CN102014959B - 血脑屏障通透性的调节 - Google Patents

Abstract

本发明涉及增加受治疗者血脑屏障通透性的方法。该方法包括选择将受益于增加血脑屏障通透性的受治疗者，并且使所选择的受治疗者接受治疗。在有效增加所述受治疗者血脑屏障通透性的条件下，该治疗提高腺苷水平和/或生物利用率，调节腺苷受体，和/或提高CD73水平和/或活性。还公开了降低受治疗者血脑屏障通透性、治疗受治疗者的中枢神经系统疾患或病症和筛选有效增加血脑屏障通透性的化合物的方法，以及药剂。

Description

血脑屏障通透性的调节

本申请要求2008年3月10日提交的美国临时申请系列第61/035,250号和2008年3月17日提交的美国临时申请系列第61/037,145号的权益，其全部内容通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及血脑屏障通透性的调节。

发明背景

血液进入中枢神经系统(“CNS”)的屏障在此处总体称作血脑屏障(“BBB”)。BBB是一种覆盖在大脑中400英里的毛细血管和血管上的非常紧密的内皮细胞层(Ransohoff等人，“ThreeorMoreRoutesforLeukocyteMigrationIntotheCentralNervousSystem(白细胞迁入中枢神经系统的三种或更多种途径)，”NatureRev.Immun.3：569-581(2003))。BBB细胞之间几乎不可渗透的连接是由约20种不同类型的蛋白质交错结合形成的。分子要进入BBB细胞就必须通过膜嵌入蛋白转运蛋白或通过穿过它的蜡质外膜直接滑入。一旦进入，外来的化合物必须避免高浓度的代谢酶和各种各样准备好消除外来物质的泛宿主性蛋白泵。在避免了这些障碍以后，外来分子接着必须穿过BBB细胞的内膜最终到达大脑。这些精细的防御允许BBB将大脑与潜在危害隔离，但是BBB也会阻碍神经学的药物递送至大脑中的患病位点。学术界、生物技术和制药工业的研究人员在研究绕过BBB或者允许它让潜在的药物进入大脑。他们正在设计可以被动扩散穿过BBB或者通过营养素转运蛋白输送进入大脑内部的小药物。其他研究人员在附加所设计的潜在治疗药物，这样使大脑会无意的吞食它们。

为大脑组织提供血液的毛细血管构成了血脑屏障(Goldstein等人，“TheBlood-BrainBarrier(血脑屏障)，”ScientificAmerican255：74-83(1986)；Pardridge，“Receptor-MediatedPeptideTransportThroughtheBlood-BrainBarrier(受体介导的肽转运通过血脑屏障)，”Endocrin.Rev.7：314-330(1986))。形成大脑毛细血管的内皮细胞与在身体其他组织中发现的内皮细胞不同。大脑毛细血管内皮细胞由紧密的细胞间连接结合在一起，其形成一个抵抗分子从血液到大脑和中枢神经系统(CNS)其他部分的被动运输的连续的壁。这些细胞的与众不同还在于，它们有很少的胞饮小泡，在其他组织中，这些胞饮小泡允许一些非选择性运输穿过毛细血管壁。同样缺少的是允许无限制的通过的细胞之间运转的连续空隙或者通路。

血脑屏障的功能在于确保大脑的环境始终被控制。血液中的各种物质(如激素类、氨基酸和离子)的水平经历频繁微小的波动，这些波动可以由例如进食和运动等活动造成(Goldstein等人，“TheBlood-BrainBarrier(血脑屏障)，”ScientificAmerican255：74-83(1986)；Pardridge，“Receptor-MediatedPeptideTransportThroughtheBlood-BrainBarrier(受体介导的肽转运通过血脑屏障)，”Endocrin.Rev.7：314-330(1986))。如果大脑在这些血清构成变化中不受血脑屏障的保护，结果可能是不受控制的神经活动。

大脑与血流的分离并不是完全的。假如是完全分离的，大脑将会由于缺乏营养素和由于需要与身体其他部分交换化学物质而不能正常发挥功能。在毛细血管内皮细胞中特殊转运系统的存在确保大脑以受控制的方式接收正常的生长和功能需要的所有化合物。在很多情况中，这些转运系统由膜结合蛋白组成，这些蛋白有选择的结合和转运某些分子穿过屏障膜。这些转运蛋白被认为是溶质载体转运蛋白。

尽管人们认为BBB通过保护CNS不暴露在潜在的毒素化合物中而提供了在正常情况下的保护功能，但在CNS疾病中，BBB可能通过妨碍治疗性化合物进入CNS中而阻碍治疗效果。例如，尽管感染部位在CNS外的许多细菌和真菌的感染可能容易得到治疗，但是当这样的感染发生在CNS内时往往非常危险，并且由于不能递送有效剂量的药物至感染部位而非常难于治疗。相似的，BBB的功能使大脑癌症的治疗比位于CNS外部的癌症的治疗更困难。即使可以通过在CNS外部施用非常大量的药物来递送有效剂量的药物到CNS中，但是CNS外部(例如在血液中)的药物水平经常会非常高，以至于达到有害于肾脏、肝脏和其他重要器官的毒性水平。据此，在现有技术中对改进化合物递送至CNS中的方法存在需要。

此外，患有水肿、脑创伤、中风和多发性硬化症的患者表现出了初始损伤部位附近BBB的破坏。破坏的水平可能对这些疾病的临床结果有深远影响。例如，患有多发性硬化症(“MS”)的患者的BBB破坏程度与该疾病的严重性相互关联。利用磁共振成像(“MRI”)已显示，当人正处于MS“发作”时，血脑屏障已经在大脑或脊髓的部分裂开，允许被称为T淋巴细胞的白血细胞穿过和破坏髓磷脂。

除了这种屏障的重要性，对控制BBB的完整性和/或通透性的分子机制了解还很少。因此，对促进此类研究的组合物和方法以及尤其对诊断和/或治疗性应用还存在相当大的需要。

本发明是针对克服现有技术的这些和其他不足之处。

发明概述

本发明涉及增加受治疗者血脑屏障通透性的方法。该方法包括选择将受益于增加血脑屏障通透性的受治疗者，并且使所选的受治疗者接受治疗。在有效增加受治疗者血脑屏障通透性的条件下，该治疗会提高腺苷水平和/或生物利用率，调节腺苷受体，和/或提高CD73水平和/或活性。

本发明还涉及降低受治疗者血脑屏障通透性的方法。该方法包括选择将受益于减少血脑屏障通透性的受治疗者，并且使所选的受治疗者接受治疗。在有效降低受治疗者血脑屏障通透性的条件下，该治疗会减少腺苷水平和/或生物利用率，调节腺苷受体，和/或降低CD73水平和/或活性。

本发明还涉及治疗受治疗者的中枢神经系统疾患或病症的方法。该方法包括选择患有中枢神经系统疾患或病症的受治疗者，并且提供有效治疗所述中枢神经系统疾患或病症的治疗药物。提供了一种血脑屏障透化剂，其中该剂提高腺苷水平和/或生物利用率，调节腺苷受体，和/或提高CD73水平和/或活性。在使治疗药物有效穿过血脑屏障并且治疗疾患或病症的条件下，该治疗药物和血脑屏障透化剂被施用于所选的受治疗者。

本发明还涉及筛选有效增加血脑屏障通透性的化合物的方法。该方法包括提供与未改造动物(unmodifiedanimal)相比具有降低的CD73表达水平、降低的腺苷表达水平、和/或调节的腺苷受体活性的改造动物(modifiedanimal)。还提供了一种或多种候选化合物，并且所述一种或多种候选化合物被施用于所述改造动物上。接着，评估所述一种或多种候选化合物是否提高了腺苷水平和/或生物利用率，调节腺苷受体，和/或提高CD73水平和/或活性。那些提高所述改造动物的腺苷水平或生物利用率，调节腺苷受体，和/或提高CD73水平和/或活性的候选化合物随即被鉴定为能潜在有效地增加血脑屏障通透性。

本发明还涉及一种药剂。该药剂具有一种有效治疗中枢神经系统疾患或病症的治疗药物和血脑屏障透化剂。该剂提高腺苷水平和/或生物利用率，调节腺苷受体，和/或提高CD73水平和/或活性。

本发明的方法和药剂提供了对患有影响血脑屏障的疾患的受治疗者的改进疗法。此外，本发明提供了控制血脑屏障来增强这些患者的治疗处理的改进方法。

附图简述

图1所示的图显示cd7^3-/-小鼠对实验性自身免疫性脑脊髓炎(“EAE”)具有耐受性。诱导了EAE，每天监测疾病活动，然后由cd7^3-/-小鼠(空心菱形，n＝11)和野生型小鼠(cd73^+/+)(实心方形，n＝13)计算平均EAE得分。所示结果是11个独立实验的代表。

图2A-D显示当转移至cd73^+/+tcrα^-/-小鼠时，cd73^-/-T淋巴细胞产生了升高的IL-1β和IL-17水平并介导EAE易感性。图2A显示来自天然的和EAE诱导后13日的cd73^-/和^-野生型小鼠的脾细胞上测量的CD4和FoxP3的表达。图2B显示了通过流式细胞术分析来自天然野生型小鼠和MOG免疫后13日的野生型小鼠的脾细胞中CD4和CD73的细胞表面表达。图2C显示从免疫的野生型或cd73^-/-小鼠中分选的细胞，这些细胞是用1x10⁴个受辐照的脾细胞以及0或10μMMOG肽培养的。在18小时时取上清液，进行细胞因子生物复合体(Bio-plex)分析。结果表示从0到10μMMOG肽各组之间细胞因子水平的倍比变化。样品是由4只小鼠混合得到的，并且代表了三个相似实验中的一个。图2D显示来自于经MOG免疫的cd73^-/-小鼠(空心菱形，n＝5)或野生型小鼠(实心方形，n＝5)的脾脏和淋巴结的CD4⁺T细胞，它们被过继转移进入T细胞缺陷的cd73^+/+tcrα^-/-小鼠。诱导EAE并且每天监测疾病的进程。结果代表了两组独立实验。

图3A-L显示了在EAE诱导后显示很少或不显示CNS淋巴细胞浸润的cd73^-/-小鼠；在EAE的诱导后，供体cd73^-/-T细胞浸润了cd73^+/+tcrα^-/-受体小鼠的CNS。来自EAE诱导后13日的野生型小鼠(图3A-C)和cd73^-/-型(图3D-F)小鼠的冷冻组织切片用CD4抗体标记。图3G显示，经EAE诱导13日的野生型和cd73^-/-小鼠的冷冻组织切片的每个视野内所定量的大脑和脊髓中浸润的CD4⁺淋巴细胞的平均数目。用10×放大率分析每只小鼠的每个大脑切片中的8个解剖学上相似的视野和每个脊髓切片中的4个视野(n＝5只小鼠/组)。误差棒代表平均值的标准误差。图3H-L显示了用CD4抗体标记的来自EAE诱导的tcrα^-/-小鼠的海马区(图3H、3I和3K)和小脑(图3J和3L)的冷冻组织切片，这些tcrα^-/-小鼠接受了来自EAE诱导后12日(图3K)、18日(图3H和3L)或22日(图3I和3J)的野生型小鼠(图3H-J)或cd73^-/-小鼠(图3K-L)的CD4⁺细胞。用HRP抗大鼠Ig加上AEC(红色)对比苏木素染色的细胞核背景(蓝色)检测免疫反应性。箭头表示淋巴细胞浸润位点。比例尺表示500μm。

图4A-K显示了在EAE诱导后显示很少或不显示CNS淋巴细胞浸润的cd73^-/-小鼠；cd73^-/-T细胞在转移进入cd73^+/+tcrα^-/-小鼠和EAE诱导后浸润了CNS。来自EAE诱导后13日的野生型小鼠(图4A-C)和cd73^-/-小鼠(图4D-F)的冷冻组织切片用CD45抗体标记。来自EAE诱导的tcrα^-/-小鼠的海马区(图4G、4H和4J)和小脑(图4I和4K)的冷冻组织切片用CD45抗体标记，这些tcrα^-/-小鼠接受了来自EAE诱导后12日(图4J)、18日(图4G和4K)或22日(图4H和4I)的野生型小鼠(图4G-I)或cd73^-/-小鼠(图4J-K)的CD4⁺细胞。用HRP抗大鼠Ig加上AEC(红色)对比苏木素染色的细胞核背景(蓝色)检测免疫反应性。箭头表示淋巴细胞浸润位点。比例尺表示500μm。

图5A-C显示了髓磷脂特异性T细胞并未有效地进入EAE诱导后的cd73^-/-小鼠的大脑。从脾脏和淋巴结分离出来自MOG_35-55免疫的转基因2d2小鼠的、表达MOG_35-55的特异性TCR的Vβ11⁺T细胞，并且将其过继转移进入伴随EAE诱导的野生型或cd73^-/-小鼠。在转移和EAE诱导后的第1、3、8和15日，移除脾脏(图5A)、淋巴结(图5B)和大脑(图5C)并收获细胞。通过流式细胞术分析细胞的CD45和Vβ11的表达。数据代表了在每个给定日每个器官的CD45⁺群体中Vβ11⁺细胞百分比的相对倍比变化(RFC)。数值被标准化为在转移/EAE诱导后第1天每个器官中发现的细胞的百分比，其中1.0等于基线值。

图6A-D显示来自野生型小鼠的过继转移的CD73⁺T细胞能够给予cd73^-/-小鼠EAE易感性。图6A显示来自MOG免疫的野生型小鼠的脾脏和淋巴结的CD4⁺T细胞被富集，并且被过继转移至伴随性EAE诱导后的野生型小鼠(实心方块，n＝5)或cd73^-/-小鼠(空心菱形，n＝5)。结果显示了两个独立实验中的一个。图6B显示，来自之前免疫的野生型和cd73^-/-小鼠的脾脏和淋巴结的T细胞以CD4和CD73的表达为基础进行分选，并且被过继转移至伴随性EAE诱导后的cd73^-/-小鼠(n＝5/每组)。实心方块代表来自野生型小鼠的表达CD73的供体细胞；空心方块代表来自野生型小鼠的缺乏CD73表达的供体细胞；空心菱形代表来自cd73^-/-小鼠的供体细胞。图6C-D显示了来自天然的野生型小鼠(图6C，左)和cd73^-/-小鼠(图6C，右)与EAE诱导后12日的野生型小鼠(图6D)的CNS脉络丛冷冻组织切片用CD73(图6C)或CD45(图6D)特异性抗体染色。用HRP抗大鼠Ig加上AEC(红色)对比苏木素染色的细胞核背景(蓝色)检测免疫反应性。括弧表示CD73染色。箭头表示CD45淋巴细胞染色。比例尺表示500μm。

图7A-D显示腺苷受体的阻断保护小鼠防止EAE形成。图7A显示当诱导EAE时的平均EAE得分，每日监测疾病活动，并且计算出只给予饮用水(实心形状)或者补充了0.6g/ml广谱腺苷受体拮抗剂咖啡因的饮用水(空心形状)的野生型小鼠(方块)和cd73^-/-小鼠(菱形)的平均EAE得分。结果来自于1个实验(n＝5只小鼠每组)。图7B显示在Z310鼠类脉络丛细胞系中腺苷受体相对于GAPDH管家基因的mRNA表达水平。样品使用3个重复；误差棒代表平均值的标准误差。图7C显示小鼠在EAE诱导前1日至后30日每日用45％DMSO中的2mg/kg(1mg/kg皮下和1mg/kg腹膜内注射)A_2a腺苷受体拮抗剂SCH58261(实心方块，n＝4只小鼠/组)或仅45％DMSO(空心方块，n＝5只小鼠/组)处理后的结果。这些结果代表了两个试验。图7D显示了SCH58261和DMSO处理的小鼠EAE诱导后15日的冷冻组织切片中每个视野所定量的大脑和脊髓中的浸润CD4⁺淋巴细胞的平均数目。用10×放大率分析每只小鼠的每个大脑切片中的8个解剖学上相似的视野和每个脊髓切片中4个视野(n＝4只小鼠)。误差棒代表了平均值的标准误差。

图8显示了A_2a腺苷受体拮抗剂SCH58261阻止在EAE诱导后脉络丛上ICAM-1的上调。小鼠在EAE诱导前1日至诱导后30日每日用DMSO中的2mg/kg(皮下给予1mg/kg和腹膜内给予1mg/kg)A_2a腺苷受体拮抗剂SCH58261(n＝4只小鼠/组)或仅DMSO(n＝5只小鼠/组)处理。这些结果来自一个试验。检验来自SCH58261和DMSO处理的小鼠EAE诱导后15日的冷冻组织切片的脉络丛ICAM-1的表达。DMSO(左)或SCH58261(右)处理野生型，并以40倍放大率染色，ICAM-1(染红色，白色箭头)和DAPI(蓝色，细胞核)。图像来自于4只独立的小鼠。

图9A-B显示因缺乏细胞外腺苷而不能通过腺苷受体充分地发信号的CD73^-/-小鼠用NECA处理，结果相比于PBS对照，其染料迁移增加几乎5倍(图9A)。经NECA处理的野生型小鼠也显示高于对照(图9B)。已知百日咳能在小鼠EAE模型中诱导血脑屏障泄漏，因此用它作为阳性对照。

图10显示了人类内皮细胞系hCMEC/D3中腺苷受体的表达。

图11显示了在如下步骤后的结果：将hCMEC/D3细胞接种于transwell膜上并让其生长到汇合；在上层小室中加入2×10⁶个Jurkat细胞，同时加入或不加入NECA(普通腺苷受体[AR]激动剂)、CCPA(A1AR激动剂)、CGS21680(A2AAR激动剂)或者DMSO载体；并于24小时后对迁移细胞计数。

图12显示了在如下步骤后的结果：将Z310细胞接种于transwell膜上并让其生长到汇合；在上层小室中加入2x10⁶个Jurkat细胞，同时加入或不加入NECA(n＝1，普通AR激动剂)、CCPA(n＝1，A1AR激动剂)、CGS21680(n＝1，A2AAR激动剂)或者DMSO载体(n＝1)；并于24小时后对迁移细胞计数。

图13显示了在如下步骤后的结果：使hCMEC/D3细胞在24孔板上生长至汇合；细胞用或不用不同浓度的NECA(普通AR激动剂)、CCPA(A1AR激动剂)、CGS21680(A2AAR激动剂)、DMSO载体或者毛喉素(Forksolin)(诱导cAMP)处理；15分钟后加入裂解缓冲液，并在-80℃冷冻细胞以终止反应；并用cAMPScreen试剂盒(AppliedBiosystems,Foster,CA)测定cAMP水平。

图14显示了敲除A1腺苷受体(A1ARKO，n＝5)的雌性小鼠和野生型(WT，n＝5)的雌性小鼠在用CFA/MOG_35-55+PTX在2008年12月2日免疫后41日的每日得分结果。

图15A-B显示了喂饲咖啡因的野生型小鼠的大脑和喂饲咖啡因的CD73^-/-小鼠的大脑，由外渗穿过大脑内皮的异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-Dextran)测量。

图16以图形式显示了异硫氰酸荧光素-葡聚糖外渗穿过用腺苷受体激动剂NECA处理的野生型小鼠的血脑屏障、而SCH58261腺苷受体拮抗剂抑制异硫氰酸荧光素-葡聚糖外渗的结果。

图17显示了在小鼠用腺苷激动剂NECA处理后，用BioTex分光光度计于620nm测量的伊文思蓝染料外渗穿过血脑屏障的结果。

发明详述

本发明的一个方面涉及增加受治疗者血脑屏障通透性的方法。该方法包括选择将受益于增加血脑屏障通透性的受治疗者，并且使所选的受治疗者接受治疗。在有效增加受治疗者血脑屏障通透性的条件下，该治疗会提高腺苷水平和/或生物利用率，调节腺苷受体，和/或提高CD73水平和/或活性。

腺苷是在含氧量低、局部缺血或炎症条件下产生的代谢困难的细胞信号。它的主要作用是通过不同的受体介导机制来降低组织创伤和促进修复，所述受体介导机制包括增加氧气的供给/需求比、预先调节、抗炎作用和刺激血管发生，(Jacobson等人，“AdenosineReceptorsasTherapeuticTargets(作为治疗靶的腺苷受体)，”Nat.Rev.DrugDiscov.5：247-264(2006)，其全部内容通过引用并入本文。腺苷的生物学效应最终由在特定的细胞类型中四种已知的腺苷受体(“AR”)亚型的不同受体分布模式和/或亲和力决定。

CD73(外-5′-核苷酸酶)是一个具有外切酶活性的70-kD的糖基-磷脂酰肌醇-锚定的细胞表面分子。它在许多细胞类型中大量表达，这些细胞类型包括淋巴细胞亚群(Yamashita等人，“CD73ExpressionandFyn-DependentSignalingonMurineLymphocytes，(鼠类淋巴细胞上的CD73表达和Fyn依赖性信号传导)”Eur.J.Immunol.28：2981-2990(1998)，其全部内容通过引用并入本文)、内皮细胞(Yamashita等人，“CD73ExpressionandFyn-DependentSignalingonMurineLymphocytes，(鼠类淋巴细胞上的CD73表达和Fyn依赖性信号传导)”Eur.J.Immunol.28：2981-2990(1998)，其全部内容通过引用并入本文)和上皮细胞(Strohmeier等人，“SurfaceExpression，Polarization，andFunctionalSignificanceofCD73inHumanIntestinalEpithelia，(在人类肠上皮中CD73的表面表达、极化和功能重要性)”J.Clin.Invest.99：2588-2601(1997)，其全部内容通过引用并入本文)。它是通过将核苷-5’-单磷酸(AMP和IMP)降解成为核苷酸(如腺苷和肌苷)的嘌呤补救合成途径的一部分。

控制CD73的适宜方法包括施用重组CD73蛋白，或者通过细胞因子或另一种能够诱导内皮CD73表达的因子，或者通过联合授予Jalkanen的美国专利申请公开号2006/0198821A1中所述的两种疗法，其全部内容通过引用并入本文。更具体地说，本发明使用的适宜的药剂包括细胞因子或其他能直接或间接地上调CD73基因转录的因子。本发明使用的适宜的细胞因子通常是干扰素或白介素，但也可使用其他药剂。若细胞因子是干扰素，干扰素可能是α-、β-、γ-、ω-或者任何其他的干扰素，并且可以是前面提到的干扰素中的任何亚型。人们相信，尤其α-、β-干扰素是适合本发明使用的。任何能够诱导内皮CD73表达的白介素也适合本发明使用。这样的白介素的实例包括IL-4、IL-10、IL-13和IL-20。

在一个实施方案中，通过提高表达或通过直接施用重组CD73蛋白获得了升高的CD73水平，为了保护由此而产生的腺苷源，将施用重组CD73蛋白或细胞因子或二者共同施用与施用腺苷一磷酸(“AMP”)相联合。

施用重组CD73蛋白或细胞因子或二者共同施用可以与施用防止AMP转化为腺苷二磷酸(“ADP”)或腺苷三磷酸(“ATP”)的腺苷酸激酶抑制剂同时进行。

可替代的，施用重组CD73蛋白或细胞因子或二者共同施用可以与防止腺苷分解的腺苷脱氨酶抑制剂的施用相联合。这还可以进一步与AMP的施用以及还有任选的腺苷酸激酶抑制剂的施用相联合，所述腺苷酸激酶抑制剂防止AMP转化为腺苷二磷酸(ADP)或腺苷三磷酸(ATP)。

细胞外的腺苷(如上所述，可能是由CD73产生的)调节免疫细胞进入中枢神经系统。相应地，BBB通透性是由局部腺苷浓度与腺苷受体活性介导的：A1受体在低腺苷浓度时被活化(高亲和力)，而A2a在高腺苷浓度时被活化(低亲和力)。因此，提高腺苷利用率将会增加BBB的通透性。相反，降低腺苷利用率将会降低BBB通透性。此外，如以上详细描述，提高CD73水平或活性将会产生额外的局部腺苷，从而增加BBB的通透性。

腺苷，是一种CD73酶活性的嘌呤核苷产物，它结合细胞表面的特异性受体。据报道，腺苷在众多生理和病理事件中具有作用。腺苷在所有活细胞中均存在，并且能够在适当条件下(如局部缺血或20缺氧)释放，从而能够与腺苷受体作用，产生多种生理效应。

目前已知腺苷受体是膜内在蛋白质，它们结合细胞外腺苷，从而经由特异的被称作G-蛋白的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白发起一个跨膜信号，以调节各种第二信使系统，包括腺苷酸环化酶、钾通道、钙通道和磷脂酶C。见Stiles，“AdenosineReceptorsandBeyond：MolecularMechanismsofPhysiologicalRegulation，(腺苷受体以及除此之外：生理调节的分子机制)”Clin.Res.38(1)：10-18(1990)；Stiles，“AdenosineReceptors，(腺苷受体)”J.BiolChem.267：6451-6454(1992)，其全部内容通过引用并入本文。

激活A2A腺苷受体将会增加BBB的通透性。适宜的腺苷受体A2A激活剂是A2A激动剂，这在本领域中是熟知的(Press等人，“TherapeuticPotentialofAdenosineReceptorAntagonistsandAgonists，(腺苷受体拮抗剂和激动剂的治疗潜力)”ExpertOpin.Ther.Patents17(8)：1-16(2007)，其全部内容通过引用并入本文)。其他A2A腺苷受体激动剂包括一些专利中所述的那些A2A腺苷受体激动剂，分别是美国专利第6,232,297号和授予Lindin等人的美国公开专利申请第2003/0186926A1号，授予Zablocki等人的2005/0054605A1，以及授予Li等人的美国公开专利申请第2006/0040888A1、2006/0040889A1、2006/0100169A1和2008/0064653A1号，其全部内容通过引用并入本文。这些化合物可以如以下文献中所述而合成：授予Olsson等人的美国专利第5,140,015和5,278,150号，；授予Cristalli的美国专利第5,593,975好；美国专利第4,956,345号，Miyasaka等人；Hutchinson等人“CGS21680C，anA2SelectiveAdenosineReceptorAgonistwithPreferentialHypotensiveActivity(CGS21680C，一种具有优先降压活性的A2选择性腺苷受体激动剂)”J.Pharmacol.Exp.Ther.，251：47-55(1989)；Olsson等人，“N6-SubstitutedN-alkyladenosine-5′-uronamides：BifunctionalLigandsHavingRecognitionGroupsforA1andA2AdenosineReceptors，(N6取代的N-烷基腺苷-5′-糖醛酰胺：具有对于A1和A2腺苷受体的识别基团的双功能配体)”J.Med.Chem.，29：1683-1689(1986)；Bridges等人，“N6-[2-(3，5-dimethoxyphenyl)-2-(2-methylphenyl)ethyl]adenosineanditsUronamideDerivatives：NovelAdenosineAgonistsWithBothHighAffinityandHighSelectivityfortheAdenosineA2Receptor，(N6-[2-(3，5-二甲氧基苯基)-2-(2-甲基苯基)乙基]腺苷及其糖醛酰胺衍生物：具有对腺苷A2受体的高亲和力和高选择性的新颖的腺苷激动剂)”J.Med.Chem.31：1282(1988)；Hutchinson等人，J.Med.Chem.，33：1919(1990)；Ukeeda等人，“2-Alkoxyadenosines：PotentandSelectiveAgonistsattheCoronaryArteryA2AdenosineReceptor(2-烷氧基腺苷：冠状动脉A2腺苷受体的潜在和选择性激动剂)，”J.Med.Chem.34：1334(1991)；Francis等人，“HighlySelectiveAdenosineA2ReceptorAgonistsinaSeriesofN-alkylated2-aminoadenosines，(在一系列N烷基化的2-氨基腺苷中的高选择性腺苷A2受体激动剂)”J.Med.Chem.34：2570-2579(1991)；Yoneyama等人，“VasodepressorMechanismsof2-(1-octynyl)-adenosine(YT-146)，aSelectiveAdenosineA2ReceptorAgonist，InvolvetheOpeningofGlibenclamide-sensitiveK+Channels，一种选择性腺苷A2受体激动剂(2-(1-辛炔基)-腺苷(YT-146)的血管减压机制涉及格列本脲敏感性K+通道的开放)”Eur.J.Pharmacol.213(2)：199-204(1992)；Peet等人，“ConformationallyRestrained，Chiral(phenylisopropyl)amino-substitutedpyrazolo[3，4-d]pyrimidinesandPurineswithSelectivityforAdenosineA1andA2Receptors，(对腺苷A1和A2受体具有选择性的构象限制的手性(苯基异丙基)氨基取代的吡唑[3，4-d]嘧啶和嘌呤)”J.Med.Chem.，35：3263-3269(1992)；和Cristalli等人，“2-AlkynylDerivativesofAdenosineandAdenosine-5′-N-ethyluronamideasSelectiveAgonistsatA2AdenosineReceptors，(作为A2腺苷受体的选择性激动剂的腺苷和腺苷-5′-N-乙基糖醛酰胺的2-炔基衍生物)”J.Med.Chem.35(13)：2363-2368(1992)，其全部内容通过引用并入本文。这些腺苷A2A受体激动剂是示例性的，而不是限制性的。

A1腺苷受体的阻断或失活也将会增加BBB的通透性。适宜的腺苷受体A1失活剂为腺苷受体A1拮抗剂，这在本领域中是熟知的(Press等人，“TherapeuticPotentialofAdenosineReceptorAntagonistsandAgonists，(腺苷受体拮抗剂和激动剂的治疗潜力)”ExpertOpin.Ther.Patents17(8)：1-16(2007)，其全部内容通过引用并入本文)。适宜的腺苷受体A1拮抗剂包括但不仅限于在授予Hocher等人的美国专利申请公开号2008/0027082A1、授予Belardinelli等人的美国专利第5,446,046和5,668,139号、授予Neely的美国专利第6,117,998号以及授予Wilson等人的美国专利第7,247,639号中所述的腺苷受体A1拮抗剂，以上文献的全部内容通过引用并入本文。

增加BBB通透性，所选择的受治疗者可能出现中枢神经系统(“CNS”)疾患。

CNS疾患(包括精神病学的/行为的疾病和疾患)可以包括但不仅限于：后天性癫痫失语症、急性播散性脑脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、胼胝体发育不全、失认症、艾卡尔迪综合征、亚历山大病、阿尔卑斯病、交替性偏瘫、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症、无脑畸形、安格尔曼综合征(Angelmansyndrome)、血管瘤、缺氧症、失语症、失用症、蛛网膜囊肿、蛛网膜炎、阿-蔡二氏畸形(Amold-chiarimalformation)、动静脉畸形、阿斯伯格综合征、共济失调毛细血管扩张症、注意力缺陷多动障碍、自闭症、听觉处理障碍、自主神经功能障碍、背痛、巴滕病、白塞氏病、贝尔氏麻痹、良性自发性睑痉挛、良性局灶性肌肉萎缩、良性颅内高压症、双侧额顶多小脑回(bilateralfrontoparietalpolymicrogyria)、宾斯旺格病(binswanger′sdisease)、眼睑痉挛、布洛赫-苏兹贝格综合征(Bloch-sulzbergersyndrome)、臂丛神经损伤、脑脓肿、脑损害、脑损伤、脑肿瘤、脊髓肿瘤、布朗-塞卡尔综合征、卡纳万病(canavandisease)、腕管综合征(cts)、灼性神经痛、中枢性疼痛综合征、脑桥中央髓鞘溶解症、中央核性肌病、头症、脑动脉瘤、大脑动脉硬化、大脑萎缩、大脑性巨人症、脑性瘫痪、夏-马-图三氏病、chiari畸形、舞蹈病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(“CIDP”)、慢性疼痛、慢性区域性疼痛综合征、科-勒二氏综合征(Coffinlowrysyndrome)、昏迷(包括持续植物人状态)、先天性面瘫、皮质基底节变性、颅内动脉炎、颅缝早闭、克雅氏病、累积性创伤障碍、库欣氏综合征、巨细胞包涵体病(“CIBD”)、巨细胞病毒感染、丹-沃二氏综合征、道森病、去莫热综合征(demorsier′ssyndrome)、Dejerine-klumpke麻痹、代-索二氏病(Dejerine-sottasdisease)、睡眠时相延迟综合征、痴呆症、皮肌炎、发展性运用障碍、糖尿病神经病变、弥漫性硬化、家族性自主神经机能异常、计算障碍、书写困难、阅读障碍、张力障碍、早期幼儿癫痫性脑病、空蝶鞍综合征、脑炎、脑膨出、脑三叉神经血管瘤病、大便失禁、癫痫、欧勃麻痹(Erb′spalsy)、红斑性肢痛病、特发性震颤、法布里病、法尔综合征(Fahr′ssyndrome)、昏厥、家族性痉挛性瘫痪、发热性惊厥(febrileseizure)、菲希尔综合征、弗里德赖希共济失调、高歇病、格斯特曼综合征、巨细胞动脉炎、巨细胞包涵体病、球细胞脑白质营养不良、灰质异位、格-巴二氏综合征(Guillain-barrésyndrome)、htlv-1相关性脊髓病、哈-斯二氏病、头部外伤、头痛、半面痉挛、遗传性痉挛性截瘫、多神经炎型遗传性共济失调、耳部带状疱疹、带状疱疹、平山综合征(hirayamasyndrome)、前脑无裂畸形、亨廷顿病、积水性无脑畸形、脑积水、皮质醇增多症、缺氧、免疫介导性脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失调症、婴幼儿植烷酸贮积病、婴儿雷弗苏姆病(infantilerefsumdisease)、婴儿痉挛、炎性肌病、颅内囊肿、颅内高压、Joubert综合征、卡恩斯-塞尔综合症、肯尼迪病、金斯伯恩综合征(kinsbournesyndrome)、克-费二氏尔综合征(Klippelfeilsyndrome)、克拉伯病、库格尔贝里-尉兰德病(Kugelberg-welanderdisease)、库鲁病、拉福拉病、朗-爱二氏肌无力综合征(Lambert-eatonmyasthenicsyndrome)、Landau-kleffner综合征、延髓背外侧(Wallenberg)综合症、学习失能、利氏病、Lennox-gastaut综合征、莱-萘二氏综合征、脑白质营养不良症、路易体痴呆、无脑回、闭锁综合征、卢格里格病、腰椎间盘突出症、莱姆病-神经系统后遗症、马查多-约瑟夫病(脊髓小脑共济失调3型)、巨脑、巨脑畸形、梅-罗综合征、美尼尔氏病、脑膜炎、门克斯病、异染性脑白质营养不良、小头畸形、偏头痛、米勒费希尔综合征、小中风、线粒体肌病、默比乌斯综合征、单肢肌萎缩、运动神经元病、运动技能障碍、烟雾病、黏多糖症、多发梗塞性痴呆、多病灶性运动神经病、多发性硬化症、伴随体位性低血压的多系统萎缩、肌营养不良症、肌痛性脑脊髓炎、重症肌无力、脱髓鞘弥漫性硬化、婴儿肌阵挛型脑病、肌阵挛、肌病、肌小管肌病、先天性肌强直、发作性睡病、神经纤维瘤病、神经阻滞剂恶性综合征、艾滋病的神经系统表现、狼疮的神经系统后遗症、神经性肌强直、神经元蜡样脂褐质沉积症、神经元迁移障碍、尼曼-匹克病、非24小时睡眠-醒觉综合征、非语言学习障碍、奥沙利文-麦克劳德综合征(O′sullivan-mcleodsyndrome)、枕神经痛、隐性脊柱神经管闭合不全序列征、大田原综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、眼阵挛-肌阵挛综合征、视神经炎、直立性低血压、过度使用综合征、视像存留、感觉异常、帕金森病、先天性副肌强直、副肿瘤性疾病、阵发性发作(paroxysmalattack)、帕-罗二氏综合征(也称为罗姆伯格氏综合征)、佩-梅二氏病、周期性瘫痪、周围神经病变、持续性植物人状态、广泛性发育障碍、旋光性喷嚏反射、植烷酸贮积病、皮克氏病、神经挟捏、垂体瘤、pmg、脊髓灰质炎、多小脑回、多发性肌炎、脑穿通畸形、小儿麻痹症后期综合征、疱疹后神经痛(“PHN”)、感染后脑脊髓炎、体位性低血压、普拉德-威利综合征、原发性侧索硬化症、朊病毒疾病、进行性单侧面萎缩(也称为罗姆伯格氏综合征)、进行性多灶性脑白质病、进行性硬化性灰质萎缩(progressivesclerosingpoliodystrophy)、进行性核上性麻痹、假性脑瘤、拉姆齐-亨特综合征(I型和II型)、罗斯默森脑炎、反射性交感神经营养不良综合征、雷夫叙姆病、重复性运动失调、重复性压力损伤、不宁腿综合征、反转录病毒相关的脊髓病、雷特综合征(rettsyndrome)、瑞氏综合征、罗姆伯格氏综合征、狂犬病、圣维塔斯舞蹈病(SaintVitus’dance)、山德霍夫氏病、精神分裂症、希尔德病、脑裂性孔洞脑、感觉统合功能障碍、透明隔-视神经发育不良、惊吓婴儿综合征、带状疱疹、希-德二氏综合征、干燥综合征、睡眠呼吸暂停、昏睡病、snatiation、索托斯综合症(Sotossyndrome)、痉挛、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓肿瘤、脊髓性肌萎缩症、椎管狭窄症、斯-理-奥三氏综合征、见进行性核上性麻痹、脊髓小脑共济失调、僵人综合征、中风、斯特奇-韦伯二氏综合征、亚急性硬化性全脑炎、皮层下动脉硬化性脑病、浅表铁质沉着症、西登哈姆舞蹈病、晕厥、通感、脊髓空洞症、迟发性运动障碍、泰-萨克斯病、颞动脉炎、破伤风、脊髓栓系综合征、Thomsen病、胸廓出口综合征、痛性痉挛、托德麻痹、多动秽语综合征、短暂性脑缺血发作、传染性海绵状脑病、横贯性脊髓炎、外伤性脑损伤、震颤、三叉神经痛、热带痉挛性截瘫、锥虫病、结节性硬化、包括颞动脉炎在内的血管炎、脑视网膜血管瘤病(“VHL”)、Viliuisk脑脊髓炎(“VE”)、瓦伦伯格综合征、韦-霍二氏病、西部综合征、急性颈部扭伤、威廉斯综合征、肝豆状核变形和齐薇格综合征(Zellwegersyndrome)。因此应了解所有CNS相关的状态和疾患都能够通过药物递送的BBB途径治疗。

本发明的化合物能够口服、胃肠外施用，例如皮下、由静脉内、肌内、腹膜内、通过鼻内滴注，或者通过应用于粘膜，例如鼻、咽喉和支气管的粘膜。这些化合物可以单独或与适宜的药物载体共同施用，并且可以为固态或液态形式，例如片剂、胶囊、粉剂、溶液、悬液或乳剂。

本发明的活性化合物可以例如与惰性稀释剂或与可同化的食用载体一起口服施用，或者它们可以被硬壳或软壳胶囊包裹，或者它们可以压缩为片剂，或者它们可以直接混入日常饮食的食物中。对于口服治疗药物的施用，这些活性化合物可以与赋形剂混合，并且以片剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆剂等形式使用。这样的组合物和制品至少应含有0.1％的活性化合物。当然，这些组合物中的化合物百分比可以被改变，并且可通常为单位重量的约2％至约60％。这些在治疗上有帮助的组合物中的活性化合物的量是那些将会获得的适宜的剂量。制备了依照本发明的优选的组合物，使得一个口服药剂单元含有约1mg至250mg之间的活性化合物。

片剂、胶囊等也可能含有粘合剂，如黄蓍树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸；润滑剂，如硬脂酸镁；和甜味剂，如蔗糖、乳糖或糖精。当剂量单元形式为胶囊时，除上述类型材料以外，可能含有液态载体，如脂肪油。

众多其他的材料都可以作为包衣或改变剂量单元的物理形式而存在。例如，片剂可以由紫胶、糖或两者同时包衣。除了活性成分以外，糖浆剂可以包含作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯、染料和作为调味物质的樱桃或橙味香料。

这些活性化合物还可以胃肠外施用。这些活性化合物的溶液或悬液可以在适当地与表面活性剂如羟丙纤维素混合的水中制备。分散相也可以在油类中的甘油、液态聚乙二醇和它们的混合物中制备。示例性的油类为石油、动物、植物或合成来源的油类，例如花生油、大豆油或矿物油。一般而言，水、盐水、含水葡萄糖和相关的糖溶液以及例如丙二醇或聚乙二醇的二醇类都是优选的液态载体，尤其是对于注射溶液。在普通储存和使用的情况下，这些制品含有防止微生物生长的防腐剂。

适宜于注射用的药剂形式包括无菌水溶液或分散体，以及用于临时配制无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须是达到容易注射程度的流体。在制造和储存的条件下，它必须是稳定的，并且必须保持不受例如细菌和真菌等微生物的污染。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、它们的适宜的混合物，以及植物油。

本发明的化合物还可以以气溶胶的形式直接施用于气道。作为气溶胶使用，溶液或悬液中的本发明的化合物可以在增压气溶胶容器中与适宜的推进剂一起包装，推进剂例如碳氢化合物推进剂，如与传统佐剂一起的丙烷、丁烷或异丁烷。本发明的材料还可以以非增压形式施用，例如在喷雾器或雾化器中。

本发明的另一方面涉及降低受治疗者血脑屏障通透性的方法。该方法包括选择将受益于降低血脑屏障通透性的受治疗者，并且使所选择的受治疗者接受治疗。在有效降低受治疗者血脑屏障通透性的条件下，该治疗会降低腺苷水平和/或生物利用率，调节腺苷受体，和/或提高CD73水平和/或活性。

本发明的这一方面可以应用上述的药物制剂和施用方法执行。

如上详述，BBB的通透性受局部腺苷水平、CD73和腺苷受体活性的控制。可以通过提供腺苷受体拮抗剂和/或激动剂来实现对腺苷受体活性的改变，这在本领域中是熟知的(Press等人，“TherapeuticPotentialofAdenosineReceptorAntagonistsandAgonists，(腺苷受体拮抗剂和激动剂的治疗潜力)”ExpertOpin.Ther.Patents17(8)：1-16(2007)，其全部内容通过引用并入本文)。

改变受治疗者体内腺苷受体活性来降低血脑屏障通透性，可以通过但不仅限于给受治疗者施用A2A腺苷受体拮抗剂和/或A1腺苷受体激动剂来实现。

许多腺苷A2A受体拮抗剂在本领域的技术人员中已知，并且能够在此所述的方法中独立或联合使用。这样的拮抗剂包括但不仅限于：(-)-R，S)-甲氟喹(市售为Mefloquine^TM的外消旋混合物中的活性对应异构体)，3，7-二甲基-1-炔丙基黄嘌呤(DMPX)，3-(3-羟丙基)-7-甲基-8-(间甲氧基苯乙烯基)-1-炔丙基黄嘌呤(MX2)，3-(3-羟丙基)-8-(3-甲氧基苯乙烯基)-7-甲基-1-炔丙基黄嘌呤磷酸二钠盐(MSX-3，MSX-2的磷酸盐前药)，7-甲基-8-苯乙烯基黄嘌呤衍生物，SCH58261，KW-6002，氨基呋喃基三唑并-三-嗪基氨基乙基苯酚(ZM241385)，和8-氯苯乙烯基-咖啡因，KF17837，VR2006，伊曲茶碱(istradefylline)，侧金盏花苷药物(如VER6489、VER6623、VER6947、VER7130、VER7146、VER7448、VER7835、VER8177、VER-11135、VER-6409、VER6440、VER6489、VER6623、VER6947、VER7130、VER7146、VER7448、VER7835、VER8177)，吡唑并[4，3-e]1，2，4-三唑并[1，5-c]嘧啶，以及5-氨基-咪唑并-[4，3-e]-1，2，4-三唑并[1，5-c]嘧啶等(授予Li等人的美国专利申请公开号2006/0128708，其全部内容通过引用并入本文)，吡唑并[4，3-e]-[1，2，4]-三唑并[1，5-c]嘧啶(见例如，授予Kase等人的WO01/92264，其全部内容通过引用并入本文)，2，7-二取代的-5-氨基-[1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶(见例如授予Kase等人的WO03/048163，其全部内容通过引用并入本文)，2，5-二取代的-7-氨基-[1，2，4]三唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪(见例如，Vu等人，“PiperazineDerivativesof[1，2，4]Triazolo[1，5-a][1，3，5]triazineasPotentandSelectiveAdenosineA2aReceptorAntagonists，(作为强效的和选择性的腺苷A2a受体拮抗剂的[1，2，4]三唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪的哌嗪衍生物)”J.Med.Chem.47(17)：4291-4299(2004)，其全部内容通过引用并入本文)，9-取代的-2-(取代的-乙炔-1-基)-腺嘌呤(见例如，授予Beauglehole等人的美国专利第7,217,702号，其全部内容通过引用并入本文)，7-甲基-8-苯乙烯基黄嘌呤衍生物，吡唑并[4，3-e)1，2，4-三唑并[1，5-c]嘧啶，和5-氨基-咪唑-[4，3-e]-1，2，4-三唑[1，5-c]嘧啶类(见例如，授予Li等人的美国专利申请公开号2006/0128708，其全部内容通过引用并入本文)。这些腺苷A2A受体拮抗剂的本意是示例性的，而不是限制性的。

适宜的A1腺苷受体激动剂包括授予Zablocki等人的美国专利申请公开号2005/0054605A1所叙述，其全部内容通过引用并入本文。

BBB通透性降低，选择的受治疗者可能出现炎性疾病。这些炎性疾病包括那些介导炎症介质穿过血脑屏障的炎性疾病。这些炎性疾病包括但不仅限于由细菌感染、病毒感染或自身免疫病引起的炎症。更具体的说，这些疾病包括但不仅限于脑脊膜炎、多发性硬化症、视神经脊髓炎、人免疫缺陷病毒(“HIV”)-1脑炎，单纯疱疹病毒(“HSV”)脑炎，刚地弓形虫脑炎，以及进行性多灶性脑白质病。

当BBB通透性降低时，选择的受治疗者还可能出现由淋巴细胞进入大脑所介导的病症。这种方式的其他可治疗的病症包括大脑脑炎、帕金森病、癫痫、HIV-AIDS的神经系统表现、狼疮的神经系统后遗症，以及亨廷顿病、脑膜炎、多发性硬化症、视神经脊髓炎、HSV脑炎和进行性多灶性脑白质病。

本发明还有一方面涉及治疗中枢神经系统疾患或病症的受治疗者的方法。该方法包括选择患有中枢神经系统疾患或病症的受治疗者，并且提供有效治疗所述中枢神经系统疾患或病症的治疗药物。提供了一种血脑屏障透化剂，该剂提高腺苷水平和/或生物利用率，调节腺苷受体，和/或提高CD73水平和/或活性。在使治疗药物有效穿过血脑屏障并且治疗所述疾患或病症的条件下，该治疗药物和血脑屏障透化剂被施用于所选择的受治疗者。

本发明的这一方面可以通过使用上述的药剂和施用方法实现。

治疗药物可以包括任何一种在CNS疾病或病症的治疗上的有用的治疗药物。这样的其他化合物可以是任一类药物或药剂，包括但不仅限于抗生素、抗寄生虫药、抗真菌药、抗病毒药和抗肿瘤药。当将抗寄生虫、抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、抗病毒剂等同时施用时，血脑屏障透化剂化合物可以通过适合疾病治疗的任何一种方法和施用途径施用，尤其是作为药物组合物。

治疗剂可以作为治疗性药物或预防性药物(例如，抑制或防止神经变性疾病的发病)递送。治疗性药物引起正在治疗的潜在疾患的消除或改善。预防性药物被施用于有患病风险的患者，或施用于尽管还没有做出诊断，但报告有一种或多种这种疾病的生理学症状的患者。可选择的，预防性药物的施用可以应用于避免潜在疾患的生理学症状发作，尤其当症状表现出周期性时。在后一种实施方案中，疗法为与伴随的生理学症状而不是潜在适应症相关的预防疗法。除了别的以外，对具体应用的有效的实际量将依赖于治疗的病症和施用的途径。

治疗性药物可以是免疫抑制剂、消炎药、抗增殖剂、抗迁移剂、抗纤维化药物、促凋亡剂(proapoptotics)、钙通道阻断剂、抗肿瘤药(anti-neoplasties)、抗体、抗凝血剂、抗血小板剂、Ilblllla剂、抗病毒药、抗癌药、化疗剂、溶栓剂、血管扩张剂、抗微生物剂或抗生素、抗有丝分裂物质、生长因子拮抗剂、自由基清除剂、生物制剂、放射治疗剂、不透射线剂(radio-opaqueagents)、放射性标记的药物、抗凝固剂(例如，肝素及其衍生物)、血管生成抑制剂(例如，沙立度胺)、血管发生药物、PDGF-B和/或EGF抑制剂、消炎药(例如，银屑病药物)、核黄素、噻唑呋林、zafurin、抗血小板剂(例如，环加氧酶抑制剂(例如，乙酰水杨酸))、ADP抑制剂(例如，氯吡格雷和噻氯匹啶(ticlopdipine))、磷酸二酯酶(hosphodiesterase)III抑制剂(例如，西洛他唑)、糖蛋白(lycoprotein)II/IIIIa剂(如阿昔单抗)、依替巴肽、以及腺苷再摄取抑制剂(例如双嘧达莫(dipyridmoles)、愈合和/或促进剂(如抗氧化剂和氮氧化物供体))、止吐药、止恶心药、雷公藤内酯二醇、二萜类、三萜类、二萜环氧化物、二萜类化合物环氧化物、三环氧化物、或雷公藤(TWHF)、SDZ-RAD、RAD、RAD666、或40-0-(2-羟基)乙基雷帕霉素，以及它们的衍生物、药用盐及其组合。

在本发明的另一方面中，治疗能力的剂(therapeuticcapableagent)是生物活性蛋白质或肽。这类生物活性蛋白质或肽的例子包括细胞调节肽、趋化肽、抗凝血肽、抗血栓形成肽、抗肿瘤肽、抗感染肽、促生长肽，以及抗炎肽。蛋白质的例子包括抗体、酶、类固醇、生长激素和生长激素释放激素、促性腺激素释放激素及其激动剂和拮抗剂类似物、生长抑素及其类似物、促性腺激素、T肽、甲状腺降钙素、甲状旁腺激素、胰高血糖素、加压素、催产素、血管紧张素I和II、缓激肽、胰激肽、促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素、胰岛素、胰高血糖素和上述分子的众多类似物和同种物。在本发明的一些方面中，血脑屏障通透性受到本文上述一个或多个递送抗生素或抗感染治疗能力的剂的方法的调节。这种抗感染药物减少微生物的活性或杀死微生物。

在某些实施例中，治疗药物和血脑屏障透化剂按配方制造为单一的“化合物”制剂。这可以由许多已知方法中的任意一种来实现。例如，治疗药物和血脑屏障透化剂可以在单一的药学上可接受的赋形剂中合并。在另一方法中，治疗药物和血脑屏障透化剂可以被配制在各自的微囊化赋形剂中，接着合并，或者在一个药片中形成各自的片层等等。

在一个实施方案中，治疗药物和血脑屏障透化剂是连接在一起的。在某些实施方案中，治疗药物和血脑屏障透化剂直接结合在一起，或由“系链”或“连接体”结合在一起形成一个单一化合物。不受具体理论束缚，人们相信这样的结合化合物提供了改善的特异性/选择性。

许多直接连接分子或通过连接体/系链的连接分子已被本领域的技术人员熟知。用于连接一种或多种治疗药物和血脑屏障透化剂形成双功能化合物的特定化学物质依赖于所期望的所述一种或多种治疗药物的化学性质和“配体内”的间隔。各种各样的治疗药物和血脑屏障透化剂典型地包含许多官能团(例如羧酸(COOH)、游离胺(-NEE)等)，这些官能团能够用于与连接体或相对成分(例即治疗药物或血脑屏障透化剂)上的适宜的官能团反应，来将这些成分连接在一起。

另一选择，这些成分可以被衍生以暴露的或附加额外的反应性官能团。衍生可以包括附加众多连接体分子的任意一种，例如那些可从伊利诺伊州罗克福德皮尔斯化学公司(PierceChemicalCompany，RockfordIll)获得的连接体分子。

如在此所使用的“连接体”和“系链”是一种用于连接两个或多个配体(例如一种或多种治疗药物或血脑屏障透化剂)形成一个双功能或多功能化合物的分子。通常选择能够与包含双功能与多功能部分的所有成分形成共价键的连接体。适宜的连接体已被本领域的技术人员所熟知，并且包括但不仅限于直链或支链碳连接体、杂环碳连接体、氨基酸、核酸、树枝状大分子、合成聚合物、肽连接体、肽及核酸类似物、碳水化合物、聚乙二醇等。当其中一个或多个成分为多肽时，连接体可以通过组成的氨基酸侧基连接到该组成氨基酸上(例如，通过二硫键连接至半胱氨酸)，或者通过末端氨基酸的α碳氨基或羧基连接到组成氨基酸上。

在某些实施方案中，具有能与第一治疗药物的基团反应的一个官能团和与血脑屏障透化剂上的基团反应的另一个官能团的双功能连接体能够用于形成双功能化合物。另一选择，衍生可以包括用高碘酸盐对所述一种或多种成分进行化学处理(例如，糖蛋白、碳水化合物或核酸的糖部分的乙二醇裂解，等等)，以产生游离醛基。游离醛基可以与连接体上的游离胺基或肼基反应，使该连接体连接到化合物上(见，例如授予Rodwell等人的美国专利第4,671,958号，其全部内容通过引用并入本文)。在多肽例如抗体或抗体片段上产生游离巯基的程序也是已知的(见，例如授予Nicolotti等人的美国专利第4,659,839号，其全部内容通过引用并入本文)。

当治疗药物和血脑屏障透化剂均为肽时，双功能化合物可以被化学合成或被重组表达为融合蛋白，该化合物同时包含两种相互直接连接或通过肽连接体连接的成分。

在某些实施方案中，赖氨酸、谷氨酸和基于不同长度的连接体的聚乙二醇(PEG)被用于成分的偶联。将分子结合到PEG上的化学试剂已被本领域的技术人员熟知(见，例如，Veronese，“PeptideandProteinPEGylation：aReviewofProblemsandSolutions，(肽和蛋白质PEG化：问题及解决方法综述)”Biomaterials22：405-417(2001)；Zalipsky等人，“AttachmentofDrugstoPolyethyleneGlycols，(药物与聚乙二醇连接)”Eur.Plym.J.19(12)：1177-1183(1983)；Olson等人，“PreparationandCharacterizationofPoly(ethyleneglycol)ylatedHumanGrowthHormoneAntagonist，(聚乙二醇化的人生长激素拮抗剂的制备和表征)”Poly(ethyleneglycol)ChemistryandBiologicalApplications(聚乙二醇化学和生物学应用)，170-181，Harris&Zalipsky编，ACS，华盛顿，DC(1997)；Delgado等人，“TheUsesandPropertiesofPEG-LinkedProteins，(PEG连接的蛋白的用途和特性)”Crit.Rev.Therap.DrugCarrierSys.9：249-304(1992)；Pedley等人，“ThePotentialforEnhancedTumourLocalisationbyPoly(ethyleneglycol)Modificationofanti-CEAAntibody，(由抗CEA抗体的聚乙二醇修饰所产生的增强的肿瘤定位的可能)”Brit.J.Cancer70：1126-1130(1994)；Eyre&Farver，TextbookofClinicalOncology377-390(Holleb等人编.1991)；Lee等人，“ProlongedCirculatingLivesofSingle-chainofFvProteinsConjugatedwithPolyethyleneGlycol：aComparisonofConjugationChemistriesandCompounds，(与聚乙二醇相轭合的Fv蛋白的单链的延长循环寿命：轭合化学物质与化合物的比较)”Bioconjug.Chem.10：973-981(1999)；Nucci等人，“TheTherapeuticValueofPoly(EthyteneGlycol)-ModifiedProteins，(聚乙二醇修饰的蛋白的治疗价值)”Adv.DrugDeliv.Rev.6：133-151(1991)；Francis等人，“PolyethyleneGlycolModification：RelevanceofImprovedMethodologytoTumourTargeting，(聚乙二醇修饰：改良的方法与肿瘤靶向的相关性)”J.DrugTargeting3：321-340(1996)，其全部内容通过引用并入本文)。

在某些实施方案中，治疗药物和血脑屏障透化剂的轭合可以通过使用例如戊二醛、EDCI、对苯二甲酰氯、溴化氰等这样的连接试剂或通过还原胺化作用来实现。在某些实施方案中，成分可以通过WO-A-9317713中所公开的一类羟基酸连接体来连接。PEG连接体还可以被用于制备多种PEG系链的药物(见，例如Lee等人，“ReductionofAzidestoPrimaryAminesinSubstratesBearingLabileEsterFunctionality：SynthesisofaPEG-Solubilized，“Y”-ShapedIminodiaceticAcidReagentforPreparationofFolate-TetheredDrugs，(在含有不稳定的酯官能团的底物中叠氮化物还原为伯胺：用于制备叶酸系链的药物的PEG溶解的“Y”形亚氨基二乙酸试剂的合成)”OrganicLett.，1：179-181(1999)，其全部内容通过引用并入本文)。

本发明还有一方面涉及筛选有效增加血脑屏障通透性的化合物的方法。该方法包括提供与未改造动物相比具有降低的CD73表达水平、降低的腺苷表达水平、和/或调节的腺苷受体活性的改造动物。同时也提供一种或多种候选化合物，并且所述一种或多种候选化合物施用于这些改造动物上。接着，评估所述一种或多种候选化合物是否提高了腺苷水平和/或生物利用率，调节腺苷受体，和/或提高CD73水平和/或活性。这些在改造动物中提高腺苷水平和/或生物利用率，调节腺苷受体，和/或提高CD73水平和/或活性的候选化合物随即被鉴定为能够潜在有效增加血脑屏障通透性。

在本发明的某些实施方案中，所述主题方法还可以使用转基因动物实验来实践。转基因动物大体上可以分为两类：“敲除”和“敲入”。“敲除”是通过引入转基因序列使靶基因改变，从而导致靶基因功能降低，优选使得该靶基因的表达无意义或不能检测到。“敲入”是转基因动物的宿主细胞基因组发生改变，导致靶基因的表达增加，例如，通过引入额外的靶基因拷贝，或者通过手动插入一段调节序列，该调节序列提供了靶基因的内源性拷贝的增强表达。敲入或敲除的转基因动物可以是关于靶基因的杂合子或纯合子。本发明的转基因动物大体上可以分为敲除或敲入，可以分别过量表达或降低表达(underexpress)CD73、腺苷和/或腺苷受体。

在本发明的某些实施方案中，转基因动物被设计提供一个用于测定、鉴别和/或定量BBB通透性调节的模型系统。这样的测定可以发生在动物生存期中的任何时间，包括BBB通透性破坏或改变前后。转基因模型系统也可以用于促进或增加BBB通透性的生物活性剂的开发。而且，该模型系统可以用于分析测试试剂是否修补屏障或降低通透性(例如，BBB“开放”后(即增加通透性)，例如，由创伤或疾病引起的BBB开放)。此外，可以从本发明的转基因动物中分离细胞，用于在基于细胞的环境或细胞培养环境(包括离体技术)中进行的进一步研究或分析。

在本发明的某些实施方案中，动物模型包括顺从于在动物的神经系统中产生改良的BBB通透性病症的步骤的任何非人类脊椎动物。优选的模型生物包括但不仅限于哺乳动物、非人类灵长类和啮齿类。优选模型的非限定实例有大鼠、小鼠、豚鼠、猫、狗、兔子、猪、黑猩猩和猴子。测试动物可以是野生型的或转基因的动物。

如今，胚胎显微操作技术的发展也允许将异源性DNA引入到受精的哺乳动物卵中。例如，全能或多能干细胞能够通过显微注射、磷酸钙介导的沉淀、脂质体融合、逆病毒感染或其他方式转化。转染的细胞接着被引入胚胎，接着胚胎将会发育成为转基因动物。在一个优选的实施方案中，发育中的胚胎由包含期望的转基因的病毒载体感染，这样使表达所述转基因的转基因动物能够从受感染的胚胎中产生。在另一优选的实施方案中，期望的转基因被共同注射入胚胎的原核或细胞质中，优选的是在单细胞阶段，接着允许胚胎发育为成熟的转基因动物。这些和其他生成转基因动物的变异方法在本领域中已经很好的建立，因此在此不详述。见，例如美国专利第5,175,385号和5,175,384号，其全部内容通过引用并入本文。

本领域中已知可以利用多种指示剂测试BBB通透性。例如染料、示踪剂、或分子量超过180Da的标记物都被阻止穿过完整的BBB。该测定可以在实验动物中实施，实验动物包括但不仅限于小鼠、大鼠、狗、猪或猴子。适宜的指示剂包括本领域已知的，用于测定、显影、测量、鉴别或定量血脑屏障通透性的任一染料、标记物、或示踪剂。非限定实例包括伊文思蓝和荧光素钠。

本发明的另一方面涉及一种药剂。该药剂有一种有效治疗中枢神经系统疾患或病症的治疗药物和血脑屏障透化剂，其中该试剂提高腺苷水平和/或生物利用率，调节腺苷受体，和/或提高CD73水平和/或活性。

该药物实质上可按上述相同的方式配制和施用。

实施例

实施例1-小鼠

Cd73^-/-小鼠在前文已经叙述过(Thompson等人，“CrucialRoleforEcto-5’-Nucleotidase(CD73)inVascularLeakageDuringHypoxia，(外-5’-核苷酸酶(CD73)在低氧期间的血管渗漏中的关键作用)”J.Exp.Med.200：1395-1405(2004)，其全部内容通过引用并入本文)，并且与C57BL/6回交14代。根据它们淋巴器官的大小和细胞成分以及T细胞与B细胞在体内与体外分析中的响应，Cd73^-/-小鼠没有明显的感染敏感性并且显示正常(Thompson等人，“CrucialRoleforEcto-5’-Nucleotidase(CD73)inVascularLeakageDuringHypoxia，(外-5’-核苷酸酶(CD73)在低氧期间的血管渗漏中的关键作用)”J.Exp.Med.200：1395-1405(2004)，其全部内容通过引用并入本文)。C57BL/6和C57BL/6背景的tcrα^-/-小鼠购于杰克逊实验室。小鼠在康奈尔大学或图尔库大学中于无特定病原条件下饲喂和圈养。对于腺苷受体阻断实验，从EAE诱导前一日开始并且在整个实验中连续供给小鼠补充了0.6g/L咖啡因(Sigma)或2mg/kg(1mg/kg皮下和1mg/kg腹腔注射)溶于DMSO的SCH58261(PBS中45％的体积)或单独的45％DMSO的饮用水。所有对小鼠进行的操作经过了相关动物审查委员会批准。

实施例2-EAE诱导及评分

通过用如下文献所述的髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(“MOG”)EAE诱导方案处理小鼠，诱导EAE：Swanborg，“ExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitisinRodentsasaModelforHumanDemyelinatingDisease(啮齿动物中的实验性自身免疫性脑脊髓炎作为人脱髓鞘病的模型)”Clin.Immunol.Immunopathol.77：4-13(1995)，和Bynoe等人，“EpicutaneousImmunizationwithAutoantigenicPeptidesInducesTSuppressorCellsthatPreventExperimentalAllergicEncephalomyelitis，(用自身抗原性肽经皮肤表面免疫诱导了阻止实验性过敏脑脊髓炎的抑制性T细胞)”Immunity19：317-328(2003)，其全部内容通过引用并入本文。简单地说，将MOG_35-55肽(PBS中的3mg/ml)(Invitrogen)和完全弗氏佐剂(CFA，Sigma)的1:1乳剂经皮下注射(50μl)至每个侧腹。在免疫同时静脉内给予(PBS中的200μl)百日咳毒素(PTX，20ng)(BiologicalLaboratoriesInc.)，并且2日后再次注射。每日根据疾病症状严重度对小鼠EAE进行评分：0＝没有疾病，0.5-1＝虚弱/跛行尾巴，2＝跛行尾巴和部分后肢瘫痪，3＝完全后肢瘫痪，4＝后肢及前肢均瘫痪，5＝死亡。4分的小鼠进行安乐死。

实施例3-T细胞制备与过继转移

用不含PTX的CFA中的MOG_35-55肽预处理小鼠。一周后，从脾脏和淋巴结收获淋巴细胞，并用ACK缓冲液(0.15MNH4Cl，1mMKHCO₃，0.1mMEDTA，pH7.3)孵育以裂解红血细胞。细胞用针对CD8(TIB-105)、IA^{b，d，v，p，q，r}(212.A1)、FcR(2.4-G2)、B220(TIB-164)、NK1.1(HB191)的抗体孵育，接着用BioMag羊抗小鼠IgG、IgM和羊抗大鼠IgG(Qiagen)孵育。负磁富集(negativemagneticenrichment)后，直接使用CD4⁺细胞或将其进一步分选为具体的亚群。对于分选，细胞用针对CD4(RM4-5)和CD73(TY/23)的抗体、并且在某些实验中为针对CD25(PC61)的抗体染色，接着利用FACSAria(BDBiosciences)分离。分选后纯度常规的大于99％。对于过继转移，总CD4⁺或分选的T细胞用无菌PBS洗涤并重悬。受体小鼠通过静脉注射接受200μl无菌PBS中的小于等于2.5×10⁶个细胞。

实施例4-流式细胞术

细胞悬液用轭合荧光染料的抗CD4(RM4-5)、CD73(TY/23)、或FoxP3(FJK-16s)抗体染色。根据制造商的说明书(eBioscience)进行细胞内的FoxP3染色。染色的细胞通过FACSCalibur(BDBiosciences)获得。用FlowJo软件(TreeStar)分析数据。

实施例5-T细胞细胞因子测定

将来自MOG免疫小鼠的分选的T细胞在经过辐照的C57BL/6脾细胞的存在下用0或10μMMOG肽培养。18小时收集上清液，用Bio-plex细胞因子(Biorad)测定分析IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IL-1β和TNFα。

实施例6-免疫组化(“IHC”)

用PBS灌注麻醉的小鼠，分离大脑、脾和脊髓并在TissueTek-OCT介质中快速冷冻。5μm切片(沿着大脑矢状方向)被附在Supefrost/Plus载玻片(Fisher)上，丙酮固定，并于-80℃储存。对于免疫染色，解冻载玻片，并用PBS中的0.03％H₂O₂处理，以封闭内源性过氧化物酶，用在正常山羊血清(Zymed)中的酪蛋白(Vector)封闭，然后用抗CD45(YW62.3)、抗CD4(RM4-5)或者抗ICAM-1(3E2)孵育。用生物素酰化的羊抗大鼠Ig(JacksonImmunoResearch)和链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Zymed)孵育载玻片，并且用AEC(红色)底物试剂盒(Zymed)和苏木素复染剂显影。用Fluoromount-G封固盖玻片，并在光下拍照(Zeiss)。

实施例7-实时定量-PCR

利用Trizol(Invitrogen)，从Z310脉络丛细胞系中分离RNA(Zheng等人，“EstablishmentandCharacterizationofanImmortalizedZ310ChoroidalEpithelialCellLinefromMurineChoroidPlexus，(来自小鼠脉络丛的永生化Z310脉络膜上皮细胞系的建立和表征)”BrainRes.958：371-380(2002)，其全部内容通过引用并入本文)。用Reverse-iT试剂盒(ABGene)合成cDNA。AR的特异性引物(可根据要求获得)被用于测定基因表达水平，并且用SYBR-Green试剂盒(ABGene)标准化为GAPDH管家基因水平，由ABI7500实时PCR系统运行完成。进行溶解曲线分析来测量每个定量PCR产物的特异性。

实施例8-对CD73在EAE中的作用的评价

由于腺苷的免疫调节和免疫抑制特性，对CD73在EAE中的作用进行了评价。基于对A₁腺苷受体(AR)缺陷小鼠的EAE恶化的报道(Tsutsui等人，“A1AdenosineReceptorUpregulationandActivationAttenuatesNeuroinflammationandDemyelinationinaModelofMultipleSclerosis，(A1腺苷受体的上调和激活减弱了多发性硬化症模型中的神经炎症和脱髓鞘)”J.Neurosci.24：1521-1529(2004)，其全部内容通过引用并入本文)，预期不能催化产生细胞外腺苷的cd73^-/-小鼠将经历严重EAE。出人意料的是，cd73^-/-小鼠对EAE的诱导具有高度的耐受性。然而，来自cd73^-/-小鼠的CD4⁺T细胞当过继转移进入cd73^+/+T细胞缺陷的小鼠时确实具备对CNS抗原产生免疫应答并引起严重EAE的能力。来自野生型小鼠的CD73⁺CD4⁺T细胞，当转移进入cd73^-/-受体时也引起疾病，这表明在EAE期间，淋巴细胞进入大脑需要CD73在淋巴细胞上或CNS中表达。因为cd73^+/+小鼠通过广谱AR拮抗剂咖啡因和A_2aAR特异性拮抗剂SCH58261保护而不受EAE诱导，这一数据表明由CD73或并不是CD73本身产生的细胞外腺苷，调节淋巴细胞在EAE期间进入CNS。这些结果首次阐明了CD73和腺苷在调节EAE形成中的作用。

实施例9-Cd73^-/-小鼠对EAE诱导具有耐受性。

为了确定CD73是否在EAE进程中有控制炎症的作用，使cd73^-/-和野生型(cd73^+/+)小鼠接受髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(“MGO”)EAE诱导方案处理(Swanborg，”ExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitisinRodentsasaModelforHumanDemyelinatingDisease，(啮齿动物中的实验性自身免疫性脑脊髓炎作为人脱髓鞘病的模型)”Clin.Immunol.Immunopathol.77：4-13(1995)；Bynoe等人，“EpicutaneousImmunizationwithAutoantigenicPeptidesInducesTSuppressorCellsthatPreventExperimentalAllergicEncephalomyelitis，(用自身抗原性肽经皮肤表面免疫诱导了阻止实验性过敏脑脊髓炎的抑制性T细胞)”Immunity19：317-328(2003)，其全部内容通过引用并入本文)。EAE发展的每日监测显示，相比于它们的野生型同类，cd73^-/-小鼠一直表现急剧降低的疾病严重度(图1)。在疾病诱导3周后，相比于野生型小鼠为2.0(跛行尾巴和部分后肢瘫痪)而言，cd73^-/-小鼠的平均EAE得分仅为0.5(尾巴虚弱)(图1)。

实施例10-来自cd73^-/-小鼠的CD4⁺T细胞响应于MOG免疫。

接着问及cd73^-/-小鼠对EAE诱导的耐受性是否能够通过cd73^-/-淋巴细胞增强的抑制免疫响应能力或这些淋巴细胞不能响应MOG刺激来解释。自然产生的CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺T细胞或Treg能够调节活化诱导的EAE(Kohm等人，“CuttingEdge：CD4+CD25+RegulatoryTCellsSuppressAntigen-SpecificAutoreactiveImmuneResponsesandCentralNervousSystemInflammationDuringActiveExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis，(前沿：CD4+CD25+调节性T细胞抑制活化的实验性自身免疫性脑脊髓炎过程中的抗原特异性自体反应免疫应答和中枢神经系统炎症)”J.Immunol.169：4712-4716(2002)，其全部内容通过引用并入本文)。鉴于最近显示Treg表达CD73，并且一些报道表明Treg发挥功能需要CD73的酶活性(Kobie等人，“TRegulatoryandPrimedUncommittedCD4TCellsExpressCD73，WhichSuppressesEffectorCD4TCellsbyConverting5’-AdenosineMonophosphatetoAdenosine，(T调节的且预处理的未定型CD4T细胞表达CD73，这通过将5’-腺苷单磷酸转换为腺苷来抑制效应CD4T细胞)”J.Immunol.177：6780-6786)；Deaglio等人，“AdenosineGenerationCatalyzedbyCD39andCD73ExpressedonRegulatoryTCellsMediatesImmuneSuppression，(由调节性T细胞上表达的CD39和CD73催化的腺苷的产生介导免疫抑制)”J.Exp.Med.204：1257-1265(2007)，其全部内容通过引用并入本文)，问及Treg的数量和抑制活性在cd73^-/-小鼠中是否是正常的。如图2A所示，在EAE诱导前后，野生型和cd73^-/-小鼠的CD4⁺FoxP3⁺Treg的频率没有显著差异。相似的，在EAE诱导后，野生型小鼠的表达CD73的CD4⁺T细胞的百分比仅有少量变化(图2B)。此外，观察到野生型和cd73^-/-Treg抑制MOG抗原特异性CD4⁺效应T细胞增殖的能力没有显著差异。为了确定当用MOG肽刺激时，cd73^-/-T细胞是否能够响应，评定了这些细胞增殖和产生细胞因子的能力。源自MOG免疫的cd73^-/-小鼠和野生型小鼠的CD4⁺T细胞在响应于不同浓度MOG肽时显示出相似的体外增殖程度。然而，相比于那些野生型的CD73⁺CD4⁺或CD73^-CD4⁺T细胞，源自MOG免疫的cd73^-/-小鼠的CD4⁺T细胞在体外MOG刺激后，分泌更高水平的IL-17和IL-1β(图2C)。IL-17水平的升高与MS(Matusevicius等人，“Interleukin-17mRNAExpressioninBloodandCSFMononuclearCellsisAugmentedinMultipleSclerosis，(血液和CSF单核细胞中的白介素-17的mRNA的表达在多发性硬化症中增强)”Mult.Scler.5：101-104(1999)，其全部内容通过引用并入本文)和EAE(Komiyama等人，“IL-17PlaysanImportantRoleintheDevelopmentofExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis，(IL-17在实验性自身免疫性脑脊髓炎的发展中的起重要作用)”J.Immunol.177：566-573(2006)，其全部内容通过引用并入本文)的发展相关，而高水平的促炎性反应IL-1β细胞因子是MS的危险因素(deJong等人.，“ProductionofIL-1betaandIL-1RaasRiskFactorsforSusceptibilityandProgressionofRelapse-OnsetMultipleSclerosis，(作为复发发作的多发性硬化症的易感性和进展的危险因素的IL-1β和IL-1Ra的产生)”J.Neuroimmunol.126：172-179(2002)，其全部内容通过引用并入本文)，并且是产生IL-17的增强剂(Sutton等人，“ACrucialRoleforInterleukin(IL)-1intheInductionofIL-17-ProducingTCellsThatMediateAutoimmuneEncephalomyelitis，(白细胞介素(IL)-1在介导自身免疫性脑脊髓炎的产生IL-17的T细胞的诱导中的关键作用)”J.Exp.Med.203：1685-1691(2006)，其全部内容通过引用并入本文)。MOG刺激后，观察到在野生型和cd73^-/-T细胞之间，IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、INF-γ和TNF-α的分泌没有差别(图2C)。综上所述，这些测定结果表明cd73^-/-T细胞能够对MOG免疫产生很好的应答。

接着确定来自cd73^-/-小鼠的T细胞是否具有引起EAE的能力。为了检测该问题，评价了源自MOG免疫的cd73^-/-小鼠的脾脏和淋巴结的CD4⁺T细胞在转移进入tcrα^-/-(cd73^+/+)受体小鼠后诱导EAE的能力。Tcrα^-/-小鼠缺乏内源性T细胞并且不能自主发生展EAE(Elliott等人，“MiceLackingAlphaBeta+TCellsareResistanttotheInductionofExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis，(缺乏αβ+T细胞的小鼠对诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎具有耐受性)”J.Neuroimmunol.70：139-144(1996)，其全部内容通过引用并入本文)。接受来自cd73^-/-供体的CD4⁺T细胞的cd73^+/+tcrα^-/-受体小鼠，相比于那些接受野生型CD4⁺T细胞的受体小鼠，发生了明显更严重的疾病(图2D)。野生型和cd73^-/-供体CD4⁺T细胞在转移进入cd73^+/+tcrα^-/-受体小鼠后显示出了相同的扩张程度。因此，来自cd73^-/-小鼠的CD4⁺T细胞当转移进入cd73^+/+tcrα^-/-小鼠时，不仅能够诱导EAE，还能引起比那些从野生型小鼠中得到的CD4⁺T细胞更严重的EAE。这些结果与体外测定一致，体外测定中cd73^-/-CD4⁺T细胞在响应于MOG刺激后，分泌升高水平的IL-17和IL-1β(已知能加重EAE(图2C)，并且这些结果还表明cd73^-/-小鼠由于在非造血细胞中缺乏CD73的表达(最可能在CNS中缺乏表达)而对MOG诱导的EAE具有耐受性。

实施例11-在EAE诱导后，Cd73-/-小鼠显示很少/没有淋巴细胞浸润进入CNS。

EAE是主要由CD4⁺T细胞介导的疾病(Montero等人，“RegulationofExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitisbyCD4+，CD25+andCD8+TCells：AnalysisUsingDepletingAntibodies，(由CD4+、CD25+和CD8+T细胞调节实验性自身免疫性脑脊髓炎：使用消耗抗体的分析)”J.Autoimmun.23：1-7(2004)，其全部内容通过引用并入本文)，并且在EAE进程中，发挥淋巴细胞必须首先获得进入CNS中的机会以便建立针对CNS抗原的炎症性响应，导致轴突的脱髓鞘和瘫痪(Brown等人，“TimeCourseandDistributionofInflammatoryandNeurodegenerativeEventsSuggestStructuralBasesforthePathogenesisofExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis，(炎症事件和神经变性事件的时间过程和分布表明实验性自身免疫性脑脊髓炎的发病机理的结构基础)”J.Comp.Neurol.502：236-260(2007)，其全部内容通过引用并入本文)。为了确定在cd73^-/-小鼠中的EAE诱导后CNS淋巴细胞浸润是否能被观察到，通过免疫组化检验了大脑和脊髓切片的CD4⁺T细胞和CD45⁺细胞的存在。在MOG免疫后13日，相比于野生型小鼠，cd73^-/-小鼠的CD4⁺淋巴细胞(图3D-G)和CD45⁺淋巴细胞(图4[补充图1])在大脑和脊髓中呈现了大幅降低的频率。此外，在淋巴细胞追踪实验中，当源自2d2TCR转基因小鼠的MOG-特异性T细胞(Bettelli等人，“MyelinOligodendrocyteGlycoprotein-SpecificTCellReceptorTransgenicMiceDevelopSpontaneousAutoimmuneOpticNeuritis，(髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白特异性的T细胞受体转基因小鼠形成了自发性自身免疫性视神经炎)”J.Exp.Med.197：1073-1081(2003)，其全部内容通过引用并入本文)转移进入伴随EAE诱导的野生型或cd73^-/-小鼠中，野生型受体小鼠CNS中的2d2细胞的百分比随时间增加了几倍，但是在cd73^-/-受体小鼠中却完全没有(图5)。综上所述，这些结果表明可观测到的保护cd73^-/-小鼠防止EAE诱导与CNS淋巴细胞浸润的相当大地降低相关。尽管如此，当来自MOG免疫的cd73^-/-小鼠的CD4⁺T细胞转移进入伴随地被诱导形成EAE的cd73^+/+tcrα^-/-小鼠后具备获得进入CNS的机会的能力(图3K和3L)。实际上，在接受cd73^-/-CD4⁺T细胞的cd73^+/+tcrα^-/-小鼠(图3K、L)中观察到了比那些接受野生型CD4⁺T细胞小鼠(图3H-J)更早的和更广泛的CNSCD4⁺淋巴细胞浸润。因此，这些结果阐明了来自cd73^-/-小鼠的供体T细胞具有浸润cd73^+/+受体小鼠的CNS的能力。

实施例12-CD73必须在淋巴细胞上或在CNS中表达才能有效形成EAE

接着问及CD4⁺T细胞上CD73的表达是否能够补偿CNS中CD73表达的缺乏，并且允许EAE的形成。因此，将CD4⁺T细胞从MOG免疫的野生型小鼠中过继转移进入伴随诱导了EAE的cd73^-/-受体中，并且与相似处理的野生型受体比较了疾病的活性(图6A)。当野生型受体如预期的在EAE诱导后发生疾病时，cd73^-/-受体也发生了显著的EAE，到诱导疾病后3周，平均疾病得分为1.5。这明显高于cd73^-/-小鼠正常情况下在同一时间点显示的0.5平均得分(图1)。为了进一步确定CD4⁺T细胞的CD73表达与EAE易感性的关系，将从免疫的野生型小鼠中分选的CD73⁺CD4⁺和CD73^-CD4⁺T细胞，或来自免疫的cd73^-/-小鼠的总CD4⁺(CD73-)T细胞转移进入伴随EAE诱导的cd73^-/-受体中(图6B)。接受野生型小鼠CD73⁺CD4⁺T细胞的cd73^-/-小鼠形成EAE，在诱导后3周平均得分约为1.5。相反的，接受源自野生型小鼠的CD73^-CD4⁺T细胞的cd73^-/-小鼠不形成显著的EAE。此外，在表达CD73的tcrα^-/-小鼠中具有引起严重EAE能力的来自cd73^-/-供体小鼠的CD4⁺细胞(图2D)，也不能在受体cd73^-/-小鼠中引起EAE(图6B)。因此，尽管T细胞上的CD73表达可以部分地补偿非造血细胞中CD73表达的缺乏，但是当CD73在两者中均表达时，才能最有效诱导EAE。

表达CD73的促进EAE发生的非造血细胞的身份是未知的。由于很多种类的内皮细胞表达CD73，BBB血管内皮细胞被认为是可能的候选细胞(Yamashita等人，“CD73ExpressionandFyn-DependentSignalingonMurineLymphocytes，(鼠类淋巴细胞上的CD73表达和Fyn依赖性信号传导)”Eur.J.Immunol.28：2981-2990(1998)，其全部内容通过引用并入本文)。然而，免疫组化显示，小鼠大脑内皮细胞是CD73^-的。然而，在这些实验过程中观察到，CD73在大脑脉络丛中大量表达(图6C)，脉络丛是EAE进展过程中淋巴细胞进入CNS的进入点((Brown等人，“TimeCourseandDistributionofInflammatoryandNeurodegenerativeEventsSuggestStructuralBasesforthePathogenesisofExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis，(炎症事件和神经变性事件的时间过程和分布表明实验性自身免疫性脑脊髓炎的发病机理的结构基础)”J.Comp.Neurol.502：236-260(2007)，其全部内容通过引用并入本文)。图4D显示诱导EAE后12日与野生型小鼠脉络丛有关的淋巴细胞浸润。还在脊髓的脑膜下区域观察了极小的CD73染色。总而言之，这些结果表明无论T细胞上或CNS内(也许在脉络丛上)的CD73表达是有效形成EAE所必需的。

实施例13-腺苷受体拮抗剂保护小鼠防止EAE诱导。

由于CD73催化AMP降解成为腺苷，并且AR在CNS内表达(Tsutsui等人，“A1AdenosineReceptorUpregulationandActivationAttenuatesNeuroinflammationandDemyelinationinaModelofMultipleSclerosis，(A1腺苷受体的上调和激活减弱了多发性硬化症模型中的神经炎症和脱髓鞘)”J.Neurosci.24：1521-1529(2004))；Rosi等人，TheInfluenceofBrainInflammationUponNeuronalAdenosineA2BReceptors，(大脑炎症对神经元腺苷A2B受体的影响)”J.Neurochem.86：220-227(2003)，其全部内容通过引用并入本文)，接着确定AR信号传导在EAE进程中是否重要。在EAE实验前1日和整个实验持续时期，用广谱AR拮抗剂咖啡因(Dall′Igna等人，“CaffeineasaNeuroprotectiveAdenosineReceptorAntagonist，(咖啡因作为神经保护性腺苷受体拮抗剂)”Ann.Pharmacother.38：717-718(2004)，其全部内容通过引用并入本文)处理野生型和cd73^-/-小鼠，用量为0.6g/L于其饮用水中，这与每日剂量大约为4.0mg/小鼠咖啡因相一致(Johansson等人，“A1andA2AAdenosineReceptorsandA1mRNAinMouseBrain：EffectofLong-TermCaffeineTreatment，(小鼠大脑中的A1和A2A腺苷受体以及A1mRNA：长期的咖啡因处理的作用)”BrainRes.762：153-164(1997)，其全部内容通过引用并入本文)(图7A)。相比于之前公布的结果(Tsutsui等人，“A1AdenosineReceptorUpregulationandActivationAttenuatesNeuroinflammationandDemyelinationinaModelofMultipleSclerosis，(A1腺苷受体的上调和激活减弱了多发性硬化症模型中的神经炎症和脱髓鞘)”J.Neurosci.24：1521-1529(2004)，其全部内容通过引用并入本文)，接受咖啡因的野生型小鼠能受到显著的保护防止EAE形成(图7A)。如所预期的，接受咖啡因的cd73^-/小鼠没有形成EAE(图7A)。由于CD73在脉络丛上大量表达(图6C)，接着确定AR是否也在脉络丛上表达。利用Z310鼠类脉络丛细胞系(Zheng等人，“EstablishmentandCharacterizationofanImmortalizedZ310ChoroidalEpithelialCellLinefromMurineChoroidPlexus，(来自小鼠脉络丛的永生化Z310脉络膜上皮细胞系的建立和表征)”BrainRes.958：371-380(2002)，其全部内容通过引用并入本文)，由定量PCR仅检测A1和A_2a腺苷受体亚型的mRNA(图7B)。由于A₁AR^-/-小鼠之前已显示在疾病诱导后能发生严重的EAE(Tsutsui等人，“A1AdenosineReceptorUpregulationandActivationAttenuatesNeuroinflammationandDemyelinationinaModelofMultipleSclerosis，(A1腺苷受体的上调和激活减弱了多发性硬化症模型中的神经炎症和脱髓鞘)”J.Neurosci.24：1521-1529(2004)，其全部内容通过引用并入本文)，问及用对A_2a亚型具有特异性的AR拮抗剂SCH58261(Melani等人，“TheSelectiveA2AReceptorAntagonistSCH58261ProtectsFromNeurologicalDeficit，BrainDamageandActivationofp38MAPKinRatFocalCerebralIschemia(选择性A2A受体拮抗剂SCH58261保护免受大鼠局灶性脑缺血的神经缺陷、大脑损害和p38MAPK的激活)，”BrainRes.1073-1074：470-480(2006)，其全部内容通过引用并入本文)处理野生型小鼠是否能够保护防止EAE形成。EAE诱导前1日和整个30日的实验过程中，每日给予野生型小鼠1mg/kg在DMSO中的SCH58261或单独的DMSO，静脉地和皮下地(总共为2mg/kg)共同给予(图7C)。相比于只接受DMSO的野生型小鼠，接受SCH58261的野生型小鼠显著地受到保护防止EAE形成(图7C)。此外，在EAE诱导后15日，相比于DMSO处理的野生型小鼠，给予SCH58261的野生型小鼠显示了大脑和脊髓中CD4⁺淋巴细胞频率的显著降低(图7D)。鉴于研究显示脉络丛上的粘附分子(例如，ICAM-1、VCAM-1和MadCAM-1)在EAE发病中发挥了作用(Engelhardt等人，“InvolvementoftheChoroidPlexusinCentralNervousSystemInflammation，(脉络丛参与中枢神经系统炎症)”Microsc.Res.Tech.52：112-129(2001)，其全部内容通过引用并入本文)，确定了在EAE诱导后，SCH58261处理是否影响粘附分子在脉络丛上的表达。比较DMSO和SCH58261处理的野生型小鼠的脉络丛，显示A_2aAR阻断防止了在EAE进程中正常出现的ICAM-1的上调(图8)。

基于这些结果，得出结论：cd73^-/-小鼠不能催化细胞外腺苷的产生解释了它们在MOG免疫后不能有效地形成EAE，并且EAE进程需要脉络丛上的CD73表达和A_2aAR信号传导。

本研究的目标是评价CD73在MS的动物模型EAE中的作用。鉴于CD73催化了通常是免疫抑制的细胞外腺苷的形成(Bours等人，“Adenosine5’-TriphosphateandAdenosineasEndogenousSignalingMoleculesinImmunityandInflammation，(作为免疫和炎症中的内源性信号传导分子的腺苷5’-三磷酸和腺苷)”Pharmacol.Ther.112：358-404(2006)，其全部内容通过引用并入本文)，并且A₁AR^-/-小鼠显示严重的EAE(Tsutsui等人，“A1AdenosineReceptorUpregulationandActivationAttenuatesNeuroinflammationandDemyelinationinaModelofMultipleSclerosis，(A1腺苷受体的上调和激活减弱了多发性硬化症模型中的神经炎症和脱髓鞘)”J.Neurosci.24：1521-1529(2004)，其全部内容通过引用并入本文)，申请人预测cd73^-/-小鼠也能形成严重EAE。然而，cd73^-/-小鼠对EAE诱导具有高度的耐受性，这是考虑到大量的证明cd73^-/-小鼠更易于发炎的研究的一项意想不到的发现。例如，cd73^-/-小鼠对博来霉素引起的肺损伤更敏感(Volmer等人，“Ecto-5′-Nucleotidase(CD73)-MediatedAdenosineProductionisTissueProtectiveinaModelofBleomycin-InducedLungInjury，(外-5′-核苷酸酶(CD73)介导的腺苷产生在博来霉素引起的肺损伤的模型中是组织保护性的)”J.Immunol.176：4449-4458(2006)，其全部内容通过引用并入本文)，并且更易于患血管炎症和新内膜形成(Zernecke等人，“CD73/ecto-5′-NucleotidaseProtectsAgainstVascularInflammationandNeointimaFormation，(CD73/外-5′-核苷酸酶保护防止血管炎症和新内膜形成)”Circulation113：2120-2127(2006)，其全部内容通过引用并入本文)。与这些报道相一致，申请人显示，在MOG刺激后，cd73^-/-T细胞产生更高水平的EAE相关的促炎细胞因子IL-1β和IL-17。此外，过继转移cd73^-/-T细胞至缺乏T细胞但在其外围各处表达CD73的tcrα^-/-小鼠，导致了在MOG免疫后的严重的CNS炎症，与腺苷作为抗炎症介质的作用相一致。有趣的是注意到，最有效的MS治疗法之一的IFN-β治疗显示出，在体外和体内均上调内皮细胞上的CD73表达(Airas等人，“MechanismofActionofIFN-BetaintheTreatmentofMultipleSclerosis：ASpecialReferencetoCD73andAdenosine，(IFN-β在治疗多发性硬化症中的作用机制：对CD73和腺苷的特别参考)”Ann.N.Y.Acad.Sci.1110：641-648(2007)，其全部内容通过引用并入本文)。因此，尽管IFN-β使MS患者受益的机制还未完全了解，伴随腺苷已知的抗炎症和神经保护作用的腺苷产生的增加可能是一个因素。

与cd73^-/-小鼠对EAE诱导的耐受性一致，相比于野生型小鼠，cd73^-/-小鼠在EAE期间细胞浸润CNS的频率更小。这也是一个意料之外的发现，鉴于CD73产生的腺苷之前已经显示限制中性白细胞在缺氧时迁移穿过血管内皮和淋巴细胞迁移穿过引流淋巴结的高内皮微静脉(Thompson等人，“CrucialRoleforEcto-5’-Nucleotidase(CD73)inVascularLeakageDuringHypoxia，(外-5’-核苷酸酶(CD73)在低氧期间的血管渗漏中的关键作用)”J.Exp.Med.200：1395-1405(2004)，其全部内容通过引用并入本文)。相反，申请人的数据显示，病原性T细胞进入CNS的有效通道需要CD73和CD73产生的细胞外腺苷。因此，CD73和腺苷在EAE期间CNS淋巴细胞浸润中的作用比其在调节神经炎症中的作用更深远。

知道T细胞迁移进入CNS内CD73必须被表达的位置，这是很重要的。CD73在T细胞亚群上(Yamashita等人，“CD73ExpressionandFyn-DependentSignalingonMurineLymphocytes，(鼠类淋巴细胞上的CD73表达和Fyn依赖性信号传导)”Eur.J.Immunol.28：2981-2990(1998)，其全部内容通过引用并入本文)以及某些上皮细胞(Strohmeier等人，“SurfaceExpression，Polarization，andFunctionalSignificanceofCD73inHumanIntestinalEpithelia，(在人肠上皮中CD73的表面表达、极化和功能重要性)”J.Clin.Invest.99：2588-2601(1997)，其全部内容通过引用并入本文)和内皮细胞中(Yamashita等人，“CD73ExpressionandFyn-DependentSignalingonMurineLymphocytes，(鼠类淋巴细胞上的CD73表达和Fyn依赖性信号传导)”Eur.J.Immunol.28：2981-2990(1998)，其全部内容通过引用并入本文)上发现。此处列出的数据清楚地阐明，尽管cd73^-/-T细胞能很好的响应于MOG免疫，但除非CD73在非造血组织(即，在从cd73^-/-小鼠过继转移CD4⁺T细胞后形成EAE的cd73^+/+tcrα^-/-小鼠)中表达，否则cd73^-/-T细胞不能进入CNS。非造血细胞上缺乏CD73，也可以部分的由T细胞上表达的CD73来补偿(即，当CD73⁺而非CD73^-的CD4⁺T细胞被过继转移时，cd73^-/-小鼠变得对EAE敏感)。因为CD73在人类大脑内皮细胞上表达(Airas等人，“MechanismofActionofIFN-BetaintheTreatmentofMultipleSclerosis：ASpecialReferencetoCD73andAdenosine，(IFN-β在治疗多发性硬化症中的作用机制：对CD73和腺苷的特别参考)”Ann.N.Y.Acad.Sci.1110：641-648(2007)，其全部内容通过引用并入本文)，当BBB内皮细胞作为CNS内CD73的相关来源来考虑时，免疫组化显示小鼠大脑内皮细胞是CD73-的。然而，发现CD73在脉络丛上皮细胞上大量表达，这些细胞形成了血液和脑脊髓液(CFS)之间的屏障，并且具有调节淋巴细胞在CNS内的免疫监视的作用(Steffen等人，“CAM-1，VCAM-1，andMAdCAM-1areExpressedonChoroidPlexusEpitheliumbutNotEndotheliumandMediateBindingofLymphocytesInVitro，(CAM-1、VCAM-1和MAdCAM-1被表达在脉络丛上皮而不是内皮上，并且介导体外淋巴细胞的结合)”Am.J.Pathol.148：1819-1838(1996)，其全部内容通过引用并入本文)。脉络丛也表明为T细胞在EAE进程起动期间的进入点(Brown等人，“TimeCourseandDistributionofInflammatoryandNeurodegenerativeEventsSuggestStructuralBasesforthePathogenesisofExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis，(炎症事件和神经变性事件的时间过程和分布表明实验性自身免疫性脑脊髓炎的发病机理的结构基础)”J.Comp.Neurol.502：236-260(2007)，其全部内容通过引用并入本文)。尽管已经很好地证明了在EAE和MS两者中，淋巴细胞-大脑内皮细胞经由VLA-4/VCAM-1结合的相互作用(Rice等人，“Anti-Alpha4IntegrinTherapyforMultipleSclerosis：MechanismsandRationale，(用于多发性硬化症的抗α4整联蛋白治疗：机制和原理)”Neurology64：1336-1342(2005)，其全部内容通过引用并入本文)，也许至少在EAE中，穿过内皮的BBB的淋巴细胞运输对于疾病的保持和进展比疾病的起动更重要。

接下来一个问题是CD73如何促进T细胞迁移进入CNS。早期的工作显示，淋巴细胞CD73能够促进人类淋巴细胞以LFA-1-依赖性方式结合内皮细胞(Airas等人，“CD73EngagementPromotesLymphocyteBindingtoEndothelialCellsViaaLymphocyteFunction-AssociatedAntigen-1-dependentMechanism，(CD73的参与通过淋巴细胞功能相关的抗原-1依赖性机制促进淋巴细胞与内皮细胞结合)”J.Immunol.165：5411-5417(2000)，其全部内容通过引用并入本文)。然而，这似乎并不是CD73在EAE中的功能，因为在cd73^+/+tcrα^-/-小鼠中CD73缺陷的T细胞能够进入CNS并且引起严重的疾病(图2D)。可选择的，CD73能够作为产生细胞外腺苷的酶而发挥功能，细胞外腺苷是细胞表面AR的配体。正是后面这种功能与现在的工作相关联，假如由咖啡因或SCH58261对AR的阻断能够保护小鼠防止EAE。尽管广谱AR拮抗剂咖啡因也抑制某些磷酸二酯酶(Choi等人，“CaffeineandTheophyllineAnalogues：CorrelationofBehavioralEffectsWithActivityasAdenosineReceptorAntagonistsandasPhosphodiesteraseInhibitors，(咖啡因和茶碱类似物：作为腺苷受体拮抗剂与作为磷酸二酯酶抑制剂的活性的行为作用的关联)”LifeSci.43：387-398(1988)，其全部内容通过引用并入本文)，其对EAE进程的调节更可能是通过其对AR信号转导的影响(Tsutsui等人，“A1AdenosineReceptorUpregulationandActivationAttenuatesNeuroinflammationandDemyelinationinaModelofMultipleSclerosis，(A1腺苷受体的上调和激活减弱了多发性硬化症模型中的神经炎症和脱髓鞘)”J.Neurosci.24：1521-1529(2004)，其全部内容通过引用并入本文)。这种想法受如下事实支持：SCH58261也通过特异性的抑制A_2aAR信号传导防止EAE进程。鉴于CD73和A₁以及A_2aAR亚型都在脉络丛上表达，由CD73在脉络丛产生的细胞外腺苷能够以自分泌的方式产生信号。

鉴于A₁和A_2aAR相互之间在功能上是拮抗的，并且对于腺苷存在不同的亲和力(Quarta等人，“OppositeModulatoryRolesforAdenosineA1andA2AReceptorsonGlutamateandDopamineReleaseintheShelloftheNucleusAccumbens.EffectsofChronicCaffeineExposure，(腺苷A1和A2A受体对伏核的壳中谷氨酸和多巴胺释放的相反的调节作用)”J.Neurochem.88：1151-1158(2004)，其全部内容通过引用并入本文)，细胞外腺苷浓度决定了表达A₁和A_2a受体的细胞将会如何应答；因此创建了凭借低浓度腺苷活化A1亚型和更高浓度腺苷刺激A_2a亚型的转换机制(Ciruela等人，“PresynapticControlofStriatalGlutamatergicNeurotransmissionbyAdenosineA1-A2AReceptorHeteromers，(由腺苷A1-A2A受体异聚体对纹状体谷氨酸的神经传递进行的突出前控制)”J.Neurosci.26：2080-2087(2006)，其全部内容通过引用并入本文)。在CNS中，有证据表明这种A₁/A_2a相互作用在介导神经细胞炎症中是很重要的，这时A1信号传导是保护性的而A_2a信号传导促进炎症。例如，缺乏A1腺苷受体的小鼠在疾病诱导后形成严重的EAE(Tsutsui等人，“A1AdenosineReceptorUpregulationandActivationAttenuatesNeuroinflammationandDemyelinationinaModelofMultipleSclerosis，(A1腺苷受体的上调和激活减弱了多发性硬化症模型中的神经炎症和脱髓鞘)”J.Neurosci.24：1521-1529(2004)，其全部内容通过引用并入本文)，而被给予A_2a拮抗剂的小鼠受到完全保护防止EAE(图5C)。此外，缺乏A_2a受体的小鼠受到保护防止由短暂局灶性缺血引起的大脑损伤(Chen等人.，“A(2A)AdenosineReceptorDeficiencyAttenuatesBrainInjuryInducedbyTransientFocalIschemiainMice，(A(2A)腺苷受体缺陷减弱了在小鼠中由短暂局灶性缺血引起的大脑损伤)”J.Neurosci.19：9192-9200(1999)，其全部内容通过引用并入本文)。因此，在脉络丛的CD73产生的腺苷信号传导显示出在调节CNS炎症上起非常重要的作用。

这种腺苷信号传导很可能调节脉络丛粘附分子的表达。研究表明，在脉络丛的粘附分子ICAM-1、VCAM-1和MadCAM-1的上调与EAE进程相关(Engelhardt等人，InvolvementoftheChoroidPlexusinCentralNervousSystemInflammation，(脉络丛参与中枢神经系统炎症)”Microsc.Res.Tech.52：112-129(2001)，其全部内容通过引用并入本文)。鉴于经A_2aAR拮抗剂SCH58261处理的小鼠未出现通常伴随EAE诱导出现的脉络丛ICAM-1表达增加(图8)(Engelhardt等人，“InvolvementoftheChoroidPlexusinCentralNervousSystemInflammation，(脉络丛参与中枢神经系统炎症)”Microsc.Res.Tech.52：112-129(2001)，其全部内容通过引用并入本文)，现有结果表明A_2aAR信号传导在EAE进程中增加ICAM-1。

综上所述，这些数据显示CD73在EAE进程中起到了关键的作用。缺乏CD73的小鼠受到保护防止与EAE诱导相关的退化症状和CNS炎症。本研究首次阐明在EAE期间，淋巴细胞有效进入CNS需要CD73的表达和AR信号传导。此处显示的数据可能将会是引导对MS和其他神经炎症疾病的新疗法的征途中迈出的第一步。

实施例14-可以通过腺苷受体的活化调节BBB

本实验的目的是确定血脑屏障是否能够通过腺苷受体的活化来调节。NECA是一种非选择性腺苷受体激动剂，对腺苷受体A1、A2a和A3具有相似的亲和力，而对于腺苷受体A2b的亲和力较低。为了确定腺苷受体的活化是否能够诱导伊文思蓝染料穿过血脑屏障(BBB)的外渗，小鼠用如下试剂处理：非选择性腺苷受体激动剂NECA(n＝5,100μl0.01nM)；A2a腺苷受体特异性拮抗剂SCH58261(n＝5,1mg/kg)；已知的诱导BBB渗漏的试剂百日咳毒素并照这样作为载体对照(n＝7,200μl)；和作为载体对照的PBS(n＝5,100μl)。缺乏产生细胞外腺苷活性的CD73^-/-小鼠也用NECA处理(n＝4,100μl0.01nM)。在静脉注射200μl1％伊文思蓝染料(总共注射2μg染料)前1小时，单次静脉注射作为处理而施用。在施用伊文思蓝后4小时，用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠，并经由左心室灌注冰冷的PBS。收集大脑，并用5μl/mg(v∶w)n，n-二甲基甲酰胺(DMF)均匀化。组织在DMF中于室温孵育72小时以抽提染料。紧接着抽提之后，组织/溶剂混合物于500×g离心30分钟，取100μl上清液用BioTex分光光度计读取620nm处的值。数据表示为μg伊文思蓝/mlDMF。

用普通腺苷受体激动剂NECA处理小鼠能够诱导染料迁移穿过血脑屏障。这表明该屏障能够通过腺苷受体活化来调节。在图9A中，缺乏细胞外腺苷并且因此不能通过腺苷受体发送足够信号的CD73^-/-小鼠经过NECA处理，与PBS对照相比，导致染料迁移增长了几乎5倍。因为申请人已经指出用该拮抗剂阻断A2a腺苷受体能够防止淋巴细胞进入大脑中，所以使用SCH58261作为阴性对照(Mills等人，“CD73isRequiredforEfficientEntryofLymphocytesintotheCentralNervousSystemDuringExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis，(在实验性自身免疫性脑脊髓炎期间淋巴细胞有效进入中枢神经系统需要CD73)”Proc.Natl.Acad.Sci.105(27)：9325-9330(2008)，其全部内容通过引用并入本文)。在图9B中，由NECA处理的野生型小鼠也显示出了增加超过对照小鼠。由于已知百日咳在小鼠EAE模型中能诱导血脑屏障渗漏，它被用于作为阳性对照。

实施例15-在人内皮细胞系hCMEC/D3中表达A2a和A2b腺苷受体

为了建立体外血脑屏障(BBB)，获取了人类大脑内皮细胞系hCMEC/D3(Weksler等人，“Blood-brainBarrier-specificPropertiesofaHumanAdultBrainEndothelialCellLine，(成人大脑内皮细胞系的血脑屏障特定的特性)”J.Neurochem.19(13)：1872-4(2005)；Poller等人，“TheHumanBrainEndothelialCellLinehCMEC/D3asaHumanBlood-brainBarrierModelforDrugTransportStudies，(人大脑内皮细胞系hCMEC/D3作为人血脑屏障模型用于药物运输研究)”J.Neurochem.107(5)：1358-1368(2008)，其全部内容通过引用并入本文)，之前已叙述了该细胞系具有BBB特性。在此，建立了在这些细胞上的腺苷受体的表达模式。

使hCMEC/D3细胞生长至汇合，收集细胞，并用TRIzol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)按照制造商说明书提取RNA。用VersocDNA试剂盒(ThermoScientific,Waltham,MA)合成cDNA，并且用PowerSYBRGreen(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)进行实时PCR。

如图10所示，发现A2a和A2b腺苷受体在人内皮细胞系hCMEC/D3上表达。

实施例16-腺苷受体对大脑内皮细胞的刺激促进淋巴细胞迁移穿过BBB

血脑屏障(BBB)是由内皮细胞组成的。在EAE晚期，已知淋巴细胞穿过BBB。为了确定是否腺苷受体对大脑内皮细胞的刺激能够促进淋巴细胞迁移穿过BBB，建立了体外BBB。获得了人类大脑内皮细胞系hCMEC/D3(Weksler等人,“Blood-brainBarrier-specificPropertiesofaHumanAdultBrainEndothelialCellLine,(成人大脑内皮细胞系的血脑屏障特定的特性)”J.Neurochem.19(13):1872-4(2005)；Poller等人,“TheHumanBrainEndothelialCellLinehCMEC/D3asaHumanBlood-brainBarrierModelforDrugTransportStudies,(人大脑内皮细胞系hCMEC/D3作为人血脑屏障模型用于药物运输研究)”J.Neurochem.107(5):1358-1368(2008)，其全部内容通过引用并入本文)，之前已叙述了该细胞系具有BBB特性。

将hCMEC/D3细胞接种于Transwell并允许其生长至汇合。加入2x10⁶个Jurkat细胞至上层小室，同时加入或不加入NECA(普通的腺苷受体[AR]激动剂)、CCPA(A1AR激动剂)、CGS21680(A2AAR激动剂)或DMSO载体。24小时后，对迁移至下层小室的细胞计数。数值与迁移通过无HCMECD3接种的transwells的细胞数相关。

如图11所示，广谱腺苷受体激动剂NECA诱导了一些迁移。A2a腺苷受体激动剂CGS在低浓度使用时促进淋巴细胞迁移穿过体外BBB。A1激动剂CCPA高水平诱导淋巴细胞迁移，这可能是由于A2a腺苷受体的活化，该受体具有较低的CCPA亲和力，因此仅在高水平CCPA时活化。

实施例17-A2a腺苷受体活化促进淋巴细胞迁移穿过CP

脉络丛(“CP”)控制淋巴细胞迁移进入CNS。CP表达A1和A2a腺苷受体。当A2a腺苷受体活性被阻断时，EAE在小鼠中被阻止。当A1腺苷受体缺失时，EAE加强。据假设，A2a腺苷受体活化促进淋巴细胞迁移穿过CP。Z310细胞是鼠类脉络丛细胞系。

为了检验该假设，将Z310细胞接种于Transwell膜上，并且允许其生长至汇合。加入2x10⁶个Jurkat细胞至上层小室，同时加入或不加入NECA(n＝1，普通AR激动剂)、CCPA(n＝1，A1AR激动剂)、CGS21680(n＝1，A2AAR激动剂)或DMSO载体(n＝1)。24小时后，对迁移至下层小室的细胞计数。数值与迁移通过无Z310接种的transwells的细胞数相关，结果如图12所示。

如图12所示，广谱腺苷受体激动剂NECA诱导迁移。A2a腺苷受体激动剂CGS促进淋巴细胞迁移穿过CP。A1激动剂CCPA高水平诱导了淋巴细胞迁移，可能是由于A2a腺苷受体的活化，该受体具有较低的CCPA亲和力，因此像这样仅在高水平CCPA时活化。

实施例18-人类大脑内皮细胞对腺苷受体诱导的cAMP调节敏感

腺苷受体的活化调节细胞中的cAMP水平。为了确定人类大脑内皮细胞是否对腺苷受体诱导的cAMP调节敏感，将人类大脑内皮细胞与不同浓度的腺苷受体激动剂一起培养，接着分析cAMP水平，如图13所示。

HCMECD3细胞在24孔板上生长至汇合。鉴于已知腺苷受体(“AR”)的刺激影响cAMP水平，使用或不使用不同浓度的NECA(普通AR激动剂)、CCPA(A1AR激动剂)、CGS21680(A2AAR激动剂)、DMSO载体或毛喉素(诱导cAMP)处理细胞。15分钟后，加入裂解缓冲液，并将细胞于-80℃冷冻以终止反应。每个条件使用两个重复样品。用cAMPScreen试剂盒(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)分析cAMP水平。

如图13所示，广谱腺苷受体激动剂NECA提高cAMP水平，证实这些细胞能够响应于腺苷受体信号传导。高水平的A1腺苷受体激动剂CCPA提高cAMP水平，再一次可能是由于A2a腺苷受体的活化，该受体具有较低的CCPA亲和力，因此像这样仅在高水平CCPA时活化。A2a腺苷受体激动剂CGS轻微地提高人类大脑内皮细胞系中的cAMP水平。

实施例19-雌性A1腺苷受体敲除小鼠形成比野生型严重的EAE

在脉络丛上表达A1和A2a腺苷受体。A2a腺苷受体拮抗剂保护小鼠防止EAE。缺乏A1腺苷受体的小鼠比野生型对照易于形成更严重的EAE？为了回答这个问题，比较了野生型和无A1腺苷受体小鼠的疾病概况。

雌性A1腺苷受体敲除小鼠(A1ARKO，n＝5)和野生型小鼠(WT，n＝5)在2008年12月2日用CFA/MOG_35-55+PTX免疫，并且持续41日每日评分。如图14的结果所示，A1ARKO小鼠形成了比WT更严重的EAE，并且也比WT形成疾病速度更快。

实施例20-喂饲腺苷受体拮抗剂的野生型小鼠大脑比喂饲苷受体拮抗剂的CD73^-/-小鼠大脑具有更高水平的异硫氰酸荧光素-葡聚糖

为了检测普通腺苷受体拮抗剂咖啡因对血脑屏障通透性的影响，用咖啡因喂饲小鼠数日，接着注射通常用于评价内皮细胞通透性的FITCDextran。

更具体的说，连续5日喂饲小鼠含有0.6g/l咖啡因(Sigma，St.Louis，MO)的水或任意常规的水。给予小鼠皮下注射FITCDextran(10,000MW，MolecularProbes，Eugene，OR)，并且30分钟后，用冰冷的PBS经由左心室灌注小鼠。移除大脑并且在OCT(TissueTek，Torrance，CA)中速冻，并于-80℃储存直至切片。组织切片(5μm)用苏木精染色，用于光学显微镜观察，并用DAPI作为荧光复染剂。结果如图15所示。

如图15A所示，喂饲咖啡因的CD73^-/-小鼠大脑切片的影像呈现了比野生型小鼠少得多的浓绿色，表明较少的FITC-Dextran外渗穿过血脑屏障。野生型小鼠大脑切片呈现了浓绿色背景(图15B)，这预示更多的FITC-Dextran外渗穿过血脑屏障。图16以图形的形式显示野生型小鼠的结果。

实施例21-腺苷受体激动剂NECA增加伊文思蓝染料外渗穿过血脑屏障

本实验的目的是确定血脑屏障是否能够通过腺苷受体的活化来调节。NECA是非选择性腺苷受体激动剂，对A1、A2A和A3腺苷受体有相似的亲和力，而对A2b腺苷受体亲和力较低。

为了确定腺苷受体的活化是否会诱导伊文思蓝染料外渗穿过血脑屏障(BBB)，小鼠首先在第1日用非选择性腺苷受体激动剂NECA(n＝2,100μl0.01nM)和作为载体对照的PBS(n＝2,100μl)处理。然后在第2日小鼠用CFA-MOG_35-55和百日咳免疫，以诱导EAE。然后每隔一日在第3日、5日、7日、9日施用NECA或PBS。在第10日，小鼠静脉注射200μl1％伊文思蓝染料(总共注射2μg染料)。施用伊文思蓝6小时后，用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠，并经由左心室灌注冰冷的PBS。收集大脑，并用5μl/mg(v∶w)的n，n-二甲基甲酰胺(DMF)均匀化。组织在DMF中于室温孵育72小时以抽提染料。紧接着抽提之后，将组织/溶剂混合物于500×g离心30分钟，并且取100μl上清液用BioTex分光光度计读取620nm处的值。数据表示为pg伊文思蓝/mlDMF，并显示在图17中。

该实验阐明用普通腺苷受体激动剂NECA处理小鼠诱导伊文思蓝染料迁移进入EAE免疫的小鼠的CNS内。这表明在EAE模型中的血脑屏障能够通过腺苷受体的活化来调节。用NECA处理的野生型EAE小鼠显示BBB通透性的增加超过PBS对照EAE小鼠。

尽管已经在此详细描述和叙述了优选的实施方案，对于相关领域的技术人员而言明显的是，可以做出各种修饰、添加、置换等而不背离本发明的精神，并且这些因此被认为是在如下权利要求所定义的本发明的范围之内。

Claims (9)

1.A2A腺苷受体激动剂在制备增加接受治疗药物的受治疗者血脑屏障通透性的药物中的用途，其中所述受治疗者对于递送所述治疗药物穿过血脑屏障受益于增加的血脑屏障通透性。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述A2A腺苷受体激动剂为NECA和/或CGS21680。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物还包括治疗药物，且其中所述治疗药物有效治疗中枢神经系统的疾患或病症。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物用于治疗选自由精神/行为的疾患和CNS疾病组成的组的病症。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述药物用于治疗选自由精神分裂症、躁狂抑郁、痴呆和双相障碍组成的组的精神/行为的疾患。

6.（i）有效治疗所述中枢神经系统疾患或病症的治疗药物；和

（ii）血脑屏障透化剂在制备治疗中枢神经系统的疾患或病症的药物中的用途，其中所述剂为A2A腺苷受体激动剂；

其中在所述治疗药物有效穿过血脑屏障并且治疗所述疾患或病症的条件下，施用所述治疗药物和所述血脑屏障透化剂。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述治疗药物和血脑屏障透化剂连接在一起。

8.根据权利要求6所述的用途，其中A2A腺苷受体激动剂为NECA和/或CGS21680。

9.根据权利要求6所述的用途，其中所述施用在静脉内执行。