JP5688288B2 - がんの処置のための相乗的な医薬の組合せ - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、相乗効果を示す、がんの処置のための新たな医薬の組合せに関する。医薬の組合せは、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、およびゲムシタビンからなる群より選択される細胞傷害性抗腫瘍剤またはその医薬上許容される塩；ならびに、式（Ｉ）（本明細書に記載する）の化合物またはその鏡像異性体もしくはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物から選択される少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）インヒビターを含む。本発明はまた、上記組合せの治療有効量をがんの処置を必要とする対象に投与する工程を含む、がんの処置方法に関する。

発明の背景
がんは、異常な細胞が制御されずに分裂する疾患を記載するために使用される一般的な用語である。がんは、組織の近くに浸潤し、血流およびリンパ系を介して、身体の他の部分に拡散し得る。膀胱がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、頭部および頸部がん、子宮内膜がん、腎臓(腎細胞)がん、白血病、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、皮膚がん、非ホジキンリンパ腫およびメラノーマなどの異なる型のがんが存在する。近年、かつてない程、化学療法、放射線治療、手術、ホルモン療法、免疫療法および遺伝子療法を含むがんについて利用可能な多くの処置が存在する。化学療法は、多くの型のがんに対して慣用される処置である。もっとも広く使用される化学療法剤（抗腫瘍剤）には、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、カルボプラチン、シスプラチン、トポテカンおよびゲムシタビンが含まれる。これらの薬剤および他の同様の抗腫瘍剤は、異なるがんの処置について良好に使用されている。しかしながら、何人かのがん患者は、そのうちに、そのような標準的な抗腫瘍剤を使用する化学療法に対して抵抗性を発達させていることが見出されている。薬物への許容または耐性は、成功した処置に対する主要な障害を示す。そのような耐性は、内因性（すなわち、処置の開始時に存在する）または後天性（すなわち、化学療法の過程で生じる）のいずれかであるとしばしば考えられる。ヒト非小細胞肺がん細胞（ＮＣＩ−Ｈ４６０）の漸増濃度のドキソルビシンへの曝露に関する調査は、ドキソルビシンに耐性（９６．２倍）であり、エトポシド、パクリタキセル、ビンブラスチンおよびエピルビシンに交差耐性である新たな細胞株（ＮＣＩ−Ｈ４６０／Ｒ）の出現を報告している（非特許文献１）。非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）腫瘍培養物におけるインビトロでの化学療法耐性の蔓延を記載する別の調査において、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ゲムシタビン、ナベルビン、パクリタキセル、タキソテールおよびトポテカンを含む多数の抗腫瘍剤に対する極度の耐性または中間の耐性が報告されている（非特許文献２）。ゲムシタビンは、膵臓がんの処置についてもっとも臨床的に有効な薬物であると考えられていたが、薬物に対する大半の腫瘍細胞の先天性または後天性の化学耐性が原因で、膵臓がん患者の状態を有意に改善できなかった（非特許文献３）。がんの処置において観察されるか蔓延している別の問題は、大半の抗腫瘍剤に付随する深刻な毒性である。ドキソルビシンのような薬物の場合の心臓毒性などの深刻な副作用の発生頻度が、非特許文献４にて報告されている。ゲムシタビン、パクリタキセルなどの従来の抗腫瘍剤に付随する抵抗性の発生頻度および深刻な毒性にもかかわらず、これらの薬剤は、腫瘤を減少させる能力を有しているので、がんの処置において重要であり続けるだろう。応答速度を改善し、従来の抗腫瘍剤に付随する毒性を防ぐために、新たな治療のアプローチが発達している。そのようなアプローチの１つは、異なる生物学的機序を有する異なる抗腫瘍剤を組み合わせることを含むプロトコルに関する（非特許文献５および６）。最適な組合せの化学療法のプロトコルは、治療有効性の増加、宿主毒性の低下、および薬物耐性の最小化および遅延をもたらし得る。異なる毒性を有する薬物を組み合わせた場合、各薬物はその最適な用量で使用され得、許容されない副作用を最小化することに役立つことが、非特許文献７にてカペシタビンおよびドセタキセルの組合せについて報告されている。いくつかの抗腫瘍剤は、単剤療法として使用した場合より、他の抗がん剤と併用した場合に、相乗的に有効であることが見出されている。例えば、シクロホスファミドおよび５−フルオロウラシルは、卵巣明細胞がん細胞にて相乗的に作用することが、非特許文献８にて報告されている。化学療法の組合せはまた、単剤療法、放射線療法または外科的処置を用いた処置が難しい進行期のがんの処置のために有利に使用され得、例えば、パクリタキセルおよびゲムシタビンの組合せが、転移性非小細胞肺がんの処置について報告されている（非特許文献９）。

近年、パクリタキセル、シスプラチンなどの標準的な抗腫瘍剤の１つまたは複数とがんの処置のための分子標的抗がん剤との組合せが、薬物応答速度を改善し、抗腫瘍剤への耐性に対処するために試されている。分子標的薬剤（例えば、イマチニブメシル酸塩、フラボピリドールなど）は、がん細胞により特異的に付随する活性を有するキナーゼなどのタンパク質を調節する。長年の研究により、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）ファミリーのメンバーが種々の細胞のプロセスにて重要な役割を担っていることが証明されている。これらのＣＤＫのうち、ＣＤＫ１、２、３、４および６が細胞周期にて重要な役割を担っている（非特許文献１０）。ＣＤＫは、Ａ−、Ｂ−、Ｃ−、Ｄ−（Ｄ１、Ｄ２およびＤ３）およびＥ−型サイクリンなどのサイクリンと一緒に非共有結合性複合体を形成することによって活性化される。このファミリーの各アイソザイムは、細胞周期の特定の局面（細胞シグナリング、転写など）を担っており、いくつかのＣＤＫアイソザイムは、特定の種類の組織に特定的である。これらのキナーゼの異常な発現および過剰発現は、多くの疾患の状態で証明されている。有用であり得るＣＤＫ抑制性の特性を有する多数の化合物が開発されており、文献にて報告されている。フラボピリドールは、臨床試験に達した、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の初めての強力なインヒビターである。フラボピリドールは、種々のがん細胞株にて従来の抗腫瘍剤の細胞傷害応答を相乗的に増強することが見出されている。例えば、ドセタキセル、フラボピリドールおよび５−フルオロウラシルを用いたＨＣＴ１１６結腸がんの逐次処置が、非特許文献１１にて報告されている。また、肺がん細胞についてドセタキセルおよびフラボピリドールを組み合わせた処置が、非特許文献１２にて報告されており、胃がんの処置について非特許文献１３にて報告されている。

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抗がん剤の組合せががんの処置のプロトコルにて有意な進展を有することが証明されているにものの、がん（処置が難しいか、または従来の抗腫瘍剤を用いた単剤療法としての処置に抵抗性を示す）の処置のための医薬品について未だ満たされていないいくつかの必要性および改善の余地が存在する。より詳細には、異なる作用機序を有する公知の抗がん剤を送達するための新たな組合せのアプローチの開発が、当該分野における重要な進展を示す。異なる作用機序を有する抗がん剤の組合せを含むプロトコルがいくつかの組合せの場合にて機能し得るものの、抗がん剤の他の組合せについて、同じやり方では機能し得ず、そのような組合せは、有利な治療効果を有する組合せを常にもたし得るわけではない。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、式（Ｉ）（本明細書に記載する）で表される化合物および異なるがんの処置のための標準的な細胞傷害性抗腫瘍剤から選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビターを含む、公知の抗がん剤の新たな医薬の組合せが、抗がん剤を単独で使用した場合と比べて、予想外で高い有効性を示すことを見出した。

発明の概要
１つの態様において、本発明は、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、およびゲムシタビンからなる群より選択される細胞傷害性抗腫瘍剤またはその医薬上許容される塩、ならびに、式（Ｉ）（本明細書に記載する）の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物から選択される少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）インヒビターを含む新たな医薬の組合せであって、がんの処置において相乗効果を示す医薬の組合せに関する。

別の態様において、本発明は、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、およびゲムシタビンからなる群より選択される細胞傷害性抗腫瘍剤またはその医薬上許容される塩、ならびに、式（Ｉ）（本明細書に記載する）の化合物またはその鏡像異性体もしくはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物から選択される少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）インヒビターを含む新たな医薬の組合せであって、がんの処置のために同時または連続して投与するための医薬の組合せに関する。

さらなる態様において、本発明は、がんの処置および細胞のアポトーシスの誘導のための新たな医薬の組合せの使用に関する。

別のさらなる態様において、本発明は、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、およびゲムシタビンからなる群より選択される細胞傷害性抗腫瘍剤またはその医薬上許容される塩の治療量を、式（Ｉ）（本明細書に記載する）の化合物で示すＣＤＫインヒビターまたはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物の治療有効量と組み合わせてがんの処置を必要とする対象に投与する工程を含む、がんの処置方法に関する。

さらに別のさらなる態様において、本発明は、がんの処置のための医薬品を調製するための新たな組合せの使用に関する。

本発明の他の態様およびさらなる適用範囲は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。

図１は、インビトロでのＨ−４６０非小細胞肺細胞の処理において、ドキソルビシンおよび化合物Ａの組合せが相乗作用を示すことを示す。グラフＡ、Ｂ、ＣおよびＤは、異なる処理群、すなわち、コントロール（９６時間）、２００ｎＭのドキソルビシン単独（２４時間）、８００ｎＭの化合物Ａ単独（７２時間）、および２００ｎＭのドキソルビシン（２４時間）、その後の８００ｎＭの化合物Ａ（７２時間）の投与を含む組合せの細胞周期の分布をそれぞれ示す。 図２は、インビトロでのＨ−４６０非小細胞肺細胞の処理において、ドキソルビシンおよび化合物Ａの組合せが相乗作用を示すことを示す。グラフＡ、Ｂ、ＣおよびＤは、異なる処理群、すなわち、コントロール（１２０時間）、１００ｎＭのドキソルビシン単独（２４時間）、１２００ｎＭの化合物Ａ単独（９６時間）、および１００ｎＭのドキソルビシン（２４時間）、その後の１２００ｎＭの化合物Ａ（９６時間）の投与を含む組合せの細胞周期の分布をそれぞれ示す。 図３は、インビトロでの膵臓（Ｐａｎｃ−１）細胞の処理において、ゲムシタビンおよび化合物Ａの組合せが相乗的な活性をもたらすことを示す。グラフＡ、Ｂ、ＣおよびＤは、異なる処理群、すなわち、コントロール（９６時間）、７０ｎＭのゲムシタビン単独（２４時間）、８００ｎＭの化合物Ａ単独（７２時間）、および７０ｎＭのドキソルビシン（２４時間）、その後の８００ｎＭの化合物Ａ（７２時間）の投与を含む組合せの細胞周期の分布をそれぞれ示す。 図４は、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色を使用した１２０時間の処理の終盤での、ドキソルビシン、およびその後の化合物Ａの相乗的な組合せにおける初期アポトーシスの検出を示す。グラフＡ、Ｂ、ＣおよびＤは、異なる処理群、すなわち、コントロール（１２０時間）、１２００ｎＭの化合物Ａ単独（９６時間）、１００ｎＭのドキソルビシン単独（２４時間）、および１００ｎＭのドキソルビシン（２４時間）、その後の１２００ｎＭの化合物Ａ（９６時間）の投与を含む組合せの四象限における細胞の分布をそれぞれ示す。 図５は、インビトロでのＨ−４６０非小細胞肺細胞の処理において、ドキソルビシンおよび化合物Ａの組合せが、クローン形成アッセイにて試験した場合、相乗作用を示すことを示す。 図６は、細胞周期の調節およびアポトーシスに関与する種々のタンパク質のウェスタンブロット分析を示す。レーン１は、未処理のコントロールであり；レーン２は、１２００ｎＭの化合物Ａ（９６時間）であり；レーン３は、１００ｎＭのドキソルビシン単独（２４時間）であり；レーン４は、ドキソルビシン、続いて化合物Ａの組合せである。 図７ａは、ヒト非小細胞肺細胞腫（Ｈ−４６０）細胞由来のドキソルビシン（２ｍｐｋ）および化合物Ａ（２０ｍｐｋ）の組合せのＨ−４６０異種移植モデルに対するインビボでの有効性を示す。図７ａにおいて、Ｄｏｘｏはドキソルビシンをいう。 図７ｂは、ドキソルビシン（２ｍｐｋ）および化合物Ａ（３５ｍｐｋ）の組合せのＨ−４６０異種移植モデルに対するインビボでの有効性を示す。図７ｂにおいて、Ｄｏｘｏはドキソルビシンをいう。 図８ａおよび８ｂは、処理の終盤での平均腫瘍重量および調査の終盤での各群における、各マウス由来の８つの腫瘍のＳＥ（バー）を示す。処理の終盤での増殖抑制（ＧＩ）パーセンテージを、異なる処理群の間の差異の統計学的有意性を評価するために使用した。統計上有意な差異は、Ｐ＜０．０５であると考えた。図８ａにおいて、Ｄｏｘｏはドキソルビシンをいう。“＞”は、ドキソルビシンが化合物Ａの前に投与されることを示す。 図８ａおよび８ｂは、処理の終盤での平均腫瘍重量および調査の終盤での各群における、各マウス由来の８つの腫瘍のＳＥ（バー）を示す。処理の終盤での増殖抑制（ＧＩ）パーセンテージを、異なる処理群の間の差異の統計学的有意性を評価するために使用した。統計上有意な差異は、Ｐ＜０．０５であると考えた。図８ｂにおいて、Ｄｏｘｏはドキソルビシンをいう。“＞”は、ドキソルビシンが化合物Ａの前に投与されることを示す。 図９は、ＣＯＸ−２抗体を使用したウェスタンブロットを示す。図９において、“＞”は、ドキソルビシンが化合物Ａの前に投与されることを示す。

これまでに、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、およびゲムシタビンからなる群より選択される細胞傷害性抗腫瘍剤またはその医薬上許容される塩、ならびに、式（Ｉ）（本明細書に記載する）の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物から選択される少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）インヒビターを含む、本発明の新たな医薬の組合せが、がん、特に、固形腫瘍の処置にて使用した場合、相乗効果を示すことを見出した。

本発明の医薬の組合せにて使用するＣＤＫインヒビターは、下記の式（Ｉ）で表す化合物から選択される。以下の式（Ｉ）で表されるＣＤＫインヒビターは、国際公開第ＷＯ２００４００４６３２号にて開示されている。式（Ｉ）で表される化合物は、多くのがん細胞の増殖を抑制し得る、見込みのあるＣＤＫインヒビターである。本発明にて使用する式（Ｉ）で表される化合物は、種々の固体および血液系腫瘍に対して有効である。本発明者らは、式（Ｉ）で表されるＣＤＫインヒビターを、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、およびゲムシタビンからなる群より選択される従来の細胞傷害性抗腫瘍剤と組み合わせることによって、アポトーシスまたはプログラム細胞死の増加をもたらすことを観察した。

本発明にて使用するＣＤＫインヒビターは、以下の式（Ｉ）：

［式中、Ａｒはフェニルであって、置換されていないか、または、塩素、臭素、フッ素またはヨウ素から選択されるハロゲン、ニトロ、シアノ、Ｃ_１−Ｃ_４−アルキル、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、Ｃ_１−Ｃ_４−アルコキシ、カルボキシ、Ｃ_１−Ｃ_４−アルコキシカルボニル、ＣＯＮＨ_２およびＮＲ_１Ｒ_２から選択される１、２または３つの同一または異なる置換基で置換されており、Ｒ_１およびＲ_２は、水素またはＣ_１−Ｃ_４−アルキルからそれぞれ独立して選択される］
で表される化合物から選択される。

式（Ｉ）で表される化合物（その医薬上許容される塩および溶媒和物の形態であり得る）の製造、および上記化合物を含む経口および／または非経口の医薬組成物の製造が、国際公開第ＷＯ２００４００４６３２号にて開示されている。上記出願（出典明示によって本明細書に組込む）は、式（Ｉ）で表されるＣＤＫインヒビターが有意な抗がん有効性を示すことを開示している。

本明細書で示す式（Ｉ）で表されるＣＤＫインヒビターは、その塩または溶媒和物の形態で使用され得る。式（Ｉ）で表される化合物の好ましい塩はとして、塩酸塩、メタンスルホン酸塩およびトリフルオロ酢酸塩が挙げられる。

当業者であれば、式（Ｉ）で表される化合物が、少なくとも２つの不斉中心を含むことを理解するだろう。式（Ｉ）の化合物は、そのため、２つの異なる光学異性体（すなわち、（＋）または（−）鏡像異性体）の形態で存在する。そのような全ての鏡像異性体およびラセミ混合物を含むその混合物は、本発明の範囲に含まれる。式（Ｉ）の化合物の鏡像異性体は、国際公開第ＷＯ２００４００４６３２号および本出願人の係属中の国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００６／０５２２９４号に記載の方法によって入手できる（出典明示によってその全体を本明細書に組込む）。式（Ｉ）で表される化合物の鏡像異性体はまた、キラルＨＰＬＣおよび酵素的分割などの、当該分野にて周知の方法によって入手できる。あるいは、式（Ｉ）で表される化合物の鏡像異性体は所望により活性な出発材料を使用することによって、合成してもよい。したがって、式（Ｉ）で表されるＣＤＫインヒビターの定義は、全ての考え得る立体異性体およびその混合物を含む。式（Ｉ）の定義は、特定の活性を有するラセミ形態および単離した光学異性体を含む。

本発明の新たな医薬の組合せにて使用する従来の細胞傷害性抗腫瘍剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、ゲムシタビン、および同様の作用機序を介して抗がん活性を示す類似の細胞傷害性抗腫瘍剤からなる群より選択され得る。

パクリタキセルは、タイヘイヨウイチイ（Taxus brevifolia）から単離された天然のジテルペン生成物である（Rowinsky et. al., J. Natl. Cancer Inst., 82, 1247-1259 (1990)）。パクリタキセルの単離およびその構造は、J. Am. Chem. Soc. 93, 2325 (1971)にて開示されている。微小管阻害剤は、脱重合を阻害することによって、チューブリン二量体からの微小管の構築を促進し、微小管を安定化する。パクリタキセルは、卵巣がんの処置での臨床的な使用（Merkman et al.; Yale Journal Of Biology and Medicine, 64:583, 1991）、および乳がんの処置（Holmes et al; J. Nat. Cancer Inst., 83; 1797, 1991）について認可されているものの、他のがんの処置にも有用であり、例えば、頭部および頸部がん（Forastire et. al., Sem. Oncol., 20: 56, 1990）、および肺がん（M. Ghaemmaghami et al; Chest; 113; 86-91 (1998)）の処置について可能性のある候補として考えられている。パクリタキセルは、感受性がんの処置におけるパクリタキセルの使用または投与の教示について、米国特許第５，６７０，５３７号（出典明示によってその全体を本明細書に組込む）にて開示されている。パクリタキセルは、注射溶液、Ｔａｘｏｌ（登録商標）として市販されている。単剤療法としてのパクリタキセルの使用にともなって、過敏症反応、低血圧、徐脈、高血圧、悪心および嘔吐を含む望ましくない副作用、ならびに注射部位反応が徐々に生じる。

ドセタキセルはタキサンファミリーに属し、パクリタキセルの準合成誘導体である。ドセタキセルは、主に、乳がんおよび非小細胞肺がんについて望ましい。ドセタキセルは、他のがんの処置についても有用である。この化合物は、感受性がんの処置におけるドセタキセルの合成および使用の教示について、米国特許第４，８１４，４７０号（出典明示によってその全体を本明細書に組込む）にて開示されている。ドセタキセル三水和物は、注射溶液、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）として市販されている。ドセタキセルを含むタキソイド誘導体に基づく全ての処置は、骨髄抑制、好中球減少症、過敏症、末梢神経障害および体液貯留などの深刻で厄介な毒性を示し得る（Fumoleau et al., Bull. Cancer, (82)8: 629-636 (1995)）。

ドキソルビシンは、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）の一般名であり、注射可能な形態で市販されている。ドキソルビシンは、スレプトミセスポイセチウスバルセシウス（Sreptomyces peucetius var caesius）の発酵ブロスからまず単離された（米国特許第3,590,028号）。この細胞傷害性抗腫瘍剤は、おそらく、ＤＮＡ二本鎖への平面アントラサイクリン核（planar anthracycline nucleus）の特異的な挿入によって、核酸に結合し、細胞複製の異常をもたらす。ドキソルビシンは、乳がん、膀胱がん、肝がん、肺がん、前立腺がん、胃がんおよび甲状腺がん;骨肉腫および軟骨肉腫;リンパ腫および白血病;ならびに、小児腫瘍の処置において使用される。ドキソルビシンの使用によって、骨髄抑制、悪心および嘔吐、皮膚粘膜、ならびに心臓効果を含む深刻な副作用が徐々に生じる。

ゲムシタビンは、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジンの一般名である。ゲムシタビンは、モノヒドロクロリド塩およびβ−異性体として市販されている。ゲムシタビンは、感受性がんの処置におけるゲムシタビンの合成および使用の教示について、米国特許第４，８０８，６１４号および第５，４６４，８２６号（出典明示によってその全体を本明細書に組込む）にて開示されている。単一の薬剤としてのゲムシタビン塩酸塩の市販の処方物は、膵臓の局所的に進行性または転移性のアデノ細胞腫または肺細胞腫（ＮＳＣＬＣ）を有する患者の第１の処置として望ましく、５−フルオロウラシルで以前処置した患者において一般に使用される。

本明細書で使用する一般的な用語は、好ましくは、ほかに言及しない限り、本発明の開示の範囲内で、以下の意味を有する。
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、ほかに明示しない限り、複数も含む。

用語「抗腫瘍剤」は、「化学療法薬」または「抗がん剤」と同意語であり、新生物の増殖を抑制または阻害することによって作用する治療剤をいう。一般に、「抗腫瘍剤」または「抗がん剤」は、がん細胞の増殖を阻害する化合物（すなわち、抗増殖剤）をいう。一般に、抗腫瘍剤は、抗増殖性細胞傷害剤と抗増殖性細胞増殖阻害剤の２つのクラスに分けられる。細胞傷害剤は、（１）ＤＮＡを複製する細胞の能力に干渉すること、および（２）がん細胞にて細胞死および／またはアポトーシスを誘導することによってがん細胞の分裂を阻害する。抗増殖性細胞増殖阻害剤は、細胞増殖を調節する細胞のシグナル伝達のプロセスを調節、干渉または抑制することによって作用する。本発明において、本発明の医薬の組合せに含まれる抗腫瘍剤は細胞傷害剤であって、細胞傷害性抗腫瘍剤をいう。

本明細書で使用する「相乗的な」は、本発明の方法および組合せを用いて達成される効果が、細胞傷害性抗腫瘍剤もしくはその医薬上許容される塩、および式（Ｉ）で表されるＣＤＫインヒビターまたはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を別々に使用することによってもたらされる効果の合計より大きいことを意味する。有利には、そのような相乗効果は、同じ用量でより高い有効性を提供し、および／または多剤耐性の累加を予防もしくは遅延させる。

本明細書で使用する用語「治療有効量」は、非増殖性の細胞に対して最小限の毒性で、増殖性の細胞の最大限のアポトーシスを与える化学療法剤の量をいう。

用語「アポトーシス」は、細胞内の一連の分子的な段階が細胞死をもたらす、細胞死の型をいう。アポトーシスは、不要または異常な細胞を除去する、身体の正常な手段である。アポトーシスのプロセスは、がん細胞ではブロックされ得る。また、プログラム細胞死ともいわれる（Dictionary of Cancer terms. National Cancer Institute）。

本明細書で使用する用語「アポトーシスの増加」は、プログラム細胞死の割合の増加、すなわち、細胞傷害性抗腫瘍剤単独またはＣＤＫインヒビター単独のいずれかへの曝露（接触）と比べて、より多くの細胞が細胞死のプロセスに誘導されることとして定義される。

本明細書で使用する用語「対象」は、動物、好ましくは哺乳動物、もっとも好ましくはヒトをいい、処置、観察または実験の対象である。

１つの実施態様において、本発明は、がんの処置のための新たな医薬の組合せに関し、該組合せは、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、およびゲムシタビンからなる群より選択される細胞傷害性抗腫瘍剤またはその医薬上許容される塩、ならびに、式（Ｉ）（本明細書に記載する）の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物から選択される少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）インヒビターを含む。

１つの実施態様において、式（Ｉ）で表されるＣＤＫインヒビターおよび本明細書に記載の細胞傷害性抗腫瘍剤を含む医薬の組合せは、該成分を物理的に一緒にすることで得られる組合せのみに限定されるものではなく、別々の投与を認める組合せも含み、投与は組合せの最大の有効性を得るために、同時、連続してまたは一定の間隔をおいてなされる。そのため、医薬の組合せは、有効ながんの処置について、同時または一定の間隔をおいて投与され得る。

本発明の目的のために、式（Ｉ）で表される化合物から選択されるＣＤＫインヒビターが、例えば、細胞傷害性抗腫瘍剤の前、後または同時に投与され得る。本発明の好ましい態様において、細胞傷害性抗腫瘍剤またはその医薬上許容される塩は、式（Ｉ）のＣＤＫインヒビターまたはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物の投与の前に、下記の投与量範囲で投与される。しかし、所定の条件下でＣＤＫインヒビターおよび細胞傷害性抗腫瘍剤の投与のための最適な方法および順番は、以下の慣用技術および本明細書に含まれる情報により当業者によって適切に選択され得る。

１つの実施態様において、組合せに含まれる成分は、異なる物理的および化学的特性が原因で、異なる経路によって投与されるべきである。例えば、式（Ｉ）のＣＤＫインヒビターは、経口または非経口のいずれかで投与されてもよく、その血中レベルを生じ、かつ維持する一方、細胞傷害性抗腫瘍剤は、静脈内、皮下または筋肉内の経路によって非経口で投与され得る。

経口での使用について、式（Ｉ）のＣＤＫインヒビターは、例えば、錠剤またはカプセル、散剤、分散性顆粒、またはカプセル（cachet）、または水溶液もしくは懸濁液の形態で投与され得る。経口での使用のための錠剤の場合、一般に使用される担体として、ラクトース、コーンスターチ、炭酸マグネシウム、タルクおよび糖が挙げられ、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤が一般に添加される。カプセル形態での経口投与について、有用な担体として、ラクトース、コーンスターチ、炭酸マグネシウム、タルクおよび糖が挙げられる。

筋肉内、腹腔内、皮下および静脈内での使用について、有効成分（細胞傷害性抗腫瘍剤またはＣＤＫインヒビター）の滅菌溶液が通常用いられ、溶液のｐＨは、適切に調整または緩衝化される。

別の実施態様において、本発明はがんの処置方法に関し、方法は、そのような処置を必要とする対象に治療有効量の組合せを投与する工程を含む。したがって、本発明の方法において、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物から選択されるＣＤＫインヒビターの治療有効量と組み合わせて、がんの処置に有効な細胞傷害性抗腫瘍剤の治療量を対象に投与することによって、相乗効果がもたらされ、がんが対象において処置される。

上記のように、本発明の医薬組成物に含まれる有効成分は、同時または連続して投与され得る。

そのため、本発明によれば、がんの処置方法は、細胞傷害性抗腫瘍剤の治療量を、式（Ｉ）のＣＤＫインヒビターの治療量と同時に、がんの処置を必要とする対象に投与する工程を含む。

１つの実施態様において、がんの処置方法は、細胞傷害性抗腫瘍剤の治療量および式（Ｉ）のＣＤＫインヒビターの治療量の、がんの処置を必要とする対象に連続投与する工程を含む。

別の実施態様において、がんの処置方法は、細胞傷害性抗腫瘍剤の治療量を、式（Ｉ）のＣＤＫインヒビターの治療量を投与する前に、がんの処置を必要とする対象に投与する工程を含む。

本発明の方法および医薬の組合せは、乳がん、肺がん(小細胞および非小細胞肺がん、および肺アデノ細胞腫を含む)、卵巣がん、膵臓がん(膵外分泌細胞腫を含む)、胃がん、結腸直腸がんおよび肝細胞がんからなる群より選択されるがんの処置において使用され得る。

好ましい態様において、本発明の医薬の組合せは、非小細胞肺がんおよび膵臓がんからなる群より選択されるがんの処置において使用され得る。

組合せに含まれる有効成分の実際の投与量は、患者の要求および処置されている状態の重症度に応じて変動し得る。特定の状況について適切な投与量の決定は、当該分野の技術範囲内である。一般に、処置は、化合物の適切な用量より少ない用量で開始する。その後、各成分の用量を、その条件下で最適な効果が得られるまで、少しずつ増加させる。しかし、医薬の組合せにおける各成分の量は、典型的に、単独で投与した場合に治療効果を生じる量より少ないだろう。例えば、１日あたりの合計用量は、所望により、部分に分けられ、投与され得る。好ましい態様において、細胞傷害性抗腫瘍剤またはその医薬上許容される塩、および式（Ｉ）で表されるＣＤＫインヒビターまたはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物は、細胞傷害性抗腫瘍剤が、１０ｍｇ〜１４００ｍｇ、好ましくは１５ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲の相乗的に有効な用量で投与され、ＣＤＫインヒビターが、５ｍｇ〜７５０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜３００ｍｇの範囲の相乗的に有効な用量で投与されるように、注射可能な形態で連続して投与される。

本発明の好ましい実施態様において、細胞傷害性抗腫瘍剤がパクリタキセルである場合、パクリタキセルは、３０ｍｇ〜３００ｍｇの範囲の相乗的に有効な用量で投与される。

本発明の好ましい実施態様において、細胞傷害性抗腫瘍剤がドセタキセルである場合、ドセタキセルは、２０ｍｇ〜１７５ｍｇの範囲の相乗的に有効な用量で投与される。

本発明の好ましい実施態様において、細胞傷害性抗腫瘍剤がドキソルビシンである場合、ドキソルビシンは、１７．５ｍｇ〜７５ｍｇの範囲の相乗的に有効な用量で投与される。

本発明の好ましい実施態様において、細胞傷害性抗腫瘍剤がゲムシタビンである場合、ゲムシタビンは、７０ｍｇ〜１２００ｍｇの範囲の相乗的に有効な用量で投与される。

本発明によって提供される組合せは、特定のアッセイシステムおよびインビトロでのいくつかの異なる投与計画にて評価されている。実験の詳細を以下に示す。本明細書にて示すデータは、式（Ｉ）のＣＤＫインヒビターと組み合わせた場合の細胞傷害性抗腫瘍剤が、相乗効果を示すことを示している。がんの処置において抗がん剤を組み合わせた場合、がんを式（Ｉ）のＣＤＫインヒビター単独または細胞傷害性抗腫瘍剤単独で処置した場合と比べて、増殖性細胞のアポトーシスまたは細胞傷害性が増加したことが明確に示されている。例えば、表２〜４のデータから、ＣＤＫインヒビター、本明細書にて化合物Ａと記載する式（Ｉ）で表される代表的な化合物は、非小細胞肺細胞腫Ｈ−４６０細胞に対するインビトロでの分析において、ドキソルビシンの細胞傷害性を増強したことが観察された。

薬理学的アッセイにおいて使用する代表的な化合物、化合物Ａは、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オンをいい、国際公開第ＷＯ２００４００４６３２号（出典明示によって本明細書に組込む）にて開示されているものである。

本発明者らはまた、インビトロでの観察結果をインビボシステムに広げる異種移植片モデルを確立した。発明者らは、ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全）オスマウスの非小細胞肺異種移植片モデルを使用して、インビボでの有効性について、本発明の組合せを試験した。ＣＤＫインヒビターをドキソルビシンと組み合わせて連続して投与した場合、ドキソルビシンの有効性は相乗的に増強された。図７ａおよび７ｂから、本発明の医薬の組合せは、ＳＣＩＤマウスの非小細胞肺異種移植片モデルにおいて医薬上相乗的な有効性を示すことが明らかである。

本発明者らが行った、ヒト非小細胞肺細胞腫Ｈ−４６０細胞株の処置において、従来の細胞傷害性抗腫瘍剤、ドキソルビシンおよび別の公知のＣＤＫインヒビター、Ｆｌａｖｏｐｉｒｉｄｏｌを含む組合せの使用を含むインビトロでの類似の調査において、投与の順番に関わりのないドキソルビシンおよびフラボピリドールの組合せは、付加的な効果をもたらし、相乗効果は示されなかった（表１６−Ａ、Ｂ、Ｃ）。調査の詳細を以下に示す。そのため、異なる作用機序を有する抗がん剤の組合せが常に有利な治療効果をもたらすことを確実に予想することはできない。しかしながら、本発明者らは、本発明の新たな医薬の組合せの相乗的な有効性を明確に示している。

細胞傷害性抗腫瘍剤およびＣＤＫインヒビターを含む本発明の組合せの相乗効果を、好ましい実施態様に言及することでより詳細に説明する。これらは、本発明の例を示すものであって、本発明を限定するものではないことに留意すべきである。

薬理学的アッセイ：
インビトロでの細胞傷害アッセイ：
使用した細胞傷害アッセイは、ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム， 内塩）アッセイであった。ヒト非小細胞肺細胞腫Ｈ−４６０細胞を、１５００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレート中の１８０μＬの培地に播種し、一晩インキュベートして、細胞を付着させた。単剤曝露の場合、組合せ中に含まれる様々な濃度の薬物をウェルに添加し、適切な期間、加湿した５％ＣＯ_２インキュベーターにて、３７℃でインキュベートした。２つの薬物で処理する場合、細胞傷害性抗腫瘍剤（パクリタキセル、ドセタキセルおよびドキソルビシン）３〜２４時間投与し、培地を除去し、細胞を培地で１回洗った。細胞を洗った後で、２つの異なる濃度の化合物Ａをウェルに添加し、プレートを４８、７２または９６時間、加湿した５％ＣＯ_２インキュベーターにて、３７℃でインキュベートした。コントロールのウェルは、ビヒクルで処理した。インキュベーションの終盤、培地をウェルから除去し、２０μＬのＭＴＳ（リン酸緩衝生理食塩水中２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６〜６．５、フィルター滅菌したもの）を各ウェルに添加し、合計体積を完全培地で２００μＬに調節した。プレートを、２〜４時間、加湿した５％ＣＯ_２インキュベーターにて、３７℃でインキュベートした。Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて、４９０ｎＭでプレートを読み取り、ＳｏｆｔＭａｘ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘのためのソフトウェアを使用して、細胞傷害性パーセンテージおよびＩＣ_５０を算出した。

実施例１
この実施例は、ドキソルビシンおよび化合物Ａの組合せの相乗効果を示し、ドキソルビシンが化合物Ａの前に投与されるように、ドキソルビシンおよび化合物Ａを連続して投与した。ヒト非小細胞肺細胞腫Ｈ−４６０細胞を、１５００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、薬物、すなわちドキソルビシン単独または化合物Ａ単独のいずれかでまず処理した。ドキソルビシン処理は最初の２４時間であり、その後、完全培地で７２時間処理し、化合物Ａの場合、最初の２４時間は完全培地中におき、その後、化合物Ａでさらに７２時間処理した。使用したドキソルビシンの濃度は１００ｎＭおよび２００ｎＭであり、一方で、化合物Ａは、８００ｎＭの濃度で使用した（４８時間の処理後のＩＣ_３０濃度）。組合せの調査において、細胞を、２００ｎＭまたは１００ｎＭのドキソルビシンで最初の２４時間まず処理し、その後、８００ｎＭの化合物Ａで７２時間処理した。薬物処理の終了後、すなわち９６時間後に、プレートをＭＴＳ生存率アッセイのために処理し、細胞傷害パーセンテージをコントロールとの比較により算出した。結果を表１に示す。

実施例２
この実施例は、ドキソルビシンおよび化合物Ａの組合せの相乗効果を示し、ドキソルビシンが化合物Ａの前に投与されるように、ドキソルビシンおよび化合物Ａを連続して投与した。この実施例において、化合物Ａは、１２００ｎＭの濃度で使用した。ヒト非小細胞肺細胞腫Ｈ−４６０細胞を、１５００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、薬物、すなわちドキソルビシン単独または化合物Ａ単独のいずれかでまず処理した。ドキソルビシン処理は最初の２４時間であり、その後、完全培地で７２時間処理し、化合物Ａの場合、最初の２４時間は完全培地中におき、その後、化合物Ａでさらに７２時間処理した。使用したドキソルビシンの濃度は１００ｎＭおよび２００ｎＭであり、一方で、化合物Ａは、１２００ｎＭの濃度で使用した（４８時間の処理後のＩＣ_３０濃度）。組合せの調査において、細胞を、２００ｎＭまたは１００ｎＭのドキソルビシンで最初の２４時間まず処理し、その後、１２００ｎＭの化合物Ａで７２時間処理した。薬物処理の終了後、すなわち９６時間後に、プレートをＭＴＳ生存率アッセイのために処理し、細胞傷害パーセンテージをコントロールとの比較により算出した。結果を表２に示す。

実施例３
この実施例は、ドキソルビシンおよび化合物Ａの組合せの相乗効果を示し、ドキソルビシンが化合物Ａの前に投与されるように、ドキソルビシンおよび化合物Ａを連続して投与した。この実施例において、化合物Ａは、１２００ｎＭの濃度で使用し、間隔時間を９６時間とした。ヒト非小細胞肺細胞腫Ｈ−４６０細胞を、１５００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、薬物、すなわちドキソルビシン単独または化合物Ａ単独のいずれかでまず処理した。ドキソルビシン処理は最初の２４時間であり、その後、完全培地で９６時間処理し、化合物Ａの場合、最初の２４時間は完全培地中におき、その後、化合物Ａでさらに９６時間処理した。使用したドキソルビシンの濃度は１００ｎＭおよび２００ｎＭであり、一方で、化合物Ａは、１２００ｎＭの濃度で使用した（４８時間の処理後のＩＣ_３０濃度）。組合せの調査において、細胞を、２００ｎＭまたは１００ｎＭのドキソルビシンで最初の２４時間まず処理し、その後、１２００ｎＭの化合物Ａで９６時間処理した。薬物処理の終了後、すなわち１２０時間後に、プレートをＭＴＳ生存率アッセイのために処理し、細胞傷害パーセンテージをコントロールとの比較により算出した。結果を表３に示す。

実施例４
この実施例は、同時に１２０時間投与されたドキソルビシンおよび化合物Ａの組合せの相乗効果を示す。ヒト非小細胞肺細胞腫Ｈ−４６０細胞を、１５００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、薬物、すなわちドキソルビシン単独または化合物Ａ単独のいずれかでまず１２０時間それぞれ処理した。使用したドキソルビシンの濃度は３０ｎＭおよび１００ｎＭであり、一方で、化合物Ａは、８００ｎＭおよび１２００ｎＭの濃度で使用した（４８時間の処理後のＩＣ_３０およびＩＣ_３０濃度まで）。組合せの調査において、細胞を、３０ｎＭまたは１００ｎＭのドキソルビシンおよび８００ｎＭまたは１２００ｎＭの化合物Ａで１２０時間処理した。薬物処理の終了後、すなわち１２０時間後に、プレートをＭＴＳ生存率アッセイのために処理し、細胞傷害パーセンテージをコントロールとの比較により算出した。結果を表４に示す。

実施例５
この実施例は、化合物Ａが細胞傷害性抗腫瘍剤、ドキソルビシンの前に投与された場合、相乗効果が生じないことを示す。この実施例において、化合物Ａは、１２００ｎＭの濃度で使用し、間隔時間を９６時間とした。ヒト非小細胞肺細胞腫Ｈ−４６０細胞を、１５００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、薬物、すなわちドキソルビシン単独または化合物Ａ単独のいずれかでまず処理した。化合物Ａの処理は最初の９６時間であり、その後、完全培地で２４時間処理し、ドキソルビシンの場合、最初の９６時間は完全培地中におき、その後、ドキソルビシンでさらに２４時間処理した。使用したドキソルビシンの濃度は３０ｎＭ、７０ｎｍ、１００ｎＭおよび２００ｎＭであり、一方で、化合物Ａは、８００ｎＭおよび１２００ｎＭの濃度で使用した（４８時間の処理後のＩＣ_３０およびＩＣ_３０濃度まで）。組合せの調査において、８００ｎＭまたは１２００ｎＭの化合物Ａを最初の９４時間添加し、その後、３０ｎＭ、７０ｎｍ、１００ｎＭまたは２００ｎＭのドキソルビシンを２４時間添加した。薬物処理の終了後、すなわち１２０時間後に、プレートをＭＴＳ生存率アッセイのために処理し、細胞傷害パーセンテージをコントロールとの比較により算出した。表６は、この組合せでの細胞傷害パーセンテージが、化合物Ａを単独で投与した場合の細胞傷害性より低いことを示す。つまり、ドキソルビシンは、第１の薬物（この場合、化合物Ａ）の効果を増強しないので、この順番の効果は拮抗性である。結果を表５に示す。

実施例１〜４では、ＣＤＫインヒビターが細胞傷害剤の後または同時に投与された場合、ＣＤＫインヒビターがドキソルビシンの効果を相乗的に増強することが示されている。実施例５はまた、連続処理の重要性を示す。ドキソルビシン、その後のＣＤＫインヒビターを用いた処理は相乗的であり、逆の順番は有効でないことが見出された。

実施例６
この実施例は、ドセタキセルおよび化合物Ａの組合せの相乗効果を示し、ドセタキセルが化合物Ａの前に投与されるように、ドセタキセルおよび化合物Ａを連続して投与した。ヒト非小細胞肺細胞腫Ｈ−４６０細胞を、３０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、薬物、すなわちドセタキセル単独または化合物Ａ単独のいずれかでまず処理した。ドキソルビシン処理は最初の３時間であり、その後、完全培地で４５時間処理し、化合物Ａの場合、最初の３時間は完全培地中におき、その後、化合物Ａでさらに４５時間処理した。使用したドセタキセルの濃度は０．１ｎＭおよび３ｎＭであり、一方で、化合物Ａは、７００ｎＭの濃度で使用した（４８時間の処理後のＩＣ_３０濃度まで）。組合せの調査において、細胞を、０．１ｎＭまたは３ｎＭのドキソルビシンで最初の３時間まず処理し、その後、７００ｎＭの化合物Ａで４５時間処理した。薬物処理の終了後、すなわち４８時間後に、プレートをＭＴＳ生存率アッセイのために処理し、細胞傷害パーセンテージをコントロールとの比較により算出した。結果を表６に示す。

実施例７
この実施例は、ドセタキセルおよび化合物Ａの組合せの相乗効果を示し、ドセタキセルが化合物Ａの前に投与されるように、ドキソルビシンおよび化合物Ａを連続して投与した。ヒト非小細胞肺細胞腫Ｈ−４６０細胞を、３０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、薬物、すなわちドセタキセル単独または化合物Ａ単独のいずれかでまず処理した。ドキソルビシン処理は最初の３時間であり、その後、完全培地で４５時間処理し、化合物Ａの場合、最初の３時間は完全培地中におき、その後、化合物Ａでさらに４５時間処理した。使用したドセタキセルの濃度は０．１ｎＭおよび３ｎＭであり、一方で、化合物Ａは、１０００ｎＭの濃度で使用した（４８時間の処理後のＩＣ_３０濃度まで）。組合せの調査において、細胞を、０．１ｎＭまたは３ｎＭのドキソルビシンで最初の３時間まず処理し、その後、１０００ｎＭの化合物Ａで４５時間処理した。薬物処理の終了後、すなわち４８時間後に、プレートをＭＴＳ生存率アッセイのために処理し、細胞傷害パーセンテージをコントロールとの比較により算出した。結果を表７に示す。

実施例８
この実施例は、パクリタキセルおよび化合物Ａの組合せの相乗効果を示し、パクリタキセルが化合物Ａの前に投与されるように、パクリタキセルおよび化合物Ａを連続して投与した。ヒト非小細胞肺細胞腫Ｈ−４６０細胞を、１５００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、薬物、すなわちパクリタキセル単独または化合物Ａ単独のいずれかでまず処理した。パクリタキセル処理は最初の３時間であり、その後、完全培地で４５時間処理し、化合物Ａの場合、最初の３時間は完全培地中におき、その後、化合物Ａでさらに４５時間処理した。使用したパクリタキセルの濃度は１０ｎＭであり、一方で、化合物Ａは、７００ｎＭの濃度で使用した（４８時間の処理後のＩＣ_３０濃度まで）。組合せの調査において、細胞を、１０ｎＭのパクリタキセルで最初の３時間まず処理し、その後、７００ｎＭの化合物Ａで４５時間処理した。薬物処理の終了後、すなわち４８時間後に、プレートをＭＴＳ生存率アッセイのために処理し、細胞傷害パーセンテージをコントロールとの比較により算出した。結果を表８に示す。

実施例９
この実施例は、ゲムシタビンおよび化合物Ａの組合せの相乗効果を示し、ゲムシタビンが化合物Ａの前に投与されるように、ゲムシタビンおよび化合物Ａを連続して投与した。ヒト膵臓（Ｐａｎｃ−１）細胞を、１５００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、薬物、すなわちゲムシタビン単独または化合物Ａ単独のいずれかでまず処理した。ゲムシタビン処理は最初の２４時間であり、その後、完全培地で７２時間処理し、化合物Ａの場合、最初の２４時間は完全培地中におき、その後、化合物Ａでさらに７２時間処理した。使用したパクリタキセルの濃度は７０ｎＭであり、一方で、化合物Ａは、３００ｎＭの濃度で使用した（４８時間の処理後のＩＣ_３０濃度まで）。組合せの調査において、細胞を、７０ｎＭのゲムシタビンで最初の２４時間まず処理し、その後、３００ｎＭの化合物Ａで７２時間処理した。薬物処理の終了後、すなわち９６時間後に、プレートをＭＴＳ生存率アッセイのために処理し、細胞傷害パーセンテージをコントロールとの比較により算出した。結果を表９に示す。

細胞周期の分布の分析およびフローサイトメトリー
ヒト非小細胞肺細胞腫Ｈ−４６０を、２５ｍｍ^３組織培養フラスコに播種した。２４時間後、細胞を、化合物Ａ単独で７２時間または９６時間および細胞傷害性抗腫瘍剤、ドキソルビシン単独で２４時間処理した。組合せの調査について、細胞を細胞傷害性抗腫瘍剤、ドキソルビシンで、２４時間処理し、その後、細胞傷害性抗腫瘍剤の除去、およびＰＢＳでの２回の細胞の洗浄後に、化合物Ａで７２時間または９６時間処理した。コントロール細胞は、９６時間または１２０時間未処理のままにした。剥離および付着細胞の両方を、異なる時点で回収した。細胞を、遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分間）を用いて、約５ｍＬのＰＢＳで２回洗った。細胞を５００μＬのＰＢＳに再懸濁し、５００μＬの氷冷した７０％エタノールで固定した。固定した細胞を、室温で３０分間インキュベートし、１０００ｒｐｍで１０分間遠心沈殿させた。細胞のペレットに、１ｍＬの冷やした７０％エタノールを添加し、細胞のペレットをさらなる分析まで、冷蔵庫で保持した。細胞をＰＢＳで２回洗浄して、固定液を除去し、２５０μＬのＰＢＳに再懸濁した。これに、５０μＬのヨウ化プロピジウム（ＰＢＳ中４ｍｇ／ｍＬ）および１２．５μＬのＲｎａｓｅ Ａ（１ｍｇ／ｍＬ）を添加した。３７℃で３０分間インキュベートした後で、フローサイトメトリーを使用して細胞を分析した。

Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーを、製造者の勧めに従って使用した。アルゴンイオンレーザーセット（４８８ｎｍ）を励振源として使用した。２ｎと４ｎの間のＤＮＡ含量を有する細胞を、赤色蛍光のレベルによって定義し、細胞周期のＧ_１、ＳおよびＧ_２／Ｍ期にあるとした。２ｎより少ないＤＮＡ含量を示す細胞は、サブＧ１細胞とした。各細胞周期部分中の細胞数を、合計細胞数のパーセンテージで示す。

実施例１０
この実施例は、図１に示すように、種々の処置についての細胞周期の分布を与える。約１〜２×１０^６個の細胞を、処置群について、組織培養フラスコに播種した。アッセイプロトコルは、細胞周期の分布の分析およびフローサイトメトリーにて上記したとおりである。細胞周期を４つの部分に分け、図１では、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３およびＭ４と示す。Ｍ１はＧ１期に対応し、Ｍ２はＳ期に対応し、Ｍ３はＧ２−Ｍ期に、Ｍ４はサブＧ１期に対応し、アポトーシスを迎えた細胞を示す。薬物処理をしていない９６時間のコントロールは、わずか２％の少量のアポトーシスしか示さず、一方、いずれかの薬物単独での処理群は、化合物Ａ単独およびドキソルビシン単独の両方について、約１０％のアポトーシスしか示さなかった。両方の薬物の組合せは、３４％の増加したアポトーシスを示した。

実施例１１
この実施例は、図２に示すように、種々の処置についての細胞周期の分布を与える。約１〜２×１０^６個の細胞を、処置群について、組織培養フラスコに播種した。アッセイプロトコルは、細胞周期の分布の分析およびフローサイトメトリーにて上記したとおりである。細胞周期を４つの部分に分け、図１では、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３およびＭ４と示す。Ｍ１はＧ１期に対応し、Ｍ２はＳ期に対応し、Ｍ３はＧ２−Ｍ期に、Ｍ４はサブＧ１期に対応し、アポトーシスを迎えた細胞を示す。薬物処理をしていない１２０時間のコントロールは、わずか８％の少量のアポトーシスしか示さず、一方、いずれかの薬物単独での処理群は、化合物Ａ単独およびドキソルビシン単独のそれぞれについて、約３２％および３％のアポトーシスしか示さなかった。両方の薬物の組合せは、６５％の増加したアポトーシスを示した。

実施例１２
この実施例は、図３に示すように、種々の処置についての細胞周期の分布を与える。約１〜２×１０^６個の膵臓細胞（Ｐａｎｃ−１）を、処置群について、組織培養フラスコに播種した。アッセイプロトコルは、細胞周期の分布の分析およびフローサイトメトリーにて上記したとおりである。細胞周期を４つの部分に分け、図１では、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３およびＭ４と示す。Ｍ１はＧ１期に対応し、Ｍ２はＳ期に対応し、Ｍ３はＧ２−Ｍ期に、Ｍ４はサブＧ１期に対応し、アポトーシスを迎えた細胞を示す。薬物処理をしていない９６時間のコントロールは、わずか２．１％の少量のアポトーシスしか示さず、一方、いずれかの薬物単独での処理群は、化合物Ａ単独およびドキソルビシン単独のそれぞれについて、約４．３％および１．７％のアポトーシスしか示さなかった。両方の薬物の組合せは、２５．４％の増加したアポトーシスを示した。

実施例１３
アネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色（初期アポトーシスの検出のための）
アネキシンＶ−ＦＩＴＣは、アポトーシス細胞を同定するための高感度プローブである。初期アポトーシスの間、膜リン脂質ホスファチジルセリン（ＰＳ）は、細胞膜の内側から外側へ移動し、それによって、ＰＳを細胞外の環境に曝露する。アネキシンＶは、３５〜３６ｋＤａのカルシウムリン脂質結合タンパク質のであって、ＰＳに対して高い親和性を有し、曝露されたＰＳを有する細胞に結合する。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は極性色素であって、漏出性の膜を介して細胞に侵入し、それによって、後期アポトーシスの検出のためのＦＩＴＣとの結合に使用される。

ヒト非小細胞肺細胞腫Ｈ−４６０を、２５ｍｍ^３組織培養フラスコに播種した。２４時間後、細胞を、１２００ｎＭの化合物Ａまたは１００ｎＭのドキソルビシン単独で、９６時間および２４時間それぞれ処理した。組合せの調査のために、細胞１００ｎＭの細胞傷害性抗腫瘍剤、ドキソルビシンで２４時間処理し、その後、細胞傷害性抗腫瘍剤（ドキソルビシン ）を除去し、細胞を培地で１回洗浄した後で、１２００ｎＭの化合物Ａで９６時間処理した。コントロールの細胞は１２０時間未処理のままにしておいた。浮遊細胞を含む培地を回収し、異なる時点でトリプシンを用いて回収した後で、付着細胞をプールした。遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分間）を用いて、細胞を冷やしたＰＢＳで洗浄した。１Ｘ結合バッファー（１０ｍｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２）に、１×１０^６細胞／ｍＬの濃度で、細胞のペレットを再懸濁した。１００μｌの溶液（１×１０^５細胞）をアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムを染色した。細胞を１５分間、室温、暗室にてインキュベートし、サンプルをフローサイトメトリーによって分析した。

これらの調査について、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーを製造者の勧めにしたがって使用した。アルゴンイオンレーザーセット（４８８ｎｍ）を、励振源として使用した。図４は、四象限での細胞の分布を示す。左下の象限Ｉ（ＬＬ）は、ＦＩＴＣおよびＰＩネガティブの細胞を示し、細胞が健康であることを示している。右下の象限ＩＩ（ＬＲ）は、ＰＩのみにポジティブな細胞を示し、これらの細胞が完全にアポトーシス性であることを示している。右上の象限ＩＩＩ（ＵＲ）は、アネキシンおよびＰＩの両方にポジティブな細胞を示し、これらの細胞が初期アポトーシスから後期アポトーシスに侵入していることを示している。左上の象限ＩＶ（ＵＬ）は、アネキシンのみにポジティブな細胞を示し、これらの細胞が初期アポトーシスにあることを示す。

細胞が化合物への曝露の終盤においてもなおアポトーシスに向かっている場合、それらの細胞はアネキシンについてポジティブに染まる。初期アポトーシスにおいて、細胞が一旦プログラム細胞死を許可されると、引き返すことはできない。結果を表１０に示す。組合せにおける細胞のもっとも高いパーセンテージは、いずれかの薬物単独と比べて、初期または後期アポトーシスのいずれかである。

実施例１４
クローン形成アッセイ
ヒト非小細胞肺細胞腫細胞（Ｈ−４６０）を、３５ｍｍ組織培養グレードプレートあたり７５０〜１０００個の細胞の密度で播種した。一晩３７℃で細胞をインキュベートし、プレートに結合させた。細胞を細胞傷害性抗腫瘍剤で２４時間処理し、細胞を洗い、化合物Ａを含む新たな培地で９６時間添加した。処理の後、培地を１０％ ＦＣＳを含む新たな完全培地に再度換え、コロニー形成について７〜１４日間インキュベートした。一旦目に見えるコロニーがプレート上に出現したら、培地を除去し、コロニーを２：１の割合のメタノール：酢酸混合物で５分間固定した。プレートを水で洗い、固定手順を繰り返した。プレートを乾燥させ、コロニーを０．１％ クリスタルバイオレット染色液で３〜５分間染色した。プレートを水で慎重にすすぎ、乾燥させ、コロニーをＧｅｌｄｏｃで計数した。

１２００ｎＭの化合物Ａまたは１００ｎＭのドキソルビシンそれぞれ単独で、９６時間および２４時間、あるいは、１００ｎＭのドキソルビシン、その後１２００ｎＭの化合物Ａを組み合わせて９６時間、細胞を処理した。コントロールまたは薬物のいずれか単独の場合と比べて、併用時にわずかに１つのコロニーしか見られないので、図５は、組合せの相乗作用を示す。

処理後の回復実験
化合物Ａおよびドキソルビシン単独またはその併用での細胞の処理についてのアッセイプロトコルは、細胞周期分布の分析に記載するものと同じである。薬物処理に続いて、細胞は、１０％ ＦＣＳを含む新たな完全培地にて回復される。回復中の細胞を、薬物単独または併用処理について、０、６、１８、２４および４８時間の時点で分析した。以下の実施例において、細胞の回復は、アポトーシスを経ている細胞のパーセンテージで示す。

実施例１５
細胞を、細胞傷害性抗腫瘍剤、ドキソルビシンのみで２４時間処理し、続いて、培地を除去し、新たな完全培地に置き換えた。薬物処理後、回復期の間、アポトーシスを経ている細胞の割合を決定するために特定した方法にて記載するように、ＦＡＣＳ分析を行った。回復期の０、６、１８、２４および４８時間の時点でアポトーシスを測定した。薬物処理の２４時間後、アポトーシスの割合は３％であり、回復期の間、有意に増加せず、細胞が薬物処理から最終的に回復したことを示す。結果を表１１に示す。

実施例１６
プロトコルに記載するように、アッセイを実施した。細胞を、化合物Ａのみで９６時間処理し、続いて、培地を除去し、新たな完全培地に置き換えた。薬物処理後、回復期の間、アポトーシスを経ている細胞の割合を決定するために特定した方法にて記載するように、ＦＡＣＳ分析を行った。回復期の０、６、１８、２４および４８時間の時点でアポトーシスを測定した。薬物処理の９６時間後、アポトーシスの割合は３２％であり、回復期の間、４８時間の回復の終わりの時点で、２４％から１９％に減少し、細胞が回復期において薬物処理から徐々に回復していることを示す。結果を表１２に示す。

実施例１７
プロトコルに記載するように、アッセイを実施した。細胞を、ドキソルビシンで２４時間処理し、続いて、化合物Ａで９６時間処理し、培地を除去し、新たな完全培地に置き換えた。薬物処理後、回復期の間、アポトーシスを経ている細胞の割合を決定するために特定した方法にて記載するように、ＦＡＣＳ分析を行った。回復期の０、６、１８、２４および４８時間の時点でアポトーシスを測定した。薬物処理後、アポトーシスの割合は５５％であった。回復期の間、６時間の時点で、さらに３２％がアポトーシスに入り、４８時間の回復で５７％まで増加し、細胞が回復期において薬物処理から回復せず、アポトーシスの状態が続いていたことを示す。結果を表１３に示す。

実施例１８
ウェスタンブロット分析
ヒト非小細胞肺細胞腫（Ｈ−４６０）細胞を処理しないか（すなわち、コントロール細胞）、または１００ｎＭのドキソルビシン単独で２４時間もしくは１２００ｎＭの化合物Ａ単独で９６時間処理した。組合せ処理において、細胞を１００ｎＭのドキソルビシンで２４時間まず処理し、続いて１２００ｎＭの化合物Ａで９６時間処理した。処理期間の後で、細胞を溶解し、可溶化物のタンパク質含量をＢｒａｄｆｏｒｄ試薬を使用して評価した。４０μｇのｐｒｏｔｅｉｎをＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードして、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーした。メンブレンをｐ５３、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２、サイクリンＤ１、Ｃｄｋ１およびアクチン抗体で調べた。一次抗体を、ホースラディッシュペルオキシド二次抗体を用いて検出し、ウェストピコケミルミネセンス（ｗｅｓｔ ｐｉｃｏ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）試薬に供した。

図６は、細胞周期の調節およびアポトーシスに関与する種々のタンパク質のウェスタンブトット分析を示す。等量のタンパク質を４つのレーンにロードした。ウェルにロードした異なるサンプルを、図の説明に記載する。結果は、抗アポトーシス性タンパク質Ｂｃｌ−２が、組合せ処理において、いずれかの薬物単独と比べて、有意に下方制御されており、コントロールとほぼ等しい。これは、ＦＡＣＳ分析において組合せ処理に見られたアポトーシスの増加と相関する。アポトーシス促進性タンパク質Ｂａｘは、全ての処理サンプルにて、コントロールと比べて、やや上方制御されている。腫瘍抑制タンパク質ｐ５３は、組合せ処理にて、コントロールと比べて有意に上方制御されているが、その他の２つの処理群ほどではなかった。Ｃｄｋ１−Ｂ１は、有糸分裂のイニシエータである。この酵素の分解が腫瘍形成をもたらす。そのため、Ｃｄｋ１を抑制することでその活性、それにより、有糸分裂および細胞増殖が抑制される。図は、ドキソルビシンが、Ｃｄｋ１レベルを有意に誘導する一方、化合物Ａの添加がＣｄｋ１をわずかなレベルに減少させ、それによって、細胞が有糸分裂することを防ぐ。化合物Ａ単独では、コントロールと等しいレベルしか示されていない。サイクリンＤ１のレベルは、種々の処理群にて有意な変化を示していない。組合せ処理において、レベルはコントロールと等しい一方、化合物Ａドキソルビシン単独では、レベルのわずかな減少が見られた。

実施例１９
この実施例は、非小細胞肺（Ｈ−４６０）異種移植モデルにおけるドキソルビシンおよびＣＤＫインヒビター、化合物Ａの組合せのインビボでの有効性試験を示す。
米国培養細胞系統保存機関、（ＡＴＣＣ）、米国から入手したヒト非小細胞肺細胞腫（Ｈ−４６０）細胞株を試験に使用した。腹腔内投与のためのドキソルビシンおよび化合物Ａを、化合物を生理食塩水に溶解させることによって調製した。
３６匹の重症複合免疫不全ＳＣＩＤオスマウス（〜２０ｇの体重、６〜８週齢）を使用した。
ヒト非小細胞肺細胞腫（Ｈ−４６０）細胞を、１０％ ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地にて、５％ ＣＯ_２インキュベータ（３７℃）で増殖させた。細胞を遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分間）でペレットにした。細胞を生理食塩水に再懸濁して、２５×１０^６個／ｍＬの細胞を得、この懸濁液０．２ｍＬを皮下（ｓ．ｃ．）経路でＳＣＩＤマウスに注射した。明白な腫瘍体積について、マウスを１日おきに観察した。一旦腫瘍の大きさが直径５〜７ｍｍに達したら、表１４に示す各処理群に無作為に分けた。表１５に示すように、ドキソルビシンを１週間に１回投与する一方、化合物Ａを５日間毎日投与した。ドキソルビシンの最初の投与に続いて、６時間の間隔を置いて、化合物Ａを５日間投与した（１サイクルを構成する）。２日間の間隔の後、次のサイクルを開始する。処置は２サイクルからなった。体重を毎日記録した。１日おきに、腫瘍の大きさ、毒性の他の徴候を記録した。体重の有意な減少および病的な状態の徴候は見られなかった。腫瘍重量（ｍｇ）を、長楕円についての以下の式：｛長さ（ｍｍ）×［幅（ｍｍ）^２］×０．５｝に従って評価し、特定のグラビティ（ｇｒａｖｉｔｙ）を１、πを３とみなした。化合物処理動物における腫瘍の増殖を、Ｔ／Ｃ（処理／コントロール）×１００％として算出し、増殖抑制パーセント（ＧＩ％）を［１００−Ｔ／Ｃ％］として算出した。結果を７ａ、７ｂ、８および９に図示する。

実施例２０
ＣＯＸ−２抗体を使用するウェスタンブロット分析
図９は、ＣＯＸ−２抗体を使用するウェスタンブロット分析を示す。ウェルにロードした異なるサンプルを図の説明に記載する。結果を以下に示す：
コントロールは、基礎（低い）レベルのＣＯＸ−２を示した。
化合物Ａ単独はまた、低いレベルのＣＯＸ−２を示した。
ドキソルビシンは、ＣＯＸ−２（ＮＦκＢシグナル経路を介する化学療法抵抗性の原因である）を強力に誘導した。
ドキソルビシン後の化合物Ａの添加は、ＣＯＸ−２を有意に下方制御した。

したがって、化合物ＡによるＮＦκＢ媒介性のＣＯＸ−２の抑制は、ヒト非小細胞肺細胞腫（Ｈ−４６０）腫瘍異種移植において、腫瘍の増殖およびドキソルビシン誘導性の化学療法抵抗性を抑制することに関与する。

実施例２１
ヒト非小細胞肺細胞腫細胞株（Ｈ−４６０）におけるドキソルビシンおよびフラボピリドールの組合せの調査
この実施例は、フラボピリドールを、細胞傷害性抗腫瘍剤、ドキソルビシンの後（表１６Ａ）、前（表１６Ｂ）または同時（表１６Ｃ）に投与した場合、相乗効果が生じないことを示す。ヒト非小細胞肺細胞腫Ｈ−４６０細胞を、１５００細胞／ウェルの密度で播種した。表１６Ａのとおり、細胞をいずれかの薬物単独（すなわち、ドキソルビシンまたはフラボピリドール単独）でまず処理した。ドキソルビシン処理を最初の２４時間行い、続いて完全培地で９６時間おく一方、フラボピリドールの場合、最初の２４時間を完全培地中におき、フラボピリドールでさらに９６時間処理した。使用したドキソルビシンの濃度は、３０ｎＭ、７０ｎＭ、１００ｎＭおよび２００ｎＭである一方、フラボピリドールは、２００ｎＭおよび３５０ｎＭの濃度で使用した（４８時間の処理の後のＩＣ_３０およびＩＣ_５０濃度）。組合せの調査において、細胞を３０ｎＭ、７０ｎＭ、１００ｎＭまたは２００ｎＭのドキソルビシンで最初の２４時間処理し、続いて、２００ｎＭまたは３５０ｎＭのフラボピリドールで９６時間処理した。薬物処理の終了後、すなわち１２０時間後に、プレートをＭＴＳ生存率アッセイについて処理し、細胞傷害性をコントロールとの比較により算出した。結果を表１６Ａに示す。

表１６Ｂの通り、細胞をいずれかの薬物単独（すなわち、ドキソルビシンまたはフラボピリドール単独）でまず処理した。フラボピリドール処理を最初の９６時間行い、続いて完全培地で２４時間おく一方、ドキソルビシンの場合、最初の９６時間を完全培地中におき、フラボピリドールでさらに２４時間処理した。使用したドキソルビシンの濃度は、３０ｎＭ、７０ｎＭ、１００ｎＭおよび２００ｎＭである一方、フラボピリドールは、２００ｎＭおよび３５０ｎＭの濃度で使用した（４８時間の処理の後のＩＣ_３０およびＩＣ_５０濃度まで）。組合せの調査において、細胞を２００ｎＭおよび３５０ｎＭのフラボピリドールで最初の９６時間処理し、続いて、３０ｎＭ、７０ｎＭ、１００ｎＭまたは２００ｎＭのフラボピリドールで２４時間処理した。薬物処理の終了後、すなわち１２０時間後に、プレートをＭＴＳ生存率アッセイについて処理し、細胞傷害性をコントロールとの比較により算出した。結果を表１６Ｂに示す。

表１６Ｃの通り、１２時間同時に投与するドキソルビシンおよびフラボピリドールの組合せは、相乗効果を生じない。ヒト非小細胞肺細胞腫Ｈ−４６０細胞を、１５００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞をいずれかの薬物単独（すなわち、ドキソルビシンまたはフラボピリドール単独）で１２０時間まず処理した。使用したドキソルビシンの濃度は、３０ｎＭ、７０ｎＭ、１００ｎＭおよび２００ｎＭである一方、フラボピリドールは、２００ｎＭおよび３５０ｎＭの濃度で使用した（４８時間の処理の後のＩＣ_３０およびＩＣ_５０濃度）。組合せの調査において、３０ｎＭ、７０ｎＭ、１００ｎＭおよび２００ ｎＭのドキソルビシン、および２００ｎＭまたは３５０ｎＭのフラボピリドールを一緒に１２０時間添加した。薬物処理の終了後、すなわち１２０時間後に、プレートをＭＴＳ生存率アッセイについて処理し、細胞傷害性をコントロールとの比較により算出した。結果を表１６Ｃに示す。

Claims (7)

1. パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシンおよびゲムシタビンからなる群より選択される細胞傷害性抗腫瘍剤またはその医薬上許容される塩；ならびに、ＣＤＫインヒビターもしくはその鏡像異性体またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を含む、がん患者を処置するための医薬の組合せであって、ここで
   該ＣＤＫインヒビターが、以下の式（Ｉ）：
   

   

   ［式中、Ａｒはフェニルであって、置換されていないか、または、塩素、ニトロ、シアノ、またはトリフルオロメチルから選択される１または２つの異なる置換基で置換されている］で表される；
   該がんの処置が、該細胞傷害性抗腫瘍剤を該ＣＤＫインヒビターの前に投与することを含む；および
   該がんが、非小細胞肺がんまたは膵臓がんである、
   医薬の組合せ。
2. ＣＤＫインヒビターが、式（Ｉ）（式中、フェニル基は塩素で置換されている）で表される化合物である、請求項１記載の医薬の組合せ。
3. 式（Ｉ）の化合物で示すＣＤＫインヒビターが、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オンまたはその医薬上許容される塩である、請求項１記載の医薬の組合せ。
4. 細胞傷害性抗腫瘍剤がパクリタキセルである、請求項１記載の医薬の組合せ。
5. 細胞傷害性抗腫瘍剤がドセタキセルである、請求項１記載の医薬の組合せ。
6. 細胞傷害性抗腫瘍剤がドキソルビシンである、請求項１記載の医薬の組合せ。
7. 細胞傷害性抗腫瘍剤がゲムシタビンである、請求項１記載の医薬の組合せ。

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