CN1458979A - 调节多谱系激酶蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了鉴别化合物的方法，该化合物可调节多谱系激酶蛋白和促进细胞生存或细胞死亡，该方法包括使包含多谱系激酶蛋白的细胞和该化合物相接触的步骤，测定该化合物是否减低多谱系激酶蛋白的活性，是否促进细胞生存。同时也提供了鉴别可用于治疗神经退化紊乱和/或发炎的化合物的方法。提供了调节多谱系激酶蛋白活性的方法，其用本发明中的茚并－或吲哚并－化合物接触蛋白或包含蛋白的细胞。本发明也提供了治疗神经退化紊乱和/或炎症的方法。

Description

调节多谱系激酶蛋自
发明领域
本发明的部分目的在于提供调节多谱系激酶(MLK)家族成员(活性)的方法，提供鉴别可调节多谱系激酶蛋白和促进细胞生存或死亡的化合物的方法，提供鉴别可用来治疗神经退化紊乱和/或炎症的化合物的方法，以及提供用能抑制多谱系激酶蛋白的化合物来治疗神经退化紊乱的方法。
发明背景
MLK家族包括一组蛋白质，该家族成员的激酶区域的蛋白质序列与MAPKKK非常相近，但它们之间的相似更高于与其它MAPKKK的相似。MLK家族成员包括一种非常复杂的激酶级联的蛋白质，例如，强信号级联，其包括，除其他因素之外，就中，尤其，N末端激酶(JNK)，依次调节，除其他因素之外，就中，尤其，转录因子，包括c-Jun，ATF2和ELK-1。JNK在美国专利号5534426，5593884，5605808，和WO95/03324中有描述，它们中的每一条均以其完整意义在本文中引用。
MLK家族部分包括下列基团：1)多谱系激酶1(MLK1)；2)多谱系激酶2(MLK2)；3)多谱系激酶3(MLK3)；4)亮氨酸拉链支撑激酶(LZK)；5)双亮氨酸拉链支撑激酶(DLK)；和6)多谱系激酶6(MLK6)。MLK1具有与Tyr和Ser/Thr的专一性激酶相似的催化区域。Dorow等，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710。MLK2也具有与Tyr和Ser/Thr的专一性激酶相似的催化区域。Dorow等，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710。MLK2也以MST为人所熟知。Katoh等，Oncogene，1995，10，1447-1451。MLK3包含一种蛋白质，其除具激酶区域外，还含2个与羧基末端碱区域相邻近的亮氨酸拉链，和1个脯氨酸富集区域。Ing等，Oncogene，1994，9，1745-1750。MLK3也称之为SPRK(Gallo等，J.Biol.Chem.，1994，269，15092-15100)和PTK1(Ezoe等，Oncogene，1994，9，935-938)。.LZK为亮氨酸拉链支撑激酶。Sakuma等，J.Biol.Chem.，1997，272，28622-28629。DLK具有1个激酶区域和2个推定的亮氨酸拉链基元。Holzman等，J.Biol.Chem.，1994，269，30808-30817。DLK也称之为ZPK(Reddy等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1994，202，613-620)和MUK(Hirai等，Oncogene，1996，12，641-650)。MLK家族中的成员在下述文件中也有描述，如美国专利号5,676,945，5,554,523，WO93/15201，加拿大专利号2,148,898，Diener等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94，9687-9692，DeAizpurua等，J.Biol.Chem.，1997，272，16364-16373，Tung等，Oncogene，1997，14，653-659，Sells等，Trends in Cell Biol.，1997，7，161-167，Mata等，J.Biol.Chem.，1996，271，16888-16896，Hirai等，J.Biol.Chem.，1997，272，15167-15173，Fan等，J.Biol.Chem.，1996，271，24788-24793，Blouin等，DNA和Cell Biol.，1996，15，631-642，Pombo等，Nature，1995，377，750-754，Kiefer等，EMBO J.，1996，15，7013-7025，Hu等，Genes & Dev.，1996，10，2251-2264，Su等，EMBOJ.，1997，16，1279-1290，和Dorow等，Eur.J.Biochem.，1995，234，492-500。近来，另一种MLK相关的激酶已在EST数据库鉴别出来。该克隆的DNA序列，MLK6，由7个overlapping entires给予描述。其克隆ID号为：1007489，1460085，510915，666323，F5555，482188和178522，每一个序列均以其完整形式在本文中引用为参考文献。在此以其全文引作参考。
近来，通过集落形成试验的测量，ZPK的稳定表达已表明其可降低NIH 3T3纤维原细胞的增生能力。Bergeron等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1997，231，153-155。然而Bergeron等未能提供任何数据证明ZPK可调节ZPK底物的活性或ZPK是否能促进细胞死亡。
编码Myc-MLK2的构建(基因)在Swiss 3T3细胞中的表达已证明在注射大约20小时后可导致细胞凋亡。Nagata等，EMBO J.，1998，17 149-158。
本发明的申请者已开发出多种indolo和indeno化合物，和其他的事物(inter alia，)，其可抑制与过增生状态(hyperproliferative states)相关的细胞的生长，并可抑制多种胚胎培养的死亡，如后根(神经)节(dorsal root ganglion)、striatal，superior cervical ganglia和运动神经细胞。美国专利号5,475,110，5,591,855，5,594,009，5,461,146，5,621,100，5,621,101，5,705,511，和5,756,494，分别转让给本申请的受让人和各在此以其全文引作参考。列举在美国专利号5,705,511中的具化学式G的化合物在本发明申请中具化学式I。本发明申请者也已证明运动神经细胞的凋亡可为K-252a的衍生物所抑制，其为indolocarbazole，也可调节压力信号级联(stress-signaling cascade)。Maroney等，J.Neurosci.，1998，18，104-111，在此以其全文引作参考。
由于筛选可调节压力信号级联的成员和促进细胞死亡或生存的化合物的不充分，持续需要有新的筛选化合物的选择性方法。此外，持续需求治疗的筛选试验，来用于治疗炎症和神经退化紊乱。本发明目的正在于此，以及其它重要的目标。
发明简述
本发明提供鉴别可调节多谱系激酶蛋白活性和促进细胞生存的化合物的方法，其包括包括使包含多谱系激酶蛋白的细胞和该化合物相接触的步骤，测定该化合物是否减低多谱系激酶蛋白的活性，是否促进细胞生存。
本发明也提供鉴别可调节多谱系激酶蛋白活性和促进细胞生存的化合物的方法，其包括包括使包含多谱系激酶蛋白的细胞和该化合物相接触的步骤，测定该化合物是否增高多谱系激酶蛋白的活性，是否促进细胞死亡。
本发明也提供鉴别可用于治疗神经退化紊乱的化合物的方法，其包括包括使包含多谱系激酶蛋白的细胞或细胞提取物和该化合物相接触，测定该化合物是否减低多谱系激酶蛋白的活性。
本发明也提供鉴别可用于治疗炎症的化合物的方法，其包括包括使包含多谱系激酶蛋白的细胞或细胞提取物和该化合物相接触，测定该化合物是否减低多谱系激酶蛋白的活性。
本发明也提供了治疗有或怀疑有神经退化紊乱的哺乳动物方法，其包括给上述哺乳动物服用可抑制或减低多谱系激酶蛋白活性的化合物。
本发明也提供了治疗有炎症的哺乳动物方法，其包括给上述哺乳动物服用可抑制或减低多谱系激酶蛋白活性的化合物。
本发明也提供了调节多谱系激酶蛋白的方法，该方法包括将蛋白或包含蛋白的细胞与具有式II的化合物相接触：
(插入化学式page 4)
其中
B环和F环，独立地，且各自和与其相连的碳原子在一起，可供选择的基团包括：
不饱和的6元碳芳香环其中的1至3个碳原子可被氮原子所替换；
不饱和的5元碳芳香环；及
不饱和的5元碳芳香环，其中
1个碳原子被氧、氮、或硫原子所替换；
2个碳原子被1个硫原子和1个氮原子，1个氧原子和1个氮原子、或2个氮原子所替换；或者
3个碳原子被3个氮原子所替换；
R1可供选择的基团包括：
H、可被取代或不可被取代的1-4个碳的烷基、可被取代或不可被取代的芳基、可被取代或不可被取代的芳烷基、可被取代或不可被取代的杂环芳基、或可被取代或不可被取代的杂环芳烷基；
-C(＝O)R9，其中R9可供选择的基团包括：烷基、芳基和杂环芳基；
-OR10，其中R10可供选择的基团包括：H和1-4个碳的烷基；
-C(＝O)NH2，-NR11R12，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)pOR10，-O(CH2)pOR10和-O(CH2)pNR11R12，其中p为1-4；及其中
R11和R12可供各自独立选择的基团包括：H和1-4个碳的烷基；或
R11和R12一起形成化学式为-(CH2)2-X1-(CH2)2-的连接基团，其中X1可供选择的基团包括：-O-，-S-、和-CH2-；
R2可供选择的基团包括：H，1-4个碳的烷基，-OH，1-4个碳的烷氧基，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)pNR11R12，-O(CH2)pOR10，可被取代或不可被取代的6-10个碳的芳香烷基、及可被取代或不可被取代的杂环芳香烷基；
R3，R4，R5和R6可供各自独立选择的基团包括：
H，芳基，杂环芳基，F，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH-，-OR9，-O(CH2)pNR11R12，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR2R7，--OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)pOR10，-CH2OR10，-NR11R12，-NR10S(＝O)2R9，-NR10C(＝O)R9；
-CH2OR14，其中R14为其羧基中的羟基移去后的氨基酸残基；
-NR10C(＝O)NR11R12，-CO2R2，-C(＝O)R2，-C(＝O)NR11R12，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)pNHR14，或-CH＝NNR2R2A其中R2A与R2相同；
-S(O)yR2-(CH2)pS(O)yR9，-CH2S(O)yR14其中y为0、1、或2；
1-8个碳的烷基、2-8个碳的烯基、2-8个碳的炔基，其中
每一个烷基、烯基或炔基是不可取代的；或
每一个烷基、烯基或炔基可为1-3个基团所取代的，可供选择的取代基团包括6-10个碳的芳基、杂环芳基、芳甲氧基、杂环烷氧基、羟基烷氧基、alkyloxy-alkoxy，hydroxyalkylthio，alkoxy-alkylthio，F，Cl，Br，I，-CN，-NO2，-OH，-OR9，-X2(CH2)pNR11R12，-X2(CH2)pC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pOC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pCO2R9，-X2(CH2)pS(O)yR9，-X2(CH2)pNR10C(＝O)NR11R12，-OC(＝O)R9，-OCONHR2，-O-tetrahydropyranyl，-NR11R12，-NR10C(＝O)R9，-NR10CO2R9，-NR10C(＝O)NR11R12，-NHC(＝NH)NH2，NR10S(O)2R9，-S(O)yR9，-CO2R2，-C(＝O)NR11R12，-C(＝O)R2，-CH2OR10，-CH＝NNR2R2A，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-S(＝O)2NR2R2A，-P(＝O)(OR10)2，-OR14，及5-7个碳的单糖其单糖的每一个羟基可各自独立地不被取代或被H所替换，1-4个碳的烷基，2-5个碳的alkylcarbonyloxy，或1-4个碳的烷氧基；
X2为O，S，或NR10；
R7和R8可供独立选择的基团包括：H、1-4个碳的烷基、1-4个碳的烷氧基、可替代或不可替代的6-10个碳的芳烷基、可替代或不可替代的杂环芳烷基、-(CH2)pOR10，-(CH2)pOC(＝O)NR11R12，和-(CH2)pNR11R12；或R7和R8一起形成化学式为-CH2-X3-CH2-的连接基团，其中X3为X2或键；
m和n各自独立地为0、1、或2；
Y可供选择的基团包括：-O-，-S-，-N(R10)-，-N+(O-)(R10)-，-N(OR10)-，和-CH2-；
Z可供选择的基团包括：键，-O-，-CH＝CH-，-S-，-C(＝O)-，-CH(OR10)-，-N(R10)-，-N(OR10)-，CH(NR11R12)-，-C(＝O)N(R17)-，-N(R17)C(＝O)-，-N(S(O)yR9)-，-N(S(O)yNR11R12)-，-N(C(＝O)R17)-，-C(R15R16)-，-N+(O-)(R10)-，-CH(OH)-CH(OH)-，和-CH(O(C＝O)R9)CH(OC(＝O)R9A)-，其中R9A与R9相同；
R15和R16可供独立选择的基团包括：H，-OH，-C(＝O)R10，-O(C＝O)R9，hydroxyalkyl，和-CO2R10；
R17可供选择的基团包括：H、烷基、芳基、和杂环芳基；
A1和A2可供选择的基团包括：H，H；H，OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；及基团其中的A1和A2一起形成＝O，＝S，和＝NR2；
B1和B2可供选择的基团包括：H，H；H，-OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；及基团其中的B1和B2一起形成＝O，＝S，和＝NR2；
附带条件是成对的A1和A2，或B1和B2中至少一对形成＝O。
本发明也提供了调节多谱系激酶蛋白活性的方法，其包括用具化学式III的化合物与蛋白或含有蛋白的细胞接触：
(插入化学式III page 7)
其中
Z1为H，Z2为H，或Z1和Z2一起形成＝O；
R1可选择的基团包括：H，Cl，CH2SO2C2H5，Br，CH2S(CH2)2NH2，CH2S(CH2)2N(CH3)2N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH2n-C4H9，NHCONHC6H5，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC6H5，N(CH3)2，CH3，CH2OCONHC2H5，NHCO2CH3，CH2OC2H5，CH2N(CH3)2，OH，O正丙基，CH＝NNH-C(＝NH)NH2，CH＝N-N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH-n-C4H9，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3；
(插入化学式page 8)
R2可选择的基团包括：H，Br，Cl，I，CH2S(CH2)2N(CH3)2，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC2H5，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，和CH2OH；
X可选择的基团包括：H，CH2OH，CH2NH-丝氨酸，H，CO2CH3，CONHC6H5，CH2NHCO2C6H5，CH2NHCO2CH3，CH2N3，CONHC2H5，CH2NH-甘氨酸，CON(CH3)2，-CH2NHCO2-，CONH2，CONHC3H7，CH2NH-Serine，CH2SOCH3，CH＝NOH，CH2NH-脯氨酸，CH2CH2(2-吡啶基)，CH＝NNHC(＝NH)NH2，CONH(CH2)2OH，CH＝NNHCONH2，CH2OCOCH3，-CH2OC(CH3)2O-，CH2SC6H5，CH2SC6H5，CH2SOC6H5，CO2正己基，CONHCH3，CO2(CH2)4CH3；
(插入化学式page 9)
及
R可选择的基团包括：OH，和OCH3.
本发明也提供了调节多谱系激酶蛋白活性的方法，其包括用具化学式IV的化合物与蛋白或含有蛋白的细胞接触：
(插入化学式page 9)
IV
其中
Z1为H，Z2为H或Z1和Z2一起形成＝O；
R1为H或Br；
R2为H；
R3为H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，(插入化学式)
或
及
R4为H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
附图简述
为了图示本发明中具体实例，在附图中显示了某些特征。然而，必须认识到，本发明不限于所示的精确的具体实例。
图1为示意图，显示桥连茚并吡咯并咔唑的一般制备过程。
图2为示意图，显示桥连茚并吡咯并咔唑的一般制备过程。
图3为示意图，显示树脂结合的茚并吡咯并咔唑的制备过程。
图4为示意图，显示被保护的、可溶解的茚并吡咯并咔唑的制备过程。
图5为示意图，显示中间产物V的制备过程。
图6为示意图，显示用方法A制备桥连茚并吡咯并咔唑的过程。
图7为示意图，显示用方法B制备桥连茚并吡咯并咔唑的过程。
图8为示意图，显示B环取代的桥连茚并吡咯并咔唑的制备过程。
图9为示意图，显示桥连茚并吡咯并咔唑的E环的衍生过程。
图10显示两个独立的实验，描述在缺乏NGF时培养5天后存活的神经分化PC-12细胞的保留数量。结果以每组内NGF对照的百分比显示(缺乏NGF组内的载体对照，n＝12；所有其它组内，n＝3)。载体对照和细胞稳定池中的差异显示在缺乏NGF
图11A描述在缺乏NGF时培养5天后存活的神经分化PC-12细胞的保留数量。结果以每组内NGF对照的百分比显示(缺乏NGF组内的载体对照，n＝12；所有其它组内，n＝3)。
图11B描述在缺乏NGF时培养5天后存活的神经分化PC-12细胞的保留数量。结果以每组内NGF对照的百分比显示(缺乏NGF组内的载体对照，n＝12；所有其它组内，n＝3)。
图12描述在缺乏NGF时培养5天后存活的神经分化PC-12细胞的保留数量。结果以每组内NGF对照的百分比显示(缺乏NGF组内的载体对照，n＝12；所有其它组内，n＝3)。
图13描述在缺乏NGF时培养5天后存活的神经分化PC-12细胞的保留数量。结果以每组内NGF对照的百分比显示(缺乏NGF组内的载体对照，n＝12；所有其它组内，n＝3)。
图14描述在缺乏NGF时培养5天后存活的神经分化PC-12细胞的保留数量。结果以每组内NGF对照的百分比显示(缺乏NGF组内的载体对照，n＝12；所有其它组内，n＝3)。
图15A描述在缺乏NGF时培养5天后存活的神经分化PC-12细胞的保留数量。结果以每组内NGF对照的百分比显示(缺乏NGF组内的载体对照，n＝12；所有其它组内，n＝3)。
图15B表示在从图15A所述样品中的免疫沉淀/激酶反应中剩余的百分活性的定量图。柱代表一式两份样品的平均值，其中误差棒表示平均值的范围。
图15C表示仅过表达HA-JNK1的细胞的免疫沉淀/激酶反应中的32P-标记c-jun的量，或采用如所示的MEKK1各种量的cDNA，并用0.025％DMSO(对照)或500nM的化合物III-3(参见，表3)处理。柱表示一式两份样品的平均值，其中误差棒表示平均值的范围。
图16表示化合物III-3以浓度依赖方式促进神经元存活。将分离的神经元从交感神经节(SG)(A)、后根神经节(DRG)(B)、睫状神经节(CG)(C)和运动神经元(MN)(D)中培养，在所示营养因子的存在或缺乏下。在铺板48小时之后对细胞进行计数，如材料和方法中所述。数据表示重复三次和四次测定的平均值±SD。所示为三次实验中的一次。
图17表示下列物质培养的反相微型图，E12 DRG(A、E)、E9交感神经元(B、F)、E8睫状神经元(C、G)和E5.5运动神经元(D、H)，在所示营养因子(对于交感神经元20ng/ml NGF以及对于睫状神经元10ng/ml，对于运动神经元(A-D)30ug/ml肌肉抽提物(MEX)的存在或缺乏下或在1uM化合物III-3(E-H)存在下，培养48小时之后(对睫状神经元24小时之后)。误差棒＝200um。
图18表示下列物质培养的反相微型图，E12 DRG(A、E)、E9交感神经元(B、F)、E8睫状神经元(C、G)和E5.5运动神经元(D、H)，在所示营养因子(对于培养48小时之后(对睫状神经元24小时之后)。(A)对照DMSO；(B)20ng/ml NGF；(C)250nM化合物III-3。48小时后，除去培养基，并将移植物用4％甲醛的磷酸缓冲液固定。
图19表示众多鸡运动神经元，在用特异性剂量的化合物III-3每天处理(E5-9)后的在E10的存活。所示数据是5-6只动物/处理组的平均值±S.D.。所报道的实验重复两次。数据来自一次代表性的实验，并表示柱的一边。*p＜0.01，**p＜0.001，在化合物III-3和对照组之间的学生氏测定，采用Bonferroni校正。
图20表示许多运动神经元，在雌性大鼠脊柱核(SNB)，第PN10或PN60天，在用化合物III-3或对照媒介物(5％SolutolTM)每日处理(PN1-5)之后。在第PN10(A，B)或PN 60(B)，将大鼠处死，并将含有SNB的脊柱切开，为组织学加工；在系列切片中计数兰染色的运功神经元，如前所述(Wingfield等，Steroids，1975，26，311-327)。实验数据为平均值±S.E.M.从4-8动物/处理组。
图21ChAT免疫反应的丧失，在成年大鼠的舌下神经外科术之后，用化合物III-3处理。舌下核的光微照片用对照媒介物(A)(5％SolutolTM)每日处理之后，以及(B)200ug的化合物III-3在切片位点施用。(C)在第PN10(A，B)或PN60(B)，将大鼠处死，并将含有SNB的脊柱切开，为组织学加工；在系列切片中计数兰染色的运功神经元，结果表示为ChAT-免疫反应运功神经元的百分比，100％定义为ChAT免疫反应运动神经元的数。
图22显示MLK-3途径的抑制，其表明体内磷酸化作用的功效和阻断。图22A表示黑质酪氨酸酶免疫神经元的增加，在用全身施用化合物III-3的MPTP损伤后。图22B是代表性的免疫印迹，表示MPTP诱导的增加，在磷酸化MKK4水平上。图22C描述了代表性免疫印迹和ELISA，显示MPTP的衰减诱导磷酸化的MKK4，在化合物III-3存在下。
图23显示IL-2在Jurkat细胞中的感应。图23A显示IL-2感应的时间进程。图23B显示化合物III-3对IL-2感应的抑制。图23C显示化合物III-3和化合物I-4对IL-2感应的抑制。
本发明优选具体实例的描述
如上述所用并贯穿于全部公开文件，除非另有指明，下列术语应该理解为具如下意思。
“细胞编程性死亡”指细胞死亡的特殊形态类型，其特征在于细胞片段化，细胞核成为膜连颗粒。细胞凋亡的引发可能是，例如，用可诱导细胞凋亡的化合物来治疗，这些化合物有etoposide，staurosporine，肿瘤坏死因子α，神经酰胺，以及类似物，或由于如X放射环境。
术语“细胞死亡”指又细胞凋亡、坏死、或其它为本领域专业人员广为知道的方式引起的细胞的死亡。“细胞死亡”的特征在于，例如，与未处理的对照细胞群相比，细胞的总数下降或细胞的生存能力下降。与对照细胞群相比，“促进细胞死亡”的化合物导致细胞数目的下降或细胞生存能力下降。与之相反，“促进细胞生存”的化合物导致细胞数目的增加或细胞生存能力增强，或减慢或减低细胞的死亡率。
术语“选择性反应”或“特殊键连”描述化合物与MLK蛋白有直接地物理或化学相互作用。相反，没有“选择性反应”或“特殊键连”的化合物可影响MLK蛋白下游或上游的蛋白，进而影响MLK蛋白的活性，但不与MLK蛋白有直接地物理或化学的相互作用。
术语“调节”指增高或减低特殊蛋白质或其底物的活性。
本发明的部分目的也在于提供鉴别化合物的方法，该化合物可调节MLK蛋白活性和促进细胞的生存或死亡。导致MLK蛋白活性增加的化合物可促进细胞死亡，而导致MLK蛋白活性下降的化合物可细胞生存。
MLK蛋白可能是鉴别属于MLK蛋白组群中的任何一种。优选的MLK蛋白选自下列组群，包括：MLK1，MLK2，MLK3(SPRK，PTK1)，LZK，DZK(ZPK，MUK)，和MLK6，其已在上文描述。在本发明的优化的具体实例中，鉴别化合物与MLK蛋白直接相互作用或结合的方法是结合试验、激酶试验、或其它等价试验。
为了鉴别可MLK蛋白活性和促进细胞生存或死亡的化合物，要用试验的化合物接触包含MLK蛋白的细胞。这种接触在为本领域专业人员所熟知的缓冲液或培养基中进行。或者，此接触发生在动物体内，例如，老鼠或为本领域专业人员所熟知的其它适合的动物。接触通过使用制药上的合成物来实现，该合成物包含试验的化合物和制药上可接受的盐、载体、或稀释液。此外，要使用不同数量的细胞和不同浓度的试验化合物。测定试验的化合物是否增强或降低MLK蛋白的活性。此外，也测定试验的化合物是否促进细胞的生存或死亡。
用试验化合物接触的细胞可以是任何一种哺乳动物细胞。优选的细胞为神经细胞。优选的细胞是陷于神经退化疾病的神经细胞。为了本发明的目的，“神经退化疾病”、“神经退化紊乱”、和“神经退化状态”是可互换的并用于描述关于神经细胞或包含在神经系统中的细胞的任何疾病或紊乱，包括，但不限于，老年痴呆症、运动神经疾病、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化、帕金森氏症、脑血管疾病、缺血性状态、AIDS性痴呆、癫痫症、亨廷顿症、和大脑或脊髓的震荡性或穿透性损伤。阿尔次海默氏病、运功的神经元病、amyotrophic脊侧索硬化、帕金森氏病、脑血管病、局部缺血症、AIDS dementia，epilepsy，亨廷顿症和concussive or penetrating对大脑或脊柱的伤害。
有多种技术可以测定MLK蛋白的活性。例如，可通过检测MLK蛋白底物的活性来测定MLK的活性。这类底物为本领域的专业人员所熟知和容易地识别。优选的底物是活化蛋白激酶的激酶家族的分裂素中的一种或是活化蛋白激酶家族的分裂素或是进一步下游途径的底物，其包括，但不限于，选自下列组群的蛋白，包括JNK1，JNK2，JNK3，ERK1，ERK2，p38α，p38β，p38γ，p38δ，MEK1，MEK2，MKK3，MKK4(SEK1)，MEK5，MKK6，MKK7，jun，ATF2，ELK1，和AEX-3的哺乳动物同族体，也可是Ser/Thr蛋白激酶的一般底物，如髓磷脂碱性蛋白(MBP)。测定底物活性的试剂和方法为本领域的专业人员所熟知。
MLK的存在也可通过检测MLK蛋白的量或编码MLK蛋白的mRNA的量来测定。所用试剂包括抗体和寡核苷酸探针，以及检测DNA或蛋白量的方法，Northern和Western杂交，其为本领域的专业人士所熟知。MLK蛋白活性也可通过体内激酶试验来测定，体内激酶试验也为本领域的专业人士所熟知。其它为本领域专业人士所熟知的检测蛋白活性的技术也可包括在本发明中。因而，本领域的专业人士可以测定试验的化合物是否可调节，即增强或减低，MLK蛋白的活性。
可通过多种方法测定试验的化合物是否促进细胞的生存或死亡。优选地，对细胞生存或死亡的促进，可通过用有死亡危险的细胞来测定，比较用试验的化合物接触细胞后仍然保持存活的数量和不用试验的化合物接触细胞后仍然保持存活的数量。优选的细胞为前编程序性死亡的初始胚胎运动神经细胞。初始胚胎运动神经细胞的描述见于Maroney等，J.Neurosci.，1998，18，104-111。在此以其全文引作参考。除非用试验的化合物援救，否则初始胚胎运动神经细胞将会死亡。因此，在用试验化合物处理的运动神经细胞群中比在未用试验化合物处理的运动神经细胞群中有更多数目的存活运动神经细胞显示试验的化合物可促进细胞生存。相反，在用试验化合物处理的运动神经细胞群中比在未用试验化合物处理的运动神经细胞群中有更少数目的存活运动神经细胞显示试验的化合物可促进细胞死亡。
在本发明的另一个实施方案中，正常细胞、或野生型细胞通过MLK蛋白的过表达而转换成有死亡危险的细胞，如下述的实施例所描述，然后用试验的化合物与之接触。除非用试验化合物援救，否则MLK蛋白过表达的细胞可能死亡。MLK蛋白的过表达可由能够表达特殊蛋白的载体在细胞中完成。所用表达载体为本领域专业人士所熟知。此外，制备表达载体的方法也为本领域专业人士所熟知。表达任何一种MLK蛋白的表达载体的制备与实施例中所描述的相似。在用试验化合物处理的过表达细胞群中比在未用试验化合物处理的过表达细胞群中有更多数目的存活细胞显示试验的化合物可促进细胞生存。相反，在用试验化合物处理的过表达细胞群中比在未用试验化合物处理的过表达细胞群中有更少数目的存活细胞显示试验的化合物可促进细胞死亡。
在本发明的另一个具体实例中，对细胞生存的促进，可通过观察和检测细胞凋亡的降低来测定。细胞质收缩和细胞核浓缩与细胞凋亡相联系。因此本领域的专业人士可通过检测或观察细胞质收缩和/或细胞核浓缩来测定细胞凋亡的降低。此外，本领域的专业人士可用常规的染色技术测定细胞凋亡。
在本发明的另一个具体实例中，正常的、野生型神经细胞可被用来鉴别化合物是否促进细胞死亡。若未被试验化合物诱导至死亡，正常神经细胞将存活。在用试验化合物处理的正常细胞群中比在未用试验化合物处理的正常细胞群中有更少数目的存活细胞显示试验的化合物可促进细胞死亡。相反，在用试验化合物处理的正常细胞群中比在未用试验化合物处理的正常细胞群中有更多或相等数目的存活细胞不能显示试验的化合物可促进细胞死亡。
本发明的部分目的也在于提供调节MLK蛋白活性的方法，其包括用具有下列化学式G的化合物(本文表示为化学式I)接触蛋白或含有该蛋白的细胞，该化合列在美国专利号为5,705,511的专利中，其转让给本申请的受让人并以其全文在此引作参考。
本发明的部分目的也在于提供调节MLK蛋白活性的方法，其包括用具有下列化学式III的化合物接触蛋白或含有该蛋白的细胞：
III
式中：
Z1为H，Z2为H，或Z1和Z2一起形成＝O；
R1可供选择的基团包括：H，Cl，CH2SO2C2H5，Br，CH2S(CH2)2NH2，CH2S(CH2)2N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH2n-C4H9，NHCONHC6H5，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC6H5，N(CH3)2，CH3，CH2OCONHC2H5，NHCO2CH3，CH2OC2H5，CH2N(CH3)2，OH，O，n-丙基，CH＝NNH-C(＝NH)NH2，CH＝N-N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH-n-C4H9，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，
及
R2可供选择的基团包括：H，Br，Cl，I，CH2S(CH2)2N(CH3)2，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，和CH2OH；
X可供选择的基团包括：H，CH2OH，CH2NH-丝氨酸H，CO2CH3，CONHC6H52，CH2NHCO2C6H5，CH2NHCO2CH3，CH2N3，CONHC2H5，CH2NH-氨基乙酸，CON(CH3)2，-CH2NHCO2-，CONH2，CONHC3H7，CH2NH-丝氨酸，CH2SOCH3，CH＝NOH，CH2NH-脯氨酸，CH2CH2(2-吡啶基)，CH＝NNHC(＝NH)NH2，CONH(CH2)2OH，CH＝NNHCONH2，CH2OCOCH3，-CH2OC(CH3)2O-，CH2SC6H5，CH2SOC6H5，CO2n-己基，CONHCH3，和CO2(CH2)4CH3；或下列化学式之一
以及
R可供选择的基团包括：OH，和OCH3。
在本发明优选的具体实例中，Z1和Z2为H，X为CO2CH3，R1为NHCONHC2H5，R2为CH2CH2(2-吡啶基)，以及R为OH。在本发明其它的优选情形中，Z1和Z2为H，X为CO2CH3；R1和R2为CH2OCH2OCH2CH3，而R为OH；或Z1和Z2为H，X为CO2CH3，R1和R2为CH2SCH2CH3，而R为OH；或Z1，Z2，R1，和R2均为H，X为CO2CH3；而R为OH；或Z1，Z2，R1，和R2均为H，X为CO2(CH2)4CH3，而R为OH；或Z1，Z2，和R1为H，R2为CH2OH，X为CO2CH3，而R为OH；或Z1，和Z2为H，R1和R2为H2S[3-(1，2，4-三嗪)]，X为CO2CH3，而R为OH；或Z1，和Z2为H，R1为Br，R2为I，X为CO2CH3；而R为OH；或Z1，Z2为H，R1和R2为CH2CH2SCH3，X为CO2CH3，而R为OH；或Z1，Z2，R1，和R2为H，X为CO2CH3，而R为OCH3；或Z1和Z2一起形成＝O，R1和R2为Br，X为CO2CH3，而R为OH。
本发明的部分目的也在于提供调节MLK蛋白活性的方法，其包括用具有下列化学式II的化合物接触蛋白或含有该蛋白的细胞：
II
式中：
B环和F环，独立地，各自与其相连的碳原子在一起，选自下列基团，包括：
a)不饱和的6元碳芳香环，其中1至3个碳原子可被氮原子代替；
b)不饱和的5元碳芳香环；和
c)不饱和的5元碳芳香环，其中
1个碳原子被氧、氮、或硫原子所代替；
2个碳原子被1个硫原子和1个氮原子，1个氧原子和1个氮原子，或2个氮原子所代替；或
3个碳原子被3个氮原子所代替；
R1可供选择的基团包括：
a)H、可被取代或不可被取代的1-4个碳的烷基、可被取代或不可被取代的芳基、可被取代或不可被取代的芳烷基、可被取代或不可被取代的杂环芳基、或可被取代或不可被取代的杂环芳烷基；
b)-C(＝O)R9，其中R9可供选择的基团包括：烷基、芳基和杂环芳基；
c)-OR10，其中R10可供选择的基团包括：H和1-4个碳的烷基；
d)-C(＝O)NH2，-NR11R12，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)pOR10，-O(CH2)pOR10和-O(CH2)pNR11R12，其中p为1-4；及其中
R11和R12可供各自独立选择的基团包括：H和1-4个碳的烷基；或
R11和R12一起形成化学式为-(CH2)2-X1-(CH2)2-的连接基团，其中X1可供选择的基团包括：-O-，-S-、和-CH2-；
R2可供选择的基团包括：H，1-4个碳的烷基，-OH，1-4个碳的烷氧基，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)pNR11R12，-O(CH2)pOR10，可被取代或不可被取代的6-10个碳的芳香烷基、及可被取代或不可被取代的杂环芳香烷基；
R3，R4，R5和R6可供各自独立选择的基团包括：
H，芳基，杂环芳基，F，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH-，-OR9，-O(CH2)pNR11R12，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR2R7，--OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)pOR10，-CH2OR10，-NR11R12，-NR10S(＝O)2R9，-NR10C(＝O)R9；
-CH2OR14，其中R14为其羧基中的羟基移去后的氨基酸残基；
-NR10C(＝O)NR11R12，-CO2R2，-C(＝O)R2，-C(＝O)NR11R12，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)pNHR14，或-CH＝NNR2R2A其中R2A与R2相同；
-S(O)yR2-(CH2)pS(O)yR9，-CH2S(O)yR14其中y为0、1、或2；
1-8个碳的烷基、2-8个碳的烯基、2-8个碳的炔基，其中
每一个烷基、烯基或炔基是不可取代的；或
每一个烷基、烯基或炔基可为1-3个基团所取代的，可供选择的取代基团包括6-10个碳的芳基、杂环芳基、芳甲氧基、杂环烷氧基，羟基烷氧基，alkyloxy-alkoxy，hydroxyalkylthio，alkoxy-alkylthio，F，Cl，Br，I，-CN，-NO2，-OH，-OR9，-X2(CH2)pNR11R12，-X2(CH2)pC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pOC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pCO2R9，-X2(CH2)pS(O)yR9，-X2(CH2)pNR10C(＝O)NR11R12，-OC(＝O)R9，-OCONHR2，-O-tetrahydropyranyl，-NR11R12，-NR10C(＝O)R9，-NR10CO2R9，-NR10C(＝O)NR11R12，-NHC(＝NH)NH2，NR10S(O)2R9，-S(O)yR9，-CO2R2，-C(＝O)NR11R12，-C(＝O)R2，-CH2OR10，-CH＝NNR2R2A，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-S(＝O)2NR2R2A，-P(＝O)(OR10)2，-OR14，及5-7个碳的单糖其单糖的每一个羟基可各自独立地不被取代或被H所替换，1-4个碳的烷基，2-5个碳的alkylcarbonyloxy，或1-4个碳的烷氧基；
X2为O，S，或NR10；
R7和R8可供独立选择的基团包括：H、1-4个碳的烷基、1-4个碳的烷氧基、可替代或不可替代的6-10个碳的芳烷基、可替代或不可替代的杂环芳烷基、-(CH2)pOR10，-(CH2)pOC(＝O)NR11R12，和-(CH2)pNR11R12；或R7和R8一起形成化学式为-CH2-X3-CH2-的连接基团，其中X3为X2或键；
m和n各自独立地为0、1、或2；
Y可供选择的基团包括：-O-，-S-，-N(R10)-，-N+(O-)(R10)-，-N(OR10)-，和-CH2-；
Z可供选择的基团包括：键，-O-，-CH＝CH-，-S-，-C(＝O)-，-CH(OR10)-，-N(R10)-，-N(OR10)-，CH(NR11R12)-，-C(＝O)N(R17)-，-N(R17)C(＝O)-，-N(S(O)yR9)-，-N(S(O)yNR11R12)-，-N(C(＝O)R17)-，-C(R15R16)-，-N+(O-)(R10)-，-CH(OH)-CH(OH)-，和-CH(O(C＝O)R9)CH(OC(＝O)R9A)-，其中R9A与R9相同；
R15和R16可供独立选择的基团包括：H，-OH，-C(＝O)R10，-O(C＝O)R9，羟基烷基，和-CO2R10；
R17可供选择的基团包括：H、烷基、芳基、和杂环芳基；
A1和A2可供选择的基团包括：H，H；H，OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；及基团其中的A1和A2一起形成＝O，＝S，和＝NR2；
B1和B2可供选择的基团包括：H，H；H，-OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；及基团其中的B1和B2一起形成＝O，＝S，和＝NR2；
附带条件是成对的A1和A2，或B1和B2中至少一对形成＝O。
本发明的部分目的也在于提供调节MLK蛋白活性的方法，其包括用具有下列化学式IV的化合物接触蛋白或含有该蛋白的细胞：
page 22
IV
式中：
Z1为H，Z2为H或Z1和Z2一起形成＝O；
R1为H或Br；
R2为H；
R3为H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，(插入化学式page 22)
或
及
R4为H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
在本发明优选的具体实例中，R1，R2，R4，Z1，和Z2为H，而R3为CH2CH＝CH2。在本发明的另一个具体实例中，R1为Br，而R2，R3，R4，Z1和Z2均为H；或R1，R2，Z1和Z2均为H，而R3和R4为CH2CH＝CH2；或R1，R2，R3，Z1，和Z2均为H，而a R4为CH2CH＝CH2；或R1，R2，Z1，和Z2均为H，而R3和R4为CH2CH2CH2OH；或R1，R2，R4，Z1，和Z2为H，而R3为
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本发明也提供了鉴别可用于治疗神经退化紊乱的化合物的方法，其包括用化合物接触包含多谱系激酶蛋白的细胞或细胞提取物并测定该化合物减低多谱系激酶蛋白活性的(状况)。所用的细胞或提取物，包括上文所描述过的。用本发明的方法所发现的化合物(即，可抑制或减低多谱系激酶蛋白活性的化合物)可用于治疗神经退化紊乱。优选的蛋白选自以下组群，包括多谱系激酶1、多谱系激酶2、多谱系激酶3、亮氨酸拉链支撑激酶、双亮氨酸拉链支撑激酶和多谱系激酶6。细胞可在体外或体内接触。优选的蛋白活性的测定方法是通过测定活性或所用蛋白底物的磷酸化作用的状态。优选的底物选自以下组群，包括JNK1，JNK2，JNK3，ERK1，ERK2，p38α，p38β，p38γ，p38δ，MEK1，MEK2，MKK3，MKK4(SEK1)，MEK5，MKK6，MKK7，jun，ATF2，ELK1，和AEX-3的哺乳动物同族体，以及通用的Ser/Thr底物，例如，髓磷脂碱性蛋白(MBP)。蛋白的活性测定也可通过测定蛋白底物的活性、蛋白底物的量、或编码蛋白底物的mRNA来实现。蛋白的活性测定也可通过体外激酶试验或结合试验来进行。优选的细胞为初始胚胎运动神经细胞，多谱系激酶蛋白过度表达的细胞，或神经细胞，但也可以是任一细胞或其提取物。优选地，与多谱系激酶蛋白直接结合的化合物的鉴别如上文所描述。
本发明也提供了鉴别可用于治疗炎症的化合物的方法，其包括用化合物接触包含多谱系激酶蛋白的细胞或细胞提取物并测定该化合物减低多谱系激酶蛋白活性的(状况)。所用的细胞或提取物，包括上文所描述过的。用本发明的方法所发现的化合物(即，可抑制或减低多谱系激酶蛋白活性的化合物)可用于治疗炎症。优选的蛋白选自以下组群，包括多谱系激酶1、多谱系激酶2、多谱系激酶3、亮氨酸拉链支撑激酶、双亮氨酸拉链支撑激酶和多谱系激酶6。细胞可在体外或体内接触。优选的蛋白活性的测定方法是通过测定活性或所用蛋白底物的磷酸化作用的状态。优选的底物选自以下组群，包括JNK1，JNK2，JNK3，ERK1，ERK2，p38α，p38β，p38γ，p38δ，MEK1，MEK2，MKK3，MKK4(SEK1)，MEK5，MKK6，MKK7，jun，ATF2，ELK1，和AEX-3的哺乳动物同族体，以及通用的Ser/Thr底物，例如，髓磷脂碱性蛋白(MBP)。蛋白的活性测定也可通过测定蛋白底物的活性、蛋白底物的量、或编码蛋白底物的mRNA来实现。蛋白的活性测定也可通过体外激酶试验或结合试验来进行。
优选的细胞为初始胚胎运动神经细胞，多谱系激酶蛋白过度表达的细胞，或神经细胞，但也可以是任一细胞或其提取物。所用的细胞包括，但不限于，陷于炎症的细胞，诸如为本领域专业人员所熟知的淋巴细胞、巨噬细胞和其它白血细胞。优选地，与多谱系激酶蛋白直接结合的化合物的鉴别如上文所描述。
本发明也提供了治疗有或怀疑有神经退化紊乱的哺乳动物方法，其包括给上述哺乳动物服用可抑制或减低多谱系激酶蛋白活性的化合物。可抑制或减低多谱系激酶蛋白活性的化合物包括，但不限于，具化学式I、II、III、和IV的化合物。优选的化合物包括上文所描述的那些化合物，及关于筛选可调节多谱系激酶蛋白和促进细胞存活或死亡的化合物的方法。优选的哺乳动物为人类。如果个体具有特别的神经退化疾病症状，其被怀疑患有神经退化疾病，并处于高度危险人群中，或具有神经退化疾病家族史。
本发明也提供了治疗患有炎症的哺乳动物方法，其包括给上述哺乳动物服用可抑制或减低多谱系激酶蛋白活性的化合物。可抑制或减低多谱系激酶蛋白活性的化合物包括，但不限于，具化学式I、II、III、和IV的化合物。优选的化合物包括上文所描述的那些化合物，及关于筛选可调节多谱系激酶蛋白和促进细胞存活或死亡的化合物的方法。优选的哺乳动物为人类。
与具有化学式I-IV的化合物的接触可发生在缓冲液或培养基中，其为本领的专业人员所熟知。或者，该接触发生于使用制药合成物，其包含试验的化合物和制药上可接受的盐、载体、或适合于动物或哺乳动物的稀释液，这些动物如老鼠或其它为本领专业人员所熟知的合适动物。另外，需要使用各种数量的细胞和各种浓度的化合物。被试验的化合物所接触的细胞可以是任何一种哺乳动物细胞。优选的细胞是神经细胞。优选的细胞要陷于神经退化疾病，例如，老年痴呆症、运动神经疾病、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化、帕金森氏症、脑血管疾病、缺血性状态、AIDS性痴呆、癫痫症、亨廷顿症、和大脑或脊髓的震荡性或穿透性损伤。具有化学式I的化合物，及制备该化合物的方法，描述于美国专利号为5,705,511的专利中，本文按其完整意义引之为参考文献。具有化学式III的化合物，及制备该化合物的方法，描述于美国专利号为5,741,8098，5,621,100，5,621,101，5,461,146，和5,756,494，及WO97/46567的专利中，每一个专利，本文均按其完整意义引之为参考文献。具有化学式IV的化合物，及制备该化合物的方法，描述于美国专利号为5,741,8098，5,621,100，5,621,101，5,461,146，和5,756,494，及WO97/46567的专利中，每一个专利，本文均按其完整意义引之为参考文献。
具有化学式II的化合物，包括diasteriomers和enantiomers在碳原子周围，取代基R2，R7，和R8与之相连。
优选的桥连茚并吡咯并咔唑为化学式II所代表：
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在一些优选的，具化学式II的化合物的具体实例中，R1为H。在更进一步优选的具体实例中，R2为H，羟基，或不可取代的烷基。
在其它优选的具体实例中，R3，R4，R5，和R6，各自独立的为H、可取代的或不可取代的烷基、卤素、可取代或不可取代的烷氧基、可取代或不可取代的氨基、或可取代或不可取代的芳基。在更进一步优化的具体实例中，R7和R8各自独立的为H，或可取代的或不可取代的烷基。
在一些优选的具体实例中，Y为O。在更进一步优选的具体实例中，Z为a键，O，S，或可取代的或不可取代的N。在再进一步优化的具体实例中，m和n各自独立为1或2。在一些特别优化的具体实例中，Y为O，Z为键或O，而m和n各自独立为1或2。
在进一步优化的具体实例中，A1A2和B1B2为＝O或H，H。
在一些特别优化的具体实例中，R1，R4，R6，和R7均为H，Y为＝O，n为1，A1A2和B1B2为＝O或H，H，R2为H，OH或低级烷基，R3为H或取代的烷基，R5和R8均为H或烷氧基，并以甲氧基为优化，Z为键或O，而m为1或2。
具有化学式II的化合物的一些特别优化的具体实例为化合物II-1，II-2，II-3，II-4a，II-4b，II-5，II-6，II-7a，II-7b，II-8，II-9，II-10，II-11，和II-12，列于下文的表1中。
化学式II所代表的化合物在下文中称为化合物(II)。
如本文所用，术语“碳环的”指环形基团其中的环部分只有碳原子组成。术语“杂环”和“杂环的”指环形基团其中的环部分包括至少一种杂环原子，如O，N或S。
如本文所用，术语“烷基”意指直链的、环链的、或分支的烷基团，其又有1至8个碳原子，如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、顺-丁基、反-丁基、戊基、异戊基、新戊基、1-乙基丙基、己基、辛基、环丙基、和环戊基。含甲基基团如、烷氧基、烷氧羰基、和烷基胺羰基基团中的甲基部分与上述定义的甲基有相同的意思。优选的较少碳原子的烷基基团，是上述定义的含1至4个碳原子的基团。术语“烯基”是指包含直链或分支的碳氢链中至少有一个碳-碳双键。烯基基团的例子包括乙烯基和丙烯基。如本文所用，术语“炔基”是指包含直链或分支的碳氢链中至少有一个碳-碳三键。炔基基团的例子包括乙炔基和丙炔基。
含酰基的基团如酰氧基的酰基部分是指包含1至6个碳原子的直链或分支的烷酰基，如甲酸基、乙酸基、丙酰基、丁酰基、戊酰基或己酰基。
如本文所用术语“芳基”意指含6-12个碳原子的基团，如苯基、二苯基和萘基。优选的芳香基团包括可取代的或不可取代的苯基和萘基。本文所用的术语“杂环芳基”是指在芳基基团的环上的一个或多个碳原子被杂原子(即非碳原子)如O、N或S所取代。优选的杂环芳基包括吡啶基、嘧啶基、pyrrolyl，furyl，thienyl，imidazolyl，triazolyl，terzolyl，quinolyl，isoquiolyl，benzoimidazolyl，thiazolyl，pyrazolyl和benzothiazolyl。
术语“芳烷基”(或“arylalkyl”)是指有7-15个碳原子的基团，其包含一个烷基基团支撑一个芳基基团。芳烷基基团的例子包括苯甲基、苯乙基、二苯甲基和萘甲基。
烷基基团和包含在取代基团如和酰氧基中的烷基部分可被取代或不被取代。被取代的烷基基团有1-3个可供选择的独立的取代基团，优选的为羟基、低级烷氧基、低级alkoxy-alkoxy，可取代的或不可取代的arylalkoxy-lower alkoxy，可取代的或不可取代的杂芳烷氧基-低级烷氧基，可取代的或不可取代的芳烷氧基、取代或未取代的杂环烷氧基、卤素、羧基、低级烷氧羧基、硝基、氨基、单或双低级烷氨基、二氧杂环乙烷、dithiolane，dithione，呋喃、内酯、或内酰胺。
取代的芳基、取代的杂芳基和取代的芳烷基每1个有1-3个可独立选择的取代基，其优选的为低级烷基、羟基、低级烷氧基、羧基、低级烷氧羰基、硝基、氨基、mono-or di-低级alkylamino、和卤素。
1个氮原子形成的杂环基团包括和三氮杂茂。1个氧原子形成的杂环基团包括呋喃、四氢呋喃、吡喃、和四氢吡喃。
“羟烷基”基团是指在烷基上另外加上1个羟基基团。
卤素包括氟、氯、溴和碘。
如本文所用，术语“杂环芳烷基”是指包含杂环原子的芳烷基。术语“含氧”指存在氧原子。因而，“烷氧基”基团是指通过氧原子连着的烷基基团，而“羰基氧”是指通过氧原子连接的羰基基团。
术语“杂环烷氧基”是指具有与其烷基部分相连的杂环基团的烷氧基基团，而术语“芳香烷氧基”是指具有与其烷基部分相连的芳基基团的烷氧基基团。术语“烷羰基氧”是指具化学式-O-C(＝O)-烷基的基团。
如本文所用，术语“alkyloxy-烷氧基”是指包含与其烷基部分相连的alkyloxy替代的烷氧基基团。术语“烷氧基-alkylthio”是指包含与其烷基部分相连的烷氧基替代的alkylthio基团(即，具化学式-S-烷基的基团)。术语“羟基-alkylthio”是指包含与其烷基部分相连的羟基替代的的alkylthio基团(即，具化学式-S-烷基的基团)。
如本文所用，术语“单糖”具有其通常的意思即简单的糖。
如本文所用，术语“氨基酸”是指既含有氨基又含有羧基的分子。氨基酸的具体实例包括α-氨基酸；即具有一般化学式HOOC-CH(NH2)-(侧链)的羧基。
氨基酸的侧链包括天然存在和非天然存在的部分。非天然存在的(即，非天然的)氨基酸侧链是指占据天然氨基酸侧链所在部位的部分，例如，氨基酸类似物。参见Lehninger，Biochemistry，Second Edition，Worth Publishers，Inc.，1975，73-75页，本文引用为参考文献。
优选的α-氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、和赖氨酸，其具有D构型、L构型、或外消旋物。
更多的代表性α-氨基酸的侧链示于下述的表1中。
表1
CH3-                         HS-CH2-
HO-CH2-                      HO2C-CH(NH2)-CH2-S-S-CH2-
C6H5-CH2-                    CH3-CH2-
HO-C6H4-CH2-                 CH3-S-CH2-CH2-
CH3-CH2-S-CH2-CH2-
HO-CH2-CH2-
CH3-CH(OH)-
HO2C-CH2-NHC(＝O)-CH2-
(插入化学式page 29)
HO2C-CH2-CH2-
NH2C(＝O)-CH2-CH2-
(CH3)2-CH-
(CH3)2-CH-CH2-
CH3-CH2-CH2-
H2N-CH2-CH2-CH2-
H2N-C(＝NH)-NH-CH2-CH2-CH2-
H2N-C(＝O)-NH-CH2-CH2-CH2-
CH3-CH2-CH(CH3)-
CH3-CH2-CH2-CH2-
H2N-CH2-CH2-CH2-CH2-
在一些优选的具体实例中，具化学式II的化合物的取代基团包括移去羧基中的羟基部分后的氨基酸残基；如，具有化学式-C(＝O)-CH(NH2)-(侧链)的基团。
存在于化学式II中的功能基团可能包含保护基团。例如，化学式II的化合物的氨基酸侧链取代可被保护基团如benzyloxycarbonyl或t-butoxycarbonyl基团所取代。保护基团本质上为化学功能基团，其可选择性地加上和移去。如，羟基基团和羧基基团。这些基团存在于化学化合物中，可致使功能惰性达到化学反应条件，而化合物暴露于此。各类保护基团中的任一种均可用于本发明。这类保护基团中1个是benzyloxycarbonyl(Cbz；Z)基团。本发明中其它的优选保护基团可在Greene，T.W.和Wuts，P.G.M.，“Protective Groups in OrganicSynthesis”2d.Ed.，Wiley & Sons，1991中找到。
BI化合物已显示在多个方面有重要药学功能活性，包括研究和治疗两个领域。这些衍生物可用作治疗试剂。这些化合物的活性对营养因子响应细胞的功能和/或生存具有正效应。对营养因子响应细胞，例如神经元谱系细胞，的功能和/或生存的效应可通过下列任一实验来证实：(1)培养脊髓乙酰胆碱转移酶(“ChAT”)试验；或(2)培养基前脑神经细胞ChAT活性试验。
如本文所用，术语“效应”当其用于修饰术语“功能”和“生存”时意为正的或负的变更或改变。本文的正效应指“增加”或“增强的”而负效应指“抑制”或“抑制的”。
如本文所用，术语“增加”或“增强的”当其用于修饰术语“功能”或“生存”时意为与细胞无该化合物相比，细胞存在BI化合物对营养因子响应细胞的功能和/或生存产生正效应。例如，但不限于此例，关于如胆碱能神经细胞的生存，该化合物经证明能使有死亡危险(如由于损伤、疾病情形、退化情形或自然进程)的胆碱能细胞群与无该化合物时相比生存力增强。处理过的群系较未处理的群系有相对更长的功能期。
如本文所用，“抑制”和“抑制状态”意指指定材料(如，酶的活性)的特殊反应在有BI化合物存在时相对减低。
如本文所用，术语“trk”指高度亲合的神经营养素受体家族，目前包括trkA、trkB、和trkC，以及其它神经营养素可结合的膜连蛋白。
如本文所用，VEGFR的抑制意指用于，如，血管发生起重要作用的疾病，比如实性肿瘤癌、子宫内膜异位、糖尿病型视网膜病、牛皮癣、成血管细胞瘤，以及其它眼的疾病和癌症。
Trk的抑制意指用于，例如，前列腺疾病如前列腺癌和量性的前列腺增生，和炎症性疼痛的治疗。
血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)的抑制意指用于，例如，各种形式的瘤形成，比如P31P4等。
如本文所用，术语“癌”和“癌的”指哺乳动物的任何一种细胞的恶性增生。具体例子包括P31P5，和其它可识别的癌。
如本文所用，术语“神经元”、“神经谱系细胞”和“神经细胞”包括，但不限于，具有单个或多个传感器和/或单个或多个功能的异源神经类型群系；优选的为胆碱能和感觉神经细胞。如本文所用，词组“胆碱能神经细胞”意指中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)的神经细胞，其神经传感器是乙酰胆碱；具体例子如基前脑、纤维、和脊髓神经细胞。如本文所用，词组“感觉神经细胞”包括对来自如皮肤、肌肉和关节的环境暗示(如，温度，运动)产生反应的神经细胞，具体例子是背根神经节的神经细胞。
如本文所定义，“营养因子响应细胞”是包括营养因子可与之特殊结合的受体的细胞；具体例子包括神经细胞(如胆碱能神经细胞和感觉神经细胞)和非神经细胞(如单核细胞和瘤细胞)。
本文所描述的BI化合物已发现可用于研究和治疗领域，例如，酶活性的抑制。比如，在研究领域，该化合物可用于试验和模型的开发以便进一步增进理解其对丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸蛋白激酶(如，PKC、trk酪氨酸激酶)的抑制作用，其可在相关紊乱和疾病的机械方面起作用。在治疗领域，该化合物抑制一些酶的活性，可用于抑制与癌一类的紊乱的有关这些酶的有害后果。
如下列实施例所示，可通过下列所列举的试验来测定用BI化合物对酶活性的抑制：
trkA酪氨酸激酶活性抑制试验
完整细胞标本中NGF-stimulated trk的磷酸化抑制；
血管内皮生长因子受体(VEGFR)激酶抑制试验；
PKC活性抑制试验；
PDGFR抑制试验。
公开的BI化合物可用于增强哺乳动物，如人类，的神经元谱系细胞的功能和/或生存。在上下文中，该化合可单独使用，或和其它保险的吡咯并咔唑和/或吲哚并咔唑，或与其它有益的分子一起使用，这些有益分子也能够影响指定的细胞的功能和/或生存。
各种神经错乱的特征在于神经细胞，其正在死亡、损伤、功能损害、经历轴突恶化、有死亡危险等。这些错乱包括，但不限于此：老年痴呆症；运动神经紊乱(如，肌萎缩性(脊髓)侧索硬化)；帕金森氏症(震颤性麻痹)；脑血管紊乱(如，中风、局部缺血)；亨廷顿氏症；艾滋病痴呆；癫痫症；多发性硬化；外周神经病(如，在化疗外周神经病时影响DRG神经细胞的疾病)，包括糖尿病性神经病和AIDS外周神经病；由兴奋氨基酸诱导的紊乱；及与大脑或脊髓的震荡或穿透相关的紊乱。
ChAT催化神经传感器乙酰胆碱的合成，其可被认为是功能性胆碱能神经细胞的酶标记。功能性神经细胞也能生存。神经细胞的生存可通过存活的神经细胞专一吸收的量和染料的酶转化来检测。
因其用途多样，本文所描述的化合物，包括那些通过本文所描述的方法鉴别的化合物，可应用于多个领域。这些化合物可用于神经细胞生存、功能、鉴定的体外模型的开发，或应用于筛选其它合成化合物其与本文所描述的化合物具有相似的活性，或应用于本文所描述的方法所鉴别的化合物。本文所描述的化合物，以及用本文所描述的方法所鉴别的化合物，可用于研究领域以调查、定义和测定与功能性响应相关的分子标靶。例如，通过放射标记一个BI化合物，或一个由本文所描述的方法所鉴别的化合物，其与专一的细胞功能(如有丝分裂发生)相联系，衍生物结合的标靶实体可被鉴别、分离和纯化以便研究其特征。
本文描述的化合物，以及用本文描述的方法鉴别的化合物，和其他的事物，不仅可用于增强营养响应细胞的营养因子诱导的活性，如胆碱能神经细胞，也可作为其它神经细胞类型的生存促进剂，如，多巴胺能的或glutamatergic。生长因子可通过向小的GTP结合蛋白下游信号的级联传送来调节神经细胞的生存，这些蛋白包括，但不限于，ras，rac，和cdc42(Denhardt，Biochem.J.，1996，318，729)，特别地，ras的活化导致磷酸化作用和细胞外受体活化激酶(ERK)的活化，其与生物生长和分化过程相连。刺激rac/cdc42导致JNK和p38活化的增强，其反应是与之相连的压力、凋亡和炎症。虽然生长因子的反应主要通过EPK途径，影响这些后续过程可导致神经细胞生存的另一可选择的机制，同效生长因子增强生存特征(Xia et al.，Science，1995，270，1326)。这类化合物也可通过与之相关的机制用作神经细胞和非神经细胞的生存促进剂，但也不同于生长因子调节生存，例如，抑制JNK和p38途径，其可通过抑制程序型细胞死亡过程导致生存。
本发明提供的化合物可用于治疗与降低ChAT活性相关的紊乱或死亡、脊髓运动神经细胞的伤害，也可用于治疗，如，与中枢和外周神经系统、免疫系统的程序性细胞死亡相关的疾病，及炎症型疾病。
本文所描述的化合物也可用于治疗疾病状态包括恶性细胞增生，如多种癌症。
药学上可接受的本文所描述的化合物的盐，以及由本发明方法鉴别的化合物，包括，药学上可接受的酸加成盐、金属盐、铵盐、有机铵加成盐、和氨基酸加成盐。酸加成盐的例子是无机酸加成盐，如盐酸盐、硫酸盐和磷酸盐；有机酸加成盐如醋酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐和乳酸盐；金属盐的例子是碱金属盐如锂盐、钠盐和钾盐，碱土金属盐如镁盐和钙盐，铝盐，和锌盐；铵盐的例子为铵盐和四甲基铵盐；有机铵加成盐的例子为具吗啉和哌啶的盐；氨基酸加成盐的例子为苷氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和赖氨酸形成的盐。
本文提供的化合物，包括由本发明方法鉴别的化合物，可作为药物成分，其通过与药学上可接受的无毒赋形剂和载体混合。这些成分可制备成适用于肠胃外投药，特别是制成液体溶液或悬浮液形式；或口服药，特别是制成片剂或胶囊；或鼻腔内投药，特别是制成粉剂、滴鼻剂、或气雾剂；或皮肤投药，如通过，经皮贴片。
药用成分可方便地制成单位剂量形式，可通过制药领域所熟知的方法中的任何一种来制备，例如，按Remington’s PharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.，Easton，PA，1980)所描述的方法制备。肠胃外投药的配制可包含常见的赋形剂、无菌水或盐水，聚(亚烷基)二醇类如聚乙二醇、油脂和植物油，氢化萘及类似物。特别地，生物适合的、生物可降解的丙交酯聚合体，丙交酯/乙交酯联合聚合体，或聚氧乙烯-聚氧丙烯联合聚合体可用作赋形剂以控制活性化合物的释放。其它适用于这类化合物的潜在肠胃外传送系统包括乙烯-醋酸乙烯联合聚合体颗粒、渗透泵、可移植的浸制系统、和脂质体。吸入给药的配制包括作为赋形剂，例如，乳糖，或包含其的水溶液，例如聚甲醛-9-月桂醇酯，甘胆酸盐和去氧胆(酸)盐，或以滴鼻剂给药的油溶液，或适合于鼻内使用的凝胶。肠胃外投药的配制也可包括口腔给药的甘胆酸盐，直肠给药的水杨酸盐，或阴道给药的柠檬酸。经皮贴片投药的配制优选亲脂性的乳剂。
本发明中化合物作为药物成分中的唯一活性物质。或者，可与其它活性成分联合使用，如，其它生长因子，其可促进疾病或紊乱的神经细胞生存或轴突再生。
本发明的化合物和包含该化合物的药学上可接受的盐类可用于口腔或非口腔给药，例如，作为药膏或注射用药。本发明的化合物在治疗成分中的浓度可以变化。其浓度依照如下因子而变化，所给药物的总剂量，所用化合物的化学特征(如，疏水性)，给药的方式，病人的年龄、体重和症状等。本发明的化合物的典型用法是以含该化合物大约0.1至10％w/v的水溶性生理缓冲液的形式肠胃外给药。典型的剂量范围是每天约1μg/kg至约1g/kg体重；优选的剂量范围为每天约0.01mg/kg至100mg/kg体重，而优选的每天1至4次给药的每次剂量为约0.1至20mg/kg体重。优选的使用药物的剂量依赖下列因素而变化，诸如疾病或紊乱的类型和发展程度，特殊病人的总体健康状况，所选择化合物的相对生物活性，化合物赋形剂的配制，以及给药的方式。
本发明的化合物，包括试验用化合物和由本发明的方法鉴别的化合物，以及制药上可接受的包含其的盐类，可以单独使用，或根据药学活性和给药的目的以各种制药成分的形式。根据本发明的制药成分可制备成均一的混合物，其包含作为活性成分的有效量的该化合物或其制药上可接受的盐类，及制药上可接受的载体。根据适合于给药的药物成分的形式，载体的形式范围较宽。期望这类药物成分制备成单位剂量形式以适合于口服或非口服给药。非口服给药的方式包括药膏和注射。
片剂的制备要使用赋形剂，诸如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纤维素，裂解剂诸如淀粉、藻酸钠、羧甲基纤维素和结晶纤维素，滑润剂诸如硬脂酸镁和滑石，粘合剂诸如白明胶、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啉、羟丙基纤维素和甲基纤维素，表面活性剂诸如蔗躺脂肪酸酯和山梨(糖)醇脂肪酸酯，以及常规制药上用的类似物。优选的剂量是每个片剂中含15-300mg的活性成分。
颗粒剂的制备要使用赋形剂，诸如乳糖和蔗糖，裂解剂诸如淀粉，粘合剂诸如白明胶，以及常规制药上用的类似物。粉剂的制备要使用赋形剂，诸如乳糖和甘露醇，以及常规制药上用的类似物。胶囊的制备要使用白明胶、水、蔗糖、阿拉伯树胶、山梨糖醇、甘油、结晶纤维素、硬脂酸镁、滑石，以及常规制药上用的类似物。优选的剂量是每个胶囊中含15-300mg的活性成分。
糖浆制剂的制备使用糖诸如蔗糖，水，乙醇，以及常规制药上用的类似物。
药膏的制备使用膏基诸如凡士林、液体石蜡、羊毛脂和macrogol，乳化剂诸如月桂醇乳酸钠、杀藻胺、山梨醇单脂肪酸酯、羧甲基纤维素钠和阿拉伯树胶，以及常规制药上用的类似物。
注射剂的制备使用溶剂诸如水、生理盐水、植物油(如橄榄油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇，加溶剂诸如安息香酸钠、水杨酸盐钠和氨基甲酸脂，等渗剂诸如氯化钠和葡萄糖，防腐剂诸如苯酚、甲酚、对-羟基安息香酸酯和氯代丁醇，抗氧化剂诸如抗坏血酸维生素C和焦亚硫酸钠，以及常规制药上用的类似物。
本发明通过下列实施例得到进一步说明，这些实施例旨在阐明本发明。这些实施例不说明、也不能理解为限制发明公开的范围。实施例实施例1：合成过程的概括描述和实施例
用于制备本发明中具有化学式II的桥连茚并吡咯并咔唑的一般合成途径示于图1和图2。合成茚并吡咯并咔唑(III)/(VIII)的一般程序可按美国专利号5,705,511所描述的执行，其所公开的内容本文完整地引用为参考文献。当R1为H时，茚并吡咯并咔唑(III)/(VIII)中内酰胺氮为合适的保护基团所保护而生成(IV)/(IX)。用合适的碱在无水的有机溶剂中处理被保护的化合物，将产生暗红色的溶液，其被认为是负碳离子。负碳离子与双功能试剂(V)反应导致(V)中的C＝Y键亲电子加成产生初始的中间产物(VI)/(X)。用磺酸或路易斯酸，如三氟化硼酯盐，处理中间产物(VI)(X)和/或(VII)/(XI)，产生桥连茚并吡咯并咔唑(I)/(II)。
内酰胺氮的保护策略(示于图3和图4)可通过酸或碱催化过程来实施。酸催化反应可用树脂粘合试剂不使茚并吡咯并咔唑(III)/(VIII)移动而形成聚合支撑，如聚苯乙烯为基础的，Rink酸树脂(XII)(图3)，生成(XIII)。另一个选择为，执行可溶试剂的酸催化反应产生化合物(XIV)(图4)。在碱催化条件下产生甲硅烷基保护的化合物(XV)(图4)。
图5描述制各中间产物(V)的几种方法。程序(a)描述各种乙缩醛(XVI)至(XVII，Z＝粘合剂)的转化。例如，酯-乙缩醛/缩酮(XVI，D＝COOR)完全还原为乙醇并氧化为醛-乙缩醛/缩酮(XVII，R8＝H)。另一个选择是，酯-乙缩醛/缩酮(XVI，D＝COOR)用DIBAL部分还原而直接提供醛(XVII，R8＝H)。与之相似，腈-醛(XVI，D＝CN)用DIBAL还原生成醛(XVII，R8＝H)。酮-乙缩醛/缩酮的制备是在Weinreb氨基-乙缩醛/缩酮(XVI，D＝CON(OMe)Me)中加入格氏试剂。
中间产物(XVII，Z＝键)也可通过程序(b)中所描绘的两步程序获得。将有机金属试剂(XIX)加至乙缩醛/缩酮(XVIII)中产生烯烃(XX)，其通过臭氧分解及随后的还原整理提供酮-乙缩醛/缩酮(XVII)。中间产物(XVII，Z＝杂环原子)的两步制备程序在程序(c)中描绘。耦合乙缩醛(XXII)与烯烃(XXI)经由产生的烯烃的臭氧分解(伴随一个还原整理)产生酮-乙缩醛/缩酮(XVII)。可供选择的方法是，程序(d)中描绘的中间产物(XVII，Z＝杂环原子)的两步制备程序。化合物(XXIV)与乙缩醛/缩酮(XVIII)反应产生(XXV)，其可通过程序(a)所描述的方法转化成酮-乙缩醛/缩酮(XVII)。酮-乙缩醛/缩酮(XVII)经用羟胺、肼、N-烷基-N-烷氧基胺、和胺的浓缩产生中间产物(XXVI)，其具有功能上亲电子的C＝N。
树脂粘合的茚并吡咯并咔唑(XIII)(图6，方法A)用过量的作为碱的格氏试剂处理，将产生暗红色的负碳离子溶液。随后与试剂(V)反应导致(V)中的C＝Y基团亲电子加成产生的产物。用磺酸或路易斯酸，如三氟化硼酯盐，处理中间产物(XXVII)和/或(XVIII)，产生桥连茚并吡咯并咔唑(II)。
相似的策略应用于可溶的内酰胺保护的中间产物，如(XV)(图7，方法B)。然而，在此情形下。中间产物(XV)在嘧啶作为碱代替格氏试剂，用Triton B处理。中间产物(XXIX)和/或(XXX)可用内酰胺保护基团完整来分离，其可进一步通过色谱纯化。如方法A所示，(图6)，用Lewis酸(如三氟化硼etherate)处理可产生IB(II)，其中R1＝H。
基团R3，R4，R5和R6的引入可按美国专利号5,705,511和4,923,986所描述的来执行，其公开的文件以其完整形式引用为参考文献。R3取代基团的引入则在BI构建之后，如图8所示。B环的3号位用NBS溴化生成化合物(XXXI)。含碳片段随后通过钯催化的Stille，Suzuki，Heck，Kumada或Castro-Stephens反应导入以生成(XXXII)，(XXXIII)等型的化合物。此外，化合物(XXXI)可提供接近化合物，其中溴基团用杂原子取代，例如基于胺的基团采用Buchwald钯催化的氨基化化学。
通过氧化过程，氧连的基团可被导入E环的茚碳中，如图9的化合物(XXXIV)所示。这一化学过程也导致内酰胺(A环)的亚甲基基团的氧化并形成如图所示的酰亚胺衍生物。实施例2：Rink树脂粘合中间产物：(XIII-A)、(XIII-B)和(XIII-C)的制备，(图3)实施例2-A
顶端带有机械搅拌器和迪安和斯塔克水闸的三颈圆底烧瓶中装入Rink酸树脂XII(10.00g，0.64mmol/g)，1-甲基-2-pyrolidinone(80mL)，苯(350mL)，VIII-A(3.00g)和对-甲苯磺酸(1.00g)。反应混合物保温回流20小时，然后过滤。用THF(5×175mL)洗涤树脂，留用滤出液。然后，依次用DMSO(4×100mL)，2％NaHCO3水溶液(4×100mL)，水(4×100mL)，DMSO(2×200mL)，THF(4×100mL)和乙酸乙酯(4×100mL)洗涤树脂。树脂经真空干燥(24小时)，获得11.70(0.47mmol/g)的树脂粘合VIII-A(XIII-A)。
最初的THF滤出液经蒸发，剩余物用水(750mL)稀释，沉淀物经过滤并依次用水，2％NaHCO3水溶液(4×100mL)，和水(4×100mL)洗涤。真空干燥后，可回收VIII-A(1.28g)。实施例2-B
用相似的方式，VIII-B()(0.5g)与Rink酸树脂XII(1.52g)结合，获得1.58g树脂粘合的VIII-B，(XIII-B)。实施例2-C
用相似的方式，VIII-C()(1.02g)与Rink酸树脂XII(3.12g)结合，获得3.70(0.46mmol/g)树脂粘合的VIII-C，(XIII-C)，及回收的VIII-C(0.44g)。实施例3：化合物(II-1)、(II-2)、(II-3)、(II-4a)、(II-4b)、(II-6)(II-8)的制备(方法A，图6)实施例3-A
在(XIII-A)(1.25g)的THF(24mL)悬浮液中加入1.0M的EtMgBr(6.25mL溶于THF)溶液，该反应在加入HMPA(5.0mL)前搅动1小时。搅动10分钟后，加入diethoxybutyraldehyde(3.0g)(其制备按照文献程序进行Paquette等，J.Am.Chem.Soc.，1997，119，9662-71)，反应搅动20小时。用10％NH4Cl(5mL)水溶液终止反应并过滤。树脂依次用10％NH4Cl(3×10mL)水溶液、水(3×10mL)、THF(3×10mL)、DMF(3×10mL)、水(3×10mL)和and醚(3×10mL)洗涤。树脂经真空干燥，用methylene chloride(15mL)吸收，并用三氟乙酸(0.15mL)处理。反应1小时后，过滤，滤液经蒸发。所得残留物用methylene chloride(20mL)吸收并用pyridinium tosylate(50mg)处理，所得溶液搅动4小时。此时，用饱和的NaHCO3水溶液和盐水洗涤反应产物，并用MgSO4干燥。
经过过滤和溶剂蒸发后，残留物用制备HPLC(Zorbax RX-8，4×25cm，采用60％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸洗脱)纯化。合适的馏分用NaHCO3中和，抽提到methylene chloride(3×50mL)中，并用MgSO4干燥。经过过滤和溶剂蒸发后，可获得70.2mg的化合物II-1，其为白色粉末并具下列特征：13C NMR(DMSO-d6)δ171.8，143.3，142.4，141.4，140.1，140.0，136.6，129.2，127.9，127.4，127.1，126.8，124.1(2C)，122.7，121.6，121.5，118.3，112.1，88.1，79.2，56.6，45.6，33.4，24.8；1HNMR(DMSO-d6)d 9.21(d，J＝7.5，1H)，8.62(s，1H)，7.98(d，J＝7.7，1H)，7.86(d，J＝8.3，1H)，7.71(d，J＝7.3，1H)，7.49(dd，J＝7.9，7.4，1H)，7.41(dd，J＝7.5，7.4，1H)7.36-7.27(m，2H)，6.86(d，J＝6.0，1H)，5.63-5.58(m，1H)，4.91(s，2H)，4.53(d，J＝3.3，1H)，2.23-2.14(m，1H)，1.96-1.92(m，1H)，0.96-0.88(m，1H)，0.60-0.57(m，1H)；MS m/z(M+H)计算值379，实测值379.
该反应产物的混合物也可通过制备HPLC分离得到化合物II-2(0.5mg)，其具有下列特征：1H NMR(DMSO-d6)δ9.17(d，J＝8.1，1H)，8.62(s，1H)，7.98(d，J＝7.0，1H)，7.85(d，J＝6.8，1H)，7.57(d，J＝6.8，1H)，7.49(dd，J＝7.9，7.4，1H)，7.44-7.26(m，3H)，6.81(d，J＝6.0，1H)，5.43-5.33(m，1H)，4.43(s，2H)，2.23-2.14(m，1H)，1.96-1.92(m，1H)，1.45-1.55(m，2H)，0.96-0.88(m，1H)，0.60-0.57(m，1H)，0.29(t，J＝7.0，3H)；MS m/z(M+H)计算值407，实测值407.实施例3-B
用与在上述化合物II-1中所描述得相似的方法，树脂(XIII-A)(70.3mg)用1，1-diethoxy-2-pentanone(0.75mL))(根据文献Sworin，et al.，J.Org.Chem.，1988，53，4984-6制备)处理，获得化合物II-3(3.5mg)，其可用制备TLC(silica gel，eluted with 50％EtOAc/toluene)分离，并具有如下特征：1H NMR(DMSO-d6)δ9.42(d，J＝8.2，1H)，8.58(s，1H)，7.95(d，J＝7.4，1H)，7.79(d，J＝8.3，1H)，7.71(d，J＝7.1)，7.50-7.20(m，4H)，6.81(d，J＝5.9，1H)，4.90(s，2H)，4.46(s，1H)，2.35-2.20(m，1H)，1.98(s，3H)，1.75-1.60(m，1H)，1.25-1.00(m，1H)，0.35-0.15(m，1H)；MS m/z(M+H)计算值393，实测值393.实施例3-C
通过相似的方式，(XIII-A)(74.3mg)用h1，1-diethoxy-2-hexanone(根据文献Brenner，J.Org.Chem.，1961，26，22-7制备)(0.75mL)处理，获得化合物II-4a(2.10mg)和化合物II4b(1.06mg)，它们各自用制备HPLC(Zorbax RX-8，4×15cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)分离。化合物II-4a具有如下特征：1H NMR(DMSO-d6)δ9.30(d，J＝8.3，1H)，8.55(s，1H)，7.97(d，J＝7.2，1H)，7.65(d，J＝8.5，1H)，7.59(d，J＝7.5)，7.48(dd，J＝7.8，7.2，1H)，7.39-7.15(m，3H)，6.31(dd，J＝5.9，5.5，1H)，5.02(s，1H)，4.88(s，2H)，0.88(s，3H)其它脂肪族的信号在溶剂峰中消失；MS m/z(M+H)计算值407，实测值407。化合物II-4b具有如下特征：1H NMR(DMSO-d6)d 9.43(d，J＝8.1，1H)，8.59(s，1H)，7.99(d，J＝7.3，1H)，7.75-7.65(m，2H)，7.49(dd，J＝7.0，6.4，1H)，7.43(dd，J＝8.2，8.1，1H)，7.36-7.25(m，2H)，6.75(s，1H)，4.91(s，2H)，4.50(s，1H)，1.95(s，3H)其它脂肪族的信号在溶剂峰中消失；MS m/z(M+H)计算值407，实测值407。实施例3-D
通过相似的方法，(XIII-C)(1.00g)用diethoxybutyraldehyde(3.65g)处理，获得化合物II-6(87.8mg)，其用制备HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)分离，该化合物具有如下特征：1H NMR(DMSO-d6)δ9.09(d，J＝8.6，1H)，8.60(s，1H)，7.95(d，J＝7.4，1H)，7.84(d，J＝8.3，1H)，7.47(dd，J＝7.2，7.0，1H)，7.35(s，1H)，7.29(dd，J＝7.0，7.0，1H)，6.98(dd，J＝8.6，1.9，1H)，6.83(d，J＝6.0，1H)，5.65-5.55(m，1H)，4.88(s，2H)，4.48(d，J＝3.9，1H)，3.82(s，3H)，2.25-2.10(m，1H)，2.08-1.85(m，1H)，0.96-0.75(m，1H)，0.65-0.50(m，1H)；MS m/z(M+Na)计算值431，实测值431.实施例3-E
通过相似的方法，树脂(XIII-B)(153.2mg)用diethoxybutyraldehyde(1.5mL)处理，获得化合物II-8(3.6mg)，其用制备HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)分离，该化合物具有如下特征：1H NMR(DMSO-d6)δ9.09(d，J＝7.9，1H)，8.81(s，1H)，7.81-7.73(m，3H)，7.48-7.35(m，3H)，7.24(dd，J＝7.6，7.5，1H)，6.85(d，J＝6.2，1H)，5.63-5.59(m，1H)，4.86(s，2H)，4.61(d，J＝3.6，1H)，3.82(s，3H)，2.21-2.13(m，1H)，1.96-1.90(m，1H)，0.87-0.79(m，1H)，0.61-0.56(m，1H)；MS m/z(M+H)计算值379，实测值379.实施例4：化合物II-7A和II-7b的制备(方法A，图6)实施例4-A(1，1-diethoxyethoxy)丙酮的制备
在冷的(0℃)NaH(2.68g，60％)的THF(150mL)悬浮液中加入1，1-diethoxyethanol(根据文献Zirkle等，J.Org.Chem.，1961，26，395-407的程序制备)(9.00g)的THF(20mL)溶液，反应混合物在室温下搅动1小时，然后加入甲代烯丙基氯(methally chloride)(8.0mL)。反应混合物加热回流过夜，冷却并用plug of celite过滤。通过旋转蒸发移去溶剂。残留物用柱色谱(硅土，20％乙酸乙酯/己烷)纯化，以生成1，1-diethoxyethyl methallyl ether(11.5，90％)。这种过冷的(-30℃)乙酸乙酯(80mL)中醚溶液进行臭氧分解知道用TLC(1小时)检测不到材料。此时，用氧清洗该反应，再用Pd(OH)2(159mg)处理，并在氢气中搅动过夜。过滤掉催化剂，滤液通过旋转蒸发来浓缩。所得的残留物用柱色谱(硅土，20％乙酸乙酯/己烷)，获得标题中的化合物(4.53g，82％)。实施例4-B
按照方法A(图6)，树脂(XIII-A)(230.2mg)用EtMgBr(1.25mL)处理，然后用(1，1-diethoxyethoxy)丙酮处理(实施例3-A)(1.2mL)。在从树脂工作和切割之后，反应粗产物混合物(10.5mg)中的蛋白用二氯甲烷(20mL)吸收，并用BF3 etherate(20uL)处理。搅动2.5小时后，用饱和的NaHCO3水溶液和盐水洗涤该溶液，然后用MgSO4干燥。经过滤并移去溶剂后，所得的残留物用预备好的HPLC(ZorbaxRX-8，4×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)纯化，获得化合物II-7a(2.34mg)和化合物II-7b(1.34mg)。化合物(II-7a)具有如下特征：1H NMR(CDCl3)δ9.35-9.20(m，1H)，7.87(d，J＝7.6，1H)，7.62(d，J＝7.0，1H)，7.60-7.45(m，1H)，7.49(dd，J＝7.7，7.5，1H)，7.40(d，J＝8.1，1H)，7.37-7.26(m，3H)，6.22(s，1H)，5.20-4.85(m，1H)，4.47(s，1H)，3.67(d，J＝12.7，1H)，3.52(d，J＝11.8，1H)，3.40(d，J＝12.7，1H)，3.38(d，J＝11.8，1H)，1.91(s，3H)；MS m/z(M+H)计算值409，实测值409。化合物II-7b具有如下特征：1H NMR(CDCl3)δ9.58-9.22(m，1H)，7.82(d，J＝7.4，1H)，7.60-7.40(m，3H)，7.37-7.27(m，3H)，7.21(d，J＝8.1，1H)，5.81(s，1H)，5.21(s，1H)，5.10-4.80(m，1H)，4.59(d，J＝13.5，1H)，4.38(dd，J＝13.5，5.3，1H)，4.21(d，J＝13.1，1H)，3.82(d，J＝13.2，1H)，1.13(s，3H)；MS m/z(M+H)计算值409，实测值409。实施例5：化合物II-5的制备(图8)
在化合物II-1(8.1mg)的THF(2mL)溶液中加入NBS(4.6mg)，搅动反应过夜。补加NBS(4.5mg)，搅动反应2.5小时。过滤掉不能溶解的材料，用旋转蒸发浓缩滤液。所得的残留物用柱色谱(C-18，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)纯化。合适的馏分用NaHCO3中和，并用二氯甲烷(3×20mL)提取，经MgSO4干燥。过滤和溶剂蒸发后，获得化合物II-5(5.1mg)，其为白色粉末，并具有以下特征：1H NMR(DMSO-d6)δ9.22(d，J＝7.4，1H)，8.67(s，1H)，8.14(s，1H)，7.86(d，J＝8.7，1H)，7.72(d，J＝7.0，1H)，7.63(d，J＝7.8，1H)，7.42(dd，J＝7.5，7.3，1H)，7.35(dd，J＝7.3，7.2，1H)，6.86(d，J＝6.0，1H)，5.63-5.58(m，1H)，4.94(s，2H)，4.54(d，J＝3.1，1H)，2.30-2.14(m，1H)，2.00-1.82(m，1H)，0.96-.088(m，1H)，0.62-0.50(m，1H)；MS m/z(M+H)计算值457/9(1∶1)，实测值457/9(1∶1)。实施例6：中间产物XV的制备(图4)
在VIII-A[A1，A2＝H2，B1，B2＝O，R3＝R4＝R5＝R6＝H](1.05g)的DMF(25mL)溶液中加三乙胺(0.75mL)和t-butyldimethylsilylchloride(TBS-Cl)(0.65g)。搅动3小时，反应用饱和的NaHCO3水溶液终止，并用乙酸乙酯提取。有机层用水和盐水洗涤，用MgSO4干燥。过滤和溶剂蒸发后，所得的残留物用乙醚研磨，生成化合物XV(848mg)。洗出液蒸发后所得的残留物用柱色谱(silica，1％EtOAc/CH2Cl2)纯化，获得额外的产物(502mg，组合产率94％)，该化合物具有下列光谱特征：1H NMR(DMSO-d6)δ11.94(s，1H)，9.32(d，J＝7.6，1H)，8.03(d，J＝7.7，1H)，7.64(d，J＝7.2，1H)，7.58(d，J＝8.1，1H)，7.44(dd，J＝7.7，7.6，1H)，7.39(dd，J＝7.7，7.6，1H)，7.32(d，J＝7.3，1H)，7.25(dd，J＝7.6，7.3，1H)，5.00(s，2H)，4.14(s，2H)，0.99(s，9H)，0.46(s，6H)；MS m/z(M+H)计算值425，实测值425。实施例7：通过方法B制备化合物II-1(图7)
Triton B的嘧啶(0.45M)溶液通过将40％Triton B溶液溶解在甲醇(10mL)和嘧啶(10mL)中来制备。在减压(20mmHg)蒸去溶剂至终体积为8mL。将残留物用嘧啶稀释至50mL，过滤并保存在氮中。XV(20.3mg)的嘧啶(2.0mL)溶液用氩气冲洗，并用300μL的Triton B(0.45M于嘧啶中)溶液和diethoxybutyraldehyde(50μL)处理。搅动2小时，用乙酸乙酯抽提，用1N HCl水溶液、盐水洗涤，并用MgSO4.干燥。经过滤和溶剂蒸发后，用CH2Cl2(10mL)吸收加合物，并用BF3 etherate(10μL)处理。搅动2小时，所得溶液用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，然后经MgSO4干燥。通过旋转蒸发移去溶剂，所得得残留物用预备好得HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)纯化。合适的馏分用NaHCO3中和，并用二氯甲烷(3×20mL)抽提及MgSO4干燥。经过和溶剂蒸发，获得II-1(11.8mg，65％产率)，其1H NMR和MS光谱和HPLC保留时间与实施例3-A中描述的通过方法A制备和分离的材料一致。实施例8：化合物II-9的制备(图8)
在镇静剂化合物II-5(6.2mg)的1-propanol(4.0mL)悬浮液中加入3-aminophenylboric acid(3.8mg)。搅动0.25小时后，依次加入Pd(OAc)2(2.0mg)、Ph3P(4.8mg)、Na2CO3(2.8mg)、和水(2.0mL)。将混合物加热回流0.75小时，冷却，用CH2Cl2抽提，并用水和盐水洗涤。有机层经MgSO4干燥，通过旋转蒸发去除溶剂，所获得的残留物用预备好的HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，50％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)纯化。合适的馏分用NaHCO3中和并用二氯甲烷抽提(3×20mL)，及MgSO4干燥。过滤和溶剂蒸发后，获得化合物II-9(3.1mg，49％yield)，其具有如下光谱特征：1H NMR(DMSO-d6)δ9.22(d，J＝7.5，1H)，8.66(s，1H)，8.00-7.25(m，8H)，7.12(dd，J＝7.1，7.0，1H)，6.95-6.80(m，3H)，6.53(d，J＝6.0，1H)，5.63-5.58(m，1H)，4.99(s，2H)，4.55(s，1H)，2.25-2.10(m，1H)，1.95-1.90(m，1H)，0.98-0.88(m，1H)，0.65-0.57(m，1H)；MS m/z(M+H)计算值470，实测值470。实施例9：化合物II-10的制备(图9)
在化合物II-1(5.0mg)的DMSO(1mL)溶液中加入NaCN(4.3mg)，混合物于145℃保温1小时。冷却，用EtOAc提取，用水(3×20mL)和盐水洗涤。有机层经MgSO4干燥，过滤及蒸发获得的残留物经预备好的HPLC(Zorbax RX-8，2.5×2.5cm，55％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)纯化。合适的馏分用NaHCO3中和，二氯甲烷提取，经MgSO4干燥。经过滤和溶剂蒸发，获得化合物II-10(2.7mg，50％yield)，其具有如下光谱特征：1H NMR(DMSO-d6)δ11.4(s，1H)，8.86(d，J＝7.9，1H)，8.79(d，J＝7.6，1H)，7.90(d，J＝8.3，1H)，7.62-7.55(m，2H)，7.49(dd，J＝7.6，7.4，3H)，7.40(dd，J＝7.4，7.3，1H)，7.35(dd，J＝7.5，7.4，1H)，6.86(d，J＝6.0，1H)，6.03(s，1H)，5.40-5.30(m，1H)，2.25-2.14(m，1H)，2.03-1.90(m，1H)，1.10-0.98(m，1H)，0.82-0.77(m，1H)。实施例10：化合物II-11的制备(方法A，图6)
按照方法A，树脂(XIIIa)(150.2mg)与EtMgBr(1.0mL)反应，然后，加入ethyl 2，5-dioxopentanoate(Schmidt等，Synthesis，1993，809)(1.5mL)。After workup and cleavage from the resin，用二氯甲烷(20mL)吸收反应的粗产物混合物，并用BF3 etherate(20μL)处理。搅动2.5小时后，所得溶液用饱和得NaHCO3水溶液和盐水洗涤，然后，经MgSO4干燥。经过滤和去除溶剂后，所获得的残留物用预备好的HPLC(ZorbaxRX-8，4×25cm，55％-75％gradient MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)纯化，获得化合物II-11(6.4mg)，其具有如下特征：1H NMR(DMSO-d6)δ9.36(d，J＝7.7，1H)，8.68(s，1H)，8.00(d，J＝7.7，1H)，7.83(d，J＝8.3，1H)，7.58-7.15(m，5H)，6.97(d，J＝5.9，1H)，4.93(s，2H)，4.82(s，1H)，4.48(q，J＝7.1，2H)，2.42-1.91(m，2H)，1.37(t，3H，J＝7.1)，1.25-0.63(m，2H)。实施例11：化合物II-12的制备
化合物II-11(3.4mg)的THF(2mL)溶液用2M LiBH4(1.0mLin THF)溶液处理，反应搅动1.5h小时。通过加入1N HCl水溶液(4mL)来终止反应。搅动20分钟后，加入10％NaOH水溶液(15mL)，所得混合物用二氯甲烷(3×10mL)提取。经MgSO4后，混合物经过过滤和溶剂蒸发，获得化合物II-12(0.32mg)，其具有如下特征：1H NMR(DMSO-d6)δ9.35(d，J＝7.7，1H)，8.62(s，1H)，7.98(d，J＝7.7，1H)，7.83(d，J＝8.2，1H)，7.75(d，J＝8.2，1H)，7.50-7.25(m，4H)，6.84(d，J＝7.7，1H)，6.11(s，1H)，4.91(s，2H)，4.71(s，1H)，4.50-4.40(m，1H)，4.30-4.20(m，1H)，2.42-1.91(m，2H)，1.25-0.63(m，2H)；MS m/z(M+H)计算值409，实测值409。实施例12：脊髓ChAT活性的增强
ChAT是功能性胆碱能神经细胞的专一性生化标记。胆碱能神经细胞代表主要的海马趾形成、嗅觉神经细胞、interpeduncular nucleus，皮层、扁桃体、和部分丘脑的胆碱能输入。在脊髓中，运动神经细胞为包括ChAT的胆碱能神经细胞(Phelps等，J.Comp.Neurol.，1988，273，459-472)。ChAT活性已被用于研究神经细胞营养素(如NGF或NT-3)在胆碱能细胞的存活和/或功能方面的效果。ChAT试验也可用作胆碱能神经细胞内ChAT水平的调节的指示。
方法：解离胎鼠脊髓细胞，按文献所描述的进行实验(Smith等，J.Cell Biology，1985，101，1608-1621；Glicksman等，J.Neuroche.，1993，61，210-221)。通过标准的胰岛素解离技术(standard trypsin dissociatedtechniques)(Smith等，supra)从解剖的老鼠(14-15天的胚胎)的脊髓中获得解离的细胞。细胞以6×105细胞/cm2放置在聚-1-鸟氨酸包被的塑料组织培养孔，不含血清N2培养基，补充有0.05％牛血清蛋白(BSA)(Bottenstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1979，76，514-517)。在5％CO2/95％空气的潮湿大气中37℃保温培养48小时。体外2天后，用改进的Fonnum方法(Fonnum，Neurochem.，1975，24，407-409)测定ChAT活性。依照McManaman等，和Glicksman等的文献(McManaman等，Develop.Biol.，1988，125，311-320；Glicksman等，J.Neurochem.，supra.)。
在实施例中描述的具有化学式II的化合物列在表2中。R1，R4，R6，和R7为H；Y为O；而n为1。
表2
    化合物   A1A2   B1B2   R2     R3     R5   R8   Z   m
    II-1     O   H，H   H     H     H   H   键   1
    II-2     O   H，H   Et     H     H   H   键   1
    II-3     O   H，H   H     H     H   Me   键   1
    II-4a     O   H，H   H     H     H   Me   键   2
    II-4b     O   H，H   H     H     H   Me   键   2
    II-5     O   H，H   H     Br     H   Me   键   1
    II-6     O   H，H   H     H   10-OMe   H   键   1
    II-7a     O   H，H   H     H     H   Me   O   1
    II-7b     O   H，H   H     H     H   Me   O   1
    II-8   H，H     O   H     H     H   H   键   1
    II-9     O   H，H   H  3’-NH2-Ph     H   H   键   1
    II-10     O     O   OH     H     H   H   键   1
    II-11     O   H，H   H     H     H  CO2-Et   键   1
    II-12     O   H，H   H     H     H  CH2-OH   键   1
实施例13：pCDNA3-EE-MLK3，pcDNA3-EE-MLK3(K144R)
按文献描述克隆MLK3(Lee等，Oncogene，1993，8，3403-3410；Ezoe等，Oncogene，1994，9，935-938)。cDNA的制备来自200ng的polyadenylated黑素细胞mRNA，反应的5％用作扩增全部PTKcDNAs的摸板，用2个或4个高度degenerate寡核苷酸引物，其来自于已知的PTKs的保守的Vib和IX亚区的保守序列：PTK1，5’-CGGATCCACMGIGAYYT-3’(SEQ ID NO：1)；PTK2，5’-GGAATTCCAWAGGACCASACRTC-3’(SEQ ID NO：2)；PTK3，5’-CGGATCCRTICAYMGIGAYYTIGCIGCIMGIAA-3’(SEQ ID NO：3)；PTK4，5’-GGAATTIAYIGGAWAIGWCCAIACRTCISW-3’(SEQ IDNO：4)。用Taq DNA聚合酶(AmpliTaq；Perkin-Elmer/Cetus)和自动DNA热循环仪进行40个循环的PCR。每个循环包括：94℃，40s，37℃，2min和63℃，3min。8个PCRs的产物收集在一起，用DNA聚合酶(Klenow)处理，用内切酶BamH1加上EcoR1进行酶切，并经5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙啶染色鉴定主要为200-230bp的酶切的带，洗脱并克隆进入M13mp18。在1次实验中，部分PCR扩增的cDNA未被酶切，代之以Smal酶切克隆blunt进入M13mp18。用链终止测序法测定核苷酸序列。
1种被鉴定为PTK1的cDNA，可用作筛选人类黑素瘤和黑素细胞cDNA文库的探针。指定为PTK1-3.2的克隆，包括完整的2541nt的开放阅读框架，编码847个氨基酸的蛋白。该cDNA用Nco1酶切，经DNA聚合酶(Klenow)补平，再用EcoR1酶切，连于载体pCDNA3-EE，其用BamH1酶切、补平、然后用EcoR1酶切。载体pCDNA3-EE的构建是在HindIII/BamH1酶位点插入1个编码为EE抗原决定部位跟随的起始密码的寡核苷酸：MEEEEYMPME(SEQ IDNO：5)(Grussenmeyer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，82，7952-7954)。利用PCR通过制备突变K144R来制备MLK3的激酶失活的版本，使用以前出版的技术(Chen等，Biotechniques，1994，17，657-659)。第一个突变的寡核苷酸为5’-GTGGCTGTGCGGGCAGCTCGCCAG-3’(SEQ ID NO：6)，第二个寡核苷酸为5’-GAGACCCTGGATCTCGCGCTT-3’(SEQ ID NO：7)。使用MLK3作为摸板，在PCR中用这些寡核苷酸来扩增806bp的片段，在第二个PCR反应中，T7引物作为另一个扩增引物，以MLK3作为摸板扩增1285bp的片段，所得片段经琼脂糖凝胶电泳分开、分离后，克隆进入pGEM-5(Promega)并测序。片段用HindIII和HpaI酶切，插进pCDNA3-EE-MLK3，其用HindIII和HpaI酶切。在核苷酸1342位检测到额外的点突变。为证实之，pf1M1片段(nt 1093-1418)从野生型MLK3切得，并用来替换in the K144R mutated MLK3中的一致的片段。实施例14：pFB-FLAG-MLK3
为获得MLK3蛋白，将cDNA克隆进入阴茎骨病毒(baculoviral)表达载体pFB-FLAG。MLK3由PTK1-3.2用Nco1酶切得来，用DNA聚合酶(Klenow)补平，再用Not1酶切并连入pFB-FLAG，其用Stu1和Not1酶解。pFB-FLAG来自pFB(LifeTechnologies)，具有FLAG抗原决定部位(Hopp等，Biotechnology，1988，6，1205-1210)的编码序列，其具有1个起始密码，MDYKDDDDK(SEQ ID NO：8)，将polylinker加入BamH1的位点。实施例15：pFB-GST-MLK3(KD)
MLK3的激酶区域的Baculoviral表达通过用EcoR1和Xho1从pGEXKG-MLK3(KD)酶切MLK3片段而完成，将其连入用EcoR1和Xho1酶切的pFB载体，谷胱甘肽S-转移酶(GST)的克隆序列已克隆进入上游区。其完成是通过获得GST编码序列和多接头来自pGEXKG载体，通过PCR利用该载体作为模板(Guan等，Anal.Bioch.，1991，192，262-267)。PCR用的5’端寡核甘酸在片段的5’端产生Bg12限制位点。该分离的片段随后用Bg12和HinD3酶解，并连入用BamH1和HinD3酶解的pFB。实施例16：pGEXKG-MLK3(KD)
包含MLK3激酶区域和亮氨酸拉链部分的cNDA片段可通过用PTK1 cDNA的PCR获得。所分离的片段用限制性内切酶EcoR1和Xho1消解，酶切位点在PCR的寡核苷酸中，将其克隆进入已用EcoR1和Xho1消解的pGEX-KG中。该pGEX-KG中的片段通过PCR截短成只包含激酶区域(nt 736-1638)。实施例17：pKH3-MLK2(KA)
用degenerate PCR(Dorow等，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710；Dorow等，Eur.J.Biochem.，1995，234，492-500)克隆MLK2。编码蛋白激酶的催化亚区的cDNAs片段在外周肿瘤细胞系Colo 16中表达，其通过反转录PCR从RNA扩增。Degenerate PCR引物基于表皮生长因子受体家族激酶催化区域的Vib核VIII亚区的编码保守基元的序列。 引物序列如下：正向引物，5’-CGGATCCGTG(A)CACC(A)GT(CG)G(A)ACC(T)-3’(SEQ ID NO：9)，反转引物，5’-GGAATTCACCA(G)TAA(G)CTCCAG(C)ACATC-3’(SEQ ID NO：10)。几种PCR产物克隆进入M13并用T7 Super-Base测序试剂盒(Bresatec)进行测序。1个216-bp PCR的产物用于作为筛选人克隆λgt11 cDNA文库(Clontech，catalog#HL 10346)的探针。片段用随机引物标记，在65℃进行杂交，过滤液洗涤到0.2X NaCl/柠檬酸盐的严格性(150mM氯化钠，15mM柠檬酸钠，pH7.0)和0.5％SDS在65℃下。过滤液放射自显影16小时在-70℃下用Kodak XAR-5胶卷。分离出4个克隆，最长的为1.2kb，作为探针再用相同的条件筛选相同的文库。又挑选出4个克隆，其中1个代表MLK2的1034bp的片段。该克隆作为探针筛选人脑λgt10文库，筛选出近500,000克隆，其中1个3454bp的克隆被分离出来，其代表MLK2的完整的编码区域。
从ATG到polyA尾部，将MLK2克隆进入载体pKH3，位于BamH1和EcoR1的酶切位点之间，这需要2步来完成，因为有1个BamH1酶切位点再MLK2序列的中间。载体pKH3的构建是通过插入3个拷贝的HA表位标记进入到pRK7多接头的位于Xba1和EcoR1酶切位点之间的BamH1的酶切位点之后。为获得突变体K125A，将MLK2的5’短BamH1片段克隆进入Promega palter载体，按制造商推荐的方法进行突变。将获得的片段回复克隆进入MLK2 pKH3载体。实施例18：pcDNA3-HA-JNK1
JNK1 cDNA的获取如文献所描述(Coso等，Cell，1995，81，1137-1146)。用人骨骼肌cDNA(Invitrogen)作为摸板通过PCR方法获得cDNA，并将其克隆进入pcDNA3-HA的Bg12/Sall位点，这是一个改进过的编码Haepitope(Wilson等，Cell，1984，37，767-778)pcDNA3表达质粒。然后从pcDNA3酶切，包括HA抗原决定部位，并连接到pGEX-4T3(Pharmacia)。将JNK1 cDNA从pGEX-4T3构建体中切开，作为Bg12/Sall片段并连接到pcDNA3-HA中，载体具有HA表位，添加在pcDNA3的HindIII/BamHI位点上。实施例19：pFLAG-DLK
按文献描述将DLK克隆进入含FLAG抗原决定部位的表达载体pcDNA3(Holzman等，J.Biol.Chem.，1994，269，30808-30817)。DLK的cDNA中的片段用degenerate oligonucleotide-based PCR克隆来分离。总RNA从embryonic day 13.5 kindeys(32 organs)和andembryonic day 17.5 kindeys(16 organs)中提取，使用commerciallyprepared phenol/guanidine isothiocyanate reagent方法，按照制造商的说明(TRIzol Reagent，Life Technologies，Inc.)进行提取。用不含Rnase的Dnase消解后，用Rnase H-反转录酶(Superscript，Life Technologies，Inc.)将总RNA反转录，从寡(dT)合成的寡核苷酸引物到单链cDNA。与蛋白的的酪氨酸激酶催化亚区Vib和IX相关的简并寡核苷酸引物最先由Wilks设计(Wilks，Proc Natl Acad Sci USA.，1989，86，1603-1607)，改进为5’EcoRI和HindIII位点，分别是(5’-ATAATTC(GT)GC(TAGC)GCCA(GA)GTC(TAGC)CGGTG-3’(SEQ ID NO：11)，5’-ATAAGCTTCC(TC)(AG)T(GC)AAGTGGA(TC)(GC)GC(AGC)CC(CT)GA-3’(SEQ ID NO：12)。进行40个循环的PCR反应，条件为：1.5minat 94℃，2min at 37℃，和3min at 63℃。加入新鲜试剂进行又1个40循环的PCR，结束前，在72℃增加10-min的延伸。所得的200-210-bp的DNA扩增产物用凝胶分离，亚克隆进入准备好的pGEM7zf(+)质粒(Promega)，转导进入大肠杆菌(Escherichia coli)。微量制备的质粒DNA来自转导的细菌及用EcoRI和HindIII限制性内切酶消解的部分。对包含插入的克隆进行测序。
从degenerate PCR获得的195-bp DLK cDNA片段经放射标记用来筛选近1×106 Uni-ZAP II的重组体(Stratagene，La Jolla，CA)，寡(dT)-primed成年老鼠cDNA文库(Holzman等，Mol Cell Biol，1990，10，5830-5838)。Filters were hybridixed in a buffer consisting of 50％formamide，5×SSC，3×Denhardt’s solution，0.25％SDS，1mg/mlpolyadenylic acid，and 200mg/ml salmon sperm DNA at 42℃.filters werewashed once at room temperature in 2×SSC，0.2％SDS and twice for 30min at 65℃.twenty five unique clones were identified；10 clones werepurified to homogeneity，in vivo excised according to the protocol of themanufacturer and restriction mapped。2个最长的克隆(分别为，3401和3397bp，仅在5’末端有差异)沿两条链测其全长序列。
全长的NotI-XhoI DLK cDNA片段(3401 bp)亚克隆进入thecytomegalovires promoter based真核生物表达载体pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)(construct designated pcDNA3-DLK)。Next，a NH4-MetFLAG epitope(DYKDDDDK)(SEQ ID NO：13)tagged construct(pFLAG-DLK)was made.The PCR was used to amplify cDNA fragmentswhich encoded a 5’HindIII site，DLK’s Kozak’s consensus sequenceincluding the initiation ATG，the FLAG epitope，and DLK cDNA openreading frame sequence extending from nucleotide 88 to an internal EcoRIsite at nucleotide 758(HPLC纯化合成寡核苷酸体积克分子浓度相等的量：5’-ATAAAGCTTCCAGAGGCCATGGAC TACAAGGA CGA CGATGACAA GGCCTGCCTCCATGAAACCCGAACA-3’(SEQ ID NO：14)forthe FLAG construct sense primer，和5’-GACAGGGCGGCCGGCTCT-3’(SEQ ID NO：15)反义引物)。凝胶纯化的HindIII和EcoRI消解的扩增引物片段进入HindIII-EcoR1准备的pcDNA3-DLK质粒。构建体沿双链测序确保Taq聚合酶的保真性和维护阅读框架。实施例20：pcDNA3-MLK1
MLK1的5’部分从EST数据库(注册号#AA160611)。该克隆是MLK1和另一个未鉴定的cDNA的融合。它包括以前未出版的MLK1的5’端序列，其沿着以前出版的MLK1的激酶区域(Dorow等，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710)。取自EST克隆的MLK1 cDNA的序列如下：GAATTCGGCACGAGAGGACTCGCAGGTGTCCGGCGACGAGGGCTGGTGGACCGGGCAGCTGAACCAGCGGGTGGGCATCTTCCCCAGCAACTACGTGACCCCGCGCAGGGCCTTCTCCAGCCGCTGCCAGCCCGGCGGCGAGGACCCCAGTTGCTACCCGCCCATTCAGTTGTTAGAAATTGATTTTGCGGAGCTCACCTTGGAAGAGATTATTGGCATCGGGGGCTTTGGGAAGGTCTATCGTGCTTTCTGGATAGGGGATGAGGTTGCTGTGAAAGCAGCTCGCCACGACCCTGATGAGGACATCAGCCAGACCATAGAGAATGTTCGCCAAGAGGCCAAGCTCTTCGCCATGCTGAAGCACCCCAACATCATTGCCCTAAGAGGGGTATGTCTGAAGGAGCCCAACCTCTGCTTGGTCATGGAGTTTGCTCGTGGAGGACCTTTGAATAGAGTGTTATCTGGGAAAAGGATTCCCCCAGACATCCTGGTGAATTGGGCTGTGCAGATTGCCAGAGGGATGAACTACTTACATGATGAGGCAATTGTTCCCATCATCCACCGCGACCTTAAGTCCAGCAAC(SEQ ID NO：16)。翻译成：NSAREDSQVS GDEGWWTGQLNQRVGIFPSN YVTPRSAFSS RCQPGGEDPS CYPPIQLLEIDFAELTLEEI IGIGGFGKVY RAFWIGDEVA VKAARHDPDEDISQTIENVR QEAKLFAMLK HPNIIA；RGV CLKEPNLCLVMEFARGGPLN RVLSGKRIPP DILVNWAVQI ARGMNYLHDEAIVPIIHRDL KSSN(SEQ ID NO：17)。
MLK1的3’部分最初由简并PCR克隆，见已出版的文献(Dorow等，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710)。MLK1的3’部分的克隆方法与上文描述的MLK2的相似，但有以下例外。在用1.2kb的克隆从文库中重新筛选获得4个克隆时，其中的3个代表MLK1。没有克隆包含可用PCR获得的完整的激酶区域。
噬菌体从1(1等分试样的放大的库(正常人结肠的上皮和人T84结肠的癌电解槽系列互补脱氧核糖核酸在(Uni-ZAPXR(Stratagene，cat#937204)通过悬浮在20um水和咬住冷冻。5ul的样品的该细胞溶解噬菌体用作PCR模板分为两部分反应各库。雷管表示该矢量是减少核苷酸序列沿直向切割矿柱该研制兼容产品位置。就该T84结肠的电解槽系列库而言，该T3和T7顺序雷管(Promega)是使用。在各反应，一个雷管来自于该3-5多股绞线的该MLK1基因，大约100bp从该5转换端该已知序列。第二底物是一个的该两个矢量底物。PCR反应含有1x预防循环转发缓冲的，2.5mM氯化镁，1U Taq聚合酶(全部从Bresatec)，0.2毫米dNTP和0.4毫米各底物在总共50uL。反应条件是60s在95℃，90s在52℃，90s在72℃为30循环与A 15最小的延长比赛时间生新开始该期末考试循环。预防循环转发产品是无性系和顺序为上面描述的。长的无性系从该库筛和PCR碎片那些包括附加的MLK1顺序是连接一起到创造1.08kb MLK1 cDAN在pUC18。
源自EST数据库的MLK1克隆由载体pBluescript(Stratagene)提供。来自克隆文库的MLK1 cDNA连接到EST克隆，其通过用EcoRI消解前者，用Klenow补平，然后用AflII酶切。将分离的片段克隆进入源自EST数据库的MLK1 cDNA，其用XhoI酶切，用Klenow补平，用AflII酶切。这一由用Not1和Apal酶切自pBluescipt的新构建体连接进入同样用Not1和Apal酶切的pcDNA3-EE。所有的克隆交叉点通过测序确证。实施例21：GST-MLK3KD的E.coli表达
PGEXKG-MLK3(KD)用电击法转导进入E.coli BL21株。含有质粒的细菌接种于15升的Applikon发酵罐中，其装有10升体积的如下丰富培养基：1.95g/L K2HPO4，0.9g/L KH2PO4，0.1g/L ampicillin，0.3g/L(NH4)2SO4，0.92g/L MgSO4 7 H2O，42.7mg/L柠檬酸钠，21.8mg/L FeSO4 7 H2O，0.5mL Pichia微量金属(Higgins等，MethodsMolecular Biology，1998，103，149-177)，20g/L casamino acids，40g/L甘油，25.5mg/L CaCl2。细菌在800rpm/68％溶解氧/30℃条件下培养过夜，直到培养浓度达到OD600＝4.4。加入1mM isopropyl-β-D-thiogalactoside诱导重组蛋白产生，在25℃下继续发酵至6hr.细菌通过离心回收，将细胞糊在-20℃冷冻保存，直至纯化。实施例22：细菌中GST-MLK3KD的纯化
部分纯化的GST-MLK3KD的制备通过在100mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，5mM dithiothreitol(DTT)，pH 7.5(buffer A)中用(超)声波降解100mg的细菌细胞糊。用Triton X-100配制成1％的溶液，在冰上搅动1hr。在20,000xg离心45分钟所得的上清液用10mL平衡于缓冲液A中的glutathione Sepharose 4B树脂(Pharmacia)在冰上混合1小时。粒化的树脂用12.5×体积的缓冲液A洗2次，然后用20mL 100mM Tris-HCl，150mM NaCl，5mM DTT(缓冲液B)，含20mM谷胱甘肽，pH7.5洗提。蛋白经透析过夜去除缓冲液并保存于aliquots at-80℃。实施例23：FLAG-MLK3 and GST-MLK3KD的阴茎骨病毒表达
能表达FLAG-MLK3和GST-MLK3KD的阴茎骨病毒分别用转导载体pFB-FLAG-MLK3和pFB-GST-MLK3KD用BAC-TO-BAC系统(Life Technologies)按照说明手册来制备。悬浮培养的Sf21细胞(Vaughn等，，In Vitro，1977，13，213-217)生长在27℃/120rpm的补充Grace’s培养基上(Hink，Nature，1970，266，466-467)，其中补充10％热灭活的小牛血清(FBS)。为制备重组的FLAG-MLK3，Sf21cells at a density of 1.5×106 cells/mL supplemented Grace’s mediumcontaining 5％FB S were infected with a multiplicity of infection(MOI)of3.1 and harvested at 39 hr after infection.To produce recombiant GST-MLK3KD，Sf21 cells at a density 1.5×106 cells/mL supplementedGrace’s medium containing 5％FB S were infected with an MOI of 2 andharvested at 41 hr after infection。在两种情况下，球化细胞均用缓冲液重新悬浮，缓冲液含有10mM HEPES，50mM Pefabloc SC，5μMpepstain，10μg/mL aprotinin，10μg/mL leupeptin，pH 7.4。在147,000xg离心1小时后的上清液用3M Tris碱重新调节至pH7.4，然后保存于-70℃直至纯化。实施例24：baculoviral GST-MLK3KD的纯化
部分纯化的baculoviral GST-MLK3KD用谷光苷肽亲和色谱来制备。在10mL的细胞提取物(26.6mg总蛋白)中，加入1mL谷光苷肽Sepharose 4B树脂(Pharmacia)，其平衡于10mM HEPES，150mMNaCl，pH7.4(缓冲液C)中，在4℃让蛋白结合45分钟。用30倍柱体积的缓冲液洗涤装于柱中的树脂，然后用5倍的含有20mM谷光苷肽的缓冲液C洗提。收集的最终产物经透析过夜去除缓冲液C并保存于aliquots at-70℃。实施例25：baculoviral FLAG-MLK3的纯化
部分纯化的FLAG-MLK3的用抗体亲和色谱来制备。15mL提取物中的蛋白(19.5mg总蛋白)加入0.1M NaCl重复加样到0.25mL的M2单克隆FLAG肽抗体结合琼脂糖树脂(Sigma)的柱中(总共3次)。在进行色谱分离前，树脂用5倍柱体积的50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4(TBS)平衡洗涤，3倍柱体积的0.1M glycine，pH3.5洗涤，继之以另一个5倍柱体积的TBS洗涤。重组的蛋白主要通过5倍柱体积的0.2mM FLAG肽(N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C)(SEQ ID NO：18)的TBS溶液洗提。在试验前蛋白保存于aliquots at-80℃。实施例26：显性的负突变：在移去生长因子后分化的PC12细胞中阻止死亡的MLK家族的显性负突变
PC-12细胞系来自老鼠pheochromocvtoma肿瘤，广泛用作检测导致神经细胞死亡的分子事件的神经细胞模型(综述，参见Troy等，Adv.Neurology，1997，103-111)。神经生长因子(NGF)诱导PC-12细胞分化成交感神经表型(Greene，Cell Biol.，1978，78，747-755)。NGF分化的PC-12细胞依赖NGF生存，在从培养基中去掉NGF时，将经历形态学上描述的细胞程序性死亡。细胞系统是显影剂到确定该随角异色效应的环中原子数混合的血统激酶家族在PC-12细胞死亡跟随NGF退缩。PC-12细胞感染cDNA译码为占优势的否定(DN)突变体的MLK-3使用Pfx脂质传输系统被该厂家(Invitrogen，Carlsbad CA)推荐。稳定的集资的转染子压榨DN-MLK-3中选使用G418硫酸盐(Mediatech Inc.，Herndon，VA)。大约30％的细胞在这些集资的里以确定由免疫组织化学形式表示DN MLK3。集资的细胞稳定地压榨该突变体激酶是片在polyornithine/laminin(10(g/ml各在磷酸盐缓冲盐水)涂层组织培养96-最佳格式片绝对大气压密度的2字母×104细胞/孔和用处理100ng/ml的神经生长因子为7天。介质含有NGF子是除去，该细胞单层用洗磷酸盐缓冲盐水和介质含有中和神经生长因子抗体(商品目录#n6655；Sigma，St.Louis，MO)绝对大气压期末考试稀释的1∶1000是重做的为1-5天。细胞耐久性被A细胞耐久性试验使用转化的该四唑盐定量，MTS，到A有三苯基甲脂哪个是读者在吸光率的570纳米在CytoFluor 2350(Millipore Bedford，MA)被制造业者(Promega，Madison，WI)。稳定的集资的压榨DN-MLK-3部分地被使免于失败细胞死亡由NGF退缩引起(图10)。实施例27：重组MLK蛋白的酶活性试验
为了证明该MLK蛋白质用表示该杆状病毒或细菌的表达系统是酶催活性，若干试验甲酸可以使用的。该MLK蛋白质可以全长的构造或A激酶领域用表达杆状病毒或细菌的表达系统。该试验可以抗体-向基底的比如酶联免疫吸附测定(ELISA)，时间分辨荧光(TRF)，否则荧光偏振(FP)。该抗体可以单克隆或多元性繁殖系的与反应性向磷酸丝氨酸，磷苏氨酸，或磷酸特定底物。另外地，非抗体-向基底的方法可以使用比如放射性凝胶-向基底的试验(参见图11)，多屏幕三氯乙酸(TCA)沉淀试验(图13)，闪烁邻近试验(SPA)，闪板(flashplate)方法，否则磷酸纤维素过滤试验开本(图13)。该试验可以用来监测直接磷酸化的基材或联结试验系统利用该下游地激酶在该信号途径。该基材可以特异的基质比如SEK-1或相对非特效药基材如髓磷脂碱性蛋白(MBP)。实施例28：激酶试验放射性凝胶激酶试验(Radioactive Gel-Based kinase assay)
该激酶活性的MLK-3通过监测该包含的磷的32P从[γ-32P]-ATP进入基质的MLK(例如激酶-死的SEK-1；髓磷脂碱性蛋白)。该50ul的试验合剂含有缓冲的A(20mM MOPS，pH7.2，25毫米(-磷酸甘油，5mM EGTA，1mM原钒酸钠，1mM二硫苏糖醇)，15毫米mgcl2，100(M ATP，10uCi[γ-32P]-ATP，并且0.1(g激酶-死的SEK-1基质(Stressgen，Inc；粘结剂谷胱甘肽S-转移酶-SEK-1(GST-SEK-1)是豁免谷胱甘肽-琼脂糖珠粒与10mM谷胱甘肽，pH8.0)或25ug MBP(Sigma Chemical Co.)。反应起源于添加MLK蛋白质(激酶领域或制备含有既全长的又激酶领域)或控制蛋白质。混合物是培养为30最小的在30℃该反应每日挤奶二次减少样品缓冲的是添加的末尾。混合物是煮器为5最小的，填充量在上A 12％SDS-PAGE凝胶(使用MBP作为基质)或8％凝胶(SEK-1作为基质)。在电泳以后，凝胶是干燥的。定量的磷酸酯并入基质，SEK-1，是履行在MolecularDynamics Phosphorimager(Sunnyvale，CA)。合成的试验设计到显示该酶的活性的杆状病毒-压榨MLK-3(FLAG-紧随全长的或GST-紧随激酶领域)使用激酶-死的GST-SEK-1或MBP作为基质是显示在图11A和11B中。杂交分析(Western blot analysis)
该激酶活性的杆状病毒-表达MLK-3被immunoblot分析检查。该20-ul试验混合物含有缓冲的A，15mM MgCl2，100uM ATP，并且0.1ug激酶-死的SEK-1基质。该反应是考虑到生产为30分钟在30℃，然后用…解渴10ul 4x减少样品缓冲的。蛋白质是分开的在8％三-大豆属凝胶和亲电转学到止动剂PVDF薄膜。该薄膜是培养与磷酸特异的SEK-1(Thr223)抗体(New England，Biolabs，Inc.)后面有辣根过氧化酶-标签山羊抗兔子免IgG(Bio-Rad)。发现的该免疫活性的带材是履行VIA增强化合光(Amersham)。该磷酸化的激酶-死的GST-SEK-1由FLAG-MLK-3蛋白质(杆状病毒制备含有既全长的又激酶领域)是说明在图12。多屏幕三氯乙酰子囊(TCA)沉淀试验
该激酶活性的细菌表达GST-MLK-3激酶领域估定使用该多屏幕三氯乙酰子囊(TCA)在＝片试验被皮特等人，描述J.Biomol.Screening，1996，1，47-51)。分析是履行在96-井多屏幕Durapore片(微孔)。各50-ul试验混合物含有20mM Hepes，pH7.4，20mMMgCl2，20mM MnCl2，2mM DTT，0.1mM Na3VO4，1(CI[(-p32]-ATP和30ug MBP底物。该反应起源于添加MLK蛋白质和考虑到收益为15分钟在37℃。该反应是停止与25ul的50％TCA。该片是考虑到平衡的为30分钟在4℃，然后用.洗冰冷的25％TCA。闪烁鸡尾酒被增加给该片，并且该放射活性决意使用Wallac MicroBeta 145PLUS闪烁计数器。该蛋白质剂量反应对32P岩层的磷的放射性同位素-标签MBP是如图13所示。磷酸纤维素过滤试验
该激酶试验是履行在A 50-ul反应混合物含有20mm Hepes(N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸)，pH7.4，20mM MgCl2，20mM MnCl2，2mM二硫苏糖醇，0.1mM Na3VO4，1uCI[(-p32]-ATP和30ugMBP。该反应起源于添加MLK蛋白质和考虑到收益为15分钟在37℃。该反应是停止与75ul的75mM磷酸。在该磷酸纤维素膜(Pierce)一等分试样的该淬灭溶液是就填充量。另外地，该96-井多屏幕Durapore(微孔)可以使用。该膜是用洗75mM H3PO4。该粘结剂磷的放射性同位素-标签磷酸化MBP是洗提在接收管由添加1M氢氧化钠。该放射性决意由Cerenkov把算在内Beckman闪烁计数器(Somerset，NJ)。该岩层的磷酸化MBP与提高浓度的细菌表达压榨GST-MLK-3激酶领域是如图13所示。实施例29：测定化合物与重组MLK家族结合的试验
k-252a(化合物III-3；看，表4)，一吲哚并咔唑代谢物的诺卡氏菌属种类，与结合起来许多品种的丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶(天使，等人，类似生物化学，1996，263，49-55；骑士，等人，类似生物化学，1997，247，376-381)。氚化了的K-252a ligang习惯于估定与结合起来人重组体总长MLK-3从A粗制备的杆状病毒受感染细胞。[[3H]K-252a特定地标记的与氚在3和9的在位置穿过与签订合同网路设备号码研究产品(Billerica MA)和具有比放射性的40Ci/mmol。粘结反应是履行在1ml在96-井片。反应混合物含有50mMMOPS缓冲的，pH7，150mM NaCl，5mM MnCl2，1mg/ml牛血清清蛋白，1％二甲亚砜和0.25纳米[3H]K-252a。样品是进行一式三份与A浓度的5μg/ml的粗杆状病毒派生MLK-3。非特异的粘结剂规定装订于出席的无标号的1.2μm K252a和是基质从全体的与…结合起来给定的特异的粘结。一看到这个稀释12-15％计数的是非特定地与蛋白质和75-85％这些当中计数是特定地与结合起来MLK-3(图14)结合起来。全部实验是履行为2热轧钢在4℃。[[3H]K252a/MLK-3配合物收集在GF/C Whatman过滤使用Brandel收获者，用洗感冒MOPS/NaCl缓冲的和依靠Wallac Microβ计数管。饱和粘结剂实验是履行到获得Kd为K252a。实施例的该由生实验是显示(图14)。卸开式系统的0.89纳米(置信界限：0.2到1.5纳米)是获得。实施例30：完整细胞试验Cos 7过表达系统原料
K-252a和衍生物这些当中化合物被Kyowa-Hakko Kogyo Co.Ltd.(东京，日本)(Kaneko等人，1997)。化合物溶于细胞培养级别二甲亚砜(DMSO)和将贮存进去该黑暗在4℃。全部稀释的化合物由制造杜皮克氏改良爱哥尔氏培养基(DMEM)含有1％牛血清清蛋白。Hemagluttinin(HA)抗体是购买者从BAbCO(Richmond，CA)。AP-1(c-jun)基质是购买者从Promega(Madison，WI)。[y-32P]-ATP(6000ci/mmol)是购买者Amersham(Arlington Heights，IL)。Cos7细胞培养
绿Monkry Kindey Cos7细胞是从ATCC，Rockville，Maryland(CRL1651)和在面供养DMEM含有10％牛血清，2mM谷氨酸盐，1mM丙酮酸盐，50u/ml penicillin/streptomycin在37℃在10％CO2，90％空气气氛。Cos7细胞是超然的为通过由添加0.25％胰蛋白酶。过表达的MLK家族环中原子数和JNK1在Cos7细胞
Cos7细胞是片在80％80％缠绕和感染与2μg cDNA结构使用脂质被该供应者(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。A总长cDNA的人MLK-3，MLK-2，或小鼠DLK或部分人MLK-1如上所述，并且总长Hemagluttinin A-紧随人JNK1，和蔼的提供由日记帐Silvio Gutkind(NIH，Bethesda，MD)，是亚克隆进入该pcDNA3vector(Invitrogen，圣迭戈，CA)。在A 48高分辨率感染以后，该细胞是用处理0.025％二甲亚砜或500表明化合物的纳米为2高分辨率后面有消散在0.4mL氚核缓冲的(1％氚核字母x-100，50mM氯化钠，10mM Tris(pH7.6)，0.1％牛血清清蛋白，30μm焦磷酸钠，50mM氟化钠，20μg/ml抑肽酶，1mM甲基磺基，1mM钒酸钠)。JNK活性该溶胞产物被免疫沉淀/激酶试验作为描述在下面试验。免疫沉定反应和激酶试验从全部细胞
溶胞产物从cos7细胞是为替人测量蛋白质浓度使用该微过境协定装备从穿透(Rockford，IL)和等份的蛋白质是免疫沉淀与该嘿抗体为1高分辨率在4℃。免疫沉淀被离心作用在A microfuge离心为20秒球团，再悬浮在trition缓冲的，洗涤由离心作用2更时间，后面有A后期洗涤在激酶缓冲的(20mM N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸pH7.4，20mM mgcl2，2mM二硫苏糖醇，0.1mM钒酸钠)。该免疫沉淀是再悬浮在激酶缓冲的含有1uM ATP和5(CI[(-磷的放射性同位素]-ATP和基质(1(g/样品的通用的-1)和培养为15分钟在30℃。该激酶反应是靠近添加的减少样品缓冲的(laemmli，属性1970：227；680-685 )。样品被加热至80℃为5分钟和填充量到10％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶之上。蛋白质被电泳分开的。凝胶是干燥的和定量的放射性在通用的-1基质的在是履行在A分子动态学MolecularDynamics Phosphorimager(Sunnyvale，Ca.)。试验哪个MLK-3，MLK-2和dlk CO-被压榨与嘿-JNK1和在不存在或出席的k-252a的培养是如图15A和15B所示。相反，对迎角的导数的该父母亲的k-252a复姓化合物III-3(表4)，哪个是A更选择性的激酶抑制剂，没有冲突与该jnk途径活化由另一个MAPKKK上游的JNK MEKK1(图15C)。全部-细胞记者试验为MLK活化JNK
企图导数无性系组成表达压榨该MLK家族已经不成功的，建议过表达的该MLK可以影响细胞生存(Bergeron等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1997，231，153-155；Nagata等人EMBOJ..，1998，17，149-158)。所以，在发展中的全部细胞试验因为记录轨迹MLK诱导生物化学的事件，电解槽系列含有遗传地工程技术可归纳的表达系统的该激酶所考虑的可以需要。例如，A PC-12电解槽系列感染与A四环素-受约束的生产主体。当细胞更进一步被感染与基因所考虑的由该可归纳的促进剂tetO驱动时，表达的那些基因被四环素平均来说(Shockett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，6522)。
要测定该活化的MLK的话，一个能够调节该磷酸化的下游地基质比如mek4，jnk或C-jun在多重测定甲酸如上所述。另一个接近测定该MLK活化完全细胞将使用记者酶活性比如该C-jun酶商购可利用的穿过该PathDetectTM系统(Stratagene，LaJolla，CA)。在这些系统，该四环素-可归纳的电解槽系列在感染与两个质体。一个质粒组成表达融合的该cjun氨基末端感染畴与该酵母GAL4 DNA……(cJun-DBD稠合蛋白质)。另一个质粒嘉利该译码顺序为荧光虫荧光素酶由五纵排地重复的该GAL4结合部位。在活化的MLK之上，该下游地基质的JNK，cjun-DBD融合蛋白质，磷酸化，与结合起来该GAL4结合位置，并且诱导luciferasw基因转移。酶容易地被试验在细胞溶胞产物通过添加它的基质(Promega Madison WI)和测量的化合光。实施例31：缔合的抑制的MLK家族环中原子数与运动神经原生存生存的大鼠脊髓培养使富足为运动神经原
Sprague-Dawley大鼠胎儿(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)的萌芽的年龄(E)14.5-15。细胞从仅仅该腹的份该脊髓是离解，并且更进一步使富足为motpneurons由离心作用在A 6.5％步骤甲泛葡胺梯度，作为描述预先(Henderson，等人，1993)，并且是分析为纯度由污渍与低级亲合性neurotrophin受体抗体(免疫免疫球蛋白G-192，Boehringer-Mannheim)(数据不显示)。细胞被种子到96-定向井井眼设计图预先涂有聚1-鸟氨酸和laminin(5μg/ml各)绝对大气压密度的6×104细胞数/cm2在用化学定义血清-释放N2介质(Bottenstein，等人，1979，上文)。为了把粘附体从生存随角异色效应中分开，添加的培养的化合物是追随字首连接时期如果1-3h。在4D由使用钙黄绿素是(olecular探头，Eugene，OR)在荧光的耐久性试验(bozyczko-Coyne，等人，1993，上文)。微观的计数的神经原有相互关系的直接与相对荧光值。总之，培养基串联稀释的在二苯亚磺酰胺(Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水)和最终浓度的μm calein是纸料是然后被加到各96-井。该片是培养为30分钟在37℃，后面有连续稀释塌陷二苯亚磺酰胺。该荧光信号读者使用A片-读数荧光计从微孔(Cytofluor2350)在刺激＝485纳米和散发＝538纳米。分别片，平均背景源出韦尔斯接受钙黄绿素是，除了不包含细胞，是减损都值。线性的该荧光信号是核对的为浓度和孕育时间为该确定的细胞密度射程这些实验。实施例百分比的生存高于控制的运动神经原在试验化合物在250纳米示于表3面。生存的皮层神经元
大脑皮质是切割的从萌芽的天18大鼠胎儿和酶催消化获得sigle细胞悬液。细胞被种子绝对大气压密度的1.56×105/cm2到聚鸟氨酸/laminin涂层96井组织培养片在血清-释放神经的基础培养基含有B27追加额之上。片用包上的A溶液聚ornithine/laminin(8ug/ml各)磷酸盐缓冲盐水为至少两个小时在37c制造。在活体外天5-7，皮层神经元暴露于Ab25-35(20uM)耳根前或缺少试验化合物。Ab25-35(Sigma，St.Louis，MO)储备溶液(1mM)是制备在消电离-蒸馏过的蒸镏的H2O。亲戚二乙基溴乙酰胺生存决意在48热轧钢后肽添加使用乳酸脱氢酶(乳酸脱氢酶)释放作为一指标的质膜主体/膜耐久性。LDH调节使用该细胞毒性发现装备(Boehringer-Mannhein，Indianapolis，IN)与该厂家指示一致。数据用来表示百分比抑制的DLH释放与培养用处理AB25-35孤独的有关。
表3
    Cortical         Motoneurons      Cos-7      Cos-7    Cos-7    Cos-7
    Neurons                           Cells      Cells    Cells    Cells
    Survival      Survival   ％JNK    DLK        MLK3     MLK2     MLK1配方    ％Control     ％Control  Inhib.@  ％JNK      ％JNK    ％JNK    ％JNK
    @250nm        @250nM     500nm    Inhib.@    Inhib.@  Inhib.@  Inhib.@
                                      500nm      500nm    500nm    500nmIII1    46，56         300        65       63，73     98，99   89，67   97，96III2    47，80         315        88     36，22，42   94，94   69，44   92，64I3     22，54         177        88       20，25     94，93   0        79，29I4     29，39         165        97       58，13     84，92   0        63，38
                                       52，8      90
1具有化学式III的化合物，式中Z1，Z2，R1，和R2为H；X为CO2CH3；R为OH。
2具有化学式III的化合物，式中Z1和Z2为H；X为CO2CH3；R1，和R2为CH2SCH2CH3；而R为OH。
3具有化学式I的化合物，式中I A1，A2，R1，R3，R5，和R6为H；B1和B2一起表示O；R2为CH2CH2Oac；R4为CH2CH2(2-Pyridyl)；而X为CH2。
4具有化学式I的化合物，式中A1，A2，R1，R3，R5，和R6为H；B1和B2一起表示O；R2为H；R4为CH2CH2(2-Pyrimidinyl)；而X为CH2。实施例32：免疫沉定反应的内源的jnk活性从运动神经原在或出席的吲哚并咔唑或的培养稠合吡咯咔唑
纯化motorneurons是片绝对大气压密度的6字母×104细胞/cm2在16mm直径井。在处理之前，细胞是考虑附加于为2小时。细胞是用处理0.0125％二甲亚砜或500纳米化合物为2热轧钢在N2合成培养基。细胞然后被用漂掉冰冷的磷酸盐缓冲盐水后面有消散在0.4mL氚核缓冲的如上所述在实施例30。溶胞产物从运动神经原培养是正规化的到档次编号和免疫沉淀与JNK1抗体(商品目_#sc-474)购买者从圣克鲁斯厂生物工艺学(圣克鲁斯厂，CA)。JNK活性从免疫活性是试验在出席的.32p-ATP和C-六月基质作为描述以上。抑制活性的纵向分布的该4试验化合物是肿瘤和正常组织细胞周期的比较在运动神经原和在cos7细胞过表达DLK，MLK-1，MLK-2或MLK-3(Table 3)。
在6×104cells/cm2密度16mm直径wells中纯化motorneuronswere plated.细胞可容许在2小时前作附加处置。细胞或用0.0125％DMSO或用500nM混合溶液在N2中处置。然后细胞以冰固体磷酸缓冲剂盐水清洗，随后在0.4ml三重氢核缓冲剂中如在实施例30中所描述的消散。Lysate源于motoneuron的标准化细胞数量和免疫反应培养with a JNK1 antibody(cat.#sc-474)购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA).JNK活性从免疫活性是试验在出席的.32p-ATP和C-jun基质作为描述以上。抑制活性的纵向分布的该4试验化合物是肿瘤和正常组织细胞周期的比较在运动神经原和在cos7细胞过表达DLK，MLK-1，MLK-2或MLK-3(表3)。实施例33：Cos7细胞中MLK-3诱导的JNK活性的抑制与原始胚胎培养物中胆碱乙酰基转移酶活性之间的关系
为了测定受这些激酶调节的JNK途径的抑制是否与神经营养化合物相关，我们评价了化合物对过表达HA-JNK和MLK3的Cos7细胞中JNK活性的影响。48小时转染期之后，将细胞与500nM的化合物温育2小时，然后细胞溶解。把细胞裂解液免疫沉淀，并如前述测定激酶活性。将结果报道为对照样品的抑制百分比，其中对照为有DMSO存在下的JNK活性。正如表4所见，脊髓中具有活性和/或基底前脑ChAT活性的大多数化合物是JNK的MLK-3活化的潜在抑制剂。
表4吲哚并和茚并咔唑对过表达MLK3的Cos7细胞中JNK活性的影响
  胆碱乙酰基转移酶活性 JNK活性的抑制％(平均)
    化合物     脊髓   基底前脑   Cos7细胞中的MLK3
    III-11     +     +     84
    III-22     +     +     96
    III-33     +     +     94
    I-14     +     +     93
    I-25     +     +     85
    I-36     +     +     93.5
    I-47     -     +     95
    I-58     -     +     97
    I-69     -     +     58
    I-710     -     +     85.5
    III-411     -     +     66
    III-512     -     +     96
    III-713     -     +     54
    I-814     +     -     89
    III-815     +     -     94
    III-916     +     +     98.5
    III-1017     +     -     78
    I-918     +     -     88
    I-1019     +     -     94
    III-1120     -     -     92.5
    I-1121     -     +     33
    I-1222     -     -     11
    I-1323     -     -     1
1具有式III的化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1是NHCONHC2H5；R2是CH2CH2(2-Pyridyl)；和R是OH。
2具有式III的化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1和R2是CH2OCH2OCH2CH3；和R是OH。
3具有式III的化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1和R2是CH2SCH2CH3；和R是OH。
4具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3和R4是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2OH；R5和R6是OCH3；和X是CH2。
5具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2Oac；R5是Br；和X是CH2。
6具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2Oac；R4是CH2CH2(2-吡啶基)；和X是CH2。
7具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R4、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2OH；和X是CH2。
8具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R4、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2CH2OH；和X是CH2。
9具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R2、R3、R4、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；和X是S。
10具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R4、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2CH2NHCO(4-(OH)Ph)；和X是CH2。
11具有式III的化合物，其中Z1、Z2、R1和R2是H；X是CO2(CH2)4CH3；和R是OH。
12具有式III的化合物，其中Z1、Z2和R1是H；R2是CH2OH；X是CO2CH3；和R是OH。
13具有式III的化合物，其中Z1和Z2一起形成＝O；R1和R2是Br；X是CO2CH3；和R是OH。
14具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是H；R4是CH2CH2(2-嘧啶基)；和X是CH2。
15具有式III的化合物，其中Z1和Z2是H；R1是Br；R2是I；X是CO2CH3；和R是OH。
16具有式III的化合物，其中Z1、Z2、R1和R2是H；X是CO2CH3；和R是OH。
17具有式III的化合物，其中Z1和Z2是H；R1和R2是CH2CH2SCH3；X是CO2CH3；和R是OH。
18具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R2、R3、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R4是CH2CH2(2-哒嗪基)；和X是CH2。
19具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是H；R4是CH2CH2(2-哒嗪基)；和X是CH2。
20具有式III的化合物，其中Z1、Z2、R1和R2是H；X是CO2CH3；和R是OCH2。
21具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R4、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是(CH2)3-NH-C(＝O)-3，5-二羟基苯基；和X是CH2。
22具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R3、R4、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是苯甲酰基；和X是CH2。
23具有式I的化合物，其中A1、A2、R1、R2、R3、R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R4是CH＝CH-C≡N；和X是CH2。实施例34：MLK活化的凝胶转移分析：
MLK的活化可导致诱导c-jun转录，增加c-jun蛋白。c-jun蛋白的增量可通过标准分析来测定，如凝胶转移分析所鉴定。Garner等，Nucleic Acids Res.，1981，9，3047-3060，在此以其全文引作参考。将编码c-jun DNA结合位点的放射性标记的双链DNA寡聚体与核细胞抽提物温育，接着是丙烯酰胺凝胶电泳，并定量分析转移到较低迁移率的放射性标记的DNA。这表示与c-jun蛋白结合的DNA的部分，其与抽提物中c-jun蛋白的量成正比。
MLK的活化也可诱导c-jun磷酸化。其检测可利用特异识别蛋白磷酸化形式的抗体在检测系统如蛋白印迹或ELISA中进行。实施例35材料
Leibovitz L15培养基、葡萄糖、碳酸氢钠、胰蛋白酶和抗生素来自Gibco。肌肉抽提物的制备如文献所述(Henderson等，Nature，1983，302，609-611，以其全文在此引作参考)。所有其他试剂来自Sigma，除非另有所指。细胞培养
根据下列文献所述的程序，采用免疫方法分离运动神经元(胚胎第5.5天)：Bloch-Gallego等，Development，1991，111，221-232，在此以其全文引作参考，程序修饰如在Weng等，NeuroReport，1996，7，1077-1081中所述，在此以其全文引作参考。将纯化的运动神经元接种到用聚-DL-鸟氨酸和昆布氨酸(1μg/ml，Upstate Biotech)预包被的35mm培养皿上(Nunc)。培养基为L15及碳酸氢钠(22.5mM)、葡萄糖(20mM)、孕酮(2×10-8M)、亚硒酸钠(3×10-8M)、伴清蛋白(0.1mg/ml)、胰岛素(5μg/ml)、青霉素-链霉素10％以及10％热灭活的马血清。肌肉抽提物以30μg/ml补充。化合物III-3以4mM的母液在DMSO中制备并在4℃避光保存。处理的和对照培养物中的DMSO的终浓度为0.125％。
将脊柱旁交感神经节(SG；胚胎第12天(E12))、后根神经节(DRG；E9)和睫状神经节(CG；E8)从鸡胚胎中在所示胚胎天时解剖，如下列文献所述：Lindsay等，Dev.Biol.，1985，112，319-328，以其全文在此引作参考。在胰蛋白酶化作用和分解后，将神经细胞悬浮液铺到聚鸟氨酸-昆布氨酸包被的培养皿中，其在Ham’s F14培养基中，补充有10％的马血清。在铺板之后，立即以下列浓度加入存活因子：神经生长因子(NGF)，20ng/ml；睫状神经营养因子(CNTF)，10ng/ml。将培养物维持在37℃及5％CO2的潮湿环境中。细胞计数
将神经元铺在带有格栅的35mm培养皿中(Nunc)。在铺板之后立即以及48小时后再次将各个皿所筛选的面积含有约10％的表面扫描相光细胞的存在以评价存活的百分数。细胞存活由台盼蓝进行必要的染色得到确认(未显示)。完整的DRG
将神经节放置在已用不含N2培养基中的聚-1-鸟氨酸和昆布氨酸(各5μg/ml磷酸缓冲的盐溶液)包被的96孔板中(Bottenstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1979，76，514-517，在此以其全文引作参考)，所述培养基中含有0.05％牛血清白蛋白(BSA)，并在37℃和5％CO2的潮湿环境中维持48小时。在铺板之后2小时，经处理的神经节接受250nM的化合物III-3或20ng/ml的NGF。
化合物III-3以浓度依赖的方式支持鸡胚胎外周神经元的存活
NGF的抽提从分离的培养物E9后根神经节传感神经元(DRG)和E12交感神经元(SG)在48小时内诱发它们进行PCD。MLK的活化可导致诱导c-jun转录，增加c-jun蛋白。c-jun蛋白的增量可通过标准分析来测定，如凝胶转移分析所鉴定。Garner等，Nucleic AcidsRes.，1981，9，3047-3060，在此以其全文引作参考。将编码c-jun DNA结合位点的放射性标记的双链DNA寡聚体与核细胞抽提物温育，接着是丙烯酰胺凝胶电泳，并定量分析转移到较低迁移率的放射性标记的DNA。这表示与c-jun蛋白结合的DNA的部分，其与抽提物中c-jun蛋白的量成正比。MLK的活化也可诱导c-jun磷酸化。其检测可利用特异识别蛋白磷酸化形式的抗体在检测系统如蛋白印迹或ELISA中进行。在最适条件下，用化合物III-3可将培养物维持一周和更长时间(数据未显示)。化合物III-3以浓度依赖的方式支持鸡胚胎运动神经元的存活
将Jurkat细胞生长于补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中。TNF-α来自Promega和抗CD3和抗CD28抗体来自Pharmigen。Jurkat实验在96孔板中以200μl的量进行。IL-2的测定采用购自BoehringerMannheim的ELISA试剂盒进行。在加入Jurkat细胞之前，让针对CD3和CD28的抗体结合到96板的塑料中(PNS中18小时)。在加入抗体包被的板之前将细胞用化合物处理1小时。把针对CD3和CD28的抗体用于激活T细胞受体和诱导IL-2。在诱导起始后6和24小时之间，IL-2从Jurkat细胞中释放出来(图17)。没有IL-2组成地制备(图16A)。接着评价化合物III-3(在诱导前用化合物III-3处理1小时)对IL-2诱导的影响(图16B)。化合物III-3浓度500nM抑制了IL-2诱导80％以上(图16B)。采用化合物III-3和化合物I-4进行更广泛的剂量应答实验，化合物III-3(数据未显示)。化合物III-3促进神经突从完整的后根神经节中生长出来
上述实验结果显示化合物III-3不仅促进胚胎神经元的存活，根据下列文献所述的程序，采用免疫方法分离运动神经元：Bloch-Gallego等，Development，1991，111，221-232，在此以其全文引作参考，程序修饰如在Weng等，NeuroReport，1996，7，1077-1081中所述，在此以其全文引作参考。将纯化的运动神经元接种到用聚-DL-鸟氨酸和昆布氨酸(1μg/ml，Upstate Biotech)预包被的35mm培养皿上(Nunc)。培养基为L15及碳酸氢钠(22.5mM)、葡萄糖(20mM)、孕酮(2×10-8M)、亚硒酸钠(3×10-8M)、伴清蛋白(0.1mg/ml)、胰岛素(5μg/ml)、青霉素-链霉素10％以及10％热灭活的马血清。肌肉抽提物以30μg/ml补充。化合物III-3存在下，其似乎稠密以及可能的丛生。实施例36：体内处理鸡胚胎中发育调节的运动神经元的死亡
本发明的例子详细描述在下列文献中：Glicksman等，J.Neurobiol.，1998，35，361-370，在此以其全文引作参考。在第E6天，制作鸡蛋壳的窗口(Spafas，Preston，CT)和将媒介物(5％Solutol TM HS 15，聚乙二醇660羟基硬脂酸酯；BASF Aktiengesellschaft，Ludwigshafen，Germany(磷酸缓冲液中，pH7.2))或媒介物中化合物III-3的具体剂量从E6到E9每天一次直接施用到the vascularized chorioallantoic膜上，如下列文献所述：Oppenheim等，Science，1991，251，1616-1617，在此以其全文引作参考)。胚胎在E10天处死并将他们的脊髓去除，在Carnoy溶液中固定(10％冰醋酸、60％absolute乙醇、30％氯仿)，对系列石蜡切片进行处理，并用硫堇染色。根据前述标准对腰神经区段的每第20切片进行计数(Clarke等，Methods In Cell Biology：Cell Death，1995，Schwart & Osbrone，Eds.，Academic Press，New York，第277-321页，在此以其全文引作参考)。新生大鼠中的发育调节的运动神经元死亡
不限期的pregenant Sprague-Dawley大鼠是从中获得哈尔纶聚偏氯乙烯纤维实验室(印第安纳波利斯，IN)。雌性大鼠小狗是注入每日的，皮下地(SC)，在该目标上方靶会阴肌肉(perineal muscles)，用化合物III-3in 5％Solutol TM HS 15或cehicle沿着开始出生日子(P1)继续的为5天(P5)。在p10或p60，小狗是斩首，血收集在肝素化(利用肝素延长血液凝固时间)毛细管，区域的灌注的之后的该脊髓含有该性双晶脊髓的核心的该球海绵体肌(SNB)该会阴的区域含有该球海绵体肌(公元前)提肌自动号码标识(LA)筋肉是切割的该带有saline/formalin的动物。脊髓的区域含有该SNB是后缀，嵌入Paraplast，区段在10(用Cresylecht violet维持(NordeenScience，1985，229，671-673，引入这里供参考)。运动神经元是计数在字母×500在连续切片从该腰的5要该祭典的1区域的该脊髓作为描述预先Nordeensupra)的话。该微观的列举是赚钱代码区段由一观察者闪锌矿到该试验组。运动神经元计数是正确的为孔眼大小和截面厚度(Konisgsmark，ContemporaryResearch Methods in Neuroanatomy，Nauta & Ebbesson，Eds.，1970，Springer-Verlag，New York，第315-340页，在此以其全文引作参考)和统计学分析是差异的单向分析(ANOVA)。会阴的肌肉系统是后缀，脱钙的，嵌入Paraplast，区段在10(用Milligans三色维持)。使用亮现场显微术(x250)，BCLA筋肉在标准的femalesiii-3-处理雌性(405animals/group)postively被通过认出两者的它们的位置出席的次级过滤。目录的肌肉组织是痕迹从交替的区段使用A投影显微镜(62-5)，the横截面积调节使用A数字化pada以电子计算机为基础的形态测量学系统(Sigmascan，Jandel Scientific)。肌肉卷通过多嘴的总数截面的面积校对为百分比结构的样品而有计划的。
收集的血室温下离心5分钟；然后去除血浆并冷冻于-20℃。血清睾酮水平(6-7动物/组)的测定遵循下列文献中所阐述的程序通过放射性免疫分析进行：Wingfield等，Steroids，1975，26，311-327，在此以其全文引作参考。成年大鼠中的轴索显微外科术诱导的运动神经元分化
左侧舌下神经是横切在成人雌性的颈缩sprague-dawley大鼠(120-180g)在下neumbutol anesthesia，50ul的III-3或它的媒介物(5％solutol同文电报诊断不明15)被用于一支，未付的碾磨，医学博士)，然后折回该中枢端横切的精神。在7天以后，该动物是使麻醉洒遍与4％仲甲醛在Sorensons缓冲的，0.07m磷酸酯，pH7.2。脑茎是除去和40-uM-厚的分期连载作品冠状面是很快向前走A低温恒温器(Chiu等，NeuroReport，1994，5，693-696，它被引入供参考)。每一第五区段是加工为闲谈免疫组织化学作为预先描述(Chiu等，J.Comp.Neurol.，1993，328，351-363，在此以其全文引作参考)使用1∶350稀释的一抗闲谈单克隆抗体从Chemicon。细胞三肼基三嗪污渍清楚地在背景是把…计算在内污渍区段上；列举细胞用来表示闲谈的比率-免疫细胞在该雾化侧的该舌下神经核对目免疫活性的细胞在该控制(未受损害的)侧数目。
化合物III-3援救大鼠胚胎运动神经元从apoptotic死亡在vitroinhibited信号途径导致jnk1活化在这些细胞(Maroney等，J.Neurosci.，1998，18，104-11 1，被引入供参考)。为了确定潜在性活性活体内，III-3是估定分为两部分的模型试验性地调整可程式化马达二乙基溴乙酰胺deathin的模型axotomy-诱导反分化在成人运动神经元。在小鸡，大约50％的该脊髓运动神经元在E5-10期间经历分区控制说明符(Hamburger等，J.Neurosci.，1982，1，38-55；Purves等，Body和Brain：A Trophic Theory of Neural Connections，1988，HarvardUniversity Press，Cambridge，MA，两者在此皆以其全文引作参考)。化合物III-3要该绒膜尿囊的膜在这期间防止马达二乙基溴乙酰胺死亡在剂量给药-依赖其它方式的话(图19)。四十百分之该运动神经元那些世界正规地印模是援救A最二辊的剂量给药已校正的(2.3和7μg/day)，25％的该运动神经元是援救在较低剂量(1.2和1.8μg/天)(图19)。
在早期的产期的生活的雌性大鼠(更迟的胚期直到产后的天(请注意)4)期间，超过50％的该运动神经元在snb的在是消除VIA分区控制说明符(Breedlove，J.Neurobiol.，1986，17，157-176，在此以其全文引作参考)。在雄性，运动神经元在这些核心里使受神经支配有条纹的阴茎筋肉包括I交配的反射。睾丸的分泌的和甾体减少SNB马达二乙基溴乙酰胺死亡在雌性和防止许多的和的萎缩LA筋肉使受神经支配由该神经原。行政的睾丸激素到雌性小狗导致A充分男性脉码调制数snb运动神经元(Nordeen等，同上)和prevented BC和LA muscle atrophy(Waiman等，Endocrinology，1941，29，955-978，在此以其全文引作参考)。每日的螺钉行政的III-3(PN 1-5)到雌性大鼠显著地纤细的马达二乙基溴乙酰胺死亡(图20A).援救的该snb马达二乙基溴乙酰胺死亡由III-3发生在两剂量给药(0.5和1mg/kg/天)。在该最大有效剂量的0.51mg/kg/，行政的III-3导致A 70％增强在马达二乙基溴乙酰胺生存哪个等于该随角异色效应的睾丸激素(图20A)。化合物III-3没有改变血浆睾丸激素处理雌性的水平。收音机免疫的测量的血浆睾丸激素水平在该1-mg/kg/每天基团导致不显著差异当比拟该车辆控制基团(0.016(0.008ng/ml，0.029和0.015ng/ml平均数标准误差(S.E.M.)，分别地)。
为了确定化合物III-3处理在长期维持运动神经存活方面是否有效，用化合物III-3处理雌性动物(0.5和1mg/kg/天)相同的期限PN(1-5)。将一半经媒介物处理的动物和两者皆处理的组在PN 10处死。剩余动物维持不经额外的化合物III-3的处理，直到第PN 60处死。如前所观察(图20A)，化合物III-3处理导致运动神经存活提高70％(图20B)。此外，100％这些当中援救运动神经元是可辨认的词法上55天后来上次处理与化合物III-3(图20B).化合物III-3抑制的马达二乙基溴乙酰胺死亡当该二乙基溴乙酰胺时期许可证马达二乙基溴乙酰胺生存进入成年。
不论该从马达二乙基溴乙酰胺损失成人人类疾病比如肌萎缩性侧索硬化成人运动神经元在最动物模型的马达二乙基溴乙酰胺伤害抗的死亡中清除掉说和很好的随角异色效应。然而，axonal伤害做导致形态(Oppenheimsupra)和生物化学变化(Oppenheim等，同上；Rende等，J.Comp.Neurol.，1992，319，284-298，以其全文在此引作参考；Chiu等，J.Comp.Neurol.，1993，328，351-363，以其全文在此引作参考)在成人运动神经元那些许多仿造物退行性病变前面的死亡在害病的在堕落的运动神经元。一个实施例这些当中种变化合成的形成axotomy的该舌下神经那些使受神经支配该舌。单方面的横切这些当中在成人的精神大鼠导致损失的95％闲谈的-免疫活性的舌下的运动神经元在该同侧的核心在7天(ChiuNeuroReport，1994，5，693-696)(Chiu等，NeuroReport，1994，5，693-696，以其全文在此引作参考)。损失在ChAT疫活性的不永久的。四威克斯跟随axotomy，100％的该运动神经元已经恢复的控制点水平的闲谈免疫活性的(Borke等，J.Neurocytol.，1993，22，141-153，以其全文在此引作参考)。ChAT免疫反应性在该对侧的舌下的运动神经元不影响(Chiu等，同上)(图21和表5)。
当应用Gelfoam TM到hypolossal神经，III-3剂量给药-独立地纤细的该减少闲谈免疫反应性在同侧的舌下的运动神经元估定7天postaxotomy。最大有效剂量(50μg)导致40％更ChAT-免疫活性的运动神经元比拟该axotomized，未经治疗控制(图21B和表5)。曾有钟形的给两者的服依赖较低和较高剂量导致生存大于该未经治疗控制，但低于那些完成在50ug。照现在的样子真实的与该snb模型，没有缔合了的重量损失，致死，否则总数组织损伤在这些动物里在任何剂量给药已校正的。
在三分开的模型的运动神经元退化活体内，化合物III-3证明神经保护活性：试验性地-调整分区控制说明符的腰的脊髓运动神经元在萌芽时期的(图19)，雄激素-敏感的死亡的产后的snb运动神经元(图20)，和axotomy-感应损耗的A官能的制造，ChAT，在成人舌下的运动神经元(图21和表5)。化合物III-3是有效的当sc注入外围地施加，应用局部到该切头的神经，或直接覆盖在这些小鸡胚胎绒膜尿囊。与母体化合物相反K-252a，化合物III-3大约五重的更有力的在居间的生存在运动神经元-加富培养(数据未显示)和没有显示的活性反对trkA酪氨酸激酶和若干丝氨酸苏氨酸激酶(Maroney等，同上Kaneko等，J.Med.Chem.，1997，40，1863-1869，在此以其全文引作参考)。
表5
化合物III-3对axotomized舌下神经运动神经元中胆碱乙酰基转移酶的免疫活性的影响
              ChAT-阳性运动神经元
处理 n 实验/对照 ％ 平均/组别
    媒介物   2     20/544     3.68     4.01
    19/437     4.35
   3.6μg III-3   2     55/420     13.10     12.84*
    72/572     12.59
   25μg III-3   2     95/597     15.91     19.01*
    142/642     22.12
   50μg III-3   2     188/484     38.84     41.34*
    278/637     43.85
   100μg III-3   4     465/920     50.54     32.61*
    235/784     29.98
    178/770     23.12
    182/679     26.80
   200μg III-3   2     99/461     21.48     24.96*
    159/559     28.44
    假性操作   2     350/335     104.48     101.24
    292/298     98.00
化合物III-3或媒介物是包括在内凝胶泡沫到舌下神经的中枢端紧接着跟随它的横切。7天后，将动物处死并依次切片through thehypoglossal nucleus，并且用抗ChAT抗体免疫染色每个第5切片。计数的闲谈-肯定的神经原由制造该同侧的(实验的)对侧的(控制)核心的侧。
*p＜0.05，与媒介物处理的动物比较统计学上显著的。
MLK-3途径的抑制剂体内显示功效并封闭MPTP模型中MLK-3的下游的磷酸化作用。
MPTP是使用剂量给药(40mg/kg)那些生产损失纹状体的多巴胺能的末端细胞主体在该黑质。酪氨酸羟化酶用作标记器为多巴胺能的神经线端在该黑质。系统给药化合物III-3纤细的损失的黑质酪氨酸羟化酶免疫活性的神经原后来MPTP损害(图22A；Saporito等，1999)。因为化合物III-3已知抑制剂的MLK-3，活化的下游地基质的MLK-3是按MPTP-处理小鼠。水平的磷酸化MKK4调节使用A磷酸MKK4特异抗体(New England Biolabs，Beverly，MA)那些经过验证的该单磷酸化由形成MKK4由immunoblot(图22B)或ELISA(图22C)。MPTP行政升降机构水平的磷酸化MKK4在黑质由高达5折叠的在控制水平(图22B)。在行政的MPTP和相符CNS服用水平的MPP+之后，山峰海拔发生4热轧钢。MPTP-居间的MKK4磷酸化被预处理用1-deprenyl预处理，表明这次磷酸化事件被MPP+媒介(图22C)。而且，MKK4磷酸化部分地抑制与化合物III-3预处理绝对大气压剂量给药(1mg/kg)那些生产对mptp-诱导鼻息下多巴胺能的损失的保护措施(图22C)。这些数据证明MPTP(MPP+)活化MKK4，下游地基质的MLK-3。而且，这些数据证明已知的抑制剂的MLK-3抑制活化这些当中激酶途径活体内。实例37：炎症由THP-1细胞中LPS诱导IL-1和TNF-α以及吲哚并咔唑和吡咯并咔唑对诱导的影响
细胞的该免疫系统是选择自后许多激酶涉及到该规则的数值免疫学的官能团，例如，该感应的该合成的细胞活素和该感应的A细胞活素生物资源。A recent report(Hambleton等，Pro.Natl.Acid.Sci.USA，1996，93，2774-2778，在此以其全文引作参考)向表明该处理的单核细胞-派生细胞系与线性规划系统引起A急促的活化的jnk活性。当单核细胞和细菌的内毒素比如脂质聚糖(线性规划系统)它们生产该激动的细胞活素建立联系，IL-1和TNF-a。抑制的生产这些当中两个细胞活素可以A有用的处理的某些激动的无序的该免疫系统。这些细胞活素能够是容易地调整商业的酶联免疫吸附测定装备。我们预定实验到确定(1)如果indolo-和稠合吡咯咔唑能够抑制该合成的IL-1和TNF-α在我们的单核细胞电解槽系列THP-1，(2)如果JNK是活化由LPS在四氢吡喃-1细胞和(3)如果活化n的jnk由左骶后能够是抑制的吲哚并-和融合吡咯并咔唑。实验程序
将THP-1细胞生长在补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中。LSP(大肠杆菌血清型0111.B4，TCA抽提的)购自Sigma并溶于PBS中。分析IL-1和TNF-α的ELISA试剂盒购自Boerhinger-Mannheim，并按照厂商的说明对THP-1培养基进行分析。根据说明得到各个试验的标准曲线。
实验是履行在12井培养皿与1或2mL的四氢吡喃-1细胞在4×105cells/ml.IL-1和TNF-α被该添加的线性规划系统到该培养基诱导和该介质收集在各种的时间其后为细胞活素试验。细胞被离心作用该浮在表面的固定在点上-70℃直到试验除去。想要求最小参数值费用实验是履行一式两份培养和该双份浮在表面的是集资的在离心作用以后。各集资的浮在表面的是试验一式两份。储备溶液的indolo-稠合吡咯咔唑在100％二甲亚砜是稀释的要该想望集中在介质含有10％胎儿牛血清或在介质含有0.5mg/ml牛血清清蛋白的话。除非另外状态，化合物被增加给该四氢吡喃-1细胞1高分辨率在前小孩他添加的线性规划系统。
在免疫沉淀该jnk蛋白质从一拔出的细胞溶解四氢吡喃-1细胞之后，试验为jnk活性是履行。球团四氢吡喃-1细胞是细胞溶解准备就绪的为15分钟在500ul的压裂缓冲的(10mM三-HCl，pH7.5，50mMNaCl，30uM焦磷酸钠，1mg/ml牛血清清蛋白，1％Triton-X-100)。该拔出是离心为10分钟在14K和5ul的jnk抗体(圣克鲁斯厂)被增加给该浮在表面的。该精确是旋转为60分钟在4℃，75ul的洗涤蛋白质A琼脂糖凝胶(20％重量容量比在压裂推荐拔出旋转另一个30分钟置值该抗体配合物到该琼脂糖凝胶。该蛋白质A琼脂糖凝胶是洗涤两次与压裂缓冲的，一次与20mM N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸，pH7.6，20mM mgcl2，2mM二硫苏糖醇，然后培养为15分钟在30℃在30ul的激酶缓冲的(20mM hepes，20mM MgCl2，2MM DTT，1μgrecombinant c-jun，和2μM ATP-γ-32P，2μCi。该反应被该添加的10ul的4x十二烷基磺酸钠凝胶装入缓冲区停止，加热为3分钟在80℃，蛋白质是分析在10％十二烷基磺酸钠凝胶。凝胶是干燥的，暴露于Phosphorimager plate，放射性带材是分析在Phosphorimager。
由抑制剂实验表明那些左骶后在2(g/ml引起该最高产量的LPS-1和浓度的线性规划系统用于全部实验之后。在添加的线性规划系统为最高产量的该细胞活素决意由拿介质为的等分试样试验在各种的时间后来该添加的线性规划系统之后，该最小值时间。第一实验表明那些既IL-1和TNF-a实现最高产量在低于5高分辨率后来该添加的LSP后。既然最最早地的收集时间是2.4高分辨率第一实验，A第二实验是履行与收集起始于15分钟后来该添加的LSP。在该添加的lps.不重要的肿瘤坏死因子-a(是发现平均来说直到90分钟后来线性规划系统添加之后，实验的合成的其中仅仅肿瘤坏死因子-a是试验向表明它实现最高产量在3高分辨率。
该急促的达到的最高产量表明很紧密规则的该合成的该2细胞活素C急促的合成和快速下降调节。在该添加的线性规划系统与或者更生霉素之前，培养的细胞是处理为30分钟，A核糖核酸合成抑制剂，否则酮环己酰亚胺，蛋白质合成抑制剂。介质是收集3高分辨率后来该添加的线性规划系统和肿瘤坏死因子-a是试验。新的核糖核酸和新的蛋白质合成都是需要的肿瘤坏死因子-a感应以后也不肿瘤坏死因子-a发现平均来说的细胞用处理抑制剂。该下一个实验是履行到确定如果化合物III-3将抑制该感应的IL-1和TNF-α。化合物III-3抑制该感应的两者的IL-1和TNF-α with IC50 values of 267nM和139nM分别。实验的合成的是获得与细胞在介质含有10％胎儿牛血清。自…以后该试验与脊髓的女生薄织物和基础的前脑薄织物为化合物被的神经营养性活性履行在血清-游离介质(500ug/ml牛血清清蛋白)它对有趣的确定该50％感染浓度喜爱该抑制的左内锋-1和肿瘤坏死因子-a在血清-释放介质。当四氢吡喃-1细胞被用处理III-3在血清-释放介质(500ug/ml牛血清清蛋白)该50％感染浓度是减少10折叠从269纳米到23纳米时。除非另有说明全部实验履行将来被履行在血清-释放介质。该抑制由III-3的该感应的左内锋-1和肿瘤坏死因子-a在四氢吡喃-1细胞建议III-3可以有用的为治疗学在处理病理学的条件由所引起该生产的正常以上大量这些细胞活素。脓毒性休克是这样的A状态。脓毒性休克由所引起该生长的革兰氏阴性细菌在该循环哪些依次释放大量该内毒素，线性规划系统。该线性规划系统然后刺激主要地该单核细胞和巨噬细胞到生产大量IL-1和肿瘤坏死因子-a，哪个然后引起大而重的组织损伤和在许多致死。
对若干种化合物测试了其抑制TNF-α的能力，并与抑制JNK的能力进行了比较。结果显示在表6中。
表6
               THP-1细胞   Cos7细胞中过表达的MLK3
  化合物   TNF-αIC50nM   JNK％抑制500nM     JNK％抑制500nM
    III-1     49.5     93.5     83.8
    III-3     29     93     94
    I-2     ＞5000     78.5     85
    I-3     366     80.5     93.7
    I-4     75.5     79.5     95
    I-5     514     89     97.2
    I-6     817.5     77.5     57.8
    I-7     1009     74     85.5
    III-4     462.5     81     66
    III-5     4     84.5     96
    III-7     590.5     11.5     54
    III-8     11.5     51     94
    III-10     4298     48     59
    I-10     4500     62     94
    I-11     686     51     92.5
化合物III-3对Jurkat细胞中的IL-2诱导的影响
进行实验以确定化合物III-3是否抑制Jurkat细胞中IL-2的诱导。实验程序
将Jurkat细胞生长于补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中。TNF-α来自Promega和抗CD3和抗CD28抗体来自Pharmigen。Jurkat实验在96孔板中以200μl的量进行。IL-2的测定采用购自BoehringerMannheim的ELISA试剂盒进行。在加入Jurkat细胞之前，让针对CD3和CD28的抗体结合到96板的塑料中(PNS中18小时)。在加入抗体包被的板之前将细胞用化合物处理1小时。把针对CD3和CD28的抗体用于激活T细胞受体和诱导IL-2。在诱导起始后6和24小时之间，IL-2从Jurkat细胞中释放出来(图23A)。没有IL-2组成地制备(图23ACNT)。接着评价化合物III-3(在诱导前用化合物III-3处理1小时)对IL-2诱导的影响(图23B)。化合物III-3浓度500nM抑制了IL-2诱导80％以上(图23B)。采用化合物III-3和化合物I-4进行更广泛的剂量应答实验，化合物III-3的IC50为139nM，而化合物I-4的IC50为207nM(图23C)。
需要说明的是本专利文献中所述的各个专利、申请、印刷出版物都以其全文在此引作参考。
本领域中的那些专业技术人员将意识到，在不背离本发明实质的情况下，针对本发明优选的实施方案可作出众多的变化和修饰。然而，所有这些变化都落入本发明的范围内。
                            序列表
                      序列表<110>赛福伦公司(Cephalon，Inc.)
安娜·马罗尼(Maroney，Anna)
凯文·M·沃尔顿(Walton，Kevin M.)
克雷格·A·迪翁(Dionne，Craig A.)
妮古拉·尼夫(Neff，Nicola)
小欧内斯特·奈特(Knight，Jr.，Ernest)
马西·A·格利克曼(Glicksman，Marcie A.)<120>调节多谱系激酶蛋白(Modulating Multiple Lineage Kinase Proteins)<130>SCT030274-09<150>60/097,980<151>1998-08-26<150>09/376,894<151>1999-08-18<150>09/637,054<151>2000-08-11<150>PCT/US01/24822<151>2001-08-08<160>18<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>17<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Ala Cys Met Gly Ile Gly Ala Tyr Tyr1               5                   10                  15Thr<210>2<211>23<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Gly Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys Ala Trp Ala Gly Gly Ala Cys Cys1              5                   10                  15Ala Ser Ala Cys Arg Thr Cys
        20<210>3<211>33<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Arg Thr Ile Cys Ala Tyr Met Gly Ile1               5                   10                  15Gly Ala Tyr Tyr Thr Ile Gly Cys Ile Gly Cys Ile Met Gly Ile Ala
        20                  25                  30Ala<210>4<211>30<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Gly Gly Ala Ala Thr Thr Ile Ala Tyr Ile Gly Gly Ala Trp Ala Ile1               5                   10                  15Gly Trp Cys Cys Ala Ile Ala Cys Arg Thr Cys Ile Ser Trp
        20                  25                  30<210>5<211>10<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>5Met Glu Glu Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu1               5                   10<210>6<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>6gtggctgtgc gggcagctcg ccag                                          24<210>7<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>7gagaccctgg atctcgcgct t                                             21<210>8<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>8Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1               5<210>9<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>9cggatccgtg acaccagtcg gaacctt                                       27<210>10<211>28<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>10ggaattcacc agtaagctcc agcacatc                                      28<210>11<211>33<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>11ataattcgtg ctagcgccag agtctagccg gtg                                33<210>12<211>39<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>12ataagcttcc tcagtgcaag tggatcgcgc agcccctga                          39<210>13<211>8<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>13Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1               5<210>14<211>69<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>14ataaagcttc cagaggccat ggactacaag gacgacgatg acaaggcctg cctccatgaa    60acccgaaca                                                            69<210>15<211>18<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>15gacagggcgg ccggctct                                                  18<210>16<211>583<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>16gaattcggca cgagaggact cgcaggtgtc cggcgacgag ggctggtgga ccgggcagct    60gaaccagcgg gtgggcatct tccccagcaa ctacgtgacc ccgcgcagcg ccttctccag    120ccgctgccag cccggcggcg aggaccccag ttgctacccg cccattcagt tgttagaaat    180tgattttgcg gagctcacct tggaagagat tattggcatc gggggctttg ggaaggtcta    240tcgtgctttc tggatagggg atgaggttgc tgtgaaagca gctcgccacg accctgatga    300ggacatcagc cagaccatag agaatgttcg ccaagaggcc aagctcttcg ccatgctgaa    360gcaccccaac atcattgccc taagaggggt atgtctgaag gagcccaacc tctgcttggt    420catggagttt gctcgtggag gacctttgaa tagagtgtta tctgggaaaa ggattccccc    480agacatcctg gtgaattggg ctgtgcagat tgccagaggg atgaactact tacatgatga    540ggcaattgtt cccatcatcc accgcgacct taagtccagc aac                      583<210>17<211>194<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>17Asn Ser Ala Arg Glu Asp Ser Gln Val Ser Gly Asp Glu Gly Trp Trp1               5                   10                  15Thr Gly Gln Leu Asn Gln Arg Val Gly Ile Phe Pro Ser Asn Tyr Val
        20                  25                  30Thr Pro Arg Ser Ala Phe Ser Ser Arg Cys Gln Pro Gly Gly Glu Asp
    35                  40                  45Pro Ser Cys Tyr Pro Pro Ile Gln Leu Leu Glu Ile Asp Phe Ala Glu
50                  55                  60Leu Thr Leu Glu Glu Ile Ile Gly Ile Gly Gly Phe Gly Lys Val Tyr65                  70                  75                  80Arg Ala Phe Trp Ile Gly Asp Glu Val Ala Val Lys Ala Ala Arg His
            85                  90                  95Asp Pro Asp Glu Asp Ile Ser Gln Thr Ile Glu Asn Val Arg Gln Glu
        100                 105                 110Ala Lys Leu Phe Ala Met Leu Lys His Pro Asn Ile Ile Ala Leu Arg
    115                 120                 125Gly Val Cys Leu Lys Glu Pro Asn Leu Cys Leu Val Met Glu Phe Ala
130                 135                 140Arg Gly Gly Pro Leu Asn Arg Val Leu Ser Gly Lys Arg Ile Pro Pro145                 150                 155                 160Asp Ile Leu Val Asn Trp Ala Val Gln Ile Ala Arg Gly Met Asn Tyr
            165                 170                 175Leu His Asp Glu Ala Ile Val Pro Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Ser
        180                 185                 190Ser Asn<210>18<211>10<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>18Asn Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Cys1               5                   10

Claims (12)

1.一种鉴别可用于治疗艾滋病周围神经病的化合物的方法，其包括用化合物与包含多谱系激酶蛋白的细胞或细胞提取物接触以测定所用化合物是否减低所接触的多谱系激酶蛋白的活性。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的多谱系激酶蛋白选自包括多谱系激酶1(MLK1)，多谱系激酶2(MLK2)，多谱系激酶3(MLK3)，亮氨酸拉链支撑激酶(LZK)，双亮氨酸拉链支撑激酶(DLK)，和多谱系激酶6(MLK6)的组群。
3.权利要求2所述的方法，其中所述的蛋白活性通过所述蛋白质底物的活性或磷酸化状态来测定，其中所述的底物选自包括JNK1，JNK2，JNK3，ERK1，ERK2，p38α，p38β，p38γ，p38δ，MEK1，MEK2，MKK3，MKK4(SEK1)，MEK5，MKK6，MKK7，jun，ATF2，ELK1，和AEX-3的哺乳动物中同族体。
4.权利要求2所述的方法，其中所述的蛋白活性通过所述蛋白质底物的活性、所述蛋白质底物的量、或所述蛋白质底物的mRNA编码来测定。
5.一种治疗具艾滋病周围神经病的病人的方法，其包括给上述病人服用能抑制多谱系激酶蛋白的化合物，以药学上可接受的盐或稀释液的形式。
6.权利要求5所述的方法，其中所述的化合物具有化学式
      (插入化学式)
其中
B和F，各自独立地，和与之相连的碳原子形成
不饱和的6碳芳香环，其中1-3个碳原子可被氮原子所替换；或
不饱和的5碳芳香环，其中的1个碳原子可被氧、氮、或硫原子所替换；或2个碳原子可被1个硫原子和1个氮原子，或1个氧原子或1个氮原子所替换；
A1和A2一起表示O，B1和B2一起表示O；
R1为H、1-4(包括1和4)个碳的烷基、芳基、芳香烷基、杂环芳基、和杂环芳香烷基；COR9，其中R9为1-4(包括1和4)个碳的烷基、或芳基，优选苯基或萘基；-OR10，其中R10为H或1-4(包括1和4)个碳的烷基；-CONH2，-NR7R8，-(CH2)nNR7R8，其中n为1-4的整数(包括1和4)；或-O(CH2)nNR7R8；而R7和R8之一独立地为H或1-4(包括1和4)个碳的烷基；或者R7和R8联合形成具有一般化学式-(CH2)2-X1-(CH2)2-的连接基团，其中X1为O、S、或CH2；
R2为H、-SO2R9；-CO2R9、1-8(包括1和8)个碳的烷基，优选1-4(包括1和4)个碳的烷基，1-8(包括1和8)个碳的烯基，优选1-4(包括1和4)个碳的烯基，或1-8(包括1和8)个碳的炔基，优选1-4(包括1和4)个碳的炔基；或5-7(包括5和7)个碳的单糖，其中单糖的每个羟基或不被取代或被H、1-4(包括1和4)个碳的烷基、2-5(包括2和5)的烷羰氧基、或1-4(包括1和4)个碳的烷氧基所替换；又或者
1-8(包括1和8)个碳的烷基、1-8(包括1和8)个碳的烯基、1-8(包括1和8)个碳的炔基中的每一个是未被取代的；或者
1-8(包括1和8)个碳的烷基、1-8(包括1和8)个碳的烯基、1-8(包括1和8)个碳的炔基各自独立的被1-3个6-10碳(包括6和10)的芳基所取代，优选苯基或萘基；或被杂环芳基、F，Cl，Br，I，-CN，-NO2，OH，OR9，-O(CH2)nNR7R8，-OCOR9，-OCONHR9，O-四羟吡喃，NH2，-NR7R8，NR10COR9所取代；或被-NR10CO2R9，-NR10CONR7R8，-NHC(＝NH)NH2，-NR10SO2R9，-S(O)yR11所取代，其中R11为H或1-4碳的烷基，6-10碳的芳基，优选苯基或萘基，或杂环芳基，而y为1或2；或被-SR11，-CO2R9，-CONR7R8，-CHO，COR9，-CH2OR7，-CH＝NNR11R12，-CH＝NOR11，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-SO2NR12R13，-PO(OR11)2，或OR14所取代，其中R14为羧基中的羟基移去后的氨基酸残基；又或者
R12和R13独立地为H、1-4个(包括1和4)碳的烷基、6-10个碳的芳基，优选苯基或萘基，或杂环芳基；或者
R12和R13联合形成连接基团，优选为-(CH2)2-X1-(CH2)2；
R3，R4，R5和R6，各自独立地为H、芳基，优选6-10个(包括6-10)碳的芳基，更优选的为苯基或萘基；杂环芳基；F，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，OH，-OR9，-O(CH2)nNR7R8，-OCOR9，-OCONHR9，NH2，-CH2OR14，-NR7R8，-NR10COR9，-NR10CONR7R8，-SR11，-S(O)yR11其中y为1或2；-CO2R9，-COR9，-CONR7R8，-CHO，-CH＝NOR11，-CH＝NR9，-CH＝NNR11R12，-(CH2)nSR9，其中n为1-4(包括1和4)的整数，-(CH2)nS(O)yR9，-CH2SR15其中R15为1-4个(包括1和4)碳的烷基；-CH2S(O)yR14，-(CH2)nNR7R8，-(CH2)nNHR14，1-8个(包括1和8)碳的烷基，优选1-4个(包括1和4)碳的烷基；1-8个(包括1和8)碳的烯基，优选1-4个(包括1和4)碳的烯基；1-8个(包括1和8)碳的炔基，优选1-4个(包括1和4)碳的炔基；又或者
1-8(包括1和8)个碳的烷基、1-8(包括1和8)个碳的烯基、1-8(包括1和8)个碳的炔基中的每一个是未被取代的；或者
1-8(包括1和8)个碳的烷基、1-8(包括1和8)个碳的烯基、1-8(包括1和8)个碳的炔基中的每一个是如上文d)2)所描述的那样被取代的；
X为，或者
不被取代的1-3个(包括1和3)碳的亚烃基；或者
X为可被1个R2基团取代的1-3个(包括1和3)碳的亚烃基，优选OR10，-SR10，R15，其中R15为1-4个(包括1和4)碳的烷基；或被苯基、萘基、7-14个(包括7和14)碳的芳烷基所取代，优选苯基；或者
X为-CH＝CH-，-CH(OH)-CH(OH)-，-O-，-S-，-S(＝O)-，-S(＝O)2-，-CR10)2-，-C(＝O)-，-C(＝NOR11)-，-C(OR11)(R11)-，-C(＝O)CHR15)-，-CHR15)C(＝O)-，-C(＝NOR11)CHR15)-，-CHR15)C(＝NOR11)-，CH2Z-，-Z-CH2-，-CH2ZCH2-，其中Z为C(OR11)(R11)，O，S，C(＝O)，C(＝NOR11)，或NR11；
或者
A1和A2一起各自独立地为H，H；H，-OR11；H，-SR11；H，-NR11)2；或一起表示＝S或＝NR11；B1和dB2一起表示O；而R1，R2，R3，R4，R5，R6和X中的每一个如上文所定义；
或者
A1和A2一起表示O，而B1和B2一起各自独立地为H，H；H，-OR11，H，-SR11，H，-NR11)2，或一起表示＝S或＝NR11；而R1，R2，R3，R4，R5，R6和X中的每一个如上文所定义。
7.权利要求6所述的方法，其中A1、A2、R1、R3、R4、R5和R6为H；B1和B2一起表示O；R2为CH2CH2OH；X为CH2。
8.权利要求5所述的方法，其中所述的化合物具有化学式
(插入化学式)
其中
B环和F环，独立地，且各自和与其相连的碳原子在一起，可供选择的基团包括：
不饱和的6元碳芳香环其中的1至3个碳原子可被氮原子所替换；
不饱和的5元碳芳香环；及
不饱和的5元碳芳香环，其中
1个碳原子被氧、氮、或硫原子所替换；
2个碳原子被1个硫原子和1个氮原子，1个氧原子和1个氮原子、或2个氮原子所替换；或者
3个碳原子被3个氮原子所替换；
R1可供选择的基团包括：
H、可被取代或不可被取代的1-4个碳的烷基、可被取代或不可被取代的芳基、可被取代或不可被取代的芳烷基、可被取代或不可被取代的杂环芳基、或可被取代或不可被取代的杂环芳烷基；
-C(＝O)R9，其中R9可供选择的基团包括：烷基、芳基和杂环芳基；
-OR10，其中R10可供选择的基团包括：H和1-4个碳的烷基；
-C(＝O)NH2，-NR11R12，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)pOR10，-O(CH2)pOR10和-O(CH2)pNR11R12，其中p为1-4；及其中
R11和R12可供各自独立选择的基团包括：H和1-4个碳的烷基；或
R11和R12一起形成化学式为-(CH2)2-X1-(CH2)2-的连接基团，其中X1可供选择的基团包括：-O-，-S-、和-CH2-；
R2可供选择的基团包括：H，1-4个碳的烷基，-OH，1-4个碳的烷氧基，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)pNR11R12，-O(CH2)pOR10，可被取代或不可被取代的6-10个碳的芳香烷基、及可被取代或不可被取代的杂环芳香烷基；
R3，R4，R5和R6可供各自独立选择的基团包括：
H，芳基，杂环芳基，F，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH-，-OR9，-O(CH2)pNR11R12，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR2R7，--OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)pOR10，-CH2OR10，-NR11R12，-NR10S(＝O)2R9，-NR10C(＝O)R9；
-CH2OR14，其中R14为其羧基中的羟基移去后的氨基酸残基；
-NR10C(＝O)NR11R12，-CO2R2，-C(＝O)R2，-C(＝O)NR11R12，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)pNHR14，或-CH＝NNR2R2A其中R2A与R2相同；
-S(O)yR2-(CH2)pS(O)yR9，-CH2S(O)yR14其中y为0、1、或2；
1-8个碳的烷基、2-8个碳的烯基、2-8个碳的炔基，其中
每一个烷基、烯基或炔基是不可取代的；或
每一个烷基、烯基或炔基可为1-3个基团所取代的，可供选择的取代基团包括6-10个碳的芳基、杂环芳基、芳甲氧基、杂环烷氧基、羟基烷氧基、alkyloxy-alkoxy，hydroxyalkylthio，alkoxy-alkylthio，F，Cl，Br，I，-CN，-NO2，-OH，-OR9，-X2(CH2)pNR11R12，-X2(CH2)pC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pOC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pCO2R9，-X2(CH2)pS(O)yR9，-X2(CH2)pNR10C(＝O)NR11R12，-OC(＝O)R9，-OCONHR2，-O-tetrahydropyranyl，-NR11R12，-NR10C(＝O)R9，-NR10CO2R9，-NR10C(＝O)NR11R12，-NHC(＝NH)NH2，NR10S(O)2R9，-S(O)yR9，-CO2R2，-C(＝O)NR11R12，-C(＝O)R2，-CH2OR10，-CH＝NNR2R2A，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-S(＝O)2NR2R2A，-P(＝O)(OR10)2，-OR14，及5-7个碳的单糖其单糖的每一个羟基可各自独立地不被取代或被H所替换，1-4个碳的烷基，2-5个碳的alkylcarbonyloxy，或1-4个碳的烷氧基；
X2为O，S，或NR10；
R7和R8可供独立选择的基团包括：H、1-4个碳的烷基、1-4个碳的烷氧基、可替代或不可替代的6-10个碳的芳烷基、可替代或不可替代的杂环芳烷基、-(CH2)pOR10，-(CH2)pOC(＝O)NR11R12，和-(CH2)pNR11R12；或R7和R8一起形成化学式为-CH2-X3-CH2-的连接基团，其中X3为X2或键；
m和n各自独立地为0、1、或2；
Y可供选择的基团包括：-O-，-S-，-N(R10)-，-N+(O-)(R10)-，-N(OR10)-，和-CH2-；
Z可供选择的基团包括：键，-O-，-CH＝CH-，-S-，-C(＝O)-，-CH(OR10)-，-N(R10)-，-N(OR10)-，CH(NR11R12)-，-C(＝O)N(R17)-，-N(R17)C(＝O)-，-N(S(O)yR9)-，-N(S(O)yNR11R12)-，-N(C(＝O)R17)-，-C(R15R16)-，-N+(O-)(R10)-，-CH(OH)-CH(OH)-，和-CH(O(C＝O)R9)CH(OC(＝O)R9A)-，其中R9A与R9相同；
R15和R16可供独立选择的基团包括：H，-OH，-C(＝O)R10，-O(C＝O)R9，羟基烷基和-CO2R10；
R17可供选择的基团包括：H、烷基、芳基、和杂环芳基；
A1和A2可供选择的基团包括：H，H；H，OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；及基团其中的A1和A2一起形成＝O，＝S，和＝NR2；
B1和B2可供选择的基团包括：H，H；H，-OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；及基团其中的B1和B2一起形成＝O，＝S，和＝NR2；
附带条件是成对的A1和A2，或B1和B2中至少一对形成＝O。
9.权利要求5所述的方法，其中所述的化合物具有化学式
(插入化学式)
其中
Z1为H，Z2为H，或Z1和Z2一起形成＝O；
R1可选择的基团包括：H，Cl，CH2SO2C2H5，Br，CH2S(CH2)2NH2，CH2S(CH2)2N(CH3)2N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH2n-C4H9，NHCONHC6H5，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC6H5，N(CH3)2，CH3，CH2OCONHC2H5，NHCO2CH3，CH2OC2H5，CH2N(CH3)2，OH，O正丙基，CH＝NNH-C(＝NH)NH2，CH＝N-N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH-n-C4H9，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3；
(插入化学式)
以及
R2可选择的基团包括：H，Br，Cl，I，CH2S(CH2)2N(CH3)2，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC2H5，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，和CH2OH；
X可选择的基团包括：H，CH2OH，CH2NH-SerineH，CO2CH3，CONHC6H5，CH2NHCO2C6H5，CH2NHCO2CH3，CH2N3，CONHC2H5，CH2NH-甘氨酸，CON(CH3)2，-CH2NHCO2-，CONH2，CONHC3H7，CH2NH-丝氨酸，CH2SOCH3，CH＝NOH，CH2NH-脯氨酸，CH2CH2(2-吡啶基)，CH＝NNHC(＝NH)NH2，CONH(CH2)2OH，CH＝NNHCONH2，CH2OCOCH3，-CH2OC(CH3)2O-，CH2SC6H5，CH2SC6H5，CH2SOC6H5，CO2正己基，CONHCH3，CO2(CH2)4CH3；
(插入化学式)
以及
R可选择的基团包括：OH，和OCH3.
10.权利要求9所述的方法，其中Z1和Z2为H；X为CO2CH3；而R为OH。
11.权利要求9所述的方法，其中Z1和Z2为H；X为CO2CH3；R1和R2为CH2SCH2CH3；而R为OH。
12.权利要求5所述的方法，其中所述的化合物具有化学式
(插入化学式)
其中
Z1为H，Z2为H或Z1和Z2一起形成＝O；
R1为H或Br；
R2为H；
R3为H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，或(插入化学式)
及
R4为H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6811992B1 (en) 1998-05-14 2004-11-02 Ya Fang Liu Method for identifying MLK inhibitors for the treatment of neurological conditions
MXPA06000514A (es) * 2003-07-14 2006-06-20 Decode Genetics Ehf Metodos de diagnostico y tratamiento del asma y otras enfermedades respiratorias basandose en la asociacion de haplotipos.
US20060014165A1 (en) * 2003-07-14 2006-01-19 Decode Genetics Ehf. Methods of diagnosis and treatment for asthma and other respiratory diseases based on haplotype association
US20060058250A1 (en) * 2004-09-10 2006-03-16 Cephalon, Inc. Methods of treating proliferative skin diseases using carbazole derivatives
WO2014172616A2 (en) * 2013-04-18 2014-10-23 President And Fellows Of Harvard College Methods, compositions and kits for promoting motor neuron survival and treating and diagnosing neurodegenerative disorders
CN115025225A (zh) * 2016-11-25 2022-09-09 基诺富公司 用于诱导神经干细胞的分化和保护的组合物及使用该组合物诱导神经再生的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5756494A (en) * 1992-07-24 1998-05-26 Cephalon, Inc. Protein kinase inhibitors for treatment of neurological disorders
US5705511A (en) * 1994-10-14 1998-01-06 Cephalon, Inc. Fused pyrrolocarbazoles
US6811992B1 (en) * 1998-05-14 2004-11-02 Ya Fang Liu Method for identifying MLK inhibitors for the treatment of neurological conditions
ES2241316T3 (es) * 1998-08-26 2005-10-16 Cephalon, Inc. Modulacion de proteinas quinasa de linaje multiple.
US6841567B1 (en) * 1999-02-12 2005-01-11 Cephalon, Inc. Cyclic substituted fused pyrrolocarbazoles and isoindolones

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