KR101903838B1 - 유방암 관련 stk32c 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유방암 관련 STK32C(Serine threonine kinase 32C) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 STK32C 유전자를 이용한 유방암의 진단, 예방, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서, STK32C 유전자의 발현 차이에 따른 유방암 세포의 변화를 확인하였으며, STK32C 유전자의 발현 억제에 의한 유방암 억제 효과 및 기질 단백질인 YB-1을 새롭게 규명하였는바, 유방암의 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟 치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

유방암 관련 STK32C 유전자 및 이의 용도 {STK32C gene involved in breast cancer and use thereof}
본 발명은 유방암 관련 STK32C(Serine threonine kinase 32C) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 STK32C 유전자를 이용한 유방암의 진단, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
국내 유방암의 발생률은 1990년대 여성암중 4-5번째의 암종이었으나, 2001년 이후 대부분 환자가 완치되고 예후가 좋은 갑상선암을 제외하고는 가장 수위의 암으로 알려져 있다. 예컨대, 국내 여성 암환자에서 암종의 연령표준화 발생률을 보면, 초음파 등 진단기기의 보급으로 인하여 급격하게 늘고 있는 갑상선암을 제외하고는 유방암의 발생률이 가장 급격하게 증가하고 있음을 확인할 수 있다. 따라서 유방암의 정확한 진단 및 치료에 대한 개발이 필요한 실정이다.
한편, 현재까지 악성종양인 암을 치료하는 방법으로 3가지 치료법 즉, 외과적인 수술, 방사선 치료 및 화학요법이 있으며, 이 중 한 가지 또는 이들의 조합을 통해 암을 치료하고 있다. 구체적으로, 외과적 수술은 질병 조직을 제거하는 방법으로, 이러한 외과적 수술은 제거가 어려운 부위에 있는 종양을 치료하거나 분산성 종양을 치료하기에는 부적절하다. 또한, 방사선 치료는 급성염증성 질환, 양성 또는 악성 종양, 내분비기능장애 및 알레르기성 질환 등에 주로 사용되며, 일반적으로 급속히 분열하는 세포로 구성된 악성종양에 효과적으로 사용되고 있다. 이러한 방사선 치료의 단점으로는 방사선의 치료에 따라 정상조직의 기능 약화 또는 상실, 치료 후 치료부위에 피부질환이 발생할 우려가 있으며, 특히 장기의 발육이 진행되는 소아의 경우 지능발달 지연 또는 골 발육 장애 등 심각한 부작용을 초래할 수 있다. 아울러, 화학요법은 암세포의 복제 또는 대사를 교란시킴으로써 유방, 폐 및 정소의 암을 치료하는데 널리 이용되고 있는데, 이러한 방법에 있어서 가장 큰 단점은 암 치료에 이용되는 전신성 화학요법에 의하여 유도되는 부작용이다. 화학요법에 의한 부작용은 환자의 생명에 중요한 영향을 미치며 치료에 대한 환자의 불안감을 증가시킬 수 있다. 또한, 화학치료제와 관련된 부작용으로는 일반적으로 이러한 약물의 투여시 주의해야 하는 용량 제한 독성(dose limiting toxicity, DLT)이 있다. 예를 들면, 점막염은 여러 항암제(항대사물질 세포독소제인 5-플루오로우라실, 메소트렉세이트 및 항종양 항생제인 독소루비신) 등에 대한 용량 제한 독성(DLT)이 있다. 이러한 화학 요법의 부작용 중 대부분은 심한 경우, 입원을 요하거나 통증을 치료하기 위하여 진통제를 필요로 하기도 한다. 이처럼, 화학치료제 및 방사선 치료에 의한 부작용들은 암 환자의 치료에 있어서 중요한 문제로 부각되고 있다.
이에, 상기와 같은 종래의 암 치료 기술의 문제점을 해소하기 위한 대안으로서, 암 관련 유전자를 타겟으로 하는 치료가 각광 받고 있다. 특히, 유방암의 발병과 관련된 유전자로서, BRCA1(Breast Cancer gene 1) 및 BRCA2(Breast Cancer gene 2)등이 보고된바 있으며, 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나(한국공개특허 10-2013-0057760), 아직은 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 STK32C(Serine threonine kinase 32C) 유전자의 발현 억제에 의한 유방암 저해 효과를 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 STK32C(Serine threonine kinase 32C)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 STK32C의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 유방암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 a) STK32C를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; b) 상기 세포에서 STK32C의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 STK32C의 발현 또는 활성을 억제시키는 시험물질을 유방암 치료 물질로 선정하는 단계를 포함하는, 유방암 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 a) 피검체 유래의 생물학적 시료에서 STK32C의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 b) 상기 측정된 STK32C의 발현 또는 활성이 정상 대조군 보다 높을 경우 유방암에 걸린 것으로 예측 또는 진단하는 단계를 포함하는, 유방암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 STK32C(Serine threonine kinase 32C)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 STK32C의 발현 억제제는 STK32C에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, microRNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 STK32C 활성 억제제는 STK32C에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 단백질, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 YB-1의 인산화를 억제시킬 수 있다.
본 발명은 STK32C의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 유방암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 STK32C의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제는 STK32C에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명은 a) STK32C를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; b) 상기 세포에서 STK32C의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 STK32C의 발현 또는 활성을 억제시키는 시험물질을 유방암 치료 물질로 선정하는 단계를 포함하는, 유방암 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 STK32C를 발현하는 세포는 MCF-10A, MCF-7, 및 MDA-MB-231 유방암 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 STK32C의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계는 STK32C에 의한 YB-1의 인산화 정도를 측정할 수 있다.
본 발명은 a) 피검체 유래의 생물학적 시료에서 STK32C의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 b) 상기 측정된 STK32C의 발현 또는 활성이 정상 대조군보다 높을 경우 유방암에 걸린 것으로 예측 또는 진단하는 단계를 포함하는, 유방암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
본 발명은 상기 STK32C의 발현 또는 활성 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 유방암 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 유방암 치료제의 제조를 위한 STK32C의 발현 또는 활성 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명은 유방암 관련 STK32C(Serine threonine kinase 32C) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 다양한 유방암 세포 또는 조직에서 STK32C 유전자의 높은 발현을 확인하였으며, STK32C 유전자 발현 차이에 따른 유방암 세포의 변화를 실험적으로 확인하였다. 또한, STK32C 유전자의 발현 억제에 의한 유방암 저해 효과 및 기질 단백질인 YB-1을 새롭게 규명하였는바, 상기 STK32C 유전자는 유방암의 진단 또는 치료를 위한 타겟 유전자로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 ER/PR positive, HER2 positive, 및 Triple negative(ER/PR/HER2 nagative) 유방암 세포에서, STK32C 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 2는 다양한 유방암 조직에서, STK32C 유전자 발현을 유방암 tissue array를 통해 확인한 결과이다.
도 3a는 STK32C 유전자를 과발현시킨 MCF-7 세포(STK32C/MCF7)에서, 증식능 변화를 나타낸 결과이다.
도 3b는 STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포(siSTK32C/MDA-MB-231)에서, 증식능 변화를 나타낸 결과이다.
도 4a는 STK32C 유전자를 과발현시킨 MCF-7 세포(STK32C)에서, 세포 주기의 변화를 나타낸 결과이다.
도 4b는 STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포(siSTK32C)에서, 세포 주기의 변화를 나타낸 결과이다.
도 5는 STK32 유전자 발현 차이에 따른 세포주기 관련 단백질의 발현 변화를 확인한 것으로서, STK32C 유전자를 과발현시킨 MCF-7 세포(STK32C), 및 STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포에서 발현을 나타낸 결과이다.
도 6a는 STK32C 유전자를 과발현시키지 않은 MCF-7 세포의 콜로니(Colony) 형성을 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 6b는 STK32C 유전자를 과발현시킨 MCF-7 세포의 콜로니(Colony) 형성을 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 7은 MCF-7 세포에서, 대조군(MCF7-mock)과 STK32C 유전자를 과발현시킨 MCF-7 세포(MCF7-STK32C)의 콜로니(Colony) 개수를 비교한 결과이다.
도 8a는 STK32C 유전자의 발현을 억제시키지 않은 MDA-MB-231 세포의 콜로니(Colony) 형성을 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 8b는 STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포의 콜로니(Colony) 형성을 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 9는 MDA-MB-231 세포에서, 대조군(MDA-MB-231-mock)과 STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MCF-7 세포(MDA-MB-231-siSTK32C)의 콜로니(Colony) 개수를 비교한 결과이다.
도 10a는 MCF-10A, MCF-7, 및 MDA-MB-231 세포에서, N-cadherin, Vimentin, 및 E-cadherin의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 비교한 결과이다.
도 10b는 MCF-10A, MCF-7, 및 MDA-MB-231 세포에서, N-cadherin, Vimentin, 및 E-cadherin의 발현을 RT-PCR을 통해 비교한 결과이다.
도 11은 MCF-10A, MCF-7, 및 MDA-MB-231 세포에서, N-cadherin, Vimentin, 및 E-cadherin의 발현을 공초점 현미경을 통해 확인한 결과이다.
도 12a는 STK32C 유전자를 과발현시킨 MCF-10 세포(pSTK32C)에서, 암세포의 침윤을 확인한 결과이다.
도 12b는 STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포(STK32C siRNA)에서, 암세포의 침윤을 확인한 결과이다.
도 13a는 STK32C 유전자를 과발현시킨 MCF-10 세포(pSTK32C)에서 암세포의 침윤을 확인한 결과이다.
도 13b는 STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포(STK32C siRNA)에서, 암세포의 침윤을 확인한 결과이다.
도 14는 STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포주를 주입한 마우스 동물모델(MDA-MB-231-luc/shSTK32C)에서 시간의 경과에 따른 암 조직의 부피 변화를 나타낸 결과이다.
도 15a는 STK32C 유전자를 억제시키지 않은 MDA-MB-231 세포주를 주입한 마우스 동물모델(MDA-MB-231-Luc/shCon)에서, 암 조직의 부피 변화를 육안으로 확인한 결과이다.
도 15b는 STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포주를 주입한 마우스 동물모델(MDA-MB-231-luc/shSTK32C)에서, 암 조직의 부피 변화를 육안으로 확인한 결과이다.
도 16a는 STK32C 유전자를 억제시키지 않은 MDA-MB-231 세포주를 주입한 마우스 동물모델(MDA-MB-231-Luc/shCon)에서, 증식 마커인 Ki67의 발현을 확인한 결과이다.
도 16b는 STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포주를 주입한 마우스 동물모델(MDA-MB-231-luc/shSTK32C)에서, 증식 마커인 Ki67의 발현을 확인한 결과이다.
도 17a는 STK32C 유전자를 억제시키지 않은 MDA-MB-231 세포주를 주입한 마우스 동물모델(MDA-MB-231-Luc/shCon)에서 폐 조직으로의 전이를 luciferase 활성 평가를 통해 확인한 결과이다.
도 17b는 STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포주를 주입한 마우스 동물모델(MDA-MB-231-Luc/shSTK32C)에서, 폐 조직으로의 전이를 luciferase 활성 평가를 통해 확인한 결과이다.
도 18a는 STK32C 유전자를 억제시키지 않은 MDA-MB-231 세포주를 주입한 마우스 동물모델(MDA-MB-231-Luc/shCon)에서, 폐 조직으로의 전이를 H&E(Hematoxillin & Eosin) 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 18b는 STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포주를 주입한 마우스 동물모델(MDA-MB-231-luc/shSTK32C)에서, 폐 조직으로의 전이를 H&E(Hematoxillin & Eosin) 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 19a는 STK32C의 기질 단백질 발굴을 위하여 STK32C를 항체로 면역침강시킨 결과이다.
도 19b는 STK32C의 기질 단백질 검증을 위하여 기질 단백질인 YB-1으로 면역침강시킨 결과이다.
도 20은 STK32C와 site directed mutagenesis에 의해 변형된 YB-1을 각각 효소원과 기질로 사용하여 in vitro kinase assay를 실시한 결과이다.
본 발명자들은, 다양한 유방암 세포 또는 조직에서, STK32C(Serine threonine kinase 32C) 유전자의 높은 발현을 확인하였으며, STK32C 유전자 발현 차이에 따른 유방암 세포의 증식, 세포주기, 콜로니 형성, 상피간엽이행, 침윤성의 변화를 확인하였다. 또한, 마우스 동물모델에서, STK32C 유전자 발현 억제에 의한 유방암 억제 효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 STK32C의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 유방암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 유방암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물에 의한 예방, 치료 대상 질병인 유방암은 유방에 생긴 암 세포로 이루어진 종괴로서, 일반적으로 유방암은 유방의 유관과 소엽에서 발생한 암을 의미한다. 유방암의 기본적 치료는 병변의 외과적 절제이며, 다른 장기에 전이가 없는 한, 모든 환자는 외과적 절제가 필요하다. 이와 더불어, 보조요법으로서, 항암 화학요법, 방사선 치료, 항호르몬 치료 등이 요구되고 있으며, 본 발명의 조성물은 유전자 표적 치료의 일환으로서, STK32C를 표적으로 하는 유방암 치료제를 제공한다.
본 발명에서, 유방암 치료의 표적 유전자인 STK32C(Serine/threonine kinase 32C) 유전자는 Serine/threonine protein 카이나제 중 하나로서, Sweet Taste Signaling과 관련되어 있다고 알려져 있으나, STK32C의 발현 또는 활성 억제를 통한 유방암 치료에 대해서는 아직 보고된 바가 없는 실정이다.
본 발명에서, STK32C의 발현 억제제는 STK32C에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, microRNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터, STK32C 활성 억제제는 STK32C에 특이적으로 결합하는 화합물, 단백질, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 유전자의 발현 또는 활성을 억제시킬 수 있는 제제라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래 의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 유방암 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 STK32C(Serine threonine kinase 32C)의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "진단"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 병리 상태, 즉 유방암의 존재 또는 특징을 확인하는 행위를 의미한다.
본 발명에서, STK32C의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제는 STK32C에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 단백질, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정할 수 있는 제제라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 다양한 유방암 세포와 조직에서 STK32C 유전자의 높은 발현을 확인함으로써, 유방암의 발병과 STK32C 유전자간 밀접한 관련성을 확인하였으며(실시예 1 참조), 이를 토대로 STK32C 유전자가 과발현 될수록 유방암 세포의 증식, 세포주기, 콜로니 형성, 상피간엽이행, 및 침윤이 촉진되며, STK32C 유전자가 억제될수록 상기와 반대의 경향성을 나타냄을 확인하였다(실시예 2 참조). 또한, 마우스 동물모델을 이용하여 STK32C 유전자 억제에 의한 유방암 저해 효과를 확인하였으며(실시예 3 참조), 상기 STK32C 유전자의 기질로 YB-1 단백질을 규명하였는바, STK32C 유전자의 발현 또는 활성 조절을 통해 유방암을 치료할 수 있음을 구체적으로 확인하였다(실시예 4 참조).
이에, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 a) STK32C를 발현하는 세포를 시험물질 또는 시험물질 없이 배양하는 단계; b) 상기 세포에서 STK32C의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 c) 시험물질 없이 배양한 군과 비교하여 STK32C의 발현 또는 활성을 억제시키는 시험물질을 유방암 치료 물질로 선정하는 단계를 포함하는 유방암 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서, STK32C를 발현하는 세포는 MCF-10A, MCF-7, 및 MDA-MB-231 유방암 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, STK32C 유전자의 발현 변화를 확인할 수 있는 세포라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 STK32C의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계는 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), DNA 칩, 웨스턴 블롯팅(Western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역 분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 단백질 칩, 및 In vitro kinase assay로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법으로 측정할 수 있으며, 바람직하게는 STK32C에 의한 YB-1의 인산화 정도를 통하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 a) 피검체 유래의 생물학적 시료에서 STK32C의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 b) 상기 측정된 STK32C의 발현 또는 활성이 정상 대조군보다 높을 경우 유방암에 걸린 것으로 예측 또는 진단하는 단계를 포함하는 유방암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
본 발명에서, 생물학적 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있으며, 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다.
상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있으며, 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 유방암 세포 또는 조직에서의 STK32C의 발현 확인
본 실시예에서는, 유방암의 발병과 STK32C(Serine threonine kinase 32C) 유전자간 관련성을 확인하기 위하여, 다양한 유방암 세포 또는 조직에서 STK32C 유전자의 발현을 확인하였다. 구체적으로, ER/PR positive, HER2 positive, 및 Triple negative(ER/PR/HER2 nagative) 유방암 세포에서 STK32C primer를 이용한 RT-PCR을 통해 STK32C 유전자의 발현 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, ER/PR positive, HER2 positive, 및 Triple negative(ER/PR/HER2 nagative) 유방암 세포에서 STK32C 유전자의 발현을 확인하였다.
또한, 침윤성 유관암(Infiltrating duct carcinoma), 전이암(metastaic carcinoma), 육종암(Sarcoma), 관내 유두암(Intraductal papillary carcinoma), 비정형적 수질성암(Atypical medullary carcinoma), 및 화생암종(Metaplastic carcinoma)과 같이 다양한 유방암 조직과 정상 유선 조직간 STK32C 유전자 발현 양상을 유방암 tissue array를 통해 비교하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 정상 유선 조직(Normal breast)에서는 STK32C 유전자의 발현이 낮은 반면, 다양한 유방암 조직에서는 높은 발현을 나타냈으며, 특히, 침윤성 유방암에서 더욱 높게 관찰되었다.
상기 결과들을 종합하여 볼때, 유방암의 발병과 STK32C 유전자는 밀접한 관련성이 있음을 나타낸다.
실시예 2. STK32C 발현에 따른 유방암 세포의 변화 확인
본 실시예에서는, STK32C 유전자가 유방암 세포에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하고자 하였다. 이에, STK32C 유전자의 발현 증가 또는 억제에 따른 유방암 세포의 증식, 세포주기, 콜로니 형성, 상피간엽이행, 침윤의 변화를 확인하였다.
실시예 2-1. 유방암 세포의 증식에 미치는 영향 확인
STK32C 유전자의 발현에 차이가 있는 MCF-7 세포 및 MDA-MB-231 세포를 이용하여 STK32C 유전자 발현에 따른 유방암 세포의 증식능 변화를 확인하였다. 구체적으로, STK32C 유전자의 발현이 상대적으로 낮은 MCF-7 세포에서, STK32C 유전자를 과발현시킨 반면, STK32C 유전자의 발현이 상대적으로 높은 MDA-MB-231 세포에서는 STK32C 유전자를 gene silencing시켰다. 상기 gene silencing은 하기 표 1에 나타낸 siRNA를 이용하여 실시하였다.
Figure 112015086934167-pat00001
이후 각각의 흡광도를 측정하여 유방암 세포 증식능을 비교하였으며, 대조군으로는 STK32C 유전자를 과발현 또는 억제시키기 전의 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포를 이용하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, STK32C 유전자를 과발현시킨 MCF-7 세포(STK32C/MCF7)에서 대조군과 비교하여 유방암 세포의 증식이 증가한 반면(도 3a), STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포(siSTK32C/MDA-MB-231)에서는 유방암 세포의 증식이 감소함을 확인하였다(도 3b). 상기 결과는 STK32C 유전자의 과발현에 의해 유방암 세포의 증식이 촉진되며, STK32C 유전자 발현의 억제에 의해 그 증식이 저해됨을 나타낸다.
실시예 2-2. 유방암세포의 세포주기에 미치는 영향 확인
암세포는 정상세포와 달리, 세포 분열에 대한 조절작용이 상실되어 끊임없이 분열 및 증식 관련 세포 주기만을 반복하게 되는바, 본 실시예에서는 STK32C 유전자의 발현에 차이에 따른 세포 주기의 변화를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 MCF-7 세포 및 MDA-MB-231 세포의 STK32C 유전자를 과발현 또는 억제시킨 후, 각각의 세포 주기(Sub-G1, G1, S, G2/M)의 분포를 수치화하여 비교하였다. 대조군으로는 STK32C 유전자를 과발현 또는 억제시키기 전의 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포를 이용하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, STK32C 유전자를 과발현시킨 MCF-7 세포(STK32C)에서, 대조군과 비교하여 분열 준비 단계인 G1 phase의 비율이 감소하고 분열 단계인 S phase의 비율이 증가한 반면(도 4a), STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포(siSTK32C)에서는, 반대로 G1 phase의 비율이 증가하고 S phase의 비율이 감소함을 확인하였다(도 4b).
또한, STK32C 유전자를 과발현시킨 MCF-7 세포 및 STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포에서, 세포주기 관련 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블롯(Western blot)을 통해 확인하였다. 대조군으로는 STK32C 유전자를 과발현 또는 억제시키기 전의 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포를 이용하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, STK32C 유전자를 과발현시킨 MCF-7 세포(STK32C)에서, 세포 주기의 진행에 관련된 인자인 cyclin 단백질의 발현이 증가하고 세포 주기의 진행을 저해하는 p21 및 p27 단백질의 발현이 감소한 반면, STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포(siSTK32C)에서는, 반대로 cyclin 단백질의 발현이 감소하고 p21 및 p27 단백질의 발현이 증가함을 확인하였다.
상기 결과들을 종합하여 볼 때, STK32C 유전자의 과발현에 의해 유방암 세포의 분열과 밀접한 관계가 있는 세포 주기의 진행을 촉진시키며, STK32C 유전자 발현의 억제에 의해 그 진행을 저해시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 2-3. 유방암 세포의 콜로니 형성에 미치는 영향 확인
STK32C 유전자를 과발현시킨 MCF-7 세포주 및 STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포주를 soft agarose 배지에 배양시켰고, 이후, 콜로니(Colony)의 형성을 현미경을 통하여 확인하였으며, 각각의 콜로니 수를 수치화하여 비교하였다. 대조군으로는 STK32C 유전자를 과발현 또는 억제시키기 전의 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포를 이용하였다.
그 결과, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, STK32C 유전자를 과발현시킨 MCF-7 세포주에서, 대조군과 비교하여 콜로니의 생성이 현저하게 증가하였으며(도 6a 및 도 6b), 상대적으로 약 5배 가량 증가함을 확인하였다(도 7). 이와 반대로, 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포주에서는 대조군과 비교하여 콜로니의 생성이 현저하게 감소하였으며(도 8a 및 도 8b), 상대적으로 약 6배 가량 감소함을 확인하였다(도 9).
상기 결과들을 종합하여 볼 때, STK32C 유전자의 과발현에 의해 유방암 세포의 콜로니 생성이 촉진되며, STK32C 유전자 발현의 억제에 의해 그 생성이 저해됨을 나타낸다.
실시예 2-4. 유방암 세포의 전이에 미치는 영향 확인
전이성 유방암의 경우, 상피간엽이행(epithelial-mesenchymal transition, EMT)을 활성화하여 암의 전이를 촉진하는바, 본 실시예에서는 STK32C 유전자의 발현에 차이에 따른 상피간엽이행의 변화를 통해 암의 전이에 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로, STK32C 유전자를 과발현시킨 MCF-10A, MCF-7 세포주 및 STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포주에서, 중간엽 마커인 N-cadherin 및 Vimentin과 상피엽 마커인 E-cadherin의 발현 양상을 웨스턴 블롯(Western blot) 및 RT-PCR을 통해 확인하였다. 또한, 상기 마커들의 발현 양상을 공초점 현미경(confocal microscopy)을 통해 재차 확인하였다. 대조군으로는 STK32C 유전자를 과발현 또는 억제시키기 전의 MCF-10A, MCF-7 및 MDA-MB-231 세포를 이용하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, STK32C 유전자를 과발현시킨 MCF-10A, MCF-7 세포에서 대조군과 비교하여 중간엽 마커인 N-cadherin 및 Vimentin의 발현이 증가된 반면, 상피엽 마커인 E-cadherin은 감소하였으며, 이와 반대로, STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포에서는 대조군과 비교하여 N-cadherin 및 Vimentin의 발현이 감소한 반면, E-cadherin이 증가함을 웨스턴 블롯(도 10a) 및 RT-PCR(도 10b)를 통하여 확인하였다. 또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, 공초점 현미경을 통해서도 상기와 동일한 실험 결과를 확인하였다.
상기 결과들을 종합하여 볼 때, STK32C 유전자의 과발현에 의해 유방암 세포의 전이가 촉진되며, STK32C 유전자 발현의 억제에 의해 그 전이가 저해됨을 나타낸다.
실시예 2-5. 유방암 세포의 침윤성에 미치는 영향 확인
STK32C 유전자를 과발현시킨 MCF-10 세포 및 STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포를 이용하여 STK32C 유전자 발현에 따른 유방암 세포의 침윤성 변화를 확인하였다. 구체적으로 MCF-10A 세포에서, STK32C 유전자를 과발현시킨 반면, MDA-MB-231 세포에서는 STK32C 유전자를 gene silencing시킨 후, 유방암세포의 침윤 정도를 수치화하여 비교하였다. 대조군으로는 STK32C 유전자를 과발현 또는 억제시키기 전의 MCF-10A 세포 및 MDA-MB-231 세포를 이용하였다.
그 결과, 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, STK32C 유전자를 과발현시킨 MCF-10A(pSTK32C)에서 침윤성이 2배 내지 4배 가량 현저히 증가한 반면(도 12a 및 도 13a), STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포주(STK32C siRNA)에서는 침윤성이 현저하게 감소함을 확인하였다(도 12b 및 13b).
상기 결과를 종합하여 볼 때, STK32C 유전자의 과발현에 의해 유방암 세포의 침윤이 촉진되며, STK32C 유전자 발현의 억제에 의해 그 침윤이 저해됨을 나타낸다.
실시예 3. 마우스 동물모델을 이용한 유방암 저해 효과 확인
본 실시예에서는, 실시예 2의 실험 결과를 토대로, 마우스 동물모델을 이용하여 STK32C 유전자의 발현 억제에 따른 유방암 저해 효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로, Luciferase를 포함하고 있는 MDA-MB-231 세포주에서, STK32C 유전자의 발현이 silencing된 MDA-MB-231-Luc/shSTK32C 세포주를 배양하였으며, SCID 마우스의 mammary fad에 상기 세포주를 주입하여 유방암을 유도하였다. 이후, 11주 동안 암 세포의 부피 변화를 확인하였으며, 암 조직을 적출한 후, 암 조직의 부피 변화를 육안으로 관찰하였고, 면역 화학염색법을 통하여 증식 마커인 Ki67의 발현을 변화를 비교하였다. 대조군으로는 STK32C 유전자를 억제시키지 않은 MDA-MB-231 세포주를 주입한 마우스 동물모델(MDA-MB-231-Luc/shCon)을 이용하였다.
그 결과, 도 14 내지 도 16에 나타낸 바와 같이, STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포주를 주입한 마우스 (MDA-MB-231-Luc/shSTK32C)는 대조군과 비교하여 암 조직의 부피가 시간의 경과에 따라 현저하게 감소되었으며(도 14, 도 15a, 및 도 15b), 증식마커인 Ki67의 발현 역시 감소되었음을 확인하였다(도 16a 및 도 16b).
또한, 폐 조직으로의 전이를 확인하고자, Luciferin을 이용하여 luciferase의 활성을 조사하였으며, 폐 조직을 적출한 후, H&E(Hematoxillin & Eosin) 염색을 통해 침윤된 세포의 변화를 비교하였다. 대조군으로는 STK32C 유전자를 억제시키지 않은 MDA-MB-231 세포주를 주입한 마우스 동물모델(MDA-MB-231-Luc/shCon)을 이용하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 대조군에서는 luciferase의 활성이 전신에 걸쳐서 확인된 반면(도 17a), STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포주를 주입한 마우스(MDA-MB-231-Luc/shSTK32C)는 국소부위에 한정되어 관찰되었다(도 17b). 또한, 도 18에 나타낸 바와 같이, H&E 염색을 통해서도 대조군에서는 폐 조직으로의 전이가 진행된 반면(도 18a), STK32C 유전자의 발현을 억제시킨 MDA-MB-231 세포주를 주입한 마우스(MDA-MB-231-Luc/shSTK32C)는 전이가 거의 일어나지 않음을 확인하였다(도 18b).
상기 결과들을 종합하여 볼 때, 실시예 2의 결과와 마찬가지로 in vivo 상에서도 STK32C 유전자의 발현을 억제시킴으로써, 유방암 세포의 증식 및 전이를 저해시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 4. STK32C의 기질 단백질 확인
본 실시예에서는, STK32C의 기질 단백질을 발굴하고 STK32C 유전자에 의해 인산화 되는 기질 단백질의 구체적인 부위를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 면역침강법(Immunoprecipitation)을 이용하여 STK32C의 기질 단백질을 확인하였으며, 상기 검출된 기질 단백질을 이용하여 재차 면역침강시킴으로써 결과를 검증하였다. 또한, 기질 단백질에서 인산화가 예상되는 특정 부위(serine 165, serine 167)를 alanine으로 site directed mutagenesis시킨 후, 상기 변형된 기질 단백질과 STK32C를 각각 기질과 효소원으로 사용하여 in vitro kinase assay를 실시하였으며, P32로 표지된 ATP를 이용하였다.
그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, STK32C의 기질 단백질로서, YB-1 단백질을 검출하였으며(도 19a), 상기 YB-1을 이용한 면역침강에서도 STK32C가 검출됨을 확인함으로써 상기 결과를 검증하였다(도 19b). 또한, 도 20에 나타낸 바와 같이, 상기 YB-1 기질 단백질의 serine 167이 STK32C에 의해 인산화됨을 확인하였다.
상기 결과들을 종합하여 볼 때, STK32C의 발현 억제에 따라 YB-1 기질 단백질(serine 167)의 인산화가 저해될 수 있음을 나타낸다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Claims (10)

  1. STK32C(Serine threonine kinase 32C)의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 포함하고, 상기 STK32C의 발현을 억제할 수 있는 제제는 STK32C의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, microRNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 STK32C의 활성을 억제할 수 있는 제제는 STK32C의 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 화합물, 펩티드, 앱타머, 단백질 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 YB-1의 인산화를 억제시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. STK32C의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 유방암 진단용 조성물로서, 상기 제제는 STK32C에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 단백질 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 유방암 진단용 조성물.
  6. 삭제
  7. 하기의 단계를 포함하는, 유방암 치료 물질의 스크리닝 방법:
    a) STK32C를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
    b) 상기 세포에서 STK32C의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 STK32C의 발현 또는 활성을 억제시키는 시험물질을 유방암 치료 물질로 선정하는 단계.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 STK32C를 발현하는 세포는 MCF-10A, MCF-7, 및 MDA-MB-231 유방암 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 STK32C의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계는 STK32C에 의한 YB-1의 인산화 정도를 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 하기의 단계를 포함하는, 유방암 진단을 위한 정보 제공방법.
    a) 피검체 유래의 생물학적 시료에서 STK32C의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    b) 상기 측정된 STK32C의 발현 또는 활성이 정상 대조군보다 높을 경우 유방암에 걸린 것으로 예측 또는 진단하는 단계.
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