CN101060841A - 拮抗腺苷a2a受体来改善成瘾行为的一种或多种构成 - Google Patents

Abstract

本发明提供了缓解/改善与长期消耗滥用物质或由此戒断有关的成瘾行为的一种或多种构成的方法。该方法典型地涉及以足够改善所述成瘾行为的一种或多种构成的量向所需的受试者施用腺苷A2A受体拮抗剂。

Description

拮抗腺苷A2A受体来改善成瘾行为的一种或多种构成

相关申请的交叉引用

本申请要求2004年6月17日提交的USSN 60/581,143的权利和优先权，为了所有目在此引用作为参考。

关于在联邦政府赞助的研究和开发之下完成的发明的权利的声明

由国家卫生学会(National Institutes of Hwalth grants))拨款AA10030和AA10039、加利福尼亚州对于乙醇和物质滥用的医学研究通过加州大学提供的资金、以及军方(the Department of the army)的拨款DAMD 17-01-1-0803，部分地支持了这项工作。在本发明中美国政府拥有某些权利。

发明领域

本发明涉及物质滥用领域。更具体地，本发明涉及发现，腺苷A2A受体拮抗剂可以抑制与长期消耗滥用物质或由此戒断有关的成瘾行为的一种或多种构成。

发明背景

乙醇和其他“成瘾物质”的滥用在美国和全世界仍然是主要的公共卫生难题。药物依赖性是极难回避的。不论这种依赖性是基于乙醇、安非他明、巴比妥酸盐、苯二氮、可卡因、烟碱、阿片样物质和苯西克定等等，这都是真实的。因此需要一种药物来降低或克服这种成瘾性和/或与这种成瘾性相关的一种或多种行为构成(例如，渴望)。

发明概述

本发明涉及发现，腺苷A2A受体拮抗剂可以抑制与长期消耗滥用物质或由此戒断有关的成瘾行为的一种或多种构成。该方法一般涉及以足够改善所述成瘾行为的一种或多种构成的量向有需要的受试者给药腺苷A2A受体拮抗剂。一般地，A2A受体拮抗剂不是花黄素(例如，咖啡因或咖啡因衍生物)。在一些实施方案中，腺苷A2A受体拮抗剂特异性地抑制A2A受体，并对其他腺苷受体(例如，A1受体)具有基本上降低的效应。

因而在一个实施方案中，本发明提供了缓解哺乳动物与滥用物质的长期消耗、停止这种长期消耗、和/或由此戒断有关的成瘾行为的一种或多种构成的方法。该方法一般涉及以足够改善该成瘾行为的一种或多种构成的量向表现出成瘾行为的一种或多种构成的哺乳动物给药腺苷A2A受体拮抗剂。在一些实施方案中，所述A2A受体拮抗剂不是咖啡因和/或不是咖啡因衍生物。在一些实施方案中，所述腺苷A2A受体拮抗剂包括，但不限于(-)-R，S)-甲氟喹、3，7-二甲基-1-炔丙基黄嘌呤(DMPX)、3-(3-羟丙基)-7-甲基-8-(间-甲氧基苯乙烯基)-1-炔丙基黄嘌呤(MX2)、3-(3-羟丙基)-8-(3-甲氧基苯乙烯基)-7-甲基-1-炔丙基黄嘌呤磷酸二钠盐(MSX-3)、7-甲基-8-苯乙烯基黄嘌呤衍生物、SCH 58261、KW-6002、氨基呋喃基三唑并-三嗪基氨基乙基苯酚(ZM 241385)和8-氯苯乙烯基咖啡因、KF17837、VR2006、istradefylline、VER-11135、VER-6409、VER 6440、VER 6489、VER 6623、VER 6947、VER 7130、VER7146、VER 7448、VER 7835、VER 8177、吡唑并[4，3-e]1，2，4-三唑并[1，5-c]嘧啶、5-氨基-咪唑并-[4，3-e]-1，2，4-三唑并[1，5-c]嘧啶等等。在一些实施方案中，所述拮抗剂基本上不拮抗腺苷A1A受体。在各种实施方案中，可以是乙醇、阿片制剂、大麻、烟碱、兴奋剂，等等。在各种实施方案中，滥用物质可以是吗啡、海洛因、大麻、印度大麻、可卡因、安非他明，等等。在一些实施方案中，所述滥用物质是乙醇。在各种实施方案中，所述成瘾行为的构成是滥用物质的长期自我施用，和/或对滥用物质的渴求，和/或寻求滥用物质行为的恢复。在一些实施方案中，所述哺乳动物是参与长期消耗滥用物质的哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是停止了滥用物质的长期消耗的哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是经历了一种或多种戒断症状的哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人，例如，没有患上帕金森氏病的人。在各种实施方案中，全身地给药所述拮抗剂(例如，通过如口服给药、鼻部给药、直肠给药、腹膜内注射、血管内注射、皮下注射、经皮给药、吸入给药，肌肉注射，等等)。一般地，所述拮抗剂被配制为单位剂量制剂，例如，定时释放制剂(time-release)。在一些实施方案中，所述方法还包括与腺苷A2A受体拮抗剂组合给药多巴胺D2受体拮抗剂或激动剂。D2受体拮抗剂或激动剂可以在A2A受体拮抗剂之前、期间、或之后给药。适合的D2受体拮抗剂包括，但不限于，布他拉莫、氯丙嗪、多潘立酮、氟非那嗪、氟哌啶醇、异芳基哌啶(heteroaryl piperidines)、甲氧氯普胺、奥氮平(olanzapine)、盐酸哌罗匹隆水合物、吩噻嗪、匹莫齐特、喹硫平、利哌利酮、舍吲哚(sertindole)、舒必利、齐拉西酮、佐替平、等等。

本发明还提供了组合物，用于缓解哺乳动物与滥用物质的长期消耗、停止这种长期消耗、或由此戒断有关的成瘾行为的一种或多种构成。所述组合物一般包含腺苷A2A受体拮抗剂；和多巴胺D2受体拮抗剂。适合的A2A受体拮抗剂和/或D2受体拮抗剂包括，但不限于如上所述的那些。

还提供了试剂盒，用于缓解哺乳动物与滥用物质的长期消耗、停止这种长期消耗、和/或由此戒断有关的成瘾行为的一种或多种构成。所述试剂盒一般包括含有一种或多种腺苷A2A受体拮抗剂的容器，其中所述一种或多种腺苷A2A受体拮抗剂的至少一种不是咖啡因和/或咖啡因衍生物；和教导在哺乳动物的物质滥用治疗中使用所述腺苷A2A受体拮抗剂的指导材料。适合的A2A受体拮抗剂包括，但不限于如上所述的那些。在各种实施方案中，所述拮抗剂基本上不拮抗腺苷A1A受体。在各种实施方案中，滥用物质包括但不限于乙醇、阿片制剂、大麻素、烟碱、兴奋剂、吗啡、海洛因、大麻、印度大麻、可卡因、安非他明，等等。所述成瘾行为的各种构成包括但不限于滥用物质的长期自我施用，对滥用物质的渴求，寻求滥用物质行为的恢复，等等。在一些实施方案中，所述拮抗剂被配制为通过下列途径来给药，例如口服给药、鼻部给药、直肠给药、腹膜内注射、血管内注射、皮下注射、经皮给药、吸入给药，肌肉注射，等等。在各种实施方案中，所述拮抗剂被配制为单位剂量制剂，例如，定时释放制剂。

还提供的是筛选药物的方法，所述药物抑制与长期消耗滥用物质有关的成瘾行为的一种或多种构成。所述方法一般地涉及提供一种或多种待测药物；并筛选所述待测药物抑制腺苷A2A受体表达或活性的能力，其中腺苷A2A受体表达或活性的抑制表明一种或多种待测药物是抑制与滥用物质的长期消耗或由此戒断有关的成瘾行为的一种或多种构成的候选药物。在一些实施方案中，所述筛选包括筛选待测药物与A2A受体结合的能力，以及，任选的进一步筛选待测药物抑制滥用物质的操作性自我施用(operantself-administration)的能力。在一些实施方案中，所述筛选包括进一步筛选所述待测药物抑制寻求滥用物质行为的恢复的能力。在一些实施方案中，滥用的物质选自由乙醇、阿片制剂、大麻素、烟碱和兴奋剂。在一些实施方案中，滥用的物质选自吗啡、海洛因、大麻、印度大麻、可卡因、安非他明等等。

本发明还提供了筛选药物的方法，所述药物抑制与滥用物质的长期消耗有关的成瘾行为的一种或多种构成，其中所述方法涉及提供一种或多种推定的腺苷A2A受体拮抗剂；以及筛选待测药物抑制与滥用物质的长期消耗或由此戒断有关的成瘾行为的一种或多种构成的能力。在一些实施方案中，所述筛选包括筛选所述待测药物抑制滥用物质的操作性自我施用的能力。在一些实施方案中，所述筛选包括进一步筛选所述待测药物抑制寻求滥用物质行为的恢复的能力。所述滥用的物质能包括，但不限于任何在此描述的滥用物质。

在一些情况下，在任何在此描述的实施方案中，预期的是可以利用腺苷A2A受体激动剂来代替A2A受体拮抗剂。

定义

术语“物质滥用”是指以某种方式使用物质，一般地性质上是化学物质，考虑到使用该物质的目的，所述方式一般被认为是不适当的。物质滥用在当今世界变得极其广泛。实际上，许多人认为物质滥用的问题达到了流行性的比例。随着物质滥用变得更为广泛，这种物质滥用的灾难性影响对于社会成员将变得越来越明显。由于对物质滥用的灾难性影响的不断增进的意识，社会开始寻求防止和治疗这种物质滥用的方法。

术语“滥用的物质”一般是指对精神起作用的并且诱导耐受性和/或成瘾性的物质。滥用的物质包括，但不限于兴奋剂(例如可卡因、安非他明)、阿片制剂(例如吗啡、海洛因)大麻素(例如大麻、印度大麻)、烟碱、乙醇、在多巴胺D2受体处介导激动剂活性的物质等等。滥用的物质包括但不限于成瘾性药物。对于成瘾性过度消耗来说，食物、糖类等等可以被认为是滥用的物质。

“多巴胺受体拮抗剂”是指降低或阻断由多巴胺受体介导的活性以应答多巴胺受体的同源配体(cognate ligand)的物质。因而，例如，多巴胺受体拮抗剂将降低或消除由多巴胺受体和相关的途径介导的多巴胺的活性。例如，通过阻断受体或通过改变受体构型或受体的活性，拮抗剂的活性能直接作用于受体。拮抗剂的活性还能位于介导受体活性的代谢途径中的其他位置(例如，一个或多个第二信使、激酶等等)。

“腺苷A2a受体拮抗剂”是指降低或阻断由腺苷A2a受体介导的活性以应答腺苷A2a受体的同源配体、的物质。例如，通过阻断受体或通过改变受体构型或受体的活性，拮抗剂的活性能直接作用于受体。拮抗剂的活性也可以位于介导受体活性的代谢途径中的其他位置(例如，一个或多个第二信使、激酶等等)。

当涉及使用腺苷A2A受体拮抗剂和多巴胺D2受体拮抗剂时，术语“组合(in conjunction with)”是指给药A2A拮抗剂和D2拮抗剂，从而在生物体上他们的生理活性中存在至少一些时间顺序的重叠(chronological overlap)。因而，A2A拮抗剂和D2拮抗剂能同时地和/或相继地给药。在相继给药中，只要当第二给药的试剂被给药或在生物体内变成有活性时，第一给药的药物已经对生物体发挥了一些生理学上的改变，在给药第二药物前甚至可以有相当的延迟(例如，数分钟或甚至数小时或数天)。

用语“基本上不拮抗受体”，例如当涉及药物对受体(例如，腺苷A1A受体)的影响时，是指例如应答同源的或其他“竞争性”配体，该药物不降低受体的活性超过50％，优选的活性不被降低超过20％、更优选的活性不被降低超过10％、最优选的活性不被降低超过5％或1％。

附图的简要说明

附图1A和1B显示了A2A拮抗剂DMPX对EtOH自我施用的双向效应。结果显示了在测试的不同DMPX剂量下，在操作性应答的30分钟FR3测试期(session)期间的杠杆压下次数的平均值±SEM(附图1A)，和g/kg EtOH消耗(附图1B)。在测试期之前20分钟腹膜内给药A2A拮抗剂。*与盐水处理相比有显著性差异(具有LSD的ANOVA由此(Post-hoc)的比较，p＜0.05，盐水组n＝18，对于1、3和10mg/kg组n＝10，对于5、7和20mg/kg组n＝8)。

附图2A和2B显示了A1拮抗剂DPCPX不影响EtOH的自我施用。结果表示在测试的不同DPCPX剂量下，在操作性应答的30分钟FR3测试期期间的杠杆压下次数的平均值±SEM(A)，和g/kg EtOH消耗(B)。在测试期前15分钟腹膜内给药A1拮抗剂(n＝7/组)。

附图3A和3B显示了D2拮抗剂依替必利剂量依赖性降低EtOH自我施用。结果表示在测试的不同依替必利剂量下，在操作性反应的30分钟FR3测试期期间的杠杆压下次数的平均值±SEM(附图3A)，和g/kg EtOH消耗(附图3B)。在测试期之前25分钟皮下给药D2拮抗剂。*、**与盐水处理相比具有显著性差异(具有LSD的ANOVA由此的比较，分别是p＜0.05和p＜0.01；n＝5/组)。

详细说明

本发明涉及发现，腺苷A2A受体的拮抗剂能抑制(降低或阻断)与物质(例如，滥用的物质)的成瘾性有关的行为的一种或多种构成。这是令人惊讶的发现，例如通过全身性给药腺苷A2A拮抗剂，抑制A2A受体阻断了滥用物质(例如，乙醇)的操作性自我施用。此外，证实了腺苷介导了寻求行为(操作性自我施用)的恢复，并且这也被全身给药的A2A拮抗剂阻断。恢复被认为是对乙醇或其他滥用物质的渴望或成瘾性的更直接的度量。此外，证实了直接向对海洛因上瘾的大鼠脑中的伏核(nucleus accumbens)给药A2A拮抗剂阻止了通过自我静脉注射海洛因自我施用的恢复。伏核是推测介导对成瘾药物的渴求的脑部区域。相比之下，腺苷A1受体拮抗剂似乎对此无效。

因而，本发明提供了缓解哺乳动物(例如，人)与滥用物质的长期消耗或由此戒断有关的成瘾行为的一种或多种构成的方法，其中所述方法涉及以足够改善成瘾行为的一种或多种构成(例如，渴望、寻求行为、焦虑、长期的自我施用等等)的量向所述哺乳动物给药一种或多种腺苷A2A受体拮抗剂。一般地，所述A2A受体拮抗剂不是咖啡因，并且在一些实施方案中，所述A2A受体拮抗剂不是黄嘌呤或修饰的或衍生的黄嘌呤。

不限于特定的理论，相信A2A受体拮抗剂在针对各种各样的成瘾材料的任一种的成瘾行为(成瘾性)的治疗中是有效的。这种材料包括，但不限于兴奋剂(例如可卡因、安非他明)、阿片制剂(例如吗啡、海洛因)大麻素(例如大麻、印度大麻)、烟碱、乙醇、在多巴胺D2受体介导激动剂活性的物质等等。在某些情况中，食物和/或糖可以被认为是滥用的物质(例如，在强迫性的进食障碍中)。

一般地，一种或多种腺苷A2A受体拮抗剂将被给药哺乳动物，更一般地，对人给药，以改善与例如滥用的物质或戒断这种物质的成瘾性有关的一种或多种行为。最一般地，给药腺苷A2A受体拮抗剂以降低自我施用和/或寻求行为和/或降低渴望和/或焦虑。在一些实施方案中，受试者是没有因帕金森氏综合征或其他神经疾病(除了与成瘾行为相关的那些)而被治疗的受试者。

I.腺苷A2A受体拮抗剂.

许多腺苷A2A受体拮抗剂是本领域技术人员已知的，在此处描述的方法中可以单独地使用或组合使用。这种拮抗剂包括，但不限于(-)-R，S)-甲氟喹(以Mefloquine^TM销售的外消旋混合物的活性对映异构体)、3，7-二甲基-1-炔丙基黄嘌呤(DMPX)、3-(3-羟丙基)-7-甲基-8-(间-甲氧基苯乙烯基)-1-炔丙基黄嘌呤(MX2)、3-(3-羟丙基)-8-(3-甲氧基苯乙烯基)-7-甲基-1-炔丙基黄嘌呤磷酸二钠盐(MSX-3，MSX-2的磷酸盐前体药物)、7-甲基-8-苯乙烯基黄嘌呤衍生物、SCH 58261、KW-6002、氨基呋喃基三唑并-三嗪基氨基乙基苯酚(ZM241385)和8-氯苯乙烯基咖啡因、KF17837、VR2006、istradefylline、VERNALIS药物例如VER 6489、VER 6623、VER 6947、VER 7130、VER 7146、VER 7448、VER 7835、VER 8177、VER-11135、VER-6409、VER 6440、VER 6489、VER 6623、VER 6947、VER 7130、VER 7146、VER 7448、VER 7835、VER8177、吡唑并[4，3-e]1，2，4-三唑并[1，5-c]嘧啶和5-氨基-咪唑并-[4，3-e]-1，2，4-三唑并[1，5-c]嘧啶等等。这些腺苷A2A受体拮抗剂是说明性的而不是限制性的。

在一些实施方案中，腺苷A2A受体拮抗剂是对腺苷A1受体具有基本上较少影响的拮抗剂。在一些实施方案中，与对腺苷A1受体相比，拮抗剂显示了对于A2A受体至少2倍、优选的至少5倍、更优选的至少10倍大的抑制活性。

II.使用多巴胺D2受体拮抗剂。

在一些实施方案中，本发明预期与一种或多种多巴胺D2受体拮抗剂组合使用腺苷A2A受体拮抗剂。

多巴胺受体拮抗剂是本领域技术人员公知的，包括但不限于，布他拉莫、氯丙嗪、多潘立酮、氟非那嗪、氟哌啶醇、异芳基哌啶、甲氧氯普胺、奥氮平、盐酸哌罗匹隆水合物、吩噻嗪、匹莫齐特、喹硫平、利哌利酮、舍吲哚、舒必利、齐拉西酮、佐替平等等。

在一些实施方案中，多巴胺D2受体拮抗剂和腺苷A2A受体拮抗剂被配制为单一“化合物(compound)”制剂。这可以通过许多已知方法的任一种来实现。例如，A2A受体拮抗剂和D2受体拮抗剂可以组合到单一可药用的赋形剂中。在另一种方法中，A2A受体拮抗剂和D2受体拮抗剂能被配制在微封装的独立的赋形剂中然后组合，或在单个药丸中形成独立层的独立赋形剂中配制，等等。

在一些实施方案中，多巴胺D2受体拮抗剂和腺苷A2A受体拮抗剂直接连接在一起，或通过“链接(tether)”或“连接(linker)”连接在一起，形成单一化合物物。不限于特定的理论，相信这种连接的拮抗剂提供了改善的特异性/选择性。

直接地或通过连接/链接来连接分子的许多化学作用对于本领域技术人员是公知的。被采用来连接D2受体拮抗剂和A2A受体拮抗剂以形成双功能拮抗剂的具体化学作用取决于所述拮抗剂的化学性质和期望的“配体内”(拮抗剂内)间距。各种D2受体和/或A2A受体拮抗剂一般含有各种官能团(例如，羧酸(COOH)、游离胺(-NH2)，等等)，可用于对于与连接上或其他拮抗剂上的适合的官能团进行反应以将拮抗剂结合在一起。

做为选择，拮抗剂能被衍生以接触或连上其他反应性官能团(functionalgroup)。衍生作用可以包括连上许多连接分子的任一种，例如可从PierceChemical Company、Rockford Illinois获得的那些。

如在此使用的，“连接”或“链接”是用于连接两个或多个配体(例如，受体拮抗剂)来形成双功能的或多功能的拮抗剂的分子。一般地选择连接以能够与包括双功能或多功能基团的所有拮抗剂形成共价键。适合的连接对于本领域技术人员是公知的，包括但不限于，直链或支链碳连接、杂环的碳连接、氨基酸、核酸、树枝状聚合物(dendrimers)、合成聚合物、肽连接、肽和核酸类似物、碳水化物、聚乙二醇等等。当一种或多种拮抗剂是多肽时，连接可以通过他们的侧基(例如，通过半胱氨酸的二硫键)，或通过末端氨基酸的α碳氨基或羧基连到构成氨基酸上。

在一些实施方案中，具有与第一D2受体拮抗剂上的基团有反应性的一个官能团和与A2A受体拮抗剂上的官能团有反应性的另一个基团的双功能连接，可用于形成双功能拮抗剂。做为选择，衍生作用可以涉及拮抗剂的化学处理，例如，用高碘酸对糖蛋白、碳水化物、或核酸等等的糖基的乙二醇裂解，来产生游离醛基。游离醛基能与连接上的游离胺或肼基团反应来将连接结合到拮抗剂上(参见，例如，美国专利No.4,671,958)。在多肽，例如抗体或抗体片段上产生游离巯基的方法是已知的(参见美国专利No.4,659,839)。

当D2受体拮抗剂和A2A受体拮抗剂都是肽时，双功能拮抗剂可以被化学合成，或重组表达为融合蛋白，所述融合蛋白包含直接相互连接或通过肽连接(peptide linker)连接的拮抗剂。

在一些实施方案中，不同长度的基于赖氨酸、谷氨酸和聚乙二醇(PEG)的连接被用于偶联(couple)拮抗剂。将分子缀合(conjugation)到PEG的化学作用是本领域技术人员公知的(参见，例如，Veronese(20010 Biomaterials，22：405-417；Zalipsky and Menon-Rudolph(1997)Pp.318-341 In：Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications.J.M.Harris and X.Zalipsky(eds).，Am.Chem.Soc.Washington，D.C；Delgado等人(1992)DrugCarrier Syst.，9：249-304；Pedley等人(1994)Br.J.Cancer，70：1126-113-0；Eyre and Farver(1991)Pp.377-390In：Textbook of Clinical Oncology，Holleb等人(eds)，Am.Cancer Soc，Atlanta GA；Lee等人(1999)Bioconjug.Chem.，10：973-981；Nucci等人(1991)Adv.Drug Deliv.，6：133-151；Francis等人(1996)J.Drug Targeting，3：321-340)。

在一些实施方案中，多巴胺D2受体拮抗剂与腺苷A2A受体拮抗剂的缀合能通过使用这样的连接剂，例如戊二醛、EDCI、对苯二酰氯、溴化氰等等，或通过还原性胺化来实现。在一些实施方案中，可以通过WO-A-9317713中公开的那种羟酸连接来连接拮抗剂。在一些实施方案中，能使用PEG连接(参见，例如，Lee等人(1999)Organic Lett.，1：179-181，for ghe preparationof various PEG tethered drugs)。

III.药物制剂.

如在此解释的，与滥用物质(例如，乙醇、阿片制剂、巴比妥酸盐，等等)的长期消耗有关的一种或多种症状能通过单独给药一种或多种腺苷A2A受体拮抗剂，或在一些实施方案中，还给药一种或多种多巴胺(D2)受体拮抗剂来缓解。类似地，与戒断滥用物质(例如，乙醇)的长期消耗有关的一种或多种症状可以通过单独给药一种或多种腺苷A2A受体拮抗剂，或在一些实施方案中，还给药一种或多种多巴胺(D2)受体拮抗剂来缓解。

腺苷A2A受体拮抗剂和/或A2A受体/D2受体拮抗剂组合能以许多形式配制，包括但不限于，游离酸的形式、盐的形式、作为水合物等。所有形式都处在本发明的范围内。可以形成碱式盐，仅仅是使用更方便的形式；实际上，盐形式的使用基本上相当于酸形式的使用。所述可用于制备盐的碱优选地包括当与游离酸结合时产生可药用的盐的那些，即所述盐的阴离子在该盐的药物剂量上对于动物生物体是无毒的，从而所述游离酸固有的有益性质不被归因于阳离子的副作用所降低。尽管酸化合物的可药用的盐是优选的，即使特定的盐本身仅期望作为中间产物，例如，当仅为纯化和鉴定的目的形成盐时，或当它被用作在通过离子交换方法制备可药用的盐时的中间物时，所有的盐作为游离酸形式的来源都是有用的。

这种物质能以各种形式给药给哺乳动物宿主，即，取决于所选给药途径，例如，口服或胃肠外地，他们可以以片剂、胶囊剂、锭剂、含锭(troches)、硬糖果(hard candies)、粉剂、喷雾剂、酏剂、糖浆剂、可注射的或滴眼液等等的形式，与各种可药用的惰性载体组合。在此，肠胃外给药包括通过以下途径给药：静脉内、肌肉内、皮下、眼内、滑膜内、经皮(包括经表皮(transdermal)、眼的、舌下的和口腔的)、局部的(包括眼的(ophthalmic)、皮肤的、眼睛(ocular)、直肠、通过吹入和气溶胶的鼻吸入)和直肠全身性的。口服给药是优选的。

活性化合物(例如腺苷A2A受体拮抗剂)能口服给药，例如，与惰性稀释剂或与可吸收的可食用载体一同，或者他们可被装入硬或软壳胶囊中，或者他们可被压成片，或者他们能被直接掺入膳食的食物中。对于口服治疗性给药，活性化合物可以与赋形剂混合，以可摄取的片剂、含片、含锭、胶囊剂、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片(wafer)等等的形式使用。这种组合物和制剂一般含有至少0.1％的活性化合物。当然，组合物和制剂的百分比可以变化，可以方便地在重量单位的约2％至约25％之间变化。在这种治疗上有用的组合物中活性化合物的数量是这样的，从而将获得适合的给药量。制备根据本发明优选的组合物或制剂，从而口服剂量单位形式含有约1和1000mg之间的活性化合物。

在一些实施方案中，片剂、含锭、丸剂、胶囊剂等也可以含有以下：粘合剂例如聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶、阿拉伯胶、蔗糖、玉米淀粉或明胶；赋形剂例如磷酸钙、柠檬酸钠和碳酸钙；崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、一些复合硅酸盐、藻酸等等；润滑剂例如十二烷基硫酸钠、滑石和硬脂酸镁；甜味剂例如蔗糖、乳糖或糖精；或调味剂例如薄荷、冬青油或樱桃调味剂(cherry flavoring)。类似类型的固体组合物也可以用作软和硬填充胶囊中的填充剂；优选的在这方面的材料还包括乳糖(lactose)或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇。当给药单位形式是胶囊剂时，除了上述类型的材料之外，它可以含有液体载体。各种其他材料可以作为包衣存在，或另外，修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可以包衣有虫胶、糖或两者。糖浆或酏剂可以含有活性化合物，含有蔗糖作为甜味剂，含有羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂，含有染料、调味剂例如樱桃或橙调味剂、乳化剂和/或悬浮剂、以及这样的稀释剂如水、乙醇、丙二醇、甘油和其各种相似组合。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何材料应当是药学上纯的，并在应用的量上是基本上无毒的。此外，活性化合物可以掺入持续释放制剂和配制中。

也可以胃肠外或腹膜内地给药活性化合物。对于肠胃外给药来说，可以采用在芝麻或花生油中或在水性丙二醇中的溶液，以及早先列举的相应的水溶性碱金属或碱土金属盐的无菌水溶液。这种水溶液应当被适合的缓冲，如有必要，首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。作为游离碱或可药用的盐的活性化合物的溶液可以在与表面活性剂例如羟丙基纤维素适当地混合的水中制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇和它们的混合物中，和在油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。这些特别的水溶液特别适合于静脉内的、肌肉内的、皮下的和腹膜内注射目的。在这一点上，所采用的无菌水介质都可以容易地通过本领域技术人员公知的标准技术来获得。

适合于可注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散体，以及用于无菌可注射溶液或分散体的即时制备的无菌粉末。在所有情况下，所述形式理想地是无菌的，并且是达到一定程度的流体，从而存在容易的可注射性。期望的是在制备和储存条件下是稳定的，并且必须是抗微生物例如细菌和真菌的污染作用的保存。载体可以是溶剂或分散介质，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等等)、其适合的混合物，和植物油。例如，通过使用包衣例如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需的粒子大小、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。可以通过各种抗菌和抗真菌剂，例如，对羟苯甲酸、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等，来达到对微生物作用的预防。在许多情况下，优选的是包括等渗试剂，例如糖类或氯化钠。通过使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长的吸收。

通过将活性化合物以所需的数量掺入到具有各种以上列举的其他成分的合适溶剂中，根据需要，继之以过滤灭菌，来制备无菌可注射溶液。一般地，通过将灭菌的活性成分掺入到含有碱性分散介质以及来自以上列举那些的其他所需成分的无菌载体中，来制备分散体。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末来说，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，其产生活性成分加上来自其早先无菌过滤溶液的任何其他期望成分的粉剂。

对于局部给药来说，可以在适合于向眼部滴液式给药的容器中制备稀释无菌水性溶液(通常浓度约0.1％至5％)，其他类似于上述的胃肠外给药溶液。本发明的治疗化合物可以单独地或与可药用的载体组合给药于哺乳动物。如上所述，根据化合物的溶解性和化学性质、选择的给药途径和标准药物实践来确定活性成分和载体的相对比例。最适合于预防或治疗的当前治疗药物的剂量将根据给药形式、所选的具体化合物和治疗的具体患者的生理特征而变化。一般地，首先使用小剂量，如有必要，少量增加地提高直到达到在这种情况下的最佳效果。口服给药需要更高的剂量。口服或胃肠外地、或作为滴眼液局部给药化合物。由医师使用本领域已知的方法可以容易地确定剂量，作为起始点的使用剂量一般根据动物研究确定。

在一些实施方案中，以标准治疗剂量、更优选的以标准的治疗剂量、尤其优选的以大约阈值剂量、最优选的以阈值下的剂量，来给药多巴胺受体拮抗剂和/或多巴胺受体拮抗剂，其中阈值剂量或阈值下的剂量是对于各个单独给药的拮抗剂的阈值或阈值下剂量。在一些特别优选的实施方案中，以低于已知产生一种或多种有害副作用的剂量的剂量给药腺苷A2A受体拮抗剂。

IV试剂盒

本发明还预期用于实践本发明的方法的试剂盒。这种试剂盒一般包括容器，所述容器中含有在此描述的一种或多种腺苷A2A受体拮抗剂。所述试剂盒一般另外包括指导材料，其教导使用这种拮抗剂来抑制与滥用物质的消耗有关的成瘾行为的一种或多种构成。所述指导材料可以教导优选的剂量、给药的模式、conterindications，等等。

虽然所述指导材料一般地包括手写的或印刷的材料，它们并不局限于此。能够存储这种说明和将它们传达到终端用户的任何介质都是本发明预期的。这种媒介包括、但不限于电子存储媒介(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学媒介(例如，CD ROM)等等。这种媒介可以包括提供这种指导材料的因特网站点地址。

V.筛选和/或预筛选缓解对滥用物质的成瘾性或由此戒断的一种或多种行为构成的药物(agent)

如上所指出，在一个方面，本发明涉及发现，腺苷A2A受体拮抗剂可以抑制与滥用物质的长期消耗或由此戒断有关的成瘾行为的一种或多种构成。因而鉴定推定的腺苷A2A受体抑制剂实际上鉴定了抑制与滥用物质的长期消耗或戒断有关的成瘾行为的一种或多种构成的候选药物。

在一些实施方案中，所述筛选方法涉及筛选待测药物(例如，推定腺苷A2A受体拮抗剂)抑制A2A受体的表达和/或活性、和/或抑制成瘾行为的一种或多种构成(例如，自我施用、渴望、寻求等等)的能力。

因而，在一些实施方案中，本发明的筛选方法能涉及用待测药物接触哺乳动物测试细胞；并检测腺苷A2A受体或A2A受体信号途径的其他元件(例如，β/γ二聚体)的表达或活性，其中，例如与对照相比，在测试细胞中差异的A2A受体表达或活性表明所述待测药物是抑制成瘾行为的一种或多种构成的候选物。

基因产物的转录(即mRNA的转录)方面、和/或基因产物的翻译(即，蛋白质的翻译)方面、和/或翻译后修饰(例如蛋白质折叠、糖基化，等等)的变化，能改变基因的表达水平。因而本发明的优选的分析包括分析转录的mRNA(或来自编码A2A受体或A2A受体信号途径的其他元件的核酸的其他核酸)的水平、翻译的蛋白质的水平、翻译的蛋白质的活性等等。这些方法的实施例如下所述。这些实施例是说明性的而不是限制性的。

A)基于核酸的分析

1)目标分子

A2A受体或A2A受体信号途径的其他元件(component)的表达水平的变化可以通过测量mRNA和/或来自编码A2A受体或途径元件的mRNA的核酸(例如，逆转录的cDNA，等等)来检测。为了测量表达水平，可取的是提供用于这种分析的核酸样品。在优选的实施方案中，所述核酸存在于生物样品中或来源于生物样品。如在此使用的术语“生物样品”是指从生物体获得的、或从生物体或细胞或组织培养物的部分(例如，细胞)获得的样品。

在某些优选的实施方案中，所述核酸(例如，来自mRNA的mRNA核酸)是根据本领域技术人员公知的许多方法的任一种从样品分离的。分离mRNA的方法是本领域技术人员公知的。例如，在Tijssen ed.，(1993)Chapter 3 ofLaboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology：HybridizationWith Nucleic Acid Probes，Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation，Elsevier，N.Y.and Tijssen ed中详细描述了核酸的分离和纯化方法。

在优选的实施方案中，使用例如酸胍盐(acid guanidinium)-苯酚-氯仿提取法从给定的样品分离“总”核酸，通过oligo dT柱层析或通过使用(dT)n磁性珠(参见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nded.)，VoIs.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)，或Current Protocols inMolecular Biology，F.Ausubel等人，ed.Greene Publishing andWiley-Interscience，New York(1987))分离polyA+mRNA。

经常地，可取的是在分析表达水平之前扩增核酸样品。扩增核酸的方法是本领域技术人员公知的，包括但不限于，聚合酶链反应(PCR，参见，Innis，等人，(1990)PCR Protocols.A guide to Methods and Application.AcademicPress，Inc.San Diego)、连接酶链反应(LCR)(参见Wu andWallace(1989)Genomics 4：560，Landegren等人(1988)Science 241：1077，和Barringer等人(1990)Gene 89：117，转录扩增(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA 86：1173)、自主序列复制(Guatelli等人(1990)Proc.Nat.Acad.Sci USA 87：1874)、点PCR和连接物PCR，等等)。

在特别优选的实施方案中，其中希望定量样品中A2A受体或A2A受体信号途径的其他元件的转录水平(以及由此的表达)，所述核酸样品是这样一种样品，其中A2A受体或A2A受体信号途径的其他元件的mRNA转录产物的浓度、或者来自A2A受体或A2A受体信号途径的其他元件的mRNA转录产物的核酸的浓度，与该基因的转录水平(由此的表达水平)成比例。类似地，优选的是杂交信号强度与杂交的核酸的数量成比例。虽然优选的是比例性是相对严格的(例如，转录速率的翻倍导致样品核酸库中mRNA转录产物的翻倍和杂交信号中的翻倍)，技术人员将理解，该比例性能更为松散或甚至是非线性的。因而，例如，其中目标mRNA浓度的5倍差异导致杂交强度中3到6倍的差异的分析，对于大多数应用是足够的。

当需要更精确的定量时，可以进行合适的对照来校正在此处描述的样品制备和杂交中引入的变异。此外，“标准”目标核酸(target nucleic acid)(例如，mRNA)的连续稀释可以用于根据本领域技术人员公知的方法制备标准曲线。当然，当仅期望检测样品中存在或不存在转录产物、或者核酸浓度中大的差异时，不需要精细的对照或校准。

在最简单的实施方案中，样品包含编码A2A受体或A2A受体信号途径的其他元件的核酸，总mRNA或总cDNA分离自和/或另外来源于生物样品。如上所指出，所述核酸可以根据本领域技术人员公知的许多方法的任一种从样品中分离。

2)基于杂交的分析

使用编码A2A受体或A2A受体信号途径的其他元件的已知核酸序列，使用核酸杂交技术(参见，例如Sambrook等人supra)能常规地实现这些核酸的转录产物的检测和/或定量。例如，评估逆转录cDNA的存在、缺乏或定量的一种方法包括“Southern印迹”。在Southern印迹中，一般被片段化并在电泳凝胶上分离的DNA(例如，逆转录的A2A受体mRNA)与特异于该核酸的探针杂交。比较“测试”探针和“对照”探针(例如，“持家”基因的探针)的杂交信号的强度，提供了对目标核酸的相对表达水平的估计。

做为选择，可以用Northern印迹直接定量mRNA。简言之，使用例如酸胍盐-苯酚-氯仿提取法从给定的细胞样品分离mRNA。然后对mRNA电泳来分离mRNA片段，将mRNA从凝胶转移到硝化纤维膜上。和Southern印迹一样，使用标记的探针来鉴定和/或定量目标mRNA。合适的对照(例如，针对持家基因的探针)提供了评估相对表达水平的参考。

测定A2A受体或A2A受体信号途径的其他元件表达水平的可选择方法是原位杂交。原位杂交分析是公知的(例如，Angerer(1987)Meth.Enzymol 152：649)。一般地，原位杂交包括以下主要步骤：(1)固定要分析的组织或生物结构；(2)对生物结构的预杂交处理以增加靶DNA的可接近性，并降低非特异性结合；(3)核酸的混合物与生物结构或组织中的核酸杂交；(4)杂交后的洗涤，以除去杂交中未结合的核酸片段；和(5)检测杂交的核酸片段。取决于具体的应用，在这些步骤中的每一步中使用的试剂和使用的条件有不同。

在一些应用中，必须阻断重复序列的杂交能力。因而，在一些实施方案中，使用tRNA、人基因组DNA、或Cot-1 DNA来阻断非特异性杂交。

3)基于扩增的分析

在另一个实施方案中，基于扩增的分析能用于测量A2A受体或A2A受体信号途径的其他元件(转录)的水平。在这种基于扩增的分析中，目标核酸序列(即，编码A2A受体或A2A受体信号途径的其他元件的核酸)充当扩增反应(例如，聚合酶链式反应(PCR)或逆转录PCR(RT-PCR))中的模板。在定量的扩增中，扩增产物的数量与初始样品中模板(例如，编码A2A受体的mRNA)的数量成比例。与适合的(例如，未与待测药物接触的健康组织或细胞)对照比较提供了对转录产物水平的测量。

“定量”扩增的方法是本领域技术人员公知的。例如，定量PCR包括使用相同的引物同时地共同扩增已知量的对照序列。这提供了可用来校准PCR反应的内部标准。在Innis等人(1990)PCR Protocols，A Guide toMethods and Applications，Academic Press，Inc.N.Y.)中提供了定量PCR的详细方案。例如，一种方法包括使用与用于扩增目标的引物相同的引物，同时地共同扩增已知量的对照序列。这提供了可用来校准PCR反应的内部标准。

一个优选的内部标准是合成的AW106 cRNA。根据本领域技术人员已知的标准技术将AW106 cRNA与从样品分离的RNA合并。然后使用逆转录酶将RNA逆转录来提供拷贝DNA。然后使用标记的引物扩增cDNA序列(例如，通过PCR)。一般地通过电泳，分离扩增的产物，并测定标记的核酸的量(与扩增的产物的量成比例)。然后与已知的AW106 RNA标准产生的信号比较，计算样品中mRNA的量。在PCR Protocols，A Guide to Methods andApplications，Innis等人(1990)Academic Press，Inc.N.Y.中提供了定量PCR的详细方案。

4)杂交形式和杂交条件的优化

a)基于阵列的杂交形式

在一个实施方案中，可以在基于阵列的杂交形式中使用本发明的方法。阵列是附着于一种或多种表面(例如，固体、膜或凝胶)的多种不同的“探针”或“目标”核酸(或其他化合物)。在优选的实施方案中，许多核酸(或其他部分)附着于单个连续表面或多个相互并列的表面。

在阵列形式中，能基本上“并行地”进行许多不同的杂交反应。这提供了在单个“实验”中快速的、基本上同时的、多个杂交的评估。以基于阵列的形式进行杂交反应的方法是本领域技术人员公知的(参见，例如，Pastinen(1997)Genome Res.7：606-614；Jackson(1996)Nature Biotechnology14：1685；Chee(1995)Science 274：610；WO 96/17958，Pinkel等人(1998)Nature Genetics 20：207-211)。

阵列、特别是核酸阵列可以根据本领域技术人员公知的各种方法来制备。例如，在简单的实施方案中，“低密度”阵列能简单地通过将不同的核酸点样(例如，手动使用吸移管)到固相基质(例如，玻璃表面、膜等等)的不同位置来产生。

这种简单的点样方法已经被自动化来产生高密度点样的阵列(参见，例如，美国专利No：5,807,522)。这个专利描述了使用自动化系统，其将微细管轻打到表面上来附着小体积的生物样品。重复这个过程来产生高密度阵列。

也可以使用寡核苷酸合成技术来产生阵列。因而，例如，美国专利No.5,143,854和PCT专利公开Nos.WO 90/15070和92/10092教导了高密度寡核苷酸阵列的光指导的组合合成(light-directed combinatorial synthesis)的使用。在美国专利5,744,305、5,800,992和5,445,934中也描述了高密度阵列的合成。

b)其他杂交形式.

如上所指出，各种核酸杂交形式是本领域技术人员已知的。例如，常见的形式包括夹心分析和竞争或置换分析。在Hames和Higgins(1985)Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press；Galland Pardue(1969)Proc.Natl.Acad.Sci USA 63：378-383；和John等人(1969)Nature 223：582-587中一般地描述了这种分析形式。

夹心分析是用于检测或分离核酸序列的商业上有用的杂交分析。这种分析使用共价固定到固相基质上的“捕获”核酸和溶液中标记的“信号”核酸。样品将提供目标核酸。“捕获”核酸和“信号”核酸探针与目标核酸杂交，形成“夹心”杂交复合物。为达到最有效，信号核酸不应与捕获核酸杂交。

一般地，标记的信号核酸被用于检测杂交。互补核酸或信号核酸可以用在此描述的一般用于检测杂交多核苷酸存在的几种方法的任一种来标记。

通过使用增加要检测的目标核酸的核酸扩增系统，可以增强杂交分析的敏感性。这种系统的实例包括聚合酶链式反应(PCR)系统和连接酶链式反应(LCR)系统。本领域中近来描述的其他方法是基于核酸序列的扩增(NASBAO，Cangene，Mississauga，Ontario)和Q Beta复制酶系统。

c)杂交条件的优化

核酸杂交仅仅涉及在探针和它的互补目标可以通过互补碱基配对形成稳定的杂交双链体的情况下，提供变性的探针和目标核酸。然后洗去不形成杂交双链体的核酸，留下杂交核酸来检测，一般通过检测连接的可检测标记来检测。一般认为，通过提高温度或降低含核酸的缓冲液的盐浓度、或添加化学试剂、或提高pH值，使核酸变性。在低严格条件(例如，低温和/或高盐和/或高目标浓度)下，将形成杂交双链体(例如，DNA:DNA、RNA:RNA或RNA:DNA)，即使在退火的序列不完美地互补的情况下。因而，在较低的严格度下，杂交的特异性降低了。反之，在较高的严格度(例如，更高的温度或更低的盐度)下，成功的杂交要求较少的错配。

本领域技术人员将理解，可以选择杂交条件来提供任何程度的严格度。在优选的实施方案中，在低严格度下进行杂交以确保杂交，然后随后的洗涤在较高的严格度下进行以消除错配的杂交双链体。可以在不断提高的严格度下(例如，在37℃到70℃降低到低至0.25×SSPE)进行连续洗涤直到获得期望的杂交特异性水平。也可以通过添加试剂例如甲酰胺来提高严格度。通过比较与测试探针的杂交和与各种能存在的对照的杂交，可以评估杂交特异性。

一般地，在杂交特异性(严格度)和信号强度之间存在权衡。因而，在优选的实施方案中，在最高的严格度下进行洗涤，其产生一致的结果并提供比背景强度大大约10％的信号强度。因而，在优选的实施方案中，杂交的阵列可以在不断提高严格度的溶液中洗涤，在每个洗涤之间读取。对由此产生的数据集的分析将揭示洗涤严格度，在所述洗涤严格度上，杂交模式没有可测量的改变并提供了特定目标探针(probes of interest)的足够的信号。

在优选的实施方案中，通过在杂交期间使用封闭试剂(例如，tRNA、精子DNA、cot-1 DNA，等等)减少非特异性结合来降低背景信号。在杂交中使用封闭试剂是本领域技术人员公知的(参见，例如，P.Tijssen，同上中的第8章)。

优化杂交条件的方法是本领域技术人员公知的(参见，例如，Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol.24：Hybridization With Nucleic Acid Probes，Elsevier，N.Y.)。

最优条件还是标记(例如，荧光)的敏感性、检测不同组合的底物类型、荧光染料、激发和发射带、斑点大小等等的函数。能使用低荧光背景表面(参见，例如，Chu(1992)Electrophoresis 13：105-114)。在候选表面上检测各种直径的样点(“目标元件(target elements)”)的敏感性可以通过例如点样系列稀释的荧光性末端标记的DNA片段来容易地确定。然后使用常规的荧光显微镜术使这些样点成像。因而可以确定可从不同组合的荧光染料和固体表面(例如，玻璃、熔融石英，等等)获得的敏感性、线性和动态范围。还能分析已知相对比例的荧光染料对的连续稀释。这确定了精确度，在所述精确度下在检测器允许的动态范围内的荧光比例测量反应了实际的荧光染料比例，并确定了底物的荧光，在所述底物上已经固定了探针。

d)核酸的标记和检测.

在此使用用于检测A2A受体或A2A受体信号途径的其他元件表达水平的探针能是全长的或不到全长的。经验性地测试了较短的探针的特异性。优选的探针是足够长的，从而在严格条件下与目标核酸特异性杂交。优选的大小范围是约20碱基到目标mRNA的长度，更优选的从约30碱基到目标mRNA的长度，最优选的从约40碱基到目标mRNA的长度。

一般地用可检测标记来标记探针。适合于在发明中使用的可检测标记包括可由分光的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电的、光学的或化学的方法检测的任何组合物。在本发明中有用的标记包括用标记的链霉抗生物素蛋白共轭物染色的生物素、磁性珠(例如，Dynabeads^TM)、荧光染料(例如，荧光素、得克萨斯红(texas red)、罗丹明、绿色荧光蛋白质等等，参见，例如，Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)、放射性标记(例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其他在ELISA中常用的)、比色标记例如胶态金(例如，40-80nm直径大小范围的金粒子高效散射绿光)或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等等)珠子。教导这些标记的使用的专利包括美国专利Nos.3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。

荧光标记是优选的，因为它提供了低背景的非常强的信号。通过快速扫描方法，在高的分辨率和敏感性下它也是光学可检测的。核酸样品能全部用单个标记，例如，单个荧光标记来标记。做为选择，在另一个实施方案中，不同的核酸样品能同时地杂交，其中各个核酸样品具有不同的标记。例如，第一个目标可以具有绿色荧光标记，第二个目标可以具有红色荧光标记。扫描步骤将从结合绿色荧光标记的那些中辨别出结合红色标记的位点。可以互相独立地分析各个核酸样品(目标核酸)。

能采用的适合的发色团包括以独特的波长范围吸收光的那些分子和化合物，从而可以观察到颜色，或做为选择，当用特定波长或波长范围的射线照射时其发出光线，例如，荧光剂。

也可以通过化学发光和生物发光的光源提供可检测信号。化学发光源包括通过化学反应成为电子激发的，并因而能发射充当可检测信号的光线或将能量传给荧光接受体的化合物。做为选择，萤光素能用于与荧光素酶或光泽精连接来提供生物发光。

通过具有可被电子自旋共振(ESR)光谱检测的不成对电子自旋的报告分子，可以提供自旋标记物。示范性的自旋标记物包括有机的自由基、跃迁的金属复合物，特别是钒、铜、铁和锰等等。示范性的自旋标记物包括氧化亚氮自由基。

能在杂交之前或之后将标记添加给目标(样品)核酸。所谓的“直接标记”是在杂交之前直接附着于或掺入到目标(样品)核酸中的可检测标记。相比之下，所谓“间接标记”在杂交之后连接到杂交双链体。通常，间接标记被附着到在杂交之前已经附着于目标核酸的结合部分上。因而，例如，目标核酸可以在杂交之前生物素化。在杂交后，抗生物素蛋白共轭物荧光基团将结合携带生物素的杂交双链体，提供容易检测的标记。对于标记核酸和检测标记的杂交核酸的方法的详细论述，参见Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology，Vol.24：Hybridization With Nucleic Acid Probes，P.Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.，(1993))。

荧光标记可以在体外转录反应期间容易地添加。因而，例如，荧光素标记UTP和CTP能掺入到体外转录中产生的RNA中。

标记可以直接地或通过连接基团附着。一般地，标记或连接-标记附着的位置不限于任何特定位置。例如，标记可以在不影响所期望的检测或杂交的任何位置附着于核苷、核苷酸或其类似物上。例如，来自Clontech(Palo Alto，CA)的某些Label-ON试剂提供了散布在寡核苷酸的整个磷酸盐骨架上的标记和在3′和5′末端的末端标记。如在此例示的，标记可以附着在核糖环上的位置，或核糖可以被按需修饰和甚至消除。有用的标记试剂的碱基部分能包括天然发生的或以一定方式修饰的那些，所述方式不影响放入所述碱基的目的。修饰的碱基包括但不限于7-deaza A和G、7-deaza-8-aza A和G，和其他杂环基团。

认识到，荧光标记不限于单纯的有机分子种类，还包括无机分子、有机和/或无机分子的多分子混合物、晶体、异聚物等等。因而，例如，可以容易地产生封装到硅质壳(silica shell)中的CdSe-CdS核-壳纳米晶体用于与生物分子偶联(Bruchez等人(1998)Science，281：2013-2016)。类似地，高荧光量子点(quantum dots)(硫化锌-帽化的硒化镉)已经共价偶联到生物分子用于超灵敏的生物检测(Warren and Nie(1998)Science，281：2016-2018)。

B)基于多肽的分析

1)分析形式

除了检测核酸表达水平之外，或作为选择，能通过检测和/或定量翻译的A2A受体蛋白或A2A受体信号途径的其他元件的数量和/或活性来检测和/或定量A2A受体或A2A受体信号途径的其他元件的表达或活性中的变化。

2)表达的蛋白质的检测

能通过本领域技术人员公知的许多方法的任一种来检测和定量A2A受体或A2A受体信号途径的其他元件。这些可以包括分析性生物化学方法，例如电泳、毛细管电泳、高效液相层析法(HPLC)、薄层层析法(TLC)、超扩散层析等等，或各种免疫学方法，例如液体或凝胶沉淀素反应、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光法分析、Western印迹等等。

在一个优选的实施方案中，在电泳蛋白质分离(例如，1维或2维电泳)中检测/定量A2A受体或A2A受体信号途径的其他元件。使用电泳技术检测蛋白的方法是本领域技术人员公知的(一般参见，R.Scopes(1982)ProteinPurification，Springer-Verlag，N.Y.；Deutscher，(1990)Methods in EnzymologyVol.182：Guide to Protein Purification，Academic Press，Inc.，N.Y.)。

在另一个优选的实施方案中，Western印迹(免疫印迹)被用于检测和定量A2A受体或A2A受体信号途径的其他元件的存在。这种技术一般包括通过凝胶电泳在分子量的基础上分离样品蛋白，将分离的蛋白转移到适合的固相支持物(例如硝化纤维素滤器、尼龙滤膜、或衍生的尼龙滤膜)上，孵育具有特异性结合目标多肽的抗体的样品。

抗体特异性地与目标多肽结合，可以被直接标记或作为选择可随后使用特异性结合该抗体的结构域的标记的抗体(例如，标记的绵羊抗鼠抗体)来检测。

在优选的实施方案中，使用免疫测定检测A2A受体或A2A受体信号途径的其他元件。如在此使用的，免疫测定是利用特异性结合被分析物(例如，目标多肽)的抗体的测定法。与使用其他物理或化学性质来分离、靶向和定量被分析物相反，免疫测定的特征是检测本发明的多肽与抗体的特异性结合。

许多公认的免疫学结合分析(参见，例如，美国专利4,366,241、4,376,110、4,517,288和4,837,168)的任一种都非常适合于检测或定量在此确定的多肽。对于一般性免疫测定的论述，还参见Asai(1993)Methods in Cell BiologyVolume 37：Antibodies in Cell Biology，Academic Press，Inc.New York；Stites &Terr(1991)Basic and Clinical Immunology 7th Edition。

免疫结合分析(或免疫测定)一般利用“捕获剂(capture agent)”来特异性地结合并且通常固定被分析物(A2A受体蛋白)。在优选的实施方案中，捕获剂是抗体。

免疫测定还常常利用标记试剂来特异性地结合并标记由捕获剂和被分析物形成的结合复合物。标记试剂本身可以是包含抗体/被分析物复合物的部分之一。因而，标记试剂可以是标记的多肽或特异性识别已经结合了目标多肽的标记的抗体。做为选择，标记试剂可以是第三个部分，例如另一个抗体，其特异性地结合捕获剂/多肽复合物。

能够特异性结合免疫球蛋白恒定区的其他蛋白质，例如蛋白A或蛋白G也可以用作标记试剂。这些蛋白是链球菌的细胞壁的正常组分。它们展现了与各个物种的免疫球蛋白恒定区的强烈非免疫原性反应性(一般参见，Kronval，等人(1973)J.Immunol，111：1401-1406，和Akerstrom(1985)J.Immunol，135：2589-2542)。

用于检测目标多肽的优选的免疫测定是竞争性或非竞争性的。非竞争性的免疫测定是在其中直接测量捕获的被分析物的量的测定法。在一个优选的“夹心”分析中，例如，捕获剂(抗体)可以直接与固体基质结合，所述试剂固定在固体基质上。这些固定的抗体然后捕获测试样品中存在的目标多肽。由此固定的目标多肽然后被标记试剂，例如携带标记的第二抗体结合。

在竞争性分析中，通过测量添加的(外源的)被分析物的量，所述被分析物由样品中存在的被分析物从捕获剂(抗体)上替换(或竞争离开)，间接地测量样品中存在的被分析物(例如，A2A受体蛋白)的量。在一种竞争性分析中，在这种情况下，已知数量的标记多肽被添加到样品中，然后用捕获剂接触样品。与抗体结合的标记多肽的量与样品中存在的目标多肽的浓度成反比。

在一个特别优选的实施方案中，抗体被固定在固体基质上。通过测量在多肽/抗体复合物中存在的目标多肽的数量、或选择性地通过测量剩余的未复合多肽的数量，可以测定与抗体结合的目标多肽的数量。

本发明的免疫测定方法包括酶免疫测定(EIA)，取决于所采用的特定方案，其利用了未标记或标记的(例如，酶标记的)多克隆或单克隆抗体或抗体片段或单链抗体的衍生物，其单独地或组合地结合β/γ二聚体多肽。在结合目标多肽的抗体未被标记的情况下，可以采用不同的可检测标记物，例如能够与结合目标多肽的单克隆抗体结合的酶标记的抗体。也可以采用任何已知的EIA的变体，例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)。如上所指出，本发明还预期的是免疫印迹免疫测定技术，例如采用酶检测系统的Western印迹。

本发明的免疫测定方法还可以是其他已知的免疫测定方法，例如，使用荧光物质例如荧光素或罗丹明的抗体共轭物或抗原共轭物的荧光免疫测定，使用抗体包被或抗原包被的胶乳粒子的胶乳凝集、使用抗体包被或抗原包被的红细胞的血细胞凝集，和采用抗生物素蛋白-生物素或strepavidin-生物素检测系统的免疫测定等等。

取决于各种因素，例如样品中抗原的浓度、样品的性质、所采用的免疫测定的种类等等，在本发明的免疫测定中采用的具体参数可以大大不同。本领域的普通技术人员可以容易地确定最优条件。在一些实施方案中，一般地选择结合目标多肽的抗体的量，来得出不存在样品时可检测标记物的50％结合。如果纯化的抗体被用作抗体来源，每个分析使用的抗体的量一般在约1ng到约100ng的范围。典型的分析条件包括约4℃到约45℃、优选的约25℃到约37℃、最优选的约25℃的温度范围，约5到9、优选约7的pH值范围，和从蒸馏水到约0.2M氯化钠、优选的约0.15M氯化钠的离子强度。取决于分析的性质，时间将大大不同，一般从约0.1分钟到约24小时。可以采用各种各样的缓冲液，例如PBS，也可以包括其他试剂，例如盐来增强离子强度，蛋白质例如血清白蛋白、稳定剂、抗微生物剂和非离子型洗涤剂。

根据本领域技术人员公知的标准方法对本发明的分析评分(阳性或阴性或目标多肽的定量)。具体的评分方法将取决于分析形式和标记的选择。例如，通过将由酶的标记产生的有色产物可视化，可以对Western印迹分析评分。在正确分子量处的明显可见的有色条带或点被计为阳性结果，而不存在明显可见的点或条带被计为阴性。条带或点的强度可以提供目标多肽浓度的定量度量。

用于在此描述的各种免疫测定的抗体是商业上可获得的，或可以使用本领域技术人员公知的标准方法产生。

C)行为分析

在各种实施方案中，可以使用行为分析来代替或补充对改变腺苷A2A受体的表达或活性的药物的分析。因而，例如，当已知化合物是腺苷A2A受体拮抗剂时，能使用行为分析来评估化合物抑制与成瘾性有关的行为的一种或多种构成的效力。

这种行为分析是本领域技术人员公知的。这些包括但不限于，操作性自我施用(例如，乙醇或其他物质)、抑制腺苷介导的恢复寻求行为等等。在实施例和其中引用的参考文献中例示了几种这样的分析。

D)结合腺苷A2A受体的待测药物的预筛选.

在一些实施方案中，希望预先筛选待测药物与编码腺苷A2A受体的核酸和/或腺苷A2A受体作用(例如，特异性结合)的能力。具体地，结合待测药物可能对A2A受体表达和/或活性起作用从而抑制A2A受体表达和/或活性。因而，在一些优选的实施方案中，在进行上述更复杂的分析之前，预先筛选结合A2A受体核酸或A2A受体或A2A受体蛋白的待测药物。

在一个实施方案中，使用简单的结合分析来实现这种预筛选。分析特定配体对核酸或对蛋白质的特异性结合或结合亲合性的方法是本领域技术人员公知的。在优选的结合分析中，目标(例如，A2A受体蛋白或核酸)被固定并与待测药物(其可以被标记)接触，或作为选择，待测药物被固定并与可被标记的A2A受体接触。然后洗涤固定的部分来除去任何未结合的材料，并检测结合的待测药物或结合的受体蛋白(例如，通过检测附着到结合的分子的标记)。固定的标记的数量与目标和待测药物之间的结合程度成比例。

E)对分析评分.

根据本领域技术人员公知的标准方法对本发明的分析评分。当存在待测药物或早先施加的待测药物所见的活性与(通常是阴性)对照之间存在差异时，本发明的分析一般被计为阳性。在一些优选的实施方案中，所述变化/差异是统计学上显著的变化/差异，例如，使用任何适合于提供的数据集的统计检验(例如，t-检验、变量分析(ANOVA)、半参数技术、非参数技术(例如，Wilcoxon Mann-Whitney检验、Wilcoxon Signed Ranks检验、Sign检验、Kruskal-Wallis检验等等))来确定。优选的差异/变化是统计学上显著的，大于80％、优选的大于约90％、更优选的大于约98％、最优选的大于约99％可信水平。最优选的“阳性”分析显示了与阴性对照的至少1.2倍、优选的至少1.5倍、更优选的至少2倍、和最优选的至少4倍或甚至10倍的差异。

F)用于筛选的药物(agent)：组合库(combinatorial libraries)(例如，小的有机分子).

实际上任何试剂都可以根据本发明的方法来筛选。这样的药物包括但不限于，核酸、蛋白质、糖类、多聚糖、糖蛋白、脂质、和小的有机分子。术语“小的有机分子”一般是指大小可以与一般用于药物的那些有机分子相比的分子。该术语排除了生物大分子(例如，蛋白、核酸等等)。优选的小有机分子大小范围最多约5000Da，更优选的最多2000Da，最优选的最多约1000Da。

通常，通过鉴定具有某些期望的性质或活性的化合物(称为“先导化合物”)、产生先导化合物的变体、和评估这些变体化合物的性质和活性，来产生具有有用性质的新的化学实体。然而，当前的趋势是缩短药物开发的所有方面的时间进程。由于快速和有效地测定大数量的能力，高通量筛选(HTS)方法正在替代常规的先导化合物鉴别方法。

在一个优选的实施方案中，高通量筛选方法包括提供含有大量潜在治疗化合物(候选化合物)的库。然后在一种或多种分析中筛选这种“组合化学物质库(combinatorial chemical library)”，如在此描述的，来鉴定显示了期望的特征活性的库成员(特别是化学物质种类或子类)。由此鉴定的化合物可以充当常规的“先导化合物”或本身可以用作潜在的或实际的治疗剂。

组合化学物质库可以是通过组合多种化学物质“构建块(building block)”例如试剂，通过化学合成或生物合成产生的多种化合物的集合。例如，线性组合化学物质库例如多肽(例如，突变蛋白)库是通过以各种可能的方式组合一系列称为氨基酸的化学构建块达到给定的化合物长度(即，多肽化合物中的氨基酸数量)来形成的。通过这种化学构建块的组合混合，可以合成数百万的化合物。例如，一位评论员已经注意到，系统性、组合性混合100种可互换的化学构建块，产生1亿种四聚体化合物或100亿种五聚体化合物的理论合成(Gallop等人(1994)J.Med.Chem.，37(9)：1233-1250)。

组合化学物质库的制备是本领域技术人员公知的。这种组合化学物质库包括但不限于，肽库(参见，例如，美国专利5,010,175，Furka(1991)Int.J.Pept.Prot.Res.，37：487-493，Houghton等人(1991)Nature，354：84-88)。肽合成决不是预想和设计用于本发明的唯一方法。也可以使用用于产生化学物质多样性库的其他化学物质。这些化学物质包括但不限于：类肽(PCT公开No WO91/19735,26 Dec.1991)、编码的肽(PCT公开WO 93/20242,14 Oct.1993)、随机的生物寡聚物(PCT公开WO 92/00091，9 Jan.1992)、苯二氮(U.S.Pat.No.5,288,514)、diversomers例如乙内酰脲、苯二氮和二肽(Hobbs等人，(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90：6909-6913)、插烯(vinylogous)多肽(Hagihara等人(1992)J.Amer.Chem.Soc.114：6568)、具有Beta-D-葡萄糖骨架的非肽性拟肽(Hirschmann等人，(1992).Amer.Chem.Soc.114：9217-9218)、小化合物库的类似的有机合成(Chen等人(1994)J.Amer.Chem.Soc.116：2661)、oligocarbamates(Cho，et al，(1993)Science 261：1303)、和/或肽基膦酸酯(peptidyl phosphonates)(Campbell等人，(1994)J.Org.Chem.59：658)。一般地，参见，Gordon等人，(1994)J.Med.Chem.37：1385、核酸库(参见，例如，Strategene，Corp.)、肽核酸库(参见，例如，美国专利5,539,083)抗体库(参见，例如，Vaughn等人(1996)Nature Biotechnology，14(3)：309-314)，和PCT/US96/10287)、碳水化物库(参见，例如，Liang等人(1996)Science，274：1520-1522和美国专利5,593,853)、以及小有机分子库(参见，例如，苯二氮，Baum(1993)C&EN，Jan 18，33页、类异戊二烯，美国专利5,569,588、噻唑烷酮类(thiazolidinones)和metathiazanones美国专利5,549,974、吡咯烷美国专利5,525,735和5,519,134、吗啉代化合物美国专利5,506,337、苯二氮5,288,514等)。

用于制备组合库的装置是商业上可获得的(参见，例如，357 MPS，390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。

对于液相化学也已经开发了许多公知的机器人系统。这些系统包括但不限于自动化的工作站，如Takeda Chemical Industries LTD.(Osaka，Japan)开发的自动化合成设备，和许多利用机器人臂的机器人系统(Zymate II，ZymarkCorporation，Hopkinton，Mass.；Orca，Hewlett-Packard，Palo Alto，Calif.)，其模拟由化学家进行的人工操作，以及Venture^TM平台，一种超高通量合成仪，其能从开始到结束运行576个和9,600个之间的平行反应(参见，AdvancedChemTech，Inc.Louisville，KY)。任何上述装置都适合于本发明使用。对这些装置进行性质和实施的修改(如果需要的话)使得它们可以如在此讨论的操作，对于相关领域技术人员是显而易见的。此外，许多组合库本身是商业上可获得的(参加，例如，ComGenex，Princeton，NJ.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD，etc.)。

G)高通量筛选

在此描述的对于调节代谢产物的蓄积或降解的化合物的任何分析都可经受高通量筛选。优选的分析是检测响应于待测化合物的存在的腺苷A2A受体表达或活性。

在本发明的方法中使用的细胞不必一次接触单个待测药物。相反，为了便于高通量筛选，单个细胞可以接触至少两个、优选的至少5个、更优选的至少10个、最优选的至少20个测试化合物。如果细胞评分为阳性，可以随后用待测药物的亚类(subset)来测试，直到确定药物具有活性。

对各种报告基因产物的高通量分析是本领域技术人员公知的。例如，多孔荧光计是商业上可获得的(例如，从Perkin-Elmer)。

此外，高通量筛选系统是商业上可获得的(参见，例如，Zymark Corp.，Hopkinton，MA；Air Technical Industries，Mentor，OH；Beckman Instruments，Inc.Fullerton，CA；Precision Systems，Inc.，Natick，MA，etc.)。这些系统一般地自动进行完整的过程，包括所有样品和试剂的移液、液体分配、定时孵育、在适合于分析的检测器中微量培养板的最终读取。这些可配制的系统提供了高通量和快速启动，以及高度的灵活性和专用化。这些系统的厂家提供了各种高通量的详细方案。因而，例如Zymark Corp.提供了技术报告，描述了用于检测基因转录、配体结合等等的调节的筛选系统。

H)调节物数据库.

在一些实施方案中，在此处描述的分析中被计为阳性的药物(例如，显示了抑制A2A受体表达或活性的能力)，能进入与消耗滥用物质或由此戒断有关的成瘾行为的一种或多种构成的推定和/或实际抑制物的数据库。术语数据库是指记录和检索信息的手段。在优选的实施方案中，数据库还提供了分类和/或检索存储的信息的手段。数据库可以包括任何方便的介质，包括但不限于纸系统、卡片系统、机械系统、电子系统、光学系统、磁系统或它们的组合。优选的数据库包括电子(例如，基于计算机的)数据库。用于存储和数据库操作的计算机系统是本领域技术人员公知的，包括但不限于“个人计算机系统”、主机系统、网内或网间的分布式结点(distributed nodes)、存储在专业化硬件(例如微芯片中)中的数据或数据库，等等。

实施例

提供以下实施例来说明，而不是限制所要求保护的发明。

实施例1

被腺苷A2A受体调节大鼠的乙醇操作性自我施用

伏核(NAc)中的多巴胺(DA)的释放涉及乙醇(EtOH)的神经和行为影响。新近的进展表明，腺苷在调节对EtOH的CNS反应中也起到重要作用。神经细胞培养的研究显示，EtOH通过激活腺苷A₂受体(A₂)，触发了cAMP/PKA信号和CRE介导的基因表达。最重要地，EtOH的亚阈浓度通过A₂和DA D₂受体(D₂)激动剂协同激活这个途径。协同作用是由Gi/o βγ二聚体介导的(Yao等人，2002)。近来，我们报道了，在NAc中βγ抑制剂的表达降低了大鼠的EtOH饮用(Yao等人2002)。如果EtOH的奖赏效应是通过该途径介导的，则A₂或D₂阻断应当减弱EtOH消耗。

方法：训练雄性Long Evans大鼠用有效(active)和无效(inactive)的杠杆每天自我施用10％EtOH 30min。各组的大鼠通过全身性注射来给予D₂拮抗剂依替必利(0.005、0.007、0.01mg/kg)、A2A拮抗剂DMPX(1、3、5、7、10和20mg/kg)以及A₁拮抗剂DPCPX(0.125、0.25、0.5mg/kg)。

结果：依替必利剂量依赖性地降低了EtOH饮用。DMPX显示了双向(bimodal)影响：10和20mg/kg降低了EtOH消耗，但1mg/kg提高了EtOH消耗。DPCPX没有影响。

结论：支持了我们的假说，D₂和A2A拮抗剂都减弱了EtOH自我施用。低剂量的A2A拮抗剂增强了EtOH饮用，与这种可能性相符，即大鼠提高了EtOH自我施用来克服部分A2A阻断。这些数据提供了第一证据，在大鼠中腺苷A2A受体的药理学调节能调节EtOH消耗。

引言

在CNS中伏核(NAc)和背侧纹状体(dorsal striatum)表达最高浓度的腺苷A2A受体(Jarvis和Williams，1989；Svenningsson等人，1997a)。在神经细胞培养体系中的实验已经证明乙醇(EtOH)活化了A₂信号(Gordon和Diamond，1986)。由于EtOH通过平衡型核苷转运蛋白ENT1阻断了腺苷的摄取，引起细胞外腺苷浓度的增加，从而发生了这种现象(Nagy等人，1990；Krauss等人，1993)。提高的细胞外腺苷激活了A₂受体，导致提高的cAMP水平。cAMP中乙醇诱导的增加引起PKA的活化和PKA的催化亚单位(PKA Cα)向核的转位(Dohrman等人，2002)。这继之以cAMP依赖性CRE-介导的基因转录的增加(Yao等人，2002)。

除了EtOH通过抑制腺苷摄取来提高细胞外腺苷的可能性之外，肝脏中的EtOH代谢也可以引起组织和器官中腺苷的增加(Carmichael等人，1987，1988，1991；Orrego等人，1988a)。肝脏的乙醇和乙醛活性使EtOH生成乙酸(acetate)(Orrego等人，1988b)。乙酸被进一步代谢为乙酰CoA，在该过程中消耗ATP；这产生腺苷(Israel等人，1994)。释放到循环中的腺苷穿过血脑屏障(Cornford和Oldendorf，1975)。此外，由肝脏中的乙醇代谢产生的乙酸被释放到循环中，在其中它也穿越血脑屏障。进入脑的乙酸被容易地转变为乙酰CoA(Berl and Frigyesi，1969)。这将在原位产生腺苷。乙酸，象腺苷一样，是CNS抑制剂。脑中乙酸的影响看起来是由腺苷介导的，因为它被腺苷受体拮抗剂阻断(Israel等人，1994；Campisi等人，1997)。合起来，这些发现表明，体内EtOH对一些行为影响可以由EtOH直接或间接诱导的脑中细胞外腺苷的增加，随后是腺苷受体的活化来介导。

NAc和背侧纹状体的独特的特征之一是在相同的GABA能中型棘突神经元(spiny neuron)上共表达腺苷A2A和多巴胺(DA)D₂受体(Fink等人，1992)。我们检查了A₂和D₂受体在细胞培养体系中调节对EtOH的神经元反应中的相互作用。我们发现了在D₂和EtOH/A₂诱导的活化之间的协同作用。D₂激动剂或EtOH的亚阈浓度，其单独没有效果，当加在一起时诱导PKA信号的最大活化。此外，我们发现Gi/o βγ二聚体的释放是由D₂激动剂和EtOH诱导的协同作用所需的。支持我们的模型，我们发现了在NAc的壳区域中βγ二聚体作用的抑制降低了EtOH自我施用(Yao等人，2002)。因为A2A受体与相同的NAc的纹状体GABA能中型棘突神经元内的D₂受体功能上相互作用(Fink等人，1992；Ferre，1997；Ferre等人，1997；Fuxe等人，1998；Svenningsson等人，1999)，我们猜测A2A和D₂受体之间的协同作用赋予了对该脑区域的选择性EtOH超敏性。具体地，我们发现，在体内，通过增加VTADA神经元的兴奋(Appel等人，2003)并由此增强NAc中的DA水平(Imperato and Di Chiara，1986；Weiss等人，1993)，和通过经由以上讨论的机制增加细胞外腺苷，EtOH本身促进了这种协同性相互作用。EtOH的增强作用可以分别由这种EtOH诱导的在DA和腺苷对D₂和A2A受体的作用方面的增加来介导。

在本文中的研究检测了阻断D₂或A2A受体是否降低EtOH的增强的作用。我们使用A2A拮抗剂DMPX来确定腺苷A2A阻断是否将降低大鼠中的EtOH自我施用。为了排除在EtOH消耗期间可能涉及腺苷A₁受体，也测试了A₁选择性拮抗剂DPCPX。已经显示了D₂受体调节EtOH自我施用(Hodge等人，1997；Cohen等人，1998；Czachowski等人，2001)。为了进一步表征在我们的研究条件下D₂受体的参与，我们测试了D₂拮抗剂依替必利的作用，据我们所知还没有测试过依替必利在大鼠的EtOH操作性自我施用的研究中的作用。

方法

动物和安置

除非另外说明，在研究开始时称重约250g的雄性Long Evans大鼠(Harlan，Indianapolis，EN)单笼饲养，可随意使用食物和水。将它们维持在12h的明/暗周期中，在上午7:00开灯。在上午8:30和下午2:00之间进行操作训练。实验步骤预先由我们的实验性动物饲养和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)批准。

药物

用于自我施用的EtOH稀释液(10％v/v)使用95％乙醇和自来水来制备。用自来水制备蔗糖(Saccharose，Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ，USA)溶液(10％w/v)。所有待测化合物获自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。将A2A拮抗剂DMPX(3，7-二甲基-1-炔丙基黄嘌呤)溶于温盐水中。将A₁拮抗剂DPCPX(8-环戊基-1，3-二丙基黄嘌呤)溶于Alkamuls EL-620(Rhodia Inc.，Cranbury，NJ，USA)和磷酸盐缓冲盐水的20∶80v/v混合物中。将D₂拮抗剂依替必利溶于盐水中。除了以5、7和20mg/kg的DMPX测试的组之外，以1ml/kg的体积给药药物，其中注射体积是2ml/kg，因为达到的最高DMPX可溶浓度是10mg/ml。药物在每个治疗天新鲜地制备。

操作性自我施用设备

在设在声响减弱的隔间的标准操作室(Med Associates，Georgia，VT)中进行EtOH操作性自我施用。每个室(33×30.5×33cm)含有靠着右墙的两个可收缩的杠杆，分别距地面7cm和右墙的左或右边缘1cm。位于地面水平上2.5cm和远离杠杆朝向室中心6cm的一个嵌入式的平皿是加强装置(reinforcer receptacle)。当激活2个可收缩的反应杠杆中的一个时，由喷射器泵递送流体(0.1ml)。在杠杆式压下时激活3sec的伸缩性(tone)。除了在蔗糖过夜期(见下文)，压下无效的杠杆导致没有可见的/听觉的提示或增强的递送。训练期的开始由位于面向杠杆的墙中心、地面上方27.2cm的房间灯的开启来给出信号。计算机控制刺激和流体递送，并记录操作性反应。

EtOH自我施用过程

在EtOH操作性自我施用开始之前，让大鼠在它们的饲养笼子中接触作为唯一液体源的10％EtOH(10E)溶液4天。接下来的14天，容许动物自由选择来自分级玻璃管的含10E的自来水或自来水。在这个14天周期结束时，根据有微小修改的蔗糖衰减技术(sucrose fading technique)(Samson，1986)开始操作性自我施用。大鼠被限制为每天给予30分钟的水，持续2个连续日。在限水的第二天晚上，将大鼠置于操作室中12-15小时进行FR1进度表上的过夜期(每个杠杆压下为0.1ml的1次加强)，带有10％蔗糖(10S)作为加强件，两个杠杆都有效。第二天，大鼠开始操作性自我施用训练。接下来4-5天动物保持限水，在这期间在接受FR1进度表上的每天一次45分钟训练期，用10S作为加强件以及一个有效杠杆。然后在剩余的实验中它们在它们的饲养笼子中自由给水，并且上述描述的训练期再训练2-3次。次日，训练期缩短到30分钟，应答的比例增加到FR3。将EtOH添加到甜味溶液(10S 10E)中，大鼠接受这种溶液的3-4个训练期，随后仅用10E至少20个训练期。在开始任何药物治疗之前需要在8个训练期中消耗最小平均0.3g/kg的EtOH。在最后8个训练期中没能消耗这个EtOH平均数量的动物不被包括在研究中。

实验设计

一旦大鼠达到稳定的EtOH反应，在每周一个训练期间使它们习惯载体的皮下(sc)或腹膜内的(ip)注射持续2周。然后，使用受试者内的拉丁方(LatinSquare)设计待测药物，从而各动物接受各剂量的一种化合物和合适的载体。测试期(test sessions)在每周星期三或星期四进行，而从星期一到星期五每天训练大鼠。在4个独立的动物组中测试这项研究中使用的三种药物。在各测试期之前，DMPX(0、1、3、5、7、10和20mg/kg)或载体腹膜内给药20分钟。1、3和10mg/kg的DMPX剂量在一组动物中测试，而其余的DMPX剂量(0、5、7和20mg/kg)在不同的组中研究，以更好地检测在显著的10mg/kg剂量周围的DMPX浓度。在各测试期之前，DPCPX(0、0.125、0.25或0.5mg/kg)或载体腹膜内注射15分钟。在各测试期前25分钟，皮下给药依替必利(0、0.005、0.007或0.01mg/kg)或载体。

统计

通过单向方差分析(ANOVA)，组内因素是DMPX、DPCPX、或依替必利剂量，分析各测试期的杠杆压下次数、EtOH加强的数目、EtOH消耗的g/kg以及无效杠杆压下的次数。对于DMPX作用，从接受5、7和20mg/kgDMPX的动物中单独地分析使用1、3和10mg/kg的待测动物组。在合适时进行Post-hoc LSD检验。

结果

DMPX对EtOH自我施用的影响

尽管在2个独立大鼠组中确定了DMPX的2个独立的剂量-效应函数，为了清楚的比较，在一个附图中显示所有待测的DMPX剂量的效应结果(附图1)。盐水处理后的平均反应是不同的：第1组：89.20±15.26(0.39±0.06g/kg)，和第2组：99.44+12.02(0.46+0.05g/kg)。在用1、3和10mg/kg DMPX测试的组中，观察到杠杆压下次数[F(3，27)＝9.68，p＜0.0003]、EtOH加强的数目[F(3，27)＝8.69，p＜0.0003]和消耗EtOH的g/kg[F(3，27)＝8.62，p＜0.0004]的显著影响。无效的杠杆压下不受任何这些剂量的影响[F(3，27)＝0.87，NS](表1)。在用5、7和20mg/kg的DMPX测试的组中，观察到杠杆压下次数[F(3，21)＝4.37，p＜0.02]、EtOH加强的数目[F(3，21)＝4.76，p＜0.02]和消耗EtOH的g/kg[F(3，21)＝4.96，p＜0.01]的显著影响，但无效杠杆压下的次数没有显著影响[F(3，21)＝0.15，NS](表1)。如在此之后的检验揭示的，A2A拮抗剂的剂量-效应函数是双向的。测试的最低剂量(1mg/kg)显著地增加了杠杆压下的次数(p＜0.02)、EtOH加强的数目(p＜0.03)以及EtOH摄入的g/kg(p＜0.03)。3、5和7mg/kg的中间剂量没有显著地影响任何测定。10mg/kg的剂量显著地降低了进行的全部测定：杠杆压下的次数(p＜0.02)、EtOH加强的数目(p＜0.03)以及EtOH消耗的g/kg(p＜0.02)。最高剂量(20mg/kg)显示了对EtOH加强的数目(p＜0.05)和EtOH摄入的g/kg(p＜0.05)的显著影响。

表1：DMPX、DPCPX和依替必利对无效杠杆压下次数的影响。

DMPX
												盐水n＝182.92±0.45	1mg/kgn＝102.60±0.85		3mg/kgn＝101.50±0.37	5mg/kgn＝83.56±1.29			7mg/kgn＝83.93±2.17	10mg/kgn＝103.60±1.76			20mg/kgn＝83.87±0.64
DPCPX
												载体n＝72.71±0.56		0.125mg/kgn＝71.78±0.62				0.25mg/kgn＝72.36±1.08				0.5mg/kgn＝72.86±0.88
依替必利
												盐水n＝52.00±0.67		0.005mg/kgn＝52.00±0.58			0.007mg/kgn＝51.00±0.41				0.01mg/kgn＝51.83±0.98

DPCPX对EtOH自我施用的影响

这个实验的结果在附图2和表1中示出。不存在选择性A₁拮抗剂DPCPX(0.125、0.25或0.5mg/kg)对测定的任何参数的影响：杠杆压下次数[F(3，18)＝0.84，NS]、EtOH加强的数目[F(3，18)＝0.74，NS]、EtOH消耗的g/kg[F(3，18)＝0.84，NS]或无效杠杆压下[F(3，18)＝0.52，NS]。

依替必利对EtOH自我施用的影响

这个实验的结果在附图3中示出。观察到在杠杆压下次数[F(3，15)＝11.13，p＜0.0004]、EtOH加强的数目[F(3，15)＝8.96，p＜0.001]以及EtOH消耗的g/kg[F(3，15)＜10.14，p＜0.0007]的显著下降。Post-hoc分析揭示了0.007mg/kg和0.01mg/kg依替必利对分析的所有测定的显著影响：杠杆压下的次数(分别为p＜0.005和p＜0.0001)、加强的数目(分别为p＜0.02和p＜0.007)和EtOH消耗的g/kg(分别为p＜0.01和p＜0.004)。0.005mg/kg的剂量没有显著影响任何分析的测定。无效的杠杆压下不受任何剂量的影响[F(3，15)＝0.39，NS](表1)。

讨论

这项研究中的主要发现是腺苷A2A受体调节EtOH的增强性质。A2A拮抗剂DMPX双向地影响操作性自我施用期间的杠杆压下的次数、加强的数目和EtOH消耗g/kg。相反，腺苷A1拮抗剂没有影响。正如所料，DA D₂拮抗剂依替必利降低了测定的所有参数，如使用其他D2拮抗剂所报道的(Hodge等人，1997；Cohen等人，1998；Czachowski等人，2001)。

通过引起细胞外腺苷增加的EtOH敏感性平衡型核苷转运蛋白ENT-I(Nagy等人，1990；Handa等人，2001)，EtOH抑制腺苷重摄取。在细胞培养物中，腺苷活化A₂受体和增强cAMP/PKA信号(Gordon等人，1986)。近来，我们报道了在D2激动剂NPA和EtOH/A₂之间对于PKA活化的协同作用。协同作用是由从Gi/o释放的βγ二聚体介导的(Yao等人，2002)。我们还提供了对于这个途径在体内的EtOH行为影响方面的作用的证明：在大鼠NAc神经元中抑制βγ二聚体降低了EtOH自我施用(Yao等人，2002)。通过证明A2A或D₂受体阻断减少了体内EtOH自我施用，对于A2A和D₂在这个过程中的重要性，当前的研究提供了进一步的支持。

我们发现DMPX的全身性给药(10和20mg/kg)降低EtOH自我施用。然而，DMPX的最低剂量相反地增加杠杆压下次数和由此的EtOH消耗的数量。对于DMPX的这种双相性影响存在几种可能的解释。首先，DMPX的低剂量和高剂量可能涉及不同受体群体的作用；例如，在低剂量，DMPX可能仅抑制高亲合性A₂受体，在更高的剂量，DMPX可能抑制高亲合性和低亲合性受体(Sebastiao and Ribero，1992；Cunha等人，1999；El Yacoubi等人，2000)。可以设想的是，DMPX也可以与A₁受体结合，尽管有较低的选择性(Jacobson等人，1993)。因此，DMPX在较高剂量的影响可能还涉及A₁受体。由于这种可能性，我们测试了选择性A₁拮抗剂对操作性EtOH自我施用的影响。A₁拮抗剂DPCPX的任何剂量都没有影响所测定的任何参数，所以我们认为这种解释是不太可能的。最终的可能性是A2A拮抗剂在低剂量仅部分地阻断A2A受体，引起EtOH消耗的增加来补偿在这些情况下降低的EtOH效应。在存在较低剂量的阿片制剂拮抗剂时，在自我施用吗啡的动物中已经观察到这种现象(Koob等人，1986)。看起来受试者将直接通过自我施用以力图克服受体的部分阻断，但当相同的受体在较高剂量被完全阻断时，则受试者减少了自我施用。这种现象提供了额外的行为学药理学证据，即A2A受体似乎是EtOH自我施用的直接和重要的介质。

由于腺苷受体也在啮齿动物中影响运动活性(Seale等人，1988；Nikodijevic等人，1991；Barraco等人，1993；Svenningsson等人，1997b；Green and Schenk，2002)，可能的是在当前研究中DMPX的影响是由于它对运动活性的影响和由于对EtOH的增强性质的影响。这不象是可能的解释，因为象其他A2A腺苷拮抗剂一样，DMPX增加了运动活性；我们没有发现DMPX对无效杠杆反应次数的影响，所述的反应次数是运动活性的间接度量。

EtOH戒断综合症和EtOH诱导的运动不协调似乎部分地涉及腺苷系统，主要通过A₁受体介导(Malec等人，1996；Jarvis和Becker，1998；Barwickand Dar，1998；Gatch等人，1999；Kaplan等人，1999；Dar，2001)。我们发现，A₁受体不调节EtOH自我施用。两个新近的报道显示，CNS中的腺苷A2A受体对EtOH有应答。El Yacoubi等(2001)显示了缺乏A2A或A2A的长期阻断降低了EtOH戒断期间的触摸诱导的惊厥。Naassila等(2002)报道了，在2瓶子选择研究中与野生型动物相比，敲除A2A的雄性小鼠消耗了6％和20％更高数量的EtOH，而不是10％，而雌性消耗了6％和10％更高数量的EtOH而不是20％。相反，我们发现腺苷A2A受体阻断降低了EtOH消耗。这种分歧的原因仍待确定，但很可能由于A₂敲除的小鼠中的适应和补偿，包括焦虑的产生(Ledent等人，1997)，和由于D₂与A₂受体的紧密生理相关性D₂功能上可能的变化(Franco等人，2000)。

有效的D₂拮抗剂依替必利剂量依赖性地降低了为了EtOH的杠杆压下次数以及消耗的EtOH的g/kg。在无效杠杆压下的次数上没有影响。这些结果与其他D₂拮抗剂降低EtOH消耗的几个报道相符(Cohen等人，1998；Czachowski等人，2001；George等人，1995；Hodge等人，1997；Samson等人，1993；Weiss等人，1990)。然而，据我们所知，这是依替必利在EtOH操作性自我施用方面的第一个研究。合起来，这些发现证实了D₂在EtOH的奖赏性质中的重要性。我们的发现也与EtOH自我施用提高NAc中细胞外DA的报道相符(Doyon等人，2003；Weiss and Porrino，2002；Weiss等人，1993，1996)。并且，大鼠直接自我施用EtOH到VTA中(Gatto等人，1994)，以及DA神经传递的药理学处理修改了增强EtOH的操作行为和EtOH偏爱(Weiss等人，1990；Samson等人，1993；George等人，1995；Hodge等人，1997；Cohen等人，1998；Czachowski等人，2001)。

总之，我们发现，A2A或D2受体的阻断降低了EtOH自我施用。这些发现证明了内源腺苷和DA在EtOH的增强的效应中的作用，虽然还不知道在当前的研究中EtOH的自我施用量是否足够引起腺苷或DA的细胞外水平的增加。不束缚于这些限制，我们的结果证明了一种工作模型，其中自我施用的EtOH阻断了腺苷转运蛋白，所述蛋白经由肝脏中的EtOH代谢强化了细胞外腺苷的增加；这种腺苷通过A2A受体起作用来增加NAc中的cAMP/PKA信号。同样地，看起来EtOH刺激的DA释放也可能通过D₂受体激活这种PKA信号级联。我们认为，A₂和D₂受体阻断通过防止这种EtOH诱导的效应降低了EtOH的增强影响。正在进行研究来确定A2A和D₂受体之间的协同作用是否促进体内EtOH自我施用。据我们所知，这些数据提供了第一证据，在大鼠中腺苷A2A受体的药理学处理能调节EtOH消耗。可能的是，阻断A2A受体功能的药物在治疗和防止乙醇中毒中的过度饮用方面是有益的。

参考文献

Appel SB，Liu Z，McElvain MA，Brodie MS(2003)Ethanol excitation ofdopaminergic ventral tegmental area neurons is blocked by quinidine.JPharmacol Exp Ther 306：437-446.

Barraco RA，Martens KA，Pareizon M，Normile HJ(1993)Adenosine A2Areceptors in the nucleus accumbens mediate locomotor depression.Brain ResBull 31：397-404.

Barwick VS，Dar MS(1998)Adenosinergic modulation of ethanol-inducedmotor incoordination in the rat motor cortex.Prog Neuro-Psychopharmacol &Biol Psychiat 22：587-607.

Berl S，Frigyesi TL(1969)The turnover of glutamate，glutamine，aspartateand GABA labeled with[1-14C]acetate in caudate nucleus，thalamus and motorcortex(CAT).Brain Res 12：444-455.

Campisi P，Carmichael FJ，Crawford M，Orrego H，Khanna JM(1997)Roleof adenosine in the ethanol-induced potentiation of the effects of generalanesthetics in rats.Eur J Pharmacol 325：165-172.

Carmichael FJ，Israel Y，Crawford M，Minhas K，Saldivia V，Sandrin S，Campisi P，Orrego H(1991)Central nervous system effects of acetate：Contribution to the central effects of ethanol.J Pharm Exp Ther 259：403-408.

Carmichael FJ，Israel Y，Saldivia V，Giles HG，Meggiorini S，OrregoH(1987)Blood acetaldehyde and the ethanol-induced increase in splanchniccirculation.Biochem Pharmacol 36：2673-2678.

Carmichael FJ，Saldivia V，Varghese GA，Israel Y，OrregoH(1988)Ethanol-induced increase in portal blood flow：role of acetate and A1-andA2-adenosine receptors.Amer J Physiol 255：G417-G423.

Cohen C，Perrault G，Sanger DJ(1998)Preferential involvement of D3 versusD2 dopamine receptors in the effects of dopamine receptor ligands on oralethanol self-administration.Psychopharmacol 140：478-485.

Cornford EM，Oldendorf WH(1975)Independent blood-brain barriertransport systems for nucleic acid precursors.Biochim Biophys Acta 394，211-219.

Cunha RA，Constantino MD，Ribeiro JA(1999)G protein coupling of CGS21680 binding sites in the rat hippocampus and cortex is different from that ofadenosine A1 and striatal A2A receptors.Naunyn-Schmiedeberg′s ArchPharmacol 359：295-302.

Czachowski CL，Chappell AM，Samson HH(2001)Effects of raclopride inthe nucleus accumbens on ethanol seeking and consumption.Alcoholism：Clinand Exp Res 25：1431-1440.

Dar MS(2001)Modulation of ethanol-induced motor incoordination bymouse striatal Ai adenosinergic receptor.Brain Res Bull 55：513-520.

Dohrman DP，Chen H-M，Gordon AS，Diamond I(2002)Ethanol-inducedtranslocation of PKA occurs in two phases：control by different molecularmechanisms.Alcohol Clin Exp Res 26：407-415.

Doyon WM，York JL，Diaz LM，Samson HH，Czachowski CL，GonzalesRA(2003)Dopamine activity in the nucleus accumbens during consummatoryphases of oral ethanol self-administration.Alcohol Clin Exp Res 27：1573-1582.

El Yacoubi M，Ledent C，Parmentier M，Costentin J，VaugeoisJ-M(2000)SCH 58261 and ZM 241385 differentially prevent the motor effects ofCGS 21680 in mice：evidence for a functional′atypical′adenosine A2A receptor.Eur J Pharm 401：63-77.

El Yacoubi M，Ledent C，Parmentier M，Daoust M，Costentin J，VaugeoisJ-M(2001)Absence of the adenosine A2A receptor or its chronic blockadedecrease ethanol withdrawal-induced seizures in mice.Neuropharmacol40：424-432.

Ferre S(1997)Adenosine-dopamine interactions in the ventral striatum.Implications for treatment of schizophrenia.Psychopharmacology 133：107-120.

Ferre S，Fredholm BB，Morelli M，Popoli P，FuxeK(1997)Adenosine-dopamine receptor-receptor interactions as an integrativemechanism in the basal ganglia.Trends in Neurosci 20：482-487.

Fink JS，Weaver DR，Rivkees SA，Peterfreund RA，Pollack AE，Adler EM，Reppert SM(1992)Molecular cloning of the rat A2 adenosine receptor：selectiveco-expression with D2 dopamine receptors in rat striatum.MoI Brain Res14：186-195.

Franco R，Ferre S，Agnati L，Torvinen M，Gines S，Hillion J，Casado V，Lledo P，ZoIi M，Lluis C，Fuxe K(2000)Evidence for adenosine/dopaminereceptor interactions：indications for heteromerization.Neuropsychopharmacology 23：S50-59.

Fuxe K，Ferre S，ZoIi M，Agnati LF(1998)Integrated events in centraldopamine transmission as analyzed at multiple levels.Evidence forintramembrane adenosine A2A/dopamine D2 and adenosine At/dopamine D1receptor interactions in the basal ganglia.Brain Res Rev 26：258-273.

Gatch MB，Wallis CJ，LaI H(1999)The effects of adenosine ligands R-PIAand CPT on ethanol withdrawal.Alcohol 19：9-14.

Gatto GJ，McBride WJ，Murphy JM，Lumeng L，Li TK(1994)Ethanol selfinfusion into the ventral tegmental area by alcohol preferring rats.Alcohol11：557-564.

George SR，Fan T，Ng GY，Jung SY，O′Dowd B F，Narajno CA(1995)Lowendogenous dopamine function in brain predisposes to high alcohol preferenceand consumption：reversal by increasing synaptic dopamine.J Pharmacol ExpTher 273：373-379.

Gordon AS，Collier K，Diamond I(1986)Ethanol regulations of adenosinereceptor-stimulated cAMP levels in a clonal neural cell line：an in vitro model ofcellular tolerance to ethanol.Proc Natl Acad Sci USA 83：2105-8.

Gordon AS，Diamond I(1986)Phosphorylation of the nicotinic acetylcholinereceptor.Prog in Brain Res 69：141-148.

Green TA，Schenk S(2002)Dopaminergic mechanisms for caffeine-producedcocaine seeking in rats.Neuropsychopharmacol 26：422-430.

Handa M，Choi DS，Caldeiro RM，Messing RO，Gordon AS，DiamondI(2001)Cloning of a novel isoform of the mouse NBMPR-sensitive equilibrativenucleoside transporter(ENT1)lacking a putative phosphorylation site.Gene262：301-7.

Hodge CW，Samson HH，Chapelle AM(1997)Alcohol self-administration：further examination of the role of dopamine receptors in the nucleus accumbens.Alcohol Clin Exp Res 21：1083-1091.

Imperato A，Di Chiara G(1986)Preferential stimulation of dopamine releasein the nucleus accumbens of freely moving rats by ethanol.J Pharmacol Exp Ther239：219-228.

Israel Y，Orrego H，Carmichael FJ(1994)Acetate-mediated effects of ethanol.Alcohol Clin Exp Res 18：144-148.

Jacobson KA，Nikodijevic O，Padgett WL，Gallo-Rodriguez C，Maillard M，Daly JW(1993)8-(3-Chlorostyryl)caffeine(CSC)is a selective A2-adenosineantagonist in vitro and in vivo.FEBS 323：141-144.

Jarvis MF，Becker HC(1998)Single and repeated episodes of ethanolwithdrawal increase adenosine Ai，but not A2A，receptor density in mouse brain.Brain Res 786：80-88.

Jarvis MF，Williams M(1989)Direct autoradiographic localization ofadenosine A2 receptors in the rat brain using the A2-selective agonist[3H]CGS21680.Eur J Pharmacol 168：243-6.

Kaplan GB，Bharmal NH，Leite-Morris KA，Adams WR(1999)Role ofadenosine Ai and A2 receptors in the alcohol withdrawal syndrome.Alcohol19：157-162.

Krauss SW，Ghimikar RB，Diamond I，Gordon AS(1993)Inhibition ofadenosine uptake by ethanol is specific for one class of nucleoside transporters.MoI Pharmcol 44：1021-6.

Koob GF，Vaccarino FJ，Amalric M，Swerdlow NR(1986)Neural Substratesfor Cocaine and Opiate Reinforcement，in Cocaine：Clinical and Biobehavioralaspects(Fisher S，Raskin A，Uhlenhuth EH eds)，pp 80-108.Oxford UniversityPress，Inc.，New York.

Ledent C，Vaugeois J-M，Schiffmann SN，Pedrazzin T，El Yacoubi M，Vanderhaegen J-J，Costentin J，Heath JK，Vassart G，ParmentierM(1997)Aggressiveness，hypoalgesia and high blood pressure in mice lacking theadenosine A2A receptor.Nature 388：674-678.

Malec D，Michalska E，Pikulicka J(1996)Influence of adenosinergic drugson ethanol withdrawal syndrome in rats.Pol J Pharmacol 48：583-8.

Naassila M，Ledent C，Daoust M(2002)Low ethanol sensitivity andincreased ethanol consumption in mice lacking adenosine A2A receptors.JNeurosci 22：10487-10493.

Nagy LE，Diamond I，Casso DJ，Franklin C，Gordon AS(1990)Ethanolincreases extracellular adenosine by inhibiting adenosine uptake via thenucleoside transporter.Journal of Biological Chemistry 265：1946-1951.

Nikodijevic O，Sarges R，Daly JW，Jacobson KA(1991)B ehavioral effects ofA1-and A2-selective adenosine agonists and antagonists：Evidence for synergismand antagonism.J Pharmacol Exp Ther 259：286-294.

Orrego H，Carmichael FJ，and Israel Y(1988a)New insights on themechanism of the alcohol-induced increase in portal blood flow.Can J Pharmacol66：1-9.

Orrego H，Carmichael FJ，Saldivia V，Giles HG，Sandrin S，and IsraelY(1988b)Ethanol-induced increase in portal blood flow：role of adenosine.AmerPhysiol Soc G495-G501.

Samson HH(1986)Initiation of ethanol reinforcement using asucrose-substitution procedure in food-and water-sated rats.Alcohol Clin ExpRes 10：436-442.

Samson HH，Hodge CW，Tolliver GA，Haraguchi M(1993)Effect ofdopamine agonists and antagonists on ethanol reinforced behavior：theinvolvement of the nucleus accumbens.Brain Res Bull 30：133-141.

Seale TW，AbIa KA，Shamim MT，Carney JM，DalyJW(1988)3，7-Dimethyl-1-propargylxanthine：A potent and selective in vivoantagonist of adenosine analogs.Life Sciences(43)：1671-1684.

Sebastiao AM，Ribeiro JA(1992)Adenosine A2 receptor-mediated excitatoryactions on the nervous system.Prog Neurobiol 48：167-189.

Svenningsson P，Hall H，Sedvall G and Fredholm BB(1997a)Distribution ofadenosine receptors in the postmortem human brain：an extendedautoradiographic study.Synapse 27：322-335.

Svenningsson P，Le Moine C，Fisone G，Fredholm BB(1999)Distribution，biochemistry and function of striatal adenosine A2A receptors.Progress inNeurobiology 59：355-396.

Svenningsson P，Nomiko GG，Ongini E，Fredholm BB(1997b)Antagonismof adenosine A2A receptors underlies the behavioural activating effect of caffeineand is associated with reduced expression of messenger RNA for NGFI-A andNGFI-B in caudate-putamen and nucleus accumbens.Neuroscience 79：753-764.

Weiss F，Lorang MT，Bloom FE，Koob GF(1993)Oral alcoholself-administration stimulates dopamine release in the rat nucleus accumbens：genetic and motivational determinants.J Pharmacol Exp Ther 267：250-258.

Weiss F，Mitchiner M，Bloom FE，Koob GF(1990)Free-choice respondingfor ethanol versus water in alcohol preferring(P)and unselected Wistar rats isdifferentially modified by naloxone，bromocriptine and methysergide.Psychopharmacology(Berl)101：178-186.

Weiss F，Parsons LH，Shulteis G，Hyytia P，Lorang MT，Bloom FE，KoobGF(1996)Ethanol self administration restores withdrawal associated deficienciesin accumbal dopamine and 5-hydroxytryptamine release in dependent rats.JNeurosci 16：3474-3485.

Weiss F，Porrino LJ(2002)Behavioral neurobiology of alcohol addiction：recent advances and challenges.J Neurosci 22：3332-3337.

Yao L，Arolfo MP，Dohrman DP，Jiang Z，Fan P，Fuchs S，Janak PH，GordonAS，and Diamond I(2002)[beta][gamma]dimers mediate synergy of dopamineD2 and adenosine A2 receptor-stimulated PKA signaling and regulate ethanolconsumption.Cell 109：733-743.

表1：DMPX、DPCPX和依替必利对无效杠杆压下的影响。

DMPX
												盐水n＝182.92±0.45	1mg/kgn＝102.60±0.85			3mg/kgn＝101.50±0.37	5mg/kgn＝83.56±1.29			7mg/kgn＝83.93±2.17	10mg/kgn＝103.60±1.76		20mg/kgn＝83.87±0.64
DPCPX
												载体n＝72.71±0.56			0.125mg/kgn＝71.78±0.62				0.25mg/kgn＝72.36±1.08			0.5mg/kgn＝72.86±0.88
依替必利
												盐水n＝52.00±0.67		0.005mg/kgn＝52.00±0.58				0.007mg/kgn＝51.00±0.41				0.01mg/kgn＝51.83±0.98

要理解的是，在此描述的实施例和实施方案仅用于说明性的目的，根据这些进行的各种修改或变化将为本领域的技术人员提供启发，并要被包括在本申请的精神和范围、以及附随的权利要求的范围内。在此引用的所有出版物、专利和专利申请为了各种目的、通过以它们的整体引用而合并在此。

Claims (50)

1.缓解哺乳动物与长期消耗滥用物质或由此戒断有关的成瘾行为的一种或多种构成的方法，所述方法包括：

向表现成瘾行为的一种或多种构成的所述哺乳动物以足以改善所述成瘾行为的一种或多种构成的量给药腺苷A2A受体拮抗剂，其中所述A2A受体拮抗剂不是咖啡因。

2.权利要求1的方法，其中所述腺苷A2A受体拮抗剂选自(-)-R，S)-甲氟喹、3，7-二甲基-1-炔丙基黄嘌呤(DMPX)、3-(3-羟丙基)-7-甲基-8-(间-甲氧基苯乙烯基)-1-炔丙基黄嘌呤(MX2)、3-(3-羟丙基)-8-(3-甲氧基苯乙烯基)-7-甲基-1-炔丙基黄嘌呤磷酸二钠盐(MSX-3)、7-甲基-8-苯乙烯基黄嘌呤衍生物、SCH 58261、KW-6002、氨基呋喃基三唑并-三嗪基氨基乙基苯酚(ZM 241385)和8-氯苯乙烯基咖啡因、KF17837、VR2006、istradefylline、VER-11135、VER-6409、VER 6440、VER 6489、VER 6623、VER 6947、VER 7130、VER7146、VER 7448、VER 7835、VER 8177、吡唑并[4，3-e]1，2，4-三唑并[1，5-c]嘧啶和5-氨基-咪唑并-[4，3-e]-1，2，4-三唑并[1，5-c]嘧啶。

3.权利要求1的方法，其中所述拮抗剂基本上不拮抗腺苷A1A受体。

4.权利要求1的方法，其中所述滥用物质选自乙醇、阿片制剂、大麻素、烟碱和兴奋剂。

5.权利要求1的方法，其中所述滥用物质选自吗啡、海洛因、大麻、印度大麻、可卡因和安非他明。

6.权利要求1的方法，其中所述滥用物质是乙醇。

7.权利要求1的方法，其中所述成瘾行为的构成是长期自我施用所述滥用物质。

8.权利要求1的方法，其中所述成瘾行为的构成是对所述滥用物质的渴求。

9.权利要求1的方法，其中所述成瘾行为的构成是寻求所述滥用物质行为的恢复。

10.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是参与长期消耗滥用物质的哺乳动物。

11.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是已经停止长期消耗滥用物质的哺乳动物。

12.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是患有一种或多种戒断综合征的哺乳动物。

13.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。

14.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是没有患上帕金森氏病的人。

15.权利要求1的方法，其中所述拮抗剂是全身地给药。

16.权利要求1的方法，其中所述拮抗剂通过选自下列途径给药：口服给药、鼻部给药、直肠给药、腹膜内注射、血管内注射、皮下注射、经皮给药、吸入给药和肌肉注射。

17.权利要求1的方法，其中所述拮抗剂被配制为单位剂量制剂。

18.权利要求1的方法，其中所述拮抗剂被配制为定时释放制剂。

19.权利要求1的方法，其中所述方法还包括与所述腺苷A2A受体拮抗剂组合给药多巴胺D2受体拮抗剂。

20.权利要求19的方法，其中在所述腺苷A2A受体拮抗剂之前给药所述多巴胺D2受体拮抗剂。

21.权利要求19的方法，其中在所述腺苷A2A受体拮抗剂之后给药所述多巴胺D2受体拮抗剂。

22.权利要求19的方法，其中与所述腺苷A2A受体拮抗剂同时给药所述多巴胺D2受体拮抗剂。

23.权利要求19的方法，其中所述腺苷A2A受体拮抗剂和所述多巴胺D2受体拮抗剂被配制为单一化合物制剂。

24.权利要求19的方法，其中所述多巴胺D2受体拮抗剂选自布他拉莫、氯丙嗪、多潘立酮、氟非那嗪、氟哌啶醇、异芳基哌啶、甲氧氯普胺、奥氮平、盐酸哌罗匹隆水合物、吩噻嗪、匹莫齐特、喹硫平、利哌利酮、舍吲哚、舒必利、齐拉西酮和佐替平。

25.用于缓解哺乳动物与长期消耗滥用物质或由此戒断有关的成瘾行为的一种或多种构成的组合物，所述组合物包括：腺苷A2A受体拮抗剂；和多巴胺D2受体拮抗剂。

26.权利要求25的组合物，其中所述多巴胺D2受体拮抗剂选自布他拉莫、氯丙嗪、多潘立酮、氟非那嗪、氟哌啶醇、异芳基哌啶、甲氧氯普胺、奥氮平、盐酸哌罗匹隆水合物、吩噻嗪、匹莫齐特、喹硫平、利哌利酮、舍吲哚、舒必利、齐拉西酮和佐替平。

27.权利要求25的组合物，其中所述腺苷A2A受体拮抗剂选自(-)-R，S)-甲氟喹、3，7-二甲基-1-炔丙基黄嘌呤(DMPX)、3-(3-羟丙基)-7-甲基-8-(间-甲氧基苯乙烯基)-1-炔丙基黄嘌呤(MX2)、3-(3-羟丙基)-8-(3-甲氧基苯乙烯基)-7-甲基-1-炔丙基黄嘌呤磷酸二钠盐(MSX-3)、7-甲基-8-苯乙烯基黄嘌呤衍生物、SCH 58261、KW-6002、氨基呋喃基三唑并-三嗪基氨基乙基苯酚(ZM241385)和8-氯苯乙烯基咖啡因、KF17837、VR2006、istradefylline、VER-11135、VER-6409、VER 6440、VER 6489、VER 6623、VER 6947、VER 7130、VER 7146、VER 7448、VER 7835、VER 8177、吡唑并[4，3-e]1，2，4-三唑并[1，5-c]嘧啶、5-氨基-咪唑并-[4，3-e]-1，2，4-三唑并[1，5-c]嘧啶。

28.用于缓解哺乳动物与长期消耗滥用物质或由此戒断有关的成瘾行为一种或多种构成的试剂盒，所述试剂盒包括：

含有一种或多种腺苷A2A受体拮抗剂的容器，其中所述一种或多种腺苷A2A受体拮抗剂的至少一种不是咖啡因；和

教导在哺乳动物的物质滥用治疗中使用所述腺苷A2A受体拮抗剂的指导材料。

29.权利要求28的试剂盒，其中所述一种或多种腺苷A2A受体拮抗剂包含选自下列的拮抗剂：(-)-R，S)-甲氟喹、3，7-二甲基-1-炔丙基黄嘌呤(DMPX)、3-(3-羟丙基)-7-甲基-8-(间-甲氧基苯乙烯基)-1-炔丙基黄嘌呤(MX2)、3-(3-羟丙基)-8-(3-甲氧基苯乙烯基)-7-甲基-1-炔丙基黄嘌呤磷酸二钠盐(MSX-3)、7-甲基-8-苯乙烯基黄嘌呤衍生物、SCH 58261、KW-6002、氨基呋喃基三唑并-三嗪基氨基乙基苯酚(ZM 241385)和8-氯苯乙烯基咖啡因、KF17837、VR2006、istradefylline、VER-11135、VER-6409、VER 6440、VER6489、VER 6623、VER 6947、VER 7130、VER 7146、VER 7448、VER 7835、VER 8177、吡唑并[4，3-e]1，2，4-三唑并[1，5-c]嘧啶、5-氨基-咪唑并-[4，3-e]-1，2，4-三唑并[1，5-c]嘧啶。

30.权利要求28的试剂盒，其中所述拮抗剂基本上不拮抗腺苷A1A受体。

31.权利要求28的试剂盒，其中所述滥用物质选自乙醇、阿片制剂、大麻素、烟碱和兴奋剂。

32.权利要求28的试剂盒，其中所述滥用物质选自吗啡、海洛因、大麻、印度大麻、可卡因和安非他明。

33.权利要求28的试剂盒，其中所述滥用物质是乙醇。

34.权利要求28的试剂盒，其中所述成瘾行为的构成是长期自我施用所述滥用物质。

35.权利要求28的试剂盒，其中所述成瘾行为的构成是对所述滥用物质的渴求。

36.权利要求28的试剂盒，其中所述成瘾行为的构成是寻求所述滥用物质行为的恢复。

37.权利要求28的试剂盒，其中所述拮抗剂被配制为通过选自下列的途径给药：口服给药、鼻部给药、直肠给药、腹膜内注射、血管内注射、皮下注射、经皮的给药、吸入给药和肌肉注射。

38.权利要求28的试剂盒，其中所述拮抗剂被配制为单位剂量制剂。

39.权利要求28的试剂盒，其中所述拮抗剂被配制为定时释放制剂。

40.筛选抑制与长期消耗滥用物质有关的成瘾行为的一种或多种构成的药物的方法，所述方法包括：

提供一种或多种待测药物；和

筛选所述待测药物抑制腺苷A2A受体表达或活性的能力，其中腺苷A2A受体表达或活性的抑制表明所述一种或多种待测药物是用于抑制与长期消耗滥用物质或由此戒断有关的成瘾行为的一种或多种构成的候选药物。

41.权利要求5的方法，其中所述筛选包括筛选所述待测药物结合A2A受体的能力。

42.权利要求41的方法，其中所述筛选还包括筛选所述待测药物抑制操作性自我施用所述滥用物质的能力。

43.权利要求41的方法，其中所述筛选还包括筛选所述待测药物抑制寻求所述滥用物质行为的恢复的能力。

44.权利要求40-43的任一项的方法，其中所述滥用物质选自乙醇、阿片制剂、大麻素、烟碱和兴奋剂。

45.权利要求40-43的任一项的方法，其中所述滥用物质选自吗啡、海洛因、大麻、印度大麻、可卡因和安非他明。

46.筛选药物的方法，所述药物抑制与长期消耗滥用物质有关的成瘾行为的一种或多种构成，所述方法包括：

提供一种或多种推定的腺苷A2A受体拮抗剂；以及

筛选所述待测药物抑制与长期消耗滥用物质或由此戒断有关的成瘾行为的一种或多种构成的能力。

47.权利要求46的方法，其中所述筛选包括筛选所述待测药物抑制操作性自我施用所述滥用物质的能力。

48.权利要求46的方法，其中所述筛选还包括筛选所述待测药物抑制寻求所述滥用物质行为的恢复的能力。

49.权利要求46-48的任一项的方法，其中所述滥用物质选自兴奋剂、阿片制剂、大麻素、烟碱和乙醇。

50.权利要求46-48的任一项的方法，其中所述滥用物质选自吗啡、海洛因、大麻、印度大麻、可卡因和安非他明。

Images