CN101426508A - 治疗癌症的己糖化合物 - Google Patents
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Abstract
通过给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的己糖化合物而提供了治疗恶性胶质瘤和胰腺癌的方法。本发明包括治疗大脑癌症和胰腺癌的方法,包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的甘露糖化合物。本发明还包括治疗肿瘤增生的方法,包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的2-FM。
Description
相关申请
本申请要求享有2006年2月24日提出的美国临时专利申请60/776,793、2006年4月27日提出的美国临时专利申请60/795,621、2006年4月27日提出的美国临时专利申请60/796,173的优先权。这些申请在此全部引入作为参考。
技术领域
本发明指向可用于治疗癌症的己糖化合物,以及通过施用这种化合物来治疗需要这种治疗的受试者中的癌症介导的疾病的方法。
背景技术
癌症的治疗往往与对肿瘤抗性发展的挑战相联系。凋亡是一种编程性细胞死亡,包括一系列会导致细胞形态学改变和死亡的生化事件。凋亡程序以安全地处理细胞碎片的方式被执行。然而,通过阐明癌症治疗过程中的细胞内信号传导路径,有可能改变诱导细胞死亡的关键结构和程序。确实,有缺陷的凋亡程序已经与许多疾病相关。过度凋亡导致细胞遗失性疾病,如缺血性疾病。另一方面,凋亡的数量不足会导致不受控制的细胞增生,例如癌症。
恶性神经胶质瘤进程中发生的变化可能与PI-3K/AKT路径的激活相关(通常通过PTEN缺失或者通过生长因子活性如EGFR的活性)。这种存活路径激活许多适应性变化,优选地,其中包括血管发生的刺激物、凋亡抑制剂和促进糖酵解激活的代谢转变。类似地,胰腺癌的新治疗靶标包括信号传导路径的靶点和与血管发生,特别地,ras致癌基因信号路径相关的分子和基质金属蛋白酶(MMP)的抑制剂。
许多癌症对传统治疗具有固有的抗性,在治疗上具有极大的挑战性,如恶性神经胶质瘤和胰腺癌。每年恶性神经胶质瘤的发生率为每万人中有6.4个病例(Central Brain Tumor Registry of the United States,2002-2003),是最常见的原发性脑瘤和致命性人类癌症的亚类。当其表现为最具侵略性的恶性胶质瘤多态形(GBM)时,即使尽最大努力进行治疗,患者的平均存活时期为9~12个月。实际上,尽管进行放射治疗和化学治疗,在约1/3患有GBM的患者中,肿瘤仍然继续生长。类似地,一般认为胰腺癌的预后是非常差的,这取决于诊断时肿瘤扩散的程度,很少患者能够在诊断5年后仍然存活,而完全免除的患者更为罕见。
进一步地,除了肿瘤对治疗产生抗性之外,恶性肿瘤治疗中的另一个问题在于治疗对未受该疾病影响的正常组织具有毒性作用。化学治疗通常靶向杀死快速分化的细胞,而不管这些细胞是正常的还是恶性的。然而,如果能够破坏肿瘤的生长控制路径,则对于抑制肿瘤而言,大范围的细胞死亡和癌症治疗的相关副作用就不是必需的。例如,一种方法利用治疗的敏感化,使用低剂量的标准治疗结合特异性靶向肿瘤细胞中的关键过程的药物,从而增强其他药物的作用。
此外,联合治疗包括基于疫苗的方法,与具有免疫治疗的肿瘤细胞毒性特异性的减灭细胞的和免疫调节的化疗元件相结合。然而,对于患者和医生来说,联合治疗一般比仅需要单一药剂的治疗方法更加困难。此外,某些肿瘤对放疗具备固有的抗性,许多化疗形式可能由于差别生长模式和不同种类的生长模式而在各个肿瘤中表现出不同低氧程度的区域。例如,神经胶质瘤主要以渗透的方式生长,相对于更为快速的明显增加的实质损害,在MRI扫描中极少或未见到明显的增大肿瘤。类似地,早期的胰腺癌可能不被检出。同样,含氧量相对低的区域可见于迅速生长的肿瘤实体的中心,该中心往往具有与该肿瘤相关的坏死区域,含氧量相对低的区域还可见于肿瘤渗入部分中的某些含氧量相对低的区域。因此,一些这种含氧量相对低的区域可能含有细胞,这些细胞以较为缓慢的速度循环,因此对化疗剂可能具有抗性。
最近,某些癌症治疗建议把目标投向利用糖酵解抑制剂。这类抑制剂被设计成能够从细胞由有氧代谢转变为无氧代谢选择性结果中获益。因为肿瘤的生长,癌细胞从血液中被除去(氧气供应)。在低氧的条件下,肿瘤细胞上调转运蛋白和糖酵解酶的表达,接着,有利于相对有氧环境下的正常细胞增加葡萄糖类似物的摄取。阻断血液中的细胞内的糖酵解不会杀死该细胞,这是因为该细胞通过利用氧气燃烧其线粒体中的脂肪和蛋白质生成能量而存活(通过储存能量的分子例如ATP)。相反,当低氧环境中的细胞内的糖酵解被阻断时,该细胞死亡,因为没有氧气,该细胞不能通过线粒体氧化脂肪和蛋白质来产生能量。因此,虽然糖酵解抑制剂具有治疗某些癌症的前景,但是对于含氧量低的环境中的癌细胞没有治疗作用。实际上,Otto瓦尔堡的经典观察已经证明许多肿瘤偏爱优先利用糖酵解来产生细胞能量,即使在存在足量的氧气的情况下(这被称作为氧化糖酵解或“瓦尔堡效应”)。对于恶性神经胶质瘤来说,这种肿瘤的适应反应看来似乎也是适用的。
因此,存在对一种治疗方法的需求,该方法用于治疗对化疗抗性的,显示出差别生长模式或者在肿瘤中具有不同程度低氧区域的生长模式,和/或具有刺激血管生成或抑制凋亡的存活路径的癌症。
发明概述
已经发现了预防、抑制和调节癌症的己糖化合物及其药物组合物,以及使用该化合物来治疗癌症,特别是恶性胶质瘤和胰腺癌。本发明公开了己糖化合物用于治疗癌症和癌症介导的疾病和状况的用途。治疗恶性胶质瘤和胰腺癌的方法包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的己糖化合物。特别有兴趣的是治疗肿瘤增生的方法,包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的2-FM。本发明包括通过给需要这种治疗的受试者施用甘露糖化合物来治疗癌症的方法。
附图简介
图1A描述用2-DG、2-FDG、2-FDM和草氨酸盐处理SKBR3细胞24小时后的肿瘤生长抑制分析的结果。各个数值是三份样品的平均值±SD。
图1B描述用2-DG、2-FDG、2-FDM和草氨酸盐处理SKBR3细胞24小时后的细胞毒性分析的结果。各个数值是三份样品的平均值±SD。
图2A描述当培养液中不存在或存在2mM的2-DG或2-FDG和乳酸盐浓度时,SKBR3细胞生长24小时时的结果。
图2B描述SKB R3细胞在存在与图2A中所用浓度相同的2-DG或2-FDG下生长6小时后,量化全细胞溶解产物中的ATP的结果。
图3A描述在存在各种糖的情形下用2-DG处理SKBR3细胞后的生长抑制分析结果。各个数值是三份样品的平均值±SD。
图3B描述在存在各种糖的情形下用2-DG处理SKBR3细胞后的细胞毒性分析结果。各个数值是三份样品的平均值±SD。
图3C描述在存在或缺少2mM甘露糖下,在用2-DG处理后,三个不同低氧模型中的生长抑制分析结果。
图3C描述在存在或缺少2mM甘露糖下,在用2-DG处理后,三个不同的低氧模型中的细胞毒性分析结果。
图4A描述用如各个泳道所标明的不同药物处理48小时的SKBR3细胞的结果,获得总的细胞抽提物,并用结合了HRP的ConA进行印迹分析。将等量的蛋白质加载到各个泳道中,并且用β-肌动蛋白验证。糖蛋白(用箭头区分)表明8mM2-DG和2-FDM而不是2-FDG降低与ConA的结合,并且这种降低能被甘露糖逆转。
图4B描述了图4A的细胞的结果,对于该细胞进行高度表达的糖蛋白erbB2的印迹分析。类似剂量的2-DG和2-FDM造成此蛋白质的分子量发生改变。
图5A显示了用8mM 2-DG、2-FDM或2-FDM处理24小时的SKBR3细胞的结果,对总细胞提取物中的两种分子伴侣Grp78和Grp94进行印迹分析。1mg/ml的衣霉素(TUN)被用作阳性对照。将蛋白质加载用β-肌动蛋白验证。
图5B显示当在低氧模型A、B和C中的细胞用类似剂量的糖类似物处理时对所分析的蛋白质进行的蛋白质印迹。
图6描述用8mM的2-DG、2-FDG或2-FDM处理24小时的SKBR3细胞的结果,并且对全细胞溶解产物中的CHOP/GADD154进行探测。通过添加外源的甘露糖能够逆转由2-DG和2-FDM引起的对CHOP/GADD154的诱导。衣霉素被用作阳性对照。将蛋白质加载用β-肌动蛋白验证。
图7显示糖酵解和N-联糖基化路径举例说明2-DG、2-FDM和2-FDG能够抑制葡糖磷酸异构酶,导致阻断糖酵解,随即含氧量低的肿瘤细胞死亡。然而,在有氧条件下,在某些肿瘤细胞类型中,2-DG和2FDM会干扰寡糖的脂联聚集,导致引发未折叠蛋白应激和毒性,这是由于它们的结构类似于甘露糖以及葡萄糖(三角形=葡萄糖,六边形=甘露糖和正方形=N-乙酰-葡糖胺)。
图8A显示证明选择的神经胶质瘤细胞系和某些本发明的己糖化合物的敏感性的MTT分析结果。
图8B显示证明选择的神经胶质瘤细胞系和某些本发明的己糖化合物的敏感性的MTT分析结果。
图8C显示证明选择的神经胶质瘤细胞系和某些本发明的己糖化合物的敏感性的MTT分析结果。
图9A描述用不同己糖化合物处理后的神经胶质瘤细胞生长状况。
图9B描述用2-DG处理后抑制D54细胞的生长。
图9C描述用2-FG处理后抑制D54细胞的生长。
图10说明低氧对用2-DG处理的细胞的不同影响。
图11显示在含氧量低和含氧量正常的条件下,人恶性胶质瘤细胞系中的乳酸产量。
图12显示在含氧量低和含氧量正常的条件下,神经胶质瘤细胞系的生长结果。
图13证明在神经胶质瘤细胞中2-FG的摄取。
图14显示在小鼠中用2-DG治疗神经胶质瘤的结果。
图15显示2-FM抗Colo357-FG胰腺癌细胞的活性。
图16显示2-卤代-D-甘露糖抗U251神经胶质瘤细胞的活性。
图17显示2-FM对U87细胞生长的抑制作用。
图18提供一张图表,描述了用2-氟-甘露糖处理后在U87神经胶质瘤细胞中诱导的自我吞噬的百分比。
发明详述
恶性神经胶质瘤的可选择治疗手段仍然相当有限。这部分是由于神经胶质瘤细胞对许多可用的化疗选择具有固有的抗性。这还可能部分地是由于恶性神经胶质瘤具有的差示生长模式(differential growthpattern)。也就是说,神经胶质瘤主要以渗透的方式生长,相对于更为快速的明显增加的实质损害,在MRI扫描中极少或未见到明显的增大肿瘤。许多研究已经表明这些不同类型的生长模式也代表了单个肿瘤中的不同低氧程度的区域。含氧量相对低的区域可见于快速生长的肿瘤实质的中心,该中心常常具有与之相关的坏死区域,而一些含氧量相对低的区域位于肿瘤渗入部分之中。因此,一些这种含氧量相对低的区域具有以较慢速度循环并且因此对许多化疗剂的抗性更强的细胞。另外,瓦尔堡的观察报告对恶性神经胶质瘤似乎也是适用的,瓦尔堡描述了即使存在足量氧气时许多肿瘤也优先进行糖酵解(被称作为氧化糖酵解或“瓦尔堡效应”)。本发明人假定由于这些特性,神经胶质瘤和其他高度发生糖分解的肿瘤如胰腺癌对糖酵解抑制剂敏感,并且对肿瘤生长具有显著影响。
因此,通常独特于大脑并特异于神经胶质瘤的其他特性在于葡萄糖转运蛋白的表达增加,这导致过度地将糖摄入CNS中。本发明人假定由于这些特征,神经胶质瘤代表了一种独特的疾病状态,其对糖酵解抑制剂特别敏感。为了检验这种假设,本发明人在含氧量低和含氧量正常的条件下,使用已知的糖酵解抑制剂体外抵抗大量神经胶质瘤细胞系小组。采用大量不同的给药方案,在具有神经胶质瘤同位异种移植物的动物中检测该试剂的作用。
高级神经胶质瘤引起的代谢改变在于即便存在氧气时也优先利用糖酵解作为主要的能量生成来源。“瓦尔堡效应”部分地是由HIF-1a和PI-3激酶路径的活化来启动。2-脱氧葡萄糖是一种有效的糖酵解抑制剂,其阻断通过烯醇酶反应进行的2-脱氧葡萄糖-6-磷酸的转化,导致该化合物由于带电磷酸基团而在细胞中发生积聚。
在高级赘生物中发生已知的代谢改变,包括优先利用糖酵解来满足细胞对能量需求的神经胶质瘤。这些改变通过存活路径来启动,包括诱导糖酵解所需的关键酶的生成以及上调葡萄糖转运蛋白的HIF-1a和PI-3激酶活化。这种糖酵解表型是一种主要特征,即便是在含氧量正常的条件下也是主要的形式。这种表型已经被证实,先前被描述为“瓦尔堡效应”。由于该表型变化,这些肿瘤对糖酵解抑制剂的敏感性应当比正常细胞高。一组基于糖的糖酵解抑制剂和其他甘露糖化合物可以作为治疗剂。2-脱氧葡萄糖是一种基于糖的原型抑制剂,在本研究中已经被证明具有可耐受的并且有效的抗神经胶质瘤的作用。在治疗癌症特别是神经胶质瘤和胰腺癌中,己糖化合物单独或者与细胞毒性化疗组合是有效的。此外,由于在肿瘤环境中,这种糖酵解表型最初是被低氧条件启动的,这种类型的治疗应当与抗血管发生治疗一同考虑。实际上,能够“逃脱”抗血管生成治疗的肿瘤一般优先对糖酵解抑制剂和/或己糖化合物更为敏感。
本发明人已经证明基于糖的己糖化合物在高级神经胶质瘤和胰腺癌的治疗中是有效的。此外,其他抑制剂类的化合物被设计成有利于被摄取到CNS中,并且保持2-DG目前所具有的有利的口服生物利用度。目前正对己糖化合物与细胞毒性剂和抗血管生成剂的组合进行研究,乐观地将为将来的临床组合试验提供智力引导。
己糖化合物是指并且包括含有六个碳原子的任何单糖。一类己糖是己醛糖家族,例如,其包括葡萄糖、半乳糖和甘露糖。己醛糖还包括各种脱氧糖,例如2-脱氧葡萄糖、岩藻糖、磁麻糖和鼠李糖。另一类己糖是己酮糖家族,示例为果糖和山梨糖。虽然本发明的己糖通常具有天然存在的D-构象,己糖也可以是L-对映体。本发明的己糖可以包括α异构体、β异构体及其混合物。本发明己糖的任何一种被任选地取代。这种取代包括用卤素,例如氟、氯或者溴置换羟基。在本发明中,取代通常位于己糖的C-2碳原子上,可以占据六元环椅式构象的己糖的直立位置或平伏位置。C-2上的取代是直立位置上的,则该糖被确定为甘露糖衍生物或者具有甘露构象的糖。C-2上取代是平伏位置上的,则该糖被确定为葡萄糖衍生物或者具有葡糖构象的糖。
可用于实施本发明的己糖化合物包括在美国专利US6,670,330和美国专利申请US 20030181393、US20050043250和US20060025351中公开的化合物,在此引入作为参考。在本发明的某些具体实施方案中,优选化合物是基于糖的肿瘤增生抑制剂,例如2-脱氧-葡萄糖(2-DG)、2-脱氧-甘露糖(2-DM)、2-氟-葡萄糖(2-FG)和2-氟-甘露糖(2-FM)等。
“中枢神经系统的肿瘤”是指在大脑、脊髓或者其他中枢神经系统组织中的任何异常生长,包括良性的或恶性的。特别包括神经胶质瘤,例如毛细胞型星细胞瘤、低级星细胞瘤、退行发育星细胞瘤和恶性胶质瘤多态形(GBM或恶性胶质瘤)。“中枢神经系统的肿瘤”还包括其他类型的良性或恶性的神经胶质瘤,例如脑干神经胶质瘤、室鼓膜瘤、神经节细胞瘤、青少年毛细胞型神经胶质瘤、混合神经胶质瘤、少突胶质瘤和视神经胶质瘤。“中枢神经系统的肿瘤”还包括非-神经胶质瘤、例如脊索瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、脑(脊)膜瘤、松果体瘤、垂体腺瘤、原神经外胚层瘤、施旺细胞瘤、血管瘤和纤维神经瘤。最后,中枢神经系统的肿瘤还包括转移性肿瘤,其中恶性细胞从机体的其他部分蔓延到中枢神经系统。
按照本发明,“治疗”、“处疗”或“缓和”是指治疗性的处理和预防性或阻止性的措施,其中目的在于阻止或减缓中枢神经系统的肿瘤的生长,缩小肿瘤的尺寸或者完全消除肿瘤。需要治疗的那些个体包括具有被确定的中枢神经系统肿瘤的受试者、被怀疑患有中枢神经系统肿瘤的受试者以及被确定为存在产生中枢神经系统肿瘤的风险的受试者。在按照本发明的方法接受了治疗量的己糖化合物后能观察到一种或多种如下状况,则受试者中枢神经系统肿瘤被成功地“治疗”:肿瘤尺寸缩小或肿瘤消失;肿瘤的生长被抑制或停止;肿瘤转移被抑制或停止;和/或与肿瘤相关的一种或多种症状减轻到一定程度,例如发生率和死亡率降低或者生活质量提高。
在某种程度上,己糖化合物阻碍生长和/或杀死现存的大脑肿瘤细胞,则被认为能抑制细胞生长和/或具有细胞毒性。
术语“进行共同施用”或“共同施用”用于包括同时或者顺序地施用治疗剂。例如,共同施用包括以单一组合物的方式施用糖酵解抑制剂和化疗剂。也包括同时施用许多这种组合物。可替代地,共同施用包括在相同时期的不同时间施用许多这种组合物。
按照本发明的己糖化合物包括,但是不限于糖酵解抑制剂,它是一种能够抑制神经胶质瘤或其他大脑肿瘤中的氧化糖酵解的化合物,还可以包括己糖化合物,例如2-脱氧-葡萄糖、2-氟-葡萄糖、2-氟-甘露糖等。
上文定义的抗增生处理可被用作为单一的治疗方式,或者可能除了至少一种本发明的化合物外,还包括一种或多种其他物质和/或处理。这种处理通过同时、顺序或者分开地施用各个治疗成分来实现。本发明的化合物还可以与已知的抗癌的和细胞毒性的试剂和处理如放疗组合使用。如果被配制成固定的剂量,这种组合产品采用在本文描述的剂量范围内的本发明的化合物和在被批准的剂量范围内的其他药物活性试剂。糖酵解抑制剂可作为还包括其他抗癌的或细胞毒性的试剂的化疗方案的一部分被顺序使用,和/或与非化疗处理例如手术或放疗结合使用。
化疗剂包括但是不限于三种主要的化疗剂类别:(i)抗血管生成剂,例如三羧氨基喹啉(Linomide)、整联蛋白-α-β3的功能抑制剂、血管抑制素、雷佐生);(ii)细胞生长抑制剂例如抗雌激素(例如,它莫西芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、iodoxifene)、孕激素(例如甲地孕酮乙酸盐)、芳香化酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、硼嗪、依西美坦)、抗激素、抗孕激素、抗雄激素(例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、环丙氯地孕酮)、LHRH激动剂和拮抗剂(例如醋酸戈舍瑞林、亮丙立得),睾丸激素5-α-二氢还原酶的抑制剂(例如非那雄胺),法尼基转移酶抑制剂、抗侵入剂(例如,金属蛋白酶抑制剂如马立马司他以及尿激酶血浆酶原活体受体功能的抑制剂)和生长因子功能的抑制剂(这种生长因子包括例如,EGF、FGF、血小板来源的生长因子和肝细胞生长因子,这种抑制剂包括生长因子抗体、生长因子受体抗体,例如Avastin.(贝伐单抗)和Erbitux.(西妥昔单抗);酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂);和(iii)抗增生/抗血管生成的药物及其组合,如药物肿瘤学上所用的,例如抗代谢物(例如抗叶酸药物如氨甲蝶呤、氟嘧啶如5-氟尿嘧啶、嘌呤和腺苷类似物,胞嘧啶阿拉伯糖苷);嵌合性抗肿瘤抗生素(例如蒽环类抗生素如阿霉素、道诺霉素、表柔比星和去甲氧基柔红霉素(伊达比星)、丝裂菌素-C、放线菌素D、光神霉素);铂衍生物(例如顺铂、卡铂);烷化剂(例如氮芥、美法仑、瘤可宁、白消安、环磷酰胺、异环磷酰胺亚硝基脲、噻替派;抗有丝分裂剂(例如长春花碱如长春新碱,和类紫杉醇如泰素(紫杉醇)、泰素帝(多西他赛)以及新的microbtubule剂例如埃坡霉素类似物、discodermolide类似物和艾榴塞洛素类似物);拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素如依托泊甙和替尼泊苷、安吖啶、拓扑替康);细胞周期抑制剂;生物反应调节物和蛋白酶体抑制剂例如Velcade(bortezomib)。
本领域的普通技术人员将容易地认识到,本发明公开的治疗方法可以通过多种给药途径和使用不同数量/浓度的己糖化合物来实施。优选的给药途径可以根据所使用的己糖化合物来变化,这种途径包括但是不限于口服、口腔的、肌肉内(i.m.)、静脉内(i.v.)、胃肠道内(i.p.)、体表或者FDA批准的任何其他给药途径。给药浓度或治疗浓度将根据正被治疗的患者和正被施用的己糖化合物而变化。在某些具体实施方案中,己糖化合物的浓度范围为1mg~50gm/kg体重。
首先,制备一系列2-氟、2-溴和2-氯-取代葡萄糖类似物,并将其作为糖酵解路径中的葡萄糖的阳性竞争底物来进行分析,这种类似物可能作为糖酵解抑制剂起作用,其作用方式与2-脱氧-葡萄糖(2-DG)类似。本发明人已经发现2-氟-D-甘露糖是一种有效的抗肿瘤剂,这是由于其具有由如下事实带来的特性,鉴于氟原子和氢原子在大小上相似,2-氟-D-甘露糖(在本文中也被称作为“2-FM”)类似于2-脱氧-D-葡萄糖(与2-脱氧-D-甘露糖相同),而在诱导效应和形成氢键的可能性方面,2-氟-D-甘露糖类似于甘露糖的羟基而不是氢原子,因而类似于D-甘露糖。在后一种情形下,2-氟-D-甘露糖会影响与D-甘露糖相关的生物学功能、代谢和生物学程序。以及这些效果的组合会影响与D-葡萄糖和D-甘露糖相关的细胞程序。
事实上,图15~18中提供的数据表明,2-氟-D-甘露糖比2-DG更为有效,并且在胰腺Colo357-FG细胞中的活性高于或类似于2-氟-D-葡萄糖的活性。此外,将2-氟-D-甘露糖(2-FM)与其他2-脱氧-D-甘露糖类似物比较,即与2-氯-D-甘露糖(2-CM)和2-溴-D-甘露糖(2-BM)比较。令人惊奇地并且不可预期的是,在这一系列物质中,2-氟-甘露糖比其他物质更为有效。特别地,该数据表明在抑制U251恶性胶质瘤和大脑肿瘤细胞的生长方面,2-氟-D-甘露糖(2-FM)明显优于溴(2-BM)和氯(2-CM)的类似物。在正常含氧量条件下,2-FM还表现出令人惊奇的优于低氧条件下的抗U87恶性胶质瘤细胞的活性(图17)。此外,至少一种2-FM的作用模式是不可能被预期的,即2-FM具有在大脑肿瘤细胞中有效诱导细胞自我吞噬的作用,从而为其抗肿瘤细胞系的作用机制提供至少一种解释。
如下面立即给出的,2-脱氧葡萄糖(2-DG)在C-2位置上具有两个氢原子。在该糖的六元环椅式构象中,这两个氢原子占据直立位置和平伏位置。
本质上,2-氟甘露糖(2-FM)用氟原子置换2-脱氧葡萄糖中的直立的氢原子(与2脱氧甘露糖中的情况一样)。氟原子通常被认为与氢原子是等排的。因此,在某些方面,2-FM的化学性质可能类似于2-DG。实际上,2-FM可能基于这种异构辩解而具有糖酵解抑制活性。然而,氟原子的电负性实质上高于氢原子,结果其能够参与氢键的基序。在该方面,2-FM表现得更为接近于甘露糖,因此,在高级的甘露糖寡聚糖合成中,2-FM可能破坏N-联糖脂/蛋白质路径。
简而言之,2-FM显示出令人惊奇地好的抗肿瘤细胞增生的作用,表现出比2-脱氧-D-葡萄糖(在此也被称作为“2-DG”)和2-脱氧-2-氟-D-葡萄糖(在此也被称作为“2-FG”)更为有效。如下文所讨论,在231-GFP乳腺癌、U251恶性胶质瘤多态型大脑肿瘤(图16)和Colo357-FG人胰腺癌细胞系(图15)中对化合物2-FM进行了测试。在U251和Colo357-FG细胞中,2-FM直接与2-DG、2-FG、2-脱氧-2氯-D-甘露糖(在此有时也被称作为“2-CM”)、2-脱氧-2-溴-甘露糖(在此也被称作为“2-BM”)、2-脱氧-氯-D-葡萄糖(在此也被称作为“2-CG”)和2-脱氧-2-溴-D-葡萄糖(在此也被称作为“2-BG”)比较。在恶性胶质瘤(图16、17和18)和胰腺癌(图15)中,2-FM是这些被比较的试剂中最有效的,在2-FM与它的氯和溴的衍生物之间观察到的差别尤其大。当与2-DG比较时,该差别也是显著的。因此,该数据表明在抑制肿瘤细胞增生方面,2-FM所起的作用不同于2-DG和2-FG。该数据进一步表明,对于癌症,特别是大脑和胰腺的肿瘤来说,2-FM是一种非常有效的抗肿瘤治疗措施。
更特别地,图15示范了用MTT分析Colo357细胞系对用2-脱氧-葡萄糖(2-DG)、2-氟-葡萄糖(2-FG)或2-氟-甘露糖(2-FM)处理的反应的细胞存活率的剂量反应曲线。可以看出,剂量反应曲线偏移到左侧,表明2-FM比2-DG或2-FG更加有效。图16证明甘露糖的第二位置上的卤素性质是影响活性的重要因素。将神经胶质瘤细胞系U251MG用2-氯-甘露糖(2-CM)、2-溴-甘露糖(2-BM)或2-氟-甘露糖(2-FM)处理。再通过MTT分析测量细胞活性,结果清楚地表明当与其他卤素类似物相比时,2-FM具有较好的活性。图17示例说明了在低氧(<1%氧气)或者含氧量正常(20%氧气)条件下用2-氟-甘露糖(2-FM)处理的细胞系进行的MTT分析。可以看出,数据体现出一种不寻常的情形,即在低氧的情况下,该试剂在U87细胞系中并不更为敏感。这隐含地表明,2-FM的另一种作用机制在于产生细胞杀死作用。
图18证明了2-氟-甘露糖(2-FM)的一种独特的和先前未被确定的作用机制。在U87 MG神经胶质瘤细胞系中,2-FM诱导通过细胞自我吞噬作用而引起的细胞死亡。图表展示的是通过用吖啶橙染色而获得的酸性囊状细胞器(AVO)的流式细胞分析结果(参见操作程序部分),这是自我吞噬过程的特性和特点。该结果显示了随着2-FM暴露剂量的增加,发生自我吞噬的细胞的比例也升高。由于仅暴露了很短的40小时就观察到该结果,因此这种自我吞噬作用的诱导程度给人的印象深刻。
目前,在临床试验中施用2-DG来评估添加糖酵解抑制剂的程度,糖酵解抑制剂杀死缓慢生长的低氧肿瘤细胞,存在于实体肿瘤中的抗性最强的细胞群体会提高标准化学治疗的治疗功效,该化学治疗靶向快速分化的含氧量正常的细胞。本发明部分地来自于发现当施用2-DG或2-FM而不是2-脱氧-2-氟-D-葡萄糖(2-FG)时,即便存在氧气,某些肿瘤细胞系也被杀死。由于2-FG和2-DG都抑制糖酵解,推定有一种除了阻断糖酵解之外的作用机制产生了这种效果。
在20世纪70年代进行的研究导致了这样的报道:2-DG和2-FM干扰病毒衣壳糖蛋白的N-联糖基化,这种干扰可以通过添加甘露糖来逆转。由于甘露糖和葡萄糖之间的差别在于C-2位置上的氢原子的方向,并且由于2-DG在C-2位置上有两个氢原子(而不是一个氢原子和一个羟基),而甘露糖和葡萄糖都是一个氢原子和一个羟基,2-DG可被视为甘露糖类似物或者葡萄糖类似物。因此,2-DG对糖酵解和糖基化都起作用。
本发明提供用于抑制肿瘤细胞增生的方法,无论该细胞处于低氧或含氧量正常的环境下,单独使用己糖衍生物,或者联合其他的抗肿瘤处理,其他抗肿瘤处理包括但是不限于靶向含氧量正常的细胞的细胞毒性剂、抗血管发生剂、放疗和手术。本发明还为临床使用如2-DG、2-CM和2-FM等类似物作为靶向某些肿瘤类型中的含氧量正常的(通过干扰糖基化)和所有低氧的(通过阻断糖酵解)的癌症细胞群体的细胞毒性剂提供依据。
下面的实施例提供数据证实了本发明的效用,并证明了2-DG、2-CM和2-FM而不是2-FG对在含氧量正常条件下生长的选择的肿瘤细胞具有毒性。在实施例中描述的一些试验被设计来确定,与抑制糖酵解相反,对糖基化的干扰是否是负责含氧量正常条件下的效果的作用机制。尽管不期望受理论的约束,所获得的结果支持了这些化合物能够抑制糖基化并从而杀死某些癌症细胞类型,无论那些细胞是否处在低氧环境下。
这些结果还支持2-FM、2-DG和2-CM而不是2-FG破坏脂联寡糖链的组装并引发未折叠蛋白应答(UPR),UPR是干扰糖蛋白酶合成的指示。接着,UPR导致在敏感细胞而不是抗性细胞中激活UPR特异性凋亡信号。
在含氧量正常的条件下对2DG、2-FM和2-CM敏感的肿瘤细胞类型已经被确定。从肿瘤中分离,并离体测试来确定在含氧量正常的条件下该细胞是否对2-DG、2-CM或2-FM敏感。下面的实施例阐明了用于确定一种细胞是否敏感的方法。在其他具体实施方案中,将密切相关的2-DG敏感和抗性的细胞对的分子信号与测试细胞系进行比较。还描述了磷酸甘露糖异构酶和参与糖基化的其他酶以及参与2-DG积聚的酶在含量和/或活性方面的差异。
在存在氧气时(含氧量正常的条件下),2-DG对肿瘤细胞系亚组具有毒性。该结果是令人惊奇的,由于先前的研究证明,在含氧量正常的情况下用2-DG处理,会抑制肿瘤细胞和正常细胞的生长而不是杀死它们。这些已有的生长抑制观察结果被认为是由于在含氧量正常的条件下,2-DG在细胞中积聚到足以阻断糖酵解的水平,使得糖酵解路径中的中间体的含量下降而降低生长速度,这些中间体可用于与细胞增生相关的各种合成代谢过程。然而,如果线粒体的功能是正常的,细胞就不会死亡,在有氧条件下处理的细胞能够在用2-DG阻断糖酵解的处理中存活。因此,为什么细胞在含氧量正常的条件下对2-DG敏感,一种可能的解释是该细胞的线粒体存在缺陷。在这一点上,已知由于线粒体呼吸存在缺陷,肿瘤细胞能够利用葡萄糖通过无氧糖酵解而不是氧化磷酸化来产生能量(ATP)。然而,进一步的试验已经证明,其他的糖酵解抑制剂对这些细胞没有毒性,如草氨酸盐和2-FG,所以线粒体呼吸存在缺陷不可能是导致它们对2-DG敏感的原因。因此,猜想存在一种除了阻断碳酵解之外的作用机制,导致在含氧量正常的条件下2-DG会对这些选择的细胞系具有毒性作用。
因此,其他猜想可能解释这种含氧量正常的细胞毒性的作用机制。一种可能的作用机制是对糖基化的干扰。对这种可能作用机制的支持可见于20世纪70年代后期以来的一系列文章,这些文章报道,在某些病毒中,N-联糖蛋白的合成被大量的包括2-DG在内的糖类似物抑制。
葡萄糖通过三种主要路径代谢:糖酵解、戊糖磷酸化支路和糖基化。图7是糖酵解和糖基化代谢路径的图解。在葡萄糖进入细胞质中后,己糖激酶将葡萄糖的C6磷酸化,合成葡萄糖-6-磷酸(G6P)。如果G6P通过葡萄糖磷酸异构酶(PGI)转化为果糖-6-磷酸,会继续进行糖酵解路径,生成ATP和丙酮酸盐。可替代地,G6P也可以用于合成各种糖,包括甘露糖,满足脂联寡糖组装的需要,该合成是在ER中进行的。已经证明2-DG会干扰三种代谢途径中的两种:通过抑制PGI来阻断糖酵解或者通过干扰二磷酸鸟苷(GDP)长醇磷酸联甘露糖转移到N-乙酰氨基葡萄糖残基上来破坏被再连接的寡糖前体的组装并且能够耗尽长醇-P,长醇-P是将甘露糖从细胞质转运到ER内腔所需要的。
如上文指出,由于2-DG在碳2的两个位置上均有氢原子,类似于一种甘露糖类似物。相反,在氟类似物的该位置上存在氟而产生新的对映体中心,因此氟衍生物仅被认为是葡萄糖类似物或甘露糖类似物;在描述这些类似物时,对于甘露糖类似物来说,氟化物部分被画在碳水化合物环平面的上方,而对于葡萄糖类似物来说,画在下方。
当甘露糖被添加到脂联寡糖链上时,其首先必须通过转移到二磷酸鸟苷(GDP)或长醇磷酸上,以被活化。2-DG转化成2-DG-GDP,在脂联寡糖的组装过程中,在将甘露糖添加到N-乙酰氨基葡萄糖残基上方面,2-DG-GDP会与甘露糖-GDP发生竞争。因此,在科技文献报道的试验中,由于用2-DG处理生成异常的寡糖,导致病毒糖蛋白的合成下降。在这些试验中,2-DG的抑制作用可以通过添加外源性甘露糖来逆转,但是添加葡萄糖不能产生逆转作用,这进一步证明了2-DG的作用有点类似于甘露糖类似物。这些研究人员还证明了另一种甘露糖类似物,2-氟-甘露糖(2-FM)具有与2-DG类似的作用,也能够被甘露糖逆转,表明这些类似物的甘露糖构象对于它们干扰糖基化作用可能是重要的。
此外,遗传试验已经表明,破坏糖基化具有重要的生物学作用。在患有1b型碳水化合物缺陷糖蛋白综合症的患者中不存在甘露糖磷酸异构酶(PMI)。缺乏这种酶会导致血清糖蛋白的低糖基化,从而引起血栓症和表现为蛋白质丢失性肠下垂的胃肠道紊乱。当在这些患者的饮食中添加外源性甘露糖时,它们的症状消失,它们的血清糖蛋白恢复正常,并且它们从该疾病中恢复。该观察结果与用于本发明中的化合物的作用机制是一致的,试验数据表明外源性甘露糖能够拯救选择的肿瘤细胞,将这些肿瘤细胞在正常氧气水平下用2-DG处理,它们会被杀死。这可能是这些特定的肿瘤细胞下调PMI或者在该酶方面存在缺陷。另一方面,在这些细胞中,生成N-联糖基化所需的甘露糖中间体的酶被上调,产生较高的2-DG-GDP与甘露糖-GDP相比的比例,从而导致这种在正常氧气条件下对2-DG的异常敏感性。
无论是何种作用机制,本发明提供即使在含氧量正常的条件下施用2-DG和其他葡萄糖类似物和甘露糖类似物作为处理肿瘤的单一试剂来治疗癌症的方法。已经证明该化合物能够有效抵抗大量肿瘤细胞系,包括人乳腺癌细胞系(SKBR3)、非小细胞肺癌细胞系(NSCLC)、神经胶质瘤细胞系、胰腺癌细胞系和骨肉瘤细胞系,当用剂量相对低的2-DG处理时,所有这些细胞系发生细胞死亡。
图3B显示了在正常氧气条件下,SKBR3细胞对用指定剂量的2-DG、2-FM和其他试剂处理72小时的反应。通过台盼蓝排除,测定细胞毒性。结果表明2-DG和甘露糖类似物2-FM具有毒性,而葡萄糖类似物2-FG没有毒性。此外,草氨酸盐作为一种在乳酸脱氢酶水平上阻断糖酵解的丙酮酸盐类似物,其对在含氧量正常的条件下生长的细胞没有毒性作用。相反,甘露糖类似物2-FM也被证明对这些细胞具有毒性,再次表明甘露糖骨架对具有这种活性的化合物是重要的。
添加外源性甘露糖能够逆转2-DG的抑制作用,但是当添加葡萄糖不能逆转2-DG的抑制作用,进一步证明2-DG是作为一种甘露糖类似物起作用的。其他测试表明,2-DG对在含氧量正常的条件下生长的NSCLC也具有毒性,而添加1mM甘露糖能够逆转这种毒性作用。
该数据进一步支持由于干扰糖基化,2-DG和2-FM对在含氧量正常条件下生长的选择的肿瘤细胞具有毒性。指示错误折叠或者错误糖基化蛋白质的未折叠蛋白应答蛋白GRP78和94以剂量依赖的方式被2-DG和2-FM上调,但是不被2-FG上调;这些作用同样可以通过添加甘露糖来逆转,证明了这些甘露糖类似物是通过这种机制而不是通过阻断糖酵解的方式起作用。
因此,甘露糖类似物2-DG和2-FM而不是葡萄糖类似物2-FG对在含氧量正常的条件下生长的选择的肿瘤细胞类型具有毒性,而添加甘露糖能逆转这种毒性。由于2-FG抑制糖酵解的效果好于2-DG,干扰糖基化而不是抑制糖酵解被认为是产生这种效果的作用机制。如上文指出,已经报道2-DG干扰病毒衣壳蛋白的N-联糖基化,而添加外源性甘露糖能逆转这种结果。因此,2-DG对含氧量正常条件下的SKBR3、NSCLC和两种其他人肿瘤细胞系的毒性作用可能是由于干扰糖基化而产生的。如果这种作用机制理论正确,那么添加甘露糖应当逆转2-DG在这些细胞系中产生的毒性作用。实际上,1mM甘露糖逆转6mM2-DG在任何一种所测试的细胞系(NSCLC)中产生的毒性作用。
已知血液中甘露糖的含量范围在50~60mg/ml,可以进行剂量反应试验来确定逆转2-DG的毒性作用所需的最小甘露糖剂量。例如,由于胎牛血清(FBS)通常含有残留量的甘露糖,因此可以用添加了经过透析的FBS的生长培养液进行试验来实施测定。此外,为了证实添加甘露糖而不是其他糖是逆转2-DG的毒性作用所需的,可以检测已知参与糖蛋白合成的糖,即葡萄糖、果糖、半乳糖等是否能够逆转2-DG的毒性作用。如果这些糖中的任何一种能够类似地逆转毒性作用,然后在诱导UPR及其后续结果即干扰寡糖链延长而逆转2-DG的作用,以及结合伴刀豆球蛋白A方面,将它们的活性与下述试验中的甘露糖的活性比较。总之,这些试验使得能够在体外评估用于在体内存在生理性甘露糖含量的情况下产生抗肿瘤活性的2-DG或2-FM的剂量。然而,用于本发明的方法中的口服施用2-DG、2-FM和2-CM的治疗有效量通常在5~500mg/kg,例如50~250mg/kg患者体重的范围内。在一个具体实施方案中,该剂量为约100mg/kg患者体重。
本发明还提供大量诊断方法,临床医生可用来确定肿瘤或者其他癌症中是否含有对目前的处理方法易感的细胞。在一个具体实施方案中,在含氧量正常的条件下对来自肿瘤的细胞进行测试,确定它们是否被2-DG、2-FM或2-CM杀死。在另一个具体实施方案中,进行该测试;然后,添加甘露糖来确定其是否逆转该细胞的毒性作用。
在另一个具体实施方案中,易感性的测试是用N-联糖基化作为指示来实施的。如上文指出,2-DG和2-FM而不是2-FG(1)破坏脂联寡糖链的组装,(2)引发未折叠蛋白应答(UPR),这指示干扰了正常的糖蛋白合成,以及(3)在2-DG敏感的细胞中而不是抗性细胞中活化UPR特异性凋亡信号。此外,甘露糖逆转这些作用。因此,可以在感兴趣的肿瘤或癌症细胞中进行这些相同的测试,确定该细胞是否对用本发明的方法处理易感。
如上文指出,在病毒感染的细胞中,在ER的细胞质表面上发生甘露糖掺入到脂联寡糖链上,而这种掺入能够被2-DG或2-FM的GDP衍生物,即GDP-2DG和GDP-2-FM抑制。通常,在第五个甘露糖被添加之后,脂联寡糖链转动面向ER的内腔。为了继续将甘露糖添加到逐渐延长的链上,长醇-磷酸酯(Dol-P)被用作将甘露糖从细胞质转运到ER的基质上的载体。2-DG-GDP与甘露糖-GDP竞争结合到长醇上,从而进一步干扰N-联糖基化。此外,在ER中,长醇联的2-DG也与甘露糖竞争被转运到寡糖链上。因此,在2-DG敏感和抗性的细胞系中进行试验,证明2-DG和2-FM对脂联寡糖前体和甘露糖衍生物形成的作用,该甘露糖衍生物即甘露糖-6-磷酸、甘露糖-1-磷酸、GDP-甘露糖和Dol-P-甘露糖。这转而证明在寡糖组装中能够被2-DG和2-FM抑制的阶段或步骤。这转而允许根据当暴露于2-DG、2-FM和/或2-CM时所生成(和未生成)的寡糖,来将其他细胞类型表征为敏感或抗性的。
先前建立的层析法可用于收集和测定SKBR3和NSCLC细胞中的甘露糖衍生物和脂联寡糖前体的含量。简而言之,将细胞用[2-H3]甘露糖标记,将细胞溶解产物分别用氯仿/甲醇(3:2)和氯仿/甲醇/水(10:10:3)提取,来收集Dol-P-Man和脂联寡糖。
对含有Dol-P-Man的等分试样进行薄层层析分析,同时可以通过HPLC分离脂联寡糖。可以通过液相闪烁计数来分析洗出液馏分。通过递减纸层析分离甘露糖磷酸和GDP-甘露糖,并且通过温和的酸解从各个馏分中释放的[2-3H]甘露糖并对其进行测量。可以将来自用2-DG或2-FM处理的细胞的数值与未处理的对照进行比较,来证明这些药物对N-联寡糖前体和甘露糖衍生物的作用。由于外源性甘露糖逆转2-DG的毒性作用,还可以测试甘露糖是否也能够逆转所观察到的2-DG糖基化紊乱。
除了2-DG和2-FM之外能够抑制N-联糖基化的特定步骤的衣霉素和脱氧mannojirimycin(DMJ)是两种其他的糖基化抑制剂,可以用作阳性对照。衣霉素干扰第一个N-乙酰氨基葡萄糖残基添加到长醇焦磷酸上,而DMJ是甘露糖苷酶I的一种特异性抑制剂,其能够修剪N-联寡糖链末端上的三个甘露糖残基。因此,外源性甘露糖应当不能逆转这些试剂的毒性或者对糖基化的作用。而且,由于葡萄糖类似物2-FG不杀死含氧量正常的条件下的SKBR3和NSCLC细胞,但是在阻断糖酵解和杀死低氧细胞方面比2-DG更为有效,它干扰糖酵解而不作用于糖基化,同样也可以在这种测试中用作工具。
干扰内质网(ER)中的N-联糖基化过程会导致糖蛋白的错误折叠,引发被称作为未折叠蛋白应答(UPR)的ER应激反应。联想到P53对DNA损伤的反应,ER对应激的反应极其相似:(1)通过诱导留守分子伴侣(resident chaperone)(GRP 78和GRP 94)而提高折叠能力,(2)通过关闭蛋白质合成而降低本身的生物合成负载,和(3)增加对未折叠蛋白质的降解。如果应激不能被减轻,则启动凋亡路径,细胞随后死亡。因此,干扰糖基化的一种测量结果是UPR上调。
当用2-DG处理SKBR3细胞时,这两种ER应激反应蛋白GRP 78和94随着剂量提高而增加;甘露糖逆转这种诱导作用。2-FG不会诱导这些蛋白质。因此,在本发明的另一个具体实施方案中,这种反应用于确定一种肿瘤或癌症细胞是否对按照本发明方法的处理易感。在含氧量正常的条件下对2-DG不敏感的细胞系可类似地被用作阴性对照,其中不出现这些蛋白质的上调是与它们对2-DG的抗性相关。
当ER应激不能够被克服时,启动凋亡信号。ER应激通过一种细胞核转录因子CHOP/GADD153诱导一种线粒体依赖的凋亡路径,CHOP/GADD153下调BCL-2,并且在人细胞系中通过胱天蛋白酶4和5以及在小鼠细胞系中通过胱天蛋白酶12诱导一种不依赖于线粒体的路径。因此,进行试验来确定特异于ER应激的凋亡信号是否在2-DG敏感的而非2-DG抗性的细胞中被活化。CHOP/GADD153的上调和胱天蛋白酶4和5的活化通过蛋白质印迹来分析。如同先前的测试,如果这种上调特异于2-DG敏感细胞系,那么在测试癌症细胞中观察到的上调指示该细胞所来源的癌症对按照本发明的处理易感。
由于SKBR3大量表达糖蛋白ErbB2,因而期望2-DG将会作用于该蛋白质的N-联糖基化,导致错误折叠和降解。对来自用2-DG处理的SKBR3细胞的ErbB2进行蛋白质印迹,与来自未处理细胞的那些ErbB2进行比较,来确定该蛋白质的总体水平。此外,通过免疫沉淀并用伴刀豆球蛋白A印迹来分析用2-DG处理后的ErbB2中的甘露糖含量,伴刀豆球蛋白A是一种识别高级甘露糖型N-联寡糖的凝集素。由于有可能甘露糖类似物不仅能够抑制ErbB2而且能够抑制所有N-联糖蛋白的甘露糖含量,也可以采用该凝集素来探查从这些细胞中获得的全细胞溶解产物。将结合所有蛋白质的丽春红染料用作阴性对照,来证明2-DG和2-FM特异性地影响糖蛋白,而且,该方法或者类似的方法可以被用于确定一种癌症或肿瘤细胞是否对按照本发明的处理易感。
即使通过2-DG和2-FM证实了指示干扰N-联糖基化的ER应激确实发生,在细胞质而不是在ER中发生的干扰O-糖基化也可以被评估。科技文献报道2-DG对从O-糖基化转录因子Sp1上切除N-乙酰氨基葡萄糖残基具有抑制作用,导致对Sp1结合到其相应的启动子上的抑制。Sp1是用于活化大量癌基因的一种重要转录因子,如果其至少部分地可能受2-DG的作用,就解释了在含氧量正常的条件下生长的SKBR3细胞为什么会对2-DG敏感。因此,在用2-DG和2-FM处理后,Sp1的糖基化模式可以通过免疫沉淀和用WGA进行探查来研究,WGA是一种特异性地结合O-糖基化蛋白质的凝集素。就2-DG对Sp1和O-联糖基化的作用程度而言,糖基化的这种改变可被测定并用作肿瘤细胞系或其他癌症细胞系对2-DG介导的细胞杀死作用易感的指示剂。
当细胞对错误折叠的蛋白质反应时,在该细胞的内质网中发生由未折叠蛋白应答引发的细胞死亡,可以通过施用一种额外试剂versipelostatin而增加这种细胞死亡。因此,在一个具体的实施方案中,2-DG、2-FM和/或2-CM被施用给需要进行癌症治疗的患者,并且将versipelostatin共同施用给该患者。
类似地,通过用蛋白体抑制剂对错误折叠糖蛋白的水解进行阻断,可以增强对蛋白质错误折叠反应而发生的细胞死亡。因此,在另一个具体的实施方案中,本发明提供通过施用与2-DG、2-FM和/或2-CM组合的一种蛋白体抑制剂来治疗癌症的方法。在一个具体实施方案中,该蛋白体抑制剂是Velcade。
某些类型的癌症可能对本发明的处理比其他肿瘤更为易感。为了确定这种类型的肿瘤,可以按照本发明的方法对多种细胞类型进行检测。例如,从ATCC获得多种癌症细胞系,如上所述对它们进行筛选,确定在存在氧气的情况下对甘露糖类似物例如2DG和2FM极其敏感的其他细胞类型。在5mM 2-DG或2-FM或更低浓度下被杀死的细胞被确定为易感的。还测试这些易感的肿瘤细胞系对剂量分别至多20mM和30mM的2-FG和草氨酸盐的敏感性。如果对糖基化的干扰是2-DG和2-FM的毒性模式,那么这些细胞系应当对其他糖酵解抑制剂2-FG和草氨酸盐具有抗性,除非它们的线粒体氧化磷酸化存在缺陷。为了验证这些细胞的线粒体的功能,使用例如Clark电极设备来测量呼吸作用。为了证实2-DG和2-FM的毒性是由于干扰了这些细胞系中的糖基化,可以如上所述分析由甘露糖产生的细胞死亡恢复作用。
细胞对目前的方法具有抗性而对另一种方法没有抗性的分子基础可能是由于与由葡萄糖合成GDP-甘露糖相关的基因的表达,即葡萄糖磷酸异构酶(PMI)存在差异,该酶能够将葡萄糖-6-磷酸转化为甘露糖-6-磷酸(参见图7)。如上提及,PMI中的缺失被证实会导致糖基化综合症1b,引起血清糖蛋白的低糖基化,导致在被确定具有该缺陷的患者中发生血栓症和胃肠道紊乱。已经证实往饮食中添加甘露糖会减轻患者的症状以及使其糖蛋白正常化。因此,该酶的缺陷或者下调能够解释2-DG和2-FM在如此测试的敏感细胞系中产生的毒性以及被外源性甘露糖逆转的现象。
当缺乏PMI时,细胞依赖于外源性甘露糖(存在于血清中)来合成N-联寡糖前体,这是PMI的下调或者缺失会在敏感细胞系中产生2-DG毒性的原因。已经知晓,在哺乳动物血清中的甘露糖浓度(50-60mg/ml)或者用于体外研究的培养液中的甘露糖浓度显著地低于葡萄糖的浓度。因此,在PMI缺失或者被下调的细胞中,低剂量的2-DG和2-FM能够顺利地与血清中存在的低含量的甘露糖竞争,完全阻断该糖被添加到寡糖链上。另一个方面,具有正常的PMI细胞能够从葡萄糖生产GDP-甘露糖;因此,较高剂量的2-DG或2-FM是导致完全破坏寡糖组件所必需的。这可以解释为什么大部分所测试的细胞在含氧量正常条件下对2DG具有抗性。对这种酶的活性的直接测量可用于本发明中,以确定PMI的缺乏或者含量低是否是导致在含氧量正常的条件下生长的选择的细胞对2-DG和2-FM敏感的原因,并且如果情况如此,则可用于确定对按照本发明方法处理易感的肿瘤和癌症细胞。解释这种异常敏感性的另一种可能是,与在正常氧气压力下生长时不受2-DG和2-FM影响的大多数正常细胞系和肿瘤细胞系相比,这些选择的细胞中的PMI被2-DG和2-FM的抑制程度较大。为了直接对此进行测试,可以从SKBR抗性和敏感的细胞对中分离细胞提取物,并且在存在或缺乏2-DG和2-FM的情况下,确定其将葡萄糖-6-P转化为甘露糖-6-P的能力。
如果PMI活性下降不是负责2-DG在SKBR3敏感细胞中产生毒性的原因,那么解释该情形的一种可替代的作用机制是编码与用于寡糖组装的甘露糖衍生物生成相关的酶的基因,即磷酸甘露糖变位酶(PMM)和GDP-Man合成酶被上调(图7)。存在一种可能性,即对2-DG敏感的细胞中的糖基化增加,从而上调这些酶的一种或者两者。从而与糖基化发生速度较慢或者数量较少的抗性细胞相比,这种细胞将积聚更多的2-DG-GDP,更大程度地干扰糖基化和随后更多的细胞死亡。
无论上调糖基化是否最终作为一种作用机制,细胞由此变得对2-DG敏感,所积聚的或者掺入到细胞中的2-DG总量也对其敏感性升高有贡献。因此,用[3H]标记的2-DG进行摄取和积聚研究,以确定较高水平的葡萄糖转运蛋白是否使得细胞对按照本发明方法的处理更为敏感。
用剂量递增的2-DG处理2-DG敏感细胞并对存活率进行筛选,可以获得2-DG抗性突变体。抗性突变体与其亲本的敏感配对物可以被用于所述的方法中。该研究还提供了理解细胞变得对2-DG具有抗性的作用机制的手段,从而可以适于更好地在临床上使用这种药物。之前的讨论表明,分子信号可被用于预测哪种肿瘤细胞类型在存在氧气的情况下会对2-DG和2-FM敏感。
细胞死亡的执行具有引人注目的塑性,其范围横跨凋亡和坏死。使用已经建立的方法,通过研究DNA断裂的类型、膜组成、完整性和色调的改变来比较细胞死亡的模式,能够确定由于干扰糖基化和抑制糖酵解而引起的细胞死亡的作用机制。抑制糖酵解和氧化磷酸化、导致严重的ATP消耗,从而导致从凋亡转变为坏死。由于ATP是活化胱天蛋白酶所需的,当ATP被严重消耗时,凋亡被阻断,最后,没有能量,细胞死于坏死。一种用糖酵解抑制剂处理的需氧细胞能够通过氧化磷酸化来生产ATP,该氧化磷酸化由作为能量来源的氨基酸和/或脂肪提供燃料。因此,在含氧量正常的情况下由2-DG诱导导致细胞死亡的UPR时,一般认为该细胞会发生凋亡。相反,在低氧的细胞模式中,预期当2-DG的剂量高至足以阻断糖酵解时,这些细胞将发生ATP耗尽,并由于坏死而死亡。
因此,可以用已经建立的分析凋亡和坏死的方法,确定2-DG是否通过凋亡、坏死或者两者的混合方式来杀死细胞。通过流式细胞分析方法检测数个凋亡参数,来区分坏死和凋亡。在用2-DG处理后,用膜连蛋白-V和碘化丙锭对细胞进行双重染色,分别检测phosphoatidyl丝氨酸是否暴露到细胞表面上以及细胞膜是否丢失其完整性。单独染色膜连蛋白-V或者同时染色膜连蛋白-V和碘化丙锭指示发生凋亡,而单独染色碘化丙锭指示坏死。此外,还可以检测凋亡的两种最终结果:核DNA分级以及形成单链DNA。已经报道,这两种参数是细胞凋亡死亡专一性的,并且已经被不同的研究人员用来区分凋亡与坏死。还可以分析ATP含量,来确定它们是否与所检测的死亡模式相关。
此外,如果2-DG在低氧细胞中诱导凋亡和坏死两者,那么可以确定2-FG在低氧条件下诱导细胞死亡的模式。如上提及,2-FG不干扰糖基化,并且是比2-DG更有效的糖酵解抑制剂。因此,预期由2-FG诱导的细胞死亡将仅通过坏死发生。
已经证明在体外的含氧量正常的条件下对2-DG和/或2-FM和/或2-CM敏感并容易在裸鼠中生长的细胞系可用于证明2-DG(和2-FM和2-CM)作为抵抗它们的单一试剂在体内给予时也是有效的。在肿瘤达到某一尺寸时,采用2-DG的处理将通过腹膜内注射而被应用。按照先前在这些动物中确定的最小致死剂量的2-DG的剂量和处理方案可用于证明肿瘤衰退和细胞毒性。
实施例1:材料与方法
分离抗性突变体。将2-DG敏感的SKBR3和NSCLC细胞暴露于剂量递增的2-DG中,并且分离抗性克隆,并在适当剂量的2-DG中繁殖。然后对所繁殖的2-DG抗性细胞进行分析,并与用于表达负责该独特的敏感性的特定基因的野生型的敏感配对物比较。
药物和抗体。Rho 123、寡霉素、星形孢菌素和2-DG、2-FG、2-FM、衣霉素、脱氧mannojirinomycin购自SigmaChemical Co.。如下的初级抗体可被使用:HIF-Ia和LDH-a的单克隆抗体(BD Biosciences);erbB2(Calbiochem,USA);Grps 78 & 94(StressGen,USA);胱天蛋白酶4和5(StressGen,USA);以及肌动蛋白(Sigma Chemical Co.);GLUT-I(USA Biological)和GADD153/CHOP(Santa Cruz,USA)的多克隆抗体。二级抗体是与辣根过氧化物酶缀合的兔抗鼠和羊抗兔(Promega,Co.)。
细胞毒性分析和快速DNA含量分析。细胞培养在37℃、5% CO2下24小时,此时开始药物处理并持续72小时。这时,用胰蛋白酶消化附着的细胞,并与它们各自的培养液混合,接着以400g离心5分钟。将含有该细胞的沉淀悬浮在1.5ml培养液/台盼蓝混合物中,用于细胞毒性分析,或者悬浮在碘化丙锭/低渗柠檬酸盐染色溶液中,用于通过Coulter XL流式细胞计数器确定核DNA含量和细胞周期。分析至少10,000个细胞,产生DNA分布柱状图。
乳酸分析。将0.025ml来自经过处理或者未被处理的培养物的脱蛋白培养液添加到含有0.1ml乳酸脱氢酶(1000units/ml)、2ml氨基乙酸缓冲液(氨基乙酸,0.6mol/L,和肼,pH9.2)以及1.66mg/ml NAD的反应混合物中,来测定乳酸。用1ml 8%w/v高氯酸处理0.5ml来自测试培养物的培养液,搅动30秒,然后在4℃下温育该混合物5分钟,并以1500g离心10分钟,进行脱蛋白质处理。将上清液离心3次以上,将0.025ml最终澄清的上清液用于测定乳酸。使用Beckman DU r 520紫外/可见分光光度计,在340nm下检测NADH的形成,其直接对应于通过乳酸盐标准曲线所确定的乳酸水平。
2-DG的摄取。将细胞接种到陪氏培养皿中,在37℃和5% CO2下培养24小时。然后除去培养液,用不含葡萄糖和血清的培养液洗涤培养皿。将2ml含有3H标记的2-DG的无血清培养液添加到该培养皿中(1γCi/皿),温育该培养皿适当时间。然后除去培养液,在4℃下洗涤培养皿3次,加入含有100μM未被标记的2-DG和0.5ml 1N NaOH的无血清培养液。在37℃下培养3小时(或过夜)后,刮下细胞并通过超声波降解获得匀浆(10秒钟)。将溶液收集到试管中,用于3H量化(保留一部分用于蛋白质分析)。将100μL蚁酸、250μL样本和7ml闪烁计数混合物添加到3H计数瓶中,并用闪烁计数器读取。通过总CPM/比放射性/总蛋白质来计算转运速度(nmol/mg蛋白质/时间)。
ATP定量分析。用ATP小试剂盒(Perkin Elmer)来量化ATP的水平。将约50mL细胞溶解液添加到底部透明的96孔平板内的100mL细胞上清液中。将该平板放置在摇床(700rpm)上,在室温下培养5分钟。将50mL底物溶液添加到孔中,并在室温下再摇晃(700rpm)5分钟。然后将该平板在黑暗中放置10分钟,测量其发光度。
Dol-P Man和脂联寡糖(LLO)的代谢标记和提取.按照Lehle描述的程序,用[2-3H]甘露糖标记细胞30分钟,刮取到2ml冰冷的甲醇中,通过超声波溶解。在加入4ml氯仿后,进行超声波降解,接着在4℃下以5000rpm离心10分钟。收集上清液,用氯仿/甲醇(3:2)(C/M)萃取沉淀两次。将含有Dol-P-Man和小分子量的脂联寡糖的组合上清液在N2中干燥,溶解在3ml C/M中,洗涤,并用含有C/M/H2O(65:25:4)的流动缓冲液在硅胶60铝薄片上进行薄层层析分析。对含有大尺寸的LLO的剩余丸片进行洗涤,并用C/M/H2O(10:10:3)进行萃取。将相应的C/M和C/M/H2O萃取物的等份物混合,并在N2下干燥,并重新悬浮在35γl 1-丙醇中。为了通过温和的加酸水解来释放寡糖,加入500γl0.02N HCI,接着在100℃下温育30分钟。
将水解的物质在N2下干燥,然后通过超声波处理而重新悬浮在200γl水中,并通过离心使之澄清。含有被释放的寡糖的上清液被用于HPLC分析。
通过HPLC进行寡糖的大小分级.可以在包括LC-NH2(2cmx 4.6mm)预柱的Supelcosil LC-NH2柱(25cmx 4.6mm;5γm;Supelco)上进行LLO的分离。以1ml/min的流速应用线性浓度梯度为70%到50%的乙腈水溶液。通过液相闪烁计数对洗出液部分进行分析。
甘露糖6-磷酸、甘露糖1-磷酸、GDP-甘露糖的制备。在用[2-3H]甘露糖标记后,收集细胞,并通过Korner等人描述的纸层析将游离的甘露糖与核苷酸连接的和磷酸化的甘露糖衍生物分离开来。部分通过液相闪烁计数对洗出液进行分析。
蛋白质印迹分析。以104个细胞/cm2将细胞铺板,并使其在药物处理的条件下生长指定时间。在处理的后期,收集细胞,并用添加了蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液(150mM NaCl、1% Np-40、0.5% DOC、0.1% SDS、50mM Tris-HCI,ph8.0)溶解。使溶液通过21G针头10次,将DNA片段化。用超级蛋白质分析试剂盒(Cytoskeleton,USA)测定蛋白质浓度。将样本与2x Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad,USA)混合,并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。将凝胶转移到硝基纤维素膜(Amersham,USA)上,用特定的抗体探查。探查后,洗涤膜并且使其与HRP缀合的二级抗体一起温育。通过对胶片进行曝光来检测化学发光。
显示时,用剥离缓冲液(Pierce,USA)来剥离膜,并且用抗肌动蛋白的初级抗体再次探查。
ErbB2的免疫沉淀反应。在处理细胞24小时后,用RIPA(15mMNaCl、1% Np-40、0.1% SDS)溶解和超声波处理细胞。将细胞溶解产物与连接到单克隆ErbB2抗体(Calbiochem,USA)上的CnBr活化的琼脂糖珠(Amersham,USA)一起温育,并以400g旋转5分钟。
将免疫沉淀的ErbB2加载到SDS-PAGE凝胶上,并用伴刀豆球蛋白A印迹,伴刀豆球蛋白A特异性地结合糖蛋白的甘露糖残基。
凋亡分析。如所述进行凋亡ELISA分析,其基于由甲酰胺引起的凋亡细胞的浓缩染色体中的选择性DNA变性以及凋亡细胞中单链DNA(ssDNA)与高度特异性地结合ssDNA的单克隆抗体的反应。这些抗体特异性地检测凋亡细胞而不与坏死细胞发生反应。
通过流式细胞计数研究细胞死亡机制。用膜连蛋白-V-荧光染色试剂盒(Roche,USA)将凋亡与坏死区分开。在进行特定处理后,将106个细胞重新悬浮在含有偶联了膜连蛋白-V的FITC和碘化丙锭的培养缓冲液中,分别检测phosphotdyl丝氨酸和质膜的完整性。在培养后,通过流式细胞计数器对细胞进行分析,使用488nm激发光,将515nm带通滤光器用于检测荧光,并且将>600nm的滤光器用于检测PI。
基因表达模式。基因阵列试剂盒购自Super Array Inc。通过反转录反应,用dCTP[α-32P](3000Ci/mmol)对来自选择的细胞系的总RNA进行探查。将探查到的被标记的cDNA加入到预杂交的阵列膜上,在杂交条件下温育过夜。在多次洗涤除去游离探针后,将膜曝光到X-射线胶片上来记录图象。
体内肿瘤试验。重复在Cancer Res.2004(Lampidis等人)中报道的用于2-DG+Dox的所述方案,用2-FG替换2-DG。将5~6周龄、重30g的CD1品种的裸鼠以107个细胞/ml植入(S.C.)100γl人骨肉瘤细胞系143b。当肿瘤大小达到50mm3(9-10天后)时,将小鼠按照如下配对分成四组(8只/组):生理盐水处理对照组;单独2-FG;单独Dox;和Dox+2-FG。在第0天,单独2-FG组和Dox+2-FG组以75mg/ml(500mg/kg)剂量接受0.2ml 2-FG i.p.,这在试验期间每周重复3次。第1天,让Dox组和Dox+2-DG组以0.6mg/ml(6mg/kg)的剂量接受0.3mlDox i.v.,该处理每周1次,总共处理3次(18mg/kg)。对小鼠进行称重,每周用卡尺测量肿瘤三次。
在上述模型中,植入SKBR3细胞并进行测试,使用2-DG或2-FM,但是不用阿霉素(Dox)。
实施例2
某些肿瘤细胞对甘露糖衍生物的含氧量正常的敏感性
在低氧条件下生长的细胞仅依赖于通过糖酵解的葡萄糖代谢来产生能量。结果,当用2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)阻断该路径时,含氧量低的细胞死亡。相比之下,当在含氧量正常的条件下阻断糖酵解时,大部分细胞能够存活,这是因为脂肪和蛋白质可以替代作为能量来源,为线粒体氧化磷酸化提供燃料。本发明部分地基于这样的发现:在正常的氧气压力下,大量被选择的肿瘤细胞系在相对低剂量的2-DG(4mM)下被杀死。先前已经证明,2-DG干扰病毒衣壳糖蛋白合成中的N-联糖基化过程,这可以通过添加外源性甘露糖来逆转。由于在此描述的含氧量正常条件下的2-DG毒性能够被低剂量的甘露糖(2mM)完全逆转,糖基化而不是糖酵解被认为是产生这些结果的作用机制。另外,在阻断糖酵解和杀死含氧量低的细胞方面,2-氟-脱氧-D-葡萄糖(2-FDG)比2-DG更有效,但是在含氧量正常的条件下,2-氟-脱氧-D-葡萄糖(2-FDG)对任何对2-DG敏感的细胞类型没有毒性。
为了研究2-DG对糖蛋白合成的作用,将伴刀豆球蛋白A(其特异性结合糖蛋白的甘露糖部分)用于研究,该研究表明2-DG而不是2-FDG使结合减小,这可以通过添加外源性甘露糖来逆转。类似地,已知当N-联糖基化发生改变时,会诱导未折叠的蛋白应答(UPR)蛋白质grp98和78,这两种蛋白质被2-DG而不是2-FDG上调,同样地,这种作用能够被甘露糖逆转。此外,2-DG通过上调介导凋亡的UPR特异性转录因子(GADD154/CHOP)而诱导细胞死亡。因此,在某些肿瘤细胞类型中,2-DG可在临床上被用作单一试剂来选择性地杀死实体肿瘤中的有氧细胞(通过干扰糖基化)以及低氧细胞(通过抑制糖酵解)。
尽管血管发生,但是肿瘤的快速生长的代谢需求常常超过氧的供应,这有助于在大部分实体肿瘤中形成低氧区域。当肿瘤生长时,发生氧含量降低,导致低氧部分中的细胞复制速度下降,产生对大部分通常靶向快速增生细胞的化疗剂的抗性。Brown,J.M,等人,Exploiting TumorHypoxia In Cancer Treatment,Nat Rev Cancer 2004;4:437-47。由于生长缓慢并且缺乏产生活性氧组分所需的氧气,低氧细胞还会对放疗产生抗性。Semenza,G.L,Intratumoral Hypoxia,Radiation Resistance,And HIF-I,Cancer Cell 2004;5:405-406。除了这些癌症治疗的不利之处外,低氧致使肿瘤细胞依赖于糖酵解来生产能量并存活。在低氧情况下,生产ATP的最有效手段的氧化磷酸化被抑制,留下糖酵解作为生成ATP的唯一手段。因此,阻断低氧肿瘤细胞的糖酵解会导致细胞死亡。实际上,在体外模拟低氧的三种不同条件下,已经证明肿瘤细胞可以被糖酵解抑制剂杀死。Maher,J.C,等人,Greater Cell Cycle Inhibition And CytotoxicityInduced By 2-deoxy-D-glucose In Tumor Cell Treated Under Hypoxic vsAerobic Conditions,Cancer Chemother Pharmacol 2004;53:116-122。此外,抑制含氧正常的细胞内的糖酵解并不显著地影响其能量生产,这是因为可替代的碳源,即氨基酸和脂肪,可被用于启动线粒体氧化磷酸化。因此,糖酵解抑制剂可用于选择性地靶向低氧肿瘤细胞,对正常的或者依靠氧气生长的肿瘤细胞不具有大的毒性。Boros,LG.,等人,InhibitionOf Oxidative And Nonoxidative Pentose Phosphate Pathways BySomatostatin:A Possible Mechanism Of Antitumor Action,MedHypotheses 1998;50:501;LaManna,J.C,Nutrient Consumption AndMetabolic Perturbation,Neurosurg Clin N Am 1997;8:145-163。
事实上,体内试验已经证明在不同人肿瘤异种移植物中,2-DG(靶向缓慢生长的低氧肿瘤细胞)提高了标准化疗剂(对准快速增生的需氧细胞)的功效。Maschek,G.,等人,2-dexyo-D-glucose Increases TheEfficacy Of Adriamycin And Paclitaxel In Human Osteosarcoma AndNon-Small Cell Lung Cancers In Vivo,Cancer Res 2004;64:31-4。这些试验的结果以及来自体外低氧模型的数据已经引导测试该策略用于改善在人中进行的化疗方案,以题为“2-脱氧-D-葡萄糖单独和结合多西他赛(docetaxel)在患有高级实体恶性肿瘤的患者中的I期剂量调整试验”的I期临床试验的形式进行,该试验目前正在进行中。Maher,J.C.,等人,Greater Cell Cycle Inhibition And Cytotoxicity Induced By2-deoxy-D-glucose In Tumor Cell Treated UnderHypoxic vs AerobicConditions,Cancer Chemother Pharmacol 2004;53:116-122。来自动物试验的数据以及来自I期临床试验的初步数据表明,对于正常细胞而言,对2-DG的耐受性很高并且相对没有毒性。
尽管理论上,含有能够进行氧化磷酸化的线粒体的肿瘤细胞不会被糖酵解抑制剂2-DG杀死,但是在存在氧气的情况下,选择量的癌症细胞系死于低剂量的这种糖类似物。该毒性作用机制不是通过阻断糖酵解,这是因为这些细胞系进行正常的线粒体呼吸,并且对其他糖酵解抑制剂具有抗性。类似的作用机制在病毒的糖蛋白合成中也已经被显示,其中2-DG通过干扰脂联寡糖组装来阻断N-联糖基化。Datema,R.等人,Interference With Glycosylation Of Glycoproteins,Biochem J1979;184:113-123;Datema,R.等人,Formation Of2-Deoxyglucose-Containing Lipid-Linked Oligosaccharides,Eur J Biochem1978;90:505-516。在含氧量正常条件下生长的被选择的肿瘤细胞系中2-DG的毒性作用似乎是由于类似的机制而引起的。
按照本发明,在某些具有含有在含氧量正常的条件下对2-DG敏感的细胞的实体肿瘤的患者中,2-DG可以被用作单一试剂。因此,在这些患者中,2-DG应当具有双重作用:(1)通过干扰糖基化而靶向需氧的肿瘤细胞群体;和(2)抑制肿瘤中的低氧部分的糖酵解;这两种机制都导致细胞死亡。
材料与方法
细胞类型
如King,M.P.等人,Human Cell Lacking Mtdna:Repopulation WithExogenous Mitochondria By Complementation,Science 1989;246:500-503中所述,通过用溴化乙锭处理骨肉瘤细胞系143B(wt)延长的时间来分离p0细胞。由于p0细胞是尿苷和丙酮酸盐营养缺陷型的,将它们培养在添加了10%胎牛血清、50mg/ml尿苷和100mM丙酮酸钠的DMEM(GIBCO,USA)中。SKBR3细胞系是从迈阿密大学的Joseph Rosenblatt教授的实验室获得。胰腺癌细胞系1420和1469、卵巢癌细胞系SKOV3、宫颈癌细胞系HELA和骨肉瘤细胞系143B购自ATCC。非小细胞肺癌细胞系和小细胞肺癌细胞系由迈阿密大学的Niramol Savaraj教授从患者中获得。将SKBR3和SKOV3细胞在McCoy的5A培养液中培养;将1420、1469和143B在DMEM(GIBCO,USA)中培养;而将HELA在MEM(GIBCO,USA)中培养。在培养液中添加了10%胎牛血清。使所有细胞在5% CO2和37℃下生长。
药物和化学药品
2-DG、寡霉素和衣霉素购自Sigma。2-FDG和2-FDM是由Priebe教授(MD Anderson Cancer Center,TX)惠赠。
低氧
对于在低氧条件下进行的试验(模式C),接种细胞,并如下用于直接细胞毒性分析那样在37℃和5% CO2下培养24小时。在培养24小时后,细胞接受药物处理,并将其放置在与110型氧气控制器(RemingBioinstruments Co.Redfield,NY)相连的Pro-Ox体外腔室中,其中用95%氮气和5% CO2混合气体灌注该腔室,以获得期望的氧气水平(0.1%)。
细胞毒性分析
在37℃和5% CO2下培养细胞24小时,此时开始药物处理,并继续培养72小时。这时,用胰蛋白酶消化附着的细胞,并与各自的培养液混合,接着以400g离心5分钟。将沉淀重新悬浮在1ml汉克斯溶液中,用Vi-CeIl(Beckman Coulter,USA)细胞存活率分析仪进行分析。
乳酸分析
将0.025ml来自经处理或未被处理的培养物的脱蛋白培养液添加到反应混合物,测量乳酸,该反应混合物中含有0.1ml乳酸脱氢酶(1000单位/ml)、2ml氨基乙酸缓冲液(氨基乙酸,0.6mol/L和肼,pH9.2)以及1.66mg/ml NAD。用1ml 8%w/v高氯酸处理0.5ml来自测试培养物的培养液,搅动30秒,然后在4℃下温育该混合物5分钟,并以1500g离心10分钟,进行脱蛋白质处理。将上清液离心3次以上,如上所述将0.025ml最终澄清的上清液用于测定乳酸。用Beckman DU r 520紫外/可见分光光度计在340nm下检测NADH的形成,其直接对应于通过乳酸盐标准曲线所确定的乳酸水平。
ATP定量分析
用ATP小试剂盒(Perkin Elmer)量化ATP的水平。将约50mL细胞溶解液添加到底部透明的96孔平板内的100mL细胞上清液中。将该平板放置在摇床(700rpm)上,在室温下培养5分钟。然后将50mL底物溶液添加到孔中,并在室温下再摇晃(700rpm)5分钟。然后在黑暗中放置该平板10分钟,测量其发光度。
蛋白质印迹分析
以104个细胞/cm2的密度将细胞铺板,并在药物处理的条件下生长指定的时间。在处理的后期,收集细胞,并用含有1%SDS并添加了蛋白酶抑制剂混合物的80mM Tris-HCL(ph7.4)缓冲液溶解。通过超声波处理使DNA片段化,并用微BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce,USA)测定蛋白质浓度。将样本与2x Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad,USA)混合,并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。将凝胶转移到硝基纤维素膜(Amersham,USA)上,用抗-KDEL(Stressgen,Canada)(用于检测Grp78和Grp94);抗-CHOP/GADD154多克隆抗体(Santa Cruz,USA)、抗-erbB2多克隆抗体(DAKO,USA)进行探查。探查后,洗涤膜,与HRP缀合的二级抗体一起温育。通过对胶片曝光来检测化学发光。显示时,用剥离缓冲液(Pierce,USA)剥离膜,并用抗肌动蛋白的初级抗体再次探查。为了分析伴刀豆球蛋白A(ConA)的结合情况,将膜与0.2mg/mlHRP缀合的ConA一起温育,并如所述检测化学发光。
结果
2-DC和2-氟-D-甘露糖,而不是2-FDG杀死在含氧量正常的条件下生长的SKB R3细胞。
在测量大量肿瘤细胞系在含氧量正常和低氧条件下对糖酵解抑制剂的不同敏感性时,发现人乳腺癌细胞系SKBR3在含氧量正常的条件下生长时对2-DG敏感。图1A和B证明,当用3mM 2-DG处理SKBR372小时时,其生长被抑制了50%(ID50),而当用12mM处理时,60%细胞被杀死。先前的研究表明,当线粒体呼吸存在缺陷或者被化学阻断时,用类似剂量2-DG进行处理,肿瘤细胞会死亡。因此,为了确定这些细胞是否存在线粒体呼吸缺陷,测定它们的氧消耗量。如下面表1所证明,在平均氧消耗量方面,SKBR3细胞和其他两种在含氧量正常条件下生长对2-DG具有抗性的细胞系没有显著差异。另一方面,线粒体缺陷的细胞系p0表现出急骤下降的氧消耗量,证明SKBR3的呼吸正常。此外,两种其他细胞系,1420和HELA,在含氧量正常的条件下对2-DG敏感,其呼吸与抗性细胞系一样甚至更好(参见表1)。因此,在含氧量正常的条件下2-DG在这些细胞中产生的毒性是由于阻断糖酵解之外的其他作用机制而引起的。为了证实这一点,将SKBR3细胞用两种其他糖酵解抑制剂,即2-脱氧-2-氟-葡萄糖(2-FDG)和草氨酸盐处理。在图1A和B中,可以看出这两种试剂对在含氧量正常的条件下生长的SKBR3细胞都没有毒性。
表1.在2-DG敏感的与抗性的细胞系中的氧消耗量的比较
细胞系 | 组织类型 | 平均氧气消耗量(nmol/106细胞/分钟) |
143B | 骨肉瘤 | 2.81±0.11 |
P0 | 骨肉瘤 | 0.09±0.004 |
SKOV3 | 卵巢癌 | 2.38±0.32 |
SKBR3 | 乳腺腺癌 | 2.01±0.29 |
1420 | 胰腺腺癌 | 4.70±0.03 |
HELA | 子宫颈腺癌 | 2.76±0.04 |
此外,在对SKBR3细胞产生毒性方面,尽管2-氟-D-甘露糖(2-FDM)的效率较低,但是与2-DG类似(参见图1)。在结构上,2-DG和2-FDM而不是2-FDG类似于甘露糖,从而能够干扰甘露糖的代谢。这些数据表明,2-DG和2-FDM干扰甘露糖的代谢,主要是众多蛋白质的N-联糖基化,引起SKBR3细胞死亡以及抑制细胞生长。
2-FDG是比2-DG更好的糖酵解抑制剂,导致在SKBR3细胞中更多地消耗了ATP
在先前的报道中,一般认为2-DG在含氧量正常条件下生长的SKBR3细胞中产生的毒性作用是通过抑制糖酵解的ATP生成来调节的。Aft,R.L.等人,Evaluation Of 2-dexyo-D-glucose As A ChemotherapeuticAgent:Mechanism Of Cell Death,Br J Cancer 2002;87:805-812。然而,如上指出,另一种糖酵解抑制剂2-FDG在这些细胞中没有毒性。而且在抑制糖酵解和杀死低氧细胞方面,2-FDG类似物优于2-DG。Lampidis,TJ.等人,Efficacy of 2-Halogen Substituted D-Glucose Analogs in BlockingGlycolysis and Killing"Hypoxic Tumor Cells,"Cancer ChemotherPharmacol(in press)。实际上,当用2-FDG或2-DG处理SKBR3细胞时,2-FDG抑制乳酸水平(糖酵解的测量值)的效果优于2-DG(参见图2A)。而且,用2-FDG处理时,ATP的损耗更为突出,进一步证实了在这些细胞中,这种糖类似物是糖酵解和ATP生成的一种较好的抑制剂(参见图2B),此外,发现当SKBR3细胞在低氧条件下生长时,2-FDG的毒性大于2-DG,进一步证实了在SKB R3细胞中,2-FDG是一种较好的糖酵解抑制剂(数据未显示出来)。因此,与先前的报道相反,2-DG在含氧量正常的条件下产生的毒性似乎与其抑制糖酵解和减少ATP库的能力无关。2-DG在含氧量正常的条件下的SKBR3细胞中产生的毒性作用可以通过外源性甘露糖逆转。
在病毒蛋白方面,2-DG已经被证明能够抑制N-联寡糖的组装,这种抑制作用可以被外源性甘露糖逆转。Datema,R.等人,Interference WithGlycosylation Of Glycoproteins,Biochem J 1979;184:113-123。图3A和3B说明添加甘露糖而不是其他糖,即葡萄糖、果糖和海藻糖,在含氧量正常的条件下暴露于2-DG引起的细胞死亡能被逆转,这表明细胞死亡是由通过类似的作用机制干扰糖基化来介导的。Datema,R.等人,Interference With Glycosylation Of Glycoproteins,Biochem J 1979;184:113-123。作为阴性对照,已经发现甘露糖不能够逆转在相同条件下由衣霉素在SKB R3细胞引起的毒性作用。这可通过如下事实来解释,即衣霉素干扰在甘露糖被添加到寡糖上之前的步骤的糖基化,从而使之不受甘露糖代谢的影响(数据未显示出)。
在三种低氧模型中的2-DG毒性作用不被外源性甘露糖所逆转
如上指出,在低氧条件下生长的细胞仅依赖于糖酵解来生产能量。因此,用糖酵解抑制剂抑制该代谢路径会导致细胞死亡,这先前已经被证明了。Maher,J.C等人,Greater Cell Cycle Inhibition And CytotoxicityInduced By 2-Deoxy-D-Glucose In Tumor Cells Treated Under Hypoxic vsAerobic Conditions,Cancer Chemother Pharmacol 2004;53:116-122。为了辨别2-DG对在含氧量正常的条件下生长的SKBR3细胞产生毒性的作用机制,将甘露糖添加给在三种不同的低氧条件下生长的细胞。如图3C和D中所示,在正常生长培养液或在添加了2mM甘露糖的相同培养液中,生长抑制和细胞死亡均不存在显著性差异。这些结果提供证据表明:外源性甘露糖逆转2-DG在含氧量正常的条件下生长的SKBR3细胞中产生的毒性作用与糖酵解无关,进一步暗示干扰糖基化是这些在含氧量正常条件下生长的细胞死亡的模式。
2-DG和2-FDM仅对在含氧量正常条件下生长的大量被选择的肿瘤细胞系具有毒性
为了研究2-DG在含氧量正常的条件下的毒性作用是否仅限于某些类型的癌症组织,对大量细胞系进行了测试。这些测试的结果示于表2中,表明仅选定数量的在正常氧气压力下的肿瘤细胞系(15个中的6个)在用6mM2-DG或2-FDM而不是2-FDG处理时发生大量细胞死亡。对2-DG敏感的细胞系是乳腺癌细胞系SKBR3;胰腺癌细胞系1420;2种直接来自患者的非小细胞肺癌细胞系;多发性骨髓瘤细胞系RT8226;宫颈癌细胞系HELA和恶性胶质瘤细胞系TG98。然而,在正常氧气压力下,来自类似组织的癌症细胞系对2-DG和2-FDM都具有抗性,表明这些糖类似物的毒性作用并不必然地是组织特异性的。
表2.抗性的与敏感的细胞系(在含氧量正常下的2-DG)
2-DG敏感细胞系 | 2-DG抗性细胞系 |
SKBR3,乳腺癌 | SKOV3,卵巢癌 |
1420,胰腺癌 | 1469,胰腺癌 |
HELA,宫颈癌 | 143B,骨肉瘤 |
S-1和S-2,非小细胞肺癌 | Ra-1、2和3,小细胞肺癌 |
TG98,大脑癌症(神经胶质瘤) | MCF-7,乳腺癌 |
RT8228,多发性骨髓瘤 | U266,多发性骨髓瘤HEPA-1,大鼠肝细胞瘤MDA-MB-231,乳腺癌MDA-MB-468,乳腺癌 |
2-DG和2-FDM降低SKBR3细胞中的伴刀豆球蛋白A(ConA)的结合以及糖蛋白的分子量。
ConA是一种特异性地结合糖蛋白上的甘露糖的凝集素,并被用于检测高级甘露糖型的糖蛋白。Protein Purification Methods:A PracticalApproach,In:Harris ELV,Angal S,editors.New York:IRLPress at OxfordUniversity Press;1994.p.270。该技术被用于证明2-DG和2-FDM以及衣霉素降低了ConA与大量糖蛋白的结合(参见图4A)。此外,在用2-DG和2-FDM而不是衣霉素处理的细胞中,外源性甘露糖恢复对照的ConA结合水平,而用2-FDG处理的细胞在ConA结合方面没有下降。此外,erbB2是一种已知的糖蛋白,是在用2-DG处理后在SKBR3细胞中表达的酪氨酸激酶受体,该糖蛋白的分子量改变可通过蛋白质印迹来分析。图4B说明了2-DG和2-FDM都能降低erbB2的分子量,而2-FDG不产生该作用。与ConA的数据相一致,外源性甘露糖能将该蛋白质的分子量恢复到其原始大小。这些数据进一步支持了2-DG和2-FDM而不是2-FDG通过干扰N-联糖基化,对被选择的肿瘤细胞具有毒性,并且这种干扰作用能够被甘露糖逆转。
用2-DG或2-FDM处理会在含氧量正常的条件下在SKBR3细胞中产生未折叠蛋白的应答
当蛋白质的正常糖基化过程受到影响时,错误折叠的蛋白质会在内质网(ER)中积聚,导致发出被称作为未折叠蛋白应答(UPR)的级联信号。已经证明干扰糖基化的药物能够引发UPR,导致通过上调分子伴侣Grp78/Bip或Grp94,提高ER的蛋白质折叠能力。如图5中所示,在含氧量正常的条件下,用2-DG、2-FDM或者众所周知的糖基化抑制剂衣霉素处理SKBR3细胞,Grp78和Grp94都被上调。此外,添加2mM甘露糖逆转2-DG和2-FDM对分子伴侣的上调作用,但是不逆转衣霉素的上调作用。甘露糖逆转由2-DG引发的UPR与图3D中的数据相关,图3D中的数据证明通过添加外源性甘露糖能逆转2-DG的毒性作用;类似结果可见于2-FDM处理的细胞中(数据未给出)。如所期望的,2-FDG不能与2-DG或2-FDM一样提高这些分子伴侣的水平,这与证明在含氧量正常的条件下被处理的SKBR3细胞未发生死亡的毒性数据是相关的(图IB)。相比之下,当2-DG或2-FDM被应用于在三种不同的低氧试验条件下生长的细胞时,与模型C相比,在模型A和B中未见UPR被显著上调,但是两种分子伴侣都被上调。此外,在所有三种模型中,作为阳性对照的衣霉素被证明会诱导这些分子伴侣的合成(图5B)。这些结果表明,当用2-DG或2-FDM处理细胞时,在“低氧”(阻断糖酵解)与含氧量正常(干扰糖基化)的条件下,细胞死亡的作用机制是不同的。
2-DG和2-FDM的毒性与SKBR3细胞中的UPR特异性凋亡路径的诱发相关。
据报道,当细胞不能克服ER应激时,UPR通过诱导GADD154/CHOP来引发特异性的凋亡路径。Xu,C等人,EndoplasmicReticulum Stress:Cell Life And Death Decisions,J Clin Invest 2005;115:2656-2664;Obeng,E.A.等人,Caspase-12 And Caspase-4 Are NotRequired For Caspase-Dependent Endoplasmic Reticulum Stress-InducedApoptosis,J Biol Chem 2005;280:29578-29587。因此,为了确定在含氧量正常的条件下,2-DG和2-FDM杀死SKBR3细胞是否是由于ER应激而致,将这种UPR特异性的凋亡蛋白质用蛋白质印迹进行分析。这可参见图6,在用2-DG、2-FDM和衣霉素处理后,诱导了GADD154/CHOP,但是2-FDG处理不诱导GADD154/CHOP。当这种凋亡路径被2-DG或2-FDM引发时,可以用甘露糖共同处理来逆转;然而,衣霉素诱导的GADD154/CHOP不能通过添加这种糖来逆转。这些数据与如图2B中所示的通过甘露糖来逆转细胞毒性作用是相关的。
实施例1和2的讨论
由于血管生成不足、肿瘤生长迅速以及肿瘤血管携带氧的能力下降,实体肿瘤含有低氧区域和含氧量正常的区域。Gillies,RJ.等人,MRIOf The Tumor Microenviroment,J Magn Reson Imaging 2002;16:430-450;Maxwell,P.H.等人,Hypoxia-Inducible Facoro-1 Modulates GeneExpression In Solid Tumors And Influences Both Angiogenesis And TumorGrowth,PNAS 1997;94:8104-8109;Semenza,G.L.,Targeting HIF-I ForCancer Therapy,Nature Rev 2003;3:721-732。由于在低氧细胞中,唯一的能量生产路径是糖酵解,已经证明糖酵解抑制剂2-DG选择性地对这些细胞具有毒性,但是对需氧细胞没有毒性并且仅抑制其生长。Maher,J.C等人,Greater Cell Cycle Inhibition And Cytotoxicity Induced By2-dexyo-D-glucpse In Tumor cell Treated Under hypoxic vs AerobicConditions,Cancer Chemother Pharmacol 2004;53:116-122;Maschek,G.等人,2-deoxy-D-glucpse Increases The Efficacy Of Adriamycin AndPaclitaxel In Human Osteosarcoma And Non-Small Cell Lung Cancers InVivo,Cancer Res 2004;64:31-4;Liu,H.等人,Hypersensitization Of Tumorcell To Glycolytic Inhibitors,Biochemistry 2001;40:5542-5547;Liu,H.等人,Hypoxia Increases Tumor Cell Sensitivity To Glycolytic Inhibitors:AStrategy For Solid Tumor Therapy(Model C,.Biochem Pharmacol 2002;64:1745-1751。然而,在存在氧气时,选定数量的肿瘤细胞系被2-DG杀死。这些敏感的细胞类型中有人乳腺癌细胞系SKBR3。线粒体呼吸的缺陷能够解释这些细胞对2-DG敏感的原因,这是因为线粒体受到危害的细胞的糖酵解被阻断将降低ATP水平,导致细胞坏死性死亡。Gramaglia,D.等人,Apoptosis To Necrosis Switching Downstream Of ApoptosomeFormation Requires Inhibition Of Both Glycolysis And OxidativePhosphorylation In A BCL-X1And PKB/AKT-Independent Fashion,CellDeath Differentiation 2004;11:342-353。然而,这种可能性通过氧消耗试验而被排除了,氧消耗试验证明SKBR3细胞的呼吸与两种被发现在含氧量正常条件下对2-DG具有抗性的其他细胞系是类似的(表1)。而且,在含氧量正常的条件下对2-DG也敏感的细胞系1420的呼吸速率高于2-DG抗性细胞系。因此,在含氧量正常的条件下,2-DG在SKBR3中的毒性不能通过线粒体功能缺陷来解释,表明该细胞死亡机制与该糖阻断糖酵解的作用无关。
先前已经报道,由于抑制了糖酵解,SKBR3细胞在含氧量正常的条件下对2-DG敏感,导致ATP库的耗尽,这会引起葡萄糖转运蛋白-I的表达增加,并且更多地摄取2-DG。Aft,R.L.等人,Evaluation Of2-Deoxy-D-Glucose As A Chemotherapeutic Agent:Mechanism Of CellDeath,Br J Cancer 2002;87:805-812。然而,2-FDG是比2-DG更为有效的糖酵解抑制剂(11,图2),但是对在含氧量正常的条件下生长的SKBR3细胞没有毒性,进一步支持了2-DG通过阻断糖酵解和抑制ATP生成的之外的其他机制杀死这些细胞的结论。
证明SKBR3细胞对甘露糖类似物2-FDM也敏感的数据表明,糖类似物的甘露糖构象对于它们在含氧量正常的条件下生长的被选择的肿瘤细胞中产生的毒性活性来说是重要的。在2-DG的第二个碳原子上缺乏氧原子,使得该化合物成为葡萄糖和甘露糖的类似物,其中2-FDG中的氟基团使其仅是葡萄糖类似物。有Schwartz领导的研究小组在20世纪70年代末期发表的试验结果支持了甘露糖构象与这些糖类似物的毒性相关的结论。
该研究小组证明2-DG、2-FDG和2-FDM会干扰鸡胎成纤维细胞中的N-联糖基化,该细胞感染了家禽瘟疫病毒,结果导致糖蛋白合成减少和病毒繁殖速度下降。Datema,R.等人,Interference With Glycosylation OfGlycoproteins,Biochem J 1979;184:113-123;Datema,R.等人,FormationOf 2-Deoxy glucose-Containing Lipid-Linked Oligosaccharides,EurJBiochem 1978;90:505-516;Datema,R.等人,Fluoro-Glucose Inhibition OfProtein Glycosylation In Vivo,Eur J Biochem 1980;109:331-341;Schmidt,M.F.G.等人,Nucleoside-diphosphate Derivatives Of 2-Deoxy-D-Glucose InAnimal Cells,Eur J Biochem 1974;49:237-247;Schmidt,M.F.G.等人,Metabolism Of2-Deoxy-2-Fluoro-D-[3H] Glucose And2-Deoxy-2-Fluoro-D-f H]Mannose In Yeast And Chick-Embryo Cells,EurJ Biochem 1978;87:55-68;McDowell,W.等人,Mechanism Of InhibitionOf Protein Glycosylation By The Antiviral Sugar Analogue2-Deoxy-2-Fluoro-D-Mannose:Inhibition Of Synthesis Of Man(Gicnac)2PP-DoI By The Guanosine Diphosphate Ester,Biochemistry 1985;24:8145-8152。这些报道得出的结论是2-DG能够抑制脂联寡糖的组装,这些脂联寡糖将被运送到细胞内质网中的蛋白质上。已经证明2-DG、GDP-2DG的代谢产物会引起寡糖组装的过早终止,产生不适合运送到蛋白质上的被削短的脂联寡糖。Datema,R.等人,Formation Of 2-Deoxyglucose-Containing Lipid-Linked Oligosaccharides,Eur J Biochem1978;90:505-516。总之,这些结果表明这些类似物抑制病毒糖蛋白合成的效率的顺序为2-DG>2-FDM>2-FDG,这与这些类似物在含氧量正常的条件下生长的SKBR3细胞中的毒性是类似的。Datema,R.等人,Fluoro-Glucose Inhibition Of Protein Glycosylation In Vivo,Eur J Biochem1980;109:331-341。该研究小组还报道这些类似物的抑制作用能够通过添加低剂量的外源性甘露糖来逆转。Datema,R.等人,Interference WithGlycosylation Of Glycoproteins,Biochem J 1979;184:113-123。类似地,2mM甘露糖完全逆转2-DG和2-FDM在SKBR3细胞中产生的毒性作用,表明这两种甘露糖类似物通过干扰N-联糖基化来杀死这些细胞。Datema,R.等人,Interference With Glycosylation Of Glycoproteins,Biochem J1979;184:113-123.;Datema,R.等人,Formation Of 2-Deoxyglucose-Containing Lipid-Linked Oligosaccharides,Eur J Biochem1978;90:505-516;Datema,R.等人,Fluoro-Glucose Inhibition Of ProteinGlycosylation In Vivo,Eur J Biochem 1980;109:331-341;Schmidt,M.F.G.等人,Nucleoside-diphosphate Derivatives Of 2-Deoxy-D-Glucose InAnimal Cells,Eur J Biochem 1974;49:237-247;Schmidt,M.F.G.等人,Metabolism Of 2-Deoxy-2-Fluoro-D-[3H]Glucose And2-Deoxy-2-Fluoro-D-[3H]Mannose In Yeast And Chick-Embryo Cells,EurJ Biochem 1978;87:55-68;McDowell,W.等人,Mechanism Of InhibitionOf Protein Glycosylation By The Antiviral Sugar Analogue2-Deoxy-2-Fluoro-D-Mannose:Inhibition Of Synthesis Of Man(Gicnac)2PP-DoI By The Guanosine Diphosphate Ester,Biochemistry 1985;24:8145-8152.
虽然甘露糖是N-联糖基化蛋白中的核心糖,但是它也能参与糖酵解路径,这是因为其能够被磷酸甘露糖异构酶转化为果糖-6-磷酸。因此,甘露糖通过规避2-DG抑制的糖酵解步骤来逆转2-DG在SKBR3细胞中产生的毒性作用仍然是可能的(图7)。然而,这种可能性似乎很小,这是由于在低氧模型A和B中,2mM甘露糖不能逆转由2-DG引起的生长抑制和细胞死亡(参见图3C和3D),尽管在模型C中,实际上细胞在低氧条件下生长,存在微小的恢复作用。这种微小的恢复作用可被解释为(1)即使在低氧条件下,2-DG和2-FDM能干扰糖基化,和/或(2)甘露糖在模型C中逆转对糖酵解的抑制,这是因为这些在0.5%低氧条件下的细胞仍然发生氧化磷酸化,尽管该磷酸化下降了。总之,在含氧量正常的条件下对2-DG和2-FDM敏感的细胞中,甘露糖逆转这些糖类似物的毒性作用,但是在线粒体被关闭的细胞(模型A和B)中不产生逆转作用,支持了干扰糖基化而不是抑制糖酵解负责含氧量正常的低氧。
当N-联糖基化被抑制,蛋白质不能够正确折叠,并被保留在ER中。Ellgaard,L.等人,Quality Control In The Endoplasmic Reticulum,Nat RevMoI Cell Biol 2003;4:181-191;Parodi,AJ.,Protein Glycosylation AndIts Role In Protein Folding,Annu Rev Biochem 2000;69:69-93。未折叠蛋白质的积聚导致细胞器膨胀以及蛋白质翻译紊乱。在这种事件中,细胞启动一种复杂但是保守的信号发送级联,被称作为未折叠蛋白应答(UPR),在ER中重新建立动态平衡。三种ER跨膜蛋白将未折叠蛋白质的信号转换成核:需要肌醇的酶1(IRE1);双链RNA活化蛋白激酶(PERK),和活化转录因子6(ATF6)。Schroder,M.等人,ER StressAnd Unfolded Protein Response,Mutat Res2005;569:29-63。当未折叠的蛋白质在ER中积聚时,分子伴侣葡萄糖调控蛋白78(Grp78/Bip)从这三种ER跨膜蛋白质中分离,从而激活它们。Pahl,H.L,SignalTransduction From The Endoplasmic ReticulumTo The Cell Nucleus,Physiol Rev 1999;79:683-701。这引起大量的代谢变化和分子改变,包括上调糖转运蛋白,增加磷脂合成、氨基酸运输和分子伴侣Grp78/Bip和Grp94的表达。Ma,Y.等人,The Unfolding Tale Of The UnfoldedProtein Response,Cell 2001;107:827-830;Doerrler.W.T.,等人,Regulation Of Dolichol Pathway In Human Fibroblasts By The EndoplasmicReticulum Unfolded Protein Response,PNAS 1999;96:13050-13055;Breckenridge,D.G.,等人,Regulation Of Apoptosis By EndoplasmicReticulumPathways,Oncogene 2003;22:8608-8618。
2-DG和2-FDM上调在含氧量正常条件下生长的SKBR3细胞中的Grp78和Grp94的表达,这可以通过添加外源性甘露糖来逆转,有力地支持了这些糖类似物干扰N-联糖基化,产生未折叠的蛋白质,从而启动UPR,此外,2-FDG是一种优于2-DG或2-FDM的糖酵解抑制剂,在引发UPR反应的效率方面也不同。对这些类似物的UPR反应大小似乎放映了对糖基化的干扰程度,这与证明在阻断病毒衣壳蛋白的脂联寡糖组装的作用方面2-DG>2-FDM>2-FDG的报道是相一致的。Datema,R.等人,Fluoro-Glucose Inhibition Of Protein Glycosylation In Vivo,Eur J Biochem1980;109:331-341;Schmidt,M.F.G.等人,Nucleoside-diphosphateDerivatives Of 2-Deoxy-D-Glucose In Animal Cells,Eur J Biochem 1974;49:237-247;Schmidt,M.F.G.等人,Metabolism Of2-Deoxy-2-Fluoro-D-[3H]Glucose And 2-Deoxy-2-Fluoro-D-[3H]MannoseIn Yeast And Chick-Embryo Cells,Eur J Biochem 1978;87:55-68;McDowell,W.等人,Mechanism OfInhibition Of Protein Glycosylation ByThe Antiviral Sugar Analogue 2-Deoxy-2-Fluoro-D-Mannose:Inhibition OfSynthesis Of Man(Gicnac)2 PP-DoI By The Guanosine Diphosphate Ester,Biochemistry 1985;24:8145-8152。此外,该UPR数据与细胞毒性结果是相一致的,细胞毒性结果类似地证明了在含氧量正常的条件下在抑制生长和杀死SKBR3细胞方面,2-DG>2-FDM>>>2-FDG。
另一方面,在低氧模型A和B中,Grp78和Grp94不被2-DG上调,表明这些细胞死亡是通过抑制糖酵解而不是通过干扰糖基化而实现的。解释在这些模型中不引发UPR的原因的一种可能作用机制与Grp78/Bip结合未折叠的蛋白质从而活化UPR所需的ATP水平相关。与模型A和B形成对照,在模型C中引发了UPR(图5B),其中ATP水平被2-DG降低得较少。此外,已知衣霉素并不显著地影响ATP水平,在“低氧”模型中,衣霉素并不上调分子伴侣,证明了这些细胞中的一种功能性UPR路径。
UPR非常类似于p53,当DNA损伤发出细胞周期停滞、活化DNA修复酶,并且取决于这些过程的结果,发出凋亡的信号。因此,如果UPR不能在内质网中重新建立动态平衡。ER应激特异性的凋亡路径被激活。Breckenridge,D.G.等人,Regulation Of Apoptosis By EndoplasmicReticulum Pathways,Oncogene 2003;22:8608-8618。在凋亡路径的调节物中包括胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶12和CHOP/GADD154,增加的后者的活化被证明是优于其他的对ER诱导的哺乳动物凋亡路径的指示。Obeng,E.A.等人,Caspase-12 And Caspase-4 Are Not Required ForCaspase-Dependent Endoplasmic Reticulum Stress-Induced Apoptosis,JBiol Chem 2005;280:29578-29587。因此,图6证明了CHOP/GADD154的表达与2-DG和2-FDM在含氧量正常的条件下生长的SKBR3细胞中产生的毒性作用相关,支持了这些糖类似物是通过干扰糖基化引起的ER应激而具有毒性作用。此外,通过添加甘露糖而不是葡萄糖逆转CHOP/GADD154的诱导,进一步支持了2-DG和2-FDM是通过这种机制而产生毒性作用的。
最基本的问题是为什么当存在氧气时,某些肿瘤细胞类型在用2-DG处理时死亡,而大部分肿瘤以及正常细胞未死亡。对该问题的一种回答来自遗传试验,其中在患有被描述为1b型碳水化合物缺陷糖蛋白综合症患者中,磷酸甘露糖异构酶被缺失。Niehues,R.等人,Carbohydrate-Deficient Glycoprotein Syndrome Type Ib.,J Clin Invest1998;101:1414-1420;Freeze,H.H.,Human Disorders in N-glycosylationand Animal Models,Biochim Biophys Acta 2002;1573:388-93。这种酶的缺失引起血清糖蛋白的次级糖基化,导致血栓症和特征为蛋白质丢失性肠下垂的胃肠道紊乱。当将外源性甘露糖添加到这些患者的饮食中时,他们的血清糖蛋白恢复正常,症状消失。Freeze,H.H.,Sweet Solution:Sugars to the Rescue,J Cell Biol 2002;158:615-616;Paneerselvam,K.等人,Mannose Corrects Altered N-glycosylation in Carbohydrate-DeficientGlycoprotein Syndrome Fibroblasts,J Clin Invest 1996;97:1478-1487。这与本发明中的证明外源性甘露糖能够拯救在含氧量正常的条件下用2-DG处理杀死的被选择的肿瘤细胞的数据是相关的。可能这些类型的肿瘤细胞下调或者缺乏磷酸甘露糖异构酶,或者2-DG在这些肿瘤细胞中对该酶的作用大于大部分在含氧量正常条件下对2-DG处理具有抗性的其他细胞。然而,如图7中所示,存在许多其他步骤,其中2-DG和2-FDM可能抑制与N-联糖基化相关的甘露糖代谢。
2-DG、2-CM和2-FDM(2-FM)通过干扰会导致ER应激和凋亡的糖基化而杀死某些肿瘤类型。2-FDG不杀死这些细胞的发现排除了2-DG和2-FDM的毒性是由于抑制糖酵解和ATP耗尽引起的可能性。在处理被选实体肿瘤时,这些试剂可用作单一试剂治疗(参见图7)。
实施例3
如图8和9中所示,多重MTT分析证明了高级神经胶质瘤细胞系和各种基于糖的糖酵解抑制剂的敏感性,并用图表显示。多种条件被采用,包括暴露于含氧量正常或低氧条件下及其对这些化合物的敏感性的影响。该结果显示了对各种基于糖的糖酵解抑制剂的相对一致的敏感性(具有一些细微的差别)。对于低氧条件对敏感性的影响,一些细胞系存在明显的差别。通常,大部分细胞系在低氧条件下生长对糖酵解抑制剂更为敏感,这将是可预期的。然而,一些细胞系完全忠于需氧的糖酵解表型(完全的“瓦尔堡效应”),例如U87MG,其中乳酸含量(作为糖酵解的标记)在含氧量正常的条件下是最大的,并且在低氧条件下不会升高(参见下面的乳酸盐数据)。由于经验观察表明在低氧条件下生长的细胞的生长速度较慢,细胞由此对能量的需求可能更低,在这种情况下,通过该经验观察来解释敏感性的差异。
图8A显示对在低氧(<1%氧气)或含氧量正常的(20%氧气)条件下用2-FG处理的U87人大脑肿瘤细胞系进行的MTT分析。图8B和8C描述类似的试验,但是基于糖的糖酵解抑制剂是不同的。在B组中使用2-DG,而在C组中使用2-FM。可以看出,U87表现出一种不平常的表型,其持久地利用糖酵解来满足其代谢需要,因此,该细胞系在低氧条件下并不表现出对这些试剂的敏感性升高了。
图9给出存在2-FG或2-FM时的6天以上的生长曲线。该组图证实了对U87细胞系生长的显著抑制作用,其中2-FG似乎比2-FM略微有效些。B组和C组证明细胞系D-54在低氧和含氧量正常的条件下具有类似的生长抑制曲线。在该情形下,当细胞在低氧条件下生长时的效果明显被提高,这与该特定细胞系在低氧条件下能够刺激进一步的糖酵解代谢是相关的。
实施例4
图10和11显示了人U87MG恶性胶质瘤-星细胞瘤细胞系(U87)与D-54人神经胶质瘤细胞系在含氧量正常和低氧条件下暴露于2-DG时,在敏感性上的差异。在低氧条件下或在有氧条件下,U87MG细胞具有高的糖酵解速度(氧化糖酵解或者“瓦尔堡效应”),因此,当U87MG细胞在低氧条件下生长时,其对2-DG的敏感性不会改变。另一方面,在有氧生长条件下,D54细胞部分地转向糖酵解代谢,因此当在低氧条件下生长时,该细胞系对2-DG的敏感性较高。
图10显示了这两种细胞系之间的显著差异,并且U87相对不敏感,其更为突出。
图11说明了U87和D54的这种表型差异背后的基本原理。该组图证明D54诱导较多的糖酵解,而U87已经在最大限度地生产乳酸盐水平。
图10和11中显示的结果证明当用糖酵解抑制剂处理细胞系时,低氧的差别作用。高度依赖于糖酵解的细胞系(例如U87MG)对糖酵解抑制剂的敏感性最大,并且不需要在缺氧条件下来表现其敏感性。细胞系例如U87MG生产的乳酸的水平高且未变化证明了这一点,而D54在低氧条件下提高了其敏感性和乳酸水平。
引人注目地,神经胶质瘤细胞系对含氧量低的条件的抗性十分高。从图12中可以看出,在含氧量正常的条件下或完全低氧条件下(<1%)生长的细胞系能够依赖糖酵解提供细胞所需的能量,并且继续相当良好地生长。
实施例5
肿瘤摄取2-DG类似物2-氟18-葡萄糖(2-F18G)的证明。图13证明了在常规的PET扫描研究中,在神经胶质瘤中过度地摄取2-F18G。对患有恶性胶质瘤多态型的患者进行PET扫描,结果证明在该肿瘤中显著地摄取了2-FG。该组图显示了在给予了患者17mCi 2-F18G后的CT无对照(A)、CT有对照(B)和CT登记的PET的扫描。该药学现象提供了这些肿瘤独特地适合基于糖的糖酵解抑制剂的戏剧性的证明。
实施例6
在小鼠中的人神经胶质瘤的处理。将小鼠的人神经胶质瘤细胞的同位异种移植物用单一的2-DG处理或者结合泰莫佐罗(temozolomide)(替莫唑胺)一起处理。这些动物提供了一种高级神经胶质瘤的同位异种移植模型。重复这些试验三次,类似结果示于图14中。在动物的颅骨内植入U87 MG细胞,5天后用阴性对照(PBS)、阳性对照(替莫唑胺)、试验性单一试剂(2-DG)或者试验性组合(2-DG+替莫唑胺)处理。
图12中所示的结果首次证明了2-DG对抗同位肿瘤模型的单一试剂功效。在三个连续的动物试验中,各个组共有18只小鼠,这些结果是重复的并且是相一致的(数据未显示出)。这种特定的动物模型是非常严谨的,并且在存活率方面仅仅最中等的提高也曾经被所研究的新药物揭示。可以看出,2-DG与目前可用于大脑肿瘤的最好药物替莫唑胺是等效的(参见参见阳性对照)。
令人惊奇地,2-DG与替莫唑胺是等效的,并且其组合甚至优于单一剂量治疗。2-DG被口服给予并且其耐受性非常好。2-DG和替莫唑胺的功能相当是重要的,这是因为替莫唑胺是目前用于治疗大脑肿瘤的“金标准”。最后,这类试剂的单一试剂的功效也已经被证明,它们独特于这种疾病。
这些结果证明抑制糖酵解提高动物的存活率,类似于所用的阳性对照替莫唑胺的作用。动物对这种治疗剂的耐受性很高,并且没有表现出毒性的迹象。最后,现在从一组相关的基于糖的糖酵解抑制中选择化合物,用于先导候选选择,所述选择基于体外和体内的功效、药物特性、化学稳定性和化学合成的成本。进行首位筛选时,进行更高级的试验以及正式的动物毒物学测试。
尽管已经详细地提供和描述了本发明的特定具体实施方案,用于阐明本发明原则的应用,但是应当理解,在不偏离该原则时本发明可以被另外地具体化。
Claims (6)
1.一种治疗恶性胶质瘤的方法,包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的己糖化合物。
2.一种治疗胰腺癌的方法,包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的己糖化合物。
3.一种治疗肿瘤增生的方法,包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的2-FM。
4.一种治疗胰腺癌的方法,包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的甘露糖化合物。
5.一种治疗大脑癌症的方法,包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的甘露糖化合物。
6.一种用于在患者中达到一种效果的方法,包括施用治疗有效量的己糖化合物,其中所述效果选自由胰腺癌和神经胶质瘤组成的组。
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