백질의 상호작용은 효모 이중 하이브리드(yeast two hybrid) 분석, 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 분석, 친화성 포획(affinity capture), 단백질 단편 상보 분석(protein-fragment complementation assay, PCA), 면역공침(immunocoprecipitation, IP) 분석 또는 표면 플라스몬 공명 분석(surface plasmon resonance assay)을 통해 분석될 수 있다.
상기 선별방법은 선별된 피검 화합물 또는 천연물을 EGFR 저해제 저항성 암세포에 EGFR 저해제와 함께 처리하여 EGFR 저해제 저항성이 감소되는지 여부를 관찰하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, GNB5 저해제 및 EGFR 저해제를 EGFR 저해제에 대한 저항성 암환자에게 투여하는 단계를 포함하는, EGFR 저해제 저항성 암환자의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 암환자로부터 암세포를 분리하는 단계; 상기 암세포에 EGFR 저해제를 처리하는 단계; 상기 암세포가 상기 EGFR 저해제에 대하여 저항성지 여부를 판정하는 단계; 및 상기 암세포가 EGFR 저해제에 대한 저항성이 있는 것으로 판정되면, 상기 암환자에 대하여 GNB5 저해제 및 상기 EGFR 저해제를 병용투여하는 단계를 포함하는 EGFR 저해제에 대한 저항성 암환자의 치료방법이 제공된다.
본 발명자들은 유전자 발현 데이터 분석과 세포주 실험을 통해 cetuximab 내성 CRC에 대한 5 가지 잠재적 표적 유전자(DUSP4, ETV5, GNB5, NT5E, PHLDA1)를 확인하였다. KRAS 야생형 세포에서 이들 5 가지 유전자를 넉다운시킬 경우 cetuximab 감수성이 증가되었다. 아울러, GNB5를 넉다운시킬 경우 KRAS 돌연변이 세포에서 cetuximab 감수성을 증가시킴을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 암 진행에서 GNB5의 역할을 추가로 조사하여 GNB5가 Akt 신호 전달 경로를 지배적으로 조절함으로써 cetuximab 내성에 기여한다는 것을 규명하였다. 본 발명자들의 상기 연구결과는 GNB5가 KRAS 돌연변이와 관계 없이 cetuximab 내성 암에 있어서 cetuximab과 병용 치료의 유망한 표적이될 수 있음을 시사하는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
일반적 방법
유전자 발현 데이터 수집 및 분석:
Cetuximab 단독요법(GSE5851)을 시행한 CRC 환자의 유전자 발현 데이터는 Gene Expression Omnibus(GEO, //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)에서 입수하였다. cetuximab에 민감한 환자와 내성 환자 사이의 차등발현 유전자(differentially expressed gene, DEG)는 Benjamini-Hochberg step-down FDR 알고리즘을 사용하여 확인되었다. 상기 알고리즘은 여러 테스트의 효과를 반영하도록 P 값을 조정한다. 차별적으로 발현된 유전자의 히트 맵은 평균 발현 수준에 대한 각 유전자의 배수 변화에 의해 생성되었다. cetuximab 치료(GSE59857)를 이용한 인간 CRC 세포주의 유전자 발현 데이터도 GEO로부터 수득하였다. CRC 및 정상 인접 점막의 유전자 발현 데이터 쌍을 TCGA로부터 수득하여 Wilcoxon rank sum test로 비교하였다.
유전자 집단 농축도 분석:
유전자 집단 농축도 분석(gene set enrichment assay, GSEA) 분석을 위한 입력 데이터 세트는 다음과 같이 준비되었다: (1) CRC 환자의 RNA-seq 데이터는 TCGA로부터 수득하였다. (2) 표현형 표지는 GNB5 표현의 중간 값을 기준으로 결정된다. (3) 유전자 온톨로지(GO) 유전자 세트, 발암 유전자 세트 및 각인 유전자 세트는 MSigDB(//www.broadinstitute.org/gsea/msigdb)에서 다운로드 받았다. 다른 매개 변수는 기본값으로 설정되었다. GSEA 분석은 3,000 개의 순열을 가진 javaGSEA Desktop Application을 사용하여 수행되었다.
임상 데이터 분석:
CRC 환자의 전체 생존율은 TCGA로부터 수득하였다. 전체 생존의 Kaplan-Meier 플롯을 R에서 Survival package를 사용하여 로그 순위 조사에 의해 생성하고 비교하였다. GNB5의 발현 수준은 중간 값을 기준으로 높거나 낮게 이분화시켰다.
수학적 모델링:
네트워크 모델의 상미분 방정식(ODEs)은 다음과 같이 Michaelis-Menten 동력학에 기반하여 주로 구성되었다:
Figure PCTKR2017014207-appb-I000001
(상기 수학식에서, <분자> a 또는 <분자> i는 각각 <분자>의 활성 또는 비활성 형태의 농도를 나타내고. 분자의 두 가지 형태의 총 농도는 <molecule> tot으로 설정되었다).
cetuximab에 의한 EGFR의 저해는 경쟁적 억제 동력학에 의해 모델링되었다. 생존 변수는 ERKa와 AKTa의 선형 조합으로 계산되어 임의의 단위를 갖는 양을 산출한다. 상기 모델의 KRAS 돌연변이는 KRAS의 감소된 분해에 의해 사용되었다. 상기 네트워크 모델은 실제 생화학 반응의 양을 엄밀하게 재현하지 않고 질적인 방식으로 메커니즘을 설명하기 위해 구성되었음을 양지할 필요가 있다. 동력학적 매개변수와 농도의 명목상 또는 조건화된 값은 단순히 신호분자 사이의 인과관계를 나타내기 위해 결정되었다. 분석에 사용된 모든 매개변수는 하기 표 1 및 2에 기재된 바와 같다.
세포 배양:
NCI-H508, HCT116 및 HEK293T 세포를 10% 우태아 혈청(FBS) 및 항생제(100 units/ml 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 펀지존 0.25 ㎍/㎖, Life Technologies Corp., USA)가 첨가된 배양배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM, Welgene Inc., 대한민국)에 넣고 37℃에서 5% CO2를 함유하는 가습 분위기에서 배양하였다. SW48 세포는 10% 우태아 혈청(FBS) 및 항생제(100 units/ml 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 펀지존 0.25 ㎍/㎖, Life Technologies Corp., USA)가 첨가된 배양배지(Leibovitz's L15 Medium, Welgene Inc., 대한민국)에 넣고 5% CO2가 포함된 가습 분위기에서 37℃의 온도로 배양하였다.
시약:
Cetuximab은 Merck Sereno(Erbitux, Darmstadt, Germany)에서 구입하였고, 디메틸 설폭사이드(DMSO)와 프로피디움 요오드(PI)는 Sigma-Aldrich(Saint Louis, MO)에서 구입하였다. Erlotinib는 Cell Signaling(Danvers, MA)에서 구입하였다.
GSE5851으로부터 cetuximab 민감성 및 저항성 환자 사이의 차등 발현 유전자
ID_REF Gene Symbol Entrez ID P-value Expression
203939_at NT5E 4907 2.585E-04 UP
217999_s_at PHLDA1 22822 5.441E-04 UP
203349_s_at ETV5 2119 5.469E-04 UP
208130_s_at TBXAS1 6916 6.070E-04 UP
204014_at DUSP4 1846 6.082E-04 UP
206503_x_at PML 5371 6.199E-04 UP
202298_at NDUFA1 4694 6.531E-04 UP
219297_at WDR44 54521 6.906E-04 UP
209029_at COPS7A 50813 7.025E-04 UP
211871_x_at GNB5 10681 9.110E-04 UP
217645_at COX16 51241 9.405E-04 UP
205767_at EREG 2069 5.620E-07 UP
205239_at AREG 374 6.722E-07 DOWN
212349_at POFUT1 23509 4.923E-05 DOWN
220818_s_at TRPC4 7223 6.296E-05 DOWN
200884_at CKB 1152 1.586E-04 DOWN
220642_x_at GPR89A 51463 1.598E-04 DOWN
219615_s_at KCNK5 8645 1.729E-04 DOWN
207653_at FOXD2 2306 1.871E-04 DOWN
221027_s_at PLA2G12A 81579 2.004E-04 DOWN
211801_x_at MFN1 55669 2.791E-04 DOWN
205112_at PLCE1 51196 3.278E-04 DOWN
204379_s_at FGFR3 2261 3.578E-04 DOWN
203560_at GGH 8836 3.853E-04 DOWN
204087_s_at SLC5A6 8884 4.012E-04 DOWN
209790_s_at CASP6 839 4.239E-04 DOWN
203434_s_at MME 4311 4.465E-04 DOWN
203858_s_at COX10 1352 4.533E-04 DOWN
202925_s_at PLAGL2 5326 5.097E-04 DOWN
220166_at CNNM1 26507 6.830E-04 DOWN
203123_s_at SLC11A2 4891 7.151E-04 DOWN
206432_at HAS2 3037 7.507E-04 DOWN
203673_at TG 7038 8.322E-04 DOWN
207127_s_at HNRNPH3 3189 8.373E-04 DOWN
204936_at MAP4K2 5871 8.582E-04 DOWN
220161_s_at EPB41L4B 54566 8.952E-04 DOWN
206552_s_at TAC1 6863 9.008E-04 DOWN
218618_s_at FNDC3B 64778 9.339E-04 DOWN
213499_at CLCN2 1181 9.544E-04 DOWN
203943_at KIF3B 9371 1.027E-03 DOWN
207705_s_at NINL 22981 1.040E-03 DOWN
216760_at HRASLS2 54979 1.074E-03 DOWN
ODE 시뮬레이션에서의 동역학적 매개변수 및 농도의 명목값
번호 이름 설명 값
동역학적 매개변수
1 k1 EGF에 의한 EGFR의 활성화 1
2 Km1 EGF에 의한 EGFR의 활성화 0.5
3 Ki1 Cetuximab에 의한 EGFR의 저해 0.1
4 kd1 EGFR의 기본 분해 0.5
5 k2a EGFR에 의한 KRAS의 활성화 5
6 k2b GNB5에 의한 KRAS의 활성화 2
7 Km2 EGFR 및 GNB5에 의한 KRAS의 활성화 10
8 kd2 KRAS의 기본 분해 5
9 k3 KRAS에 의한 MEK의 활성화 2
10 Km3 EGFR 및 KRAS에 의한 MEK의 활성화 1
11 kd3 MEK의 기본 분해 0.5
12 k4 MEK에 의한 ERK의 활성화 1
13 Km4 MEK에 의한 ERK의 활성화 1
14 kd4 ERK의 기본 분해 0.5
15 k5a KRAS에 의한 PI3K의 활성화 5
16 k5b GNB5에 의한 PI3K의 활성화 2
17 k5c ERK에 의한 PI3K의 저해 10
18 Km5 KRAS 및 GNB5에 의한 PI3K의 활성화 10
19 Ki5 ERK에 의한 PI3K의 저해 10
20 kd5 PI3K의 기본 분해 0.5
21 k6 PI3K에 의한 AKT의 활성화 1
22 Km6 PI3K에 의한 AKT의 활성화 5
23 kd6 AKT의 기본 분해 0.5
24 wERK 생존 변수에 대한 선형 조합 가중치 0.5
25 wAKT 생존 변수에 대한 선형 조합 가중치 0.5
농도
1 EGFRtot EGFR의 총농도 1
2 KRAStot KRAS의 총농도 1
3 MEKtot MEK의 총농도 1
4 ERKtot ERK의 총농도 1
5 PI3Ktot PI3K의 총농도 1
6 AKTtot AKT의 총농도 1
7 EGF 대조 조건에서의 EGF의 농도 1
8 Cetuximab 대조조건에서의 cetuximab의 농도 0
9 GNB5 대조조건에서의 GNB5 0.5
총 RNA 추출, RT- PCR 및 qRT - PCR :
제조사의 표준 프로토콜에 따라 PureLink® RNA Mini Kit(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)를 사용하여 세포에서 총 RNA를 추출하고 RNA 분해 효소가 없는 DNase I(Thermo Fisher Scientific Inc.)를 처리하여 오염된 게놈 DNA를 제거하였다. 그런 다음 DiaStar RT kit(Solgent, Daejeon, Republic)를 사용하여 역전사(Reverse Transcription, RT) 반응을 수행하여 총 RNA로부터 cDNA를 합성 하였다. RT-PCR 분석은 PCR 시스템(Veriti 96well Thermal Cycler, Applied Biosystems, Waltham, MA)을 사용하여 하기 표 3에 기재된 인간 유전자에 대한 프라이머를 사용하여 수행하였다. 정량적 RT-PCR 분석은 상응하는 프라이머를 이용하여 QuantStudio 5 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였다.
PCR에 사용된 프라이머
유전자 포워드 프라이머(서열번호) 리버스 프라이머(서열번호)
COPS7A 5'-TGATGAGTGCGGAAGTGAAG-3' (1) 5'-TTCCGGGCTTCAGCTAAGTA-3' (2)
DUSP4 5'-TCACGGCTCTGTTGAATGTC-3' (3) 5'-TCACGGCTCTGTTGAATGTC-3' (4)
ETV5 5'-GACACAGATCTGGCTCACGA-3' (5) 5'-GGCATGAAGCACCAGGTTAT-3' (6)
GNB5 5'-GGGAACAAAGTCCTGTGCAT-3' (7) 5'-TATCCAAACCACCACAAGCA-3' (8)
NT5E 5'-GGCTGCTGTATTGCCCTTTG-3' (9) 5'-ATACACCACATGGATTCCGCC-3' (10)
PHLDA1 5'-GGTCAAGCTCAAGGAACTGC-3' (11) 5'-GATGGCCTGACGATTCTTGT-3' (12)
PML 5'-ACACAACGTGAGCTTCATGG-3' (13) 5'-ACACAACGTGAGCTTCATGG-3' (14)
TBXAS1 5'-ATTGCAGAGACGCTGAGGAT-3' (15) 5'-CACGTGGAGCAGTGTCAACT-3' (16)
WDR44 5'-TCTCTCCTAACCGCAAGCAT-3' (17) 5'-TGCTACAGTCTGCCCATCAG-3' (18)
β-Actin 5'-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3' (19) 5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3' (20)
GAPDH 5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTT-3' (21) 5'-CCATGGTGTCTGAGCGATGT-3' (22)
플라스미드 구축 및 바이러스 생산:
렌티바이러스 입자를 생성하기 위해 HEK 293T 세포를 Lipofectamine (Invitrogene, Carlsbad, CA)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 관련 렌티바이러스 플라스미드 및 패키징 혼합물(pLP1, pLP2 및 pLP/VSVG)와 함께 형질감염시켰다. 과발현 실험을 위해, 인간 뇌 cDNA 라이브러리(Clontech)로부터 전장 인간 GNB5를 PCR 증폭시켜, pLentiM1.4 렌티 바이러스 벡터에 결찰시키고, 시퀀싱으로 확인하였다. 녹다운 실험을 위해, DUSP4, ETV5, NT5E, GNB5 및 PHLDA1(Sigma-Aldrich, USA)에 대한 shRNAs를 포함 pLKO.1 lentiviral 기반 플라스미드를 사용하였다.
세포사멸 분석:
세포사멸을 분석하기 위해 PI 기반 분석을 수행하였다. IncuCyte ZOOM(Essen Biosciences, Ann Arbor, MI, USA)을 사용하여 세포사멸 정도를 제조자의 지시에 따라 검출하였다. 일시적으로 넉다운 또는 과발현된 세포를 96-웰 플레이트에 파종하고 24 시간 동안 배양하였다(1×104 cells/well). 그런다음 세포를 표시된 농도의 cetuximab(Merck Sereno, USA)로 72시간 동안 처리하였다. 파종 후, IncuCyte ZOOM을 사용하여 세포를 영상화하였다. 세포사멸을 평가하기 위해, IncuCyte ZOOM 분석 소프트웨어를 사용하여 각 시점에서 PI-표지된 세포의 평균 면적을 측정하였다. 이미지는 20× 대물렌즈로 웰당 3 개의 분리된 영역으로부터 3 시간 간격으로 수득하였다.
콜로니 형성 검정:
NCI-H508 세포(200 세포)를 6-웰 플레이트에 파종하고(n=3) 37℃에서 14일 동안 배양 하였다. 세포를 3.7% PFA로 15분간 고정하고, 0.5% crystal violet 용액으로 1시간 동안 염색하고, 증류수로 헹군다음, 공기 건조시켰다. 세포에 결합된 크리스탈 바이올렛을 1% SDS로 용해시키고 UV-VIS 분광 광도계(xMarkTM microplate spectrophotometer, Bio-Rad, USA)를 사용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하였다.
웨스턴 블랏 분석:
웨스턴 블랏팅은 종래에 기술된 대로 수행하였다. 간단히, 세포를 용해 완충액(20 mM HEPES, pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 10 % 글리세롤, 1 ㎍/ml apronitin, 1 ㎍ leupeptin, 1 mM Na3VO4, 1mM NaF)에서 용해시켰다. 단백질 밴드는 ImageJ(NIH, Bethesda, MD, USA)을 이용하여 정량화하였다.
면역 블랏팅을 위한 항체로는 항-Akt 항체(Cell Signaling Technology, Inc., USA), 항-DUSP4 항체(Cell Signaling Technology, Inc., USA), 항-ERK1/2 항체(Cell Signaling Technology, Inc., USA), 항-ETV5 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA), 항-β-actin 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA), 항-α-actinin 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA), 항-α-튜불린 항체(Merck, Billerica, USA)를 사용하였다. 포스포-Akt 및 포스포-ERK1/2에 대한 항체는 Cell Signaling Technology 사에서 구입했다. 토끼 다클론 항-GAPDH 항체는 권기선(한국생명공학연구원) 박사로부터 기증을 받았다.
GNB5의 기능 또는 발현을 저해할 수 있는 화합물 또는 천연물의 탐색:
GNB5는 세포내 단백질로서 이미 다양한 파트너 단백질 또는 짝단백질과 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 특정 화합물 또는 천연물이 GNB5 단백질과 졀합할 경우, 이들 짝단백질과의 상호작용을 방해함으로써 GNB5의 활성을 억제할 수 있다. 이에, GNB5 단백질과 피검 화합물 또는 천연물의 결합여부를 측정함으로써 GNB5 활성을 억제함으로써 EGFR 저해제에 대한 저항성 암의 치료제 후보물질을 스크리닝할 수 있다.
GNB5 활성 억제제의 스크리닝에는 다양한 단백질과 화합물의 결합 분석 방법이 사용될 수 있는데, 이러한 방법으로는 방사성 동위원소 표지 세포 이용 소화합물-친화성 크로마토그래피, 약물 친화 반응 표적 안정성 분석(drug affinity responsive target stability, DARTS), 산화율 이용 단백질 안정성 분석(stability of proteins from rate of oxidation, SPROX), 차등 정적 광산란(differential static light scattering DSLS) 분석, 차등 스캐닝 형광측정(differential scanning fluorometry, DSF), 및 리간드의 차등 방사 모세관 거동 분석(differential radial capillary action of ligand assay, DraCALA) 등이 사용될 수 있는데, 이러한 분석방법은 McFedries 등에 의해 상세히 소개되고 있다(McFedries et al., Chem . Biol., 20: 667-673, 2013). 상기 문헌은 본 문서에 참조로 삽입된다.
아울러, GNB5의 활성 억제제의 스크리닝에는 GNB5 및 상기 GNB5와 상호작용하는 것으로 알려진 짝단백질이 포함된 반응액에 피검 화합물 또는 천연물을 처리한 후 상기 GNB5 및 짝단백질의 상호작용을 억제하는 피검 화합물 또는 천연물을 선별함으로써 수행될 수 있다. 이러한 단백질 사이의 상호작용을 분석하는 방법으로는 효모 two hybrid 분석, 면역공침분석, 표면 플라스몬 공명 분석(surface plasmon resonance assay), 연속 친화성 정제-질량분석(TAP-MS), 형광 공명 에너지 전이(FRET) 분석, 단백질-단편 상보 분석(protein-fragment complementation assay), 파지 디스플레이(phage display), 친화성 포획(affinity capture), 재구성 복합체(reconstituted complex) 분석 등이 사용될 수 있으며, 이러한 방법들 역시 문헌을 통해 잘 알려져 있다(Rao et al., Int . J. Proteom. 147648, 2014; Phizicky and Fields, Microbiol. Rev. 59(1): 94-123, 1995). 상기 문헌들 역시 본 문서에 참조로 삽입된다.
한편, GNB5 발현을 억제하는 GNB5 발현 억제제는 GNB5를 암호화하는 핵산분자의 핵산서열에 기반하여 고안될 수 있다. 이러한 GNB5 발현 억제제는 GNB5를 암호화하는 핵산분자 또는 그에 상보적인 핵산분자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드 분자 또는 GNB5를 암호화하는 핵산분자를 표적으로 하는 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 마이크로 RNA(miRNA)와 같은 RNA 간섭(RNA interference) 현상을 유도하는 핵산분자일 수 있다.
실시예 1: cetuximab 내성을 극복할 수 있는 후보 표적의 선택
cetuximab 내성을 극복 할 수 있는 잠재적 표적을 확인하기 위해 본 발명자들은 우선 80명의 mCRC 환자에 대해 cetuximab 단독 요법에 대한 반응을 주석 처리 한 Khambata-Ford 데이터 세트(GSE5851)의 유전자 발현 데이터를 분석했다(내성: n=42, 민감성: n=26, 중간: n=12). 본 발명자들은 내성과 민감성 환자 사이의 13,162 개의 유전자에서 차별적으로 발현된 42개의 유전자(FDR 보정을 수반하여 P 값 < 0.05인)를 발견하였다(도 1A 및 표 1). 상기 유전자들은 저항성 환자에서 11 개의 상향 조절된 유전자와 31개의 하향 조절된 유전자로 구성된다. 본 발명자들은 후속 분석을 통해 상향 조절된 유전자에 초점을 맞추어 cetuximab 치료와 함께 상승 작용을 일으킬 수 있는 표적 유전자 억제를 확인하였다. 이를 위해 본 발명자들은 추가적으로 155개의 세포주(내성: n=131, 민감성: n=10, 중간: n=14)에서 cetuximab에 대한 반응성을 주석 처리한 유전자 발현 데이터(GSE59857)를 분석하였다. 저항성 환자에서 12개의 상향 조절된 유전자 중 8개의 유전자가 내성 세포주에서 지속적으로 상향 조절된 발현을 나타냈(도 1B). 상기 결과를 검증하기 위해 cetuximab-반응성 세포주(NCI-H508) 및 cetuximab 내성 세포주(HCT116, HT29 및 SW48)에서 8개의 상향 조절된 유전자에 대한 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)을 수행하였다 (도 1C). 그 결과 도 1C에서 나타난 바와 같이, cetuximab 저항성 세포주에서 DUSP4(dual specificity phosphatase 4), ETV5(ETS translocation variant 5), NT5E(5'-nucleotidase), GNB5(guanine nucleotide-binding protein subunit beta-5) 및 PHLDA1(Pleckstrin homology-like domain family A member 1)의 5 가지 유전자의 발현이 유의하게 증가함을 확인하였다.
실시예 2: 잠재적인 표적 유전자의 억제와 cetuximab 반응성 회복과의 상관관계
상기 5가지 잠재 표적 유전자인 DUSP4, ETV5, GNB5, NT5E, 및 PHLDA1은 일부 이전 연구에서 cetuximab의 반응성과 관련이 있다고 제안되었지만(Khambata-Ford et al., J. Clin . Oncol. 2007; 25(22): 3230-3237, 2007; Cushman et al., Clin . Cancer Res. 21(5): 1078-1086, 2015; Oliveras-Ferraros et al., J. Cell Biochem. 112(1): 10-29, 2011; Balko et al., BMC Cancer. 9: 145, 2009), 암세포가 실제로 어떻게 반응하는지에 대한 실험적 연구는 없었다. 이에 본 발명자들은 상기 잠재적 표적 유전자가 CRC에서 cetuximab 반응성을 유도할 수 있는 효과적인 조합 표적인지 여부를 조사하기 위해 상기 유전자들에 대항하여 shRNA를 발현시킴으로써 RNA 간섭을 유도하여 상기 다섯 가지 유전자의 넉다움에 의한 효과를 조사하였다(도 2 및 도 5). 그 결과는 KRAS의 돌연변이 여부에 따라서 이들 각각의 넉다운에 의한 세포반응은 상이하였다. 도 2에서 나타난 바와 같이, KRAS 야생형인 cetuximab 저항 세포주인 SW48에서 상기 다섯 가지 잠재적 표적 유전자에 대한 넉다운 모두 cetuximab 반응성을 증가시켰다. 상기 다섯 가지 잠재적 표적 유전자의 넉다운 모두 대조군에 비해 증가된 세포사멸을 나타냈다. 본 발명자들은 또한 다섯 가지 표적 유전자 중 어느 하나의 넉다운시 잘 알려진 또 다른 EGFR 억제제인 erlotinib(도 3)에 대한 감수성을 증가시킨다는 것을 발견하였다.
흥미롭게도, KRAS 돌연변이 세포주인 cetuximab 내성 세포주인 HCT116의 경우, GNB5의 넉다운이 cetuximab에 대한 감수성을 증가시킴을 확인하였다(도 4C 및 도 5). 반면에 HCT116 세포에서 DUSP4, ETV5, NT5E 또는 PHLDA1 넉다운은 대조군인 스크램블 shRNA 처리군과 cetuximab 반응성의 차이가 없었다(도 3A, 3B, 3D 및 3E). 높은 GNB5 발현을 보이는 다른 KRAS 돌연변이 SW620 세포주에서 cetuximab 치료와 GNB5 넉다운의 병용효과가 확인되었다(도 6). HCT116 세포에서 GNB5 넉다운의 경우, erlotinib에 대한 약물 감수성도 증가하는 것으로 확인되었다(도 7C). HCT116 세포에서 DUSP4, ETV5, NT5E 또는 PHLDA1 넉다운의 경우에는 erlotinib 감수성에 차이가 없었다(도 7A, 7B, 7D 및 7E). 이러한 결과는 GNB5를 표적으로 삼는 것이 KRAS 돌연변이 여부와 무관하게 다른 EGFR 억제제뿐만 아니라 cetuximab에 대한 내성을 극복하는 새로운 방법이 될 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 3: 암 진행에서 GNB5의 역할
본 발명자들은 CRC에서 GNB5의 역할을 규명하기 위해 데이터베이스에서 GNB5의 특성을 조사하였다. 바이오마커는 종종 암세포에서 과발현되거나 변이되기 때문에 cBioPortal(//cbioportal.org)에서 CRC의 유전적 변이를 확인하였다(Cerami et al., Cancer Discov . 2(5): 401-404, 2012). 그 결과, 도 8A에 도시된 바와 같이, CRC에서 GNB5 유전자의 증폭, 돌연변이 또는 결실은 거의 없었다. 이에 본 발명자들은 GNB5가 TCGA(Cancer Genome Atlas)의 RNA-seq 데이터를 사용하여 CRC에서 높게 발현되는지 여부를 조사하였다(Giannakis et al., Cell reports. 15(4): 857-865, 2016). 그러나, 50개의 대장암 종양 및 인접한 정상 점막을 조사하였음에도 불구하고, GNB5의 발현 양상에는 차이가 없었다(도 8B).
GNB5 발현과 임상 결과 간의 연관성을 분석하기 위해 TCGA에서 282명의 CRC 환자의 전체 생존율을 분석했다. 흥미롭게도, 높은 GNB5 발현은 CRC 환자의 생존율을 감소시키는 것으로 확인되었다(도 8C). 전체 생존의 Kaplan-Meier 생존 곡선은 GNB5의 과발현이 CRC 환자의 예후 불량과 유의한 상관관계가 있음을 보여 주었다. GNB5에 의해 조절되는 신호전달 경로를 확인하기 위해 TCGA(n=619)의 RNA-seq 데이터를 사용하여 유전자 집단 농축도 분석(GSEA)을 수행하였다. 그 결과, GNB5에 의해 상향조절된 유전자는 상피세포 증식과 강하게 연관되어 있었다(도 8D, 좌측 판넬). 상기 유전자들은 또한 저산소증과 상피-중간엽 변이(EMT)와 관련된 유전자 세트에서 상당히 농축되었다(도 9). 상기 결과는 또한 GNB5의 기능이 암의 진행과 관련 될 수 있음을 시사하는 것이다. 더욱이 본 발명자들은 GNB5가 MEK 또는 Akt에 의해 상향 조절되는 유전자와 양성의 상관관계가 있음을 확인하였다(도 8D, 가운데 및 우측 판넬).
실시예 4: cetuximab에 대한 내성을 지닌 GNB5 발현의 관계
GNB5는 생리학적으로 중요한 신호전달을 매개로하는 가장 큰 수용체 계열인 G 단백질 결합 수용체(GPCRs)의 하류에 있는 분자이다(Osmond et al., Curr . Opin . Mol . Ther. 12(3): 305-315, 2010). Gβγ 서브 유닛 중 하나인 GNB5는 GPCR로부터 다양한 하류의 효과기로 신호를 전달한다(O'Hayre et al., Curr . Opin. Cell Biol . 27: 126-135, 2014). cetuximab 내성에서 GNB5의 역할을 탐색하기 위해 본 발명자들은 MEK와 Akt의 세포 신호전달 경로가 cetuximab 내성에 관련되어 있는지를 조사하였다(도 10). 그 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이, cetuximab 처리시 cetuximab에 민감한 NCI-H508 세포에서 ERK와 Akt의 인산화를 억제했지만 cetuximab 내성 SW48 세포에서는 억제하지 못하였다. 이에 본 발명자들은 GNB5의 발현을 조작함으로써 ERK 및 Akt의 활성 수준이 cetuximab 내성에 대한 지표가 될 수 있는지 더 조사하였다. 구체적으로 본 발명자들은 NCI-H508 세포에서 GNB5 과발현에 의한 ERK와 Akt의 인산화를 분석하였다(도 11A). 그 결과 도 11A에서 나타난 바와 같이, GNB5의 과발현에 의해 Akt의 인산화는 유의하게 증가하는 반면, ERK의 인산화는 중간 정도의 수준을 나타냈다. 이러한 결과로부터 본 발명자들은 GNB5가 ERK 신호 전달보다 Akt 신호 전달에 지배적으로 작용함으로써 cetuximab 내성에 기여함을 확인할 수 있었다. 본 발명자들은 추가로 cetuximab 처리에 대한 GNB5의 역할을 조사하였다(도 11B). 그 결과 도 11B에서 나타난 바와 같이, GNB5 과발현 NCI-H508 세포에 대한 cetuximab 처리시 세포 생존성이 대조군보다 상당히 증가함을 확인하였다. 또한, 콜로니 형성 분석을 통해 GNB5 과발현 세포가 대조군 보다 콜로니 형성에서 더 능력이 있음이 확인되었다(도 11C). 이러한 결과는 GNB5가 Akt 활성을 지배적으로 조절함으로써 세포증식과 cetuximab에 대한 저항성을 증가시키는 역할을 할 수 있음을 시사한다.
실시예 5: GNB5 발현과 cetuximab 반응성 및 KRAS 돌연변이와의 관계
본 발명자들은 상기 결과를 토대로 GNB5 발현과 cetuximab 반응성 및 KRAS 돌연변이와의 관계를 조사하였다. 구체적으로, GES59757의 GNB5 발현을 일방향 이중 시료 t-테스트를 통해 분석하였다(도 12). 그 결과, 도 12에서 나타난 것과 같이, GNB5의 발현양상은 KRAS의 돌연변이 유무와 무관하게 나타났다. 따라서, GNB5 억제제는 KRAS 돌연변이와는 독립적으로 EGFR 저해제와의 병용요법에서 효과를 나타낼 수 있을 것으로 판단된다.
실시예 6: GNB5에 의한 cetuximab 내성을 밝히기 위한 수학적 모델
GNB5의 기본 메커니즘을 명료화하기 위해 상술한 바와 같이, EGFR-GNB5 신호 전달 네트워크의 수학적 모델을 구축하였다. 본 발명자들의 조절 네트워크 모델에서, 표준 RAS-MEK-ERK 및 PI3K-Akt 경로는 GNB5와 KRAS 및 PI3K의 상호 작용뿐만 아니라 ERK와 PI3K 사이의 교차조절을 포함하여 통합되었다(Won et al., J. Mol . Cell Biol . 4(3): 153-163, 2012). 네트워크 모델의 모든 규정은 상미분 방정식(ODEs)을 사용하여 수학적으로 설명하였다. ERK 및 Akt 활성의 배율변화는 대조 조건 하에서의 활성수준에 기초하여 계산되었다. 세포생존 가능성의 범위를 기술하기 위해, 생존변수는 ERK와 Akt 활동의 선형조합으로 정의되었다. 본 발명자들은 생존변수의 값에 따라 본 발명의 일 실시예에 따른 네트워크 모델의 cetuximab 반응성을 결정하였다. KRAS 야생형의 경우, 네트워크 모델의 세포생존 가능성은 cetuximab 처리에 의해 감소되었다(도 13A, 좌측 판넬). 도 9A에서 실험적으로 관찰 된 바와 같이, GNB5 과발현은 주로 Akt 활성을 증가시켰고(그림 13A, 중간 판넬), 이후 cetuximab 내성으로 이끌었다(도 13A, 우측 판넬). KRAS 돌연변이로 인해 cetuximab 내성이 발생하였다(도 13B, 좌측 판넬). GNB5의 넉다운만으로는 네트워크 모델(도 13B, 중간 판넬)의 세포생존 가능성에 큰 변화가 없었으나, cetuximab과 함께 처리를 한 경우 cetuximab에 대한 감수성을 나타냄으로써 세포 생존 가능성이 효과적으로 감소하였다(도 12B, 우측 판넬). 본 발명의 일 실시에에 따른 네트워크 모델의 동역학을 KRAS 돌연변이 SW620 세포에서 시간에 따른 Akt 및 ERK 인산화 수준 변화를 측정함으로써 확인하였는데(도 14A), 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 네트워크 모델으로부터 모사된 상응하는 반응 그래프와 정성적으로 일치하는 결과였다(도 14B 및 14C). KRAS 돌연변이 모델에 대한 시뮬레이션 결과는 일반적으로 SW620 세포에 대한 실험 결과와 유사한 경향을 나타냈다(도 12B 및 도 14D). 위 모델에 대한 강건성 테스트 수행한 결과, 모델에서 제시한 결론이 무작위 매개변수 섭동에 대하여 견고하다는 것을 알 수 있다(도 15). 종합하면, 본 발명자들은 GNB5가 도 11C에 도시된 바와 같이 Akt 신호전달을 지배함으로써 cetuximab에 대한 저항성을 부여하고, 따라서 cetuximab 저항성을 극복하기 위한 유망한 표적 분자임을 입증하였다.
본 발명에서는 GNB5에 의한 약물 저항성의 주된 메커니즘을 Akt 과활성으로 설명하였으나, 이 외에도 GNB5의 cetuximab 저항성 관련 다른 기전으로 면역학적 효과 즉, GNB5의 과발현이 항체-의존적 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)를 방해함으로써 나타난 것일 수도 있다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 암 특히 cetuxmab과 같은 EGFR 저해제에 대하여 내성을 갖는 암의 치료를 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.
서열번호 1 내지 22에 기재된 핵산서열은 GNB5 등 다양한 유전자의 발현정도를 확인하기 위한 RT-PCR을 위한 프라이머들의 핵산서열이다.

Claims (13)

  1. GNB5에 특이적인 저해제 및 EGFR 저해제를 유효성분으로 포함하는 EGFR 저해제에 대한 저항성 암의 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 GNB5에 특이적인 저해제는 GNB5 활성 억제제 또는 GNB5 발현 억제제인, 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 GNB5 활성 억제제는 GNB5 길항 항체 또는 그의 기능성 단편, GNB5에 특이적으로 결합하는 항체 유사체, 갈레인(gallein) 또는 GRK2i인, 약학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 GNB5 발현 억제제는 GNB5 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로 RNA인, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 EGFR 저해제에 대한 저항성 암은 KRAS 유전자에 돌연변이가 일어나거나 일어나지 않은 암인, 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 돌연변이는 KRAS 유전자의 엑손 2에서 발생한 것인, 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 EGFR에 대한 저항성 암은 대장암, 폐암, 췌장암 또는 두경부암인, 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 EGFR 저해제는 EGFR 저해 화합물, EGFR 길항항체 또는 그의 기능성 단편 또는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 유사체인, 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 EGFR 저해 화합물은 gefitinib, erlotinib, lapatinib, vadetanib, neratinib, 또는 osimertinib인, 약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 EGFR 길항 항체는 cetuximab, pantiumumab, 또는 necitumumab인, 약학적 조성물.
  11. 피검 화합물 또는 천연물을 GNB5와 반응시키는 단계; 및
    GNB5와 특이적으로 결합하는 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는, EGFR 저해제에 대한 저항성 암 치료제 후보물질의 선별방법
  12. GNB5를 발현하는 세포에 피검 화합물 또는 천연물을 처리하는 단계; 및
    아무 것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 GNB5의 발현을 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 EGFR 저해제에 대한 저항성 암 치료제 후보물질의 선별방법.
  13. GNB5 및 상기 GNB5와 상호작용하는 짝단백질을 포함하는 조성물에 피검 화합물 또는 천연물을 처리하는 단계; 및
    아무 것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 GNB5 및 상기 짝단백질의 상호작용을 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 EGFR 저해제에 대한 저항성 암 치료제 후보물질의 선별방법.
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