KR20100017763A - 상승 효과가 있는 암 치료용 약제 조합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신 또는 젬시타빈으로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포독성 항신생물제, 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염과 적어도 하나의 사이클린 의존성 키나제 (CDK) 저해제를 포함하여, 암 치료에 이용하면 상승 효과를 나타내는 약제 조합물을 제시한다. 또한, 본 발명은 상기 약제 조합물을 치료에 유효한 양으로 이용하는 암 치료 방법도 제시한다.
사이클린 의존성 키나제, 세포독성 항신생물제, 항암제, 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 젬시타빈

Description

상승 효과가 있는 암 치료용 약제 조합물{A SYNERGISTIC PHARMACEUTICAL COMBINATION FOR THE TREATMENT OF CANCER}
본 발명은 상승 효과가 있는 신규 암 치료용 약제 조합물에 관한 것이다. 상기 약제 조합물은 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신 또는 젬시타빈으로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포독성 항신생물제, 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염, 및 화학식 1 (본문에서 설명함)의 화합물로부터 선택되는 적어도 하나의 사이클린 의존성 키나제 (CDK) 저해제, 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매 화합물을 포함한다. 또한, 본 발명은 치료가 필요한 대상에게 상기 조합물을 치료에 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법에 관한 것이다.
암은 비정상 세포가 통제되지 못하고 분리되는 질병을 칭하는 일반적인 용어이다. 암 세포는 조직 근처로 침투해서 혈류와 림프계를 통해 신체의 다른 부위로 퍼질 수 있다. 방광암, 유방암, 결장암, 직장암, 두경부 암, 자궁내막암, 신장(신세포)암, 백혈병, 소세포폐암, 비소세포폐암, 췌장암, 전립선암, 갑상선암, 피부암, 비호지킨림프종, 및 흑색종 등 다양한 종류의 암이 있다. 현재에는, 화학요법, 방사선, 수술, 호르몬 요법, 면역 요법 및 유전자 요법 등 과거보다 이용가능한 암 치료 방법이 많다. 화학요법은 많은 종류의 암의 치료에 일반적으로 이용되 는 치료 방법이다. 가장 널리 사용되는 화학치료제(항신생물제)로는 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 에토포사이드, 카르보플라틴, 시스플라틴, 토포테칸 및 젬시타빈이 있다. 이들 및 기타 항신생물제는 다양한 암의 치료에 성공적으로 이용되어 왔다. 그러나, 시간이 경과함에 따라, 암 환자들은 이러한 표준 항신생물제를 이용하는 단일 치료법에 내성을 나타내는 것으로 알려졌다. 약물에 대한 저항 또는 내성은 성공적인 치료에 주요 장애가 된다. 이러한 내성은 선천적이거나(즉, 치료 착수 시 나타남) 또는 후천적(즉, 화학치료 중에 발생)이기도 하다. 점차 농도가 증가되는 독소루비신에 인체 비소세포폐암 세포 (NCI-H460)을 노출하는 연구에서, 독소루비신(96.2배)에 내성이 있고, 에토포사이드, 파클리탁셀, 빈블라스틴 및 에피루비신에 반내성(cross-resistant)이 있는 신규한 세포주(NCI-H460/R)의 출현이 보고되었다(J. Chemother., 2006 Feb; 18(1) 66-73). 비소세포 폐암 (NSCLC) 종양 배양물이 시험관내 화학요법 내성을 발현함을 설명하는 또 다른 연구에서는, 시스플라틴, 독소루비신, 에토포사이드, 젬시타빈, 나벨빈, 파클리탁셀, 탁소텔 및 토포테칸을 포함한 많은 항신생물제에 대한 극도의 또는 보통의 약제 내성이 보고되었다 (Ann. Thorac. Surg. 2006 Feb;81 (2):440-6; discussion 446-7). 젬시타빈은 췌장암 치료에 있어, 가장 우수한 임상적 활성을 나타내는 약물인 것으로 생각되었으나, 대부분의 종양 세포가 갖는 약물에 대한 기존의 내성이나, 후천적인 화학 내성에 의해 췌장암 대상의 컨디션을 상당히 증진시키지는 못하였다 (Oncogene 2003 May 22; 22(21): 3243-51). 암 치료 중 관찰되거나 일반적으로 나타나는 또 다른 문제점은 이러한 항신생물제의 대부분과 관련되는 심각한 세포독성 이다. 독소루비신과 같은 약물의 경우, 심장의 세포독성과 같은 심각한 부작용이 발생됨이 보고되었다 (J Egypt Natl Cane Inst. 2005 Dec_17(4)_291-300). 젬시타빈, 파클리탁셀 등의 종래의 항신생물제와 관련된 내성과 심각한 세포독성이 발생되더라도, 이들 항신생물제는 종양의 질량을 줄일 수 있으므로, 지속적으로 암 치료에 중요할 것이다. 반응 속도를 증진하고, 종래의 항신생물제와 관련된 세포독성을 방지하기 위한 새로운 치료 방법이 고려되었다. 그 중 하나는 상이한 생물 기전을 갖는 다른 항암제를 조합하는 프로토콜에 관한 것이다 (Jekunen et al., Br. J. Cancer, 69, 299-306 (1994); Yeh et al., Life Sciences, 54, 431-35 (1994)). 최적의 조합 화학요법 프로토콜로 치료 효능은 증진되고, 숙주 세포독성은 감소되며, 약물 내성은 최소화되거나 지연될 수 있다. 다른 세포독성을 갖는 약물을 조합하는 경우, 각 약물을 최적량 이용하여 지나친 부작용을 최소화할 수 있게 된다 (Oncology, Williston Park, 2002 Oct; 16:17-22: 카페시타민과 도세탁셀의 조합이 보고됨). 단일 요법을 이용하는 것보다 다른 항암제와 함께 이용하는 경우에 여러 항신생물제는 상승 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 이를 테면, 사이클로포스파마이드와 5-플루오로우라실은 난소의 투명세포암에 작용하여 상승 효과를 나타낸다(Cancer Lett. 2001 Jan 10;162(1):39-48)에 보고됨). 병용 화학요법은 단일요법, 방사선 또는 수술로 치료하기 어려운 진행 단계 (advanced stages)에 있는 암의 치료에 이용할 수 있는 장점이 있다. 예를 들어, 전이성 비소세포폐암의 치료에 파클리탁셀과 젬시타빈의 조합이 보고되었다 (Cancer, 2006 Sep 1 ;107(5):1050-4).
최근에는, 반응 속도를 높이고 항신생물제에 대한 내성을 줄이기 위한 파클리탁셀, 시스플라틴 등 하나 이상의 표준 항신생물제와 암 치료용 분자 표적 항암제의 조합이 시도되고 있다. 이마티닙 메실레이트, 플라보피리돌 등 분자 표적 항암제는 암 세포와 관련하여 보다 특정한 활성을 나타내는 키나아제 등 단백질을 조절한다. 장기간의 연구를 통해 사이클린-의존 키나아제(CDK)류는 다양한 세포 과정에 중요한 역할을 하는 것이 증명되었다. 지금까지 11종의 CDK류가 알려져 있다. 그 중, CDK1, CDK2, CDK3, CDK4, CDK6은 세포 주기에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (cyclins and cyclin-dependent kinases: theme and variations. Adv Cancer Res. 1995;66:181-212). CDK는 A형, B형, C형, D형(D1, D2, 및 D3) 사이클린 및 E형 사이클린 등의 사이클린과 비공유성 복합체를 형성하여 활성화된다. 이러한 종류의 동질효소는 각각 세포 주기의 특정 양상(세포의 신호전달, 전사 등)에 원인이 되고, 일부 CDK 동질효소는 특정 종류의 조직에 대한 특이성을 나타낸다. 이들 키나아제의 비이상 발현과 과발현은 많은 질병 상태에서 나타난다. 매우 유용한 CDK 저해성을 갖는 많은 화합물이 개발되어 논문에 보고되었다. 플라보피리돌은 임상 연구에 이른 사이클린-의존 키나아제(CDK)의 가장 강력한 저해제이다.
플라보피리돌은 다양한 암 세포주에서의 종래의 항신생물제 세포독성 반응을 매우 증진할 수 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, HCT116 결장암을 도세탁셀, 플라보피리돌 및 5-플루오로우라실을 차례로 치료하는 방법이 보고되었다 (Acta Pharmacol Sin. 2006 Oct; 27(10):1375-81). 또한, 폐암세포 치료를 위한 도세탁 셀과 플라보피리돌의 조합(Radiother Oncol. 2004 May; 71 (2):213-21)과, 위암 치료를 위한 이들의 조합도 보고되었다(MoI Cancer Ther. 2003 Jun;2(6):549-55).
항암제 조합으로 암 치료 프로토콜이 상당히 진전되었으나, 치료가 어렵거나, 종래의 항신생물제를 단일 요법으로 이용하는 치료 방법에 내성을 나타내는 암 을 치료하기 위한 약물은 아직 충족되지 못하여 개발이 필요한 실정이다. 보다 상세하게는, 다른 작용 기전을 갖는 공지된 항암제를 얻기 위한 새로운 조합 방법의 개발은 본 기술 분야에 있어 상당한 진전에 해당될 것이다. 다른 작용 기전을 갖는 항암제의 조합을 포함하는 프로토콜이 여러 조합에 작용하더라도, 이는 다른 항암제 조합과 동일한 방식으로 작용하지 않고, 이러한 조합이 항상 유리한 치료 효과를 갖는 조합인 것은 아니다. 그러나, 본 발명자는 화학식 1(본문에서 설명함)으로 나타내는 화합물로부터 선택되는 사이클린 의존 키나아제 저해제를 포함하는 공지된 항암제와 여러 암의 치료를 위한 표준 세포독성 항신생물제를 새로 약제학적으로 조합하면 항암제만을 단독 이용하는 것보다 의외로 우수한 효능이 나타남을 발견하였다.
발명의 요약
일 양태에 있어, 본 발명은 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신 또는 젬시타빈으로부터 선택되는 세포독성 항신생물제 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염과; 화학식 1(본문에서 설명함)의 화합물로부터 선택되는 사이클린 의존성 키나제 (CDK) 저해제 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매 화합물을 포함하며, 암 치료에 있어 상승 효과를 나타내는 신규 약제 조합물에 관한 것이다.
다른 양태에 있어, 본 발명은 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신 또는 젬시타빈으로부터 선택되는 세포독성 항신생물제, 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염과; 화학식 1(본문에서 설명함)의 화합물로부터 선택되는 사이클린 의존성 키나제 (CDK) 저해제 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매 화합물을 포함하며, 암 치료에 있어 동시에 또는 차례로 투여되는 신규 약제 조합물에 관한 것이다.
또 다른 양태에 있어, 본 발명은 암을 치료하고 세포의 아포토시스(apoptosis)를 유도하기 위한 신규 약제 조합물의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에 있어, 본 발명은 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신 또는 젬시타빈으로부터 선택되는 세포독성 항신생물제, 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염의 치료에 유효한 양과, 화학식 1(본문에서 설명함)의 화합물로부터 선택되는 사이클린 의존성 키나제 (CDK) 저해제 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매 화합물의 치료에 유효한 양을 함께 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에 있어, 본 발명은 암 치료 약제를 제조하기 위한 상기 신규 조합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태와 적용 범위는 후술하는 상세한 설명으로부터 자명할 것이다.
도 1은 H-460 비소세포 폐 세포에 독소루비신과 화합물 A을 시험관 내 조합 처리한 경우에 상승 효과가 나타남을 보여준다. A, B, C 및 D 그래프는 다양한 처리군, 즉, 대조군 (96 시간), 200 nM 독소루비신 단독 처리군 (24 시간), 800 nM 화합물 A 단독 처리군 (72 시간) 및 200 nM 독소루비신 (24 시간) 후 800 nM 화합물 A (72 시간)의 조합 처리군에 대한 세포 주기 분포를 보여준다.
도 2는 H-460 비소세포 폐 세포에 독소루비신과 화합물 A을 시험관 내 조합 처리한 경우에 상승 효과가 나타남을 보여준다. A, B, C 및 D 그래프는 다양한 처리군, 즉, 대조군 (120 시간), 100 nM 독소루비신 단독 처리군 (24 시간), 1200 nM 화합물 A 단독 처리군 (96 시간) 및 100 nM 독소루비신 (24 시간) 후 1200 nM 화합물 A (96 시간)의 조합 처리군에 대한 세포 주기 분포를 보여준다.
도 3은 췌장 (Panc-1) 세포에 젬시타빈과 화합물 A을 시험관 내 조합 처리한 경우 상승 효과가 나타남을 보여준다. A, B, C, D 및 E 그래프는 다양한 처리군, 즉, 대조군 (24 시간), 대조군 (96 시간), 70 nM 젬시타빈 단독 처리군 (24 시간), 300 nM 화합물 A 단독 처리군 (72 시간), 및 70 nM 젬시타빈 (24 시간) 후, 300 nM 화합물 A (72 시간) 조합 처리군에 대한 세포 주기 분포를 보여준다.
도 4는 독소루비신에 이어, 화합물 A을 120 시간 조합 처리하여 상승 효과를 얻은 경우, 아넥신 V 염색을 이용한 조기 아포토시스의 검출을 보여준다. A, B, C 및 D 그래프는 다른 처리군, 즉, 대조군 (120 시간), 1200 nM 화합물 A 단독 처리군 (96 시간), 100 nM 독소루비신 단독 처리군 (24 시간), 및 100 nM 독소루비신 (24 시간) 후 1200 nM 화합물 A (96 시간)의 병합 처리군에 대한 네 개의 사분면의 세포 분포를 보여준다.
도 5는 클론원성 분석 시험에서 독소루비신과 화합물 A을 H-460 비소세포 폐 세포 시험관 내 조합 처리한 경우 상승 효과가 나타남을 보여준다.
도 6는 세포 주기 조절과 아포토시스와 관련된 다양한 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다.
도 7a는 H-460 이종 이식 모델에 독소루비신 (2 mpk)과 화합물 A (20 mpk)을 조합 처리한 경우 생체 내 효능을 보여준다.
도 7b는 H-460 이종 이식 모델에 독소루비신 (2 mpk)과 화합물 A (35 mpk)을 조합 처리한 경우 생체 내 효능을 보여준다.
도 8a 및 도 8b는 처리 후 평균 종양 질량과 연구 후 각 군의 마우스 종양 8개 SE (막대)를 보여준다. 처리 후, 성장 저해율 (Gl)은 각 군의 막대 상단으로 나타낸다. 상이한 처리군간 통계학상 유의적 차이를 측정하는 데 대응 t 검정을 이용하였다. 통계학상 유의적 차이는 P < 0.05인 것으로 가정하였다.
도 9는 COX-2 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명에 따른 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신 또는 젬시타빈으로부터 선택되는 세포독성 항신생물제, 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염과; 화학식 1(본문에서 설명함)의 화합물로부터 선택되는 사이클린 의존성 키나제 (CDK) 저해제 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매 화합물을 포함하는 신규 약제 조합물은 암(특히, 고체 종양)의 치료에 이용되어 상승 효과를 나타내는 것이 발견되었다.
본 발명의 약제 조합물에 이용된 CDK 저해제는 후술하는 바와 같이 화학식 1의 화합물로부터 선택된다. 하기 화학식 1에 나타내는 CDK 저해제는 PCT 특허 공개 제 WO2004004632호에 기술되어 있다. 화학식 1의 화합물은 많은 암 세포의 증식을 억제할 수 있는 유망한 CDK 저해제이다. 본 발명에 이용될 수 있는 화학식 1의 화합물은 다양한 고상 혈액 악성 종양에 효과가 있다. 본 발명의 발명자는 화학식 1의 CDK 저해제와 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신 또는 젬시타빈로부터 선택되는 종래의 세포독성 항신생물제를 조합하면 아포토시스나 세포예정사가 증가됨을 관찰하였다.
본 발명에 이용되는 CDK 저해제는 하기 화학식 1로 나타내는 화합물로부터 선택된다:
Figure 112009076388005-PCT00001
상기 식에서,
Ar은 치환되지 않거나, 클로로, 브로모, 플루오로 또는 아이오도 등 할로겐, 니트로, 시아노, C1-C4 알킬, 트리플루오로메틸, 히드록실, C1-C4 알콕시, 카르복시, C1-C4 알콕시카르보닐, CONH2, 및 NR1R2(여기서, R1과 R2은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬로부터 선택됨)로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기 하나, 둘 또는 셋으로 치환되는 페닐기이다.
약제학적으로 허용되는 염과 용매 화합물의 형태일 수 있는 화학식 1의 화합물의 제조와 상기 화합물을 함유하는 경구용 및/또는 비경구용 약제 조성물의 제조는 PCT 특허 공개 제 WO2004004632호에 개시되어 있다. 참조 문헌으로서 본문에 포함되는 상기 특허는 화학식 1로 나타내는 CDK 저해제가 상당한 항암 효능을 나타냄을 개시하고 있다.
상술한 바와 같이, 화학식 1의 CDK 저해제는 이들의 염이나 용매 화합물 형태로 이용될 수 있다. 화학식 1의 화합물의 염은 염산염, 메탄술폰산염과 트리플루오로아세트산염이 바람직하다.
본 기술 분야의 당업자라면, 화학식 1의 화합물이 적어도 두 개의 키랄 중심을 포함하는 것을 잘 알고 있을 것이다. 이에 따라, 화학식 1의 화합물은 두 개의 다른 광학 이성질체 (즉, (+) 또는 (-) 거울상 이성질체) 형태로 존재한다. 이러한 거울상 이성질체와 라세미 혼합물을 포함하는 이들의 혼합물은 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 화학식 1의 화합물의 거울상 이성질체는 참조 문헌으로서 전문이 그대로 본문에 포함되는 PCT 특허 공개 제 WO2004004632호와 본 출원인의 국제특허 출원 제 PCT/IB2006/052294호에 개시된 방법에 따라 얻을 수 있다. 화학식 1의 화합물의 거울상 이성질체는 키랄 HPLC 및 효소적 분할 등 본 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법으로도 얻을 수 있다. 다른 방법으로, 화학식 1의 화합물의 거울상 이성질체는 광학 활성인 출발 물질을 이용하여 합성할 수도 있다. 따라서, 화학식 1의 CDK 저해제는 가능한 모든 입체 이성질체와 이들의 혼합물을 포함하는 것으로 정의된다. 화학식 1은 특정 활성을 갖는 라세미 형태와 분리된 광학 이성질체를 포함하는 것으로 정의된다.
본 발명의 약제 조합물에 이용될 수 있는 종래의 세포독성 항신생물제는 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 젬시타빈 및 유사한 작용 기전을 통해 항암성을 나타내는 유사 세포독성 항신생물제로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
파클리탁셀은 태평양 주목 나무 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)에서 분리된 천연 디테르펜 제품(Rowinsky et. al., J. Natl. Cancer Inst., 82, 1247-1259 (1990))이다. 파클리탁셀의 분리와 그 구조는 J. Am. Chem. Soc. 93, 2325 (1971)에 개시되어 있다. 이는 튜블린 이합체로부터 미세소관의 결합을 촉진하고 탈중합을 방지하여 미세소관을 안정화하는 항미세소관제이다. 파클리탁셀은 난소암 치료((Merkman et al.; Yale Journal Of Biology and Medicine, 64:583, 1991)와 유방암 치료(Holmes et al; J. Nat. cancer Inst., 83; 1797, 1991 )에 있어 임상적 용도가 승인되었다. 그러나, 이는 다른 암의 치료에도 유용하다. 예를 들면, 두경부암 (Forastire et. al., Sem. Oncol., 20: 56, 1990) 및 폐암 (M. Ghaemmaghami et al; Chest; 1 13; 86-91 (1998))의 우수한 치료 가능성이 있는 것으로 여겨져 왔다. 파클리탁셀은 참조 문헌으로 본문에 포함되는, 발명되기 쉬운 암(susceptible cancers)을 치료하기 위한 용도와 그것의 투여를 교시하는 미국 특 허 제 5,670,537호에 개시되어 있다. 파클리탁셀은 주사액, Taxol®로 시판되고 있다. 파클리탁셀을 단일 요법으로 이용하면 일반적으로 과민 반응, 저혈압, 서맥, 고혈압, 오심 및 구토 및 주사 부위 반응을 포함하는 바람직하지 않은 부작용이 수반된다.
도세탁셀은 탁산류에 속하고, 파클리탁셀의 반-합성 유도체이다. 도세탁셀은 주로 유방암과 비소세포폐암에 효능이 있다. 이는 다른 암의 치료에도 유용하다. 이 화합물은 참조 문헌으로 본문에 포함되는 도세탁셀의 합성과 발병되기 쉬운 암의 치료를 위한 그것의 용도를 교시하는 미국 특허 제 4,814,470호에 개시되어 있다. 도세탁셀 삼수화물은 탁소텔®이라는 주사액으로 시판되고 있다. 도세탁셀을 포함한 탁소이드 유도체를 매개로 하는 치료 방법은 모두 골수억제, 호중구감소증, 과민증, 말초 신경장애, 수액 정체 등 심각하고 문제시되는 독성을 나타낼 수 있다(Fumoleau et al., Bull. Cancer, (82)8: 629-636 (1995)).
독소루비신은 일반명이 아드리아마이신(Adriamycin®)이고, 주사액으로 시판되고 있다. 독소루비신 먼저 스트렙토마이세스 페우세티우스 바르 카에시우스 (reptomyces peucetius var caesius) 발효액 (미국 특허 제 3,590,028호)에서 분리된다. 이러한 세포독성 항신생물제는 이중 나선의 평면상 안트라사이클린 세포핵의 특정 흡장(intercalation)에 의해 핵산과 결합하여, 비정상적인 세포 복제를 야기한다. 독소루비신은 유방암, 전립선암, 간암, 폐암, 위암 및 갑상선암과; 골조직 및 연조직 육종과; 임파종 및 백혈병과; 어린이 종양의 치료에 이용된다. 독소 루비신을 이용하면 일반적으로 골수억제, 오심 및 구토, 점액피부 및 심장 효과를 포함한 부작용이 수반된다.
젬시타빈의 일반명은 2'-데옥시-2',2'-디플루오로 사이티딘이다. 이는 단일염산염과 β-이성질체로 시판되고 있다. 젬시타빈은, 본문에 참조 문헌으로 포함되는, 젬시타빈의 합성 방법과 발병하기 쉬운 암의 치료를 위한 그것의 용도를 교시하는 미국 특허 제 4,808,614호 및 제 5,464,826호에 개시되어 있다. 단일 성분으로서 젬시타빈 염산염의 상업용 제제는 국부진행성 또는 전이성 췌장선암이나 폐세포암 (NSCLC) 환자에 있어 가장 중요한 치료제로서의 효능이 있고, 이미 5-플루오로우라실 치료받은 환자에 통상적으로 이용된다.
앞서 사용하고, 이제부터 사용하는 일반적인 용어는 다른 언급이 없는 한, 본 명세서 문맥에서 다음을 의미하는 것이 바람직하다.
단수형("a," "an," 및 "the")은 문맥에서 명확하게 달리 언급하지 않는 한 복수형을 포함한다.
"항신생물제(antineoplastic agent)"라는 용어는 "화학치료제( chemotherapeutic agent)" 또는 "항암제(anticancer agent)"와 의미가 같으며, 종양 성장을 저해하거나 예방하는 작용을 하는 치료제를 말한다. "항신생물제(antineoplastic agent)" 또는 "항암제(anticancer agent)"라는 용어는 일반적으로 암세포의 증식을 방지하는 화합물(즉, 항증식제)을 말한다. 일반적으로, 항신생물제(들)은 항증식 세포독성제와 항증식 세포증식 억제제의 두 종류로 분류된다. 세포독성제는 (1) 세포의 DNA 복제능을 방해하고 (2) 암세포에서 세포 사멸 및/또 는 아포토시스를 유도하여 암세포의 증식을 방지한다. 항증식성 세포증식 억제제는 세포 증식을 조절하는 세포의 신호 변환 과정을 조정하거나, 방해하거나 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 약제 조합물에 포함된 항신생물제는 세포독성제이므로, 세포독성 항신생물제로 칭한다.
본문에서 사용된 "synergistic(상승)"이라는 용어는 본 발명의 방법과 조합물로 얻을 수 있는 효과가 세포독성 항신생물제(들) 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염과, 화학식 1의 CDK 저해제, 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매 화합물을 별개로 이용한 경우에 초래되는 전체 효과보다 큰 것을 의미한다. 이러한 상승은 같은 양 이용하더라도 효능이 더 우수하고(우수하거나), 다중 약물 내성의 형성을 방지하거나 지연함을 의미한다.
본문에서 사용된 "치료에 유효한 양(therapeutically effective amount)"이라는 용어는 비증식 세포의 세포독성을 최소화하면서, 증식 세포의 아포토시스를 최대화할 수 있는 화학치료제의 양을 말한다.
"아포토시스(apotosis)"라는 용어는 세포가 일련의 분자 단계를 거치면서 사멸되는 세포 사멸의 일종을 말한다. 이는 불필요하나 비정상적인 세포를 제거하는 인체의 정상적인 방법이다. 아포토시스 과정은 암세포에 의해 차단될 수 있다. 이는 세포예정사(암 용어 사전, 국제 암 연구소)로도 불리운다.
본문에서 사용된 "아포토시스의 증가(increasing apotosis)"는 세포예정사비의 증가로 정의된다. 다시 말해, 세포독성 항신생물제 단독이나, CDK 저해제 단독으로 노출(접촉)되는 경우에 비해, 많은 세포가 사멸 과정을 겪는 것을 말한다.
본문에서 사용된 "대상(subject)"이라는 용어는 치료, 관찰 또는 실험의 객체가 되는 동물을 말하며, 바람직하게는 포유류이고, 가장 바람직하게는 인간이다.
일 실시예에 있어, 본 발명은 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신 또는 젬시타빈으로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포독성 항신생물제, 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염과; 화학식 1(본문에서 설명함)의 화합물로부터 선택되는 적어도 하나의 사이클린 의존성 키나제 (CDK) 저해제 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매 화합물을 포함하는 신규 암 치료용 약제 조합물에 관한 것이다.
일 실시예에서, 본문에서 설명한 화학식 1의 CDK 저해제와 세포독성 항신생물제를 포함하는 약제 조합물은 상기 성분들의 물리적 조합에 의해 얻을 수 있는 조합물에 제한되지 않고, 조합물의 최대 효능을 얻을 수 있도록 동시에, 차례로, 또는 일정 시간 간격을 두고 별도로 투여될 수 있는 조합물을 포함한다. 이에 따라, 약제 조합물은 효과적인 암 치료를 위해 동시에 또는 일정 시간의 간격을 두고 투여될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 화학식 1의 화합물로부터 선택되는 CDK 저해제는 이를 테면, 세포독성 항신생물제의 투여 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 세포독성 항신생물제 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염은 후술되는 용량의 화학식 1의 CDK 저해제 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매 화합물을 투여하기 전에 투여될 수 있다. 그러나, 본 기술 분야의 당업자는 본 명세서에 포함되는 하기 일반적인 기술과 정보를 통해 이러한 조건으로 CDK 저해제와 세포독성 항신생물제의 투여하는 최적의 방법과 과정 을 적절히 선택할 수 있을 것이다.
일 실시예에서, 본 조합에 포함되는 성분들은 물리적 및 화학적 특성이 다르므로 다른 경로로 투여되어야 한다. 이를 테면, 화학식 1의 CDK 저해제는 적절한 혈액 농도를 형성하고 이를 유지하도록 경구 또는 비경구 투여될 수 있으나, 세포독성 항신생물제(들)은 정맥, 피하 또는 근육으로 비경구 투여될 수 있다.
경구용 화학식 1의 CDK 저해제는, 이를 테면, 정제 또는 캡슐, 분말, 분산성 과립, 또는 교갑, 또는 수용액 또는 현탁액의 형태로 투여될 수 있다. 경구용 정제인 경우에는, 락토오즈, 옥수수전분, 탄산 마그네슘, 활석 및 당을 포함한 통상적으로 이용되는 담체와 스테아린산 마그네슘 등 윤활제를 통상적으로 첨가한다. 캡슐 형태로 경구 투여하는 경우 유용한 담체는 락토오즈, 옥수수전분, 탄산 마그네슘, 활석 및 당을 포함한다.
근육내, 복강내, 피하내 및 정맥내 투여에 있어, 활성 성분 (세포독성 항신생물제(들) 또는 CDK 저해제) 살균액을 대개 이용하고, 용액의 pH는 적절하게 조절하고 버퍼링하여야 한다.
다른 실시예에 있어, 본 발명은 치료에 유효한 양의 조합물을 치료가 필요한 대상에게 투여하여 상승 효과를 얻는 것을 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 방법에서는, 암의 치료에 유효한 양의 세포독성 항신생물제와 함께, 화학식 1(본문에서 설명함)의 화합물로부터 선택되는 CDK 저해제 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매 화합물의 치료에 유효한 양을 치료가 필요한 대상에게 투여하여 암을 치료하고 상승 효과를 얻는다.
전술한 바와 같이, 본 약제 조성물에 포함되는 활성 성분은 동시에 또는 차례로 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르면, 암 치료 방법은 치료를 필요로 하는 대상에게 치료에 유효한 양의 세포독성 항신생물제를 치료에 유효한 양의 화학식 1(본문에서 설명함)의 화합물로 나타내는 CDK 저해제와 동시에 투여하는 것을 포함한다.
일 실시예에 있어, 본 암 치료 방법은 치료를 필요로 하는 대상에게 치료에 유효한 양의 세포독성 항신생물제와, 치료에 유효한 양의 화학식 1(본문에서 설명함)의 화합물로 나타내는 CDK 저해제를 차례로 투여하는 것을 포함한다.
다른 실시예에 있어, 본 암 치료 방법은 치료를 필요로 하는 대상에 화학식 1(본문에서 설명함)의 화합물로 나타내는 CDK 저해제를 투여하기 전에, 치료에 유효한 양의 세포독성 항신생물제를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법과 약제 조합물은 유방암, 폐암 (소세포 및 비소세포폐암 및 폐 선암 포함), 난소암, 췌장암 (외분비성 췌장암 포함), 위암, 결장직장암 및 간세포성암을 포함하는 군으로부터 선택되는 암의 치료에 이용될 수 있다.
바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 약제 조합물은 비소세포폐암과 췌장암으로부터 선택되는 암의 치료에 이용될 수 있다.
상기 조합물의 활성 성분의 실제 용량은 치료되는 환자의 필요 요건과 상태의 심각도에 따라 달라질 수 있다. 특정 상태에 적절한 용량은 본 기술 분야의 기술에서 결정될 수 있다. 일반적으로, 화합물의 최적량보다 적은 소량으로 치료를 시작한다. 그 이후, 각 성분의 용량은 상황에 따라 최적의 효과를 얻을 수 있을 때까지 조금씩 증가된다. 그러나, 약제 조합물의 각 성분량은 단독 투여하는 경우에 치료 효과를 나타내는 양보다 적은 것이 전형적이다. 편의를 위해, 총 일일복용량은 필요에 따라 하루에 나누어 분리 투여될 수 있다. 바람직한 실시예에 있어, 세포독성 항신생물제 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염과, 화학식 1의 화합물로 나타내는 CDK 저해제 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물은, 세포독성 항신생물제는 10 mg 내지 1400 mg 범위, 바람직하게는 15 mg 내지 1000 mg의 범위 내에서 상승 유효량 투여하고, CDK 저해제는 5 mg 내지 750 mg, 바람직하게는 10 mg 내지 300 mg 범위 내에서 상승 유효량 투여할 수 있도록 주사 형태로 차례로 투여한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 세포독성 항신생물제는 파클리탁셀이고, 이는 30 mg 내지 300 mg 범위 내에서 상승 유효량 투여된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에 있어서, 세포독성 항신생물제가 도세탁셀인 경우, 이는 20 mg 내지 175 mg 범위 내에서 상승 유효량 투여된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에 있어서, 세포독성 항신생물제가 독소루비신인 경우, 이는 17.5 mg 내지 75 mg 범위 내에서 상승 유효량 투여된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에 있어서, 세포독성 항신생물제가 젬시타빈인 경우, 이는 70 mg 내지 1,200 mg 범위 내에서 상승 유효량 투여된다.
본 발명에 의해 제공되는 조합물은 특정 분석 시스템과 시험관내 여러 상이한 투여 스케줄로 측정되었다. 실험에 대한 상세한 설명은 본문에서 후술된다. 본문에 제시하는 데이타는 세포독성 항신생물제를 화학식 1의 CDK 저해제와 병용하 면 상승 효과가 나타남을 명백하게 보여준다. 암 치료에 항암제를 병용하는 경우에, 암 세포를 화학식 1의 CDK 저해제 단독이나, 세포독성 항신생물제 단독으로 치료하는 경우보다, 증식 세포의 아포토시스 또는 세포 독성이 증가되는 것이 명백하게 나타났다. 예를 들면, 표 2 내지 표 4에 나타낸 데이타로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, 비소세포 폐암 H-460 세포에 대한 시험관 내 분석에서 CDK 저해제인화학식 1의 대표적인 화합물 (본문에서는 화합물 A로 칭하기로 함)은 독소루비신의 세포독성을 상호보완적으로 증진하였다.
본 약물 분석에 사용한 대표적인 화합물인 화합물 A은 (+)-트랜스-2-(2-클로로-페닐)-5,7-디하이드록시-8-(2-하이드록시메틸-1-메틸-피롤리딘-3-일)-크로멘-4-온 하이드로클로라이드이고, 이는 본문에 참조 문헌으로 포함되는 PCT 특허 공개 출원 제 WO2004004632호에 개시된 화합물 중 하나이다.
본 발명자는 시험관 내 관찰을 생체내 시스템으로 확장하는 이종이식 모델도 확립하였다. 본 발명자는 본 발명의 비소세포 폐 이종 이식 모델로서 중증 복합형 면역 부전증 (SCID) 수컷 마우스를 이용하여 조합물의 생체내 효능을 시험하였다. CDK 저해제는 독소루비신과 함께 차례로 투여하는 경우 독소루비신의 효능을 증진하는 것이 관찰되었다. 도 7a 및 7b에 나타낸 그래프로부터 자명한 바와 같이, 본 발명의 약제 조합물은 SCID 마우스의 비소세포 폐 이종 이식 모델에서 상승적인 치료 효과를 나타냈다.
이에 대응하여, 종래의 세포독성 항신생물제인 독소루비신과, 다른 공지된 CDK 저해제인 플라보피리돌을 포함하는 조합물을 인체 비소세포 폐암 H-460 세포 주에 이용하는 시험관내 연구에서, 본 발명자는 투여 순서와는 상관없이, 독소루비신과 플라보피리돌을 조합하면 부가적인 효과를 얻을 수 있고, 상승 효과는 나타나지 않음을 발견하였다 (표 16-A,B,C). 이 연구의 세부 사항은 후술할 것이다.
따라서, 다른 작용 기전을 갖는 항암제를 조합하면 항상 유리한 치료 효능을 얻을 수 있다고 확신할 수는 없다. 그러나, 본 발명자는 본 발명의 신규 약제 조합물의 상승 효능을 명백하게 증명하였다.
이제부터, 바람직한 실시예를 참조로 하여 본 발명의 세포독성 항신생물제와 CDK 저해제를 포함하는 신규 약제 조합물의 상승 효과를 상세히 설명할 것이다. 이러한 실시예는 예시 목적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명을 제한하는 것을 의도한 것은 아니다.
약리학적 분석:
시험관 내 세포독성 분석:
사용한 세포독성 분석은 MTS (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움, 내부 염) 분석이다. 배양 배지 180 μl의 96-웰 플레이트에 인체 비소세포 폐암 H-460 세포를 1,500 세포수/웰의 밀도로 시딩하고, 밤새 배양하여 세포가 부착되게 하였다. 농도를 변화시키면서 조합물에 함유되는 약물을 웰에 첨가하고, 단일 약물을 접하는 경우에는 5% 습도 37℃ 배양기에서 적절한 시간 배양하였다. 두 종류의 약물을 처리하는 경우에는, 3시간 내지 24시간 동안 종래의 세포독성 항신생물제 (파클리탁셀, 도세탁셀 및 독소루비신)를 투여한 후, 배지를 제거하고, 배지로 세포를 1회 세척하였다. 세포 세척 후, 농도가 다른 두 화합물 A를 배지에 첨가하고, 플레이트를 5% 습도, 37℃ 배양기에서 48, 72 또는 96 시간 배양하였다. 대조군 웰은 비하이클 처리하였다. 배양 후, 웰에서 배지를 제거하고, MTS (인산염 버퍼 식염수 중 2 mg/mL, pH 6-6.5, 여과 살균) 20 μl과 페나진 메토설페이트 (PMS, 인산염 버퍼 식염수 중 3 mM, pH 7.3, 여과 살균) 1 μl을 웰에 첨가하고, 완전 배지로 전체 부피를 200 μL로 맞추었다. 플레이트는 5 % 습도, 37℃ 배양기에서 2-4 시간 배양하였다. 플레이트는 분광광도계(SpectraMax, Molecular Devices), 490 nM에서 읽었다; SoftMax (SpectraMax사 소프트웨어)를 이용하여 세포독성(%)과 IC50를 측정하였다.
실시예 1:
본 실시예는 화합물 A보다 먼저 독소루비신을 투여하는 방법으로 독소루비신과 화합물 A을 차례로 투여한 방법으로 독소루비신과 화합물 A을 조합한 경우의 상승 효과를 나타낸다. 인체 비소세포 폐암 H-460 세포는 1,500 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 우선, 세포는 약물 단독, 즉, 독소루비신 또는 화합물 A만을 처리하였다. 독소루비신 처리는 24 시간 독소루비신 처리한 후, 72 시간 완전 배지처리하여 수행하는 것과는 달리, 화합물 A의 경우에는, 처음 24 시간은 완전 배지 처리한 후, 72 시간 화합물 A 처리하였다. 독소루비신의 사용 농도는 100 nM와 200 nM이었고, 화합물 A의 농도는 800 nM (48시간 처리 후 IC3O 농도)이었다. 조합 연구에서, 세포는 초기 24 시간 200 nM 또는 100 nM 독소루비신 처리한 후, 72 시간 800 nM 화합물 A 처리하였다. 약물 처리가 종료된 후 (즉, 96 시간 후), 플레이트 의 MTS 생존능 분석을 수행하고, 대조군에 대한 세포독성(%)을 계산하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
약물 처리 독소루비신 농도 (nM) CDK 저해제 (화합물 A) 농도 (nM) 세포독성(%)
독소루비신 200 0 19
100 0 16
CDK 저해제 (화합물 A) 0 800 17
독소루비신 (24시간) 후, CDK 저해제 (화합물 A, 72 시간) 200 800 53
100 800 46
실시예 2:
본 실시예는 화합물 A보다 먼저 독소루비신을 투여하는 방법으로 독소루비신과 화합물 A을 차례로 투여하는 방법으로 독소루비신과 화합물 A을 조합 처리한 경우의 상승 효과를 나타낸다. 본 실시예에서, 화합물 A은 1,200 nM의 농도로 이용하였다. 인체 비소세포 폐암 H-460 세포는 1,500 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 세포는 우선 약물 단독, 즉, 독소루비신 또는 화합물 A 단독 처리하였다. 독소루비신 처리는 처음 24 시간 독소루비신 처리한 후, 72 시간 완전 배지 처리하여 수행하는 반면, 화합물 A의 경우는, 처음 24 시간은 완전 배지 처리하고, 72 시간 화합물 A 처리하였다. 독소루비신의 사용 농도는 200 nM와 100 nM이었고, 화합물 A의 농도는 1,200 nM (48 시간 처리 후 IC5O 농도)이었다. 조합 연구에서, 세포는 먼저 24 시간 100 nM 또는 200 nM 독소루비신 처리한 후, 72 시간 1,200 nM 화합물 A를 처리하였다. 약물 처리 후 (즉, 96 시간 후), 플레이트의 MTS 생존능 분석을 수행하고, 대조군에 대한 세포독성(%)을 계산하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
약물 처리 독소루비신 농도 (nM) CDK 저해제 (화합물 A) 농도 (nM) 세포독성(%)
독소루비신 200 0 19
100 0 16
CDK 저해제 (화합물 A) 0 1200 36
독소루비신 (24시간) 후, CDK 저해제 (화합물 A, 72 시간) 200 1200 70
100 1200 67
실시예 3:
본 실시예는 화합물 A보다 먼저 독소루비신을 투여하는 방법으로 독소루비신과 화합물 A을 차례로 투여한 경우에 독소루비신과 화합물 A의 조합의 상승 효과를 나타낸다. 본 실시예에서는, 화합물 A는 1,200 nM의 농도로 이용하였고, 시간 간격은 96 시간이었다. 인체 비소세포 폐암 H-460 세포는 1,500 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 우선, 세포는 약물 단독, 즉, 독소루비신 또는 화합물 A 단독 처리하였다. 독소루비신 처리는 최초 24 시간 독소루비신 처리한 후, 96 시간 완전 배지로 처리하여 수행하며, 화합물 A의 경우는, 처음 24 시간은 완전 배지 처리한 후, 96 시간 화합물 A 처리하였다. 사용한 독소루비신의 농도는 200 nM와 100 nM이었고, 화합물 A는 1,200 nM (48 시간 처리 후 IC5O 농도)의 농도로 이용하였다. 조합 연구에 있어, 세포는 먼저 24 시간 100 nM 또는 200 nM 독소루비신 처리한 후, 96 시간 1,200 nM 화합물 A를 처리하였다. 약물 처리가 종료된 후 (즉, 120 시간 후), 플레이트의 MTS 생존능 분석을 수행하고, 대조군에 대한 세포독성(%)을 계산하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
약물 처리 독소루비신 농도 (nM) CDK 저해제 (화합물 A) 농도 (nM) 세포독성(%)
독소루비신 200 0 17
100 0 8
CDK 저해제 (화합물 A) 0 1200 32
독소루비신 (24시간) 처리 후, CDK 저해제 (화합물 A, 96 시간) 200 1200 73
100 1200 69
실시예 4:
본 실시예는 120 시간 동안 동시에 투여하는 독소루비신과 화합물 A의 조합물의 상승 효과를 나타낸다. 인체 비소세포 폐암 H-460 세포는 1,500 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 우선, 세포는 각각 120 시간, 약물 단독, 즉, 독소루비신 또는 화합물 A 단독 처리하였다. 사용한 독소루비신의 농도는 30 nM와 100 nM이었고, 화합물 A는 800 nM과 1200 nM (48 시간 처리 후 IC30 및 IC5O 농도)의 농도로 이용하였다. 본 조합 연구에서는, 30 nM 또는 100 nM 독소루비신과, 1200 nM 또는 800 nM 화합물 A을 120 시간 함께 첨가하였다. 약물 처리 후 (즉, 120 시간 후), 플레이트의 MTS 생존능 분석을 수행하고, 대조군에 대한 세포독성(%)을 계산하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
약물 처리 독소루비신 농도 (nM) CDK 저해제 (화합물 A) 농도 (nM) 세포독성(%)
독소루비신 100 0 19
30 0 3
CDK 저해제 (화합물 A) 0 1200 44
0 800 24
독소루비신 및 CDK 저해제 (화합물 A) 동시 처리 (120 시간) 100 800 61
30 1200 60
실시예 5:
본 실시예는 화합물 A을 세포독성 항신생물제인 독소루비신보다 먼저 투여하는 경우에 상승 효과가 없음을 보여준다. 인체 비소세포 폐암 H-460 세포는 1,500 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 우선, 세포는 약물 단독, 즉, 독소루비신 또는 화합물 A을 단독 처리하였다. 화합물 A은 먼저 96 시간 처리한 후, 24 시간 완전 배지 처리하는 반면에, 독소루비신의 경우, 완전 배지에서 96 시간 처리한 후, 24 시간 독소루비신 처리하였다. 사용한 독소루비신의 농도는 30 nM, 70 nM, 100 nM 및 200 nM이었고, 화합물 A는 800 nM와 1200 nM (48시간 처리 후 IC3O 및 IC50 농도)의 농도로 이용하였다. 본 조합 연구에 있어, 세포는 초기 96 시간 1,200 nM 또는 800 nM 화합물 A 처리한 후, 72 시간 30 nM, 70 nM, 100 nM 및 200 nM 독소루비신 처리하였다. 약물 처리 후 (즉, 120 시간 후), 플레이트의 MTS 생존능 분석을 수행하고, 대조군에 대한 세포독성(%)을 계산하였다. 표 6은 화합물 A을 단독 투여하는 경우보다, 상기 조합의 세포독성(%)이 낮음을 보여준다. 그러므로, 독소루비신은 최초 약물(이 경우, 화합물 A)의 효능을 증진하지 못하므로, 이러한 시퀀스 효과는 길항적이다. 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
독소루비신 농도 (nM) CDK 저해제 (화합물 A) 농도 (nM) 세포독성(%) [CDK 저해제 (화합물 A, 96 시간) 후, 독소루비신 처리 (24 시간)
200 1200 46
800 16
100 1200 45.6
800 15
70 1200 42.3
800 14
30 1200 41
800 17.5
0 1200 52
0 800 19
실시예 1 내지 4는 CDK 저해제를 세포독성제보다 나중에 또는 그와 동시에 투여하는 경우에, CDK 저해제가 독소루비신의 효과를 상승시킴을 보여준다. 실시예 5는 순차적 투여의 중요성도 보여준다. 독소루비신 후 CDK 저해제를 처리하면, 상승 효과가 있으나, 역순서인 경우에는 효과가 없다.
실시예 6:
본 실시예는 화합물 A보다 먼저 도세탁셀을 투여하는 방법으로 도세탁셀과 화합물 A을 차례로 투여한 경우에 도세탁셀과 화합물 A의 조합의 상승 효과를 나타낸다. 인체 비소세포 폐암 H-460 세포는 3,000 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 우선, 세포는 약물 단독, 즉, 도세탁셀 또는 화합물 A를 단독 처리하였다. 도세탁셀처리는 3 시간 도세탁셀 처리한 후, 45 시간 완전 배지 처리하여 수행하는 반면에, 화합물 A의 경우는, 우선 3시간 완전 배지 처리한 후, 45 시간 화합물 A 처리하였다. 사용한 도세탁셀 농도는 0.1 nM와 3 nM이었고, 화합물 A는 700 nM (48 시간 처리 후 IC3O 농도)의 농도로 이용하였다. 본 조합 연구에 있어, 세포는 먼저 3시간 0.1 nM 또는 3 nM 도세탁셀 처리한 후, 45시간 700 nM 화합물 A 처리하였다. 약물 처리 후 (즉, 48 시간 후), 플레이트의 MTS 생존능 분석을 수행하고, 대조군에 대한 세포독성(%)를 계산하였다. 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
약물 처리 도세탁셀 농도 (nM) CDK 저해제 (화합물 A) 농도 (nM) 세포독성(%)
도세탁셀 3 0 2
0.1 0 0
CDK 저해제 (화합물 A) 0 700 13
도세탁셀 (3시간) 후, CDK 저해제 (화합물 A, 45 시간) 3 700 33
0.1 700 30
실시예 7:
본 실시예는 화합물 A보다 먼저 도세탁셀을 투여하는 방법으로 도세탁셀과 화합물 A을 차례로 투여한 경우에 도세탁셀과 화합물 A 조합의 상승 효과를 나타낸다. 인체 비소세포 폐암 H-460 세포는 3,000 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 우선, 세포는 약물 단독, 즉, 도세탁셀 또는 화합물 A을 단독 처리하였다. 도세탁셀처리는 3 시간 도세탁셀 처리한 후, 45시간 완전 배지 처리하여 수행하며, 화합물 A의 경우에는, 우선 3시간 완전 배지 처리한 후, 45 시간 화합물 A 처리하였다. 사용한 도세탁셀 농도는 0.1 nM와 3 nM이었고, 화합물 A는 1,000 nM (48 시간 처리 후 IC5O 농도)의 농도로 이용하였다. 본 조합 연구에 있어, 세포는 먼저 3 시간 0.1 nM 또는 3 nM 도세탁셀 처리한 후, 45 시간 700 nM 화합물 A를 처리하였다. 약물 처리 후 (즉, 48 시간 후), 플레이트의 MTS 생존능 분석을 수행하고, 대조군에 대한 세포독성(%)을 계산하였다. 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
약물 처리 도세탁셀 농도 (nM) CDK 저해제 (화합물 A) 농도 (nM) 세포독성(%)
도세탁셀 3 0 2
0.1 0 0
CDK 저해제 (화합물 A) 0 1000 35
도세탁셀 (3시간) 후, CDK 저해제 (화합물 A, 45 시간) 3 1000 53
0.1 1000 52
실시예 8:
본 실시예는 화합물 A보다 먼저 파클리탁셀을 투여하는 방법으로 파클리탁셀과 화합물 A을 차례로 투여한 경우에 파클리탁셀과 화합물 A 조합의 상승 효과를 나타낸다. 인체 비소세포 폐암 H-460 세포는 1,500 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 우선, 세포는 약물 단독, 즉, 파클리탁셀 또는 화합물 A을 단독 처리하였다. 파클리탁셀 처리는 3 시간 파클리탁셀 처리한 후, 45 시간 완전 배지 처리하여 수행하는 반면에, 화합물 A의 경우에는, 우선 3시간 완전 배지 처리한 후, 45 시간 화합물 A 처리하였다. 사용한 파클리탁셀 농도는 10 nM이었고, 화합물 A는 700 nM (48 시간 처리 후 IC3O 농도)의 농도로 이용하였다. 본 조합 연구에 있어, 세포는 먼저 3 시간 10 nM 파클리탁셀 처리한 후, 45 시간 700 nM 화합물 A를 처리하였다. 약물 처리가 종료된 후 (즉, 48 시간 후), 플레이트의 MTS 생존능 분석을 수행하고, 대조군에 대한 세포독성(%)을 계산하였다. 그 결과는 하기 표 8에 나타내었다.
약물 처리 파클리탁셀 농도 (nM) CDK 저해제 (화합물 A) 농도 (nM) 세포독성(%)
파클리탁셀 10 0 10
CDK 저해제 (화합물 A) 0 700 21
파클리탁셀 (3시간) 후, CDK 저해제 (화합물 A, 45 시간) 10 700 41
실시예 9:
본 실시예는 화합물 A보다 먼저 젬시타빈을 투여하는 방법으로 젬시타빈과 화합물 A을 차례로 투여한 경우에 젬시타빈과 화합물 A 조합의 상승 효과를 나타낸다. 인간 췌장 (Panc-1) 세포주는 1,500 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 우선, 세포는 약물 단독, 즉, 젬시타빈 또는 화합물 A을 단독 처리하였다. 젬시타빈 처리는 24 시간 젬시타빈 처리한 후, 72 시간 완전 배지로 처리하여 수행하는 반면에, 화합물 A의 경우에는, 우선 24 시간 완전 배지 처리한 후, 72 시간 화합물 A 처리하였다. 사용한 젬시타빈 농도는 70 nM이었고, 화합물 A는 300 nM (48 시간 처리 후 IC3O 농도)의 농도로 이용하였다. 본 조합 연구에서는, 세포는 먼저 24 시간 70 nM 젬시타빈 처리한 후, 72시간 300 nM 화합물 A를 처리하였다. 약물 처리 후 (즉, 96 시간 후), 플레이트의 MTS 생존능 분석을 수행하고, 대조군에 대한 세포독성(%)을 계산하였다. 그 결과는 하기 표 9에 나타내었다.
약물 처리 젬시타빈 농도 (nM) CDK 저해제 (화합물 A) 농도 (nM) 세포독성(%)
젬시타빈 200 0 78
100 0 38
70 0 18
30 0 2
CDK 저해제 (화합물 A) 0 300 34
젬시타빈 (24시간) 후, CDK 저해제 (화합물 A, 72 시간) 200 300 97
100 300 82
70 300 74
30 300 53
세포주기 분포 분석 및 유세포 분석
25 mm3 조직 배양 플라스크에 인체 비소세포 폐암 H-460을 시딩하였다. 24 시간 후, 72 시간 또는 96 시간 세포를 화합물 A 단독 처리하고, 세포독성 항신생물제인 독소루비신만을 24 시간 처리하였다. 조합 연구에서는, 먼저 세포는 세포독성 항신생물제인 독소루비신을 24 시간 처리한 후, 세포독성 항신생물제를 제거하고, 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 화합물 A를 72 시간 또는 96 시간 처리하였다. 대조군 세포는 96 시간이나 120 시간 처리하지 않은 채로 두었다. 분리 세포와 부착 세포 모두 각기 다른 시점에서 수집하였다. 세포는 1000 rpm에서 10분간 원심분리하면서, PBS 약 5 ml로 2회 세척하였다. 세포는 PBS 500 μl로 재현탁하고, 빙냉 70% 에탄올 500 μL로 고정하였다. 고정 세포는 실온에서 30분간 배양하고, 1,000 rpm으로 10분간 스피닝하였다. 세포 펠렛에 70 % 냉각 에탄올 1 ml을 첨가한 후, 이를 추후 분석할 때까지 냉장고에 두었다. 세포를 PBS로 2회 세척하여 부착물을 제거하고, PBS 250 μL에 재현탁하였다. 여기에 프로피디움 요오다이드 50 μl (PBS 중 4 mg/mL)과 Rnase A 12.5 μL (1 mg/mL)를 가하였다. 30분간 37℃에서 배양한 후, 유세포 분석기를 이용하여 세포 분석하였다.
제조자의 권고에 따라 Becton Dickinson FACS Calibur 유세포 분석기를 이용하였다. 여기원으로 488 nm 아르곤 이온 레이저를 이용하였다. 적형광 수치로 정의되는 바와 같이, DNA 함량이 2n 내지 4n인 세포를 세포 주기의 Gi, S 및 G2/M 단계인 것으로 칭하였다. DNA 함0량이 2n보다 낮은 세포는 sub-Gi 세포로 칭하였다. 각 세포 주기 분획 내 세포수는 존재하는 세포의 전체수의 백분율로 나타내었다.
실시예 10:
본 실시예는 도 1에 나타낸 바와 같이 다양한 처리를 위한 세포 주기 분포를 부여한다. 처리군의 조직 배양 플라스크에 약 1-2 x 106 세포를 시딩하였다. 분석 프로토콜은 전술한 바와 같이 "세포 주기 분포 분석 및 유세포 분석(analysis of cell cycle distribution and flow cytometry)"이었다. 세포 주기는 도 1에서 M1, M2, M3 및 M4으로 나타내는 4 부분으로 나누었다. M1은 G1 단계에 대응되고, M2는 S 단계에 대응되고, M3는 G2-M 단계에 대응되고, M4는 sub G1 단계에 대응되며, 이는 아포토시스를 겪은 세포를 나타낸다. 약물 처리를 하지 않은 96 시간 대조군은 무시할만한 정도(2 %)의 아포토시스를 나타내는 반면에, 화합물 A와 독소루비신 모두에 대하여, 단독 처리한 처리군은 10 %의 아포토시스만을 나타내었다. 두 약물을 함께 투여한 경우, 아포토시스는 34 %로 증가하였다.
실시예 11:
본 실시예는 도 2에 나타낸 바와 같이 다양한 처리를 위한 세포 주기 분포를 부여한다. 처리군의 조직 배양 플라스크에 약 1-2 x 106 세포를 시딩하였다. 분석 프로토콜은 전술한 바와 같이 "세포 주기 분포 분석 및 유세포 분석(analysis of cell cycle distribution and flow cytometry)"이었다. 세포 주기는 도면에서 M1, M2, M3 및 M4으로 나타내는 4 부분으로 나누었다. M1은 G1 단계에 대응되고, M2는 S 단계에 대응되고, M3는 G2-M 단계에 대응되고, M4는 sub G1 단계에 대응되며, 이는 아포토시스를 겪은 세포를 나타낸다. 약물 처리를 하지 않은 120 시간 대조군은 무시할만한 정도(8 %)의 아포토시스를 나타내는 반면, 화합물 A 또는 독소루비신을 단독 처리한 처리군은 각각 32%와 3% 아포토시스를 나타내었다. 두 약물을 함께 투여한 경우, 아포토시스는 65%로 증가하였다.
실시예 12:
본 실시예는 도 3에 나타낸 바와 같이 다양한 처리를 위한 세포 주기 분포를 부여한다. 처리군의 조직 배양 플라스크에 약 1-2 x 106 췌장 세포(Panc-1)를 시딩하였다. 분석 프로토콜은 전술한 바와 같이 "세포 주기 분포 분석 및 유세포 분석(analysis of cell cycle distribution and flow cytometry)"이었다. 세포 주기는 도면에서 M1, M2, M3 및 M4으로 나타내는 4 부분으로 나누었다. M1은 G1 단계에 대응되고, M2는 S 단계에 대응되고, M3는 G2-M 단계에 대응되고, M4는 sub G1 단계에 대응되며, 이는 아포토시스를 겪은 세포를 나타낸다. 약물 처리를 하지 않은 96 시간 대조군은 무시할만한 정도(2.1 %)의 아포토시스를 나타내는 반면에, 화합물 A와 젬시타빈을 단독 처리한 처리군은 각각 4.3%와 1.7%의 아포토시스를 나타내었다. 두 약물을 함께 투여한 경우, 아포토시스는 25.4%로 증가하였다.
실시예 13:
아넥신(Annexin) V-FITC 염색 (조기 아포토시스의 검출 목적)
아넥신 V-FITC은 아포토시스 세포를 분별하는 민감한 탐침기이다. 조기 아포토시스 중에 인지질막인 포스파티딜세린 (phosphatidylserine, PS)은 원형질막의 내부에서 외부 리플릿으로 역좌되어, PS가 외부 세포 환경에 노출된다. 아넥신 V은 높은 PS 친화성을 갖고, 노출된 PS와 함께 세포에 결합되는 35-36 kDa 칼슘 인지질 결합 단백질이다. 프로피디움 아이오다이드 (Pl)은 막의 누출부를 통해 세포에 진입하여 후기 아포토시스 검출에 FITC와 병용되는 극성 염료이다.
25 mm3 조직 배양 플라스크에 인체 비소세포 폐암 H-460 를 시딩하였다. 24 시간 후, 세포는 1200 nM 화합물 A 또는 100 nM 독소루비신을 96 시간과 24 시간 각각 단독 처리하였다. 조합 연구에서, 세포는 세포독성 항신생물제인 독소루비신 100 nM을 24 시간 처리한 후, 세포독성 항신생물제(독소루비신)을 제거하고, 배지로 세포를 1회 세척한 후, 1,200 nM 화합물 A을 96 시간 처리하였다. 대조군 세포는 120 시간 처리하지 않고 두었다. 부유 세포를 함유한 배지를 모으고, 각기 다른 시점에서 트립신으로 부착 세포를 포획한 후 풀링(pooling)하였다. 세포는 1000 rpm에서 10분간 원심분리하면서, 냉각 PBS로 2회 세척하였다. 세포 펠렛은 1 x 106 세포/ml의 농도로 1 X 결합 버퍼 (10 mm HEPES pH 7.4, 140 mM NaCI, 2.5 mM CaCI2)에 현탁하였다. 상기 용액 100 μl (1 x 105 세포)을 아넥신 V-FITC과 프로피디움 아이오다이드로 염색하였다. 15분간 실온 그늘에서 세포 배양하고, 시료는 유세포 분석기로 분석하였다.
제조자의 권고에 따라 Becton Dickinson FACS Calibur 유세포 분석기를 이용하였다. 여기원으로 488 nm 아르곤 이온 레이저를 이용하였다. 도 4는 네 개의 사분면내 세포의 분포를 나타낸다. 좌측 하부 코너에 위치하는 사분면 I (LL)은 FITC과 Pl 음성인 세포를 나타내고, 이들 세포는 건강함을 의미한다. 우측 하부 (LR)에 위치한 사분면 II은 P1에 대해서만 양성인 세포이고, 이들 세포는 완전히 아포토시스됨을 의미한다. 우측 상부 (UR)에 위치한 사분면 III은 아넥신과 Pl 모두에 양성인 세포이고, 이들 세포가 조기 아포토시스에서 말기 아포토시스에 진입함을 의미한다. 죄측 하부(UL)에 위치한 사분면 IV는 아데신만 양성인 세포이고, 이들 세포는 조기 아포토시스를 겪고 있음을 보여준다.
화합물의 노출이 종료되었더라도, 세포가 계속 아포토시스되는 경우, 이들은 아넥신에 양성 염색될 것이다. 조기 아포토시스를 겪은 세포는 세포 예정사되어고, 되돌아가지 않는다. 그 결과는 표 10에 나타내었다. 약물 단독 투여에 비해서, 약물 병합 투여의 경우 가장 많은 퍼센트의 세포가 조기 아포토시스 또는 조기 내지 말기 아포토시스에 진입함을 알 수 있다.
약물 처리 생존 세포 (건강 세포) (%) 아넥신 +ve (%) (조기 아포토시스 세포) 아넥신 + Pl +ve (%) (조기 -말기 아포토시스 세포) 아넥신 +ve (%) (사멸 세포)
대조군 90.5 3 4 2.3
독소루비신 (100 nM) 60 30.4 8.6 1
CDK 저해제 (화합물 A, 1200 nM) 53 38.5 8.2 0.3
독소루비신 후, CDK 저해제 (화합물 A) 14.1 58.2 27.3 1
실시예 14:
클론원성 분석(Clonogenic assay ):
인체 비소세포 폐암 세포 (H-460)는 35 mm 조직 배양 플레이트 당 750-1000 세포의 밀도로 시딩하였다. 37℃에서 밤새 배양하여 플레이트에 세포를 부착시킨다. 세포는 세포독성 항신생물제로 24 시간 처리한 후, 세척하고 화합물 A를 함유하는 새로운 배지를 96 시간 첨가하였다. 처리 종료시, 배지를 10 % FCS를 함유하는 새로운 완전 배지로 교환하고 콜로니 형성을 위해 7-14일간 배양하였다. 플레이트에 식별가능한 콜로니가 나타나면, 배지를 제거하고, 콜로니는 메탄올과 아세트산 혼합물(2:1)로 5분간 고정하였다. 플레이트는 물로 세척하고, 고정 과정을 반복하였다. 플레이트를 건조하고, 콜로니는 0.1 % 결정상 자색 염료로 3-5분간 염색하였다. 플레이트는 조심스럽게 물로 세척하고 콜로니는 Geldoc으로 카운트하였다.
세포는 1200 nM 화합물 A 또는 100 nM 독소루비신만을 각각 96 시간과 24 시간 단독 투여하거나, 100 nM 독소루비신 후 1200 nM 화합물 A을 96 시간 함께 투여하였다. 도 5는 대조군이나 약물 단독 투여한 경우와 비교했을 때, 병용 투여의 경우에만 콜로니가 나타나므로, 병용 투여의 상승 효과를 보여준다.
처리 후 회복 실험
세포를 화합물 A과 독소루비신 단독 또는 이들의 병합 처리한 경우 분석 프로토콜은 세포 주기 분포 분석에서와 같다. 약물 치료 후, 세포는 10% FCS를 함유하는 새로운 완전 배지에서 회복되었다. 회복된 세포는 약물 단독 투여 및 병용 투여의 경우에 있어, FACS 0, 6, 18, 24 및 48 시간을 기점으로 분석하였다. 하기 실시예에서, 세포의 회복은 아포토시스를 겪은 세포의 퍼센트로 나타내었다.
실시예 15:
세포는 세포독성 항신생물제인 독소루비신으로 24 시간 처리한 후, 배지를 제거하고, 새로운 완전 배지로 교환하였다. FACS 분석은 약물 치료 후, 회복 기간 중에 아포토시스를 겪는 세포의 비율의 결정에 특정화된 방법에서 설명한 바와 같이 수행하였다. 아포토시스는 회복 기간 중 0, 6, 18, 24 및 48 시간을 기점으로 결정하였다. 약물 처리 24 시간 후, 아포토시스 비는 3%이었고, 회복 기간 중에 현저하게 증가하지 않았다. 이는 세포가 궁극적으로 약물 처리로부터 회복되었음을 의미한다. 그 결과는 표 11에 나타내었다.
세포독성 항신생물제로서 독소루비신을 24 시간 단독 처리하고, 0, 6, 18, 24 및 48 시간 경과 후 세포 회복
약물 처리(독소루비신 100 nM, 24시간) 아포토시스(%)
0 시간 회복 3
6 시간 회복 5
18시간 회복 4
24시간 회복 5
48시간 회복 4
실시예 16:
상기 프로토콜에서 설명한 바와 같이 분석하였다. 세포는 화합물 A를 96시간 처리한 후, 배지를 제거하고, 새로운 완전 배지로 교체하였다. FACS 분석은 약물 치료 후, 회복 기간 중에 아포토시스를 겪는 세포의 퍼센트 결정 방법에서 설명한 바와 같이 수행하였다. 아포토시스는 회복 기간 중 0, 6, 18, 24 및 48 시간을 기점으로 결정하였다. 96시간 약물 처리 후, 아포토시스 비는 32%이었고, 회복 기간 중에 48 시간 회복 기간 후 24%에서 19%로 감소되고, 이는 세포가 회복 기간이 진행됨에 따라, 점차 회복됨을 나타낸다. 그 결과는 표 12에 나타내었다.
화합물 A 96 시간 단독 처리하고, 0, 6, 18, 24 및 48 시간 경과 후 세포 회복
약물 처리(화합물 A 1200 nM 96 시간) 아포토시스(%)
0 시간 회복 32
6 시간 회복 24
18시간 회복 23
24시간 회복 21
48시간 회복 19
실시예 17:
상기 프로토콜에서 설명한 바와 같이 분석하였다. 세포는 독소루비신을 24시간 처리한 후, 화합물 A를 96시간 처리하고, 배지를 제거하고, 새로운 완전 배지로 교체하였다. FACS 분석은 약물 치료 후, 회복 기간 중에 아포토시스를 겪는 세포의 퍼센트 결정 방법에서 설명한 바와 같이 수행하였다. 아포토시스는 회복 기간 중 0, 6, 18, 24 및 48 시간을 기점으로 결정하였다. 약물 처리 후, 아포토시스 비는 55%이었다. 회복 기간 중에, 6 시간 후, 32%가 더 아포토시스되고, 48 시간 회복 기간 후에는 57 %까지 증가되었고, 이는 세포가 회복 기간 중에 회복하는 것이 아니라, 계속 아포토시스를 겪음을 의미한다. 그 결과는 표 13에 나타내었다.
24 시간 독소루비신 처리에 이어, 96 시간 화합물 A 처리하고, 0, 6, 18, 24 및 48 시간 경과된 후 세포 회복
약물 처리(독소루비신 100 nM 24 시간 처리 후, 화합물 A 1200 nM 96 시간 처리) 아포토시스(%)
0 시간 회복 55
6 시간 회복 32
18시간 회복 34
24시간 회복 49
48시간 회복 57
실시예 18:
웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis ):
인체 비소세포 폐암 (H-460) 세포는 처리하지 않거나(즉, 대조군) 100 nM 독소루비신만을 24 시간 단독 투여하거나, 1200 nM 화합물 A만을 96 시간 단독 투여하였다. 병합 처리에서, 세포는 우선 100 nM 독소루비신을 24 시간 동안 처리한 후, 1,200 nM 화합물 A을 96 시간 처리하였다. 처리 기간 후, 세포를 융해하고, 브래드퍼드(Bradford) 시약으로 융해물의 단백질량을 예측하였다. SDS-PAGE에 단백질 40 μg을 로딩하고, PVDF 막으로 옮겼다. p53, Bax, Bcl-2, 사이클린 D1, Cdk1 및 액틴 항체로 막을 시험하였다. 서양고추냉이 과산화효소 (horseradish peroxide) 2차 항체로 제 1 항체를 검출하고, 웨스트 피코 화학발광(west pico chemiluminescence) 시약 처리하였다.
도 6은 세포 주기 분포와 아포토시스와 관련된 다양한 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 네 개의 레인에 같은 양의 단백질을 로딩하였다. 웰에 로딩된 다른 샘플은 도면에 나타내었다. 그 결과는 약물 단독 처리군에 비해서, 병용 투여군에서 항-아포토시스 단백질 Bcl-2은 대조군과 거의 동일한 정도로 상당히 감소 조절되었음을 의미한다. 이는 FACS 분석에서 있어 병합 처리에서 나타난 아포토시스 증가와 관련된다. 프로-아포토시스 단백질 Bax은 모든 처리 샘플에서 대하여 대조군에 비해 약간 증가되도록 조절되었다. 종양 억제 단백질 p53은 다른 두 처리군 만큼은 아니지만 대조군에 비해 병용 처리군에서 상당히 증가 조절되었다. Cdk1-B1은 유사분열의 개시제이다. 이 효소의 비조절은 종양 형성을 초래한다. 따라서, Cdk1을 저해하면, 그것의 활성을 저해하여 유사분열의 개시 및 세포 증식을 저해할 것이다. 도면은 독소루비신은 Cdk1 농도를 상당히 낮추는 반면에, 화합물 A의 첨가는 Cdk1를 무시할 수 있을 정도로 낮추어, 세포의 유사분열을 방지함을 나타낸다. 화합물 A 단독 처리는 대조군과 동일한 정도를 나타낸다. 사이클린 D1 농도는 다양한 처리군의 상당한 변화를 의미하지는 않는다. 화합물 A와 독소루비신을 단독 처리한 경우, 농도가 근소하게 감소하는 것에 반하여, 병합 처리하는 경우에는 대조군과 농도가 같다.
실시예 19:
본 실시예는 비소세포 폐 (H-460) 이종 이식 모델에 독소루비신과 CDK 저해제인, 화합물 A를 병합 처리한 경우 생체내 효능을 보여준다.
본 연구에서는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection (ATCC), USA)사의 인체 비소세포 폐암 (H-460) 세포주를 이용하였다.
식염수에 상기 화합물을 녹여 복강 투여용 독소루비신과 화합물 A를 준비하였다.
중증 복합형 면역 부전증 (SCID) 수컷 (체중: 20 g, 연령: 6주) 마우스 36마리의 그룹을 이용하였다. 5% CO2 배양기, 37℃, 10% 우태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 인체 비소세포 폐암 (H-460) 세포를 성장시켰다. 세포는 1,000 rpm에서 10분간 원심분리하면서 펠렛화하였다. 세포는 식염수에 재현탁하여 25 X 106개의 세포를 얻고, 이 세포 현탁액은 SCID 마우스에 피하 주사하였다. 격일마다 마우스의 식별가능한 종양 덩어리를 관찰하였다. 종양 크기가 직경 5-7 mm에 이르면, 동물을 하기 표 14에 나타낸 바와 같이 각 처리군으로 임의 추출하였다. 표 15에 나타낸 바와 같이, 독소루비신은 매주마다 투여하는 반면에, 화합물 A은 총 5일간 매일 1회 투여하였다. 독소루비신의 투여 후 6 시간 간격을 두고, 5일 동안 매일 (1 사이클) 화합물 A를 투여하였다. 이틀 간격을 두고, 다음 사이클이 시작된다. 처리는 총 2 사이클로 진행된다. 매일 체중을 기록하였다. 종양 크기와 세포독성의 다른 징표는 격일로 기록하였다. 현저한 체중 감소나 사망의 징표는 나타나지 않았다. 종양 중량(mg)은 편장형 타원체식: {길이 (mm) x [너비 (mm)2] x 0.5}, (상기 식에서, 상대 중력은 1로, π는 3으로 가정함)으로 예측하였다. 화합물 처리한 동물에서 종양 성장은 T/C (처리군/대조군) x 100%으로 계산하고, 성장 저해비 (Gl%)는 [100-T/C%]로 계산하였다. 그 결과는 도 7a, 7b, 8 및 9의 그래프로 나타내었다.
처리군
군 약물 처리 용량 경로 치료 회수 개체수
I 대조군(무처리) -- i.p. 8
II 독소루비신 2 mpk i.p. 1주 1회 (2w) 8
III 화합물 A 20 mpk i.p. 1주 5일 (2w) 8
IV 화합물 A 35 mpk i.p. 1주 5일 (2w) 8
V 독소 > 화합물 A 2 mpk > 20 mpk i.p. 1주 5일 (2w) 8
VI 독소 > 화합물A 2 mpk > 35 mpk i.p. 1주 5일 (2w) 8
독소: 독소루비신, w:주, i.p.: 복강내(lnterperitoneally) "> "는 독소루비신이 화합물 A보다 먼저 투여됨을 의미함.
복용 주기 (1 사이클)
군 세부사항 M T W T F
I 군 무처리 S S S S S
II 군 독소루비신 2 mpk D - - - -
III 군 화합물 A 20 mpk P P P P P
IV 군 화합물 A 35 mpk P P P P P
V 군 D > P: > 2 mpk > 20 mpk D/P P P P P
VI 군 D > P: > 2 mpk > 35 mpk D/P P P P P
S - 식염수, P - 화합물 A, D - 독소루비신
M, T, W, T 및 F: 평일 (월요일, 화요일, 수요일, 목요일 및 금요일)
">"은 독소루비신을 화합물 A보다 먼저 투여함을 의미함.
실시예 20:
COX -2 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석
도 9는 COX-2 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 웰에 로딩한 각 샘플은 도면에 나타내었다. 그 결과는 다음과 같다:
- 대조군은 낮은 COX-2의 기준값을 나타내었다.
- 화합물 A 단독은 낮은 COX-2를 나타내었다.
- 독소루비신은 강력하게 COX-2를 유도하고, 이는 NFKB 신호 전달 경로를 통한 화학물질 내성 때문이다.
- 독소루비신에 이어 화합물 A를 첨가하면, COX-2이 매우 감소 조절된다. 그러므로, 화합물 A에 의한 COX-2의 NFKB-매개성 저해는 종양 성장의 억제에 관여하고, 독소루비신은 인체 비소세포 폐암 (H-460) 종양 이종 이식물에 화학물질 내성을 유도하였다.
실시예 21:
인체 비소세포 폐암 세포주 (H-460)에 있어, 독소루비신과 플라보피리돌의 조합 연구
본 실시예는 세포독성 항신생물제인 독소루비신을 투여한 후에 (표 16A), 투여하기 전에 (표 16A) 또는 이와 동시에 (표 16C) 플라보피리돌을 투여하는 경우에, 상승 효과가 없음을 보여준다. 인체 비소세포 폐암 H-460 세포는 1,500 세포/well 밀도로 시딩하였다. 표 16A에 나타낸 바와 같이, 세포는 약물 단독, 즉, 독소루비신 또는 플라보피리돌 단독 처리하였다. 독소루비신은 24 시간 처리한 후, 완전 배지를 96 시간 투여하는 것에 반하여, 플라보피리돌의 경우에는, 24 시간 완전 배지 처리한 후, 96 시간 플라보피리돌 처리하였다. 독소루비신의 사용 농도는 30 nM, 70 nM, 100 nM 및 200 nM인 것에 반하여, 플라보피리돌의 이용농도는 200 nM 및 350 nM (각각, 48 시간 처리 후 IC30 및 IC50 농도)이었다. 조합물 연구에서, 세포는 24 시간 30 nM, 70 nM, 100 nM 및 200 nM 독소루비신 처리한 후, 96 시간 200 nM 및 350 nM 플라보피리돌 처리하였다. 약물 처리 종료 후, 즉, 120 시간 후, 플레이트의 MTS 생존능을 분석을 수행하고, 대조군에 대한 세포독성(%)을 계산하였다. 그 결과는 하기 표 16A에 나타내었다.
표 16B을 참조하면, 세포는 우선 약물 단독, 즉 독소루비신 또는 플라보피리돌 단독 처리하였다. 플라보피리돌의 경우에는, 96 시간 플라보피리돌 처리한 후, 24 시간 완전 배지 처리하는 것에 반하여, 독소루비신의 경우에는, 먼저 96 시간 완전 배지 처리한 후, 24 시간 독소루비신 처리하였다. 독소루비신의 사용 농도는 30 nM, 70 nM, 100 nM 및 200 nM인 것에 반하여, 플라보피리돌의 사용 농도는 200 nM 및 350 nM (48 시간 처리 후, HC30 및 HC50 농도)이었다. 본 조합물 연구에서, 200 nM 또는 350 nM 플라보피리돌을 96 시간 처리한 후, 30 nM, 70 nM, 100 nM 또는 200 nM 독소루비신을 24 시간 처리하였다. 약물 처리 후, 즉, 120 시간 후, 플레이트의 MTS 생존능 분석을 수행하고, 대조군에 대한 세포독성(%)을 계산하였다. 그 결과는 하기 표 16B에 나타내었다.
표 16C은 독소루비신과 플라보피리돌을 120 시간 함께 투여한 경우에 상승 효과가 없음을 나타낸다. 인체 비소세포 폐암 H-460 세포는 1,500 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 세포는 약물, 즉 독소루비신 또는 플라보피리돌을 각각 120 시간 단독 처리하였다. 독소루비신의 사용 농도는 30 nM, 70 nM, 100 nM 및 200 nM인 것에 반하여, 플라보피리돌의 사용 농도는 200 nM 및 350 nM (48 시간 처리 후, IC30 및 IC50 농도)이었다. 본 조합물 연구에서, 30 nM, 70 nM, 100 nM 또는 200 nM 독소루비신과 200 nM 또는 350 nM 플라보피리돌 각각을 120 시간 함께 첨가하였다. 약물 처리 종료 후, 즉, 120 시간 후, 플레이트의 MTS 생존능 분석을 수행하고, 대조군에 대한 세포독성(%)을 계산하였다. 그 결과는 하기 표 16C에 나타내었다.
H-460 세포주에 있어 독소루비신과 플라보피리돌의 조합 연구 A) 독소루비신에 이어 CDK 저해제인 플라보피리돌을 투여한 경우
Doxo (24 시간) > FP (200 nM, 96 시간)
Doxo 농도 세포독성 (%)
200 nM Doxo. 48
Doxo. > FP 65
100 nM Doxo. 16
Doxo. > FP 38
70 nM Doxo. 14
Doxo. > FP 35
30 nM Doxo. 0
Doxo. > FP 16
FP 200 nM 17
Doxo (24 시간) > FP (350 nM, 96 시간)
Doxo 농도 세포독성 (%)
200 nM Doxo. 48
Doxo. > FP 75
100 nM Doxo. 9
Doxo. > FP 66
70 nM Doxo. 12
Doxo. > FP 71
30 nM Doxo. 0
Doxo. > EP 56
FP 350 nM 57
B) 플라보피리돌에 이어 독소루비신을 투여한 경우
FP (200 nM, 96 시간) > Doxo (24 시간)
Doxo 농도 세포독성 (%)
200 nM FP > Doxo 26
100 nM FP > Doxo 26
70 nM FP > Doxo 26
30 nM FP > Doxo 24
FP 200 nM 29
FP (350 nM, 96 시간) > Doxo (24 시간)
Doxo 농도 세포독성 (%)
200 nM FP > Doxo 80
100 nM FP > Doxo 75
70 nM FP > Doxo 79
30 nM FP > Doxo 77
FP 350 nM 73
">"는 어느 약물을 다른 약물보다 먼저 투여함을 의미함.
C) 플라보피리돌과 독소루비신을 동시 투여한 경우
Doxo + FP (200 nM, 120 시간)
Doxo 농도 세포독성 (%)
200 nM Doxo 48
Doxo.+ FP 68
100 nM Doxo 24
Doxo.+ FP 62
70 nM Doxo 28
Doxo.+ FP 65
30 nM Doxo 2
Doxo.+ FP 35
FP 200 nM 39
Doxo + FP (350 nM, 120 시간)
Doxo 농도 세포독성 (%)
200 nM Doxo 48
Doxo.+ FP 88
100 nM Doxo 24
Doxo.+ FP 85
70 nM Doxo 28
Doxo.+ FP 87
30 nM Doxo 2
Doxo.+ FP 80
FP 350 nM 81
Doxo = 독소루비신, FP = 플라보피리돌
"+"은 약물을 동시 투여함을 나타냄.

Claims (19)

  1. 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신 및 젬시타빈으로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포독성 항신생물제, 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염과, 하기 화학식 1으로 나타내는 사이클린 의존성 키나제 (CDK) 저해제 또는 그것의 거울상 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매 화합물을 포함하는 약제 조합물.
    화학식 1
    Figure 112009076388005-PCT00002
    [상기 식에서,
    Ar은 치환되지 않거나, 염소, 브롬, 불소 또는 요오드로부터 선택되는 할로겐, 니트로, 시아노, C1-C4 알킬, 트리플루오로메틸, 히드록실, C1-C4 알콕시, 카르복시, C1-C4 알콕시카르보닐, CONH2, 및 NR1R2(여기서, R1과 R2은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬로부터 선택됨)로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기 하나, 둘 또는 셋으로 치환된 페닐이다]
  2. 제 1항에 있어서, 상기 CDK 저해제는 상기 페닐기가 염소, 브롬, 불소 또는 요오드로부터 선택되는 할로겐, C1-C4 알킬 또는 트리플루오로메틸로부터 선택되는 하나, 둘 또는 셋의 치환기로 치환된 화학식 1의 화합물인 약제 조합물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 CDK 저해제는 상기 페닐기가 염소, 브롬, 불소 또는 요오드로부터 선택되는 하나, 둘 또는 셋의 치환기로 치환된 화학식 1의 화합물인 약제 조합물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 CDK 저해제는 상기 페닐기가 염소로 치환된 화학식 1의 화합물인 약제 조합물.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 CDK 저해제는 상기 페닐기가 하나, 둘 또는 셋의 트리플루오로메틸기로 치환된 화학식 1의 화합물인 약제 조합물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물로 나타내는 CDK 저해제는 (+)-트랜스-2-(2-클로로-페닐)-5,7-디하이드록시-8-(2-하이드록시메틸-1-메틸-피롤리딘-3-일)-크로멘-4-온 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염인 약제 조합물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 세포독성 항신생물제는 파클리탁셀인 약제 조합물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 세포독성 항신생물제는 도세탁셀인 약제 조합물.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 세포독성 항신생물제는 독소루비신인 약제 조합물.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 세포독성 항신생물제는 젬시타빈인 약제 조합물.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 조합물은 유방암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 위암, 결장직장암 및 간세포성 암로 구성되는 군으로부터 선택되는 암의 치료에 적합한 약제 조합물.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 암은 비소세포 폐암 또는 췌장암인 약제 조합물.
  13. 유방암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 위암, 결장직장암 및 간세포성 암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 암의 치료가 필요한 대상을 치료하는 방법으로서, 제 1항의 약제 조합물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 암은 비소세포 폐암 또는 췌장암인 방법.
  15. 유방암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 위암, 결장직장암 및 간세포성 암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 암의 치료가 필요한 대상을 치료하 는 방법으로서, 제 1항의 약제 조합물을 상기 치료가 필요한 대상에게 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 및 젬시타빈으로부터 구성되는 군으로부터 선택되는 세포독성 항신생물제 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염의 치료량과, 상기 화학식 1d의 화합물로 나타내는 사이클린 의존성 키나제 (CDK) 저해제 또는 그것의 거울상 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매 화합물의 치료량을 동시에 또는 차례로 투여하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 및 젬시타빈으로부터 구성되는 군으로부터 선택되는 세포독성 항신생물제 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염의 치료량과, 상기 화학식 1의 화합물로 나타내는 사이클린 의존성 키나제 (CDK) 저해제 또는 그것의 거울상 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매 화합물의 치료량을 동시에 투여하는 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 및 젬시타빈으로부터 구성되는 군으로부터 선택되는 세포독성 항신생물제 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염의 치료량과, 화학식 1의 화합물로 나타내는 사이클린 의존성 키나제 (CDK) 저해제 또는 그것의 거울상 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매 화합물의 치료량을 차례로 투여하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 및 젬시타빈으 로부터 구성되는 군으로부터 선택되는 세포독성 항신생물제 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염의 치료량은, 상기 화학식 1의 화합물로부터 나타내는 사이클린 의존성 키나제 (CDK) 저해제 또는 그것의 거울상 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매 화합물의 치료량을 투여하기 전에 투여하는 방법.
  19. 선행하는 제 13항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조합물은 상승된 치료 효과를 나타내는 방법.
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WO (1) WO2008139271A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140056190A (ko) * 2011-05-31 2014-05-09 피라말 엔터프라이지즈 리미티드 두경부 편평세포암종의 치료를 위한 상승작용성 약학 조합물

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI461194B (zh) * 2009-05-05 2014-11-21 Piramal Entpr Ltd 吡咯啶取代黃酮作為輻射致敏劑
US9763982B2 (en) 2010-06-29 2017-09-19 The Regents Of The University Of California Depletion of cancer stem cells
US20120009203A1 (en) * 2010-06-29 2012-01-12 Anahid Jewett Depletion of cancer stem cells
US20130237582A1 (en) * 2010-11-19 2013-09-12 Piramal Enterprises Limited Pharmaceutical combination of paclitaxel and a cdk inhibitor
WO2012069972A1 (en) 2010-11-19 2012-05-31 Piramal Life Sciences Limited A pharmaceutical combination for the treatment of breast cancer
TW201242597A (en) 2011-03-14 2012-11-01 Piramal Life Sciences Ltd A synergistic pharmaceutical combination for the treatment of pancreatic cancer
KR20140056227A (ko) 2011-06-24 2014-05-09 피라말 엔터프라이지즈 리미티드 인간 유두종바이러스와 관련된 암의 치료를 위한 화합물
JP6568060B2 (ja) 2013-07-12 2019-08-28 ピラマル エンタープライズイズ リミテッド 黒色腫の治療のための組合せ医薬
AU2016252609B2 (en) 2015-04-20 2022-06-30 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Predicting response to alvocidib by mitochondrial profiling
TR201911032T4 (tr) 2015-05-18 2019-08-21 Tolero Pharmaceuticals Inc Artırılmış biyoyararlanıma sahip alvocıdıb ön ilaçları.
RU2759963C2 (ru) 2015-08-03 2021-11-19 Сумитомо Даиниппон Фарма Онколоджи, Инк. Комбинированные терапии для лечения рака
WO2017172826A1 (en) * 2016-03-28 2017-10-05 Presage Biosciences, Inc. Pharmaceutical combinations for the treatment of cancer
WO2018094275A1 (en) 2016-11-18 2018-05-24 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors
WO2018187478A1 (en) * 2017-04-04 2018-10-11 University Of Miami Biomarkers indicative of prostate cancer and treatment thereof
WO2019055579A1 (en) 2017-09-12 2019-03-21 Tolero Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT REGIME FOR CANCERS THAT ARE INSENSITIVE TO BCL-2 INHIBITORS USING THE MCL-1 ALVOCIDIB INHIBITOR
JP7277476B2 (ja) * 2018-03-12 2023-05-19 イェディテペ・ウニヴェルシテシ アレキシジンジヒドロクロリドと五硼酸ナトリウム五水和物との組み合わせを含む化学療法剤
CN113490499A (zh) 2018-12-04 2021-10-08 大日本住友制药肿瘤公司 用作治疗癌症的活性剂的cdk9抑制剂及其多晶型物
JP2022525149A (ja) 2019-03-20 2022-05-11 スミトモ ダイニッポン ファーマ オンコロジー， インコーポレイテッド ベネトクラクスが失敗した急性骨髄性白血病（ａｍｌ）の処置
RU2710273C1 (ru) * 2019-04-24 2019-12-25 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) Фармацевтическая композиция для лечения злокачественных новообразований
CN114767669B (zh) * 2022-05-20 2023-07-04 湖南省中医药研究院 一种P-gp抑制剂及其提取方法和应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI331034B (en) * 2002-07-08 2010-10-01 Piramal Life Sciences Ltd Inhibitors of cyclin-dependent kinases and their use
US7271193B2 (en) * 2002-07-08 2007-09-18 Nicholas Piramal India, Ltd. Inhibitors of cyclin-dependent kinases and their use
US7884127B2 (en) * 2002-07-08 2011-02-08 Pirimal Life Sciences Ltd. Inhibitors of cyclin dependent kinases and their use
US7915301B2 (en) * 2002-07-08 2011-03-29 Piramal Life Science Limited Inhibitors of cyclin dependent kinases and their use
BR0316004A (pt) * 2002-11-06 2005-09-13 Cyclacel Ltd Composição farmacêutica compreendendo um inibidor de cdk e gemcitabina
WO2005055952A2 (en) * 2003-12-08 2005-06-23 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Synergistic anti-cancer compositions
CA2600797A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-21 The Regents Of The University Of Michigan Chromen-4-one inhibitors of anti-apoptotic bcl-2 family members and the uses thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140056190A (ko) * 2011-05-31 2014-05-09 피라말 엔터프라이지즈 리미티드 두경부 편평세포암종의 치료를 위한 상승작용성 약학 조합물

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