CN1154065A - 一氧化碳依赖性的鸟苷酰环化酶效应物 - Google Patents

Abstract

这里公开的方法和有关的组合物及药剂一般是针对细胞活性和神经活性的控制，以及选择性和控制性地诱导一种或多种天然存在的遗传编码分子在哺乳动物体内的遗传表达。更具体地说，本发明选择性地激活或阻遏编码天然存在的特异分子如蛋白质和神经营养因子的基因，通过施用能调节嘌呤衍生物的一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶来诱导内源性产生这些天然存在的化合物。本发明的方法可用于影响细胞和神经的多种功能和活动以及用于多种疾病如神经行性病变，神经学、细胞和生理紊乱的治疗或预防。

Description

一氧化碳依赖性的鸟苷酰环化酶效应物

                      发明领域

本发明总的来讲涉及细胞活性和神经活性的控制以及细胞和神经紊乱的治疗。更具体地说，本发明针对通过施用能调节嘌呤衍生物的一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶改变哺乳动物的细胞和神经活性的方法和相关组合物及药剂，它能选择性地控制诱导包括神经营养因子在内的天然存在的遗传编码分子在体内的遗传表达。本发明的方法、组合物和药剂可用于调节细胞和神经的多种活动以及用于许多种生理、神经退行性和神经紊乱(异常)的治疗或预防。

                        发明的背景

哺乳动物中枢神经系统的进化是对复杂性不断增加的环境的自然反应，以解决环境中出现的难题。其产生的结构是一个复杂的生化基质，后者通过化学调控途径的精细系统得到准确的控制和弱化。通过一系列精细的、高度专一性的化学反应，这些途径监控和指导中枢神经系统结构和运行的每一个方面，再通过中枢神经系统监控和指导有机体和各个方面。正常情况下，各种不同控制系统间的复杂相互作用协调合作，产生一个由大脑操纵的、高效的多功能中枢神经系统。但是，如果由于年龄、疾病或其它原因导致中枢神经系统的生化基质受损失，那么正常的调节途径有可能不能有效地弥补所述损失。在这种情况下，极其希望改进或补充神经机制，以预防或弥补此类疾病紊乱。这正是本发明的焦点所在。

更具体说，哺乳物大脑是由大约100亿个神经细胞或“神经元”构成，它们由数量更多的、被称做神经胶质或星形细胞的支持细胞包围着。神经元和其它体细胞一样，是由细胞核、细胞质及外围的细胞膜构成。然而，神经元又不同于其它细胞，它还具有独特的、纤维状的延伸，使得每一个神经细胞能与其它数千个神经细胞网络化，形成神经基础结构或网络结构。在这一复杂网络结构中的信息联系为有机体进行的各种智能活动过程提供了一个基础。

在每一个神经细胞中，传入的信号由被称做“树突”的神经延伸部位接受，每个神经细胞可能有数千个“树突”。同样地，神经信息沿着神经细胞的“轴突”辐射，“轴突”可以分枝成多达1万个不同的神经末梢。总的来说，这些神经细胞轴突和树突一般被称做“神经突”，每一个神经元通过它们与其它神经元构成广泛的联系。结果，健康大脑中可能的神经联系的数量数以万亿计，从而产生了巨大的智能。相反地，由于年龄、疾病、氧化性应激或直接的物理损伤引起神经细胞死亡或退化，使神经网络结构中的联系中断，此时有机体的智能也将遭到严重损害。

每一个轴突与其它神经元的树突或细胞体相连系的部位叫做“突触”。每个神经元之间的信息传导正是在突触部位通过化学信使跨过突触而进行的。大多数化学信使或者说“神经递质”都是一些小肽、儿茶酚胺或氨基酸。当神经轴突联系受到适当的刺激时，神经递质跨过突触扩散到邻近的神经元，从而将刺激信号沿着神经网络结构传导到下一个神经元。根据神经细胞之间传递的信息复杂性的不同，目前认为在哺乳动物大脑内有50至100种不同的神经递质用于信号传递。

最近发现，一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)可能具有神经递质的功能。这些气体分子似乎参与多种影响细胞生长和相互作用的神经元调节途径。大脑和其它身体部位相同，其CO是由“血红加氧酶II”(HO)催化产生的。不管CO是由HO催化产生的还是来自其它途径，都认为当CO扩散到神经元时，它通过调节一种被称做“鸟苷酸酯(guanylate)环化酶”或“鸟苷酰(guanylyl)环化酶”的酶诱导另一个被称做“环一磷酰鸟苷”(cGMP)的次级神经递质的增加。因此，CO在鸟苷酰环化酶调节途径中起着信号分子的作用。cGMP水平的提高似乎可以改变若干种神经营养因子及其它神经元因子，它们又可以诱导、促进或改变包括细胞生长、细胞保护和细胞间通讯在内的一系列细胞功能。

神经营养因子具有刺激神经元发育和分化以及维持细胞完整性的多种作用，同时它们也是在有机体整个生命周期中神经元生存和发育所必需的。一般说来，神经营养因子可以分为两大类：神经营养素和多效营养素。多效营养素不同于神经营养素，前者缺乏特征性的分子信号序列，该营养素分子可从细胞中分泌出来；前者还能作用于包括神经元在内许多种不同的细胞。神经营养因子有两种作用尤其重要：(i)防止神经元死亡及(ii)刺激神经突(新生的轴突或树突)的分枝生长。此外，CO诱导的神经营养因子似乎可以降低神经细胞的膜电位，使得神经元能更容易地接受和传递信号。

今天的许多研究者认为，记忆和突触活性的变化有关，其中通过反复多次的刺激活动，在大脑某些区域的特殊神经元组群之间的突触联系逐渐增强或变得容易。结果，这些经改变的突触联系更加容易活化。这种易化作用被认为发生在整个大脑，但在海马中尤为突出，它是对记忆至关重要的一个大脑区域。最初刺激后的许多天内，对海马中神经元途径的刺激可增强通过这些途径的其突触传递。此过程叫做长时增强效应(LTP)。

更具体说，长时增强效应是活性依赖性突触电活动的形式，所述电活动可通过许多神经元途径展现出来。在这种状态下，普遍认为它是一种细胞记忆类型，神经细胞对刺激更为敏感。因此，广泛认为LTP为了解该类型突触的可塑性的细胞和分子基础提供了一个较好的模式，突触的可塑性构成了包括人类在内的脊椎动物学习和记忆的基础。

目前，NO和CO是易化LTP的最主要的信使物质，因为这些化合物的抑制剂能阻滞增强效应的诱导。利用这些或其它信号传递物来改善神经活性、增加实现LTP可行性的能力能潜在地提高学习效率和认知能力，并可能弥补智能敏度的下降。在本发明之前，还没有已知的方法或药剂能在体内细胞水平上有效改变细胞和神经调节途径，从而易化神经元的LTP。

与长时增强效应引起的智能提高相比，当神经细胞死亡或组成性细胞的机能障碍破坏了神经元网络结构时，智能将可能在不同程度上受到阻碍。虽然智力降低与神经网络结构的破坏有直接关系，但重要的是记住破坏发生在细胞水平上。在单个细胞水平上导致神经元破坏的有害作用可以由下面任何一个因素引起，它们包括神经退行性疾病和紊乱、心脏病、中风、衰老、创伤和接触有害化合物或环境试剂。

在反过来又阻碍神经元功能的已知神经疾病中，包括早老性痴呆病及有关紊乱，帕金森氏病，运动神经病变如肌肉萎缩性单侧坏死、大脑麻痹、多样性坏死，和享廷氏舞蹈病。由于正常衰老或中风、心脏病或其它循环系统病变引起的神经元联系损伤也可能导致类似的问题。直接的物理创伤以及化学试剂、重金属等等的环境因子都可能诱发神经元或细胞的损害、机能障碍或死亡。

在肌肉萎缩性单侧坏死、帕金森氏病、早老性痴呆病、癌症和老化等各种细胞和神经退行性病症中，由于氧化性自由基造成的细胞损伤的累积被认为是关键因素之一。大多数细胞具有多种保护机制，以免受具有细胞毒性的自由基的伤害。例如，高水平的谷胱甘肽可以防止自由基的氧化性伤害。神经元缺乏这种抗氧化剂的来源。

不管造成神经紊乱或机能障碍的原因是什么，在自然条件下受损伤的神经细胞通常不能大量再生或更新将导致需要对神经细胞施用神经营养因子，以通过刺激神经生长及其功能帮助恢复神经元功能。同样地，通过施用神经生长因子来刺激轴突生成或轴突生长，可赋予存活下来的神经元形成轴突联系并恢复其神经功能的能力。

目前，为了直接对患有神经紊乱的病人施用神经营养因子，现有的技术和化合物已经没有效果或不实用。部分原因是由于神经营养因子之间分子的复杂相互作用及神经细胞生长和神经轴突生成的协同调节。神经营养因子是一个长的化学级联的结果，所述级联由一系列复杂的递质和受体在分子水平上进行微妙的调节。因此，神经细胞受到不同神经营养因子的作用，每一个神经营养因子作用于神经元发育的不同阶段的不同方面。实际上，神经营养因子是整个级联过程中最末尾的一环，因此它是调节途径中最复杂的成份之一。正是如此，本领域先前的实践者天真地设想在随机的一个时间(从细胞观点看)不减少施用单个神经营养因子的量能大大促进细胞活性或再生。相反，早期改变级联过程中的调节途径使得能产生比较合适数量的特定生长因子，并在适当的时间进入到复杂的细胞环境中。

其它实用的考虑也排除采用现有技术用神经营养因子刺激神经元网络结构的再生。神经营养因子(包括神经营养素和多效性营养素)是大分子蛋白质，这种蛋白质不适合于正常的医药给药途径。例如，这些蛋白质不能通过口服传递给患者或受害者，因为这些蛋白质在没有到达靶神经位点之前将被病人的消化系统消化了。此外，这些蛋白质分子比较大，不能跨过血脑屏障，无法进入体内最重要的神经位点区。另外，将神经营养因子直接注射到大脑或脑脊髓液中基本上能解决上述问题，但是遇到了其本身的许多技术问题，因此证明是很难操作的。例如，已证明给大脑直接注入已知的神经营养素是不现实的，因为提供治疗剂量的浓度需要数年的给药时间。进一步说，在给大脑直接注射后的极短时间内伴随神经组织有危险的肿胀和炎症。因此，理论上所希望的对患者直接施用神经营养因子在目前是不可行的。

因此，本发明总的目的是提供一些方法及有关的组合物和药剂，以有效地改变哺乳动物细胞、神经元、细胞活性或神经活性，从而获得多种有益的结果。这些结果包括防止由自由基引起的氧化性应激和损伤以及更为普遍性的生理反应如哺乳动物血压降低。

因此，本发明的另一个目的是提供治疗哺乳动物神经学病症和细胞紊乱的方法及有关组合物和药剂。

本发明还有一个目的是提供诱导哺乳动物神经元膜电位长期变化的方法及有关组合物和药剂。

本发明的另有一个目的是提供诱导在体内细胞中生理性产生或施用遗传编码分子和神经营养因子的方法及有关组合物和药剂。

本发明的再一个目的是提供为在生理环境中增强神经营养因子的神经再生效应的方法及有关组合物和药剂。

                     本发明概述

实现上述目的及其它目的有赖于本发明的方法、组合物和药剂，它们通常选择性诱导天然存在的遗传编码分子(包括神经营养因子)在体内的遗传表达和产生，以及通过使用至少一种一氧化碳依赖性的、鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物治疗(处理)哺乳动物细胞和神经元以改变细胞和神经活性。

那些本领域熟练的技术人员可意识到，由本发明的方法、组合物及药剂作用引起的体内遗传表达的激活或阻抑和示例性的细胞与神经活性的改变可以多种形式或其结合表现出来。例如，按本发明的教导处理哺乳动物细胞或神经元，可以通过促进细胞内各种天然存在的遗传编码的化合物如蛋白质和神经营养因子在细胞内的产生，或者刺激这些化合物的活性，继而作用于天然存在的细胞或神经元的机制、功能、发育和生存使得体内表达分子对细胞直接进行自我给药。这些后继的作用包括防止自由基的氧化和细胞损伤、稳定其它因子的细胞受体、一氧化碳和抗氧化剂化合物的内源产生，甚至通过一氧化碳激活细胞机制降低血压。本发明的方法和药剂还可以直接刺激细胞或神经元的生长、发育和生存，但却没有现有技术和方法的有害作用。再者，本发明可用于降低或改变细胞的膜电位、增加细胞的可塑性和诱导长时增强效应。

用于实践本发明的示例性的一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物包括鸟苷、次黄苷pranobex和4-[3-(1，6-二氢-6-氧-9嘌呤-9-基)-1-氧丙基]氨基]苯甲酸(AIT-082)。不同于现有技术中的化合物，这些化合物可通过口服或注射或其它常规途径对患者直接给药。这些示例性的化合物没有毒性，还可以通过血脑屏障。

进一步说，在更为特定的方面，本发明的方法和组合物可用于神经疾病和细胞紊乱的治疗或预防，所述的神经学疾病和细胞紊乱包括由疾病、氧化性应激、衰老、创伤或接触有害化学试剂引起的紊乱。通过促进每个神经元和细胞的生存、生长和发育，本发明有利于神经网络结构的再生和发育，减弱细胞和神经机能障碍的表现。

当然，那些本领域熟练的技术人员会意识到，药物组合物和药剂可通过将本发明的有效浓度的一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物与药理学上能接受的赋形剂和载体掺合而形成。这些药物组合物可通过口服、皮肤、局部或注射给药。此外，用于本发明方法的活性试剂能穿过血脑屏障，因此没有必要向大脑或中枢神经系统直接注射或输入给药。

还有一个方面，本发明的方法和组合物可用于诱导哺乳动物神经元膜电位的长时间变化。这些长时增强效应的变化可导致膜可塑性的增大，并伴有相应的细胞记忆加强。反过来，增强的细胞记忆可以提高受试者的智力，并使得学习速度加快，对原始素材的记忆增加。

考虑到下文详细描述的示例性优选实施方案以及在首先简述的附图中所示的数据，本发明的其它目的、特点和优越性对本领域的熟练技术人员而言是明显的。

                   附图的简要描述

图1是按照本发明施用嘌呤衍生物AIT-082后的鼠类血浆浓度图。

图2图示了胆碱拮抗剂阿托品通过嘌呤衍生物AIT-082对小鼠记忆加强的作用。

图3显示的是不同浓度的嘌呤衍生物AIT-082对体外生长的神经细胞的神经生长因子介导的神经再生反应的影响。

图4A、4B、4C比较了选择性抑制剂和嘌呤衍生物对神经生长因子介导的神经再生反应的影响；图4A显示了在正铁血红蛋白(一种CO净化剂)存在下生长的细胞的神经再生反应；图4B显示了在含有甲烯兰(一种鸟苷酰环化酶抑制剂)存在下生长的细胞具有相同的反应；图4C显示了在锌原卟啉IX(一种一氧化碳净化剂)存在下生长的细胞的反应；

图5A和5B比较了在嘌呤衍生物AIT-082和不同浓度的一氧化氮抑制剂存在下生长的细胞的神经生长因子介导的神经再生反应。

图6比较了cGMP在含有嘌呤衍生物AIT-082和不含AIT-082的培养基中生长的细胞中的产生；

图7显示了采用winshift记忆测验测得的不同剂量的嘌呤衍生物AIT-082对端士Webster小鼠学习的影响；

图8比较了在测定过程中单一剂量(60mg/kg和30mg/kg)嘌呤衍生物的持续作用时间；

图9比较了采用嘌呤衍生物AIT-082和毒扁豆碱药物处理因年龄导致的记忆缺陷型瑞士Webster鼠的学习能力；

图10比较了采用嘌呤衍生物AIT-082和毒扁豆碱药物处理因年龄导致的记忆缺陷型C57BL/6鼠的学习能力；

图11比较了嘌呤衍生物AIT-082对处理的小鼠和未处理小鼠因年龄导致的记忆缺陷的预防作用；

图12A和12B比较了添加嘌呤衍生物后鼠类皮层星形细胞的神经生长因子的产生，测定方法为ELISA；图12A显示了所测定的在不同浓度的鸟苷三磷酸存在下生长的神经元的神经生长因子的浓度，图12B显示了在不同浓度鸟苷存在下生长的细胞的神经生长因子浓度；

图13A和13B比较了在含有和不含有鸟苷的培养基中生长的鼠类皮层星形细胞在不同时间产生的各种不同的神经营养因子的mRNA；图13A显示了神经生长因子(NGF)的mRNA水平，图13B显示了成纤维细胞生长因子(FGF)的mRNA水平。

图14、A14B和14C比较了在含有不含有神经生长因子的情况下神经再生对不同浓度的嘌呤衍生物的反应；图14A显示了在含有神经生长因子的情况下神经再生对不同浓度的各种嘌呤衍生物的反应，图14B显示了在不含神经生长因子的情况下神经再生的反应，图14C显示了在含有和不含有神经生长因子的情况下单个或多个嘌呤衍生物的混合物对神经再生的影响；

图15A、15B和15C比较了神经生长因子介导的神经再生在含有不同浓度的不同种类的嘌呤衍生物存在下生长的神经元中的反应；图15A显示了对不同浓度次黄苷的神经再生反应；图15B显示了对不同浓度次黄嘌呤有相同的神经再生反应；图15C显示了暴露于不同浓度黄嘌呤的神经元细胞的神经再生反应；

图16显示了在不同浓度嘌呤衍生物AIT-034存在下生长的神经元细胞中测得的神经生长因子介导的神经突生长；

图17比较了在含有和不含有神经生长因子条件下，不同浓度的鸟苷三磷酸和腺苷三磷酸对生长于其中的神经元细胞的神经再生反应的影响；

图18比较了神经生长因子介导的神经再生对鸟苷和腺苷一磷酸、二磷酸、三磷酸嘌呤衍生物的反应；

图19比较了在不同浓度嘌呤衍生物鸟苷存在下生长的神经元细胞中产生的cGMP；

图20A、20B和20C比较了在含有不同浓度的三种不同抑制剂条件下，生长于含有和不含嘌呤衍生物鸟苷中的细胞的神经生长因子介导的神经再生反应；图20A显示了在甲烯兰(一种鸟苷酰环化酶抑制剂)存在下生长的细胞的神经再生反应；图20B显示了在各种不同浓度LY83583存在下生长的细胞的神经再生的反应，LY83583也是鸟苷酰环化酶的抑制剂；图20C显示了在各种不同浓度心房促钠排泄因子(一种能与鸟苷酰环化酶相互作用的激素)存在下生长的细胞的神经再生反应；

图21显示了在硝酸钠(无机化合物一氧化氮的供体)存在下生长的神经元的神经生长因子介导的神经再生反应；

图22A和22B比较了在一氧化氮供体和一氧化氮、一氧化碳清除剂存在下生长的神经元的神经生长因子介导的神经再生反应；图22A显示了在一氧化氮供体和血红蛋白的各种不同组合下生长的细胞的神经再生反应；图22B显示了在一氧化氮供体和正铁血红蛋的各种不同组合下生长的细胞的神经再生反应；

图23比较了在各种浓度血红蛋白(加或不加嘌呤衍生物鸟苷)存在下生长的细胞的神经生长因子介导的神经再生反应；

图24比较了在不同浓度的L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)(加或不加嘌呤衍生物鸟苷)存在下生长的细胞的神经生长因子介导的神经再生反应。

图25比较了在存在有不同浓度锌原卟啉IX(ZnPP)(CO合成的抑制剂)及加或不加鸟苷的情况下生长的细胞的神经生长因子介导的神经再生反应；

图26是图25的阴性对照，它比较了生长于不同浓度铜原卟啉IX(CuPP)和加或不加嘌呤衍生物鸟苷中的细胞的神经生长因子介导的神经再生反应；

图27显示了在不同浓度嘌呤衍生物次黄苷pranobex存在下生长的神经元细胞的神经生长因子介导的神经再生反应。

                        发明详述

从大的方面看，本发明针对可专一性地用于处理哺乳动物细胞和神经元，以改善细胞或神经的活性的方法及有关组合物和药剂。更具体说，本发明针对使用有效的嘌呤衍生物调控细胞或神经元中的二氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节系统，以产生各种有益的结果，包括诱导天然存在的神经营养因子在体内的遗传表达，给哺乳动物直接施用所得的这些天然存在的遗传编码分子，内源性产生抗氧化剂化合物和一氧化碳以及降低哺乳动物血压。采用本发明的方法和组合物可防止退化细胞的损伤，治疗由于自由基氧化性应激造成细胞损伤所致的疾病。

在本发明的示例性的实施方案中，一些特定的嘌呤衍生物可用于诱导编码分子的遗传表达、刺激神经突生长、促进神经元生长以及改变神经元的膜电位从而提高哺乳动物的学习能力。下面将讨论典型的研究和处理情况，选择典型的嘌呤衍生物和具有代表性的组合物，使用不同的剂量和给药途径，这些在本发明的方法中都应是有效的。当然，那些本领域的普通技术人员能认识到，本发明并不特别局限于下面要详细描述的这些特定的组合物和给药剂量或途径。

根据受治疗者个体的具体需要，按照本发明的教导，所用的组合物作为药剂可以不同剂量和剂型进行给药以取得有效的治疗浓度。选用的组合物的有效剂量是可以改变的，它取决于以下因素，如选用的嘌呤衍生物的活性，患者的生理特征，患者神经退化或紊乱的程度与性质以及给药方法。已证实可有效地改善神经活性的典型治疗浓度范围为小于1μM到500mM或更高。一般说，可改变起始剂量以确定治疗特定哺乳动物患者的最佳剂量。组合物的给药途径有许多种，包括口服、局部给药、皮肤给药、腹膜内注射或直接静脉内注射到血流中。当然，如果需要的话，也可以向脑脊髓液中注射或向大脑中直接灌注有效量的嘌呤衍生物。

将嘌呤衍生物作为药剂给哺乳动物患者给药，既可以单独给药也可以按照药物配方以结合形式给药本发明的方法均是有效的。进一步说，嘌呤衍生物可以和药理上可接受的赋形剂和载体物质如惰性固体稀释剂、水溶液或无毒的有机溶剂一起使用。如果需要的话，这些药的配方还可包括防腐剂和稳定剂等。

本发明的方法和药剂可有控制地长期改善各种类型细胞或神经的活性，包括在体内产生天然存在的遗传编码分子如血红素加氧酶和神经营养生长因子(包括神经营养素，多效性营养素和细胞素)直接施用体内产生的此类分子，增强这些分子和神经营养因子的作用以及刺激细胞的生长、功能、保护和发育。再进一步，本发明可用于促进神经突生长、形成侧突神经回路、增强环状嘌呤核苷酸的形成、促进突触形成和改变神经元的膜电位。这些作用对于治疗神经退化和提高学习能力方面可能极有益处。同样地，对于治疗和防止与氧化性损伤有关的疾病，如癌症、衰老和各种神经性紊乱，诱导体内产生天然存在的内源性抗氧化剂化合物是极其有用的。

由于显而易见的实用上的和道德方面的原因，有关这些麻烦事情，开始就对人开展实验确定组合物和方法的功效的工作是行不通的。因此，开发任何药物或疗法的早期阶段，考虑到安全和代价的因素，标准的程序是采用合适的动物模型。采用实验动物模型之所以能成功是基于这样的理解，即哺乳动物的细胞和神经生理学是相似的。因而，某种物种的成员例如啮齿类，和另一不同物种的成员，例如人类，其细胞或神经营养反应经常一致。只有充分发展了实验动物模型以后，才能在人上进行临床试验，以进一步证实某种药剂在人上的安全性和功效。

有关神经退行性疾病和紊乱及其临床表现，小鼠动物模型和人在这些疾病病理的许多方面极其相似。因此，那些本领域熟练的技术人员很容易懂得，推测小鼠或“鼠类”作为人和其它哺乳动物的动物模型是合适的。与人类一样，神经元退化很易引起小鼠的学习紊乱，其引起的原因不管是外伤、氧化性损伤、衰老、疾病还是有害化学试剂。正如明显地看到，鼠类动物模型的和人的神经营养因子的作用方式实质上是相同的，神经元的反应也非常相似。因此，目的只是为了解释而不是为了限制，本文将主要通过小鼠作为哺乳动物的典型来初步展示本发明。那些本领域的普通技术人员将认识到本发明可以在包括人在内的其他哺乳动物中进行实践。

就像本文的资料所表明的，按照本发明的教导，已发现数种嘌呤衍生物能有效地作用。具体地说，这些资料表明，鸟苷似乎能很好地用于刺激神经营养因子的产生和促进神经突生长。另外一个相似的典型的嘌呤衍生物是4-[3-(1，6-二氢-6氧-9-嘌呤-9-基)-1-氧丙基]氨基]苯甲酸(AIT-082)，已表明它能刺激天然存在的基因在体内的激活或解抑制以及天然存在的遗传编码分子如神经营养因子的产生。它还能诱导内源性的产生血红素加氧酶，后者又诱导内源性产生一氧化碳和胆色素抗氧化剂化合物。AIT-082还能增强神经突的生长，提高神经营养因子的功效，改变神经元的膜电位，继而使得细胞容易产生长时增强效应。

1992年2月25日授权的专利号为5,091,432的美国专利公开了AIT-082，该专利的发明人也是本专利申请的发明者，因此将该专利引入本文作为参考。已表明适用于本发明的另一种典型的成分是次黄苷Pranobex即isoprinosine。次黄苷Pranobex是次黄苷和DIP-PacBa按1∶3克分子浓度比混合成的混合物，发现它能促进神经突的生长和神经营养因子在体外的效用。上述本发明的不同的实施方案显示了用各种不同的嘌呤衍生物通过调节一氧化碳依赖性鸟苷环化酶系统以改变细胞和神经的活性。

本发明典型的优选实施方案涉及用AIT-082即4-[3-(1，6-二氢-6-氧-9-嘌呤-9基)-1-氧丙基]氨基]苯甲酸进行细胞或神经元的治疗。正如前面所讨论的，AIT-082是次黄嘌呤的一种独特衍生物，它含有对-氨基苯甲酸成份。经口服后它能迅速地吸收，通过血脑屏障后毫无改变地进入大脑。口服后30分钟，每毫克脑组织测出的水平高达3.3毫微克。AIT-082诱导天然存在的遗传编码分子如血红素加氧酶和神经营养因子在体内的遗传表达。结果，本发明能诱导被处理细胞进行直接给药这些化合物，刺激有关代谢途径，产生生理效应。如果将这些化合物单独加入培养基中，它还能刺激神经元细胞的神经突生长，增强神经营养因子如神经生长因子(NGF)的神经再生效应。更为重要的是，AIT-082经腹膜腔内或口服给药后，能增强年老记忆缺陷的小鼠的记忆。

AIT-082的促神经再生活性能被血红蛋白、甲烯兰、ZnPP及所有CO清除剂抑制，但不被CuPP和一氧化氮合成酶的其它抑制剂所抑制。已知的神经递质及神经调控剂受体的体外活性筛选实验是阴性的。业已清楚ZnPP也是血红素加氧酶I的抑制剂，该酶能识别这种典型的鸟苷环化酶调节的嘌呤衍生物的作用位点。血红素加氧酶是已知的热休克(应激)蛋白。已经证实热体克蛋白能调节细胞内蛋白质的构象、胞内运输和降解。它们还涉及到在应激过程中维持细胞的存活力。本领域的一些人认为，热休克(应激)蛋白的含量降低或功能下降可能是引起早老性痴呆病患者的异常折叠蛋白质沉积增多和细胞死亡的因素之一。因此，AIT-082能够诱导体内产生血红素加氧酶的能力印证了本发明对多种细胞保护性途径的作用，表明本发明除了治疗其它疾病外还适用于治疗心脏病和中风。

结合下面非限制性的实施例，那些本领域的普通技术人员能进一步了解本发明。这些实施例按照本发明的教导，阐述了嘌呤衍生物的鉴定、特点和使用的示例性实验程序。

                        实施例1

               小鼠血浆中AIT-082的水平

对成年C57BL/6小鼠按30mg/kg进行腹膜内(I.P.)给药溶于生理盐水的AIT-082。给药AIT-082后30分钟、45分钟、60分钟和90分钟将动物去头处死。用加有肝素的试管收集血液，混匀，2000rpm离心15分钟。取出血浆上清液并贮存于-70℃备用。采用高压液相色谱系统分析测定血浆和脑组织中的AIT-082。采用的分析方法在数种密切相关的嘌呤分子的存在下对AIT-082具有选择性。本方法的灵敏度为每毫升血浆含0.1微克AIT-082，每毫克脑组织(湿重)含0.1微克AIT-082。

这些测定结果示于表A和图1，其中示出了对C57BL/6小鼠给药(腹膜内，30mg/kg)后30分钟、45分钟和60分钟AIT-082在血浆中的量。根据这些资料可以估测，血液中AIT-082浓度的高峰值大约出现在45分钟时，血浆中的半衰期为大约为12分钟，其K_el＝3.45/小时。

                          表A

                    血浆AIT-082的浓度

         时间(分钟)            浓度(μg/ml±标准误)

             15                       42±6

             30                       108±13

             45                       437±131

             60                       86±24

             90                       20±12

                      实施例2

               AIT-082穿过血脑屏障

对两只个小鼠腹膜内注射30mg/kg的AIT-082，给药30分钟后将之处死，然后分析这两只动物的脑组织。迅速取出大脑并置于冰上。用5.0ml生理盐水在Brinkman Polytron组织匀浆器中匀化脑组织(大约250-300mg湿重)，贮存于-70℃备用。采用Gelman Acrodisc滤膜进行超滤以除去大脑匀浆物中的蛋白质；首先用1.2微米的滤膜超滤，然后用0.2微米的滤膜超滤。如上所述用30μl样品进行HPLC分析。向未处理小鼠的大脑匀浆物中加入已知量的AIT-082以制作标准曲线。大脑组织的分析表明了在这两个动物的大脑皮层样品和脑其它部位样品均检测到了AIT-082。结果直接见表B。

                          表B

                 大脑组织的AIT-082浓度

样品#         脑部位         脑重(mg)      AIT-082浓度

                                           (ng/mg脑组织)

  S3          皮层             181             2.8

  S3          其它部位         153             3.3

  S4          皮层             146             3.4

  S4          其它部位         217             2.3

该表表明30分钟后大脑组织中存在AIT-082是非常关键的，因为AIT-082能穿过血脑屏障而没有降解。

                          实施例3

               AIT-082与胆碱能系统相互使用

因为在早老性疾呆病人的海马中发现胆碱能神经元严重损失，所以人们对能改变该系统活性的化合物记忆的作用非常感兴趣。以病变或中风为模型的研究支持记忆的胆碱能假说。海马的CA1区病变似乎专一性地阻断记忆活动。在中风模型中，脊椎动脉和颈动脉闭塞(30分钟)引起海马CA1区的特异性细胞损失和记忆功能的损失。在老龄大鼠的这些模型中，已表明胆碱酯酶抑制剂毒扁豆碱能促进记忆。THA是另一种能提高胆碱能功能的药物，表明它也能促进老龄猴子的记忆。观察到AIT-082能以毒扁豆碱和THA大体相同的方式促进记忆活动，这提示是否AIT-082对胆碱能系统可能有某些作用。

为了阐明AIT-082促进记忆的机制，试图通过给小鼠同时施用短效胆碱能拮抗剂阿托品以阻断AIT-082的作用，然后对小鼠进行简单的学习测验。据报道，阿托品能够阻断毒扁豆碱和THA的作用。从第1天到第4天，给小鼠注射AIT-082(30mg/kg)后2小时进行学习测验。仅仅在第3天上，学习测验前半小时或注射AIT-082后1.5小时再注射阿托品(0.5mg/kg)(28)。所有注射均为腹膜内注射。先让小鼠在T-迷宫中来回跑动以确定赏格在迷宫位置，然后再试验，看看它们能否记住赏格的位置。小鼠的正确识别反应的百分率见图2所示。

图2证实了在第3天上阿托品阻断了AIT-082增强记忆的活性，阻断效应是短暂的，因为第4天未施用阿托品时AIT-082的增强效应又重新出现。此现象提示，胆碱能机制可能与AIT-082的作用有关。

                   实施例4

         AIT-082对乙酰胆碱受体的作用

应用Fields的方法[J.Bol.Chem.253(9)：3251-3258，1978]，通过干扰小鼠组织中QNB(3-quinuclidinyl benzilate)的结合，测定AIT-082与乙酰胆碱受体的相互作用。用这种法测不出AIT-082的作用。

在此研究中，用AIT-082(30mg/kg)处理小鼠后2小时，将之去头处死，处理组织以获得含有乙酰胆碱受体的膜。当在体外测定这些组织时，发现AIT-082对QNB的亲和力(Kd)没有影响，AIT-082的施给是按照测验记忆力的相同条件进行的。但发现皮层和纹状体的受体数量(B最大值)有变化，其中皮层的乙酰胆碱结合位点减少，纹状体的乙酰胆碱结合位点增多。这些资料与下面的假学是一致的，即对小鼠给药AIT-082后的结果是向皮层的输入量增加。典型的情况是，输入量增加将导致受体的下调节。

                      实施例5

        AIT-082对受体配体体外结合的影响

估测AIT-082对配体与38个分离得到的受体结合的抑制能力。筛选到的受体及其配体如下：

腺苷

氨基酸：

有刺激作用的氨基酸(甘氨酸、红藻氨酸、MK-801、NMDA、PCP、quisqualate和sigma)；

有抑制作用的氨基酸(苯并二吖庚因、GABA-A、GABA-B及甘氨酸)

生物胺(多巴胺-1；多巴胺-2；5-羟色胺-1；5-羟色胺-2)

钙通道蛋白(硝苯吡啶，omegaconotoxin，氯化物，钾)

肽因子(ANF，EGF，NGF)

肽类：(血管紧张素，精氨酸-加压素-V₁和V₂，韩蛙皮素，中枢和外周CCK，神经降压素，NPY，生长激素抑制素，K物质，P物质，VIP)

第二信使系统：

腺苷酸环化酶

蛋白激酶(佛波醇酯和肌醇三磷酸酯)

测验在Nova实验室(Baltimore，MD)按合同进行，体外进行的任何测定均未发现AIT-082有活性。

因此，虽然AIT-082通过胆碱能神经系统(阿托品阻断它的活性)发挥作用，但是AIT-082是通过不涉及到与乙酰胆碱受体直接相互作用的一种机制发挥作用。重要的是要注意到在体外AIT-082并不与腺苷受体结合。

为了更加充分地估测AIT-082的中枢神经系统活性的范围，因此建立了一系列心理药理学试验：

(a)运动协调，采用加速Rota-Rod踏车试验，

(b)探寻和饲养笼运动活性，采用Stoelting活性监测器，

(c)焦虑分裂活性，采用Plus迷宫的方法估测，

(d)伤害感受。

AIT-082与标准参考药物进行比较。

                       实施例6

            AIT-082增强小鼠的运动协调作用

小鼠的运动协调测定采用加速Rota-Rod踏车方法(Ugo Basile公司)进行。在用生理盐水或药物处理后的不同时间，将小鼠放在Rota-Rod上，这种踏车的速度在5分钟内增至最大。下面的表C记录了受试小鼠从踏车上掉下来的时间(以秒计)。每只小鼠测试3次，记录其平均时间。

                      表C

           AIT-082对Roto-Rod表现的影响

    AIT剂量(mg/kg)                  时间(秒)

         对照                       123±64

        0.005                       162±93

        0.05                        207^*±73

        0.5                         184^*±76

        30.0                        187^*±68

        60.0                        229^*±80

^*P＜0.05，与对照相比的t-检验

用AIT-082处理的受试小鼠的运动协调能力增强，与对照发鼠(生理盐水处理)和低剂量(0.005mg/kg处理)的鼠相比表现为在roto-rod踏车上停留时间较长。

                        实施例7

               AIT-082不抑制探寻活动

为了测定探寻行为，将用生理盐水或AIT-082处理的受试小鼠放在一个新的大笼子(25×48×16cm，宽×长×高)里，然后在30分钟内每隔1分钟测定其运动情况。这种大笼子(圣地亚哥仪器公司，圣地亚哥，加利福尼亚)装有垂直的控测器，能记录舍饲活动情况。没有记录到对受试小鼠的探寻活动的影响作用，表明受试小鼠不是残废。

                         实施例8

                  AIT-082不抑制运动活性

为了测定饲养笼运动活性，将饲养笼放在活性监测器(Stoelting仪器公司)的平台上。在15分钟内每隔1分钟记录饲养笼运动活性的活动情况。给受试小鼠注射生理盐水或AIT-082，将之放回到它们的饲养笼中。注射后10分钟，将饲养笼重新放在活性监测器的平台上。在30分钟内每隔1分钟记录饲养笼活性的活动情况。在前5分钟，还监测到并记录下了舐毛活动。结果见下面的表D。

                         表D

               AIT-082对运动活性的影响

                            运动情况

                        (平均值±标准差)

 AIT剂量    给药前          给药后          差异

 (mg/kg)

  对照      1633±434       1385±492        248±492

  0.005     1884±230       1375±563        509±429

  0.05      1718±606       1508±456        209±340

  0.5       1610±349       1320±689        290±435

  30.0      1440±264       1098±189        342±267

  60.0      1690±223       634^*±223       1056^*±154

^*P＜0.05，与对照比较的t-检验

由表D的资料可见，高剂量(60mg/kg)可使受试小鼠更加适应其环境，用AIT-082处理后活动量较少。其它的剂量没有记录到作用效果。

                    实施例9

            AIT-082基本上增加焦虑

Plus迷宫由黑色有机玻璃构成，这种有机玻璃是由两个方向相对的开放臂状物(30×5cm，长×宽)和两个方向相对的封闭臂状物(30×5×15cm，长×宽×高)组成。封闭臂状物的墙壁是光滑的有机玻璃，四个臂状物相联的中间面积为5×5cm。整个Plus迷宫安装在高于地板38cm的基座上。测试时，将受试小鼠放在其中一个开放臂状物的一端。记录受试小鼠离开起始位置(开放臂状物的前10cm)所花费的时间，再记录受试小鼠进入其中一个封闭臂状物一半时所需的时间。当受试小鼠到达封闭臂状物一半的地点时，开始进行3分钟的测试试验。在3分钟的测验阶段，记录受试小鼠进入开放臂状物的次数。至少有两只脚爪踏上了开放臂状物的台子才算一次进入。当AIT-082的剂量为30mg/kg时，小鼠有轻微的焦虑表现但在较高剂量(60mg/kg)或较低剂量(0.005-0.5mg/kg)时均未观察到这种现象。

                   实施例10

            AIT-082不影响伤害感受

将小鼠放在55℃的电热板(Omnitech)上，记录受试小鼠自放到板上后直至开始舔后肢时的时间长短。如果45秒钟内没有反应则终止试验。这个试验表明AIT-082对伤害感受没有影响。

                     实施例11

                 AIT-082没有毒性

用AIT-082对大鼠和小鼠进行急性中毒预试验，给药途径为口服或腹膜内注射，表明其LD₅₀剂量超过3000mg/kg。采用Panlab′s普通药理学筛选程序(Panlabs，11804 North Creek Parkway South，Bothwell，Washington 98011)评价了AIT-082的毒性，结果表明在79个不同的标准能力的测验系统中它没有任何毒性。

根据AIT-082的化学结构特点，预期的结果表明该化合物在代谢过程中不会产生任何有毒性的代谢物。

总之，除了在上述一个剂量时引起轻微的焦虑反应外，AIT-082在各种心理药理学试验中几乎没有任何有害作用。剂量范围为0.05-60mg/kg时，运动协调(roto-rod测验)能力增强；在运动测试中，剂量为60mg/kg时学习和适应能力也可能提高。

了解了这种示例性化合物的心理药理学特性后，进行了下一步研究是为了证实本发明的神经生长效应。

                        实施例12

           AIT-082促进PC12细胞的神经突生长

研究本发明的化合物特性的大多数研究工作都涉及到使用PC12细胞。这种细胞来源于大鼠的嗜铬细胞瘤，它在含有NGF的培养基中能长出神经突、停止细胞分裂，表现出交感神经元的许多特征。如果培养基中不含有神经生长因子(NGF)，很少的PC12细胞的神经突比其细胞直径长。添加饱和浓度的NGF并维持48小时可刺激大约20-35％的细胞长出神经突。因为它们是一些同源的神经元样细胞群，又没有星形细胞污染，因此有可能在这些细胞中研究基于嘌呤的化合物对这些细胞的神经突生长的直接影响。

为了证实本发明的示例性化合物引起神经元的变化，通过测定刺激PC12细胞的神经突生长以制作AIT-082的剂量反应曲线。细胞先培养在含有1.5％马血清和1.5％胎牛血清的RPMI1640中，然后再转接到多聚鸟氨酸包被的24孔培养板上，每孔2.5×10⁴个细胞。细胞转接后立即向各种培养基中加AIT-082和NGF。培养48小时后，除去培养基，立即用10％的福尔马林和PBS固定细胞10分钟。细胞和神经突在固定的2天内进行计数。

神经突定义为从细胞伸出至少一个细胞直径的长度并在其顶端显示有生长锥的突起。对于每一次处理，从处理条件完全相同的6个培养物中选出一个进行计数，计数时选用2个有代表性显微镜视野。计算出每孔的细胞总数(约100个细胞)和生长有神经突的细胞总数，然后确定每孔中含有神经突的细胞数所占的比例。计算出每一次处理的平均值(±SEM)。为了便于比较，长出的神经突以占仅有NGF(NGF＝100％)存在时长有神经突的细胞的相对比例表示。通过Tukey显著性检验的方差分析(ANOVA)比较有和没有NGF时化合物的作用效果。

结果见图3，其中曲线代表不同浓度的AIT-082加饱和浓度的2.5SNGF(40ng/ml)。中间水平线代表对照值，即培养在仅含有40ng/ml的NGF的培养基中的细胞的值。水平线的上限和下限为仅含有NGF的置信区间，采用的方法为标准统计方法。

如图3所示，AIT-082刺激神经突生长，在低浓度(1μm)时加强NGF刺激的PC12细胞的神经突生长。资料分析显示，在促进PC12细胞神经突生长和NGF的最佳效应提高30％方面，AIT-082和NGF效果一样。为了进行比较和在下面更详细地讨论，在刺激神经突生长和增强NGF刺激的PC12细胞神经突生长方面，次黄苷和次黄嘌呤的效果较弱，但在较低浓度(30-300nM)时效果较好。在30-300μM的较高浓度时，鸟苷和AIT-082相似具有显著的效果。

                        实施例13

           抑制剂对AIT-082促神经突生长的作用

与年龄有关的记忆损失和NGF依赖性前脑基部神经元的损失有关。这种情况可以通过静脉滴注(i.c.v)NGF得到改善。仅仅AIT-082对神经突生长的作用以及AIT-082和NGF对神经突生长的作用可采用实施例12的程序进行研究。为了研究AIT-082的作用机制，进行了一系列实验，应用抑制剂阻止或改变专一性的生化过程。所有的培养基均含有最佳剂量(40ng/ml)的NGF，因此没有加AIT-082的一系列培养基体现了抑制剂对NGF活性的作用。如前文所表明的，添加AIT-082的剂量为10μM，该剂量是明显易理解的最佳剂量。使用了三种选择性的抑制剂。

这些研究的结果如下面的表E所示，图4A、4B和4C显示了在所示的条件下培养48小时后长有神经突的细胞的比例。基础水平线的值代表生长于无NGF或AIT-082的细胞。

                        表E

            AIT-082和选择性的抑制剂单独或

             与NGF一起对神经突生长的作用

抑制剂     浓度     仅有AIT-   仅有NGF     AIT-082+NGF

                      082¹无                   0.2±0.02   0.2±0.02   0.26±0.01正铁血红蛋白  0                  0.2±0.02   0.26±0.01

            1μM               0.2±0.02   0.17±0.02甲烯兰        0                  0.2±0.02   0.26±0.01

            5μM               0.24±0.03  0.10±0.01锌原卟啉IX    0                  0.20±0.02  0.26±0.01

            1μM               0.22±0.03  0.13±0.01

¹长有神经突的细胞的比例。

正铁血红蛋白(MHb)俘获并清除掉培养基中的一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)。MHb对NGF的活性没有影响但抑制AIT-082的作用，这提示NO或CO与AIT-082的作用有关。

甲烯兰(MB)抑制可溶性的鸟苷酰环化酶，该酶产生一种细胞内物质环状GMP(cGMP)，如前文所述，cGMP参与神经脉冲传递的第二信使系统。MB对NGF的活性没有影响但抑制AIT-082的作用，这提示鸟苷酰环化酶与AIT-082的作用机制有关。

锌原卟啉区(ZnPP)是血红素加氧酶II(HO)的抑制剂，HO又产生CO。ZnPP对NGF的活性没有影响但抑制AIT-082的作用。以此鉴定了AIT-082作用的一个潜在位点，它涉及到HO的产生。以此还确认了CO的产生结果是AIT-082作用机制的一部分。这些结果表明了本发明的许多重要的方面和特点。

如前面所讨论的，HO是一种热体克(应激)蛋白。这种蛋白被认为是保护机制的一部分，保护机制是应激过程中维持细胞活力所必需的(例如参见，Georgopoulos，C.and W.J.Welch，Role of the major heatshock proteins as molecular chaperones.Annu.Rev.Cell Biol.，1993.9：P.601-634)。除了调节细胞内蛋白质的构象、胞内运输和降解外，HO还与高效抗氧化剂化合物的产生非常有关，这些抗氧化剂化合物是通过HO的酶促反应和血红素的降解产生的。在哺乳动物组织中，产生保护性抗氧化剂胆色素胆绿素和胆红素的唯一来源是HO作用下的血红素降解。大量的证据表明，这些胆色素在细胞的抗氧化剂防护机制中起着非常重要的作用(Stocker，P.，et al.，Bilirubin is an antioxidant ofpossible physiological importance.Sciene，1987.235：P.1043-1047)。此外，在大脑中发现了HO，已知热激后其浓度大为升高(Ewing，J.F.，S.N.Haber，and M.D.Maines，Normal and heat-induced patterns ofexpression of heme oxygenase-1(HSP32)in rat brain：hyperthermia causesrapid induction of mRNA and protein.J.Neurochem.，1992.58：P1140-1149)。

与此了解的情况相同，许多神经营养素具有神经保护性作用，刺激产生内源性防护以抵抗自由基引起的氧化性应激和损伤(Williams，L.R.，Oxidative stress，age-related neurodegeneration，and the potentialfor neurotrophic therapy，in Cerebrovasc.Brain Metab.Rev.1995，Raven Press，Ltd.：New York，NY.P.55-73.Mattson，M.P.，B.Cheng and V.L.Smith-Swintosky，Mechanisms of neurotophic factorprotection against calcium and free radical-mediated excitotoxic injury：implications for treating neurodegenerative disorders.Exp.Neuro1.，1993.124：P.89-95)。因为各种神经退行性疾病的病原学怀疑自由基具有细胞毒性作用，所以很自然得出结论本发明能够刺激HO的产生及其活性以产生保护性的抗氧化剂化合物，后者通过中和或隔离这些有毒性的氧化性化合物而防止氧化性自由基对退化细胞的伤害作用。

近来，许多本领域的普通技术人员认为，ALS、帕金森氏病和早老性疾呆病可能起因于自由基引起的细胞损伤的积累。本领域的普通技术人员中的一些实践者已经进行通过给药神经营养素来治疗ALS病的实验(DiStefano，P.S.，Neurotrophic factors in the treatmene of motorneuron disease and trauma.Exp.Neurol.，1993.124：P.56-59.Thoenen，H.，R.A.Hughes，and M.Sendtner，Trophic support of motorneurons：Physiological，pathophysiological，and therapeutic implications.Exp.Neurol.，1993.124：P.47-55)。因为本发明能够内源性地产生这些保护性化合物，所以它为这些和其它退行性细胞病变提供了有效的治疗手段。这种保护性能力对于神经元病变的治疗尤其重要，因为不同于大多数具有各种保护机制如高水平的谷胱甘肽的细胞，神经元缺乏这种抗氧化剂源。

在哺乳动物中，本发明能够刺激HO的产生及其活性的能力至少还带来一个直接的生理作用。当血红素被HO降解为胆红素和胆绿素时，也产生CO。因此，本发明能够刺激HO的产生及其活性的能力也赋予本发明刺激活体细胞产生CO的能力。已知CO是可溶性鸟苷酸环化酶的活化剂，它可通过cGMP依赖性机制使血管平滑肌松驰(Graser，T.，Y.P.Verdernikov，and D.S.Li，Study of the mechanism of carbonmonoxide induced endothelium-independent relaxation in porcine coronaryartery and vein.Biomed.Biochem.Acta，1990.49：P.293-296.Morita，T.，et al.，Smooth muscle cell-derived carbon monoxide is a regulator ofvascular cGMP.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995.92：P.1475-1479)。最近，本领域的其他人证实，通过抑制HO消除CO的降血压效应可导致哺乳动物血压升高(Johnson，R.A.，et al.，A heme oxygenaseproduct，presumably carbon monoxide，mediates a vasodepressorfunction in rats.Hypertension，1995.25：P.166-169)。因此，有理由推断，本发明能够刺激体内产生CO的能力，除了增加了抗氧化剂的保护作用外，还能降低哺乳动物的血压。本发明能够直接诱导体内产生天然存在的细胞化合物，后者能产生显著的生理效应，这些能力在本领域中从未预见到。

                      实施例14

            一氧化氮抑制剂对AIT-082的作用

一氧化氮是在一氧化氮合成酶(NOS)作用下产生的。有两种化学药品选择性地抑制NOS，它们是N-硝基-L-精氨酸甲基酯(L-NAME)和N-硝基-L-精氨酸(NOLA)。不同浓度的这些化学药品和AIT-082同时给药，然后采用实施例12的程序测定PC12细胞的神经突生长。L-NAME的结果列于表F，而NOLA的结果见表G。下面两个表所列的结果直接示于图5A和5B。

                           表F

                  L-NAME对神经突生长的影响

                      L-NAME的浓度(μM)

AIT-082    0             0.1           1.0           10.0

0          0.246±0.017  0.259±0.027  0.257±0.013  0.251±0.013

10μM      0.254±0.008  0.220±0.010  0.302±0.027  0.254±0.018

100μM     0.309±0.027  0.257±0.016  0.232±0.019  0.289±0.006

                          表G

                 NOLA对神经突生长的影响

                      NOLA浓度(μM)AIT-082    0             0.1           1.0           10.0

0         0.246±0.017  0.259±0.009  0.311±0.016  0.305±0.017

10μM     0.254±0.008  0.277±0.016  0.312±0.029  0.298±0.019

100μM    0.309±0.027  0.279±0.027  0.295±0.028  0.310±0.023

由表F和表G中的数据可见，NOS的这两种抑制剂均不能阻断AIT-082对神经突生长的作用。这些结果表明，NO不参与AIT-082的作用机制。

                    实施例15

        AIT-082对PC-12细胞cGMP水平的影响

为了证实CO依赖性鸟苷酰环化酶的修饰作用，加入AIT-082后测定PC12细胞的环状一磷酸鸟苷(cGMP)的水平。起初，PC-12细胞在低血清培养基(1.5％马血清和5％胎牛血清)中用40ng/ml的NGF先培养3天。将细胞种植在测定板上培养1个小时，所用培养基为含有40ng/mlNGF的低血清培养基。如图表所示，将培养基改变为低精氨酸(80μM)、无血清和NGF以及含罂粟碱(100μM)的培养基。在所示的时间添加试验化合物，用含有10,000dpm H³-cGMP的5％TCA终止反应。采用Maurice的放免测定法测定cGMP[Mol.Pharmacol.37：671-681，1990]。用粉末状木炭(5克)纯化TCA，然后用Whatman 1号滤纸过滤此混合物。此法可清除掉TCA中的污染物，否则污染物将干扰cGMP的放免测定(RIA)。

放免测定前将cGMP从cAMP和其它污染物中纯化出来是必要的，因为这些其它的物质能干扰测定。简要地说，使TCA溶液过Dowex柱子(50W-8X，200-400筛孔)，然后进行洗脱。将中性的氧化铝柱子置于每根Dowex柱子的下面。向每根Dowex柱子中加4ml 0.05M HCl，将cGMP从Dowex柱子中洗脱到中性的氧化铝柱子中。接着依次用2mlHCL、4ml水、最后用0.2M醋酸钠(pH6.2)洗脱该中性的氧化铝层析柱。收集cGMP用于RIA测定，洗脱时用1ml醋酸钠，洗脱回收率为50-65％。测定cGMP用Dupont RIA试剂盒。结果见图6所示。

如图6所示，加入AIT-082后增加PC12细胞中cGMP的产生，表明AIT-082是通过改变一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶的活性而发挥作用的。

                        实施例16

         AIT-082对神经营养素mRNA遗传表达的影响

为了证实AIT-082诱导天然存在的遗传编码分子神经营养素的体内遗传表达及其产生，和增强这些分子的活性，进行了下面的实验。通过对培养于AIT-082、NGF或其两者中的星形细胞的Northern印迹分析鉴定神经营养素mRNA的诱导。培养处理24小时后收集细胞并提取RNA。

更具体地说，从瑞士NIH小鼠的大脑皮层中分离星形细胞。简言之，将新生幼仔(0-24小时)去头处死。在无菌条件下取出大脑组织，然后置于含有20％热灭活马血清(Hyclone)的Dulbecco改良培养基(DMEM)(“完全培养基”)中。然后将新大脑皮层从大脑半球中割离下来并切成1立方毫米的小方块。

用机械方法分离星形细胞。将小方块以最高速旋涡振荡1分钟。细胞悬浮液先用75mm Nitex过滤，然后用10mm Nitex过滤。获得的细胞悬浮液在完全培养基中稀释，至最后的浓度为每10ml完全培养基中含有一个脑的量。将10ml的稀释细胞培养液加入每一个100mm的Falcon组织培养板(Fisher)上。3天后培养基再用10ml新鲜的完全培养基替换，以后用含有10％热灭活马血清的DMEM培养基(“生长培养基”)每星期替换两次。经过两星期的培养，星形细胞形成融合的单层细胞层。

为了提取RNA，需要用胰白酶处理星形细胞。然后，将星形细胞再铺在100mm的PORN包被的板上，细胞密度为每板(10ml生长培养基)10⁶个细胞。2小时后，向适当的培养板中加入10mM的PBS、Guo或GTP。用TRIzol试剂及其供应商提供的方法(GIBCO BRL/LifeTechnologies，Inc.)处理4小时和24小时后，对每次处理的1.5×10⁷个细胞提取RNA。为了做印迹分析，可按照Transfer and Immobilizationof Nucleic Acids and Proteins to S & S Solid Supports(S and S操作程序：Schleicher & Schuell，New Hampshire，USA)介绍的方法将总RNA结合在Hybond-N滤膜(Amersham/United States Biochemicals)上。用10-20mg总RNA对每个样品也进行了Northern印迹分析。将总RNA样品在含有甲酰胺的1％琼脂糖凝胶中电泳，然后按照S & S操作方法印迹到Hybond-N滤膜上。

印迹膜用P³²标记的cDNA(NGF，NT-3和BDNF探针)或寡核苷酸探针(FGF-2)在50℃中杂交过夜，杂交液为哌嗪-N，N′-双-[2-乙磺酸](PIPES)缓冲液(50mM PIPES，pH6.8；50mM NaH₂PO₄；0.1M NaCl；5％ SDS和1mM EDTA)。印迹膜用洗膜缓冲液(2×SSC、0.1％ SDS)在室温中洗2次，每次20分钟。然后再用洗膜缓冲液(0.1×SSC、0.1％SDS)于52℃洗2次，每次20分钟。1×SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠，pH7.0。湿润的印迹膜用Saran wrap膜包裹并用Hyperfilm-MP胶片(Amersham/USB)在放有增感屏的暗盒中进行放射性自显影。用分光光度计测定每个总RNA样品的浓度，对不同浓度的总RNA(0.25-4mg)进行印迹并用探针标记，保证感光片的线性感光强度，进行定量分析。采用MCID图像分析系统(St.Catherine′s，Ontario，Canada)进行定量分析。

为了获得探针，分离出在质粒pGEM.NGF(+)中的小鼠NGF基因的cDNA克隆及在质粒Bluescript中的NT-3和BDNF基因的cDNA克隆。分离后，采用随机引物DNA标记试剂盒(Boehringer MannheimBiochemica)及其方法用³²P-dCTP(ICN Biomedicals Canada，Ltd.)标记cDNA探针。

人工合成40聚体的反义寡核苷酸(MOBIX McMaster University)作为FGF-2的探针。它和小鼠FGF-2的mRNA上的编码序列的5′末端是互补的。使用多聚核苷酸激酶、One-Phor-All缓冲液和PharmaciaBiotech Inc.供应商介绍的方法，以及ATPg P³²(ICN BiomedicalsCanada，Ltd.)，标记该寡核苷酸的5′末端。

产生四种不同的神经营养因子的研究结果见下表H。

                            表H

         星形细胞神经营养素mRNAs的Northern印迹分析

神经营养素            NGF       AIT-082   AIT-082(100mM)

mRNA         对照     40ng/ml   100mM     +NGF(40ng/ml)

NGF            -        -         ++           +

FGF-2          +        -         ++           +

BDNF           +        +          +           +

NT-3           -        -         ++           +

产生可检测量的每种神经营养素的条件用“+”表示，“++”表示产生了至少两倍的可检测量。阴性的印迹用“-”表示。

这些结果表明AIT-082诱导数种神经营养因子(包括NGF)的mRNA表达。更为重要的是，这些资料清楚地证实，按照本发明的教导处理后，AIT-082选择性地可控制地诱导至少一种天然存在的遗传编码分子在哺乳动物体内的遗传表达。施用这种示例性的嘌呤衍生物选择性地诱导已鉴定的四种编码神经营养因子中的三种，NGF、NGF-2、和NT-3mRNA表达，但不能诱导编码BDNF mRNA的基因的活化或阻遏。这种选择性控制和本发明的化合物和方法给药的易操作性相偶合，有效地克服了现有技术的局限性。不是通过复杂的甚至可能是危险的技术直接给细胞施用这些分子化合物，本发明却能够通过传统的无侵害的给药途径处理哺乳动物患者，诱导被处理的细胞表达编码所需化合物的遗传物质，导致这些物质在体内直接传递和给药。遗传修饰是不必要的，虽然它在本发明中与修饰的基因或其它分子生物学技术结合起来还有潜在的用途。

在前文已经表明，在早老性疾呆症病人的海马中，基因表达程序的改变导致神经营养因子mRAN水平异常。许多动物和临床研究已经证实，施用单个神经营养素不足于治疗神经退行性疾病。因此，本发明的化合物能够刺激多种神经营养素mRNA在细胞内的产生，通过给病人直接有效地施用这些天然存在的遗传编码分子及诱导它们在体内的遗传表达，治疗各种神经退行性疾病的可能性大幅度提高。

前面的实施例表明，AIT-082单独刺激体外PC12细胞的神经突生长，增强神经生长因子(NGF)的作用。更进一步，正铁血红蛋白(它俘获并清除一氧化氮和一氧化碳)、甲烯蓝(它抑制鸟苷酰环化酶)和锌原卟啉IX(血红素加氧酶的抑制剂，该酶产生一氧化碳)均能降低AIT-082的神经生长作用。L-NAME和NOLA(NO产生的抑制剂)均不影响AIT-082的神经生长效应。此外，体外施用ALT-082后星形细胞内的这些因子的mRNA水平升高，从而证实了ALT-082刺激许多不同神经营养因子的产生。再者，如实施例2所述既然AIT-082口服是有活性的并且很快通过血脑屏障，那么作为NGF类似的试剂用于早老性疾呆症和其它神经退行性病症和细胞疾病的治疗就有显著的价值。

鉴于前述的结果，进行一些研究以证实使用AIT-082治疗典型的神经退行性病症的有效性。丧失记忆是早老性疾呆症的核心症状，其它许多神经病变也是如此。早老性疾呆症、健忘、衰老和猴子海马病变均有特殊的工作(working)(小插曲(episodic))记忆功能的损害。有关神经退行性病症的治疗，AIT-082能减轻记忆丧失的作用可用来证实本发明的化合物的功效。

                     实施例17

          不同品系小鼠的记忆钱留的比较

已经表明，成功者变换(win-shift)T-迷宫范例特异性地模拟啮齿类的工作记忆功能，是一种广泛接受的方法。啮齿类天生的行为是饥饿时争抢食物，因此，吃完安放的食物后不返回到原来的位置。这种模型的设计不能获得所有的大量的有关记忆的资料。低氧和局部缺血研究资料和选择性损害CA1海马细胞的程序均引起工作记忆功能的缺陷，而其它类型的记忆不受影响。这一点强烈地表示，记忆具有不同的类型，并且具有不同的解剖学位点和非常可能不同的神经生化输入。因此，虽然成功者变换模型不能阐明有关工作记忆功能的所有神经化学输入，但是该模型的确提供了一个有用的本领域已接受的技术工具，该工具可用于设计药理学实验，从而为记忆改善机制提供信息。

瑞士Webster 6月龄(青年成鼠)和11月龄(老龄鼠)雄鼠来源于国家衰老研究所(Natimal Institute On Aging)，饲养在单个的笼子里，22小时光照和22小时黑暗轮流进行，并保持连续供水。限制食物以便小鼠稳定在自由采食体重的80％。在一个星期内，每天给小鼠称重。成功者变换模型按照文献所述的方法进行，其中的T-迷宫试验是每次正确的试验后改变正确的应答反应内容。试验之间的间隔是变化的，以便确定受试小鼠能够记住与前一次的正确应答反应试验间的最长时间。这样就可以测定记忆残留的持续时间。得5分(每10个试验有5个反应正确，50％的正确)被认为是偶然的，也就是说，小鼠记不住哪一个盒子是它在前一次试验中选择正确的奖品。每次正确反应的试验后改变奖品目标盒。每只小鼠每天进行10个试验。如果小鼠建立了空间学习定向(仅为右侧)，那么每次试验它们都将返回到原来相同的目标位置，其正确应答反应率显著低于50％的正确率。记录离开起始合子的潜伏时间以测定其动机，记录跑动时间(从离开起始盒到到达目标盒的时间)以测定其运动成绩，记录正确反应次数以测定其记忆能力。

表I的资料显示了对青年成鼠不施用任何药物延长试验间隔的影响。

                          表I

         试验间隔长短在成功者变换范例中的作用⁽¹⁾

                     试验间隔(秒)

                 30     60        90     120       150瑞士Webster小鼠      7.5^*  7.5^*    5.0C57BL/6小鼠          7.0^*  7.4^*    7.0^*  7.8       5.6

(1)记分是每10次试验中正确应答反应的平均次数。试验前1小时施用生理盐水。

^*P＜0.05。参照显著性ANOVA方法进行了资料分析，用Dunnett检验比较了给药组和对照组。Arc Sign变换根据百分数资料进行。

从表I的数据可见，当试验间隔为30或60秒时，瑞士Webster小鼠能够记住成功者变换的策略。试验间隔延长至90秒、用生理盐水处理，其得分为5分(50％)的小鼠几乎没有(极少)。这些资料表明，试验间隔在60和90秒之间的小鼠其“记忆残留”消失。除了指明的外，对正常成年瑞士Webster小鼠以90秒试验间隔进行了所有药物的评估试验。C57BL/6小鼠的记忆残留持续时间为120秒。

                         实施例18

              AIT-082对记忆残留持续时间的影响

比较AIT-082和塔克林(THA)与毒扁豆碱(PHY)的活性，后两者是能增强动物记忆力的实验用抗胆碱酯酶试剂。对这些药物对运动活性的影响也进行了评估。在成功者变换记忆的范例中，评估了给药18天后AIT-082诱导忍耐力的能力。此外，测试了AIT-082在一个改进的T-迷宫辨别任务中改进学习的活性。

本实施例使用的药物是4-[[3-(1，6-二氢-6-氧-9-嘌呤-9-基)-1-氧丙基]氨基]苯甲酸(AIT-082)，一种典型的钾盐的盐酸塔克林(四氢氨基吖啶，THA，Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri)和毒扁豆碱(一种半硫酸盐)(PHY，Sigma，Chemical Co.，St.Louis，Missouri)。这些药物溶解在生理盐水中，每天新鲜制备。所有注射均按每10克体重给药0.1毫升药物进行。当测定药物的效应时，试验开始1小时前腹膜内(i.p.)注射AIT-082或THA。由于PHY的作用持续时间较短，因此在试验前30分注射PHY。对照小鼠用生理盐水(赋形剂)做相似的注射处理。

为了确定记忆残留的持续时间，对小鼠给药或生理盐水30分钟(PHY)或1小时(AIT-082或THA)后，再让它们进行一个单程预跑动，在两个目标盒中放上奶品奖品。在所示的试验间隔后，将受试小鼠放回到起始盒。进行第一个试验，此时奶品奖品只放与在前一个正确试验时它进入的那个盒子相反的另一个盒子中。对受试小鼠进行10次试验，并且只有在每次正确应答之后才改变奖品所放的位置。

为了确定对AIT-082的生物学效应的是否发生了耐受，因此在进行标准的成功者变换范例试验前，连续18天每天给药或生理盐水。

用与上面讨论的成功者变换模型中所用的T-迷宫一样的T-迷宫，训练受试小鼠。像成功者变换方法那样，给受试小鼠定向，然后让它们进行单程预跑动，奖品放在两个目标盒内。只允许受试小鼠吃掉所选择的目标盒中的奶奖品。在下一次跑动中，找到奖品即正确反应为找到与在预跑动中所选择的同一目标盒，两者没有变化。要求受试小鼠明白作为正确反应的目标盒没有变换。受试小鼠每天进行10次试验，一直继续到连续两天受试小鼠在10次试验中有8次正确的应答反应。记录达到这一成绩标准所需要的天数。受试小鼠达到了这一标准后，调换作为正确反应的目标盒。记录调换目标盒后达到标准所需的天数。

T-迷宫学习任务和成功者变换记忆测验的结果见下表J。

                     表J

          AIT-082，THA和PHY以90秒试

        验间隔对瑞士Webster小鼠的影响

试验类型(1)            对照	THA	AIT-082	PHY
				剂量(mg/kg)生理盐水	1.25	0.5     30.0	0.125
成功者变换记忆测验正确应答反应          4.6(正确反应/10次试验)潜伏时间(秒)          2.68跑动时间(秒)          1.95	7.1*8.22*3.65*	6.5*   8.2*1.95    2.032.20    1.95	6.52.65
				运动活性(2)           343	671*	323     378	N/T
T-迷宫学习(达到标准的天数)学习                  3.6调换后                4.2忍耐力                4.9(正确反应/10次试验)	N/T(3)N/TN/T	3.0     3.33.78    3.5N/T     7.6*	N/TN/TN/T

⁽¹⁾每组至少8只小鼠进行试验。

⁽²⁾每小时自发的运动情况。

⁽³⁾未试验。

^*表示P＜0.05。数据分析参照ANOVA显著性方法，对给药组和对照组进行Dunnett检验。根据百分数资料进行Arc Sign转换，将潜伏时间转换成相应的时间分数或速度分数。

如表J资料所示，AIT-082处理导致正确反应(记忆)的次数增多(与生理盐水对照组比)。虽然THA和PHY的影响范围相同，但是THA和PHY两者还使潜伏时间延长(延长离开起始盒的时间，证明了其活动能力的降低)，THA增强自发运动活性。AIT-082对学习或调换后的结果没有影响，对18天预处理后AIT-082的记忆增强效应没有产生耐受性。AIT-082只增强记忆功能而不影响学习、活动能力、表现成绩和运动活性。采用口服给药AIT-082也获得了相似的资料结果。

                    实施例19

        AIT-082剂量对记忆残留持续时间的影响

用瑞士Webster青年成鼠研究了AIT-082的剂量反应及其作用持续时间。结果用超过偶然正确反应的百分数表示，偶然正确是指50％的正确率。如图7所示，在剂量范围为0.5-60mg/kg时，AIT-082的活性增强瑞士Webster正常成年鼠的记忆力，但最佳作用的剂量为20-30mg/kg。进一步说，如图8所示，其作用的启动是迅速的(1小时，资料未示出)，施用单一剂量60mg/kg后其作用可维持至少7天。那些本领域的普通技术人员将认识到该药物作用时间的延长将大大降低给药的频率，从患者的意愿和花费考虑是非常有益的。

                         实施例20

       AIT-082对C57BL/6小鼠记忆残留持续时间的影响

前面的工作已经证实，在成功者变换范例中瑞士Webster正常成年鼠的记忆残留持续时间为60秒，它可以通过施用AIT-082得以延长。为了进一步证实本发明的方法和组合物的适用性和可操作性，换另一个记忆残留持续时间不同的小鼠品系并用前述的实验程序对之给药AIT-082。结果见下表K。

                         表K

              C57BL/6小鼠记忆残留持续时间

试验间隔(秒)	处理组
				对照(生理盐水)	AIT-082(30mg/kg)	毒扁豆碱(0.125mg/kg)
	306090120150180210240270	超过偶然正确反应次数◇/总数#3/5      70±11**3/5      70±16**4/5      70±6**4/5      78±16**1/5      56±102/7      58±12	超过偶然正确反应次数◇/总数#4/6      70±15**4/6      78±15**0/6      50±60/6      50±6				超过偶然正确反应次数◇/总数#3/6       65±16*1/6       53±9

#＝正确反应高于偶然性(60％)的小鼠数/受试小鼠总数

◇＝记分平均数±标准误

^**＝P＜0.01(与偶然性相比的t检验)

^*＝P＜0.05(与偶然性相比的t检验)

通常，在成功者变换争抢(食物)范例中，C57BL/6小鼠的记忆残留持续时间为120秒。如表K所示，腹膜内注射30mg/kg AIT-082可使记忆残留持续时间延长到超过210秒。虽然在这个模型中毒扁豆碱也可使记忆残留时间从120秒延长到180秒，但它不如AIT-082有效。

                        实施例21

            用AIT-082治疗年龄诱导的记忆紊乱

根据前面的结果，为了证实AIT-082不仅能促进健康动物的记忆而且能促进患有神经元紊乱的哺乳动物的记忆，进行了下面的研究。筛选了12月龄的瑞士Webster雄鼠用于成功者变换争抢测验试验。用不同的试验间隔时间长度测验受试小鼠，开始时用10秒，以后延长到30秒、60秒、90秒和120秒。未处理小鼠的结果如下表L所示。

                          表L

      年龄诱导的瑞士Webster小鼠的工作记忆功能缺陷记忆残留持续时间  受试小鼠数量  受试小鼠百分数(％)  记忆损伤程度

  不到10秒         6             25％              严重

  10秒             8             33                中等

  30秒             10            42                轻度

  总数             24            100

表L的结果表明，每只受试小鼠可按照工作记忆损伤的程度进行分类。损伤程度严重的小鼠在10秒钟时不能记住正确的应答反应，而损伤轻微的小鼠在30秒的间隔后也能记住正确的应答反应，但60秒的间隔则使其不能记住。中等程度损伤的小鼠能记住10秒间隔前的正确反应但不能记住30秒间隔前的正确反应。因此，成功者变换模型能够检测出年龄诱导的工作记忆损伤。正如那些本领域的普通的技术人员所认识到的，这种观察结果是重要的，因为它提供了用年龄与记忆损伤程度相匹配的受试小鼠进行潜在的治疗药剂评估的能力。

按照建立的基线，三组(每组为6只)受试小鼠用AIT-082(30mg/kg，试验前一小时施用)或毒扁豆碱(0.125mg/kg，试验前30分钟施用)处理，然后进行成功者变换争抢试验。结果见下表M和图9。

                         表M

              AIT-082和PHY对年龄诱导的瑞士

         Webster小鼠的记忆残留持续时间的影响

缺陷   试验间隔长度      对照       AIT-082     PHY

程度       (秒)       (生理盐水)    30mg/kg     0.125mg/kg

轻微       60             0/6       6/6^*       5/6

           90                       4/6         3/6

           120                      2/6         2/6

           150                      1/6         2/6

           180                      1/6         1/6

           210                      0/6         0/6

中等       30             0/6       4/6^*       1/6

           60                       2/6         0/6

           90                       0/6

严重       ＜10           0/6       0/6         0/6

数据表示：成绩显著高于偶然性的受试小鼠数量/受试小鼠总数；

*表示P＜0.05(t检验)。

6只受试小鼠严重缺陷，没有记忆残留，它们在10秒间隔时记不住其应执行的任务。用AIT-082或PHY处理后这些受试小鼠没有一只表现出记忆恢复。对于中度记忆缺陷、记忆残留持续时间为10秒的6只受试小鼠，AIT-082可使其中4只受试小鼠(占受试小鼠的67％)的记忆残留持续时间增加到30秒以上，可使其中2只(50％)增加到60秒以上。对于轻微记忆缺陷、记忆残留持续为30秒的6只受试小鼠，AIT-082能使其中2只的记忆残留持续时间增加到60秒，能使其中2只增加到90秒，能使另外的2只分别增加到120秒和180秒。在中度缺陷组，PHY仅能使其中一只小鼠的记忆残留持续时间从10秒增加到30秒。在轻微缺陷组，PHY能使其中1只小鼠的记忆残留持续时增加到60秒，使其中2只增加到90秒，使其中另两只至少增加到至少180秒。因此，对中度缺陷组AIT-082的作用比毒扁豆碱强，但对轻微缺陷组AIT-082的活性至少与毒扁豆碱的相同。

                        实施例22

           用AIT-082治疗年龄缺陷性记忆紊乱

挑选12月龄C57BL/6小鼠用于成功者变换争抢试验的测验。采用不同试验间隔测试受试小鼠。10秒间隔的表现成绩达不到标准(＞60％的正确)的受试小鼠划分为严重缺陷。10秒间隔的表现成绩能达到标准但30秒的不能达到标准的小鼠划分中度缺陷；30秒能达到但90秒不能达到标准的小鼠划分为轻微缺陷。如实施例21所示，每组受试小鼠或用AIT-082或用PHY处理以测定工作记忆残留被延长的程度。结果见下表N和图10所示。

                       表N

            AIT-082和PHY对年龄诱导缺陷的

         C57BL/6小鼠记忆残留持续时间的影响

缺陷   试验间隔时间    对照        AIT-082   PHY

程度       (秒)     (生理盐水)     30mg/kg   0.125mg/kg

轻微       60          0/6         4/4^*     7/8^*

           90                      2/4^*     3/8

           120                               2/8

           150                               2/8

           180                               2/8

           210                               0/8

中度       10          6/6         6/6^*     6/6

           30          0/6         4/6       1/6

           60                      1/6       0/6

           90                      0/6

严重       ＜10        0/6         0/6       0/6

数据表示为：表现显著高于偶然性的受试小鼠数量/受试小鼠总数；*表示P＜0.05

在轻微缺陷组，AIT-082使记忆残留持续时间从30秒延长到90秒，而在中度缺陷组它使持续时间从10秒延长到30秒。显然PHY使轻微组的记忆时间延长，但它对中度组没有作用。因此，AIT-082可使正常的瑞士Webster小鼠和C57BL/6小鼠以及年龄诱导工作记忆缺陷的瑞士Webster小鼠和C57BL/6小鼠的记忆功能得到恢复。具体地说，结果表明AIT-082可使轻度和中度记忆缺陷小鼠的记忆功能恢复。根据前面的其它实施例，有理由得出结论，AIT-082是通过改善一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶系统完成记忆恢复过程的。

                     实施例23

        应用AIT-082预防年龄缺陷性记忆紊乱

已经观察到，年龄诱导的记忆缺陷典型地在14月龄和16月龄小鼠中开始显现出来。因此，我们在饮用水中加入AIT-082(30mg/kg/天)对14月龄的小鼠开始处理。采用前述的成功者变换争抢试验每月测定小鼠的记忆力。结果如图11所示，表明施用AIT-082可延长记忆缺陷的发作和推迟其严重性的出现。

                      实施例24

       应用AIT-082预防酒精诱导的缺陷性记忆紊乱

为了证实本发明在不同类型的神经退行性紊乱方面的广泛的适用性，使用AIT-082阻遏酒精诱导的记忆缺陷的产生。用成功者变换模型再结合酒精(一种非特异性的记忆抑制物)和AIT-082处理，对6月龄C57BL/6小鼠进行了试验评价。在试验前1小时用生理盐水(对照)或AIT-582(30mg/kg，腹膜内注射)处理受试小鼠。试验前10分钟按0.5mg/kg的剂量腹膜注射酒精。该开创性试验研究结果见下表O。

                              表O

          酒精产生的记忆功能缺陷和AIT-082的矫正作用

                                  处理

                 对照          酒精         酒精+AIT-082正确的试验^1，2       8.08±0.29    6.5±26^*    7.89±0.54^※潜伏时间(秒)²       1.24±0.17    1.18±0.10   1.77±0.27跑动时间(秒)²       1.44±0.35    1.17±0.08   3.22±0.61^*※受试小鼠数量         13            13           9

¹表示每10次试验正确反应的平均数；

²表示平均值±标准误；

^*表示P＜0.05，与对照相比的t检验；

^※表示P＜0.05，与酒精处理相比的t检验。

表O的结果证实，有可能鉴定出阻断剂的剂量，所述阻断剂能够产生如成功者变换模型所测定出来的记忆缺陷。选用酒精作为非特异性阻断剂，它的作用可以通过在酒精处理前施用AIT-0.82矫正过来。因此，评价在特异性受体位点上有活性的其它更加特异性的阻断剂似乎是可行的。

除了AIT-082之外，相信其它嘌呤衍生物在中枢神经系统损伤或细胞死亡之后的神经元存活、突触发生和受伤后的功能恢复方面起作用。例如，鸟苷和AIT-082之间的相似性表明，AIT-082和鸟苷的作用机制也是相似的。也就是说，两者似乎都起着一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶的调节物的作用。更进一步说，已知细胞遭破坏后，向细胞外周渗出大量的嘌呤核苷和核苷酸。病灶性大脑损伤区的细胞外鸟苷浓度可达50mM，至少在7天的时间还可升高达5倍。因此，损伤后，星形细胞或神经胶质细胞和神经元被暴露于胞外高浓度的鸟苷。

因此，为了证实采用其它典型的嘌呤衍生物如鸟苷以调节一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶系统的有效性，进行了下面的研究。

                      实施例25

          星形细胞接触鸟苷和GTP后产生促因子

星形细胞对胞外鸟苷和三磷酸鸟苷(GTP)的反应似乎是增殖。GTP或鸟苷还可以刺激培养的新生小鼠大脑新皮层星形细胞释放促因子。分别以不同浓度的鸟苷和GTP与星形细胞一起温育，然后用ELISA法测定来自被处理细胞的在培养基中的神经营养素的免疫反应活性。

简言之，96孔Fatcon板(Fisher)用1mg/ml含0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.6)的绵羊单特异性抗-NGF IgG(亲和层析纯化的)进行包被。4℃温育过夜，然后加封闭溶液(含10％山羊血清的PBS)以除掉过量的抗体。室温温育4小时，然后用含有0.05％ Tween 20的PBS洗板3次。加入条件培养基和标准的2.5S HPLC纯化的NGF，继续温育过夜。第二天培养板用PBS-0.05％ Tween 20洗3次。加第二抗体，即兔特异性单抗NGF IgG，该单抗结合有β-半乳糖苷酶(Pierce-SPDP方法)(1∶500稀释)。培养板于4℃温浴过夜。次日用PBS-0.05％ Tween 20清洗培养板3次。每一孔中加入用0.1M磷酸盐缓冲液(1mM MgCl₂，pH7.2)配制的0.2mM 4-甲基伞形酰(lumbelliferyl)-β-半乳糖(MUG)。室温温育4小时后加入0.1M甘氨酸(pH10.3)终止反应。用Microfluor ELISA(激发用360nm，发射用450nm)读数仪测定样品。此法测定的灵敏度为每孔10pg的NGF。

用ELISA测定神经营养素NGF和NT-3两者的亲和力几乎相等，而BDNF的亲和力低100倍。如图12A和12B所示，鸟苷和GTP均增加培养基中NGF样物质的免疫反应活性。接受不同浓度鸟苷处理的星形细胞比接受相同量GTP处理的星形细胞的反应要强烈许多。

                      实施例26

        暴露于鸟苷的星形细胞产生神经营养因子

为了确实前面测定的结果，测定了用鸟苷处理的星形细胞中促因子FGF-2和NGF的mRNA水平。测定mRNA水平的方法和前述实施例16所用的方法相同。如图13A和13B所示，向星形细胞加入鸟苷后，在4小时和24小时后，NGF和GFG-2mRNA的水平可分别提高。当细胞外鸟苷的浓度明显高时，观察到脑损伤后或脑损伤恢复后神经营养素mRNA水平升高是重要的。由于大脑损伤后细胞暴露于高浓度鸟苷多天，所以这一数据表明鸟苷可能有助于一些功能的恢复。

如前面所讨论的，能够穿过血脑屏障和增加神经营养因子浓度(如本文测定的mRNA水平)的药剂对神经元存活和神经侧枝环路的形成具有很强的正向作用。然后，这种作用又可促进许多不同神经学疾病和神经系统损伤后的功能恢复。

                        实施例27

             神经元受鸟苷作用表现为神经突生长

除了神经胶质或星形细胞的变化外，病灶性大脑损伤还发生重要的神经元变化。存活神经元的轴突也可能出现神经突生长。因此，根据前面使用AIT-082所得的结果，进行了一些研究，以证实鸟苷也能改变一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶，刺激神经突生长。如前文所讨论的，因为PC12细胞是由同源的神经元样细胞构成，没有星形细胞污染，所以能容易地观察到本发明的示例性嘌呤衍生物对这些细胞神经突生长的直接影响。因此，在有或没有NGF的情况下，用鸟苷和腺苷处理PC12细胞，然后按实施例12的方法进行监测。嘌呤衍生物和NGF的作用结果示于图14A，而在不含NGF的情况下受嘌呤衍生物影响的结果示于图14B。对于每一种化合物，在有或没有NGF的情况下，图14C直接比较了这些嘌呤衍生物的作用结果。

如图14A所示，是鸟苷而不是腺苷48小时后能增强NGF诱导的PC12细胞的神经突生长。当鸟苷浓度为30mM和300mM时，这种增强作用比仅用NGF时的显著。腺苷在任何浓度下均不能增强NGF诱导的神经突生长。这点表明由嘌呤诱导的神经突生长并不是普遍的现象。5′-N-乙基氨甲酰腺嘌呤(NECA)(腺苷A₁和A₂的受体拮抗剂)也能增强神经突生长作用，但增强的程度不如鸟苷。

如果没有NGF，腺苷和鸟苷只能轻度地增加具有神经突的细胞的比例，见图14B。在浓度为30mM和300mM时，鸟苷的作用比相同浓度的腺苷的作用强。在NECA存在下，几乎没有对神经突生长的刺激作用。因为在有NGF存在的情况下，化合物的作用非常容易记分，而且试验结果变化较大，所以大多数有关促进神经突生长的数据都是在有NGF的情况下测定出来的。

数据的比较见图14A和14B，并在图14C中被着重比较了一下；根据比较的结果表明，鸟苷导致某些神经突的延伸，并且还协同反应增强NGF的促效应。虽然腺苷本身可略微促进神经突的生长，但它不能增强NGF的效应。有趣的是，如图14C所示，在有NGF或无NGF存在的情况下，NECA能(但腺苷不能)协同增强鸟苷的作用。腺苷不能但鸟苷能增强PC12细胞的NGF依赖性神经突生长作用的这一事实提示，它们与PC12细胞的相互作用是不同的。腺苷能与腺苷受体如A2嘌呤受体相互作用。这样能激活腺苷酸环化酶，提高细胞内的cAMP浓度。很明显，NECA也以这种方式起作用。但是，NECA和鸟苷是协同作用的。这一情况表明，鸟苷和NECA增强神经突生长所使用的信号途径是不同的。

                      实施例28

    各种不同嘌呤衍生物使神经突生长的速率是不同的

鉴于前面的结果，为了证实那些调节一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶和改变神经活性的化合物的专一性，测试了其它示例性的嘌呤衍生物。特别是，按照实施例12的方法，在有NGF存在的情况下，对不同浓度的嘌呤衍生物次黄苷、次黄嘌呤和黄嘌呤进行了测试以证实它们改变神经活性的能力。

如图15A所示，与只用NGF处理细胞相比，次黄苷只轻度地增强神经突的生长。次黄苷的有效浓度范围为0.3mM-300mM。图15A还显示，次黄苷对神经突生长的增强作用大大低于鸟苷的作用。

图15B和15C还表明，次黄嘌呤和黄嘌呤产生的结果分别和次黄苷对NGF诱导的神经突生长的作用结果是相似的。在图15C中，浓度为0.3-30mM(300mM对细胞有毒性作用)的黄嘌呤对NGF诱导的神经突生长仅有轻度增强作用。图15B显示，尽管其它浓度的次黄嘌呤没有显示出增强作用，但浓度为0.3mM和300mM时的增强作用最大(尽管不是过分的大)。即使观察到了次黄嘌呤对神经突生长的某些增强作用，但相对的增强作用仍不及鸟苷的作用。这些结果表明，次黄苷、黄嘌呤和次黄嘌呤不是调节一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶系统而使得神经活性改变，而是影响其它信号机制。

                          实施例29

                AIT-34对神经突生长的影响

为了证实与AIT-082相似的化合物对神经突生长的作用，将PC12细胞在生长过程中用AIT-34处理，然后按实施例12的方法进行监测，AIT-34的化学名称为3-(1，6-二氢-6-氧-9氢-嘌呤-9-基)-N-[3-(2-oxopyrrolidin-1-基)丙基]丙酰胺。如图16所示，各种不同浓度的AIT-034均不能增强用AIT-082处理后观察到的NGF诱导的神经突生长作用。

                         实施例30

               ATP和GTP对神经突生长的影响

为了进一步证实具有不同官能基团的嘌呤衍生物可以按照本发明的教导进行使用，所以使PC12细胞暴露于ATP和GTP，然后用实施例12的方法监测神经突的生长。

以与腺苷和鸟苷对PC12细胞的神经突生长作用非常相似的方式，它们相应的核苷酸对神经突生长有平行的作用效果。如图17所示，ATP既不能单独增强神经突生长作用，也不能增强用NGF处理了的细胞的神经突生长作用。与之形成鲜明的对比，30mM和300mM的GTP在有NGF的情况下的确增强神经突生长作用，而且它还能单独引起神经突生长。

然而，如图18所示，GTP似乎不能作为以被控制的方式释放鸟苷的来源。如果胞外酶能将GTP水解为二磷酸鸟苷(GDP)、单磷酸鸟苷(GMP)和最后得到鸟苷，那么可以推测GDP和GMP也能增强PC12细胞的神经突生长作用。可是，GDP和GMP既不能单独有效地作用，也不能与NGF一起促使神经突生长。经过比较，腺苷衍生的所有化合物均有抑制效应。

                     实施例31

        鸟苷而不是GTP增加PC12细胞的cGMP水平

根据前面的实施例，进行研究以分别证实GTP和鸟苷的神经生长机制。已经表明，鸟苷和GTP能增加血管平滑肌细胞内3′，5′-环-单磷酸鸟苷(cGMP)的水平。因为已经报道cGMP类似物刺激成神经细胞瘤细胞生出神经突。所以有可能鸟苷和GTP通过增加胞内cGMP水平发挥它们的作用。如图19所示，按照实施例15详述的方法进行放射免疫测定，可见鸟苷增加PC12细胞内的cGMP水平。这种增加正是一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节物所带来的。与之相反，发现GTP不能增加cGMP水平，这表明任何GTP刺激的神经突生长作用都是通过另外的机制实现的。

                      实施例32

            应用鸟苷酰环化酶的非选择性抑

           制剂降低鸟苷的促神经突生长作用

为了证实鸟苷改变一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶系统，进行的研究表明，细胞内cGMP水平的升高对于鸟苷增强PC12细胞NGF介导的神经生长作用是必要的。具体地讲，用不同浓度的鸟苷酰环化酶的三种抑制剂和鸟苷处理PC12细胞，然后按实施例12的方法测定神经突生长作用。

甲烯蓝(MB)抑制可溶性的鸟苷酰环化酶(SGC)，该酶合成cGMP。如图20A所示，向PC12细胞培养基中加入MB(0.1-5mM)，可以破坏鸟苷和NGF的协同作用。相反地，MB对NGF刺激的神经突生长没有影响。

LY83583同时抑制微粒(particulate)和SGC。图20B表明，LY83583抑制鸟苷引起的神经突生长反应，但对NGF引起的反应不影响。LY83583抑制鸟苷酰环化酶的机制不清楚，但它可能是间接的、与谷胱甘肽的代谢有关。因此，鸟苷酰环化酶的两种非选择性抑制剂分别以不同的作用机制使鸟苷的促神经生长作用减弱。

这些数据表明，鸟苷和NGF的作用机制不同。它们还表明，对于鸟苷发挥促神经生长作用来说，细胞内cGMP水平的升高是必要的，尽管可能不是充分的。

为了测试对于引起神经突生长来说cGMP升高是否是足够的，按照与用鸟苷处理相似的方法向细胞培养物中加入心房钠泵因子(ANF)。ANF是一种激素，已知的它的唯一的信号传导途径是激活微粒性的鸟苷酰环化酶。如图20C所示，ANF和鸟苷一样，它增强NGF刺激的PC12细胞的神经突生长作用，这表明增加细胞内cGMP的产生，并受到一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶或其它有助于刺激神经突生长的机制的诱导。

                       实施例33

      一氧化氮和一氧化碳促进鸟苷的神经突生长作用

如实施例31所示，由于鸟苷升高细胞内的cGMP水平，所以需要进行研究以证实鸟苷的信号是否是通过产生NO或CO而进行传导的。如果NO是如此作用，那么加入能释放NO的一氧化氮供体应能模仿鸟苷的作用。

在硝普钠(SNP)或硝酸钠(SN)(两者均能释放NO)的存在下，将PC12细胞培养48小时。SNP和SN均不能单独引起PC12细胞的神经突生长。然而，像鸟苷一样，SNP和SN两者均能以协同的方式增强NGF介导的神经突生长，图21显示了加入SN的结果。图22A和22B进一步证实了这种作用，如图所示，血红蛋白(Hb)和正铁血红蛋白(MB)均抑制NO供体的神经生长特性。这两种物质以高的亲和力清除NO和CO，防止它们行使信号递质的作用。

因此，如果NO和CO介导鸟苷的神经生长效应，那么在培养物中加入血红蛋白应降低这种作用效应。图23清楚地显示了这种作用，即Hb(0.1-1mM)抑制鸟苷的神经生长效应，但不抑制NGF的这种生长效应。这一点表明，鸟苷的神经生长作用需要NO或CO的合成，但NGF则不需要。

好几个事实表明，是CO而不是NO与鸟苷相互作用以改变神经活性。例如，如果NO介导鸟苷的作用，那么向PC12细胞中加入鸟苷应该刺激PC12细胞中的cNOS产生NO。然而，尚没有报道PC12细胞有cNOS，未处理(鸟苷和NGF首次处理)的PC12细胞不存在黄递酶，该酶与NOS共定位在一起。由于cNOS是钙/钙调蛋白敏感性的，所以加钙离子载体后它的活性将增高，从而导致cGMP水平的升高。向PC12细胞培养基中加入离子载体A23187则不能引起cGMP的增加。

                     实施例34

     一氧化碳而非一氧化氮介导鸟苷对神经突的生长作用

在前述实施例的结果的基础上，进行研究以证实本发明的嘌呤衍生物(包括鸟苷)调节一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶系统，从而改变神经活性。

如实施例6所述，一氧化碳通过使用抑制剂介导AIT-082的作用，相同的技术证实鸟苷也与一氧化碳依赖性系统相互作用。具体地讲如图24所示，cNOS的抑制剂L-硝基精氨酸甲基酯(L-NAME)不影响鸟苷增强NGF介导的神经突生长作用的能力。这些资料证实，cNOS不参与鸟苷对PC12细胞的神经生长作用介导的信号传导途径。

为了进一步证实CO而非NO介导鸟苷的神经生长效应，向生长的细胞中加入锌原卟啉IX(ZnPP)，它抑制血红素加氧酶，从而抑制CO的合成。如图25所示，ZnPP破坏鸟苷的神经生长效应，但不影响NGF的相应效应。相反，原卟啉的另一个有关的衍生物铜卟啉IX(CuPP)却不抑制血红素加氧酶。因此，图26显示了铜卟啉IX不降低鸟苷增强依赖于NGF的PC12细胞的神经突生长的能力。正如用AIT-082作用的结果，这些资料表明鸟苷增加CO的合成。反过来，CO激活SGC并增加细胞内的GMP水平，从而促进神经突生长。

                    实施例35

          不溶性Pranobex增强神经突的生长作用

为了进一步提供本发明的可操作性和范围的证据，使用次黄苷Pranobex进行了神经生长的研究。具体地讲，次黄苷Pranobex是次黄苷和DIP-PacBa以1∶3的摩尔比相混的混合物。向NGF处理的PC12细胞中加入不同浓度的这种化合物，然后按实施例12的方法进行监测。

如图27所示，次黄苷Pranobex显著地增强被处理细胞的神经突生长。图27中的曲线代表不同浓度的次黄苷Pranobex加饱和浓度的NGF的作用，而水平线表示NGF对照及其置信度水平。在图中选用的大多数浓度下，被处理细胞的值均高于对照水平线(基线)。

为了使细胞或神经功能恢复，可以按照本发明，改进细胞的尤其是神经的活性以治疗多种的细胞和神经退行性疾病。因此，本发明可用来治疗由任何原因包括氧化性应激、疾病、创伤、年龄和接触有害的物理或化学试剂而起的细胞和神经退化。相似地，本文揭示的方法和药剂可用于治疗神经学疾病，包括(但不局限于)早老性痴呆病及其相关的退行性紊乱，帕金森氏病及有关紊乱如黑色纹状体(Striatonigral)退化，脊脑萎缩，运动神经元病变或“运动系统病变”包括肌萎缩性单侧坏死、Werdnig-Hoffmann病、Wohlfart-Kugelberg-Welander综合症和遗传痉挛性双瘫，局部缺血(如在中风中)、缺氧症和低血糖(例如循环系统阻滞时间过长后)造成的神经元损伤，亨廷顿氏舞蹈病，大脑麻痹，多样性坏死，精神紊乱包括情绪紊乱、精神分裂症、癫痫和发作，各种原因引起的外周神经病变，学习能力丧失和记忆紊乱。还可以治疗由下列因素导致的神经元及其突起的损伤，所述因素包括物理因素如放射和电流或化学试剂如酒精、铝、重金属、工业毒素、天然毒素和麻醉药或毒品。这些方法还可以用于治疗大脑和脊髓损伤引起的神经元损伤、年龄有关的疾病如良性健忘症和神经元或神经元间联系伤失引起的感觉能力、运动能力、反射能力和识别能力的退化。对于患有任何一种前面提到的细胞或神经紊乱的患者，只需要给药本发明的至少一种、有效剂量的一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物都会诱导细胞发生变化，使得功能得到恢复。

特别是，按照本发明改变一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶系统将使神经元和神经胶质细胞(包括星形细胞)的神经活性发生改变。例如，使用本发明可以改变星形细胞的神经活性，合成各种神经营养因子和细胞素(包括成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、大脑衍生的神经营养因子(BDNF)和神经营养素-3(NT-3))。这些因子不仅能促进新细胞的发育，还能影响存活下来的神经元的神经突起的萌发。然后，新的突触可形成，功能获得某些恢复。这些神经营养因子还起着神经保护性作用。因此，诱导它们的产生也就能减轻神经的进一步损伤。

按照本发明许多嘌呤衍生物可以使用。然而，通过调节一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶系统而改变神经活性的能力并不是所有嘌呤或嘌呤衍生物的普通特性。例如，如下面的资料所示，次黄苷、腺苷、次黄嘌呤和黄嘌呤在改变神经活性方面相对地没有效果。不能改变神经活性的其它嘌呤衍生物包括3-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙酸、乙酯(AIT-0026)、3-(1，6-二氢-6-氧-9H-嘌呤-9-基)-N-{3-(2-oxopyrolidin-1-基)丙基]丙酰胺(AIT-0034)和Propentofylline。此外，虽然其它嘌呤和嘌呤衍生物如5′-N-乙基氨甲酰腺苷(NECA)表现为刺激神经突生长，但这种作用不是通过调节一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶机制实现的。因此，本发明范围由本文所述的和图表所示的能改变细胞或神经活性的嘌呤衍生物的功能反应活性来定义，当然，那些本领域的普通技术人员将认识到，本发明的化合物的功能等价异构体、类似物和同系物可被替换。

本领域的普通技术人员还将认识到本发明可以以其它特定的形式实施而不背离本发明的精神和核心特征。既然本发明前面的描述揭示的仅仅是它的示例性的实施方案，那么可以理解对本发明的各种变化仍归于本发明范围之内。因此，本发明不限于本文已经详细描述的那些具体的实施方案。而且，应参照所附的权利要求来理解本发明的范围和内容。

Claims (91)

1.长时间改变哺乳动物神经活性的药剂，所述的药剂包含有效量的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物。

2.权利要求1的药剂，其中所说的一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物选自鸟苷、4-[[3-(1，6-二氢-6-氧-9H-嘌呤-9-基(-1-氧丙基]氨基]苯甲酸和次黄苷Pranobex。

3.权利要求1的药剂，其中所说的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物的所说的有效量是指产生至少为1μM治疗浓度的量。

4.权利要求2的药剂，制成口服剂型对哺乳动物给药所述的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物。

5.权利要求2的药剂，制成注射剂型对哺乳动物注射给药至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物。

6.权利要求1的药剂，其中所说的改变哺乳动物神经活性是指产生神经营养素。

7.权利要求1的药剂，其中所说的改变哺乳动物神经活性是指产生多效性营养素。

8.权利要求1的药剂，其中所说的改变哺乳动物神经活性是指增强神经元的存活力。

9.权利要求1的药剂，其中所说的改变哺乳动物神经活性是指形成了神经侧枝回路。

10.权利要求1的药剂，其中所说的改变哺乳动物神经活性是指神经突的生长作用。

11.权利要求1的药剂，其中所说的改变哺乳动物神经活性是指突触形成。

12.权利要求1的药剂，其中所说的改变哺乳动物神经活性是指产生了环状嘌呤核苷酸。

13.权利要求1的药剂，其中所说的改变哺乳动物神经活性是指增强了的神经营养素和多效性营养素的活性。

14.权利要求13的药剂，其中所说的增强了的神经营养素和多效性营养素的活性是由下列神经营养因子或其中多种神经营养因子结合起来产生的，所述的神经营养因子包括神经生长因子、成纤维细胞生长因子、神经营养素-3、大脑衍生的神经营养因子、神经营养素4/5睫状体神经营养因子和S100B。

15.治疗哺乳动物神经学疾病的药剂，含有有效量的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物。

16.权利要求15的药剂，其中所说的一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物选自鸟苷、4-[[3-(1，6-二氢-6-氧-9H-嘌呤-9-基)-1-氧丙基]氨基]苯甲酸和次黄苷Pranobex。

17.权利要求15的药剂，其中所说的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物的所说的有效量是指产生至少为1μM治疗浓度的量。

18.权利要求16的药剂，制成口服剂型对所说的哺乳动物给药所说的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物。

19.权利要求16的药剂，制成注射剂型给哺乳动物注射给药所说的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物。

20.权利要求15的药剂，其中所说的哺乳动物神经学疾病是指早老性痴呆症及相关的退行性紊乱。

21.权利要求15的药剂，其中所说的哺乳动物神经学疾病是指老年性良性健忘症及其有关的紊乱。

22.权利要求15的药剂，其中所说的哺乳动物神经学疾病是指与衰老有关的神经元或神经元联系的丧失及有关的感觉、运动、反射和识别能力的退化。

23.权利要求15的药剂，其中所说的哺乳动物神经学疾病是指帕金森氏病及有关的紊乱。

24.权利要求15的药剂，其中所说的哺乳动物神经学疾病是指脊髓-小脑萎缩。

25.权利要求15的药剂，其中所说的哺乳动物神经学疾病是指运动神经元病变。

26.权利要求15的药剂，其中所说的哺乳动物神经学疾病是指物理因素造成的神经元及其突起的损伤。

27.权利要求15的药剂，其中所说的哺乳动物神经学疾病是指局部缺血、低氧或低血糖造成的神经元损伤。

28.权利要求15的药剂，其中所说的哺乳动物神经学疾病是指化学试剂造成的神经元损伤。

29.权利要求15的药剂，其中所说的哺乳动物神经学疾病是指大脑或脊髓创伤。

30.权利要求15的药剂，其中所说的哺乳动物神经学疾病是指癫痫或癫痫发作。

31.权利要求15的药剂，其中所说的哺乳动物神经学疾病是指外周神经病变。

32.权利要求15的药剂，其中所说的哺乳动物神经学疾病是指学习能力丧失。

33.权利要求15的药剂，其中所说的哺乳动物神经学疾病是指大脑麻痹。

34.权利要求15的药剂，其中所说的哺乳动物神经学疾病是指心理紊乱。

35.权利要求15的药剂，其中所说的哺乳动物神经学疾病是指记忆紊乱。

36.权利要求15的药剂，其中所说的哺乳动物神经学疾病是指亨廷顿氏舞蹈病。

37.诱导哺乳动物神经元膜电位长时间变化的药剂，所说的药剂含有有效量的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物。

38.权利要求37的药剂，其中所说的一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物选自鸟苷、4-[[3-[(1，6-二氢-6-氧-9H-嘌呤-9-基)-1-氧丙基]氨基]苯甲酸和次黄苷Pranobex。

39.权利要求37的药剂，其中所说的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物的所说的有效量是指产生至少为1μM治疗浓度的量。

40.选择性和控制性地诱导至少一种天然存在的遗传编码分子在哺乳动物体内遗传表达的药剂，所说的药剂包含有效量的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物。

41.权利要求40的药剂，其中所说的一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物选自鸟苷、4-[[3-(1，6-二氢-6-氧-9H-嘌呤-9-基)-1-氧丙基]氨基]苯甲酸和次黄苷Pranobex。

42.权利要求40的药剂，其中所说的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物的所说的有效量是指产生至少为1μM治疗浓度的量。

43.权利要求40的药剂，其中所说的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物是以口服途径对所说的哺乳动物给药。

44.权利要求40的药剂，其中所说的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物是以注射途径对所说的哺乳动物给药。

45.权利要求40的药剂，其中所说的至少一种天然存在的遗传编码分子是指神经营养因子。

46.权利要求45的药剂，其中所说的神经营养因子是指神经营养素。

47.权利要求45的药剂，其中所说的神经营养因子是指多效性营养素。

48.权利要求45的药剂，其中所说的神经营养因子选自神经生长因子、成纤维细胞生长因子、神经营养素-3、大脑衍生的神经营养因子、神经营养素-4/5睫状体神经营养因子、S100B及其组合物。

49.直接有效地对哺乳动物施用至少一种天然存在的遗传编码分子的药剂，它选择性地诱导所说的分子在所说的哺乳动物体内的遗传表达，所说的药剂包含对所说的哺乳动物给药有效量的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷环化酶调节的嘌呤衍生物的步骤。

50.权利要求49的药剂，其中所说的一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物选自鸟苷、4-[[3-(1，6-二氢-6-氧-9H-嘌呤-9-基)-1-氧丙基]氨基]苯甲酸和次黄苷Pranobex。

51.权利要求49的药剂，其中所说的有效量的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物的所说的有效量是指产生至少为1μM治疗浓度的量。

52.权利要求49的药剂，其中所说的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物以口服途径对所说的哺乳动物给药。

53.权利要求49的药剂，其中所说的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物以注射途径对所说的哺乳动物给药。

54.权利要求49的药剂，其中所说的至少一种天然存在的编码分子是神经营养因子。

55.权利要求54的药剂，其中所说的神经营养因子是神经营养素。

56.权利要求54的药剂，其中所说的神经营养因子是多效性营养素。

57.权利要求54的药剂，其中所说的神经营养因子选自神经生长因子、成纤维细胞生长因子、神经营养素-3、大脑衍生的神经营养因子、神经营养素-4/5睫状体神经营养因子、S100B及其组合物。

58.通过诱导体内产生至少一种天然存在的内源性抗氧化剂治疗由氧化性应激引起的与细胞性损伤有关的哺乳动物疾病的药剂，所说的药剂包含有效量的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物的给药步骤。

59.权利要求58的药剂，其中所说的一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的衍生物选自鸟苷、4-[[3-(1，6-二氢-6-氧-9H-嘌呤-9-基)-1-氧丙基]氨基]苯甲酸和次黄苷Pranobex。

60.权利要求58的药剂，其中所说的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物的所说的有效量是指产生至少为1μM治疗浓度的量。

61.权利要求59的药剂，制成口服剂型以口服给药所说的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物。

62.权利要求59的药剂，制成注射剂型以注射给药所说的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物。

63.权利要求58的药剂，其中所说的哺乳动物疾病是指早老性痴呆症及其有关的紊乱。

64.权利要求58的药剂，其中所说的哺乳动物疾病是指老年性良性健忘症及有关的紊乱。

65.权利要求58的药剂，其中所说的哺乳动物疾病是指与年龄有关的神经元或神经元联系的丧失及有关的感觉、运动、反射和识别能力的退化。

66.权利要求58的药剂，其中所说的哺乳动物疾病是指帕金森氏病及有关的紊乱。

67.权利要求58的药剂，其中所说的哺乳动物疾病是指脊髓-小脑萎缩。

68.权利要求58的药剂，其中所说的哺乳动物疾病是指运动神经病变或肌肉萎缩性单侧坏死。

69.权利要求58的药剂，其中所说的哺乳动物疾病是指物理因素引起的神经元及其突起的损伤。

70.权利要求58的药剂，其中所说的哺乳动物疾病是指由局部缺血、缺氧、低氧、或低血糖引起的神经元损伤。

71.权利要求58的药剂，其中所说的哺乳动物疾病是指由化学试剂导致的神经元损伤。

72.权利要求58的药剂，其中所说的哺乳动物疾病是指心脏、大脑或脊髓创伤。

73.权利要求58的药剂，其中所说的哺乳动物疾病是指癫痫或癫痫发作。

74.权利要求58的药剂，其中所说的哺乳动物疾病是指外周神经病变。

75.权利要求58的药剂，其中所说的哺乳动物疾病是指学习能力丧失。

76.权利要求58的药剂，其中所说的哺乳动物疾病是指大脑麻痹。

77.权利要求58的药剂，其中所说的哺乳动物疾病是指心理紊乱。

78.权利要求58的药剂，其中所说的哺乳动物疾病是指记忆紊乱。

79.权利要求58的药剂，其中所说的哺乳动物疾病是指亨廷氏顿舞蹈病。

80.权利要求58的药剂，其中所说的内源性抗氧化剂是指胆色素。

81.权利要求80的药剂，其中所说的胆色素选自胆绿素和胆红素。

82.权利要求80的药剂，其中所说的胆色素是由血红素加氧酶降解血红素产生的。

83.诱导哺乳动物体内产生血红素加氧酶的药剂，所说的药剂含有有效量的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物。

84.权利要求83的药剂，其中所说的一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物选自鸟苷、4-[[3-(1，6-二氢-6-氧-9H-嘌呤-9-基)-1-氧丙基]氨基]苯甲酸和次黄苷Pranobex。

85.权利83的药剂，其中所说的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物的所说的有效量是指产生至少为1μM治疗浓度的量。

86.权利要求84的药剂，制成口服剂型以口服给药所说的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰调节的嘌呤衍生物。

87.权利要求84的药剂，制成注射剂型以注射给药所说的至少一种一氧化碳依赖性鸟苷酰环化酶调节的嘌呤衍生物。

88.权利要求83的药剂，该药剂诱导在所说的血红素加氧酶作用下使所说的哺乳动物的血红素降解，产生内源性的胆色素和一氧化碳。

89.权利要求88的药剂，其中所说的药剂以所说的内源性产生的一氧化碳调节所说的哺乳动物的鸟苷酰环化酶。

90.权利要求88的药剂，其中所说的药剂以内源性产生的胆色素中和或隔离自由基。

91.权利要求88的药剂，其中所说的药剂在所说的内源性产生的一氧化碳作用下，诱导所说的哺乳动物的血压的降低。

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