CN113549696B

CN113549696B - 肿瘤标志物sorcs2及其应用

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Publication number: CN113549696B
Application number: CN202111114672.1A
Authority: CN
Inventors: 崔书中; 曾丽斯; 杨贤盛; 田云; 温俊财; 杨贤子; 唐鸿生; 雷子颖; 刘高杰; 阮强; 廖权星; 董海霞
Original assignee: Cancer Center of Guangzhou Medical University
Current assignee: Cancer Center of Guangzhou Medical University
Priority date: 2021-09-23
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2041-09-23
Also published as: CN113549696A

Abstract

本发明提供了一种肿瘤标志物SORCS2及其应用，属于生物医药技术领域。本发明首次发现SORCS2基因的表达与胃癌有关，SORCS2基因有望作为胃癌预后的标记物，并为研究胃癌的发生、发展、预后的分子机理提供新的思路，具有重要的临床应用价值；且其在胃癌中具有重要的调控作用，可作为胃癌热疗增敏标记物，为腹腔热灌注化疗发挥更佳治疗效果，有利于指导胃癌的治疗及预后；同时，SORCS2基因表达与肿瘤恶化程度呈正相关，SORCS2基因也可作为新的胃癌治疗靶点，为胃癌治疗药物的开发提供了新的方向。

Description

肿瘤标志物SORCS2及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种肿瘤标志物SORCS2及其应用。

背景技术

肿瘤（tumour）是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物（neogrowth），根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。恶性肿瘤可分为癌和肉瘤，癌是指来源于上皮组织的恶性肿瘤，肉瘤是指间叶组织，包括纤维结缔组织、脂肪、肌肉、脉管、骨和软骨组织等，发生的恶性肿瘤，如由大肠黏膜上皮形成的恶性肿瘤称为大肠黏膜上皮癌，简称大肠癌，由皮肤上皮形成的称皮肤上皮癌，简称皮肤癌等等。肿瘤在发生进展的过程中形成了特殊的生物学功能，包括无限增殖，对生长抑制基因的逃避，细胞凋亡抑制，诱导血管生成及激活侵袭与转移等。在这些生物学特征形成的过程中，相关编码基因扮演着重要的角色。

良性肿瘤与恶性肿瘤临床表现不一。良性肿瘤一般生长缓慢，有包膜，膨胀性生长，其边界清楚，不专一，预后一般良好，有局部的压迫症状，无全身症状。而恶性肿瘤生长迅速，侵袭性生长，与周围组织黏连，边界不清，易发生转移，治疗后易复发，且在早期即有可能发生低热、食欲差、体重下降，晚期出现严重消瘦、贫血、发热等症状，不及时治疗，常导致死亡。

胃癌（gastric cancer,GC）是指源自胃粘膜、结缔组织、神经内分泌组织或淋巴组织的恶性肿瘤，是全世界最常见的癌症之一。其病因包括：（1）地域环境及饮食生活因素：长期食用熏烤、盐腌食品的人群中胃远端癌发病率高，与食品中亚硝酸盐、真菌毒素、多环芳烃化合物等致癌物或前致癌物含量高有关，吸烟者的胃癌发病危险较不吸烟者高50%；（2）幽门螺杆菌（Hp）感染：幽门螺杆菌能促使硝酸盐转化成亚硝酸盐及亚硝胺而致癌，Hp感染引起胃黏膜慢性炎症加上环境致病因素加速黏膜上皮细胞的过度增殖，导致畸变致癌，幽门螺杆菌的毒性产物CagA、VacA可能具有促癌作用，胃癌患者中抗CagA抗体检出率较一般人群明显为高；（3）癌前病变：胃疾病包括胃息肉、慢性萎缩性胃炎及胃部分切除后的残胃，这些病变都可能伴有不同程度的慢性炎症过程、胃黏膜肠上皮化生或非典型增生，有可能转变为癌，癌前病变系指容易发生癌变的胃黏膜病理组织学改变，是从良性上皮组织转变成癌过程中的交界性病理变化，胃黏膜上皮的异型增生属于癌前病变，根据细胞的异型程度，可分为轻、中、重三度，重度异型增生与分化较好的早期胃癌有时很难区分；（4）遗传和基因：遗传与分子生物学研究表明，胃癌患者有血缘关系的亲属其胃癌发病率较对照组高4倍，胃癌的癌变是一个多因素、多步骤、多阶段发展过程，涉及癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因与转移相关基因等的改变，而基因改变的形式也是多种多样的。最新统计数据表明，胃癌的发病率居全球第五位，死亡率居第四位。胃癌早期症状不典型，多表现为上腹部不适，进食后饱胀恶心等非特异性的上消化道症状，胃窦癌者可出现类似十二指肠溃疡的症状。病情进展后期出现上腹疼痛加剧，食欲下降，乏力，消瘦，体重减轻等恶病质症状，亦可有呕血、黑便等。由于胃癌早期症状不典型，确诊时往往伴有远处转移，如肝、肺、胰、骨以及腹膜等。

胃癌的检查可通过以下方式进行：（1）X线钡餐检查：数字化X线胃肠造影技术的应用，目前仍为诊断胃癌的常用方法，常采用气钡双重造影，通过黏膜相和充盈相的观察作出诊断，早期胃癌的主要改变为黏膜相异常，进展期胃癌的形态与胃癌大体分型基本一致；（2）纤维胃镜检查：直接观察胃黏膜病变的部位和范围，并可获取病变组织作病理学检查，是诊断胃癌的最有效方法，采用带超声探头的纤维胃镜，对病变区域进行超声探测成像，有助于了解肿瘤浸润深度以及周围脏器和淋巴结有无侵犯和转移；（3）腹部超声：在胃癌诊断中，腹部超声主要用于观察胃的邻近脏器（特别是肝、胰）受浸润及淋巴结转移的情况；（4）螺旋CT与正电子发射成像检查：多排螺旋CT扫描结合三维立体重建和模拟内腔镜技术，是一种新型无创检查手段，有助于胃癌的诊断和术前临床分期，利用胃癌组织对于氟和脱氧-D-葡萄糖（FDG）的亲和性，采用正电子发射成像技术（PET）可以判断淋巴结与远处转移病灶情况，准确性较高；（5）肿瘤标记物：血清CEA、CA50、CA72-4、CA19-9等肿瘤相关抗原可升高，但敏感性和特异性均不高，有助于判别肿瘤的预后及化疗的疗效。

传统的治疗方法包括手术、放疗、化疗以及靶向治疗等。尽管人类对胃癌的诊治已经取得了长足进展，但是胃癌患者预后仍然较差，特别是发生腹膜转移的患者。胃癌根治术、化疗以及其他治疗方法均无法完全清除腹腔游离癌细胞，达到根治腹膜转移灶的治疗效果。腹腔热灌注化疗（hyperthermia intraperitoneal chemotherapy，HIPEC）是国内外公认的推荐治疗方法，可显著提高胃癌患者中位生存期6.7个月，5年OS率提高13.44%。HIPEC是将化疗药物与43℃热疗联合，循环灌入腹腔，起到协同杀灭肿瘤细胞的作用。然而，临床上部分胃癌患者HIPEC疗效甚微，或者经HIPEC治疗后短期内即出现腹膜肿瘤复发，这是由于肿瘤组织出现了热适应性及抵抗性，阻碍了HIPEC发挥热化疗的治疗效果。

专利CN102628080A公开了一种PCDH17基因在胃癌及结直肠癌中的应用，一方面，该基因可作为胃癌和结直肠癌早期诊断的标志物，有利于胃癌和结直肠癌的早期监测和预防；另一方面，该基因可作为胃癌和结直肠癌化学治疗敏感性检测的新靶点，有利于指导胃癌和结直肠癌的化学治疗。专利CN111893112A则公开了一种胃癌肿瘤标志物，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，还提供了一对上述胃癌肿瘤标志物的检测引物对及其应用，其所述的胃癌肿瘤标志物能够使得胃癌诊断简便准确快速，提高胃癌早期诊断水平，适于大规模推广应用。

SORCS2（sortilin-related VPS10 domain containing receptor 2）是Vps10p蛋白家族成员，其共同特征是蛋白的末端都有一个以Vps10p为生物学标志的结构域，这个家族包括共Sortilin、SORCS1、SORCS2、SORCS3和SorLA（Hermey,2009）5个成员。在蛋白的运输、信号转导蛋白的运输、神经和非神经细胞的胞内或胞间信号调节，Vps10p都发挥着重要作用（Lane et al.,2012）。另一方面，Vps10p被报道与哺乳动物的神经疾病有关（Rezgaouiet al.,2001；Willnow et al.,2008）。SORCS2在发育或成熟的神经系统中皆高表达（Rezgaoui et al.,2001），与脑部疾病如精神病有关。SORCS2基因上部分位点（rs4411993,rs7683874和rs10937823）的变异会诱发躁郁症（Ollila etal.,2009）。最近的研究表明，SORCS2在大脑中多巴胺能的正确接线扮演着重要角色（Glerup et al.,2014）。它可以作为一种神经营养因子前体蛋白（proneurotrophin，proNT）受体，与p75NTR结合调节细胞的生长和凋亡。缺乏SORCS2或p75NTR的小鼠，额叶皮质的多巴胺水平会显著下降。

现有技术中关于调控胃癌热疗敏感性相关基因的研究较少，因此，进一步寻找并研究胃癌中调控热疗敏感性相关基因，为腹腔热灌注化疗发挥更佳治疗效果，已成为亟待解决的科学问题。

发明内容

针对上述不足，本发明提供了一种肿瘤标志物SORCS2及其应用。本发明首次发现SORCS2基因可以作为胃癌预后的标记物，有利于胃癌进程的检测、诊断及预后治疗；且其在胃癌中具有重要的调控作用，可作为胃癌热疗增敏标记物，为腹腔热灌注化疗发挥更佳治疗效果，有利于指导胃癌的治疗及预后。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种SORCS2基因在制备肿瘤预后检测产品中的应用。

具体地，所述的产品包含结合SORCS2的转录或翻译产物的检测试剂。

进一步具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。

进一步具体地，所述的产品包括但不限于基因检测试剂盒或蛋白表达检测试剂盒。

具体地，所述的肿瘤包括但不限于膀胱癌、胃癌、结肠和直肠癌、乳腺癌、食道癌、肺癌、淋巴瘤、胰腺癌或睾丸癌。

进一步具体地，所述的肿瘤为胃癌。

另一方面，本发明提供了一种肿瘤预后检测产品，所述的产品包含结合SORCS2的转录或翻译产物的检测试剂。

具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。

具体地，所述的产品包括但不限于基因检测试剂盒或蛋白表达检测试剂盒。

进一步具体地，所述的肿瘤为胃癌。

又一方面，本发明提供了SORCS2基因作为肿瘤预后检测新靶点的应用。

进一步具体地，所述的肿瘤为胃癌。

又一方面，本发明提供了SORCS2基因在制备肿瘤热增敏产品中的应用。

具体地，所述的产品包含结合SORCS2的转录或翻译产物的靶向试剂。

进一步具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片、药物或试剂盒。

进一步具体地，所述的肿瘤为胃癌。

又一方面，本发明提供了一种肿瘤热增敏产品，所述的产品包含结合SORCS2的转录或翻译产物的靶向试剂。

具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片、药物或试剂盒。

进一步具体地，所述的肿瘤为胃癌。

又一方面，本发明提供了SORCS2基因作为肿瘤治疗热增敏标记物的应用。

进一步具体地，所述的肿瘤为胃癌。

又一方面，本发明提供了SORCS2基因在制备治疗肿瘤药物中的应用。

具体地，所述的药物包含调控SORCS2基因的转录或翻译产物的试剂或化合物。

进一步具体地，所述的肿瘤为胃癌。

又一方面，本发明提供了一种肿瘤药物，所述的药物包含调控SORCS2基因的转录或翻译产物的试剂或化合物。

具体地，所述的药物还包含药学上可接受的载体，所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂中的任意一种或多种。

进一步具体地，所述的肿瘤为胃癌。

又一方面，本发明提供了SORCS2基因作为肿瘤调控分子的应用。

进一步具体地，所述的肿瘤为胃癌。

与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：

（1）本发明首次公开了SORCS2基因的表达与胃癌有关，SORCS2基因有望成为诊断胃癌的分子标志物，并为研究胃癌的发生、发展、预后的分子机理提供新的思路，具有重要的临床应用价值。

（2）本申请发现SORCS2基因在胃癌中具有重要的调控作用，可作为胃癌热疗增敏标记物，为腹腔热灌注化疗发挥更佳治疗效果，有利于指导胃癌的治疗及预后。

（3）本申请还发现SORCS2基因表达与肿瘤恶化程度呈正相关，SORCS2基因也可作为新的胃癌治疗靶点，为胃癌治疗药物的开发提供了新的方向。

附图说明

图1为免疫组织化学法检测SORCS2基因在胃癌中的表达检测结果图。

图2为AGS和MKN45细胞SORCS2基因干扰/过表达效率检测结果图。

图3为细胞热敏感性检测结果图。

图4为细胞增殖活性检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件（如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。

如本文中所使用的，单词“一个”、“一种”和“该/所述”，如无另外特别说明是指“至少一个”。

术语“分离的”和“纯化的”与物质（例如多肽、抗体、多核苷酸等）相关联使用时，指该物质基本上不含至少一种在天然来源中可包括的物质。例如，分离的或纯化的抗体指基本上不含细胞材料（例如来自所述蛋白质的细胞或组织来源的碳水化合物、脂质或其它污染性蛋白质）或者在化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品的抗体。术语“基本上不含细胞材料”包括多肽的制备物，其中所述多肽与细胞（该多肽是从该细胞分离或自该细胞重组制备的）的细胞组分是分离的。

例如，基本上不含细胞材料的多肽包括多肽制备物，其具有小于约30%、20%、10%或5%（以干重计）的异源蛋白质（或“污染蛋白质”）。在多肽以重组方式生成时，在一些实施方案中，它也基本上不含培养基，包括多肽的其中培养基小于蛋白质制备物体积的约20%、10%或5%的制备物。特定蛋白质制备物含有经分离或纯化的多肽，可以例如通过在蛋白质制备物的十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳和对凝胶进行考马斯亮蓝染色等处理后出现单一条带来示明。在一个实施方案中，包括本发明制备的蛋白质是分离的或纯化的。

“分离的”或“纯化的”核酸分子，例如cDNA分子，在通过重组技术生成时可以基本上不含其它细胞材料或培养基，或者在化学合成时可以基本上不含化学前体或其它化学品。在一个实施方案中，编码本发明蛋白质的核酸分子是分离的或纯化的。

术语“蛋白”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语不但适用于天然存在的氨基酸聚合物，还适用于其中一个或多个氨基酸残基是经修饰的残基或非天然存在的残基（例如，相应的天然存在氨基酸的人工化学模拟物）的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸相似地发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸以及那些在细胞中翻译后经修饰的氨基酸（例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸）)。短语“氨基酸类似物”指这样的化合物，其与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构（与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基），但具有经修饰的R基或经修饰的主链（例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸、亚砜、甲硫氨酸甲基硫）。短语“氨基酸模拟物”指与通用氨基酸具有不同结构但相似功能的化学化合物。

氨基酸在本文中可以通过其公知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会（Biochemical Nomenclature Commission）推荐的单字母符号提及。除非另有明确指明，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互换使用，并且与它们普遍接受的单字母密码所提及的氨基酸类似。与氨基酸类似，它们涵盖天然存在的和非天然存在的核酸聚合物两者。多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸、或核酸分子可以由DNA、RNA或其组合构成。

如本文中所使用的，术语“生物学样品”指整个生物体或其组织、细胞或构成部分（例如，体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊髓液、唾液、羊水、脐带血、尿、阴道液和精液）的亚组。“生物学样品”还指从整个生物体或其细胞、组织或构成部分的亚组制备的匀浆、裂解物、提取物、细胞培养物或组织培养物，或其级分或部分。最后，“生物学样品”指这样的培养基，例如培养过生物体的营养肉汤或凝胶，其含有细胞组分，例如蛋白质或多核苷酸。

人SORCS2基因的核苷酸序列可以通过GenBank登录号NC_000004.12获得。在本文中，短语“SORCS2基因”涵盖人SORCS2基因以及包括非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马和牛但不限于此的其它动物的SORCS2基因，并且包括等位突变体和与SORCS2基因对应的在其它动物中找到的基因。在本发明中，由SORCS2基因编码的多肽称为“SORCS2”，也可称为“SORCS2多肽”或“SORCS2蛋白”。

用于本方法的多肽或片段可以作为天然存在的蛋白通过常规纯化方法从自然界获得，或基于所选择的氨基酸序列通过化学合成获得。例如，可以用于合成的常规肽合成方法，包括：

（1）Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；

（2）The Proteins，第2卷，Academic Press，New York，1976；

（3）Peptide Synthesis(in Japanese)，Maruzen Co.，1975；

（4）Basics and Experiment of Peptide Synthesis(in Japanese)，MaruzenCo.，1985；

（5）Development of Pharmaceuticals(第二卷)(in Japanese)，第14卷(peptidesynthesis)，Hirokawa，1991；

（6）WO99/67288；及

（7）Barany G.和Merrifield R.B.，Peptides第2卷，“Solid PhasePeptideSynthesis”，Academic Press，New York，1980，100-118.

或者，可以采用生成多肽的任何已知基因工程方法来获得蛋白质（例如，MorrisonDA.等，J Bacteriol.1977年10月；132(1)：349-51；Clark-Curtiss JE和CurtissR 3rd.Methods Enzymol.1983；101：347-62）。例如，制备适合的载体，其包含可表达形式的（例如在调节序列包括启动子的下游）编码目的蛋白质的多核苷酸，转化入合适的宿主细胞中，然后培养宿主细胞以生成蛋白质。更具体地，通过将基因插入表达外来基因的载体，例如，pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3.1、pCAGGS或pCD8中在宿主（例如动物）细胞等中表达编码SORCS2蛋白的基因。

启动子可以用于表达。可以采用任何常用的启动子，包括例如SV40早期启动子（Rigby in Williamson(编)，Genetic engineering，第3卷Academic Press，London，1982，83-141）、EF-alpha启动子（Kim DW等Gene.1990年7月16日；91(2)：217-23）、CAG启动子（Niwa H等，Gene.1991年12月15日；108(2)：193-9）、RSV LTR启动子（CullenBR.MethodsEnzymol.1987；152：684-704）、SR alpha启动子（Takebe Y等，Mol CellBiol.1988年1月；8(1)：466-72）、CMV立即早期启动子（Seed B和Aruffo A.Proc Natl AcadSciUSA.1987年5月；84(10)：3365-9）、SV40晚期启动子（Gheysen D和Fiers W.JMol ApplGenet.1982；1(5)：385-94）、腺病毒晚期启动子（Kaufman RJ等，Mol Cell Biol.1989年3月；9(3)：946-58）、HSV TK启动子等等。

可以根据任何方法将载体导入宿主细胞中以表达SORCS2基因，例如，电穿孔法（Chu G等，Nucleic Acids Res.1987年2月11日；15(3)：1311-26）、磷酸钙法（Chen C和Okayama H.Mol Cell Biol.1987年8月；7(8)：2745-52）、DEAE右旋糖苷法（Lopata MA等，Nucleic Acids Res.1984年7月25日；12(14)：5707-17；Sussman DJ和Milman G.MolCellBiol.1984年8月；4(8)：1641-3）、Lipofectin法（Derijard B等，Cell.1994年3月25日；76(6)：1025-37；Lamb BT等，Nat Genet.1993年9月；5(1)：22-30；Rabindran SK等，Science.1993年1月8日；259(5092)：230-4）等等。

也可以采用体外翻译系统在体外生成SORCS2蛋白。在本发明的上下文中，短语“SORCS2基因”涵盖编码人SORCS2基因或人SORCS2基因的任何功能等同物的多核苷酸。

SORCS2基因可以作为天然存在的蛋白质通过常规克隆方法从自然界获得，或基于所选择的核苷酸序列通过化学合成获得。采用cDNA文库等克隆基因的方法在本领域中是公知的。

除非另有明确指明，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用，通过其通常所接受的单字母密码来指称。该术语适用于这样的核酸（核苷酸）聚合物，其中一个或多个核酸通过酯键合连接。多核苷酸或寡核苷酸可以由DNA、RNA或其组合构成。

如本文中所使用的，术语“分离的双链分子”指抑制靶基因表达的核酸分子，包括例如，短干扰RNA（siRNA；例如双链核糖核酸（dsRNA）或小发夹RNA（shRNA））和短干扰DNA/RNA（siD/R-NA；例如DNA和RNA的双链嵌合体（dsD/R-NA）或DNA和RNA的小发夹嵌合体（shD/R-NA））。

如本文中所使用的，术语“siRNA”指阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。使用将siRNA导入细胞中的标准技术，包括用DNA作为RNA转录模板的那些技术。siRNA包括与SORCS2基因有义核酸序列对应的核糖核苷酸（也称为“有义链”）、与SORCS2基因反义核酸序列对应的核糖核苷酸（也称为“反义链”）或这两者。siRNA可以这样构建，使单个转录物同时具有靶基因的有义核酸序列和互补的反义核酸序列，例如发夹。siRNA可以是dsRNA或shRNA。如本文中所使用的，术语“dsRNA”是指两个RNA分子的构建体，这两个RNA分子含有彼此互补的序列，并且通过所述互补序列退火在一起形成双链RNA分子。两条链的序列不仅可以包括选自靶基因序列的蛋白质编码序列的“有义”或“反义”RNA，还包括具有选自靶基因非编码区的核苷酸序列的RNA分子。

如本文中所使用的，术语“shRNA”是指具有茎-环结构的siRNA，其包含彼此互补的第一区和第二区，即有义链和反义链。区的互补程度和方向足以使该区之间发生碱基配对，所述第一区和第二区通过环区连接，所述环是由于环区内的核苷酸（或核苷酸类似物）之间缺乏碱基配对而形成的。shRNA的环区是介于有义和反义链之间的单链区，并且也可以称为“居间单链”。

如本文中所使用的，术语“siD/R-NA”是指由RNA和DNA两者组成的双链分子，并且包括RNA和DNA的杂合体和嵌合体，而且阻止靶mRNA的翻译。在本文中，杂合体指明这样的分子，其中由DNA组成的寡核苷酸和由RNA组成的寡核苷酸相互杂交以形成双链分子；而嵌合体指明组成双链分子的一条或两条链可以同时含有RNA和DNA。使用将siD/R-NA导入细胞中的标准技术。siD/R-NA包括SORCS2基因的有义核酸序列（也称为“有义链”）、SORCS2基因的反义核酸序列（也称为“反义链”）或这两者。siD/R-NA可以这样构建，使单个转录物同时具有来自靶基因的有义和互补的反义核酸序列，例如发夹。siD/R-NA可以是dsD/R-NA或shD/R-NA。

如本文中所使用的，术语“dsD/R-NA”是指这样两个分子的构建体，两个分子包含彼此互补的序列，并且通过所述互补序列退火在一起以形成双链多核苷酸分子。两条链的核苷酸序列可以不仅包括选自靶基因序列的蛋白编码序列的“有义”或“反义”多核苷酸序列，还可以包括具有选自靶基因非编码区核苷酸序列的多核苷酸。组成dsD/R-NA的两个分子中的一个或两个是由RNA和DNA组成（嵌合分子），或者其中一个分子由RNA组成而另一个分子由DNA组成（杂合双链）。

如本文中所使用的，术语“shD/R-NA”是指具有茎-环结构的siD/R-NA，其包含彼此互补的第一区和第二区，即有义链和反义链。所述区的互补程度和方向足以使该区之间发生碱基配对，第一区和第二区通过环区连接，所述环是由于环区内的核苷酸（或核苷酸类似物）之间缺乏碱基配对而形成的。shD/R-NA的环区是介于有义和反义链之间的单链区，并且也可以称为“居间单链”。

用于设计具有抑制细胞中的靶基因表达的能力的双链分子的方法是已知的。（参见，例如美国专利号6,506,559，以提述的方式将其全部内容并入本文中）。例如，可以从Ambion网站（在万维网上于ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html）获得用于设计siRNA的计算机程序。计算机程序根据下列方案选择双链分子的靶核苷酸序列。

靶位点的设计

（1）以转录物的AUG起始密码子开始，向下游扫描AA双核苷酸序列。记录每个AA的出现及3’邻近的19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点。Tuschl等建议避免针对5’和3’非翻译区（UTR）以及起始密码子邻近区域（75个碱基内）设计siRNA，因为这些区域可能更富含调节蛋白结合位点，而UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合。

（2）将潜在靶位点与合适的基因组数据库（人、小鼠、大鼠等）进行比较，并且将任何与其它编码序列显著同源的靶序列排除在考虑之外。主要使用BLAST，其可以在互联网ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/的NCBI服务器上找到（Altschul SF等，Nucleic AcidsRes.1997年9月1日；25(17)：3389-402）。

（3）选择合格的靶序列用于合成。通常沿着待评估的基因的长度选择几个靶序列。

本发明还包括含有一种或多种本文所述双链分子的载体和包含该载体的细胞。本发明的载体编码处于可表达形式本发明的双链分子。在本文中，短语“处于可表达形式”表示载体在导入细胞中时会表达该分子。在一个实施方案中，载体包括双链分子表达所必需的调控元件。本发明的此类载体可以用于生成本发明的双链分子，或直接作为用于治疗癌症的活性成分。

本发明的载体可以通过例如将含有靶序列的序列克隆到表达载体中，使得该序列以容许两条链都表达（通过DNA分子转录）的方式可操作连接于调节序列来生成（Lee NS等，Nat Biotechnol，2002年5月，20(5)：500-5）。例如，与mRNA反义的RNA分子由第一启动子（例如位于克隆序列3’末端侧翼的启动子序列）来转录，mRNA有义链的RNA分子由第二启动子（例如位于克隆序列5’末端侧翼的启动子序列）来转录。有义和反义链在体内杂交，产生用于基因沉默的双链分子构建体。或者，利用分别编码双链分子有义和反义链的两个载体构建体分别表达有义和反义链，接着形成双链分子构建体。此外，克隆的序列可以编码具有二级结构（例如发夹）的构建体；即，载体的单个转录物同时含有靶基因的有义和互补反义序列。

还可以对本发明的载体进行配置以实现在靶细胞基因组中的稳定插入（参见，例如Thomas KR和Capecchi MR，Cell 1987，51：503-12，关于同源重组盒载体的描述）。参见，例如Wolff等，Science 1990，247：1465-8；美国专利号5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647和WO98/04720。基于DNA的递送技术的例子包括“裸DNA”、辅助（布比卡因（bupivicaine）、聚合物、肽介导的）递送、阳离子脂质复合物以及颗粒介导（“基因枪”）或压力介导的递送（参见，例如美国专利号5,922,687）。

本发明的载体可以是例如病毒或细菌载体。表达载体的例子包括减毒病毒宿主，例如牛痘或禽痘（参见，例如美国专利号4,722,848）。此方法涉及使用痘苗病毒，例如作为表达编码双链分子的核苷酸序列的载体。在导入表达靶基因的细胞中后，重组痘苗病毒表达所述分子，并且由此抑制该细胞的增殖。可使用的载体的另一个例子包括卡介苗（BCG）。BCG载体在Stover等，Nature 1991，351：456-60中有描述。极其多种其它载体可用于双链分子的治疗性施用和生产；例子包括腺病毒载体和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）载体、脱毒的炭疽毒素载体等。参见，例如Shata等，MolMedToday 2000，6：66-71；Shedlock等，J Leukoc Biol 2000，68：793-806和Hipp等，InVivo2000，14：571-85。

通过使细胞与针对SORCS2基因的双链分子、表达该分子的载体或含有其的组合物相接触来抑制或过表达SORCS2基因以检测细胞的生长。进一步使所述细胞与转染剂接触。合适的转染剂在本领域是公知的。短语“抑制/促进细胞生长”表示与未暴露于该分子的细胞相比，细胞以较低/较高的速率增殖，或细胞生存力降低/升高。细胞生长可以通过本领域公知的方法来测定，例如采用MTT细胞增殖测定法。

根据本方法可以抑制任何类型细胞的生长，只要该细胞表达或过表达本发明双链分子的靶基因。例示性的细胞包括癌细胞。如此，可以通过施用至少一种本双链分子、至少一种表达至少一种所述分子的载体或至少一种含有至少一种所述分子的组合物，对患有或有风险患上SORCS2基因相关疾病的患者进行治疗。例如，根据本方法可以治疗癌症患者。癌症类型可以根据要诊断的肿瘤的特定类型，采用标准方法来鉴别。在一些实施方案中，通过RT-PCR、杂交或免疫测定法来检测SORCS2基因在患者来源的活组织检查物中的（过）表达，从而选择依照本发明方法治疗的患者。在一些实施方案中，在本发明处理前，通过本领域公知的方法来确认受试者来源的活检标本中SORCS2基因的表达情况，所述本领域公知的方法例如，免疫组织化学分析、杂交或RT-PCR等方法。

根据本发明的抑制或减少细胞生长并由此治疗癌症的方法，当施用多种针对本发明所述靶标的双链分子（或表达所述分子的载体、或含有所述分子的组合物）时，每个分子都可以针对相同基因的不同靶序列，或不同基因的不同靶序列。例如，该方法可以利用针对相同SORCS2基因转录物的不同双链分子。或者，例如，该方法可以利用针对选自相同SORCS2基因的一个、两个或多个靶序列的双链分子。

为了抑制细胞生长，可以将本发明的双链分子以实现该分子与对应的mRNA转录物的结合的形式直接导入细胞中。或者，如上文所述，可以将编码双链分子的DNA作为载体导入细胞中。为了将双链分子和载体导入细胞中，可以采用转染增强剂，例如FuGENE（Rochediagnostics）、Lipofectamine2000（Invitrogen）、Oligofectamine（Invitrogen）以及Nucleofector（Wako pure Chemical）。

如果治疗产生临床效益，例如，受试者中SORCS2基因的表达增多、或癌症尺寸减少、普遍性（prevalence）或转移潜力减小，则认为该治疗有效。当预防性地适用治疗时，“有效”表示其延缓或阻止癌症形成、或阻止或减轻癌症的临床症状。结合特定肿瘤类型的任何已知的诊断或治疗方法来确定有效性。

本领域技术人员在考虑一些因素，例如体重、年龄、性别、疾病类型、受试者的症状和其它条件；给药途径、以及是局部还是全身给药的基础上，能够容易地确定要向给定受试者施用的本发明双链分子的有效量。通常，本发明双链分子的有效量包括在癌症部位或其邻近约1纳摩尔（nM）至约100nM的胞内浓度，例如约2nM-约50nM，例如约2.5nM-约10nM。预想可以施用更多或更少量的双链分子。

本方法可以用于抑制癌症的生长或转移；例如，由SORCS2基因突变/缺失引起的癌症或由SORCS2基因介导的癌症，例如，胃癌。

为了治疗癌症，例如由SORCS2基因促进的癌症，还可以将本发明双链分子与不同于双链分子的作用剂联合施用给受试者。或者，可以将本发明双链分子与为治疗癌症所设计的另一治疗方法联合施用给受试者。例如，本发明双链分子可以与目前用于治疗癌症或阻止癌症转移的治疗方法（例如，放射疗法、外科手术和采用化疗剂的治疗，例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔红霉素daunorubicin或他莫昔芬tamoxifen）联合施用。

在本方法中，可以将双链分子作为裸双链分子与投递试剂结合，或作为表达双链分子的重组质粒或病毒载体施用给受试者。

适合与本发明双链分子联合施用的投递试剂包括Mirus Transit TKO亲脂试剂；Lipofectin；Lipofectamine；Cellfectin或多聚阳离子（例如，多聚赖氨酸）或脂质体。脂质体可以有助于将双链分子递送到特定组织，例如视网膜或肿瘤组织，而且还可以增加双链分子的血液半衰期。本发明适用的脂质体是由标准的囊泡形成脂质（vesile-forminglipid）形成的，其通常包括中性或带负电荷的磷脂和固醇，例如胆固醇。对一些因素的考虑通常可以为脂质的选择提供指导，例如所需的脂质体大小和脂质体在血流中的半衰期。多种用于制备脂质体的方法是公知的，例如在Szoka等，Ann Rev Biophys Bioeng 1980，9：467和美国专利号4,235,871；4,501,728 ；4,837,028以及5,019,369中所描述的，以提述的方式将它们的全部内容并入本文中。

本发明所述双链分子可以通过任何适合于将双链分子递送到癌症部位的方式来施用给受试者。例如，双链分子可以通过基因枪、电穿孔或通过其它适合胃肠外或肠内施用路径来施用。

合适的肠内施用路径包括口服、直肠或鼻内递送。

合适的胃肠外施用路径包括血管内施用（例如静脉内推注、静脉内输注、动脉内推注、动脉内输注和向血管网络中的导管滴注）；组织周围和组织内注射（例如肿瘤周围和肿瘤内注射）；皮下注射或沉积，包括皮下输注（例如利用浸透压泵）；直接施加到癌症部位或其附近的区域，例如借助导管或其它放置装置（例如，包含多孔性、非多孔性或明胶状材料的栓剂或植入物）；和吸入。在一些实施方案中，通过注射或输注将双链核酸分子或载体施用到癌症部位或其附近。

本发明的双链分子可以以单剂或多剂施用。当经输注施用本发明的双链分子时，输注可以是单一的持续剂量或可以经多次输注递送。可以直接将作用剂注射到癌症组织或邻近癌症部位。可以将作用剂多次注射到癌症组织或邻近癌症部位。

本领域技术人员也可以容易地确定适合于向给定受试者施用本发明的双链分子的给药方案。例如，可以将双链分子一次性施用给受试者，例如作为单次注射或者沉积的形式施用到癌症部位或邻近癌症部位。或者，双链分子可以在约3至约28天、例如约7至约10天的期间内每天一次或两次施用给受试者。在一个例示性的给药方案中，双链分子可以在7天内每天一次地注射到癌症部位或邻近癌症部位。当给药方案包括多次给药时，应当理解的是，给受试者施用的双链分子的有效量可以包括在整个给药方案里施用的双链分子的总量。

根据本领域已知的技术，向受试者施用之前，可以将本发明双链分子配制为药物组合物。本发明的药物组合物具有至少灭菌和无热原的特征。正如本说明书中所使用的，“药物配制剂”包括用于人用和兽医用的配制剂。用于制备本发明药物组合物的方法在本领域的技术范围之内，例如，在Remington’s Pharmaceutical Science，第17版，MackPublishing Company，Easton，Pa.(1985)中所描述的，以提述的方式将其全部内容并入本文中。

本发明药物配制剂含有至少一种本发明双链分子或编码所述双链分子的载体（例如，以重量计0.1-90%）或所述分子的生理学可接受盐，其与生理学可接受载体培养液混合。例示性的生理学可接受载体培养液包括，例如水、缓冲水、生理盐水、0.4%盐水、0.3%甘氨酸、透明质酸等。

根据本发明，组合物可以含有多种类型的双链分子，每种分子都可以针对SORCS2基因的相同靶序列，或不同靶序列。例如，所述组合物可以含有针对SORCS2基因的双链分子。或者，例如，所述组合物可以含有针对选自SORCS2基因的一个、两个或更多个靶序列的双链分子。

此外，本发明组合物可以含有编码一个或多个双链分子的载体。例如，所述载体可以编码一种、两种或多种本发明双链分子。或者，本组合物可以含有多种载体，每种载体均编码不同的双链分子。此外，本双链分子可以作为脂质体包含在本组合物中。

本发明药物组合物还可以包含常规的药用赋形剂和/或添加剂。合适的药用赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、缓冲液和pH调节剂。适合的添加剂包括生理学生物相容性缓冲液（例如氨基丁三醇盐酸盐）、补加螯合剂（例如DTPA或DTPA-双酰胺）或钙螯合剂配合物（例如DTPA钙、CaNaDTPA-双酰胺）、或者，任选地，添加钙或钠盐（例如氯化钙、抗坏血酸酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙）。本发明药物组合物可以进行包装以作为液体使用，或者也可以加以冷冻干燥。

对于固体组合物，可以采用常规的无毒性固体载体；例如，药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。

例如，用于口服施用的固体药物组合物可以含有上面所列的任何载体和赋形剂，以及10-95%的本发明的一种或多种双链分子，例如25-75%。用于气雾剂（吸入）施用的药物组合物可以含有以重量计0.01-20%，例如以重量计1-10%的包埋于上述脂质体中的一种或多种本发明双链分子以及推进剂（propellant）。还可以视需要包含载体；例如，用于鼻内递送的卵磷脂。

除了上述内容外，本组合物还可以包含其它药物活性成分，只要它们不抑制本双链分子的体内功能。例如，所述组合物可以包含通常用于治疗癌症的化疗剂。

本发明提供了用于检测或鉴定来源于受试者的组织样品中的癌细胞的方法，所述方法包括测定SORCS2基因在来源于受试者的组织样品中的表达水平的步骤，其中与所述基因的正常对照水平相比，所述表达水平的降低指明组织中癌细胞的存在或怀疑。

优选地，组织是胃组织。

根据本发明，可以提供用于检查受试者状况的中间结果。这些中间结果可以与其它信息组合来帮助医生、护士或其它从业者来诊断受试者患有该疾病。或者，本发明可以用于检测来源于受试者的组织中的癌性细胞，并且给医生提供有用信息来诊断受试者患有该疾病。

例如，根据本发明，在关于自受试者获得的组织中存在癌细胞有疑问时，可以通过考虑SORCS2基因的表达水平，加上疾病的不同方面，包括组织的病理学、血液中的已知肿瘤标志物的水平、和受试者的临床过程等来做出临床决定。例如，血液中的一些公知的诊断性肺癌和食道癌标志物包括ACT、CA19-9、CA50、CA72-4、CA130、CA602、CEA、DUPAN-2、IAP、KMO-1、NSE、SCC、SLX、Span-1、STN、TPA、细胞角蛋白19片段、和CYFRA 21-1。也就是说，在本发明的此具体的实施方案中，基因表达分析的结果起中间结果的作用，用于进一步诊断受试者的疾病状态。

通过本方法诊断的受试者可以是哺乳动物。例示性的哺乳动物包括但不限于例如人、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马和牛。

在进行本方法的过程中，自要诊断的受试者收集生物学样品来进行诊断。任何生物学材料都可以用作供测定的生物学样品，只要它包含SORCS2基因的目标转录或翻译产物。所述生物学样品包括但不限于身体组织和体液，例如血液，诸如血清、痰、尿液和胸腔积液。在一些实施方案中，所述生物学样品含有包含上皮细胞（例如癌性上皮细胞或来源于怀疑为癌性的组织的上皮细胞）的细胞群。此外，若必要的话，可以从所获得的身体组织和体液纯化出所述细胞，然后用作生物学样品。

对照水平可以与测试生物学样品同时确定，使用先前从已知疾病状态（癌性或非癌性）的受试者收集并保存的样品。或者，可以用基于对先前确定的已知疾病状态的受试者来源的样品中SORCS2基因表达水平分析所获结果的统计方法确定对照水平。此外，所述对照水平可以是来自先前测试的细胞的表达模式数据库。此外，根据本发明的一个方面，可以将SORCS2在生物学样品中的表达水平与多个对照水平进行比较，所述多个对照水平是从多个参比样品确定的。在一些实施方案中，对照水平采用参比样品来确定，所述参比样品来自与来源于受试者的生物学样品类似的组织类型。在一些实施方案中，采用已知疾病状态的群体中SORCS2表达水平的标准值。标准值可以通过本领域公知的任何方法获得。例如，可以使用平均值+/-2S.D.或平均值+/-3S.D.的范围作为标准值。

在本发明语境下，从已知非癌性的生物学样品测定的对照水平称作“正常对照水平”。另一方面，如果从癌性生物学样品测定对照水平，则它会被称作“癌性对照水平”。

除此之外，可以依据对照核酸的表达水平对测试生物学样品表达水平和对照水平之间的差异进行标准化，所述对照核酸已知其表达水平不取决于细胞的癌或非癌状态而发生变化，例如持家基因。例示性的对照基因包括但不限于β肌动蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和核糖体蛋白P1。

在本文中，术语“预后”是指由病例性质和症状所提示的、对疾病可能的结果以及疾病恢复前景的预测。因而，较不利的（less favorable）、负面的或不良的预后被定义为治疗后存活期或存活率较低。相反，正面的、有利的、或良好的预后以提高的治疗后存活期或存活率定义。术语“评估预后”指预测、预报患者癌症的未来结果（例如恶性、治愈癌症的可能性、估计的存活时间等）、或者将给定的检测或测量与患者癌症的未来结果相联系的能力。例如，通过测定SORCS2随时间的表达水平，能够预测患者的结果（例如，恶性的增加或减少、癌症等级的增加或减少、治愈癌症的可能性、存活等）。在本发明的语境下，短语“评估（或确定）预后”试图包括对癌症、行进，特别是癌症复发、转移性扩散以及病情复发的预测和可能性分析。本发明的用于评价预后的方法意图在临床上用于做出关于治疗方式的决定，所述治疗方式包括治疗性干预、诊断标准，例如疾病分期、和疾病监测以及对肿瘤性疾病转移或反复的监控。

所述方法所使用的来源于患者的生物学样品可以是来源于要评价的受试者的任何样品，只要可以在该样品中检测到SORCS2基因。在一些实施方案中，所述生物样品包含肺细胞（自肺或食道获得的细胞）。此外，所述生物学样品包括体液，例如痰、血液、血清、血浆、胸腔积液、食道粘液等。此外，所述样品可以是从组织纯化的细胞。所述生物样品可以在不同时间点从患者获得，包括治疗前、治疗中和/或治疗后。

根据本方法，用于比较的“对照水平”可以是，例如，在接受任何种类的治疗后显示良好的或正面的癌症预后的个体或个体群体在接受该治疗前检出的SORCS2基因表达水平，在本文中将其称为“良好预后对照水平”。或者，“对照水平”可以是在接受任何种类的治疗后显示不良的或负面的癌症预后的个体或个体群体在接受该治疗前检出的SORCS2基因表达水平，在本文中将其称为“不良预后对照水平”。所述“对照水平”是单一表达模式，其衍生自单个参比群体，或者衍生自多种表达模式。如此，对照水平可以在下述基础上确定：在对癌症患者或已知疾病状态（预后良好或预后不良）的患者群体进行任何种类的治疗前，所检测到的SORCS2基因表达水平。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。在一些实施方案中，采用SORCS2基因在已知疾病状态的患者组中的表达水平的标准值。标准值可以通过本领域公知的任何方法获得。例如，平均值+/-2S.D.或平均值+/-3 S.D.的范围可以用作标准值。

对照水平可以与测试生物学样品同时测定，其通过使用在进行任何种类的治疗前预先从已知疾病状态（预后良好或预后不良）的癌症患者（对照或对照组）收集和保存的样品来进行。

或者，可以基于对先前从对照组收集和保存的样品中SORCS2基因表达水平的分析所获的结果，用统计方法确定对照水平。此外，所述对照水平可以是来自先前测试的细胞或患者的表达模式数据库。此外，根据本发明的一个方面，可以将SORCS2基因在生物学样品中的表达水平与多个对照水平进行比较，所述对照水平由多个参比样品测定。在一些实施方案中，所用的对照水平是用这样的参比样品来测定的，所述参比样品来自与来源于患者的生物学样品类似的组织类型。

除此之外，可以将测试生物学样品的表达水平与对照水平之间的差异相对于对照例如持家基因标准化。例如，已知其表达水平在癌性和非癌性细胞之间没有差别的多核苷酸，包括编码β肌动蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和核糖体蛋白P1的多核苷酸，可以用于将SORCS2基因的表达水平标准化。

根据本方法，要评估癌症预后的患者可以是哺乳动物，包括人、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马和牛。

或者，根据本发明，除了评估受试者预后的其它测试结果以外，还可以提供中间结果。这些中间结果可以帮助医生、护士或其他从业者评价、确定或估计受试者的预后。可以考虑将其它信息与通过本发明获得的中间结果组合来评价预后，包括受试者临床症状和身体状况。

1、实验所用试剂或材料

（1）AGS和MKN45细胞：购自中国科学院上海细胞库。

（2）环保透明剂：购自武汉宏兹生物公司，货号H-H0102。

（3）枸橼酸钠抗原修复液：购自上海生工公司，货号E673002-0010。

（4）一抗SORCS2：购自R&D system公司，货号AF4238。

（5）羊抗小鼠/兔IgG聚合物：购自福州迈新生物技术有限公司，货号KIT-9710。

（6）链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶：购自福州迈新生物技术有限公司，货号KIT-9710。

（7）DAB显色液：购自福州迈新生物技术有限公司，货号DAB-0031。

（8）苏木素染液：购自上海生工公司，货号E607317-0100。

（9）RPMI1640细胞培养基：购自Gibco公司，货号11875168。

（10）CCK-8检测试剂盒：购自日本同仁公司，货号CK04-550T。

（11）EdU工作液：购自碧云天公司，货号C0075S。

（12）内源性过氧化物酶阻断剂：购自福州迈新生物技术有限公司，货号KIT-9710。

（13）非特异染色阻断剂：购自福州迈新生物技术有限公司，货号KIT-9710。

（14）病毒液：购自广州复能基因有限公司，货号：LPP-EGFP-LV105-025，GC09092K2002。

实施例1：免疫组织化学法检测SORCS2基因在胃癌中的表达

在广州医科大学附属肿瘤医院40例III、IV期胃癌并腹膜转移的患者，经过标准D2根治术后行HIPEC治疗，随访患者术后总生存时间（OS）。根据OS≥11个月分为HIPEC疗效好组，OS＜11个月分为HIPEC疗效差组，应用免疫组织化学技术检测了SORCS2在两组中的表达。该实验已获得患者许可。

将患者样本石蜡切片放置在60℃烘箱中烘烤3小时。随后将其依次按下列步骤进行脱蜡处理：完全浸入环保透明剂10min，取出后再次完全浸入环保透明剂10min。将脱蜡好的石蜡切片依次、完全浸入不同浓度乙醇中进行水化处理：100%乙醇/5min，100%乙醇/5min，90%乙醇/5min，80%乙醇/5min，70%乙醇/5min，PBS润洗石蜡切片3次，每次3min。在玻璃瓶中加入适量枸橼酸钠抗原修复液，放入微波炉中加热至抗原修复液煮沸，将润洗好的石蜡切片没入枸橼酸钠抗原修复液中，继续加热煮沸10min后在室温下自然冷却。PBS润洗石蜡切片3次，每次3min。滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温下湿盒避光孵育10min，PBS润洗石蜡切片3次，每次3min。滴加非特异染色阻断剂，室温下湿盒避光孵育10min，PBS润洗石蜡切片3次，每次3min。滴加PBS稀释的一抗SORCS2，4℃湿盒孵育过夜。PBS润洗石蜡切片3次，每次3min。滴加生物素标记的羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室温下湿盒避光孵育10min，PBS润洗石蜡切片3次，每次3min。滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温下湿盒避光孵育10min，PBS润洗石蜡切片3次，每次3min。根据试剂使用说明书配制1×DAB显色液，滴加至甩干的石蜡组织上，显微镜下观察显棕色后，及时用自来水终止染色。在润洗过的石蜡切片中加入苏木素染液染色10-20s，随后用自来水清洗苏木素染液反蓝。随后依次按下列步骤进行组织脱水，70%乙醇/5min，80%乙醇/5min，90%乙醇/5min，100%乙醇/10min，100%乙醇/10min。将组织切片置于环保透明剂10min，取出后再次置于环保透明剂10min进行透明化，室温下晾干，滴加适量中性树脂封片，机器扫描观察实验结果如图1所示。

如图1所示，IHC结果显示癌组织细胞排列紊乱，细胞大小不等，表现为多形性，胞核大且染色深，核质比增大，核仁明显。SORCS2蛋白阳性反应物质为棕黄色颗粒，镜下见阳性信号主要分布于细胞浆，HIPEC疗效好组SORCS2明显高表达。进一步分析SORCS2蛋白表达与胃癌患者预后的关系，Kaplan-Meier法生存率估计HIPEC疗效差组中位生存时间为3.8个月，Log-rank检验发现χ=52.47，P＜0.001，SORCS2高表达与胃癌患者预后好显著相关。

实施例2：AGS敲降SORCS2基因和MKN45过表达SORCS2基因稳转细胞株构建

将AGS和MKN45细胞培养瓶中的培养基倒去，用PBS清洗1-2次，加入500μL含0.25%EDTA的胰酶消化细胞，室温消化2-3分钟后，加入2mL培养基终止消化。使用离心机1000rpm/5min离心，去除上清，使用培养基重悬细胞后铺至六孔板中，密度约50-70%，待细胞贴壁并状态恢复，弃去培养液，每孔加入1mL含有病毒液和10μg/mL polybrene的培养基，放入37℃培养箱中培养。24小时后吸去培养基，加入含2μg/mL嘌呤霉素的培养基药筛1-2周。将细胞扩大培养并提取蛋白，western blot检测SORCS2基因干扰前后表达差异，结果如图2所示。

由图2检测结果可知，AGS敲降SORCS2基因（AGS shSORCS2）和MKN45过表达SORCS2基因（MKN45 SORCS2 OE）的稳转细胞株构建成功。

实施例3：肿瘤细胞热疗敏感性检测实验

将AGS NC和AGS shSORCS2、MKN45 NC和MKN45 SORCS2 OE细胞弃去培养基，PBS清洗后按照实施例2所述的方法消化重悬细胞，计数后将细胞铺至96孔板中，每孔细胞数为1万个。待细胞贴壁状态稳定后，分别置于37℃，41℃，43℃，45℃，49℃，55℃下培养1.5小时，然后转至37℃培养箱继续培养48小时，CCK-8法检测细胞活力及LT50值（半数致死温度）。检测结果如图3所示。

由图3可知，敲降SORCS2后，AGS细胞LT50由44.804升高至47.648℃；过表达SORCS2后，MKN45细胞LT50由45.786.℃降低至44.56℃。这表明，本申请所述的SORCS2基因可作为热敏标记物，促进肿瘤细胞对热疗的敏感性，为腹腔热灌注化疗发挥更佳治疗效果，有利于指导胃癌的治疗及预后。

实施例4：SORCS2基因抑制肿瘤细胞增殖

将AGS NC和AGS shSORCS2、MKN45 NC和MKN45 SORCS2 OE细胞弃去培养基，按照实施例2所述的方法将细胞铺至96孔板中，细胞数为1万/孔，36小时后，加入预热的1×EdU工作液，37℃培养箱中继续孵育2小时。EdU标记细胞完成后，去除培养液，加入4%的多聚甲醛，室温固定15分钟。去除固定液，用PBS清洗细胞3次，每次3-5分钟。加入含0.3%TritonX-100的PBS，室温孵育15分钟，去除通透剂，用PBS清洗细胞3次，每次3-5分钟。配置含有ClickReaction Buffer、CuSO4、Azide555、Click Additive Solution的Click反应液，加入培养孔中室温避光孵育30min，用PBS清洗细胞3次，每次3-5分钟。加入含有抗荧光淬灭剂的DAPI对细胞核进行染色，荧光显微镜下进行拍照。检测结果如图4所示。

由图4可知，敲降SORCS2基因后，AGS细胞细胞增殖能力显著增强；过表达SORCS2的MKN45细胞增殖能力显著降低。这表明，SORCS2基因参与了肿瘤细胞的增殖，可作为新的肿瘤治疗的靶点，为肿瘤治疗药物的开发提供了新的方向。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种在细胞中过表达SORCS2基因的试剂在制备胃癌热增敏产品中的应用。

2.一种在细胞中过表达SORCS2基因的试剂在制备治疗胃癌药物中的应用。