KR100762931B1 - 피라졸로［1,5-α］피리미딘계 화합물을 유효성분으로함유하는 항암 보조제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제 및 항암제 내성 암 치료제에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 세포내 에너지 감지 단백질인 AMPK의 활성을 억제하여 항암제의 활성을 증가시키는 피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제에 관한 것이다. 본 발명의 치료제는 기존의 항암제, 특히 시스플라틴과 병용투여시 매우 높은 항암활성을 나타내고 위암, 대장암 등 항암제 내성 암의 치료 효과가 높으므로 새로운 항암 보조제로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물, AMPK, 시스플라틴

Description

피라졸로［1,5-α］피리미딘계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제{An anti-cancer supplement agent containing pyrazolo[1,5-α]pyrimidine class compound}

도 1은 시스플라틴(cisplatin) 저항성 암세포에서 시스플라틴이 AMPK의 활성과 p53에 미치는 영향을 나타낸 것으로, AGS 세포에 시스플라틴을 처리한 후, 웨스턴 블럿을 실시한 결과를 나타낸 그림이고,

도 2는 시스플라틴 유도의 세포사멸에서 AMPK의 억제 효과를 나타낸 것으로, 암 세포에 Compound C와 시스플라틴을 처리한 후 MTT 어세이를 실시한 결과를 나타낸 그림이고,

도 3A는 시스플라틴 유도의 AMPK 억제에 의한 세포내 PARP의 변화를 나타낸 것으로, HCT116 세포에 Compound C와 시스플라틴을 처리한 후, 웨스턴 블럿을 실시한 결과를 나타낸 그림이고,

도 3B는 HCT116 세포에 Compound C와 시스플라틴을 처리한 후, ATP 레벨을 측정한 결과를 나타낸 그림이고,

도 4는 Compound C에 의한 AMPK 활성 억제와 시스플라틴의 사용이 p53의 발현 및 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, AGS 암세포에 Compound C를 전처리 한 후 시스플라틴으로 처리하였을 때, p53 인산화 정도를 나타낸 그림이고,

도 5는 in vivo 모델에서 AMPK 억제제인 Compound C는 시스플라틴에 민감도를 증가시킴을 나타낸 것으로, HCT116 세포를 누드 마우스의 다리에 이식한 후 각각 시스플라틴과 Compound C 또는 이들을 함께 투여한 결과를 나타낸 그림이고,

도 6은 다양한 암세포와 항암제에서 Compound C의 효과를 알아보기 위한 것으로,

도 6A는 ACS(위암), HCT116(대쟝암), HepG2(간암), MCF-7(유방암) 등의 암세포에 Compound C를 전처리한 후 시스플라틴으로 처리하였을 때의 세포 생존력을 측정한 결과를 나타낸 그래프이고

도 6B는 AGS 암세포에 Compound C를 전처리한 후, 시스플라틴, 에토포사이드 및 독소루비신으로 처리하였을 때의 세포 생존력을 측정하여 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제 및 항암제 내성 암 치료제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 세포내 에너지 감지 단백질인 AMPK의 활성을 억제하여 항암제의 활성을 증가시키는 피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물, 특히 Compound C를 유효성분으로 함유하는 항암 보조 제 및 항암제에 내성 암 치료제에 관한 것이다.

암세포에서 세포 신호 전달 경로를 조절함으로써 화학적 치료제의 효과를 증가시킬 수 있다. 많은 경우의 화학적 암 치료에 있어, 표적 단백질에 특이적인 화학적 치료제를 개발하여 암을 치료하는 방법이 연구되었고 실제적으로 임상에서 사용되고 있다. 그 중에서 시스플라틴[cisplatin(cis-diamminedichloroplatinum; CDDP)]은 가장 효과적인 암 치료제로서, 현재 임상에서 사용되고 있는 30여종의 항암제 중 가장 유용한 약제의 하나로 고환암, 난소암, 폐암, 두경부암, 방광암, 위암, 자궁 경부암 등의 암에 유효하다(Teni Boulikas, Oncology Reports, 10:1663-1682, 2003).

시스플라틴은 DNA에 부착하는 물질(adductant)로서 intrastrand 또는 interstrand에 cross-link하여 DNA의 복제와 전사를 방해하여 암 세포의 성장을 방해하고 세포사멸을 유도한다. 시스플라틴에 의한 세포사멸은 DNA 손상에 의한 신호전달 단백질들의 발현으로 이루어지게 되고 이들의 신호 전달 경로가 암세포의 사멸에 중요한 역할을 하는데 그 중에서 DNA 손상에 의해 발현되는 단백질 중 핵심이 되는 단백질은 암 억제 단백질인 p53이다. p53은 DNA 손상을 일으키는 자극물이 세포 내로 들어오면 발현양이 증가하여서 p21과 같은 하류의 단백질을 조절하여 세포주기 정지를 가져오게 되고 DNA 복구를 하게 되는데 자극의 정도가 지나치게 되면 하류의 전-세포사멸 단백질인 Bax 단백질을 발현시켜서 세포가 세포사멸로 가게 하는 역할을 하기도 한다(Wafik s El-Deiry, Oncogene, 22: 7486-7495, 2003; Zahid H Siddik, Oncogene, 22:7265-7279, 2003)

p53은 여러 가지 기전에 의해 발현양이 조절되게 되는데 그의 상류(upstream)에는 ATM/ATR 키나제가 위치하여 있고 정상세포에서 p53은 프로테아좀 단백질인 MDM2와 결합하고 있는데 외부 스트레스에 의해 DNA 손상이 있을 경우 p53을 인산화시켜 MDM2와의 결합을 파괴하여 p53을 안정화시킨다. 이는 핵으로 들어가서 DNA에 결합, 표적 유전자들의 전사를 증가시키게 되므로 이러한 p53의 신호전달 경로의 조절을 통한 암 치료 방법 또한 중요한 암 치료 법으로 많이 보고되고 있다(George Iliakis, Oncogene, 22:5834-5847, 2003)

최근에는 시스플라틴 저항성을 가진 암 들이 많이 보고되고 있는데 그 기전은 정확히 밝혀지지 않았지만 몇몇 미스매치(mismatch) 복구 단백질의 과다발현이나 항-세포사멸 단백질들의 과다발현 등 여러가지 기전이 가능성이 있는 것으로 여겨지고 있다. 현재 이런 저항성을 가진 암 세포들이 문제시 되고 암 치료 후 재발의 위험을 가지고 있기 때문에 시스플라틴과 다른 화학물질과의 복합요법 또는 시스플라틴과 세포 내 발현단백질의 조절에 의한 치료의 연구가 활발히 진행중이다(Tito Fojo, Oncogene, 22: 7512-7523, 2003) 또한 암에 대한 분자생물학적 이해의 발전으로 암 발생의 결정적인 역할을 하는 많은 분자생물학적 물질이 발견되었고, 이를 표적으로 한 새로운 치료 방법들이 개발되어 기존에 사용되어온 항암 치료와 더불어 사용함으로써 치료효과가 더욱 개선될 것으로 기대되고 있다.

AMP-activated 단백질 인산화 효소(AMPK)는 세포 내부의 에너지상태를 감지하는 단백질로서 세포 생존에 필수적인 단백질로 알려져 있다(Carling D, Trends Biochem Sci, 29: 18-24, 2004) 또한 AMPK는 근육에서 다양한 대사 유전자(예: 글루코스 전달인자, GLUT4, 해체 단백질-3)들을 발현시켜 당 흡수와 지방산 대사를 조절하는 중요한 단백질로 알려져 있다(Nandakumar Sambandam, Progress in Lipid Research, 42:238-256, 2003). 최근의 보고에서, AMPK는 외부의 스트레스로부터 세포를 보호하는 작용을 하는 것이 보고가 되었고 이는 AMPK의 역할이 지질대사에 국한된 것이 아니라 세포내의 스트레스에 의한 AMP/ATP 비율에 의해 활성도가 조절되어 ATP를 소모하는 경로에 관련된 효소의 활성도를 억제 시키고 반대로 ATP를 생성하는 경로에 관련된 효소를 활성화시키는 중심의 단백질로 알려지고 있다(Kazuyoshi Kato, Oncogene, 21: 6082-6090, 2002). 즉, AMPK는 대사성 스트레스에 의해 활성화되어 포도당 흡수, 지방산 산화를 촉진하여 세포 내 에너지 상태를 향상시켜 궁극적으로는 세포의 생존률을 높게 만드는 단백질이라 할 수 있다.

한편, Compound C는 AMPK를 직접적으로 저해하는 저해물질로 알려져 있고 현재 MERCK사에서 합성되어 시판되고 있다(Gaochao Zhou et al., J. Clin. Invest. 108: 1167-1174, 2001). 그러나 AMPK 저해제 이외의 다른 용도는 잘 알려져 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 세포 내 스트레스에 의한 에너지 대사에 중심적 단백질인 AMPK가 시스플라틴에 의한 세포 사멸시에 유도되는 p53 안정화를 억제하여 시스플라틴 저항성을 나타나게 하므로 AMPK 억제제인 Compound C를 시스플라틴과 병용투여함으로써 시스플라틴 저항성을 억제하여 항암활성을 증진시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 기존 항암제의 약효를 증진시키는 보조제, 특히 항암제에 내성을 가진 암세포의 출현으로 단독으로 항암효과를 나타내기 어려운 항암제의 보조제를 제공하는 것이다.

본 발명은 화학식 Ⅰ로 표시되는 피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다.

또한, 본 발명은 피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물을 포함하는 p53 활성 증가제를 제공한다.

아울러, 본 발명은 피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물을 투여하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 화학식 Ⅰ로 표시되는 피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다.

피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물은 하기 화학식 1로 표시되고,

<화학식 1>

상기 화학식에서 R은

또는

이고,

Het은

또는

이다.

상기 <화학식 1>에 해당하는 피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물은 미국 특허 US 6,380,203B1에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.

피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물의 일종인 6-[4-(2-피페리딘-1-일-에톡시)-페닐)]-3-피리딘-4-일-피라졸로[1,5-α]-피림(이하, Compound C)는 하기 화학식 Ⅱ의 구조식을 갖는다.

<화학식 Ⅱ>

APMK는 PFK-2(phosphofructokinase-2)의 인산화와 활성을 높이고 ACC(acetyl-CoA carboxylase)의 활성을 억제함으로써 당분해와 지방산 산화를 촉진시키는 것으로 알려져 있다. APMK는 허혈(ischemia)에 의해 유발되는 세포 손상과 세포사멸을 줄이는데 매우 중요한 역할을 하고 AMPK-관련 단백질 인산화 효소 5(ARK5)은 암세포에서 영양 스트레스에 의한 세포사멸로부터 세포를 보호하고 있다. 또한, 본 발명자들의 선행연구 결과, 세포내에서 저산소(hypoxia)(Minyoung Lee, JBC, 278:39653-39661, 2003), 당 결핍(glucose deprivation)(Hee Yun, JBC, 280: 9963-9972, 2005), 암 유발 금속(carcingenic metal)(Jin-Taek Hwang, Carcinogenesis, 25: 2497-2507, 2004)과 같은 여러가지 자극에 의해서도 AMPK가 활성화 되고, 이 활성은 HIF-1(hypoxia-inducible factor-1)과 VEGF(vascular endothelial growth factor) 같은 암 관련 분자들의 활성을 증가시켜 암세포를 스트레스로부터 보호하고 있음을 보고하였다.

본 발명자들은 시스플라틴 처리시 AMPK가 빠르게 활성화되며 이 활성은 여러 암세포에서 시스플라틴에 대한 저항성을 증가시킴을 확인하였다.

구체적으로, 시스플라틴에 저항성을 갖는 AGS 세포에 시스플라틴을 처리하고, AMPK 키네틱스(kinetics)를 관찰한 결과, AMPK에 의해 인산화되는 것으로 알려진 ACC와 AMPK의 인산화 레벨이 증가함을 관찰하였다(도 1).

AMPK는 세포내 에너지 상태를 향상시킴으로써 세포의 생존율을 높이는 단백질이므로 본 발명자들은 시스플라틴으로 유도한 AMPK의 활성을 피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물의 일종인 Compound C로 억제시킨 후 PARP 분절(Poly-ADP-ribose polymerase)과 ATP 어세이를 통하여 AMPK와 ATP 레벨 및 세포사멸과의 상관관계를 알아보았다. 그 결과 시스플라틴, Compound C 각각 단독으로는 세포 사멸과 ATP 레벨에 큰 변화를 주지 못하였으나, 두 가지를 동시에 처리했을 경우 세포의 사멸이 촉진되고(도 2 및 도 3A) ATP 레벨의 항상성이 심하게 결여되는 것을 확인하였다(도 3). 따라서, Compound C와 시스플라틴을 병용투여함으로써 항암 개선 효과를 보일 것으로 예상된다.

본 발명자들은 현재 임상에서 암 환자에게 사용하고 있는 항암제 중 대표적인 독소루비신, 에토포사이드, 시스플라틴 등과 Compound C의 효과가 동일하게 나타나는지 알아보기 위하여, AGS, HCT116, HepG, MCF-7등 다양한 암세포에 Compound C를 전 처리한 후 시스플라틴으로 처리하였을 때 세포 생존력을 측정하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 실험한 모든 암세포와 항암제에 대해 Compound C를 병용투여한 경우 세포사멸이 2배 이상 증가하였다.

따라서, Compound C와 병용투여 가능한 항암제는 시스플라틴 뿐 아니라, 독소루비신(doxorubicin), 에토포사이드(etoposide)등 일반적으로 사용되고 있는 모 든 항암제를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물을 포함하는 p53 활성 증가제를 제공한다.

시스플라틴이 DNA를 손상시켜 종양 억제 기능을 가진 p53 단백질의 발현과 활성도를 증가시킴으로써 암세포의 증식을 차단하거나 세포사멸을 유도한다고 알려져 있고 p53 단백질은 다양한 번역 후 변형(post- translational modification)에 의해 활성화가 조절되며 인산화 과정 또한 매우 중요한 조절 기전으로 알려져 있다. p53은 매우 많은 인산화 자리가 존재하며 이 중 Serine15의 인산화가 가장 중요한 역할을 하고 있으며, 이 자리가 인산화되면 p53 단백질의 활성도 높아지고 세포질 내에서 안정화되어 단백질의 발현량도 증가한다. 따라서, 본 발명자들은 시스플라틴과 Compound C를 시간로 처리한 후 p53-ser15의 인산화와 전체 p53 레벨을 웨스턴 블럿을 통하여 확인하였다.

그 결과, 시스플라틴에 의해 p53 세린 15의 인산화 정도가 증가하고 동시에 p53 단백질 양도 증가하였으며, Compound C를 전처리한 후, 시스플라틴을 처리하면 그 정도가 더욱 증가함을 확인하였다(도 4 참조).

아울러, 본 발명은 피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물을 투여하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 Compound C에 의한 시스플라틴의 항암증진 효과가 생체에서도 재현되는지를 확인하기 위하여 생체내 이종이식 모델(in vivo xenografts model)을 이용한 실험을 실시하였다. 구체적으로 인간 대장암 세포를 누드 마우스에 이식하고 시스플라틴과 Compound C를 처리한 후 관찰한 결과, 시스플라틴과 Compound C의 단독 처리에서는 항암 효과가 적었으나, 두 약물의 혼합 처리시 그 약효가 증대됨을 확인하였다(도 5).

따라서, 피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물, 특히 Compound C가 시스플라틴에 대한 민감성을 증가시키고, 저항성을 극복하게 하므로, 이를 암 환자에 투여하면 각종 암, 특히 항암제 내성암을 치료할 수 있을 것이다.

본 발명의 피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제 및 항암제 내성 암 치료제는 상기 Compound C에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 상기 치료제는 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제 또는 피부의 침투를 향상시키는 성분을 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형 등으로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 피라졸로[1,5-α] 피리미딘계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제 및 항암제 내성 암 치료제는 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 화학식 1 또는 2의 화합물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

또한 본 발명의 항암 보조제 및 항암제 내성 암 치료제는 경구 투여용 제형의 경우, 예를 들면 정제, 트로치제(troches), 로렌지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 치료제는 Compound C를 0.1~100㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 1~10㎎/㎏의 농도로 포함하며 한달 에 일회 또는 수회 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명을 한정하지는 않는다.

<실험예 1> 세포 배양 및 시약

다양한 암세포들[AGS;stomach, HCT116;colon, HepG2;Liver, MCF-7;breast, HeLa;cervix)](American Type Culture Collection, ATCC) 10% 우태아 혈청(FBS)이 첨가된 RPMI 1640 배지(Invitrogen corporation)를 사용하여 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 배양하였다. 시스플라틴(Sigma)는 배양액에 포함시켜 배양하였으며, Compound C는 시스플라틴처리 30분 전에 전 처리하여 하였다. 시스플라틴은 sigma에서 구입하였고, Compound C는 Merck로부터 증정받아 사용하였다. anti-phospho Acetyl CoA carboxylase(p-ACC), p-AMPK, p-p53는 cell signaling Technology사로부터, anti-ACC, p53, PARP, p21, 및 α-actinin는 santacruz biotechnology사에서 구입하였다.

<실시예 1> 시스플라틴에 의한 AMPK 활성화 정도 측정

본 발명자들은 시스플라틴에 저항성을 갖는 AGS 세포에 시스플라틴을 농도별 로 1시간 처리한 후 각 각의 샘플을 만들었고, 1차 항체로는 각각 항-p-AMPK(cell signaling tech), 항-p-ACC(cell signaling tech), 항-전체 AMPK(pan-α)(cell signaling tech), 항-전체-ACC(santacruz biotech)을 사용하고 2차 항체로는 항-래빗(anti-rabbit)을 이용한 웨스턴 블롯으로 AMPK 키네틱스(kinetics)를 관찰하였다. 그 결과 AMPK에 의해 인산화되는 것으로 알려진 acetyl-coA carboxylase(ACC)의 ser79의 인산화 레벨과 AMPK의 Thr172의 인산화 레벨이 증가함을 관찰하였고 전체 ACC와 AMPK의 양은 일정하게 나타남으로써 이는 ACC와 AMPK의 발현증가에 따른 것이 아니라 AMPK에 의한 인산화 증가에 의한 것임을 확인하였다(도 1).

<실시예 2> AMPK의 활성 억제에 의한 세포사멸 확인

본 발명자들은 항암제에 저항성을 가지고 있다고 알려진 위암 세포, 대장암에 시스플라틴을 처리한 후 MTT 어세이를 실시하여 세포사멸 정도를 확인하였다.

MTT 어세이는 살아있는 세포 내 미토콘드리아의 탈수소효소가 MTT를 환원시키며 생성한 포르마잔(formazan)의 흡광도를 측정하는 방법으로 측정된 흡광도는 생존한 상태이고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다. 본 발명자들은 각 세포 플레이트에 시스플라틴(60μM)을 처리하고 24시간 후 MTT(5mg/ml)(Sigma)를 첨가하여 1시간 동안 반응시키고 590nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, AGS 위암 세포에서 시스플라틴의 세포사멸 효과는 미미하여 세포의 생존력에 거의 영향을 주지 못하였으나 Compound C가 처치된 경우에는 뚜렷한 항암효과를 나타내었다. 따라서, 시스플라틴에 내성을 보 이는 암세포의 경우에도 Compound C와 병용투여함으로써 항암 개선 효과를 보일 것으로 예상된다.

<실시예 3> AMPK의 활성 억제에 의한 ATP 레벨변화 측정

AMPK는 대사성 스트레스에 의해 활성화되어 포도당 흡수 및 지방산 산화를 촉진하여 세포내 에너지 상태를 향상시킴으로써 세포의 생존율을 높이는 단백질이므로 PARP 분절(Poly-ADP-ribose polymerase)과 ATP 어세이를 통하여 AMPK와 ATP 레벨 및 세포사멸과의 상관관계를 알아보았다. 세포사멸의 정도는 PARP 분절을 웨스턴 블럿으로 확인하였으며 ATP 레벨은 세포파쇄 완충용액(50mM Tris-HCl pH7.4, 1% Nonidet P-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1mM Sodium orthovanadate, 1mM NaF) 200㎕를 HCT116 세포에 처리하여 세포 파쇄액을 수득하여 ATP determination kit(molecular probes)를 이용하여 제조사 프로토콜에 따라 측정하였다.

그 결과 시스플라틴, Compound C 각각 단독으로는 세포 사멸과 ATP 레벨에 큰 변화를 주지 못하였으나, 두 가지를 동시에 처리 했을 경우 세포의 사멸이 촉진되고 ATP 레벨의 항상성이 심하게 결여되는 것을 확인하였다(도 3A 및 B). 따라서 AMPK의 억제제인 Compound C는 세포내의 에너지의 균형을 잃게 함으로써 시스플라틴 유도의 세포사멸을 촉진하는 것이라고 생각된다.

<실시예 4> AMPK 억제에 의한 p53-ser15의 인산화 증가 확인

본 발명자들은 시스플라틴(60μM)과 Compound C(20μM)를 1, 3, 6, 12, 24 시간별로 처리한 후 p53-ser15의 인산화와 전체 p53 및 p21의 레벨을 각각의 항체를 이용하여 웨스턴 블럿으로 확인하였다. 사용한 항체는 각각 항-p-ACC, 항-p-p53(cell signaling tech), 항-p53(Pab 1801)(santacruz biotech,), 항-p21(187)(santacruz biotech) 및 항-α-actinin(H-2)(santacruz biotech)이고 각각에 대한 2차 항체는 항-p-ACC과 항-p-p53 항체에 대해서는 항-래빗이고 나머지에 대해서는 항-마우스이다.

웨스턴 블럿 결과, 시스플라틴에 의해 p53 세린 15의 인산화 정도가 증가하고 동시에 p53 단백질 양도 증가하였으며, Compound C를 전처리한 후, 시스플라틴을 처리하면 그 정도가 더욱 증가함을 확인하였다(도 4).

<실시예 5> Compound C의 시스플라틴의 약효 증진 효과

본 발명자들은 상기 실시예에서와 같은 Compound C에 의한 시스플라틴의 항암증진 효과가 생체에서도 재현되는지를 확인하기 위하여 생체내 이종이식 모델(in vivo xenografts model)을 이용한 실험을 실시하였다.

구체적으로 HCT116 세포(1 X 10⁷)를 5-6주령 누드 마우스의 뒷다리에 주사하였다. 이식된 종양이 200mm³ 이 되었을 때 마우스를 시스플라틴, Compound C 및 혼합 처리군의 4개 군으로 나누고(각 군당 5마리 마우스) 시스플라틴(2mg/kg)과 Compound C(4mg/kg)을 각각의 실험군의 복강을 통해 5일 마다 투여하고, 종양의 성 장을 관찰하였다. 종양의 크기는 측정된 종양의 길이(L) 및 폭(I)을 (L x I²)/2 의 공식을 이용하여 부피를 계산하였다.

그 결과, 시스플라틴과 Compound C의 단독 처리에서는 항암 효과가 적었으나, 두 약물의 혼합 처리시 그 약효가 증대됨을 확인하였다(도 5).

<실시예 6> 다양한 암세포와 항암제에서 Compound C의 효과 확인

본 발명자들은 AGS(위), HCT116(대장), HepG2(간), MCF-7(유방)등 다양한 암세포에 Compound C(20μM)를 전 처리한 후 시스플라틴(60μM)으로 처리하였을 때의 세포 생존력을 MTT 어세이로 측정하였다.

그 결과, 도 6a에 나타난 바와 같이, 모든 세포에서 Compound C에 의해 세포사멸이 증가하는 것을 확인하였다.

AGS 암세포에 Compound C(20μM)를 전 처리한 후 시스플라틴(60μM), 에토포사이드(etoposide, 50μM) 및 독소루비신(Doxorubicin, 2.5μM)으로 처리하였을 때의 세포 생존력을 MTT 어세이로 측정하였다.

그 결과, 모든 항암제에 있어서,Compound C를 함께 처리하였을 때 항암제 단독처리에 비해 50% 이상 세포사멸 증가 효과를 나타냄을 확인하였다(도 6).

<제제예 1> 주사액제의 제조방법

본 발명의 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

Compound C 100mg, 5‘-클로로-3,2’-디하이드록시찰콘 또는 5‘-클로로-2,3’-디하이드록시찰콘ㆍ염산염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 120℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

<제제예 2> 정제의 제조방법

본 발명의 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

Compound C 100mg, 5‘-클로로-3,2’-디하이드록시찰콘 또는 5‘-클로로-2,3’-디하이드록시찰콘ㆍ염산염 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

본 발명자들이 AMPK가 시스플라틴 치료시 세포 보호 반응에 중요하게 작용하는 분자로서 이를 억제하는 Compound C와 시스플라틴을 병용투여함으로써 항암효과를 증진시킴을 확인함으로써 Compound C는 시스플라틴에 내성이 있는 암에 대해 항암 증진제로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims (9)

1. 항암제와 병용되는, 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 6-[4-(2-피페리딘-1-일-에톡시)-페닐)]-3-피리딘-4-일-피라졸로[1,5-α]-피림을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제.

   <화학식 Ⅱ>

   
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4. 제 1항에 있어서, 항암제는 시스플라틴(cisplatin), 독소루비신(doxorubicin) 및 에토포사이드(etoposide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항암 보조제.
5. 제 1항에 있어서, 상기 암은 고환암, 난소암, 폐암, 두경부암, 방광암, 위암, 자궁 경부암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 항암 보조제.
6. 제 1항 또는 제 5항에 있어서, 암은 항암제에 내성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항암 보조제.
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