KR20030051871A - 항암제에 대한 종양 세포의 감수성을 검정하는 방법 - Google Patents

항암제에 대한 종양 세포의 감수성을 검정하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 항암제(E7070 및 관련 화합물)를 투여한 암 환자로부터 추출된 종양 세포를 채취하고, 표 3 및 표 4에 기재된 유전자의 발현량을 측정하거나 암 환자로부터 추출된 종양 세포에 항암제를 작용시켜 표 3 및 표 4에 기재된 유전자의 발현량을 측정하여 표 3에 기재된 유전자의 발현량이 증가하거나 표 4에 기재된 유전자의 발현량이 감소하는 경우에, 당해 종양 세포가 당해 항암제에 대해 감수성이라고 판정함으로써, 당해 종양 세포의 당해 항암제에 대한 감수성을 검정하는 방법에 관한 것이다.

Description

항암제에 대한 종양 세포의 감수성을 검정하는 방법{Method of testing anticancer agent-sensitivity of tumor cells}
종래의 항암제의 임상 시험에서는, 우선, 제1 단계 임상 시험에서 독성의 프로파일과 최대 추천 용량이 결정되며, 이어서 제2 단계 임상 시험에서 종양 축소율을 효과 판정을 기준으로 하는 응답율(response rate)에 의해 약제로서의 평가가 이루어져 왔다. 한편, 최근의 암 생물학의 진전에 따라, 세포내 정보 전달계나 혈관 신생 등을 저해하는 새로운 작용 기작의 약제가 활발한 연구 개발 중에 있다. 이러한 신규 항암제에서는 반드시 독성 용량에 가까운 최대 추천 용량이 투여될 필요성이 없을 가능성이 고려된다. 또한, 종양의 축소보다도 오히려 종양의 증식 억제에 수반되는 QOL(질적 새활(Quality of Life))의 개선이나 수명연장을 지표로 하는 편이 약제의 효과를 적정하게 판정할 수 있을 것으로 추측된다. 이 경우, 보다 논리적이면서 구체적으로 약제의 효과를 확인하기 위해서는, 종양의 증식 억제 기작에 밀접하게 관련하는 생물학적 마커의 변화를, 대리(surrogate) 마커로서 이용하는 것이 요망된다.
일반적으로 항암 요법에서, 항암제를 투여하였을 때의 생체의 반응성은 약제의 표적이 되는 종양 세포의 이 약제에 대한 감수성에 크게 의존한다. 이러한 종양 세포의 약제에 대한 감수성은, 종양 세포마다 크게 상이하다. 이러한 감수성의 차이는, 이 약제의 표적 분자 또는 이에 관련하는 인자의 양적 또는 질적 차이, 또는 약제 내성의 획득 등에 기인한다. 이러한 배경을 근거로 하면, 표적이 되는 종양 세포가 약제에 대하여 감수성을 나타낼 경우에 특이적으로 유발되는 종양 세포의 변화를, 생체 조직편(biopsy) 등에 의해 취득된 종양 조직 등을 사용하여 측정할 수 있다면, 이것을 대리 마커로 하여, 조기에 약제의 효과 판정, 치료법의 확립, 새로운 치료법의 선택 등이 가능해져 대단히 유익하다. 또한, 치료에 앞서 생체 조직편 등에 의해 취득된 종양 조직에서, 상법에 따라 종양 세포를 분리한 후 약제 처리를 실시하여, 이 종양 세포가 약제 감수성인지 여부를 상기 대리 마커의 변화에 의해 측정하면, 미리 이 약제에 의한 치료가 유효한지 여부를 예측할 수 있기 때문에 임상적으로 매우 유용하다. 이러한 대리 마커는 이의 변화가 항종양 효과에 특이적인 것이 중요하며, 또한 고감도로 측정 가능하면 양호하다. 구체적으로는, 약제의 항종양 효과에 특이적인 유전자 발현 변동의 정량, 이러한 유전자 발현의 변화에 따른 단백질의 양적 변동의 해석, 또한 이러한 변화에 따른 기능 변화의 해석 등 모두 이러한 대리 마커가 될 수 있다.
E7070(N-(3-클로로-7-인돌릴)-1,4-벤젠디설폰아미드)는 세포 주기의 G1기를표적으로 하는 항종양 효과를 갖는 화합물이며, 현재 임상 개발 중이다[참조: Takash, Owa, Hiroshi Yoshino, Tatsuo Okauchi, Kentaro Yoshimatsu, Yoichi Ozawa, Naoko Hata Sugi, Takeshi Nagasu, Nozomu Koyanagi and Kyosuke Kitoh, J.Med.Chem, 1999, 42, 3789-3799].
이러한 화합물의 여러 가지의 종양 세포에 대한 세포 증식 억제 작용의 강도 스펙트럼은 기존의 항암제 어느 것과도 상이하며, 새로운 작용 기작을 갖는 항암제로서 이의 효과가 기대된다. 이 약제의 임상 개발을 빠르게 진행시키고, 임상 치료법을 조기에 확립하기 위해서, 또는 확립된 치료법에 기초하여 효율적으로 치료를 진행시켜, 환자의 QOL 향상에 공헌하기 위해서, 본 약제 투여시에 특이적으로 사용할 수 있는 대리 마커를 발견하고, 응용할 것이 요망된다.
최근, 여러 가지의 DNA 마이크로 어레이를 사용하여, 다수 유전자의 발현량을 동시에 검출하는 방법이 확립되어, 폭넓은 목적으로 응용되고 있다[참조: Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO, Science 1995, 270, 467-70, Lockhart, D.J., Dong, H., Byrne, M.C., Follettie, M.T., Gallo, M.V., Chee, M.S., Mittmann, M., Wang C., Kobayashi, M., Horton, H. Brown, E.L., Nature Biotechnology, 1996, 14, 1675-1680].
암 연구 분야에서도 이러한 DNA 마이크로 어레이를 사용하는 연구는 왕성하게 이루어지고 있다. 예를 들면, DNA 마이크로 어레이를 사용한 발현 해석에 의해 전이성 거대 B세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma; DLBCL)을 해석한 연구에서는, DLBCL이 유전자 발현 프로파일의 차이에 의해 2개의 다른 형으로 분류되며, 이러한 분류가 예후를 예측할 수 있게 하는 것으로 나타난다[참조: Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, Ma C, Lossos IS, Rosenwald A, Boldrick JC, Sabet H, Tran T, Yu X, Powell JI, Yang L, Marti GE, Moore T, Hudson J Jr, Lu L, Lewis DB, Tibshirani R, Sherlock G, Chan WC, Greiner TC, Weisenburger DD, Armitage JO, Warnke R, Staudt LM, et al, Nature, 2000, 403, 503-11]. 또한, 미국에서는 국립 암 연구기관의 60종류의 암 세포주 패널에 관해서 유전자 발현 프로파일을 해석함으로써, 이러한 세포주를 재분류하고, 이의 특성을 검토한 보고[참조: Ross DT, Scherf U, Eisen MB, Perou CM, Rees C, Spellman P, Iyer V, Jeffrey SS, Van de Rijn M, Waltham M, Pergamenschikov A, Lee JC, Lashkari D, Shalon D, Myers TG, Weinstein JN, Botstein D, Brown PO, Nat Genet, 2000, 24, 227-35], 또한, 이러한 60종류의 암 세포주 패널의 유전자 발현 프로파일과 각 세포주의 각종 항암제에 대한 감수성간의 관련에 관해서 고찰한 보고[참조: Scherf U, Ross DT, Waltham M, Smith LH, Lee JK, Tanabe L, Kohn KW, Reinhold WC, Myers TG, Andrews DT, Scudiero DA, Eisen MB, Sausville EA, Pommier Y, Botstein D, Brown PO, Weinstein JN, Nat Genet, 2000, 24, 236-44]등이 이루어지고 있다.
또한, 마찬가지로 DNA 마이크로 어레이(일부 막 필터를 사용한 마이크로 어레이)를 사용하여, 종양 세포에 항암제를 작용시킬 때에 야기되는 유전자 발현 변화를 검토한 보고도 몇 가지 이루어지고 있다[참조: Rhee CH, Ruan S, Chen S, Chenchik A, Levin VA, Yung AW, Fuller GN, Zhang W, Oncol Rep, 1999, 6, 393-401. Zimmermann J, Erdmann D, Lalande I, Grossenbacher R, Noorani M, Furst P,Oncogene, 2000, 19, 2913-20. Kudoh K, Ramanna M, Ravatn R, Elkahloun AG, Bittner ML, Meltzer PS, Trent JM, Dalton WS, Chin KV, Cancer Res, 2000, 4161-6]. 이러한 보고는 유전자 발현의 변동 해석이 복수 세포 집단의 특성 비교나 약제의 처리 등에 의해 세포에 야기되는 생물학적인 변화를 분자 수준으로 포괄적으로 연구할 목적에 매우 유용하다는 것을 나타내고 있다.
본 발명은 항암제에 대하여 종양 세포의 감수성 여부를 검정하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 세포주 HCT116-C9, HCT116-C9-C1, LX-1, LX-1-E2의 E7070에 의한 세포 증식 억제 곡선을 나타낸다.
도 2는 E7070 감수성주 HCT116-C9에서의 유전자 발현 변동의 정량적 PCR에 의한 해석의 결과를 나타낸다.
도 3은 E7070 감수성주 LX-1에서의 유전자 발현 변동의 정량적 PCR에 의한 해석의 결과를 나타낸다.
도 4는 E7070 내성주 HCT116-C9-C1에서의 유전자 발현 변동의 정량적 PCR에 의한 해석의 결과를 나타낸다.
도 5는 E7070 내성주 LX-1-E2에서의 유전자 발현 변동의 정량적 PCR에 의한 해석의 결과를 나타낸다.
발명을 수행하기 위한 실시 형태
이하에 본 발명의 실시의 형태에 관해서, 상세하게 설명한다.
본 발명의 검정 방법은 종양 세포가 생체내 또는 시험관내에서 항암제에 노출되었을 때, 종양 세포에서의 특정 유전자의 발현량 변화를 종양 세포의 항암제에 대한 감수성의 지표로 하는 점을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 제1 양태의 검정 방법은, 1) 화학식Ⅰ의 항암제를 투여한 암 환자로부터 추출된 종양 세포의 표 3 및 표 4에 기재된 유전자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 또는 복수의 유전자의 발현량을 측정하고,
2) 당해 암 환자로부터 항암제 투여전에 추출된 종양 세포와 비교하여, 표 3에 기재된 유전자의 발현량이 증가하거나, 표 4에 기재된 유전자의 발현량이 감소하는 경우에, 당해 종양 세포가 당해 항암제에 대하여 감수성이라고 판정하는 공정을 포함하여 이루어진다.
또한, 본 발명의 제2 양태의 검정 방법은, 1) 암 환자로부터 추출된 종양 세포에 화학식Ⅰ의 항암제를 작용시키고,
2) 당해 종양 세포의 표 3 및 표 4에 기재된 유전자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 또는 복수의 유전자의 발현량을 측정하고,
3) 무처리의 종양 세포와 비교하여, 표 3에 기재된 유전자의 발현량이 증가하거나, 표 4에 기재된 유전자의 발현량이 감소하는 경우에, 당해 종양 세포가 당해 항암제에 대하여 감수성이라고 판정하는 공정을 포함하여 이루어진다.
본 발명에서의 항암제는 화학식Ⅰ의 설폰아미드 유도체 및 설폰산 에스테르 유도체이다.
화학식Ⅰ에서, A가 의미하는「치환체를 가질 수 있는 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 방향족 환」이란, 방향족 탄화수소, 또는 질소 원자, 산소 원자 및 황 원자 중 1개 이상을 포함하는 방향족 헤테로사이클릭 환이며, 당해 환 위에는 치환체 1 내지 3개가 있을 수 있다. A에 포함되는 주된 방향족 환을 예시하자면, 피롤, 피라졸, 이미다졸, 티오펜, 푸란, 티아졸, 옥사졸, 벤젠, 피리딘, 피리미딘, 피라진, 피리다진, 나프탈렌, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 프탈라진, 나프틸리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 인돌, 이소인돌, 인돌리딘, 인다졸, 벤조푸란, 벤조티오펜, 벤즈옥사졸, 벤즈이미다졸, 벤조피라졸, 벤조티아졸 등이 있다. 상기 방향족 환은 치환체 1 내지 3개를 가질 수 있으며, 치환체가 2개 이상인 경우에는, 동일하거나 상이할 수 있다. 치환체로서는, 예를 들면, 저급 알킬 그룹 또는 저급 사이클로알킬 그룹으로 치환될 수 있는 아미노 그룹, 저급 알킬 그룹, 저급 알콕시 그룹, 하이드록실 그룹, 니트로 그룹, 머캅토 그룹, 시아노 그룹, 저급 알킬티오 그룹, 할로겐 그룹, 화학식 -a-b[여기서, a는 단일결합, -(CH2)k-, -O-(CH2)k-, -S-(CH2)k- 또는 -N(R3)-(CH2)k-(여기서, k는 1 내지 5의 정수이고, R3은 수소 원자 또는 저급 알킬 그룹이다)이고, b는 -CH2-d(여기서, d는 저급 알킬 그룹으로 치환될 수 있는 아미노 그룹, 할로겐 그룹, 하이드록실 그룹, 저급 알킬티오 그룹, 시아노 그룹 또는 저급 알콕시 그룹이다)이다]의 그룹이며, 화학식 -a-e-f[여기서, a는 위에서 정의한 바와 동일하며, e는 -S(O)- 또는 -S(O)2-이고, f는 저급 알킬 그룹 또는 저급 알콕시 그룹으로 치환될 수 있는 아미노 그룹, 저급 알킬 그룹, 트리플루오로메틸 그룹, -(CH2)m-b 또는 -N(R4)-(CH2)m-b(여기서, b는 위에서 정의한 바와 동일하며, R4은 수소 원자 또는 저급 알킬 그룹이고, m은 1 내지 5의 정수이다)이다]의 그룹이며, 화학식 -a-g-h[여기서, a는 위에서 정의한 바와 동일하며, g는 -C(O)- 또는 -C(S)-이고, h는 저급 알킬 그룹으로 치환될 수 있는 아미노 그룹, 하이드록실 그룹, 저급 알킬 그룹, 저급 알콕시 그룹, -(CH2)n-b 또는 -N(R5)-(CH2)n-b(여기서, b는 위에서 정의한 바와 동일하며, R5은 수소 원자 또는 저급 알킬 그룹이고, n은 1 내지 5의 정수이다)이다]의 그룹이며, 화학식 -a-N(R6)-g-i[여기서, a 및 g는 위에서 정의한 바와 동일하며, R6은 수소 원자 또는 저급 알킬 그룹이고, i는 수소 원자, 저급 알콕시 그룹 또는 f(f는 위에서 정의한 바와 동일하다)이다]의 그룹이며, 화학식 -a-N(R7)-e-f(여기서, a, e 및 f는 위에서 정의한 바와 동일하며, R7은 수소 원자 또는 저급 알킬 그룹이다)의 그룹이며, 또는 화학식 -(CH2)p-j-(CH2)q-b(여기서, j는 산소 원자 또는 황 원자이고, b는 위에서 정의한 바와 동일하며, p 및 q는 동일하거나 상이하며, 1 내지 5의 정수이다)의 그룹 등을 들 수 있다.
상기 치환체 예에서, 아미노 그룹이 2개의 알킬 그룹으로 치환되어 있는 경우에는, 이러한 알킬 그룹이 결합하여 5 또는 6원 환을 형성할 수 있다. 또한, A가 하이드록실 그룹 또는 머캅토 그룹을 갖는 질소 함유 헤테로사이클릭 환인 경우에는, 이들의 그룹이 공명 구조를 취함으로써, 옥소 그룹 또는 티옥소 그룹의 형태로 존재할 수 있다.
B가 의미하는「치환체를 가질 수 있는 6원 불포화 탄화수소 환 또는 헤테로원자로서 질소 원자를 1개 포함하는 불포화 6원 헤테로사이클릭 환」이란, 일부가수소화될 수 있는 벤젠 또는 피리딘이며, 해당 환 위에 치환체 1 또는 2개를 가질 수 있으며, 치환체가 2개 있는 경우에는 동일하거나 상이할 수 있음을 나타낸다.
C가 의미하는「치환체를 가질 수 있는 질소 원자를 1 또는 2개 포함하는 5원 헤테로사이클릭 환」이란, 일부가 수소화될 수 있는 피롤, 피라졸, 이미다졸이며, 해당 환 위에 치환체 1 또는 2개를 가질 수 있으며, 치환체가 2개 있는 경우에는 동일하거나 상이할 수 있음을 나타낸다.
B 및 C가 가질 수 있는 치환체로서는, 예를 들면, 할로겐 그룹, 시아노 그룹, 저급 알킬 그룹, 저급 알콕시 그룹, 하이드록실 그룹, 옥소 그룹, 화학식 -C(0)-r(여기서, r은 수소 원자, 저급 알킬 그룹으로 치환될 수 있는 아미노 그룹, 저급 알킬 그룹, 저급 알콕시 그룹 또는 하이드록실 그룹이다), 저급 알킬 그룹으로 치환될 수 있는 아미노 그룹, 트리플루오로메틸 그룹 등을 들 수 있다.
화학식Ⅰ에서, R1, R2및 A, B 및 C가 가질 수 있는 치환체 정의 중의 저급 알킬 그룹은, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 또는 측쇄상의 알킬 그룹, 예를 들면, 메틸 그룹, 에틸 그룹, n-프로필 그룹, 이소프로필 그룹, n-부틸 그룹, 이소부틸 그룹, 2급 부틸 그룹, 3급 부틸 그룹, n-펜틸 그룹(아밀 그룹), 이소펜틸 그룹, 네오펜틸 그룹, 3급 펜틸 그룹, 1-메틸부틸 그룹, 2-메틸부틸 그룹, 1,2-디메틸프로필 그룹, n-헥실 그룹, 이소헥실 그룹, 1-메틸펜틸 그룹, 2-메틸펜틸 그룹, 3-메틸펜틸 그룹, 1,1-디메틸부틸 그룹, 1,2-디메틸부틸 그룹, 2,2-디메틸부틸 그룹, 1,3-디메틸부틸 그룹, 2,3-디메틸부틸 그룹, 3,3-디메틸부틸 그룹, 1-에틸부틸 그룹, 2-에틸부틸 그룹, 1,1,2-트리메틸프로필 그룹, 1,2,2-트리메틸프로필 그룹, 1-에틸-1-메틸프로필 그룹, 1-에틸-2-메틸프로필 그룹 등을 의미한다. 이 중에서 바람직한 그룹으로서는, 메틸 그룹, 에틸 그룹, n-프로필 그룹, 이소프로필 그룹, n-부틸 그룹, 이소부틸 그룹 등을 들 수 있으며, 이 중에서 가장 바람직한 그룹으로서는 메틸 그룹, 에틸 그룹, n-프로필 그룹, 이소프로필 그룹을 들 수 있다.
A가 가질 수 있는 치환체 정의 중의 저급 사이클로알킬 그룹은 탄소수 3 내지 8의 사이클로알킬 그룹을 의미하여, 예를 들면 사이클로프로필 그룹, 사이클로펜틸 그룹, 사이클로헥실 그룹 등을 들 수 있다.
A, B 및 C가 가질 수 있는 치환체 정의 중의 저급 알콕시 그룹이란, 메톡시 그룹, 에톡시 그룹, n-프로폭시 그룹, 이소프로폭시 그룹, n-부톡시 그룹, 이소부톡시 그룹, 3급 부톡시 그룹 등 상기의 저급 알킬 그룹으로부터 유도되는 알콕시 그룹을 의미하지만, 이 중에서 가장 바람직한 그룹으로서는 메톡시 그룹, 에톡시 그룹을 들 수 있다. 저급 알킬티오 그룹은 상기의 저급 알킬 그룹으로부터 유도되는 알킬티오 그룹을 의미한다. 또한 할로겐 원자로서는 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 등을 들 수 있다.
화학식Ⅰ의 설폰아미드 유도체 또는 설폰산 에스테르 유도체는 산 또는 염기와 염을 형성하는 경우도 있다. 본 발명에서의 항암제는 화학식Ⅰ의 화합물의 염도 포함한다. 산과의 염으로서는, 예를 들면, 염산염, 브롬화 수소산염, 황산염 등의 무기산염이나 아세트산, 락트산, 숙신산, 푸말산, 말레산, 시트르산, 벤조산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산 등의 유기산과의 염을 들 수 있다. 또한, 염기와의염으로서는, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 등의 무기염, 트리에틸아민, 아르기닌,라이신 등의 유기염기와의 염을 들 수 있다.
또한, 이러한 화합물의 수화물은 물론 광학이성체가 존재하는 경우는 이들 모두가 포함되는 것은 말할 필요도 없다. 또한, 본 발명에서의 항암제는 강한 항종양 활성을 나타내지만, 생체 내에서 산화, 환원, 가수분해, 포합(抱合) 등의 대사를 받아 항종양 활성을 나타내는 화합물도 포함한다. 또한 추가로, 본 발명에서의 항암제는 생체 내에서 산화, 환원, 가수분해 등의 대사를 받아 화학식Ⅰ의 화합물을 생성하는 화합물도 포함한다.
감수성을 검정하는 종양 세포는, 화학식Ⅰ의 항암제에 대하여 감수성을 나타내는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 대장암, 폐암, 유방암, 백혈병, 췌장암, 신장암, 흑색종, 악성 림프종, 머리 경부암, 위암 등에 유래하는 종양 세포를 들 수 있다.
암 환자로부터 추출한 종양 세포는 암 환자로부터 적출된 암조직에 포함되는 종양 세포도 포함된다.
제1 양태의 검정 방법의 경우에는, 암 환자로부터 추출된 종양 세포는 화학식Ⅰ의 항암제가 종양 세포의 감수성이 측정 가능한 양이 투여된 암 환자로부터 추출된 종양 세포이면 양호하며, 통상적으로는 100 내지 1500mg의 용량으로 1 내지 14일 동안 투여된 암 환자로부터 추출한 종양 세포이다.
제2 양태의 검정 방법의 경우에는, 암 환자로부터 추출한 종양 세포에 화학식Ⅰ의 항암제를 작용시키는 조건은, 종양 세포의 감수성이 측정 가능한 것이면 양호하며, 통상적으로는 배지 중 0.01 내지 10μM의 항암제 농도에서 6 내지 72시간 동안 배양하는 조건을 들 수 있다.
유전자의 발현량 측정은 유전자의 전사 산물인 RNA 또는 유전자 산물인 단백질을 정량함으로써 실시할 수 있다. RNA 또는 단백질의 정량은 통상적으로는 종양 세포로부터 RNA 또는 단백질을 추출하여, 추출물 중의 RNA 또는 단백질을 정량함으로써 실시할 수 있다. 이하, 1. RNA 또는 단백질의 추출, 2. RNA의 정량, 3. 단백질의 정량의 순서로 이들의 예를 상세하게 설명한다.
1. RNA의 추출
1) 화학식Ⅰ의 항암제가 투여된 환자의 암 조직으로부터 RNA 또는 단백질의 추출
화학식Ⅰ의 항암제가 투여된 환자로부터 생체 조직편 등으로 적출된 암 조직에서 이하에서 설명하는 방법으로 RNA 또는 단백질을 추출한다.
RNA의 추출은 일반적인 RNA 추출법에 따라서 실시할 수 있다. 예를 들면 TRIZOL 시약[공급원: Life Technologies Oriental] 등을 사용하여, 첨부된 조작법에 따라 실시할 수 있다. 구체적으로는 이하와 같다. 암 조직 50 내지 100mg에 대하여 1ml의 TRIZOL 시약을 가하고, 테플론 균질화기를 사용하여 균일화한다. 이것을 원심분리하여(12,000xg, 10분간, 4℃), 수득된 상등액을 실온에서 5분 동안 방치한 후, 사용한 TRIZOL 시약 1ml에 대하여 0.2ml의 비율로 클로로포름을 첨가한다. 이 용액을 15초 동안 격렬하게 진탕, 교반하여 실온에서 2 내지 3분 동안 방치한 후, 원심분리한다(12,000xg, 15분간, 4℃). 원심분리후, 수층을 새로운 튜브에 옮기고, 사용한 TRIZOL 시약 1ml에 대하여 0.5ml의 비율로 이소프로필알콜을 가하여, 실온에서 10분 동안 방치한 후, 원심분리를 실시한다(12,000xg, 10분간, 4℃). 수득된 침전물을 75% 에탄올로 세정한 후, 바람으로 건조시키고, 전체 RNA로서 이하의 조작에 사용한다.
암 조직으로부터의 단백질 추출은 문헌[참조: Bollag, D.M., Rozycki M.D., Edelstein S.J., Protein Methods, 1996, Wiley-Liss, Inc., New York, U.S.A. Walker,J.M., The protein handbook, 1996, Humana Press, New Jersey, U.S.A.]등에 기재된 방법에 따라서 실시할 수 있다.
2) 화학식Ⅰ의 항암제의 존재하에서 배양한 암 세포로부터의 RNA 또는 단백질의 추출
환자로부터 생체 조직편 등으로 수득된 암 조직에서 정법(定法)에 따라서 암 세포(종양세포)를 분리한다. 예를 들면, 햄버거(Hamburger) 등[참조: Hamburger A., Salmon S.E., Kim M.B., Trent J.M., Soehnlen B.J., Alberts D.S., and Schmidt H.t., Cancer Res., 38, 3438-3443, 1978]에 따라서, 수득된 조직을 무균적으로 세절(細切)한 다음, 스테인레스 메쉬(mesh), 주사 바늘 또는 나일론 메시 등을 사용하여 세포의 현탁액을 조제한다. 이렇게 해서 수득된 세포를 적당한 배지(예를 들면, 10 내지 15% FCS를 포함하는 RPMI-1640, MEM, McCoy 배지 등)에 배양한다. 수득된 암 세포를 화학식Ⅰ의 항암제의 존재하에서 적당한 기간, 바람직하게는 3시간·6시간·12시간 또는 24시간, 더욱 바람직하게는 12시간 5% CO2조건하 37℃에서 배양하여, 이하에 설명하는 방법으로 RNA 또는 단백질을 추출한다. 또한, 사용하는 생체 조직편 등으로 수득된 조직 중에서 연한천(soft agar) 배양법[참조: Hamburger A., and Salmon S.E., Science, 197, 461-463, 1977, Hamburger A., and Salmon S.E., J.Clin. Invest., 60, 846-854, 1977, Von Hoff D.D., and Johnson, G.E., Proc. Am. Assoc. Cancer Res.,20, 51, 1979]을 사용하여, 암 세포만을 특이적으로 분리하여 사용하는 것도 가능하다.
암 세포로부터의 RNA 추출은 암 조직으로부터의 RNA 추출과 마찬가지로 일반적인 RNA 추출법에 따라서 실시할 수 있다. 예를 들면, TRIZOL 시약[참조: Life technologies Oriental]을 사용한 경우, 첨부된 조작법에 따라서 실시할 수 있다. 구체적으로는 암 세포 5 내지 1O x 106에 대하여 1ml의 TRIZOL 시약을 가하여, 이하의 암 조직으로부터의 RNA 추출과 동일한 조작을 실시하면 양호하다.
암 세포로부터의 단백질 추출에 관해서도, 암 조직으로부터의 추출과 마찬가지로 공개문헌에 기재된 방법에 따르면 양호하다.
2.RNA의 정량
RNA는 노던 블로팅(northern blotting) 해석·DNA 마이크로 어레이·RT-PCR·정량적 PCR 등의 기술에 의해 정량할 수 있다. 바람직하게는 DNA 마이크로 어레이·정량적 PCR인 것이 바람직하다. 이하에 각각에 관해서 설명하지만, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않는다.
DNA 마이크로 어레이에 의한 정량은 다음과 같이 실시한다. 처음에 수득된 RNA를 주형으로 하여 슈퍼스크립트 선별 시스템(Super Script Choice System)[참조: Life Technologies Oriental] 및 T7-d(T)24프라이머를 사용하여 이본쇄 cDNA를 합성하고, 계속해서 이 cDNA를 주형으로 하여 비오틴화된 cRNA를 합성한다.
구체적으로는 우선 수득된 RNA로부터 T7-d(T)24프라이머를 사용하여 일본쇄 DNA를 합성한다. 이어서 dNTP·DNA 리가제·DNA 폴리머라제 I·RNase H를 첨가하여 반응시킨 후, 추가로 T4 DNA 폴리머라제 I를 추가로 첨가하여 이본쇄 cDNA를 합성한다. 수득된 cDNA를 정제한 후, RNA 전사체 라벨링 키트(Transcript Labeling Kit)(Enzo Diagnostics)를 사용하여, 비오틴화 UTP 및 CTP을 가하여 라벨화 반응을 실시한다. 반응 생성물을 정제한 후, 200mM 트리스/아세트테이트 pH 8.1, 150mM 마그네슘 아세테이트, 50mM 칼륨 아세테이트 중에서 94℃에서 35분 동안 가열하여, 단편화된 cRNA를 수득한다.
단편화된 cRNA를 예를 들면, 100mM MES, 1M 나트륨염, 20mM EDTA, 0.01% Tween 20 중에서, 45℃에서 16시간, 유전자 칩(Affymetrix) Hu6800 또는 개량된 제품에 하이브리드화시킨다. 하이브리드화시킨 후, 유전자 칩은 공급원[Affymetrix fluidics station]에 첨부된 프로토콜 EukGE-WS2에 따라서 세정·염색한다. 염색에는 스트렙토 아비딘·피코에리트린과 비오틴화 항 스트렙토 아비딘 산양 항체를 사용한다. 염색 후의 유전자 칩을 HP 아르곤 이온 레이저 공초점 현미경[제조원: Hewlett Packard]을 사용하여 스캐닝하고, 형광 강도를 측정한다. 이러한 형광 색소의 경우, 측정은 488nm의 여기광을 사용하여 570nm의 형광을 측정한다.
정량적 데이터 해석을 바람직하게는 유전자 칩 소프트웨어(Affymetrix)를 사용하여 실시한다. RNA를 정량하기 위해서, 각각의 프로브 패밀리(probe family)마다「차([완전 매치 하이브리드화 시그널(perfect match hybridization signal)]-[미스매치 시그널(mismatch signal])」의 차이값 평균(average difference)을 구하여, 이 값이 50 이상이고, 또한 2가지 조건 사이에서 RNA의 정량치가 많은 차이가 있는 경우, 바람직하게는 1.8배 이상 해리되어 있는 경우에 있어서, 이의 유전자의 발현이 유의적으로「증가」또는「감소」한다고 판단한다.
표 3에 기재된 1개 또는 복수개 유전자의 RNA량이 증가하거나 표 4에 기재된 1개 또는 복수개 유전자의 RNA양이 감소하는 경우에, 당해 종양 세포가 당해 항암제에 대하여 감수성이라고 판정한다.
또한, 정량적 PCR은 SYBR 그린(Green)과 ABI 프리즘(Prism) 7700 서열 검출 시스템(Perkin-Elmer Applied Biosystems)를 사용하여, 다음과 같이 실시한다.
조작은 역전사 반응 및 PCR 반응의 2단계로 실시한다. 처음 단계인 역전사 반응은, 수득된 RNA에 dNTP·올리고 d(T)16프라이머·Rnase 억제제 혼합물 및 다중전사 역전사 효소(Perkin-Elmer Applied Biosystems)를 가하여, 25℃에서 10분 동안 보온한 후, 48℃에서 30분 동안 가열시킴으로써 실시한다. 반응을 95℃에서 5분 동안 가열시킴으로써 정지시킨다.
수득된 cDNA를 제2단계의 PCR 반응에 사용한다. PCR 반응은, 예를 들면 4ng cDNA, 1x SYBR PCR 완충액, 3mM MgCl2, 각 200μM dATP, dCTP, dGTP, 400μM dUTP, 200nM 프라이머 대, 0.01U/㎕ AmpErase UNG, 0.025U/㎕ 앰플리타크 골드(AmpliTaq Gold) DNA 폴리머라제(Perkin-Elmer Applied Biosystems)의 반응계에서 실시한다. 반응조건은, 예를 들면 50℃에서 2분간, 95℃에서 10분간에 이어서 95℃에서 20초간·55℃에서 20초간·72℃에서 30초간을 40사이클로 실시한다. 프라이머와 프로브는, 예를 들면, 프라이머 발현(Perkin-Elmer Applied Biosystems)을 사용하여 설계한다. 2개 이상의 검체의 비교는 정량치를 각 검체의 전사량에 변동이 적은 하우스 키핑(house keeping) 유전자, 바람직하게는 GAPDH의 mRNA 수준에 의해 보정하여 실시한다.
표 3에 기재된 1개 또는 복수개 유전자의 RNA량이 증가하거나, 표 4에 기재된 1개 또는 복수개 유전자의 RNA량이 감소하는 경우에, 당해 종양 세포가 당해 항암제에 대하여 감수성이라고 판정한다.
본 발명은 본 발명의 검정 방법에서 사용하기 위한, 발현량을 측정하는 대칭 유전자의 전사 산물인 RNA에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 구성 요소로서 포함하는, RNA 정량 시약도 제공한다. 구성 성분이 되는 올리고 뉴클레오타이드는 정량적 PCR에 사용되는 프라이머 및/또는 프로브이고, 상기와 같이 하여 설계할 수 있다. 본 발명의 RNA의 정량 시약은, 상기 올리고 뉴클레오타이드에 가하여, 일반 정량 시약에 허용되는 성분을 포함할 수 있다.
3. 단백질의 정량
단백질은 이의 활성 또는 항원성을 기초로 정량하지만, 바람직하게는 단백질은 일반적으로 적용하기 쉬운 항원성을 기초로 한 정량, 즉 면역 화학적 정량이 바람직하다.
단백질에 대한 항체는, 이의 아미노산 서열로부터 파커(Parker) 등의 보고[참조: Parker J.M.R., Guo D., Hodges R.S., Biochemistry, 25, 5425, 1986] 또는 카플러스(Karplus) 등의 보고[참조: Karplus P.A., Schulz G.E., Naturwissenschaften, 72, 212, 1985]에 기초하여 항원 결정기를 예측하여, 펩타이드를 합성하거나 융합 단백질, 예를 들면, 글루타치온 합성효소(GST)와의 융합 단백질을 발현시켜 글루타치온 컬럼으로 정제하여, 항원을 제작하고, 수득된 항원을 집 토끼·마우스 등에 면역하여 폴리클로날, 바람직하게는 모노클로날 항체[참조: Harlow E., Lane D., Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]를 제작할 수 있다. 또한, 시판 중인 항체를 이용할 수 있는 경우는, 특이성을 확인한 후에 사용하는 것도 허용된다.
수득된 항체를 사용하며, 예를 들면, 효소 면역 측정법[참조: 이시카와 에이지 외, 이가쿠 쇼인, 1982] 또는 효소 면역 측정법[참조: Ishikawa E., Kawai T., Miyai, K., Igaku-Shoin, Tokyo New York, 1981]에 기재된 방법에 의해 ELISA 또는 RIA를 실시하여 단백질을 정량한다. 단백질이 종양 세포 밖으로 분비되는 것인 경우에는, 종양 세포로부터 단백질을 추출하지 않고, 배지 중의 단백질을 정량하는 것이 가능하다.
표 3에 기재된 1개 또는 복수개 유전자의 단백질량이 증가하거나, 표 4에 기재된 1개 또는 복수개 유전자의 단백질량이 감소하는 경우에, 당해 종양 세포가 당해 항암제에 대하여 감수성이라고 판정한다.
본 발명은 본 발명의 검정 방법에서 사용하기 위한, 당해 단백질에 대한 항체를 구성 요소로서 포함하는 면역 측정 시약도 제공한다. 구성 성분이 되는 항체는 상기와 같이 하여 수득할 수 있다. 본 발명의 면역 측정 시약은 상기 항체에 가하여, 일반적인 면역 측정 시약에 허용되는 성분을 포함할 수 있다.
실시예
이하에 구체적인 예를 들어 본 발명을 나타내지만, 본 발명이 이것에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] E7070 감수성주 및 내성주의 배양과 RNA의 추출
모든 세포는 10%의 태아 소혈청, 10O유니트/ml의 페니실린, 10Omg/ml의 스트렙토마이신을 첨가한 RPMI-1640 배지를 사용하여 5% CO2조건하 37℃에서 배양한다.
E7070 또는 하기 구조식을 나타내는 ER-35748 또는 ER-68487을 E7070 감수성주 HCT116-C9 및 E7070 내성주 HCT116-C9-C1의 배지에 8μM의 농도로 첨가하여 배양하고, 0, 3, 6, 12시간 후의 세포를 회수한다. 또한,약제를 가하지 않고 12시간 동안 배양한 세포도 동일하게 회수한다.
ER-35748
ER-68487
이러한 세포로부터 전체 RNA를 추출한 다음, 해석에 사용한다. 약제 첨가 12시간 후의 세포로부터 추출한 RNA 및 약제를 첨가하지 않고 12시간 동안 배양한 세포로부터 추출한 RNA를 실시예 2에 나타내는 DNA 마이크로 어레이에 의한 유전자 발현 해석에 사용한다. 또한, HCT116-C9는 사람 대장암 유래 HCT116[참조: American Type Culture Collection, Manassas, VA, U.S.A.]부터 분리한 아세포주(substrain)이고, 이러한 HCT116-C9를 E7070 존재하에서 배양, E7070 농도를 점차적으로 상승시킴으로써 수득한 E7070 내성 아세포주가 HCT116-C9-C1이다.
마찬가지로 E7070을 E7070 감수성주 LX-1 및 E7070 내성주 LX-1-E2의 배지에
8μM의 농도로 첨가하여 배양하고, 0, 3, 6, 12시간 후의 세포를 회수한다. 이러한 세포로부터 전체 RNA를 추출한 다음, 해석에 사용한다. 또한, LX-1[참조: Cancer Chemotherapy Center, Japan Foundation for Cancer Research, Tokyo, Japan]는 사람 소세포성 폐암 유래의 세포주이고, 이러한 LX-1를 E7070 존재하에서 배양, E7070 농도를 점차적으로 상승시킴으로써 수득한 E7070 내성 아주가 LX-1-E2이다.
사용한 세포주 HCT116-C9, HCT116-C9-C1, LX-1, LX-1-E2에 E7070를 첨가하여 72시간 동안 배양하고, MTT법[참조: Mosmann T., J.Immunol. Methods, 65, 55, 1983]에 의해 측정한 세포 증식 억제곡선을 도 1에 나타낸다. 실제 조작은 세포 역가 96 비 방사선 세포 증식 분석법(Non-Radioactive Cell Proliferation Assay)(Promega, Madison, WI)을 사용하여, 첨부된 조작법에 따라서 실시한다.
회수한 세포로부터의 전체 RNA의 추출은, TRIZOL 시약[참조: Life Technologies Oriental]을 사용하여 첨부된 조작법에 따라서 실시한다.
[실시예 2] DNA 마이크로 어레이에 의한 유전자 발현 해석
1) cDNA 합성과 비오틴 라벨링
실시예 1에서 수득된 RNA를 100㎕의 디에틸피로카보네이트(DEPC) 처리를 실시한 멸균수에 용해하고, 또한 RNeasy 컬럼(QIAGEN)을 사용하여 정제하며, 슈퍼스크립트 선별 시스템[참조: 라이프테크 오리엔탈] 및 T7-d(T)24프라이머를 사용하여 이본쇄 cDNA를 합성한다.
우선 10㎍의 RNA에 5μM의 T7-d(T)24프라이머, 1x 일본쇄 완충액, 10mM DTT, 500μM의 dNTP 혼합물, 20유니트/㎕의 슈퍼스크립트 전사 효소를 가하여, 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 일본쇄 DNA를 합성한다. 계속해서 1x 이본쇄 완충액, 200μM의 dNTP 혼합물, 67U/ml DNA 리가제, 270U/ml DNA 폴리머라제 I, 13U/mlRNase H를 첨가하여 16℃에서 2시간 동안 반응시키고, 이본쇄 cDNA를 합성한다. 추가로, 67U/ml T4 DNA 폴리머라제 I를 첨가하여 16℃에서 5분 동안 반응시킨 후, 10㎕의 0.5M EDTA를 가하여 반응을 정지시킨다.
수득된 cDNA를 페놀/클로로포름으로 정제하고, RNA 전사 라벨링 키트(Enzo Diagnostics)를 사용하여, 첨부된 조작법에 따라서, 비오틴화 UTP 및 CTP에 의한 라벨링 반응을 실시한다. 반응 생성물을 Rneasy 컬럼으로 정제한 후, 200mM 트리스/아세테이트 pH 8.1, 150mM 마그네슘 아세테이트, 50mM 칼륨 아세테이트 중에서 94℃에서 35분 동안 가열하여 cRNA 단편을 수득한다.
2) DNA 마이크로 어레이(유전자 칩)에 대한 하이브리드화 및 측정
단편화된 cRNA를 100mM MES, 1M 나트륨염, 20mM EDTA, 0.01% Tween 20 중에서, 45℃에서 16시간, 유전자 칩(Affymetrix) Hu6800에 하이브리드화시킨다. 하이브리드화시킨 후, 유전자 칩은 제조원[Affymetrix fluidics station]에 첨부된 프로토콜 EukGE-WS2에 따라 세정·염색한다. 염색에는 스트렙토 아비딘·피코에리트린과 비오틴화 항스트렙토 아비딘 산양 항체를 사용한다. 염색 후의 유전자 칩을 HP 아르곤 이온 레이저 공초점 스캐너[참조: Hewlett Packard]를 사용하여 스캐닝하고, 형광 강도를 측정한다. 측정은 488nm의 여기광을 사용하여 570nm의 형광에서 실시한다.
정량적 데이터 해석은 모두 유전자 칩 소프트웨어(Affymetrix)를 사용하여 실시한다. RNA를 정량하기 위해서, 각각의 프로브 패밀리마다([완전 매치 하이브리드화 시그널(perfect match hybridization signal)]-[미스매치 시그널(mismatch signl)])의 차이값 평균(average difference)을 구하여, 이 값이 50이상이면서 2개의 조건 사이에서 RNA의 정량치가 많은 차이가 있는 경우, 바람직하게는 1.8배 이상 해리되어 있는 경우에 있어서, 이의 유전자의 발현이 유의적으로 「증가」 또는「감소」했다고 판단한다.
E7070 또는 ER-35748, ER-68487을 HCT116-C9의 배지에 8μM의 농도로 첨가하여 배양하고, 12시간 후에 세포로부터 추출한 RNA의 유전자 칩에 의한 해석 결과를, 약제를 가하지 않고 동일한 조작에 의해 수득한 HCT116-C9 세포의 RNA 해석 결과와 비교한다. 이 결과, E7070, ER-35748, ER-68487의 3종의 약제 처리에 의해, 공통적으로 발현이 상승된 유전자의 리스트(GenBank의 등록번호도 함께 나타낸다(이하의 표에서 동일))를 표 1에, 마찬가지로 3종의 약제 처리에 의해 공통적으로 발현이 감소한 유전자의 리스트를 표 2에 나타낸다.
등록번호 유전자명
D59253 NCBP 작용 단백질 1
D78514 유비퀴틴 결합 효소
D83767 Rep-8
HG1139-HT4910 Fk506-결합 단백질
HG3484-HT3678 Cdc형 키나제 1(Clk 1)
J04152 종양 관련 항원 GA733-1, M1S1
M21154 S-아데노실메티오닌 데카복실라제
M60724 p70 리보솜 S6 키나제 알파-1
M84349 막관통 단백질 CD59
S61953 c-ErbB3 수용체 티로신 키나제
U52960 RNA 폴리머라제 Ⅱ복합체 성분 SRB7
U84720 수송 단백질 RAE1
U92014 결함 마리너 트랜스포존 Hsmar2
Z18951 카베올린
등록번호 유전자명
AB000409 세린/트레오닌 단백질 키나제 MNK1
AB000450 추정 세린/트레오닌 단백질 키나제 VRK2
AB002380 백혈병 관련 Rho GEF
AB003102 프로테아솜 26S 서브유니트 p44.5
AC002045 CIT987SK-A-589H1
AF002020 니에만-픽(Niemann-Pick) C 질환 단백질(NPC1)
AF008445 인지질 스크램블라제
D00723 수소 전달 단백질, 글라이신 신타제
D14659 KIAA0103
D21852 KIAA0029
D26535 디하이드롤리포아미드 숙시닐트랜스퍼라제
D28364 어넥신 Ⅱ
D29677 KIAA0054
D29810 미지의 생성물
D29956 유비퀴틴 특이적 프로테아제 8
D30756 KIAA0049
D31883 액틴 결합 LIM 단백질
D32002 핵 캡 결합 단백질
D38521 KIAA0077
D38552 KIAA0073
D38553 KIAA0074
D43947 KIAA0100
D43948 ch-TOG
D50645 SDF2
D50663 다이네인(Dynein)(TCTEL1)
D50912 RNA-결합 모티프 단백질 10
D50916 유비퀴틴화 인자 E4A
D61391 PAP39
D63480 KIAA0146
D63506 신택신 결합 단백질 3
D63875 TPR-함유/SH2-결합 단백질
D63880 KIAA0159
D78586 다작용성 단백질 CAD
D79983 KIAA0161
D79987 KIAA0165
D79988 KIAA0166
D79991 KIAA0169
D83776 KIAA0191
D83781 KIAA0197
D84307 포스포에탄올아민 시티딜릴트랜스퍼라제
D86981 아밀로이드 전구 단백질 결합 단백질 2
D87435 KIAA0248
등록번호 유전자명
D87446 KIAA0257
D87448 DNA 토포이소머라제 Ⅱ-결합 단백질
D87743 용해질 캐리어 패밀리 9
HG1869-HT1904 남성 항진 항원
HG2379-HT3996 세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제, 세포질
HG4094-HT4364 전사 인자 Lsf-ld
J04088 DNA 토포이소머라제 Ⅱ(top 2)
J04501 근육 글리코겐 신타제
J04543 시넥신
L06845 시스테이닐-tRNA 신세타제
L07033 하이드록시메틸글루타릴-CoA 리아제
L07540 복제 인자 C, 36-kDa 서브유니트
L07597 리보솜 단백질 S6 키나제 2
L07758 IEF SSP 9502
L21936 숙시네이트 데하이드로게나제 플라보단백질 서브유니트
L25444 TAFⅡ70-알파
L25931 라민 B 수용체
L33075 Ras GTPase-활성화 유사 단백질 IQGAP1
L33881 단백질 키나제 C 이오타 이소폼
L38810 프로테아솜 26S 서브유니트 p45
L40395 진핵 세포 개시 인자 2B-베타
L41870 망막아세포종 감수성 단백질(RB1)
L47276 알파 토포이소머라제 절단 형태
M15796 PCNA
M19267 트로포미오신
M22632 미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제
M23379 GTPase-활성화 단백질 ras p21
M24486 프롤릴 4-하이드록실라제 알파 서브유니트
M29204 DNA-결합 인자
M29550 칼시네우린 A1
M30496 유비퀴틴 카복실 말단 하이드롤라제
M33518 HLA-B-관련 전사체 2(BAT2)
M34309 상피 성장 인자 수용체 HER3
M37400 세포질 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제
M55905 미토콘드리아 NAD(P)+의존성 말릭 효소
M58525 카테콜-O-메틸트랜스퍼라제
M59911 인테그린 알파-3
M61764 감마-투불린
M62994 필라민 B
M74089 TB1
M85085 절단 자극 인자
M86707 미리스토일 CoA:단백질 N-미리스토일 트랜스퍼라제
등록번호 유전자명
M87338 복제 인자 C, 40-kDa 서브유니트(A1)
M87339 복제 인자 C, 37-kDa 서브유니트(RFC4)
M88163 광범위 전사 활성화 인자 (hSNF2/SWI2)
M91432 중쇄 아실-CoA 데하이드로게나제(MCAD)
M92439 류신 풍부 단백질
M93056 단핵구/호중구 엘라스타제 억제제
M95809 기본 전사 인자 62kD 서브유니트(BTF2)
M95929 호메오박스 단백질 PHOX1
M97935 전사 인자 ISGF-3
S58544 75kDa 불임 관련 정자 단백질
S59184 RYK=관련 수용체 티로신 키나제
S72904 APK1 항원=MAb KI 인지됨
S78085 PDCD2, Rp8 동족체
S80343 아르기닐-tRNA 신세타제(ArgRS)
U01062 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트 수용체형 3
U02566 수용체 티로신 키나제 티프
U04285 리소좀 산 리파제
U06631 H326
U07231 G-풍부 서열 인자-1
U07681 이소시트레이트 데하이드로게나제 3(NAD+)알파
U07919 알데하이드 데하이드로게나제 6(ALDH6)
U08815 스플라이스 단백질 SAP61
U10324 핵 인자 NF90
U11791 사이클린 H
U15174 Nip3
U15306 DNA-결합 단백질 NFX1
U18291 CDC16Hs
U18934 수용체 티로신 키나제 DTK
U20979 염색질 어셈블리 인자-Ⅰp150 서브유니트
U22233 메틸티오아데노신 포스포릴라제
U23028 진핵 세포 개시 인자 2B-엡실론
U23946 LUCA15
U26648 신탁신 5A
U27459 고유 인식 복합 단백질 2 동족체
U27460 우리딘 디포스포글루코스 피로포스포릴라제
U28413 코카인 증후군 보체화 그룹 A
U28811 시스테인 풍부 섬유아세포 성장 인자 수용체
U28831 항-PTH Ab와 면역 반응
U28963 Gps2
U30313 디아데노신 테트라포스파타제
U30521 P311 HUM-3.1
U30827 스플라이싱 인자 SRp40-3(SRp40)
등록번호 유전자명
U30828 스플라이싱 인자 SRp55-2(SRp55)
U34252 감마-아미노부티르알데하이드 데하이드로게나제
U34683 글루타치온 신세타제
U36341 SLC6A8
U40282 인테그린 연결 키나제
U46006 평활근 LIM 단백질(h-SmLIM)
U49844 FRAP-관련 단백질(FRP1/ATR)
U50078 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자 p532
U50939 아밀로이드 전구체 단백질-결합 단백질 1
U53468 NADH:유비퀴논 옥시도리덕타제 서브유니트 B13
U57629 망막염 색소 GTPase 조절 인자
U60808 CDP-디아실글리세롤 신타제
U61145 zeste 동족체 2의 인핸서
U61263 아세토락테이트 신타제 동족체
U63743 유사분열 센트로미어 관련 키네신(MCAK)
U65785 산소 조절 단백질 ORP-150
U72514 C2f
U72515 C3f
U76764 CD97
U77413 O-연결 GlcNAc 트랜스퍼라제
U77949 Cdc6-관련 단백질(HsCDC6)
U79241 클론 23759
U80034 미토콘드리아 중간체 펩티다제 전구체
U81554 CaM 키나제 Ⅱ이소폼
U85611 DNA-PK 상호작용 단백질(KIP)
U89606 피리독살 키나제
U90426 핵 RNA 헬리카제
U94319 전사 보조활성화 인자 p75(DFS70)
U95740 362G6.1
U97188 추정 RNA 결합 단백질 KOC
X06745 DNA 폴리머라제 알파 서브유니트
X13482 U2 snRNP-특이적 A 단백질
X51956 뉴런 특이적 (감마) 에놀라제
X53587 인테그린 베타-4
X54199 GARS-AIRS-GART
X54867 NGK2-A
X59871 T 세포 인자 1
X61100 75 kDa 서브유니트 NADH 데하이드로게나제 전구체
X66364 세린/트레오닌 단백질 키나제 PSSALRE
X68836 S-아데노실메티오닌 신세타제
X70476 코아토머 복합체의 서브유니트
X75535 PxF
등록번호 유전자명
X81003 HCG V
X84740 DNA 리가제 Ⅲ
X94754 효모 메티오닐-tRNA 신세타제 동족체
X98248 소르틸린
X99209 아르기닌 메틸트랜스퍼라제
Y08612 Nup88
Y08682 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제형 Ⅰ
Y13115 세린/트레오닌 단백질 키나제 SAK
Z11518 히스티딜-tRNA 신세타제
Z17227 막관통 수용체 단백질 CRF2-4
Z46629 SOX9
Z68747 이모겐 38
표 1 및 표 2에 나타낸 유전자에 관하여, E7070 내성주 2개의 세포주(C9-C1 및 C9-C1과 동일한 방법에 의해 수득된 별도의 내성주(C9-C4))를 사용하여, 상기와 같이 8μM의 E7070으로 12시간 동안 처리한 후에, 유전자의 변동을 유전자 칩에 의해 해석한다. 그 결과, 1.8배 이상 발현이 증가 또는 감소하는 유전자는 2개의 세포주에서 확인되지 않았다.
이상의 결과로부터, 이러한 3종의 항암제 처리에 의해 공통적으로 변동하는 유전자는 단독 또는 조합으로 그 변화를 측정함으로써 E7070 및 관련 화합물의 항종양 효과의 대리 마커로서 사용할 수 있는 것이 분명하다.
[실시예 3] 정량적 PCR에 의한 유전자 발현 해석
실시예 2에서 수득된 유전자의 발현 변동이, 종양 세포의 E7070에 대한 감수성을 반영한 것임을 확인할 목적으로, 실시예 1에 나타낸 RNA를 사용하여, E7070 감수성 세포와 내성 세포에서의 이러한 유전자 발현의 변화를 SYBR 그린과 ABI 프리즘 7700 서열 검출 시스템(Perkin-Elmer Applied Biosystems)을 사용한 정량적 PCR에 의해 검토한다.
조작은 역전사 반응 및 PCR 반응의 2단계로 실시한다. 처음 단계인 역전사 반응은, 1㎍의 전체 RNA에 1x TaqMan RT 완충액, 5.5mM MgCl2, 500μM의 dNTP 혼합물, 2.5μM 올리고 d(T)16프라이머, 0.4U/㎕ RNase 억제제, 1.25U/㎕ 다중전사 역전사 효소(Perkin-Elmer Applied Biosystems)를 가하여, 25℃에서 10분 동안 보온한 후, 48℃에서 30분 동안 가열함으로써 실시한다. 반응을 95℃에서 5분 동안 가열함으로써 정지시킨다.
수득된 cDNA를 제2단계의 PCR 반응에 사용한다. PCR 반응은 4 ng cDNA, 1xSYBR PCR 완충액, 3mM MgCl2, 각 200μM dATP, dCTP, dGTP, 400μM dUTP, 200nM 프라이머 대, 0.01U/㎕ AmpErase UNG, 0.025U/㎕ 앰플리타크 골드 DNA 폴리머라제(Perkin-Elmer Applied Biosystems)의 반응계에서 실시한다. 반응조건은 50℃에서 2분간, 95℃에서 10분간에 이어 95℃에서 20초간· 55℃에서 20초간·72℃에서 30초간을 40사이클로 실시한다. 프라이머는, GAPDH에 대해 서열 1 및 2, S80343에 대해 서열 3 및 4, U07919에 대해 서열 5 및 6, U11791에 대해 서열 7 및 8, M95809에 대해 서열 9 및 10, U18291에 대해 서열 11 및 12, U63743에 대해 서열 13 및 14, M61764에 대해 서열 15 및 16에 나타낸 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 사용한다.
각 검체 중의 mRNA량은 형광 강도를 측정함으로써 정량한다. 또한, 복수검체의 비교에서는, 정량치를 각 검체의 GAPDH의 mRNA량에 의해 보정하여 실시한다. 약제 처리 0시간에서의 정량치를 대조군(100%)으로 하여, 약제 처리 시간과 각 mRNA량의 관계를 나타낸 것이 도 2 내지 도 5이다. 각 유전자는 감수성이 가장 높은 HCT116-C9에서 최대의 발현 변동을 나타내며(도 2), 감수성주 LX-1에서는 HCT116-C9보다는 변동의 폭은 작지만, S80343를 제외한 모든 유전자에서 발현 변동을 나타낸다(도 3). 이것에 대하여 내성주 HCT116-C9-C1에서는, 전혀 발현 변동이 확인되지 않으며 (도 4), 실험에 사용한 8μM의 약제 농도에서 다소의 증식 억제 효과가 확인되는 내성주 LX-1-E2에서는, U11791이 발현 변동을 나타내며 M95809 및 U18291에 약간의 발현 변동이 확인된다(도 5).
실시예 2에서 나타낸 유전자의 발현 변동은 E7070에 대한 감수성과 관계가 있으며, 실시예 2에서 나타낸 유전자는 단독 또는 조합으로 이의 변화를 측정함으로써 E7070 및 관련 화합물의 항종양 효과의 대리 마커로서 사용할 수 있는 것이 확인된다.
[실시예 4] ELISA에 의한 해석
실시예 2의 표 2에 나타낸 유전자 중, 세포 밖으로 분비되는 것이 보고되어 있는 X51956(뉴런 특이적(감마) 에놀라제에 대한 사람 EN02)에 관해서 이미 보고되어 있는 ELISA법[참조: Duncan M.E., McAleese S.M., Booth N.A., Melvin W.T., and Fothergill J.E., J.of Immunol. Methods, 151, 227-236, 1992, Yamaguchi K., Aoyagi K., Urakami K., Fukutani T., Maki N., Yamamoto S., Otsubo K., MiyakeY., and Kodama T., Jpn. J. Cancer Res.,86, 698-705, 1995]에 의해 이의 발현 수준을 검토한다. 실제 측정에는 에이켄카가쿠(동경)의 NSE ELISA 키트를 사용하며, 조작은 첨부된 자료에 따른다.
[실시예 5] 3개의 암종에서의 유전자 발현 해석
HCT116-C9(사람 대장암 세포주), MDA-MB-435(사람 유방암 세포주) 및 MOLT-4(사람 T 림파 아구계 백혈병 세포주)의 3개의 암종에 관해서, 실시예 2와 동일하게 하여, E7070(8μM에서 12시간 처리)에 의한 유전자 발현 변화를 유전자 칩을 사용하여 조사한다.
3개의 암종에서 공통적으로 1.8배 이상 발현이 항진되는 유전자의 리스트를 표 3에 나타낸다. 또한, 3암종에서 공통적으로 1.8배 이상 발현이 억제되는 유전자의 리스트를 표 4에 나타낸다. 유전적 배경이 전혀 다른 암 환자로부터 수립된 이들 3개의 암종에서 공통적으로 발현이 변동(항진 또는 감소)되는 유전자는 종양 세포에 공통적인 E7070의 항종양 작용 메카니즘에 보다 깊이 관계하고 있을 가능성이 높기 때문에, 종양 세포의 E7070 및 관련 화합물에 대한 감수성을 검정할 때에 유효한 마커가 될 수 있다고 생각된다.
등록번호 유전자명
D78514 유비퀴틴 결합 효소
D83767 Rep-8
HG1139-HT4910 Fk506-결합 단백질
HG3484-HT3678 Cdc형 키나제 1(Clk1)
M21154 S-아데노실메티오닌 데카복실라제
M60724 p70 리보솜 S6 키나제 알파-1
S61953 c-ErbB3 수용체 티로신 키나제
U52960 RNA 폴리머라제 Ⅱ복합 성분 SRB7
U84720 수송 단백질 RAE1
U92014 결함 마리너 트랜스포존 Hsmar2
등록번호 유전자명
AB000409 세린/트레오닌 단백질 키나제 MNK1
AB000450 추정 세린/트레오닌 단백질 키나제 VRK2
AC002045 CIT987SK-A-589H1
AF008445 인지질 스크램블라제
D00723 수소 전달 단백질, 글라이신 신타제
D14659 KIAA0103
D21852 KIAA0029
D26535 디하이드롤리포아미드 숙시닐트랜스퍼라제
D32002 핵 캡 결합 단백질
D38521 KIAA0077
D38553 KIAA0074
D43947 KIAA0100
D50912 RNA-결합 모티프 단백질 10
D61391 PAP39
D63480 KIAA0146
D63880 KIAA0159
D78586 다작용성 단백질 CAD
D79983 KIAA0161
D79991 KIAA0169
D83781 KIAA0197
D84307 포스포에탄올아민 시티딜릴트랜스퍼라제
D87446 KIAA0257
HG1869-HT1904 남성 항진 항원
HG2379-HT3996 세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제, 세포질
HG4094-HT4364 전사 인자 Lsf-ld
J04088 DNA 토포이소머라제 Ⅱ(top2)
L07758 IEF SSP 9502
L21936 숙시네이트 데하이드로게나제 플라보단백질 서브유니트
L25931 라민 B 수용체
L38810 프로테아솜 26S 서브유니트 p45
L41870 망막아세포종 감수성 단백질(RB1)
L47276 알파 토포이소머라제 절단 형태
M19267 트로포미오신
M22632 미토콘드리아 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제
M29204 DNA-결합 인자
M29550 칼시네우린 A1
M30496 유비퀴틴 카복실 말단 하이드롤라제
M34309 상피 성장 인자 수용체 HER3
M55905 미토콘드리아 NAD(P)+의존성 말릭 효소
M61764 감마-투불린
M85085 절단 자극 인자
M87338 복제 인자 C, 40-kDa 서브유니트(A1)
등록번호 유전자명
M91432 중쇄 아실-CoA 데하이드로게나제(MCAD)
M92439 류신 풍부 단백질
M93056 단핵구/호중구 엘라스타제 억제제
M95809 기본 전사 인자 62kD 서브유니트(BTF2)
M97935 전사 인자 ISGF-3
S72904 APK1 항원=MAb KI 인지됨
S78085 PDCD2, Rp8 동족체
U01062 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트 수용체형 3
U07231 G-풍부 서열 인자-1
U08815 스플라이솜 단백질 SAP61
U11791 사이클린 H
U15306 DNA-결합 단백질 NFX1
U18291 CDC16Hs
U18934 수용체 티로신 키나제 DTK
U20979 염색질 어셈블리 인자-Ⅰp150 서브유니트
U22233 메틸티오아데노신 포스포릴라제
U23028 진핵 세포 개시 인자 2B-엡실론
U23946 LUCA 15
U28831 항-PTH Ab와의 면역 반응
U28963 Gps2
U30828 스플라이싱 인자 SRp55-2(SRp55)
U34683 글루타치온 신세타제
U40282 인테그린 연결 키나제
U49844 FRAP-관련 단백질(FRP1/ATR)
U50939 아밀로이드 전구 단백질 결합 단백질 1
U57629 망막염 색소 GTPase 조절인자
U61145 zeste 동족체 2의 인핸서
U72514 C2f
U77413 O 연결 GlcNAc 트랜스퍼라제
U77949 Cdc6 관련 단백질(HsCDC6)
U79241 클론 23759
U80034 미토콘드리아 중간체 펩티다제 전구체
U81554 CaM 키나제 Ⅱ이소폼
U89606 피리독살 키나제
U94319 전사 보조활성화 인자 p75(DFS70)
X06745 DNA 폴리머라제 알파 서브유니트
X13482 U2 snRNP 특이적 A 단백질
X51956 뉴런 특이적 (감마) 에놀라제
X54199 GARS-AIRS-GART
X61100 75 kDa 서브유니트 NADH 데하이드로게나제 전구체
X68836 S-아데노실메티오닌 신세타제
X70476 코아토머 복합체의 서브유니트
등록번호 유전자명
X75535 PxF
X99209 아르기닌 메틸트랜스퍼라제
Y08612 Nup88
Y08682 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제형 Ⅰ
Z17227 막관통 수용체 단백질 CRF2-4
본 발명의 과제는 종양 세포에 E7070 및 이의 관련 화합물을 작용시켰을 경우에 당해 화합물의 항종양 효과의 대리 마커를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 E7070 및 이의 관련 화합물을 이들 항암제에 대하여 감수성인 종양 세포에 작용시켰을 때에 야기되는 유전자 발현의 변화를 DNA 마이크로 어레이법으로 해석하여, 이들 항암제에 의해 공통으로 나타나는 유전자 발현의 변화를 밝혀냈다.
또한, 이러한 유전자 중에는 3개의 암종에 공통된 발현의 변화를 나타내는 것이 있는 것을 밝혀내고, 이들 유전자의 발현 변화가 E7070 및 이의 관련 화합물의 항종양 효과의 대리 마커로서 사용할 수 있는 것을 밝혀내고, 본 발명을 완성시킨다.
즉, 본 발명은 하기의 방법을 제공한다:
1. 1) 화학식Ⅰ의 항암제를 투여한 암 환자로부터 추출된 종양 세포의, 표 3 및 표 4에 기재된 유전자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 또는 복수개 유전자의 발현량을 측정하고,
2) 당해 암 환자에게서 항암제 투여 전에 추출된 종양 세포와 비교하여, 표 3에 기재된 유전자의 발현량이 증가하거나 표 4에 기재된 유전자의 발현량이 감소되는 경우에, 당해 종양 세포가 당해 항암제에 대하여 감수성이라고 판정하는 공정을 포함하여 이루어지는 당해 종양 세포의 당해 항암제에 대한 감수성을 검정하는 방법.
상기식에서,
A는 치환체를 가질 수 있는 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 방향족 환이고,
B는 치환체를 가질 수 있는 불포화 6원 탄화수소 환 또는 헤테로원자로서 질소 원자를 1개 포함하는 불포화 6원 헤테로사이클릭 환이고,
C는 치환체를 가질 수 있는 질소 원자를 1 또는 2개 포함하는 5원 헤테로사이클릭 환이고,
W는 단일결합 또는 -CH=CH-이고,
X는 -N(R1)- 또는 산소 원자이고,
Y는 탄소 원자 또는 질소 원자이고,
Z는 -N(R2)- 또는 질소 원자이고,
R1및 R2는 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 저급 알킬 그룹이다.
2. 1) 암 환자로부터 취출된 종양 세포에 화학식Ⅰ의 항암제를 작용시키고,
2) 당해 종양 세포의 표 3 및 표 4에 기재된 유전자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 또는 복수개 유전자의 발현량을 측정하고,
3) 무처리의 종양 세포와 비교하여, 표 3에 기재된 유전자의 발현량이 증가하거나 표 4에 기재된 유전자의 발현량이 감소하는 경우에, 당해 종양 세포가 당해 항암제에 대하여 감수성이라고 판정하는 공정을 포함하여 이루어지는 당해 종양 세포의 당해 항암제에 대한 감수성을 검정하는 방법.
화학식 Ⅰ
상기식에서,
A는 치환체를 가질 수 있는 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 방향족 환이고,
B는 치환체를 가질 수 있는 불포화 6원 탄화수소 환 또는 헤테로원자로서 질소 원자를 1개 포함하는 불포화 6원 헤테로사이클릭 환이고,
C는 치환체를 가질 수 있는 질소 원자를 1 또는 2개 포함하는 5원 헤테로사이클릭 환이고,
W는 단일결합 또는 -CH=CH-이고,
X는 -N(R1)- 또는 산소 원자이고,
Y는 탄소 원자 또는 질소 원자이고,
Z는 -N(R2)- 또는 질소 원자이고,
R1및 R2는 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 저급 알킬 그룹이다.
3. 1 또는 2에 있어서, 유전자의 발현량 측정을, 당해 유전자의 전사 산물인 RNA를 DNA 마이크로 어레이에 의해 정량함으로써 수행하는 방법.
4. 1 또는 2에 있어서, 유전자의 발현량 측정을, 당해 유전자의 전사 산물인 RNA를 정량적 PCR에 의해 정량함으로써 수행하는 방법.
5. 4에 따르는 방법에 사용하기 위한 당해 RNA에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 구성 요소로서 포함하는 RNA의 정량 시약.
6. 1 또는 2에 있어서, 유전자의 발현량 측정을, 당해 유전자의 유전자 산물인 단백질을 면역 화학적 방법에 의해 정량함으로써 수행하는 방법.
7. 6에 있어서, 유전자의 발현량 측정을, 당해 유전자의 유전자 산물인 단백질을 ELISA에 의해 정량함으로써 수행하는 방법.
8. 6에 있어서, 유전자의 발현량 측정을, 당해 유전자의 유전자 산물인 단백질을 웨스턴 블로팅(western blotting)에 의해 정량함으로써 수행하는 방법.
9. 6에 따르는 방법에 사용하기 위한 당해 단백질에 대한 항체를 구성 요소로서 포함하는 면역 측정 시약.
10. 1 또는 2에 있어서, A가 치환체를 가질 수 있는 벤젠 또는 피리딘이며, B가 치환체를 가질 수 있는 벤젠이며, C가 치환체를 가질 수 있는 피롤이며, W가 단일결합이고, 또한 X 및 Z가 모두 -NH-인 방법.
본 발명에 의해, 화학식 Ⅰ의 항암제를 투여한 암 환자로부터 추출된 종양 세포의 표 3 및 표 4에 기재된 유전자 발현량을 측정함으로써, 또는 암 환자로부터 추출된 종양 세포에 화학식 Ⅰ의 항암제를 작용시켜, 표 3 및 표 4에 기재된 유전자의 발현량을 측정함으로써, 당해 종양 세포의 당해 항암제에 대한 감수성을 조사하는 것이 가능해진다.

Claims (10)

1) 화학식Ⅰ의 항암제를 투여한 암 환자로부터 추출된 종양 세포의 표 3 및 표 4에 기재된 유전자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 또는 복수개 유전자의 발현량을 측정하고,
2) 당해 암 환자로부터 항암제 투여 전에 추출한 종양 세포와 비교하여, 표 3에 기재된 유전자의 발현량이 증가하거나 표 4에 기재된 유전자의 발현량이 감소하는 경우에, 당해 종양 세포가 당해 항암제에 대하여 감수성이라고 판정하는 공정을 포함하여, 당해 종양 세포의 당해 항암제에 대한 감수성을 검정하는 방법.
화학식 Ⅰ
상기식에서,
A는 치환체를 가질 수 있는 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 방향족 환이고,
B는 치환체를 가질 수 있는 6원 불포화 탄화수소 환 또는 헤테로원자로서 질소 원자를 1개 포함하는 불포화 6원 헤테로사이클릭 환이고,
C는 치환체를 가질 수 있는 질소 원자를 1 또는 2개 포함하는 5원 헤테로사이클릭 환이고,
W는 단일결합 또는 -CH=CH-이고,
X는 -N(R1)- 또는 산소 원자이고,
Y는 탄소 원자 또는 질소 원자이고,
Z는 -N(R2)- 또는 질소 원자이고,
R1및 R2은 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 저급 알킬 그룹이다.
1) 암 환자로부터 추출된 종양 세포에 화학식 Ⅰ의 항암제를 작용시키고,
2) 당해 종양 세포의, 표 3 및 표 4에 기재된 유전자로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1개 또는 복수개 유전자의 발현량을 측정하며,
3) 무처리의 종양 세포와 비교하여, 표 3에 기재된 유전자의 발현량이 증가하거나 표 4에 기재된 유전자의 발현량이 감소하는 경우에, 당해 종양 세포가 당해 항암제에 대해 감수성이라고 판정하는 공정을 포함하여, 당해 종양 세포의 당해 항암제에 대한 감수성을 검정하는 방법.
화학식 Ⅰ
상기식에서,
A는 치환체를 가질 수 있는 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 방향족 환이고,
B는 치환체를 가질 수 있는 6원 불포화 탄화수소 환 또는 헤테로원자로서 질소 원자를 1개 포함하는 불포화 6원 헤테로사이클릭 환이고,
C는 치환체를 가질 수 있는 질소 원자를 1 또는 2개 포함하는 5원 헤테로사이클릭 환이고,
W는 단일결합 또는 -CH=CH-이고,
X는 -N(R1)- 또는 산소 원자이고,
Y는 탄소 원자 또는 질소 원자이고,
Z는 -N(R2)- 또는 질소 원자이고,
R1및 R2은 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 저급 알킬 그룹이다.
제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자의 발현량 측정을, 당해 유전자 전사 산물인 RNA를 DNA 마이크로 어레이에 의해 정량함으로써 수행하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자의 발현량 측정을, 당해 유전자의 전사 산물인 RNA를 정량적 PCR에 의해 정량함으로써 수행하는 방법.
제4항에 따르는 방법에 사용하기 위한 당해 RNA에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 구성요소로서 함유하는 RNA의 정량 시약.
제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자의 발현량 측정을, 당해 유전자의 유전자산물인 단백질을 면역 화학적 방법에 의해 정량함으로써 수행하는 방법.
제6항에 있어서, 유전자의 발현량 측정을, 당해 유전자의 유전자 산물인 단백질을 ELISA에 의해 정량함으로써 수행하는 방법.
제6항에 있어서, 유전자의 발현량 측정을, 당해 유전자의 유전자 산물인 단백질을 웨스턴 블로팅에 의해 정량함으로써 수행하는 방법.
제6항에 따르는 방법에 사용하기 위한 당해 단백질에 대한 항체를 구성 요소로서 함유하는 면역 측정 시약.
제1항 또는 제2항에 있어서, A가 치환체를 가질 수 있는 벤젠 또는 피리딘이며, B가 치환체를 가질 수 있는 벤젠이며, C가 치환체를 가질 수 있는 피롤이며, W가 단일결합이며, 또한 X 및 Z가 모두 -NH-인 방법.
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